JP7015306B2 - 光誘発性ウイルス療法の遠隔制御 - Google Patents
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Description
本明細書に記載の磁性ウイルス粒子は、酸化鉄ナノ粒子のような磁性粒子に付着した任意のウイルス粒子であってもよい。いくつかの場合において、ウイルス粒子は、ウイルス遺伝物質(例えば、ウイルスの種類に応じるDNAまたはRNA)を封入したウイルスタンパク質を含有してもよく、これは、ウイルス粒子の集合を容易にすることができる。当該ウイルス遺伝物質としては、野生型対応物に比べて、本明細書に記載の方法に使用されるウイルス粒子が自己複製することができないような、欠陥があるものであることが好ましい。さらに、当該ウイルス粒子は、天然の宿主細胞に感染することができないように修飾されてもよく、例えば、細胞受容体との相互作用に関与するウイルスタンパク質に欠陥がある。あるいは、本明細書に記載のウイルス粒子は、ウイルス遺伝物質を含まない。このようなウイルス粒子は、ウイルス様粒子(VLP)としても知られており、当技術分野において公知の方法によって調製することができる。当該ウイルス粒子は、適切なウイルス起源に由来することができる。いくつかの実施形態において、ウイルス粒子は、レンチウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルスに由来する。
MGSEGGPALFQSDMTFKIFIDGEVNGQKFTIVADGSSKFPHGDFNVHAVCETGKLPMSWKPICHLIQYGEPFFARYPDGISHFAQECFPEGLSIDRTVRFENDGTMTSHHTYELDDTCVVSRITVNCDGFQPDGPIMRDQLVDILPNETHMFPHGPNAVRQLAFIGFTTADGGLMMGHFDSKMTFNGSRAIEIPGPHFVTIITKQMRDTSDKRDHVCQREVAYAHSVPRITSAIGSDED
(配列番号1)
磁性ウイルス粒子は、磁場によって標的化されることができ、または、磁気温熱療法に使用されることができる(Chan(2005); Ito(2005))。1つ以上の光増感剤を担持する任意の磁性ウイルス粒子は、磁場によって所望の部位(例えば、腫瘍部位)に標的化されることができる。光増感剤は、光を照射すると、細胞傷害剤を生成し、それは所望の部位で腫瘍細胞のような罹患細胞を殺すことができる。
本開示は、癌のような疾患細胞が関与する疾患/障害の治療に使用されるキットをも提供する。このようなキットは、少なくとも1つの光増感剤を担持する本明細書に記載の磁性ウイルス粒子のいずれかを含む、1つ以上の容器を含むことができる。
本発明の実施は、他に示さない限り、当該分野の技術の範囲内にある分子生物学(組換え技術を含む)、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の技術を使用する。このような技術は、例えば、Molecular Cloning:A Laboratory Manual, second edition(Sambrookら、1989)Cold Spring Harbor Press、Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait,ed.,1984)、Methods in Molecular Biology,Humana Press; Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis,ed.,1998)Academic Press、Animal Cell Culture(R.I.Freshney,ed.,1987)、Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather and P.E.Roberts,1998)Plenum Press、Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths,and D.G.Newell,eds.,1993-8)J.Wiley and Sons、Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.)、Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir and C.C.Blackwell,eds.)、Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller and M.P.Calos,eds.,1987)、Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubelら、eds.,1987)、PCR: The Polymerase Chain Reaction(Mullisら、eds.,1994)、Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan et al.,eds.,1991)、Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons,1999)、Immunobiology(C.A.Janeway and P.Travers,1997)、Antibodies(P.Finch,1997)、Antibodies: a practical approach(D.Catty.,ed.,IRL Press,1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach(P.Shepherd and C.Dean,eds.,Oxford University Press,2000)、 Using antibodies:a laboratory manual(E.Harlow and D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)、The Antibodies(M.Zanetti and J.D.Capra,eds.,Harwood Academic Publishers,1995)などの文献に十分に説明されている。
材料と細胞培養
カルボン酸を有する酸化鉄ナノ粒子(ロット番号:051413A、サイズ:5nm、ゼータ電位:-30mV~-50mV)は、Ocean NanoTech(San Diego、CA)から購入した。(1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩)(EDC)、N-ヒドロキシスルホスクシンイミド(Sulfo-NHS)、および2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)緩衝食塩水は、Thermo Scientific Inc.(Rockford、IL)から購入した。リン酸緩衝生理食塩水(PBS)は、Sigma Co.(St.Louis、MO)から購入した。分岐ポリエチレンイミン(PEI、Mw=25,000)は、Aldrich(ミルウォーキー、MI)から購入した。pKillerRed-dMitoのプラスミドDNAは、Evrogen JSC(Moscow、Russia)から購入した。ウイルス(AAV2-ルシフェラーゼ)およびpHelper、pAAV-RC2、pAAV-GFP、およびpAAV-MCSのプラスミドDNAは、Cell Biolabs(San Diego、CA)から購入した。プラスミドpAAV-KillerRedは、以下のようにして構築した。まず、以下のプライマー配列:5'-GGCGAATTCGCCACCATGGGTTCAGAGGGCGGCCCCGCCC-3'(配列番号5)および5'-ACGCGTCGACTTAATCCTCGTCGCTACCGATGGCGCTGGT-3'(配列番号2)を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用することにより、pKillerRed-dMitoからのKillerRedフラグメントにEcoRIおよびSalI部位を付加した。次いで、PCRで生成したKillerRed cDNA(0.71kb)をpAAV-MCSのEcoRI-Sall部位にクローニングして、pAAV-KillerRedを得た(図3Aおよび図8)。
AAV-2ヘルパーフリー包装システム(Cell Biolabs)を用いて、AAV2-GFPまたはAV2-KillerRedの生産を行った。簡単に説明すると、AAV2レポーターは、293T細胞において、プラスミドDNA(pHelper、pAAV-RC2、およびpAAVトランスジーン)のPEI媒介同時トランスフェクションにより、産生された。各100mm皿について、293T細胞を20μgのpHelper、10μgのpAAV-RC2およびpAAV-GFP(またはpAAV-KillerRed)でトランスフェクトした。3つのプラスミドDNAを無血清培地に40μgのPEIと混合し、次いで、ボルテックス混合により、30~60秒間徹底的に混合し、少なくとも20~30分間放置した。トランスフェクション時間は30分間だけ行った。トランスフェクションの3日間後に、トランスフェクションした細胞を採取した。ウイルス形質導入のために、ViraBind(商標)AAV精製キット(Cell Biolabs)およびQuickTiter(商標)AAV定量キット(Cell Biolabs)のプロトコールに従って、AAV2-GFPまたはAAV2-KillerRedの精製および滴定を行った。ウイルス生産の各バッチ(8×100mmディッシュ)について、AAV2-GFPまたはAAV2-KillerRedストックのミリリットル当たりのゲノムコピー数(GC)は、1011~1012の範囲であった。精製ウイルスを使用するまで-80℃で保存した。
鉄化AAV2は、化学共役の手順に従って調製された(図1B)。MES緩衝食塩水中に、カルボン酸を有する酸化鉄ナノ粒子(25μg、0.1725nmol)、EDC(0.1725、0.865、1.73、3.46、4.325、8.65または17.3nmol)を含有する反応混合物を調製し、混合物にSulfo-NHSを穏やかに添加しながら25℃で15分間撹拌し、アミン反応性Sulfo-NHSエステルを有する酸化鉄ナノ粒子の均一溶液を得た。PBS中のAAV2ストック(0.5μL、1×1012GC mL-1)を混合物に滴下して加えた後、25℃の一定温度で120分間反応させた。化学的共役プロセスの後、黄色溶液を、PBSで平衡化されPBSに溶媒交換されたサイズ脱塩カラム(分子量カットオフ:100K)を用いて精製した(図9)。精製工程の後、AAV2-KillerRed用のプライマー配列:5'-GCCCATGAGCTGGAAGCC-3'(配列番号3)および5'-CGATGGCGCTGGTGATGC-3'(配列番号4)を用いたPCRを使用することにより、~90%の再リサイクル収率が得られた(図10)。得られたAAV2-KillerRedのPCR断片は、予想サイズ539bpと一致した。
ウイルス感染および形質導入のすべての実験は、10%FBS、100U mL-1ペニシリンおよび100μg mL-1ストレプトマイシンを含む培地を使用した。磁場を用いずに、鉄イオン化ウイルスまたは非鉄イオン化ウイルスの形質導入能力を測定するために、AAV2-GFP(緑色蛍光タンパク質)をシグナル指標として使用した。HEK293細胞を24ウェルプレートに1×105細胞 ウェル-1で播種し、翌日感染させた。様々なモル比のナノ粒子/EDCおよびAAV2-GFPのみの鉄化AAV2の試験サンプルを、それぞれ、10%FBSを含むDMEM中の細胞に添加し、6日間形質導入させた。
7×104個のHEK293細胞を24ウェルプレートの各ウェルに播種し、培地を12時間供給した。次いで、細胞を、異なるモル比のナノ粒子/EDCで試験鉄化AAV2に曝露し、pH7.4で24時間インキュベートした。24時間インキュベートした後、試験サンプルを含有するトランスフェクション培地を除去した。さらに、酸化鉄ナノ粒子またはAAV2は、pH7.4で24時間インキュベートしただけであった。CellTiter 96(商標)AQueous one solution細胞増殖アッセイシステム(Promega、Madison、WI、USA)を用いて、以前の研究に従って細胞増殖を決定した。490nmにおけるホルマザンの13,16光学密度(O.D.)は、細胞生存率を定量化した。この試薬は、テトラゾリウム化合物3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-5-(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム、分子内塩(MTS)を含有し、未処理細胞によって達成されたMTSの減少は100%に設定し、試験細胞のそれは未処理細胞の百分率として表した。
図1Eおよび図1Fの結果からわかるように、以下のインビトロおよびインビボ試験のために、鉄化ウイルスを最適化するためのナノ粒子/EDCのモル比が1/20である鉄化AAV2が選択された。HEK293細胞を、2.5×105細胞 ウェル-1で35mm皿に播種し、翌日感染させた。鉄化AAV2またはAAV2のみの試験サンプルを、10%FBSを含むDMEM中の細胞とインキュベートし、1,500μm直径を有する外部磁場(2,000~2,200ガウス)の異なるタイムコース(0、5、10、または30分)で分析した。続いて、サンプルを4%パラホルムアルデヒド(PFA)で固定し、AAV2の主要コートタンパク質VP3のアミノ酸75~86に特異的な抗AAV抗体(abeam、Cambridge、MA)を用いて、ウイルスの免疫染色を実施することにより、AAV2の配布を観察した。Alexa Fluor(商標)488(abeam)に共役されたヤギ抗ウサギIgG H&Lを用いて、シグナル増幅を展開し、共焦点顕微鏡で観察した。あるいは、6日間の形質導入後に、感染された細胞は、共焦点顕微鏡でGFP発現を観察して分析した。感染された細胞をDAPIで染色して細胞核を標識した。
動物に関するすべての手順は、中央研究院の施設内動物管理および利用委員会(AS IACUC)によって許可された。胸腺欠損BALB/cヌードマウス(6週齢のオス)は、国立実験動物センター(台湾)から提供された。マウスは、12時間/12時間の明/暗サイクルで制御された環境に養われ、最大5つのグループに収容され、食物と水を自由に摂取させた。
腫瘍部位に対する外部磁場の有無にかかわらず、鉄化AAV2または未修飾AAV2の光誘発性ウイルス療法効果を評価するために、図4Aの試験調製に従って、L858RおよびT790Mを有するEGFR-TKI耐性H1975細胞を、皮下注射で2×106個の細胞を6週齢の雄の胸腺欠損ヌードマウスの腹部に注入することにより、異種移植腫瘍を確立した。腫瘍体積が~200mm3に達したら、マウスを5つのグループにランダムで分け、鉄化AAV2(5×109GC/マウス)またはAAV2(5×109GC/マウス)を有する100μLのPBSを尾静脈注射した。PBS注射処置を対照マウスとして用いた。標的腫瘍に磁場を印加する処置において、H1975(EGFRL858R/T790M)異種移植腫瘍を1.5Tガウスで磁場に2時間曝露した。
H1975(EGFRL858R/T790M)異種移植腫瘍を、接種後15日目に採取した。採取した異種移植腫瘍を10%ホルマリン中で固定し、パラフィン包埋し、5mm切片をヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)で染色し、顕微鏡で検査した。異種移植片腫瘍切片は、プルシアンブルーまたはAlexa Fluor(商標)594(Molecular Probes、Eugene、Oregon)を有するClick-iT(商標)Plus TUNELアッセイをも用いて染色し、腫瘍内の鉄化AAV2の酸化鉄ナノ粒子を検出するか、またはin situアポトーシス検出を観察した。
0日目、2日目、7日目、および14日目に、鉄化AAV2-KillerRedを投与した後、眼窩洞採血を用いて、胸腺欠損BALB/cヌードマウスからの血清を採取した。グルタミン酸-オキサロ酢酸トランスアミナーゼ(GOT)、グルタミン酸-ピルビン酸(GPT)、総ビリルビン(TBIL)、およびクレアチニン(CRE)のレベルの生化学的分析を評価した。GOTおよびGPTレベルの決定のために、相対するアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)およびアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)の活性を測定する酵素的方法を使用した。また、肝癌および肝炎を含む肝細胞損傷の指標であるTBILのレベルは、製造元の指示に従って、Randox診断テストキットを用いて決定した。腎機能の指標とするCREレベルは、Randox診断テストキットを用いて試験した。
無菌濾過したPBS溶液(全量100μLにおける5×109GC AAV2を含有)中の鉄化AAV2-ルシフェラーゼまたはAAV2-ルシフェラーゼを、異種移植腫瘍に外部磁場を用いるかまたは用いていないマウスに、尾静脈注射した。生物発光イメージングは、治療後7日目と14日目に達成された。マウスを、酸素中に2%のイソフルランで満たしたチャンバー内で麻酔した。ルシフェリン(~240μL、Caliper Life Sciences Inc.、Hopkinton、MA)の腹腔内(IP)注射後、発光イメージは、インキュベーション後5~10分間において、5分間の一定の画像取得時間(Bin:16/4、FOV:12)で、IVISイメージングシステム(Living Imageソフトウェアを有するXenogen IVIS-50)によって捕捉した。インビボでの生物発光シグナルは、全身の関心領域からのバックグラウンド減算(光子束 秒-1cm-2sr-1)の後、各マウスについての伏臥時取得および仰向け取得の両方の合計として計算した。
データは、6回行った実験の平均値±標準偏差として示す。インビボでの腫瘍体積の測定において、データは、6回行った実験の平均値±平均値の標準誤差として示す。統計的有意差検定では、不等分散を仮定して両側t検定を使用してP値を計算した。
(1)ウイルス用の鉄スーツの製造
この新しい概念を厳密に検証するために、AAV表面タンパク質のアミノ基を介したEDC/N-ヒドロキシスルホスクシンイミド(Sulfo-NHS)共役により、アデノ随伴ウイルス血清型2(AAV2)を、様々なモル比のナノ粒子/1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)で、カルボン酸を有する酸化鉄ナノ粒子(サイズ:5nm)と化学的に共役した(図1B)。酸化鉄ナノ粒子または鉄化AAV2の透過型電子顕微鏡(TEM)画像は、ca.5nm(図1C)または30~40nm(図1D)の直径を有した。
鉄化AAV2の遠隔磁気制御能力をさらに評価するために、抗AAV2抗体と蛍光色素ALEXA FLUOR(商標)488に共役された二次抗体とを利用した免疫染色アッセイにより、細胞培養中のAAV2分布を観察した。5分間、10分間または30分間の磁場(2,000~2,200ガウス)への曝露で、相当な蛍光が蓄積して、AAV2分布の局所的制御を生じさせた(図2A)。これに対して、修飾されていないAAV2は、30分間の磁場曝露で、均一にランダムな分布を示した(図2B)。同様に、鉄化AAV2で感染した細胞のGFP発現は、処置した細胞を直径1500μmの円筒形磁石を有する同じ磁場に曝露して最大30分間インキュベートした後、形質導入後6日目に調べた。GFP発現細胞の分布は、図2Cおよび図2D中の蛍光強度によって表され、直径2,000μmの「マイクロトランスダクション」プロファイルを示す。これに対して、GFPを発現する未修飾AAV2処理細胞は、ランダムに分布していた(図2E)。
細胞のマイクロ形質導入が成功したことを確認するデータを用いて、561nmの対応する波長およびAAV2-KillerRed(図3A)を利用して、20分間照射することにより、光誘発ウイルス療法を行った(Tsengら、Nat.Commun.,2015)。観察された鉄化AAV2に感染したGFP発現細胞と一致して、KillerRed発現は、円形領域のみをもたらした(図5A)。また、GFP発現と一致して、AAV2-KillerRed対照は、優先的な空間形質導入を示さなかった(図5B)。KillerRedは、光誘発毒性を有するので、KillerRedタンパク質を発現する細胞において、黄色光の照射後には細胞死が観察された。AAV2-KillerRedに感染していない場合には、細胞死の分布は、磁場の微小スポットに効果的に蓄積され、光毒性を示さなかったため(図3Bおよび図3C)、未修飾AAV2と比較して、光誘発ウイルス療法のための遠隔制御鉄化AAV2を実証した(図3D)。
EGFR-TKI耐性HI 975(EGFRL858R/T790M)異種移植腫瘍を有する胸腺欠損BALB/cヌードマウスにおいて、遠隔鉄化AAV2-KillerRedを用いて、光誘発ウイルス療法治療を行った(図4A)。注目すべきことに、H&E(ヘマトキシリンおよびエオシン)染色により示される大面積の腫瘍壊死(図4C)、TUNEL(末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼdUTPニックエンドラベリング)アッセイによる広範囲の陽性染色(図4D)、およびDAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール)染色により標識された核酸(図4E)を対照することにより、他の治療法と比較して、鉄化AAV2-KillerRedによる治療は、腫瘍増殖の強力な抑制と関連することを示した(図4Bおよび図6)。また、プルシアンブルーで染色された淡青色の領域は、磁場および鉄化AAV2に露出されたサンプルにおいて、鉄の分布および存在量の増加を示した(図4F)。尾静脈注射により鉄化AAV2-KillerRedの単回投与は、有意な腫瘍増殖の抑制をもたらしたが、長期抑制を欠いた。印象的なことに、8日目に鉄化AAV2-KillerRedを再度注射した場合、さらなる5日間では腫瘍の体積増加を完全に停止したことが達成され、これを超えると、有意に抑制された(P<0.015)。これに対して、磁化場または光照射しない場合には、AAV2-KillerRedのみまたは鉄化AAV2-KillerRedの送達は、統計的に関連のある抗腫瘍効果をもたらさなかった。全身送達を達成する際に本質的に困難な課題を克服するのを助けるために、同時送達は他の研究と一致している(Ledford,Nature,2015;Bellら、Cell Host Microbe,2014;Russellら、Nat.Biotechnol,2012;Miestら、Nat.Rev.Microbiol,2014;Kottermanら、Nat.Rev.Genet.,2014)。
本明細書に開示されている全ての特徴は、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本明細書に開示されている各特徴は、同じ、同等、または類似の目的を果たす代替の特徴によって置き換えられてもよい。ゆえに、他に明示的に述べられていない限り、開示された各特徴は、包括的な一連の同等または類似の特徴の一例にすぎない。
本明細書ではいくつかの本発明の実施形態を説明して例示しましたが、当業者は、機能の実行かつ/または結果の獲得のために、様々な他の手段および/または構造および/または1つ以上の説明した利点を容易に想起し、そして、このような変形および/または修正の各々は、本明細書に記載の発明の実施形態の範囲内にあると見なされる。より一般的に言えば、当業者は、本明細書に記載のすべてのパラメータ、寸法、材料、および構成が例示的であることを意味し、実際のパラメータ、寸法、材料、および/または構成は、特定の用途に依存するまたは本発明の教示が使用されることを容易に理解する。当業者であれば、本明細書に記載の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識し、または日常的な実験のみを用いて確かめることができる。したがって、前記の本発明の実施形態は、例としてのみ提示され、添付の特許請求の範囲およびその均等物の範囲内で、具体的に説明および特許請求される以外の方法で本発明の実施形態を実施できることを理解されたい。本開示の実施形態は、本明細書に記載されている個々の特徴、システム、物品、材料、キット、および/または方法のそれぞれに関する。さらに、このような特徴、システム、物品、材料、キットおよび/または方法が互いに矛盾していない場合、このような特徴、システム、物品、材料、キット、および/または方法の2つ以上の任意の組み合わせも本開示の発明の範囲に含まれる。
Claims (13)
- 磁性酸化物ナノ粒子と化学的に共役して共有結合を形成したウイルス粒子を含む、磁性ウイルス粒子であって、
光増感剤が前記ウイルス粒子内にカプセル化されており、
前記化学的な共役は、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)を介した共役であり、
前記磁性酸化物ナノ粒子/前記1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)のモル比は、1/1~1/20であり、
前記磁性酸化物ナノ粒子は、酸化鉄ナノ粒子である、前記磁性ウイルス粒子。 - 前記磁性ウイルス粒子は、前記磁性酸化物ナノ粒子と化学的に共役して共有結合を形成したウイルス粒子を含む鉄化ウイルス粒子である、請求項1に記載の磁性ウイルス粒子。
- 前記磁性酸化物ナノ粒子は、1~100nmの範囲の直径を有する、請求項1または2に記載の磁性ウイルス粒子。
- 前記磁性酸化物ナノ粒子は、1~20nmの範囲の直径を有する、請求項3に記載の磁性ウイルス粒子。
- 前記ウイルス粒子は、アデノ随伴ウイルス(AAV)粒子、レンチウイルス粒子、またはアデノウイルス粒子である、請求項1~4のいずれか一項に記載の磁性ウイルス粒子。
- 前記ウイルス粒子は、AAV粒子であり、AAV血清型1~9のいずれか1つである、請求項5に記載の磁性ウイルス粒子。
- 前記光増感剤は、KillerRedタンパク質を含む、請求項1~6のいずれか1項に記載の磁性ウイルス粒子。
- 前記KillerRedタンパク質は、配列番号1のアミノ酸配列を含む、請求項7に記載の磁性ウイルス粒子。
- 請求項1~8のいずれか一項に記載の磁性ウイルス粒子を含む、腫瘍治療用医薬組成物。
- 前記腫瘍部位は、肺、腎臓、心臓、脳、膀胱、皮膚、乳房、または腸にある、請求項9に記載の医薬組成物。
- 1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)およびN-ヒドロキシスルホスクシンイミド(Sulfo-NHS)の存在下で磁性酸化物ナノ粒子とウイルス粒子とが化学的に共役して共有結合を形成する工程を含む、磁性ウイルス粒子の製造方法であって、
光増感剤が前記ウイルス粒子内にカプセル化されており、
前記化学的な共役は、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)を介した共役であり、
前記磁性酸化物ナノ粒子/前記1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)のモル比は、1/1~1/20であり、
前記磁性酸化物ナノ粒子は、酸化鉄ナノ粒子であり、
前記共役が、
(i)1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)の存在下で、磁性酸化物ナノ粒子をカルボン酸と混合して、混合物を形成する工程、
(ii)N-ヒドロキシスルホスクシンイミド(Sulfo-NHS)を混合物に入れて、アミン反応性NHSエステルで修飾された磁性酸化物ナノ粒子を形成する工程、および
(iii)修飾された磁性酸化物ナノ粒子をウイルス粒子と共にインキュベートして、磁性ウイルス粒子を形成する工程、
を含む、前記磁性ウイルス粒子の製造方法。 - 前記光増感剤は、KillerRedタンパク質を含む、請求項11に記載の方法。
- 前記KillerRedタンパク質は、配列番号1のアミノ酸配列を含む、請求項12に記載の方法。
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