JP2013526616A

JP2013526616A - 磁性ナノ粒子

Info

Publication number: JP2013526616A
Application number: JP2013512242A
Authority: JP
Inventors: ウェイスレーダー，ラルフ; リー，ハコー; ユン，テ−ジョン
Original assignee: ザジェネラルホスピタルコーポレイション
Priority date: 2010-05-26
Filing date: 2011-05-26
Publication date: 2013-06-24
Also published as: CN106265593A; EP2575772A2; US20150258222A1; EP2575772A4; US20130195767A1; CN103025314A; US20170216463A1; WO2011150212A2; US9623126B2; US10111971B2; US8945628B2; CN106265593B; WO2011150212A3

Abstract

磁性ナノ粒子は、磁性コアと超常磁性外殻とを含む。外殻はナノ粒子の磁気特性を増強する。ナノ粒子の増強された磁気特性により、ナノ粒子の高感度の検出が可能になり、非特異的凝集が減少する。

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１０年５月２６日に提出され、その開示全体が引用によりこの明細書中に援用される米国仮出願シリアル番号第６１／３４８５６１号に基づく優先権の利益を主張する。

連邦政府による資金提供を受けた研究開発
本発明は契約番号ＵＯｌＨＬ０８０７３１−０２におけるアメリカ国立衛生研究所からの政府支援によって行われた。政府は本発明において一定の権利を所有する。

発明の分野
本開示は磁性ナノ粒子に関する。

背景
生体適合性のあるおよび／または分解できる磁性ナノ粒子は、生物工学および医学に広く応用されている。特に、生体サンプルおよび組織が本質的に低い固有磁化率を有する場合、磁性ナノ粒子は高度な選択的検出をするための有効的な対照メカニズムを提供することができる。たとえば、バイオ分離、薬物輸送および遺伝子導入をに限定されないがこれらを含む応用に磁性ナノ粒子を適用することができる。

概要
本開示は、磁性ナノ粒子と、その合成および使用の方法とに関する。各々の磁性ナノ粒子は磁性コアおよび生体適合性のある外殻を含む。外殻は、コアを酸化されないように保護し、ナノ粒子の磁気特性を増強する。増強された磁気特性は、磁性コアの磁性が増加することおよびその保磁力が減少することを含む。増強された磁気特性により、ナノ粒子の高感度の検出および非特異的凝集の減少が可能になる。増強された磁気特性を有する生体適合性のあるナノ粒子を形成することによって、たとえばたんぱく質および単一細胞のような特異的標的分子の検出を改善することができる。

概して、本明細書に記載された主題の１つの局面は、強磁性コアとこの磁性コアを囲む超常磁性殻とを含むナノ粒子によって具体化される。

一部の実施形態において、ナノ粒子は約２ｎｍ以上の直径を有する。一部の実施形態において、内部にある強磁性コアは約１ｎｍ〜約１５ｎｍ範囲のコア径を有する。一部の実施形態において、超常磁性殻は約０．１ｎｍ以上の厚さを有する。強磁性コアはＦｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、ＦｅＰｔまたはＳｍＣｏを含んでもよい。

一部の実施形態において、超常磁性殻は磁性材料の酸化物を含む。一部の実施形態において、超常磁性殻はドーパント材料を含む。ドーパントは、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｎｉ、ＺｎおよびＺｎＭｎからなる群より選択される金属を含んでもよい。

一部の実施形態において、ナノ粒子は超常磁性殻上にある被覆を含み、その被覆は上記ナノ粒子の水溶性を増加させるように構成される。その被覆は、２，３−ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）を含んでもよい。

一部の実施形態において、ナノ粒子は超常磁性殻上にある被覆を含み、その被覆は標的分子にナノ粒子を結合させるように構成される。

一部の実施形態において、ナノ粒子は超常磁性殻上にあるデキストランポリマー被覆を含む。

一部の実施形態において、超常磁性殻は酸化鉄を含む。
別の局面では、ナノ粒子を形成する方法は、１つ以上の強磁性ナノ粒子コアを形成するステップと、１つ以上の強磁性ナノ粒子コアの各々の上に超常磁性殻を形成するステップとを含む。上記強磁性ナノ粒子の形成は、第１溶液中で金属錯体と界面活性剤とを混合するステップと、第１溶液をアニーリングして、金属錯体を熱分解させ、第１溶液中で上記１つ以上の強磁性ナノ粒子コアを形成するステップとを含んでもよい。

一部の実施形態において、１つ以上の強磁性ナノ粒子コアの各々の上に超常磁性殻を形成するステップは、第１溶液をアニーリングするステップの後、第１溶液に１つ以上のオレイン酸金属塩複合体を混合し、第２溶液を形成するステップと、第２溶液をアニーリングして、上記１つ以上の強磁性ナノ粒子殻の上に超常磁性殻を形成するステップとを含む。

別の局面では、被検体において標的分子の有無を判断する方法は、強磁性コアと、超常磁性殻と、超常磁性殻上にあってかつ標的分子に特異的に結合するターゲティング部位とを有するナノ粒子を被検体に投与するステップと、ナノ粒子を標的分子に結合させるための十分な時間を与えるステップと、被検体の磁気共鳴画像を生成するステップとを含み、上記画像における信号は標的分子の存在を示す。

別の局面では、治療方法は、強磁性コアと、超常磁性殻と、超常磁性殻上にあってかつ被検体の標的細胞と結合する被覆とを有するナノ粒子を被検体に投与するステップと、ナノ粒子を標的細胞に結合させるための十分な時間を与えるステップと、被検体に交流電磁場を印加して標的細胞を治療するステップとを含む。

架橋ポリマーとは、ポリマー鎖および／または分枝にある官能基が別のポリマーにある官能基と反応して形成した網状のポリマーである。

非架橋ポリマーとは、ポリマーの鎖が別のポリマーの鎖とほとんどまたは全く反応せず、相互連結して形成した網状のポリマーである。

磁気モーメントは、磁石が磁場に沿って整列する傾向を表す。
磁気保磁力は、強磁性材料の消磁に対する抵抗を表す。

磁化率は、材料が印加された磁場に応じて磁化される度合いを表す。
超常磁性は、磁場が印加されない場合に磁気特性を示さないが、磁場が印加されると磁石と類似の挙動をする材料を指す。

本発明はいくつの利点を有する。たとえば、一部の実施形態において、磁性ナノ粒子の外殻はナノ粒子コアの進行性酸化を防止し、よって、ナノ粒子の全体磁化の減少を防止する。一部の実施形態において、磁性ナノ粒子の外殻を金属でドーピングすると、ナノ粒子の全体磁化を向上させることができる。外殻の厚さが時間に関係なく常に一定であるので、磁性ナノ粒子は安定した外殻を有するという利点を備えている。一部の実施形態において、磁性ナノ粒子の外殻は生体適合性表面を与えて、その表面に標的分子または他の結合部位を付着させることができる。磁性ナノ粒子は、高磁化であるため、そのような標的分子および／または標的部位を高感度で検出するのに有用でる。さらに、超常磁性殻のおかげで、磁性ナノ粒子コアは低磁場でほとんどまたは全く保磁力を示さない。したがって、外部から印加される磁場が存在しない場合、複数の磁性ナノ粒子の非特異的凝集を回避することができる。逆に、設定しきい値を超える外部磁界を印加することによって、磁性ナノ粒子の凝集を意図的に誘発することができる。このような誘発された凝集は、磁気ナノ粒子に付着させた特定の標的分子の収集および／または分離に有用である。

別段の規定がない限り、本明細書に用いられたすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に普通に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または均等の方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、適切な方法および材料が以下に記載される。本明細書に記載されているすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全体が引用により援用される。矛盾がある場合には、定義を含む本明細書が優先する。さらに、材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定する意図はない。

その他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、図面および特許請求の範囲から明らかになるであろう。

例示的な磁性ナノ粒子の断面図である。例示的な磁性ナノ粒子の断面図である。磁性ナノ粒子を製造するための例示的なプロセスを示すフローチャートである。それぞれ異なる金属錯体対界面活性剤モル比のうち１つを有する金属錯体−界面活性剤溶液から製造されたナノ粒子コアの画像である。それぞれ異なる金属錯体対界面活性剤モル比のうち１つを有する金属錯体−界面活性剤溶液から製造されたナノ粒子コアの画像である。それぞれ異なる金属錯体対界面活性剤モル比のうち１つを有する金属錯体−界面活性剤溶液から製造されたナノ粒子コアの画像である。それぞれ異なる金属錯体対界面活性剤モル比のうち１つを有する金属錯体−界面活性剤溶液から製造されたナノ粒子コアの画像である。異なる反応温度のうち１つの反応温度で金属錯体−界面活性剤溶液から製造されたナノ粒子コアの画像である。異なる反応温度のうち１つの反応温度で金属錯体−界面活性剤溶液から製造されたナノ粒子コアの画像である。異なる反応温度のうち１つの反応温度で金属錯体−界面活性剤溶液から製造されたナノ粒子コアの画像である。異なる反応温度のうち１つの反応温度で金属錯体−界面活性剤溶液から製造されたナノ粒子コアの画像である。異なる反応温度のうち１つの反応温度で金属錯体−界面活性剤溶液から製造されたナノ粒子コアの画像である。異なる反応温度のうち１つの反応温度で金属錯体−界面活性剤溶液から製造されたナノ粒子コアの画像である。反応温度に対してナノ粒子の直径を示すグラフである。温度に対してＦｅ＠ＭＦｅ_２Ｏ_４（Ｍ＝Ｆｅ，Ｃｏ，Ｍｎ）磁性ナノ粒子（ＭＮＰ）の正規化された磁性を示すグラフである。Ｆｅ＠ＦｅＯ磁性ナノ粒子の磁化曲線図である。Ｆｅ＠ＭＦｅ_２Ｏ_４（Ｍ＝Ｆｅ，Ｃｏ，Ｍｎ）磁性ナノ粒子の磁化曲線図である。異なる磁性ナノ粒子の横緩和値（ｒ_２）の比較を示すグラフである。ターゲティング部位と共役するためのジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）を被覆する前および後のＦｅ＠ＭｎＦｅ_２Ｏ_４を示す概略図である。アビジン濃度にに対していくつかの種類のナノ粒子の正規化されたΔＴ２を示すグラフである。いくつかの種類のＭＮＰの細胞濃度当たりの緩和率を示すグラフである。細胞濃度に対してＦｅ＠ＭｎＦｅ_２Ｏ_４ＭＮＰの正規化されたΔＴ２を示すグラフである。磁性ナノ粒子を注入する前の臓器のＭＲＩ画像である。Ｆｅ＠ＭｎＦｅ_２Ｏ_４磁性ナノ粒子を注入した後の臓器のＭＲＩ画像である。Ｆｅ＠Ｆｅ_３Ｏ_４磁性ナノ粒子を注入した後の臓器のＭＲＩ画像である。ＣＬＩＯ磁性ナノ粒子を注入した後の臓器のＭＲＩ画像である。

詳細な説明
好ましくは、磁性ナノ粒子は、検出選択性を高めるため、高磁気モーメントを有する。ナノ粒子の粒径を大きくするとより高い磁気モーメントが得られるが、ナノ粒子が大きすぎると、小さい分子および細胞を検出するのに使用することが困難になり得る。さらに、一部の事例では、磁性粒子は酸化の影響を受けやすいので、磁化が経時的に減少してゆくことがあり得る。また、粒子の磁気性質により、自発的凝集が起こり得る。それによって、ナノ粒子を応用に用いることが困難になり、分子をナノ粒子に選択的結合させることも困難になり得る。

本開示は、磁性ナノ粒子と、その合成方法および使用方法とに関する。各々の磁性ナノ粒子は磁性コアおよび生体適合性のある外殻を含む。外殻は、コアを酸化されないように保護し、ナノ粒子の磁気特性を増強する。増強された磁気特性は、磁性コアの磁性が増加することおよびその保磁力が減少することを含む。増強された磁気特性により、ナノ粒子の高感度の検出および非特異的凝集の減少が可能になる。増強された磁気特性を有する生体適合性のあるナノ粒子を形成することによって、たとえばたんぱく質および単一細胞のような特異的標的分子の検出を改善することができる。

磁性ナノ粒子
図１Ａは例示的な磁性ナノ粒子２の断面図を示している。磁性ナノ粒子２は、外殻６に囲まれているナノ粒子コア４を含む。円形断面（３次元の場合球形）を有する形状として示されているが、磁性ナノ粒子２はさまざまな形状を有してもよい。たとえば、磁性ナノ粒子２はロッド／シリンダ、ワイヤまたはホイスカーと類似形状に形成されてもよい。ナノ粒子は、他の形状を有してもよい。また、磁性ナノ粒子２はさまざまな大きさを有してもよい。一部の実施形態において、磁性ナノ粒子は、たとえば約２ｎｍ、約５ｎｍ、約１０ｎｍ、約１５ｎｍまたは約１６ｎｍを含め、約１ｎｍ〜約２０ｎｍ範囲における平均最大寸法を有してもよい。

一部の実施形態において、ナノ粒子コア４は、結晶構造、多結晶構造または非晶質構造を有する強磁性材料から形成される。たとえば、ナノ粒子コア４は、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、ＦｅＯＦｅ_２Ｏ_３、ＮｉＯＦｅ_２Ｏ_３、ＣｕＯＦｅＯ_３、ＭｇＯＦｅ_２Ｏ_３、ＭｎＢｉ、ＭｎＳｂ、ＭｎＯＦｅ_２Ｏ_３、Ｙ３Ｆｅ_５Ｏ_１２、ＣｒＯ_２、ＭｎＡｓ、ＳｍＣｏ、ＦｅＰｔなど、またはそれらの組合わせに限定されないがこれらを含むことができる。ナノ粒子コア４は、磁性ナノ粒子２全体と類似する形状を有してもよい。たとえば、ナノ粒子コア４は、球形、ロッド／シリンダ、ワイヤまたはホイスカーと類似形状に形成されてもよい。ナノ粒子コア４は、他の形状を有してもよい。ナノ粒子コア４の平均最大寸法は、たとえば約２ｎｍ、約５ｎｍ、約１０ｎｍまたは約１５ｎｍを含め、約１ｎｍ〜約２０ｎｍにおいて変化してもよい。

磁性ナノ粒子２の外殻６は、ナノ粒子コア４を部分的にまたは全体的に囲む。一部の実施形態において、殻６は、結晶構造、多結晶構造または非晶質構造を有する超常磁性材料から形成される。一部の実施形態において、上記殻を形成するのに使用される材料は生体適合性がある。すなわち、殻材料は、所定の有機体に不利な生物学／免疫学的応答をほとんどまたは全く誘発せずおよび／または細胞および臓器にとって無毒である。殻６に使用できる材料の例は、金属酸化物、たとえばフェライト（Ｆｅ_３Ｏ_４）、ＦｅＯ、Ｆｅ_２Ｏ_３、ＣｏＦｅ_２Ｏ_４、ＭｎＦｅ_２Ｏ_４、ＮｉＦｅ_２Ｏ_４、ＺｎＭｎＦｅ_２Ｏ_４、またはそれらの組合わせに限定されないがこれらを含むことができる。殻６は、たとえば約１ｎｍ、約１．５ｎｍ、約２ｎｍまたは約２．５ｎｍを含め、約０．５ｎｍ〜約３ｎｍ範囲に変化する厚さを有してもよい。

磁性ナノ粒子２の外殻６は、さまざまな機能を果たすことができる。たとえば、殻を有しない孤立したナノ粒子コアが酸化剤（たとえば空気中の酸素）に暴露されると、コア材料の全部または一部が酸化して、ナノ粒子の磁気特性の劣化を引起し得る。また、形成された酸化物は、コア材料と比べて弱い磁気特性を有し得る。コア４の上に外殻６を形成することにより、コア材料の望ましくない酸化を防止することができ、それによって、コア４の磁気特性を維持することができる。さらに、一部の実施形態において、殻６はナノ粒子コア４の磁気特性を増強させる。たとえば、殻材料のみから形成されたナノ粒子コアに比べて、殻６を有する磁性ナノ粒子は、約１０倍、約１００倍または約１０００倍の磁気モーメントを示すことができる。

磁性ナノ粒子２の磁化（粒子の単位体積当たりの磁気モーメント）は、コア４の最大平均寸法、殻６の厚さ、およびコア４と殻６との磁化にそれぞれ部分的に依存する。たとえば、Ｆｅ＠Ｆｅ_３Ｏ_４粒子の全体磁化（Ｍ_０）は、体積加重平均値としてのＦｅコアおよびフェライト殻それぞれからの寄与からなる。

式中、Ｍ_ＦｅおよびＭ_{フェライト}はそれぞれ、コアおよび殻の磁化であり、Ｖ_ＦｅおよびＶ_{フェライト}はそれぞれ、コアおよび殻の体積である。

一部の実施形態において、殻材料はコア材料の酸化物と同様である。このとき、酸化物は、コア材料から形成されるのではなく、コア４をさらに酸化せずに管理されたプロセスにおいてナノ粒子コア４の表面上に被覆させたものである。この管理された殻形成プロセスは、時間に関係なく安定した厚さ（すなわち、殻の厚さがほとんどまたは全く増加しない）および強い磁気特性を有する殻を形成することができる。さらに、ナノ粒子コア４の表面上に殻６を形成することによって、ナノ粒子コアの大きさは減少しない。

殻６が超常磁性特性であるため、磁性ナノ粒子２に外部磁場を印加しないとき、ナノ粒子２は磁気特性をほとんどまたは全く示さない。逆に、ナノ粒子２に設定しきい値を超える外部磁場を印加するとき、上述のようにナノ粒子は増強された磁気モーメントを示す。

すなわち、殻６は、全体のナノ粒子２が超常磁性に見えるように、ナノ粒子２の磁気特性を変化させる。増強された磁気モーメントを示させるためのしきい値は、殻６の材質および構造に依存する。

一部の実施形態において、外部からの印加磁場が存在しないときの磁気モーメントの減少および／または不足が、さもなければナノ粒子２群の磁気特性によって生じ得る非特異的／自発的凝集を減少および／または防止することができる。逆に、上記のコア／殻構造を有する複数のナノ粒子に外部磁場を印加することにより、一部の実施形態においてナノ粒子の凝集を誘発することができる。このような誘発された凝集は、磁気ナノ粒子に結合した検体または他の分子の検出を試みるときに有用となり得る。

一部の実施形態において、ナノ粒子２の磁気モーメントを、殻材料にドーパントを含有させることによって、さらに増強することができる。たとえば、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｚｎ、ＺｎＭｎ、およびそれらの組合わせに限定されないがこれらを含む金属を用いて、殻６をドープすることができる。また、ナノ粒子殻６に存在するドーパントは、外部からの印加磁場が存在するときにナノ粒子２が磁気特性を示すポイントに影響を与えることができる。たとえばＭｎＦｅ_２Ｏ_４、ＣｏＦｅ_２Ｏ_４、ＮｉＦｅ_２Ｏ_４、ＺｎＦｅ_２Ｏ_４、ＺｎＭｎＦｅ_２Ｏ_４のように、Ｆｅの半分のレベルに達したドーパントイオンを含有させると、磁性ナノ粒子に最大磁気モーメントを付与することができる。

一部の実施形態において、磁性ナノ粒子２はさらに表面被覆を有している。たとえば、図１Ｂに示されたナノ粒子２には、超常磁性殻６の表面上に表面被覆８が形成されている。この表面被覆８は殻６を完全にまたは部分的に被覆している。被覆８の少なくとも１つの目的は、ターゲティング部位および結合基などで容易に官能化されることができる生体適合性表面を与えることにある。一部の実施形態において、表面被覆８は、磁性ナノ粒子を本質的に親水性または疎水性にする。ポリエチレングリコールまたはシランなどの合成ポリマー、天然ポリマー、合成または天然ポリマーの誘導体、およびそれらの組合わせに限定されないがこれらをを含むポリマーから表面被覆８を形成することができる。天然ポリマーは、微生物、植物、または動物によって合成された多糖類のような純粋なポリマーを実質的に純粋な形で抽出することによって得られる。合成ポリマーは、当業者に知られているモノマーからポリマーを合成する標準的な高分子化学技術を用いて、非生物学的合成から得られる。上記ポリマーは、単一種類のモノマーから合成されるホモポリマーまたは２種類以上のモノマーから合成されるコポリマーであってもよい。上記ポリマーは、架橋されてもまたは架橋されなくてもよい。架橋ポリマーは、生物システムにおいて分解に対する熱安定性および熱耐性を有することが特徴である。架橋ポリマーは出発原料のポリマーより著しく高い分子量を有する。

一部の実施形態において、表面被覆８は、磁性ナノ粒子２を囲む連続膜ではなく、磁性ナノ粒子２に付着させられ、磁性ナノ粒子２を囲む「網状」または「雲状」の延長ポリマー鎖である。ポリマーの例としては、デキストラン、プラナン（pullanan）、カルボキシデキストラン、カルボキシメチルデキストラン、および/または還元型カルボキシメチルデキストラン、ポリメタクリル酸メチルポリマーおよびポリビニルアルコールポリマーのような多糖類および誘導体に限定されないがこれらを含む。一部の実施形態において、これらのポリマー被覆は、殻材料に比べてターゲティング部位および／または結合基がはるかに容易に結合することができる表面を与える。

たとえば、デキストランで被覆されたナノ粒子を作り、エピクロロヒドリンと架橋してもよい。添加されたアンモニアは、エポキシ基と反応してアミン基を生成する。この材料は、架橋酸化鉄あるいは「ＣＬＩＯ」として知られている。アミンを用いて官能化されると、この材料はアミン−ＣＬＩＯまたはＮＨ_２−ＣＬＩＯと呼ばれる。カルボキシ官能化されたナノ粒子を、エチレンジアミンまたはヘキサンジアミンのような水溶性のカルボジイミドおよびジアミンを用いて、アミノ官能化された磁性粒子に転換してもよい。使用のため、アビジンまたはストレプトアビジンを、オリゴヌクレオチドまたはポリペプチドのようなビオチン化結合部位を介してナノ粒子に付着させてもよい。同様に、使用のため、ビオチンをアビジンに標識された結合部位を介してナノ粒子に付着させてもよい。

他の実施形態において、ナノ粒子は、非ポリマー官能基組成物に会合される。本発明の範囲に含まれている、会合されたポリマーを有しない安定かつ官能化されたナノ粒子を合成する方法が既知である。このような方法は、たとえば、Halbreich et al., Biochimie, 80(5-6): 379-90, 1998およびCaroline R.A. Volois et al., Biomaterials, 31(2): 366-374に記載されている。

一般的に、結合部位は合成または天然の分子である。この合成または天然の分子は、標的分子または別の結合部位（または特定の実施形態において、凝集誘発分子）に特異的に結合し、さもなければたとえば共有結合もしくは非共有結合によりリンクしまたはハイブリッドする。たとえば、結合部位は、特定の相補的核酸標的にハイブリッドする合成オリゴヌクレオチドであってもよい。結合部位は、抗原にまたは任意のタンパク質−タンパク質相互作用に向かわせた抗体であってもよい。また、結合部位は、対応の標的に結合する多糖類であってもよい。一部の実施形態において、結合部位が別の結合部位に結合された場合、溶液中の酵素などの標的分子の基質として機能するように結合部位を設計または選択してもよい。結合部位は、たとえば、オリゴヌクレオチド結合部位、ポリペプチド結合部位、抗体結合部位、および多糖類結合部位を含む。

磁性ナノ粒子の合成
図２は、磁性ナノ粒子を製造するための例示的なプロセスを示すフローチャートである。図２に示すように、磁性ナノ粒子の製造は、ナノ粒子コア（ステップ２００）の形成からスタートしてもよい。ナノ粒子コアを製造するため、界面活性剤を含有する溶液の中で金属錯体を熱分解する。一部の実施形態において、反応により形成されるナノ粒子コアの酸化を避けるために、熱分解は無酸素環境（たとえば、真空または窒素環境下）で行われる。例として、１−オクタデセン（ＯＤＥ）とオレイルアミン（ＯＹ）界面活性剤との溶液を２５０℃まで加熱する。溶液の温度が安定したら、たとえばＦｅ（ＣＯ）_５のような金属錯体を溶液に添加し、攪拌する。Ｆｅの磁性ナノ粒子（鉄ＭＮＰ）のコアが形成され、溶液から析出する。次いで、この溶液を室温まで冷却する。他の金属錯体の例としては、Ｆｅ（ａｃａｃ）_２（ａｃａｃはアセチルアセトネートである）、Ｆｅ（ａｃａｃ）_３、コバルト錯体、およびニッケル錯体に限定されないがこれらを含む。他の界面活性剤の例としては、オレイルアミン、オレイン酸、およびアミンあるいはカルボン酸化学官能基を含有する他の化学物質に限定されないがこれらを含む。

ナノ粒子コアの大きさは、金属源と界面活性剤とのモル比に部分的に依存する。一部の実施形態において、金属源に対する界面活性剤のレベルを減少させると、その結果として粒径が増加する。たとえば、図３は、ＯＹと鉄金属錯体とを含有する溶液から製造したＦｅナノ粒子コアの画像を示している。図面には、一定の温度においてモル比（［Ｆｅ］：［ＯＹ］）を５：１から３５：１まで変化させた。モル比は５：１から１２：１に変更した場合、粒径の成長は約２ｎｍのみであった。モル比は１２：１を超えたら、粒径は約２ｎｍに安定した。

ナノ粒子コアの大きさは、ナノ粒子コアが形成される間の反応温度にも依存する。一部の実施形態において、反応が起こる温度を上げると粒径が増加する。たとえば、図４Ａ〜図４Ｆは、ＯＹと鉄金属錯体とを含有する溶液から製造したＦｅナノ粒子コアの画像を示めしている。図面には、一定のモル比（［Ｆｅ］：［ＯＹ］）においてナノ粒子コアが形成される間の反応温度を１４０℃から２６０℃まで変化させた。反応温度を１４０℃から２６０℃まで段階的に上昇させると、ナノ粒子コアの直径は約４．４ｎｍから約１４．５ｎｍに増加した。

図３および図４に示された例示的なナノ粒子コアの画像の各々において、ナノ粒子のコア材料が空気暴露およびその後の酸化により形成された自然の非晶質フェライト殻（ＦｅＯ）は目視できる。この自然の非晶質殻は、弱い磁気特性を有しまたは磁気特性を有さず、Ｆｅコアを非晶質酸化物に転換するように経時的に徐々に厚くなる可能性がある。例示されたナノ粒子の上記直径は、フェライト殻の体積を調整することによって推定された。図４Ｇは、反応温度に対して自然にできた酸化物殻を有するナノ粒子のコア径および自然にできた酸化物殻を有しないナノ粒子の推定コア径を示すグラフである。

再び図２を参照して、ナノ粒子コアの製造の次に、粒子コアの表面上に合成殻を形成する（ステップ２０２）。殻を製造するために、金属錯体を含有する別の溶液を調製し、磁性ナノ粒子コアを含有する溶液に添加してもよい。合成殻を製造する前に自然の非晶質フェライト殻の形成を防止するため、ナノ粒子コアを含有する溶液を無酸素環境（たとえば、真空下または主に窒素環境）に維持してもよい。次いで、混合された混合物をアニールしてナノ粒子コアの表面上にナノ粒子殻を形成してもよい。

例として、鉄ＭＮＰコアを含有する上記溶液とは別に、鉄−オレイン酸複合体の溶液を調製する。具体的には、Ｆｅ（ＣＯ）_５、オレイン酸（ＯＡ）およびＯＤＥを含有する溶液を調製してアニールする。好ましくは、空気のない環境下でアニールする。冷却後、この新しい溶液を、鉄ＭＮＰコアを含有する溶液に移す。その後、鉄ＭＮＰコアと金属錯体とを含有する混合物の温度を昇温して鉄ＭＮＰコアの周りに合成殻を形成する。具体的には、反応器をゆっくり加熱し、その温度を最適のアニーリング温度（たとえば、３００℃）まで上昇させ、Ｆｅコアおよび合成多結晶フェライト殻（Ｆｅ_３Ｏ_４）を有する鉄ＭＮＰを形成する。この鉄ＭＮＰにおいて、合成殻は超常磁性特性を示す。合成殻は、コアの酸化を防止する障壁として機能し、厚さが経時的に変化せず、一般的に安定している。混合物を冷却した後、超常磁性殻を有する磁性ナノ粒子を、たとえば遠心分離によって収集してもよい。

一部の実施形態において、磁性ナノ粒子の合成外殻を形成するプロセスは、追加の異なる金属錯体をＭＮＰコアを含有する溶液に添加してもよい。追加の異なる金属錯体は、その後に形成された磁性ナノ粒子の合成外殻に１つまたは複数のドーパントを与えることができる。上記ドーパントはＭＮＰの磁気特性（たとえば、磁気モーメント）を高めることができる。異なる金属錯体の１つまたは複数の組合せ（たとえば、Ｎｉ（ＣＯ）_４、Ｃｏ_２（ＣＯ）_８）を溶液に添加して、合成殻中に１つまたは複数のドーパントを形成してもよい。例として、鉄ＭＮＰコアおよび鉄金属錯体を含有する上記混合物を加熱する前に、Ｍｎ_２（ＣＯ）_１０をこの混合物に添加する。前述と同じく、反応器をゆっくり加熱し、その温度を最適のアニーリング温度（たとえば、３００℃）まで上昇させ、ＦｅコアおよびＭｎでドープされた合成多結晶フェライト殻（Ｆｅ_２Ｏ_４）を有する鉄ＭＮＰ（Ｆｅ＠ＭｎＦｅ_２Ｏ_４）を形成する。

一部の実施形態において、ＭＮＰをさらに処理して合成殻の上に表面被覆を形成してもよい（ステップ２０４）。この表面被覆はＭＮＰを結合部位に結合させるための官能基を含む。前述のように、表面被覆は官能化ポリマー被覆または官能化非ポリマー被覆を含んでもよい。一部の実施形態において、上記被覆は、ＭＮＰの湿潤性を増加または減少させることができる。ポリマー被覆または非ポリマー被覆は、特異的または非特異的部位に結合するための露出官能基を与えることができる。たとえば、このような官能基は、特異的または非特異的部位に結合するためのアミノ基、カルボキシル基、または他の活性基を含んでもよい。一部の実施形態において、結合部位は、特にアミノ基またはカルボキシ基に結合するアミノ末端、スルフヒドリル、またはリン酸基を有するオリゴヌクレオチドを含んでもよい。もう一つの方法として、結合部位を合成ＭＮＰの殻上に形成される官能化ポリマーを介して磁性ナノ粒子に付着させてもよい。以下、官能化および被覆されたナノ粒子を合成するための方法に係るさまざまな非限定的な例を説明する。

例として、非ポリマー被覆ＤＭＳＡを合成殻の表面上に形成することができる（たとえば、Albrecht et al.,Biochimie,80(5-6):379-90,1998参照）。ＤＭＳＡは、合成フェライト殻に結合され、露出官能基を与える。別の例として、ゴーマン方法（ＷＯ００／６１１９１参照）に従って、ＭＮＰ上にカルボキシ官能化表面被覆を合成することができる。この方法では、還元性のカルボキシメチル（ＣＭ）デキストランは市販のデキストランから合成される。ＣＭ−デキストランと鉄塩とを一緒に混合し、その後、水酸化アンモニウムを用いて中和する。得られたカルボキシ官能化されたナノ粒子は、アミノ官能化されたオリゴヌクレオチドを結合するために使用することができる。

別の例として、強塩基の中で多糖類被覆のＭＮＰをブロモ酸またはクロロ酢酸と反応させてカルボキシル基を付着させることにより、多糖類被覆のＭＮＰからカルボキシ官能化されたＭＮＰを製造してもよい。また、無水コハク酸または無水マレイン酸などの試薬を用いてアミノ官能化されたＭＮＰのアミノ基をカルボキシル基に変換することにより、アミノ官能化されたＭＮＰからカルボキシ官能化された粒子を製造してもよい。

別の例として、デキストランで被覆された磁性ナノ粒子を製造し、エピクロロヒドリンと架橋してもよい。添加されたアンモニアは、エポキシ基と反応してアミン基を生成する（たとえば、引用により本明細書に援用された米国出願公開第２００３０１２４１９４号および米国出願公開第２００３００９２０２９号、Hogemann, D., et al.,「Improvement of MRI probes to allow efficient detection of gene expression」,Bioconjug.Chem.,2000,11(6):941-6、およびJosephson et al.,「High-efficiency intracellular magnetic labeling with novel superparamagnetic-Tat peptide conjugates」,Bioconjug.Chem.,1999,10(2):186-91参照）。この材料は、架橋酸化鉄あるいは「ＣＬＩＯ」として知られている。アミンを用いて官能化されると、この材料はアミン−ＣＬＩＯまたはＮＨ_２−ＣＬＩＯと呼ばれる。

別の例として、エチレンジアミンまたはヘキサンジアミンのような水溶性のカルボジイミドおよびジアミンを用いて、カルボキシ官能化された磁性ナノ粒子をアミノ官能化された磁性粒子に転換してもよい。一部の実施形態では、使用のため、アビジンまたはストレプトアビジンは、オリゴヌクレオチドまたはポリペプチドのようなビオチン化された結合部位を経由してナノ粒子に付着させもよい（たとえば、Shen et al.,「Magnetically labeled secretin retains receptor affinity to pancreas acinar cells」,Bioconjug.Chem.,1996,7(3):311-6参照）。同様に、使用のため、ビオチンをアビジンに標識された結合部位を経由してナノ粒子に付着させてもよい。

ＭＮＰの特徴付け
ＭＮＰの特性はさまざまな技術を用いて特徴付けることができる。たとえば、ゼロ磁場冷却磁化曲線および磁場冷却磁化曲線を分析することによって、ＭＮＰの磁気特性を評価することができる。例として、Ｆｅ＠ＭｎＦｅ_２Ｏ_４磁性ナノ粒子を製造し、拡張Stoner-Wohlfarth磁化モデルを用いて評価を行った。このモデルは、同一かつ単一ドメインにランダムに配向しかつ互いに干渉しないナノ粒子全体の磁気挙動を説明するために開発された。以下に要約したように、我々は、Ｆｅ＠ＭＦｅ_２Ｏ_４粒子を有する実際の物理系統を反映するように、このモデルを拡張した。
・Ｆｅおよびフェライトの立体結晶磁気異方性の性質に適応させるために、我々はJoffeおよびHeubergerによって開発された枠組みを採用した。
・磁気モーメントの熱活性化磁化反転を可能にすることにより、磁化に与える熱活性化の影響を含めた。
・我々は、ＴＥＭ解析により得られた粒度分布関数を用いて、粒子全体の粒径のばらつきを説明した。

この方法を用いて、ナノ粒子コアが非ゼロ保磁力（Ｈ_ｃ＝３５０Ｏｅ）を有する安定した単一ドメインの挙動をとり、一方合成殻が典型的な超常磁性曲線に従っていることが判明した。ナノ粒子コアの保磁力に比べて、ＭＮＰの総磁化（すなわち、コアと殻の磁化の体積加重平均値）は、かなり低下した保磁力（Ｈ_ｃ＝４０Ｏｅ）を有していた。この例では、合成殻からの超常磁性寄与が飽和して低磁場におけるナノ粒子コアの比較的遅い磁化に打ち勝つ。逆に、高磁場においてナノ粒子コアから磁化への寄与が支配的になり、ＭＮＰの全体磁化を増加させる。他の技術、たとえばマイクロ磁気シミュレーションおよび核磁気緩和分散の測定をＭＮＰのさらなる特徴付けに使用することが可能である。

ＭＮＰの用途
磁性ナノ粒子は、生物学的に適合しかつ環境に敏感なセンサおよび／または分子造影剤として、薬を含むさまざまな応用に使用することができる。たとえば、ＭＮＰは、磁気共鳴に基づくセンサとして使用することができる。ここで、ＭＮＰは、水性（すなわち水を含有する）サンプル中の種々の分析物を検出するためのリモートセンサとして使用することができ、水性サンプル中の分析物の変化レベルを継続的に監視するために使用することもできる。ＭＮＰを水性液相に懸濁させまたは水性液相に懸濁可能にし、ＭＮＰの凝集状態を変更するために選択された１つ以上の結合部位と共有結合または非共有結合的に連結させ、そうでなければ表面上に選択された１つ以上の結合部位を固定させて、ＭＮＰを溶液中の分析物の有無または濃度の関数として使用することができる（たとえば、引用により本明細書に援用された米国出願公開第２００６０２６９９６５号参照）。

別の例として、標的分子を検出するため、ＭＮＰを凝集形成アッセイに用いることができる（たとえば、引用により本明細書に援用された米国出願公開第２００３００９２０２９号参照）。凝集体形成アッセイでは、共役体の集団（または標的分子もしくは一種の標的分子に向かわせた異なる結合部位を有する２つ以上の共役体集団の混合物）をサンプル溶液中に入れる。各共役体は、１つ以上の結合部位（たとえば、オリゴヌクレオチド、核酸、ポリペプチドまたは多糖類）を含む。その結合部位は、たとえば共有結合または非共有結合により磁気ナノ粒子、たとえば超常磁性ナノ粒子と結合している。結合部位は、標的分子（一部の実施形態において、アビジンのような凝集誘発分子）との特異的相互作用を引起こす。結合部位は、選択された標的分子、たとえば核酸、ポリペプチドまたは多糖類と特異的に結合する。その結果、共役体の分散状態が凝集状態に切替わり、水溶液中の隣接する水プロトンのスピン−スピン緩和時間（Ｔ２）が減少する。一部の実施形態において、ＭＮＰは、たとえばタンパク質のような標的分子の磁気分離に使用することができる。

別の例として、ＭＮＰは、標的分子を検出するために、凝集分散アッセイに用いることができる（たとえば、引用により本明細書に援用された米国出願公開第２００３００９２０２９号参照）。凝集分散アッセイでは、共役体を用いて小さな凝集体を調製して、得られた凝集体をサンプル溶液に入れる。このアッセイシステムでは、結合部位は、互いに結合する（またはアビジンのような特異的凝集誘発分子と結合する）ことによって凝集体を形成するように設計され、かつ、特異的標的分子によって切断される基質になる（または互いに結合するもしくは凝集誘発分子と結合することにより基質を形成する）ように設計される。サンプル溶液が標的分子を含有する場合、結合部位によって形成された基質が切断され、結果として凝集の溶解が発生する。したがって、凝集状態が分散状態に切り替わり、緩和時間Ｔ２が増加する。

共役体または凝集体を投与した後、これらのアッセイシステム中の凝集体を、生体外で、たとえばバイアルまたは２次元アレイあるいは３次元アレイなどで観察および検出することができ、生体内で被検体のＭＲイメージングを用いて凝集体を観察および検出することもできる。一部の応用において、ＭＮＰは、複数のナノ粒子の凝集を必要とせず、イメージングに使用することができる。上記用途のさらなる説明は、たとえば、米国特許第６８１８１９９号、第６２０３７７８号および第５７６６５７２号、Jae-Hyun Lee et al., Nature Medicine 13:95-99、およびDaniel L.J.Thorek Annals of Biomedical Engineering 2006,23-38に記載されている。

別の例として、ＭＮＰを癌細胞などの標的細胞と結合して磁気温熱療法に使用することができる。特に、共役ＭＮＰを、生体外または生体内の癌細胞または組織に与え、癌細胞／組織と結合することができる。一部の実施形態において、ＭＮＰはターゲティング部位を含む。ＭＮＰが全身注入されたときに、これらのターゲティング部位は、ＭＮＰを特定の癌細胞に結合させおよび／または被検体の身体の特定の部位に移動させる。たとえば、Maite Lewin et al., Nature Biotechnology,18:410-414、ＰＣＴ番号ＰＣＴ／ＫＲ０７／００９６１を参照する。その後、外部からの印加交流磁場（たとえば、１００ｋＨｚ）が結合したＭＮＰに印加され、印加された磁場に応じたＭＮＰの運動が熱エネルギーを増加させて標的細胞／組織を治療する。具体的には、熱エネルギーの増加によって癌細胞／組織破壊することができる。

別の例として、ＭＮＰをマグネトフェクション（Magnetofection）に使用することができる。マグネトフェクションにおいて、共役ＭＮＰは核酸などの標的分子に結合しており、その後、標的分子と結合したＭＮＰに磁場を印加してナノ粒子を１つまたは複数の標的細胞に意図的に導入および集中させる。その後、核酸は、以下のさまざまな異なるメカニズムによって細胞の細胞質中に放出することができる。このようなメカニズムは、たとえば、１）ＭＮＰに被覆され、エンドソーム浸透膨張、エンドソーム膜の破裂および細胞内の核酸の遊離を促進するカチオン性ポリマーにより生じたプロトンスポンジ効果、または、２）ＭＮＰに被覆され、細胞負脂質および電荷中和のフリップフロップによって核酸を細胞内に遊離させる陽イオン性脂質によるエンドソームの不安定化である。たとえば、米国特許第７６３５７３４号およびEric M Pridgen et al., Nanomedicine 2(5):669-680参照。

実施例
以下の実施例を用いて本発明をさらに説明する。これらの実施例は、特許請求の範囲に記載の本発明の範囲を限定するものではない。

実施例１：強磁性Ｆｅコア／超常磁性酸化鉄殻を有するナノ粒子の合成および特徴付け
まず、鉄ＭＮＰのコアを準備した。２５０ｍＬの３口丸底ガラスフラスコに、２０ｍＬのＯＤＥおよび０．３ｍＬのＯＹ（０．６４ｍｍｏｌ）を添加した。フラスコの異なる首に、コンデンサおよび熱電対を接続した。真空下、混合物を６０℃まで１時間加熱して、Ｎ_２ガスを充填してＯ_２を完全に排出した。この操作を２回繰返した。次いで、混合物を所望の温度（たとえば、１６ｎｍの鉄ＭＮＰコアの場合、２６０℃）に加熱した。温度が安定したら、激しく撹拌しながら、反応器にＦｅ（ＣＯ）_５（１．４ｍＬ、１０ｍｍｏｌ）を慎重に注入した。カルボニルが分解してナノ粒子が形成し始めたため、溶液はすぐに黒く変色した。溶液をこの高温およびＮ_２フロー状態で１時間維持して、その後室温に冷却した。

鉄のみのＭＮＰコアを形成している間に、マンガンおよび鉄−オレイン酸複合体を別に調製した。１００ｍＬの３口丸底フラスコに、Ｍｎ_２（ＣＯ）_１０（１５６ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ）、ＯＡ（２．３ｍＬ、７．２６ｍｍｏｌ）および１０ｍＬのＯＤＥを添加した。真空下、温度を６０℃に昇温して１時間が経ってからＮ_２フローを行った。この操作を２回以上繰返した。この無酸素溶液を１２０℃に加熱した後、Ｆｅ（ＣＯ）_５（０．２１ｍＬ、１．６１ｍｍｏｌ）を注入した。混合物を３０分間攪拌した。このプロセス中に溶液は黄色に変色した。しかしながら、温度が比較的低いため（１２０℃）、粒子は形成されなかった。金属−オレイン酸錯体を含有する溶液を室温に冷却した後、両頭針を用いて鉄のみのＭＮＰコアの溶液に慎重に移した。鉄のみのＭＮＰコアおよび金属−オレイン酸複合体の混合物を室温で３０分間攪拌した。その後、反応器の温度を５℃／分でゆっくりと昇温した。我々は、温度上昇時のナノ粒子の結晶性を監視し、フェライト殻形成に最適なアニーリング温度（３００℃）を決定した。温度が安定してから、混合物をさらに１時間攪拌した。反応終了後、溶液を室温まで冷却し、１５０ｍＬのイソプロパノール溶液（ＯＤＥ／イソプロパノール＝０．２Ｖ／Ｖ）を添加した。Ｆｅ＠ＭｎＦｅ_２Ｏ_４ＭＮＰを遠心分離（３０００ｒｐｍ、１５分間）により収集し、１０ｍＬのヘキサン中に分散させた。粒子を洗浄するために、粒子溶液に５０ｍＬのエタノールを添加し、混合物を遠心分離し、沈降物を１０ｍＬのヘキサンに再分散させた。余分の化学物質を確実に除去するために、これらの洗浄プロセスを３回繰り返した。

実施例２：コア／殻を有するナノ粒子の磁気特性
動的光散乱（Zetasizer Nano-ZS，Malvern）を用いて調製したナノ粒子の粒径を特徴付けた。さらに、透過型電子顕微鏡（TEM；JEOL 2100，JOEL USA）、X線粉末回折計（XRD；RU300，理学電機）および誘発結合プラズマ原子発光分光器（ICP-AES；Activa-S，HORIBA Jobin Yvon）をそれぞれ用いて、ナノ粒子の形状、構造および組成を特徴付けた。振動試料磁力計（EV-5，ADE Magnetics）および超伝導量子干渉装置（ＳＱＵＩＤ）磁力計（MPMS-5，Quantum Design）を用いて、ナノ粒子の磁気特性を分析した。

我々は、Ｆｅ＠ＭＦｅ_２Ｏ_４ＭＮＰの磁気特性を特徴付けた。比較分析のため、我々はまた、異なる粒径および組成を有するフェライトＭＮＰを合成した。すべての種類のＦｅコア粒子（Ｆｅ＠ＦｅＯおよびＦｅ＠ＭＦｅ_２Ｏ_４、Ｍ＝Ｆｅ、Ｃｏ、Ｍｎ）のＭｓは、フェライトＭＮＰのＭｓよりも大きかった。そのうち、Ｆｅ＠ＭＦｅ_２Ｏ_４が最大のＭｓを呈する。フェライト殻は、おそらくそれらの多結晶性質のため、バルク材料に比べて磁化が減少した。図５は、Ｆｅ＠ＭＦｅ_２Ｏ_４（Ｍ＝Ｆｅ、Ｃｏ、Ｍｎ）ＭＮＰのゼロ磁場冷却正規磁化および磁場冷却正規磁化をを示したグラフである。図面において、ピークが２つの異なる温度（ＴＢ１＞ＴＢ２）に表示されている。２つのピークはそれぞれ、Ｆｅコア（ＴＢ１）およびフェライト殻（ＴＢ２）における超常磁性の始まりを示す。ＦｅコアのＴＢ１≫２９０℃であり、室温でのコアの安定した強磁性の性質を示す。

図６ａ〜図６ｂは、Ｆｅ＠ＦｅＯＭＮＰおよびＦｅ＠ＭＦｅ_２Ｏ_４（Ｍ＝Ｆｅ、Ｃｏ、Ｍｎ）ＭＮＰの磁化曲線を示している。磁化曲線は、振動試料磁力計を用いてＴ＝３００Ｋで得られた。すべての測定は、粉末形態のＭＮＰに対して合成後の２時間で行われた。サンプル中のＭＮＰの数は、誘発結合プラズマ原子発光分光器（ＩＣＰＡＥＳ）を用いて定量した。まず、我々は、Ｆｅ＠ＦｅＯ磁性ナノ粒子（図６ａ）の磁気特性を分析した。ヒステリシス曲線により、１１ｎｍまでのＦｅコア径を有する粒子の超常磁性の性質を確認した。全体的に、大きくなるＦｅコア部につれて大きくなる粒子にＭｓがより多く増加することが観察された。殻のみのＭＮＰを用いて測定したＦｅＯ殻のＭｓは、比較的小さかった（８ｅｍｕ／ｇ［Ｆｅ］）。殻の寄与を補償した後、Ｆｅコアの推定Ｍｓは２０６ｅｍｕ／ｇ［Ｆｅ］（１１ｎｍコアの場合）であり、バルク材料の推定Ｍｓ（２１０ｅｍｕ／ｇ［Ｆｅ］）に近かった。

Ｆｅ＠ＭＦｅ_２Ｏ_４（Ｍ＝Ｆｅ、Ｃｏ、Ｍｎ）ＭＮＰの磁化曲線の各々は、無視できる残留磁気と同時に起きたヒステリシス損失の独特な特徴（図６ｂ）を示した。同じ大きさのＦｅコアを有するＭＮＰでは、全体磁化は、殻材料と同じＭｓ順（ＭｎＦｅ_２Ｏ_４＞Ｆｅ_３Ｏ_４＞ＣｏＦｅ_２Ｏ_４）に従った。よって、この傾向は、フェライト殻を金属ドーピングすることにより粒子の全体Ｍｓを増加させるための我々の手法を検証するのに役立つ。表１は、異なる種類のＭＮＰの全体Ｍｓ、酸化物殻のＭｓ、および全体Ｍｓへの殻の寄与を示している。フェライトのみのＭＮＰがコア／殻構造を有しないため、それらのナノ粒子の全体Ｍｓおよび酸化鉄のＭｓの間には差がない。各種類のＭＮＰのＭｓは、３００Ｋの温度およびＨｅｘｔ＝ｌ０ｋＯｅの外部磁場強度で測定された。測定されたナノ粒子の全体直径は約１６ｎｍであった。おそらく殻のマルチドメイン性質のため、フェライト殻の推定ＭｓはフェライトのみのＭＮＰの推定Ｍｓより小さい。

さらなる分析のため、非ゼロ温度および立体結晶磁気異方性の影響を含む拡張Stoner-Wohlfarth磁化モデルを用いてＦｅ＠ＭＦｅ_２Ｏ_４ＭＮＰの磁気特性を計算した。この模擬結果によると、殻（Ｍ_{ｓｈｅｌｌ}）の磁化は典型的な超常磁性曲線に従い、一方コア部分（Ｍ_ｃｏｒｅ）は非ゼロ保磁力（Ｈ_ｃ＝３５０Ｏｅ）を有する安定した単一ドメインの挙動を呈した。しかしながら、（Ｍ_{ｓｈｅｌｌ}からの）超常磁性寄与がすぐに飽和して低磁場におけるコアの比較的遅い磁化に打ち勝つため、粒子の総磁化（Ｍ_ｔｏｔ）およびＭ_ｃｏｒｅとＭ_{ｓｈｅｌｌ}との体積加重平均値は、かなり低くなった保磁力を（Ｈ_ｃ＝４０Ｏｅ）を有した。そして、高磁場においてコアの寄与（Ｍ_ｃｏｒｅ）が支配的になり、全体Ｍ_ｔｏｔを増加させる。

実施例３：磁化の数値シミュレーション
Ｆｅ＠ＭｎＦｅ_２Ｏ_４のマイクロマグネティックシミュレーションはさらに仮定磁化メカニズムを確証した。外部磁場（Ｈ_ｅｘｔ）が存在しない状態およびＴ＝３００Ｋで、Ｆｅコアの磁化ベクトルは渦状態を形成した。これは、磁化の熱反転に耐えられる強い交換カップリングを示した。粒子の殻において、ベクターはランダムに指向しており、超常磁性の性質を示している。これらの形態は、室温でＦｅコアに高ＴＢ１および殻にはるかに低いＴＢ２を示したゼロ磁場冷却磁化測定および磁場冷却磁化測定と定性的に一致した。非ゼロの電界強度では、磁気モーメントの整列が経路依存的であって、ヒステリシスループにつながった。フェライトのＭＮＰと同様のシミュレーションはヒステリシスを示さず、Ｈ_ｅｘｔ＝０のとき、磁化ベクトルが熱エネルギーによってランダムになった。

次いで、我々はＦｅコアＭＮＰの横緩和（ｒ_２）を特徴付けた。ＭｓおよびＭＮＰの粒径（ｄ）がｒ_２に与えた影響をさらに詳しく調べるために、我々はまた、異なる直径のフェライト（Ｆｅ_３Ｏ_４）ＭＮＰを準備した。図７は異なるＭＮＰのｒ_２値の比較図である。これらのｒ_２値は、ラーモア周波数ｆ０（＝ω０／２π）＝２０ＭＨｚおよびＴ＝３００Ｋで測定された。フェライトＭＮＰの中で、ｒ_２値は粒径（ｄ）の増加に上昇した。一定粒径（ｄ＝１６ｎｍ）の粒子に対して、ｒ_２値はＭｓに比例しており、よって、ＦｅコアＭＮＰはフェライト系粒子に比べてより高いｒ_２値を有した。Ｆｅ＠ＭｎＦｅ_２Ｏ_４ＭＮＰは、最大のＭｓを有するため、最高のｒ_２値を呈した。Ｆｅ_３Ｏ_４ナノ粒子または架橋酸化鉄（ＣＬＩＯ）ナノ粒子によって増強したｒ_２値は、それぞれ２倍以上および３００倍以上となった。我々はさらに、ｒ_２計算時に水拡散を考慮する外圏モデルを用いてＭＮＰのｒ_２の挙動を分析した。一言で言えば、粒径が十分に小さい際に、水分子の拡散運動がＭＮＰから磁場を平均化するのに十分速い。この状態のｒ_２は〜ｄ^２・Ｍｓである。実際に観測されたｒ_２値は理論値と非常に適合している。このことは、１）粒径及び磁化を増加することによってｒ_２を増強する手法を実証し、２）ＭＮＰが凝集することなく運動によって平均化された状態に十分に分散されたことを検証した（Ｆｅ＠ＭｎＦｅ_２Ｏ_４の場合、ｄが２３ｎｍ未満）。

Ｆｅ＠ＭＦｅ_２Ｏ_４ＭＮＰの独特な磁気特性を理解するため、我々は２つの異なるレベルの磁気シミュレーションを行った。

・熱活性化磁化反転の影響を探究することを含め、ＭＮＰの全体に対してヒステリシスループを計算した。

・マイクロマグネティックシミュレーションを介して、単一粒子における磁化ベクトルの形態を分析した。

結果は、Ｆｅ＠ＭＦｅ_２Ｏ_４ＭＮＰ中の新たな磁化メカニズムを明らかにした。このメカニズムにおいて、Ｆｅコア（直径＝１２ｎｍ）は相当の保磁力を持つ単一ドメインおよび強磁性挙動を示す一方、フェライト殻は、超常磁性の性質を有し、低外部磁界（Ｈｅｘｔ）に容易に磁化される。これら２つの構成成分（コアと殻）が一緒に結合されると、殻が低Ｈｅｘｔで初期磁化されるため保磁力は減少されるが、より高いＨｅｘｔでコアに関連するヒステリシス損失は保持されている。したがって、提案されたモデルは、温度および外部磁場依存磁化におけるＦｅ＠ＭＦｅ_２Ｏ_４ＭＮＰから観察された磁気挙動を説明した。

実施例４：表面修飾およびビオチンまたは抗体との共役
１０ｍＬのクロロホルムにＦｅ＠ＭｎＦｅ_２Ｏ_４ＭＮＰを懸濁し、５０mＬのトリエチルアミンを添加した。１０ｍｌのＤＭＳＯに含有されたＤＭＳＡ（５０ｍｇ）をナノ粒子溶液に注入した。混合物を徐々に異質になるまで、４０℃で６時間振とうした。そして、この混合物を遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分間）によって沈降させた。沈降物をエタノールで慎重に洗浄し、余分のＤＭＳＡを除去して、ホモジナイザーを用いて１０ｍＬのエタノール中に分散させた。このナノ粒子−エタノール溶液に、１０ｍＬのＤＭＳＯに含有されたＤＭＳＡ（５０ｍｇ）を再度添加してから、すべてのプロセスを繰返した。最終沈降物を５０ｍＬのＨ_２Ｏに分散させた。最後に、ＤＭＳＡ処理したナノ粒子をスルフヒドリル（−ＳＨ）および非結合カルボン酸を用いて終端した。両方の化学官能基は、特定のターゲティング部位と共役させるために使用することができる。エルマン試薬（Pierce Biotechnology）を用いて決定された１ナノ粒子当たりのスルフヒドリル基の数は約５０であった。ＤＭＳＥ処理したＦｅ＠ＭｎＦｅ_２Ｏ_４ＭＮＰを（＋）ビオチン−ヒドラジド（Aldrich）と共役させるために、Ｆｅ＠ＭｎＦｅ_２Ｏ_４ＭＮＰにカルボン酸を用いてアミド結合を形成し、ビオチンにＮＨＳ／ＥＤＣ化学反応を用いてアミン基を形成した。

ＤＭＳＡ処理したＦｅ＠ＭｎＦｅ_２Ｏ_４ＭＮＰ（２５ｍｇ）を１０ｍＬのＨ_２Ｏの中に分散させてから、ＮＨＳ（３．５ｍｇ）、ＥＤＣ（５ｍｇ）およびビオチン（１ｍｇ）を添加した。混合物を室温で３時間振とうした。次いで、共役したＦｅ＠ＭｎＦｅ_２Ｏ_４ＭＮＰは沈降させられ（１２０００ｒｐｍ、２０分間）、Ｈ_２Ｏで３回洗浄した。抗体と共役させるため、まず、マレイミド官能基を付着させることによって抗体をチオールに対して活性になるようにした。次いで、抗体（Anti-Her2/neu：ハーセプチン、６ｍｇ／ｍＬ）を１ｍＬのＰＢＳ緩衝液中に溶解して、０．１ＭのＮａＨＣＯ_３および１ｍｇのスルホ−ＳＭＣＣを加えることによってｐＨを８．２に調整した。混合物を３７℃で３０分間培養した。その後、このマレイミド活性な抗体を、ＰＤ−１０脱塩カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を用いて精製してから、直ちにＤＭＳＡ処理したナノ粒子（５ｍｇ／ｍＬ）と混合した。混合物を４℃で６時間振とうしてから、セファデックスＧ−１００（ＤＮＡグレード、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を用いて精製した。ビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡタンパク質アッセイキット、Pierce Biotechnology）を用いて決定された１ナノ粒子当たりの抗体の数は約１０であった。

実施例５：ＭＮＰの表面修飾および細胞毒性試験
上記のように合成した疎水性のＦｅ＠ＭｎＦｅ_２Ｏ_４ＭＮＰを水性の緩衝物に転換させるため、我々は、配位子交換により２，３−ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）を用いて粒子表面を修飾した。ＤＭＳＡは、２つのカルボン酸基（−ＣＯＯＨ）と２つのスルフヒドリル基（−ＳＨ）を含有している。ＭＮＰと混合すると、カルボン酸はまず、Ｆｅ＠ＭｎＦｅ_２Ｏ_４ＭＮＰの表面と直接キレート結合を形成する。図８は、ターゲティング部位と共役するため、ＤＭＳＡで被覆したＦｅ＠ＭｎＦｅ_２Ｏ_４を示す概略図である。このＤＭＳＡ被覆は、ＤＭＳＡ分子の分子間ジスルフィド架橋によって安定化される。この方法を採用することにより、Ｆｅ＠ＭｎＦｅ_２Ｏ_４ＭＮＰを確実に水溶性にすることができる。

ターゲティング部位を粒子に共役させるために、我々は、端末スルフヒドリル官能基またはカルボン酸官能基を利用した。たとえば、ＮＨＳ／ＥＤＣ化学品（Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド：ＮＨＳ、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−（ジメチルアミノ）プロピル）カルボジイミド：ＥＤＣ）を用いてビオチン分子をＤＭＳＡのカルボン酸基に結合させることができる。別にマレイミド官能基で修飾された抗体を、ジスルフィド結合（セクションＶＩＩＩ）を介してスルフヒドリル基に共役させた。その後、我々は、ＤＭＳＡ被覆のＦｅ＠ＭｎＦｅ_２Ｏ_４ＭＮＰに付随する潜在的な細胞毒性について試験を行った。正常細胞（３Ｔ３線維芽細胞）および癌細胞（ＨＣＴ１１６）を２４時間培養してから、異なる量のＭＮＰを導入した。その後、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）臭化物アッセイ（セクションＶＩＩ参照）に従って細胞生存率を分析した。急性細胞毒性効果は観察されなかったので、ＤＭＳＡ被覆および磁気材料両方の生体適合性を確認した。

実施例６：アビジン滴定および細胞アッセイを含む生物学的応用の実証
Ｆｅ＠ＭＦｅ_２Ｏ_４ＭＮＰの生物学的応用を実証するため、我々は粒子を使用して、ＮＭＲに基づく診断プラットフォーム（診断磁気共鳴：ＤＭＲ）で生物学的マーカーを感知した。サンプル中の検出標的がＭＮＰによって認識される場合、ＤＭＲの感度は横緩和時間（ΔΤ２）の変化に依存する。分子標的（たとえばたんぱく質）の場合、ＤＭＲのアッセイは、ＭＮＰが標的分子に架橋され、ナノスケールのクラスタを形成する磁気緩和スイッチングという現象を採用する。大きな被検体（たとえば、細菌、哺乳動物の細胞）の場合、標的をＭＮＰで標識し、結合していない粒子を測定前に排除する。両方のアッセイ構成では、検出感度がＭＮＰのｒ_２値に比例した。

まず、我々はビオチン−アビジン相互作用をモデルとして用いて、分子検出時にＦｅ＠ＭＦｅ_２Ｏ_４ＭＮＰの感知能力を評価した。ビオチン化されたＭＮＰの滴定実験は、アビジン用量に依存するＴ２の変化を示した。図９は、アビジン濃度に対していくつかの種類のナノ粒子の正規化されたΔＴ_２を示すグラフである。他の種類のＭＮＰに比べて、Ｆｅ＠ＭｎＦｅ_２Ｏ_４は約１．５ｐＭのアビジンを検出したので、最高の感度を示した。ＤＭＲアッセイはＥＬＩＳＡと同等の感度を有する上に、はるかに小さいサンプル（約１mｌ）およびはるかに短いアッセイ時間（３０分未満）を必要とするという付加的な利点も有する。

アビジン滴定：アビジン（ImmunoPure Avidin＃２１１２１；Pierce Biotechnology）をＰＢＳに溶解させた。さまざまな量のアビジンをビオチン化Ｆｅ＠ＭｎＦｅ_２Ｏ_４ＭＮＰに混合してサンプルを調製した。３７℃で１５分間培養後、１mＬのサンプルに対して、「細胞の検出と分子解析用チップ−ＮＭＲバイオセンサー」（Lee et al., Nat. Med. 14, pp. 869-874(2008)）に報告され小型化された核磁気共鳴（ＮＭＲ）システムを用いてサンプルのＴ２値を測定した。以下のパラメータでCarr-Purcell-Meiboom-Gill（CPMG）のパルス系列を使用した：エコー時間（ＴＥ）＝４ｍｓｅｃ、繰返し時間（ＴＲ）＝６ｓｅｃ、１回のスキャン当たりの１８０°パルス数＝５００、およびスキャン数＝８。参考として、アビジンなしのサンプルのＴ２値を用いてΔΤ２を算出した。すべての測定が３組で行われ、データを平均±標準誤差で表示した。

細胞検出のために、我々は、腫瘍マーカー（ＨＥＲ２）を標的とする抗体に共役されたＭＮＰを用いて癌細胞（ＳｋＢｒ３）をタグ付けした。ＭＮＰの培養後、細胞濃度当たりの緩和率（１／Ｔ２）として定義されている細胞緩和能がＭＮＰのｒ２に比例することが判明した。図１０Ａは、いくつかの種類のＭＮＰの細胞濃度当たりの緩和率を示すグラフである。それ故、Ｆｅ＠ＭｎＦｅ_２Ｏ_４が最も顕著なΔΤ２を出しており、単一細胞のレベルに近い標的検出を可能にした。図１０Ｂは、細胞濃度に対してＦｅ＠ＭｎＦｅ_２Ｏ_４ＭＮＰの正規化されたΔＴ２を示すグラフである。

人間のＳｋＢｒ３乳癌細胞をベンダ推奨の培地で培養し、５％ＣＯ_２含有加湿空気の雰囲気中で３７℃に維持した。合流点で、細胞をＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体と共役したＦｅ＠ＭｎＦｅ_２Ｏ_４ＭＮＰとともに３７℃で１０分間培養した。参照サンプルを標的化せずに調製した。すべてのサンプルを遠心分離（１０００ｒｐｍ、５分間）を用いて３回洗浄して、ＰＢＳに再懸濁して、連続的に希釈した。サンプル中の細胞濃度を血球計を用いて測定した。上記と同様の小型化されたＮＭＲシステムおよびパルス系列（前述）を用いてＴ２の測定値を得た。

実施例７：磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）
ＭＲＩ造影剤として使用されるＦｅ＠ＭＦｅ_２Ｏ_４ＭＮＰを評価した。ファントムの比較研究は、Ｆｅ＠ＭｎＦｅ_２Ｏ_４の使用がコントラストを増強することを確証した。たとえば、広く使用されているＣＬＩＯナノ粒子に比べて、Ｆｅ＠ＭｎＦｅ_２Ｏ_４は約１０倍低い用量で同じ信号変化を生成することができた。我々はまた、生体内イメージング研究における予備試験を行った。我々は、同じ金属用量（１０ｍｇ［金属］／ｋｇ）を保ちながら、マウスにさまざまなＭＮＰ（架橋酸化鉄（ＣＬＩＯ）、Ｆｅ_３Ｏ_４およびＦｅ＠ＭｎＦｅ_２Ｏ_４）を静脈注射した。次に、７ＴＭＲＩ装置（Pharmascan，Bruker社）を用いて、異なる時点でＴ２加重の画像を得た。注射３時間後に撮影した画像は、コントラスト増強が実際に各種類のＭＮＰのｒ_２値に比例することを証明した。

図１１Ａは、ＭＮＰを注入する前の臓器のＭＲＩ画像である。図１１Ｂ〜図１１Ｄは、異なるＭＮＰを注入した後の臓器のＭＲＩ画像である。画像内の文字「Ｌ」は肝臓の位置を表し、画像内の文字「Ｋ」は腎臓の位置を表す。Ｆｅ＠ＭｎＦｅ_２Ｏ_４ＭＮＰ（図１１Ｄ）は最も暗い暗色をもたらしたので、有効的造影剤としてＦｅ＠ＭｎＦｅ_２Ｏ_４ＭＮＰの潜在的な有用性を裏付けた。食細胞を含む臓器、たとえば肝臓、脾臓、骨髄において、ピーク信号の変化が静脈投与後３時間程度で発生した。このことは、１時間の血中半減期と一致した。初期の時点では、腎臓を含むほとんどの臓器が血管潅流に起因するかなり暗い暗色を示した。これらの変化は２４時間以内にすべて基準値に戻った。

４．７Ｔおよび７．０Ｔのスキャナ（Ｂｒｕｋｅｒ）および鳥籠設計を有するボリュームコイル（Rapid Biomedical、ドイツ）を用いてイメージング研究を行った。ｒ２を決定するために、異なる金属濃度のＦｅ＠ＭｎＦｅ_２Ｏ_４ＭＮＰからなるファントムを用意して、Ｔ２値を次のスピンエコーパラメータを用いて測定した：ＴＥ＝１０ｍｓｅｃ、ＴＲ＝２０００ｍｓｅｃ、マトリックス＝２５６×２５６、１回のスキャン当たりの１８０°パルス数＝１６。マウスを撮影するために、尾静脈からＦｅ＠ＭｎＦｅ_２Ｏ_４ＭＮＰ（ＰＢＳ中）を１０ｍｇ［金属］／ｋｇの金属用量で静脈内注射した。Ｎ_２ＯおよびＯ_２（７：３）混合ガス中のイソフルラン（５％で誘発、１．５％で維持）を用いてそのマウスを麻酔した。次のパラメータを使用してＴ２加重の画像を得た：ＴＥ＝３６ｍｓｅｃ、ＴＲ＝２４２０ｍｓｅｃ、フリップ角＝９０°、マトリックス＝１２８×１２８、視野＝４×４ｃｍ^２、スライス厚さ＝１ｍｍ。

他の実施形態
なお、本発明をその詳細な説明と併せて説明したが、前述の説明は本発明の範囲を例示するものであって、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定しないことを意図していることを理解すべきであろう。他の局面、利点、および変形は、添付の特許請求の範囲内に含まれる。

Claims

強磁性コアと、前記磁性コアを囲む超常磁性殻とを含むナノ粒子。
前記ナノ粒子は約２ｎｍ以上の直径を有する、請求項１に記載のナノ粒子。
内部にある前記強磁性コアは約１ｎｍ〜約１５ｎｍの範囲におけるコア径を有する、請求項１に記載のナノ粒子。
前記超常磁性殻は約０．１ｎｍ以上の厚さを有する、請求項１に記載のナノ粒子。
前記強磁性コアはＦｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、ＦｅＰｔまたはＳｍＣｏを含む、請求項１に記載のナノ粒子。
前記超常磁性殻は磁性材料の酸化物を含む、請求項１に記載のナノ粒子。
前記超常磁性殻はドーパント材料を含む、請求項１に記載のナノ粒子。
前記ドーパントは、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｎｉ、ＺｎおよびＺｎＭｎからなる群より選択される金属を含む、請求項７に記載のナノ粒子。
前記ナノ粒子はさらに前記超常磁性殻上にある被覆を含み、前記被覆は前記ナノ粒子の水溶性を増加させるように構成される、請求項１に記載のナノ粒子。
前記被覆は、２，３‐ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）を含む、請求項９に記載のナノ粒子。
前記ナノ粒子はさらに前記超常磁性殻上にある被覆を含み、前記被覆は前記ナノ粒子を標的分子に結合させるように構成される、請求項１に記載のナノ粒子。
さらに前記超常磁性殻上にあるデキストランポリマー被覆を含む、請求項１に記載のナノ粒子。
ナノ粒子を形成する方法であって、
１つ以上の強磁性ナノ粒子コアを形成するステップと、
前記１つ以上の強磁性ナノ粒子コアの各々の上に超常磁性殻を形成するステップとを含む、ナノ粒子を形成する方法。
前記強磁性ナノ粒子の形成は、
第１溶液中で金属錯体と界面活性剤とを混合するステップと、
前記第１溶液をアニーリングして、金属錯体を熱分解させ、前記第１溶液中で前記１つ以上の強磁性ナノ粒子コアを形成するステップとを含む、請求項１３に記載の方法。
前記１つ以上の強磁性ナノ粒子コアの各々の上に前記超常磁性殻を形成するステップは、
前記第１溶液をアニーリングするステップの後、前記第１溶液に１つ以上のオレイン酸金属塩複合体を混合し、第２溶液を形成するステップと、
前記第２溶液をアニーリングして、前記１つ以上の強磁性ナノ粒子殻の上に前記超常磁性殻を形成するステップとを含む、請求項１４に記載の方法。
被検体において標的分子の有無を判断する方法であって、
前記被検体にナノ粒子を投与するステップを含み、前記ナノ粒子は、強磁性コアと、超常磁性殻と、前記超常磁性殻上にあってかつ前記標的分子に特異的に結合するターゲティング部位とを有し、
前記標的分子に前記ナノ粒子を結合させるための十分な時間を与えるステップと、
前記被検体の磁気共鳴画像を生成するステップとを含み、前記画像における信号は前記標的分子の存在を示す、方法。
治療方法であって、
前記被検体にナノ粒子を投与するステップを含み、前記ナノ粒子は、強磁性コアと、超常磁性殻と、前記超常磁性殻上にあってかつ前記被検体の標的細胞に特異的に結合する被覆とを有し、
前記ナノ粒子を前記標的細胞に結合させるための十分な時間を与えるステップと、
前記被検体に交流電磁場を印加して前記標的細胞を治療するステップとを含む、治療方法。
前記超常磁性殻は酸化鉄を含む、請求項１に記載のナノ粒子。