TWI722252B - 光觸發病毒療法之遠端控制 - Google Patents

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Abstract

鐵化病毒粒子，例如可帶有如KillerRed蛋白質之光敏劑的鐵化腺相關病毒粒子，及其用於光觸發之抗腫瘤病毒療法。

Description

光觸發病毒療法之遠端控制 相關申請案的交叉引用
本案主張於2016年11月4日提交的美國臨時申請案62/417,946的權益，其內容藉由引用的方式整體併入本文中。
本發明係關於一種磁性病毒粒子，包含與磁氧化奈米粒子共軛之病毒粒子。
在癌症的創新性治療中，病毒療法係一種具潛能的癌症治療劑，目前正在臨床試驗中評估幾個不同病毒科的病毒(Bell et al.,Cell Host Microbe,2014；Russell et al.,Nat.Biotechnol.,2012；Miest et al.,Nat.Rev.Microbiol.,2014)。在大多數病毒療法的臨床試驗中，病人係藉由腫瘤內注射來進行病毒療法(Miest et al.,Nat.Rev.Microbiol.,2014)。於癌症治療中，強化病毒之全身性傳遞仍為有效病毒療法的一個障礙(Ledford,Nature,2015；Bell et al.,Cell Host Microbe,2014；Russell et al.,Nat.Biotechnol.,2012；Miest et al.,Nat.Rev.Microbiol., 2014；Kotterman et al.,Nat.Rev.Genet.,2014)。因此，實現有效且準確的全身性傳遞將大幅擴展病毒療法的機會。
涉及腺相關病毒(adeno-associated virus,AAV)介導之基因遞送的臨床試驗已使許多單基因疾病的治療(Kotterman et al.,Nat.Rev.Genet.,2014；Naldini,Nature,2015)及組織工程的發展(Yoo et al.,Adv.Healthc.Mater.,2016)能夠成功。定向定位降低了治療劑量，因此也降低了AAV導向的免疫反應、異位表現及導致基因突變的致癌基因活化之風險。又，設計AAV殼體(Lisowski et al.,Nature,2014)及從AAV基因體中消除CpG基序(Faust et al.,J.Clin.Invest.,2013)的改進方法已藉由使其避免與因人類自然暴露於AAV所產生的中和抗體結合，進而降低了AAV的免疫原性。有趣的是，AAV殼體被設計以表現光依賴性因子基序，該光依賴性因子基序結合於經核定位序列標記的光可切換式蛋白質，當在暴露於光時，該AAV殼體顯示顯著增加之基因遞送效率(Gomez et al.,ACS Nano.,2016)。惟，準確並特定地遞送合適劑量之遺傳物質一直係主要的挑戰。對於全身性的透過身體血液循環施予病毒，肝臟通常係預設的目的地(Kotterman et al.,Nat.Rev.Genet.,2014)，且當其他器官/組織為預期靶標時則代表屏障。
本揭露係至少部分地基於磁性病毒粒子的發展，舉例言之，帶有光敏劑蛋白質(如：KillerRed蛋白質) 之鐵化病毒粒子，其係成功地定位於有施予磁場的部位。當用於光觸發病毒療法時，此種鐵化AAV2粒子成功地降低腫瘤的生長。
據此，本揭露之一態樣特徵為磁性病毒粒子(如：鐵化病毒粒子)，包含與磁氧化奈米粒子(如：氧化鐵奈米粒子)共軛之病毒粒子。該磁氧化粒子可具有從1至100nm之直徑範圍。於一些情況下，該磁氧化粒子可具有5nm之平均直徑。於一些具體實施例中，該病毒粒子係腺相關病毒(AAV)粒子，舉例言之，血清型1至9中之任一型(如：AAV2)粒子、慢病毒粒子或腺病毒粒子。於一些具體實施例中，本文所述的磁性病毒粒子中之任一者可帶有例如KillerRed蛋白質之光敏劑蛋白質，其可包含SEQ ID No：1之胺基酸序列。
於另一態樣中，本揭露提供一種治療腫瘤之方法，包含：(i)對有需要的受試者施予有效量之本文所述之磁性病毒粒子，其中，該磁性病毒粒子帶有光敏劑，例如KillerRed蛋白質；(ii)對受試者的腫瘤部位施予磁場，以誘導磁性病毒粒子定位於腫瘤部位；以及(iii)於步驟(ii)之後，對受試者的腫瘤部位執行光照射。於一些具體實施例中，步驟(iii)係以波長540至580nm(如：561nm)執行。或者或此外，該腫瘤部位係位於肺、腎、心臟、膀胱、皮膚、乳房或腸道。
於又另一態樣中，本揭露提供一種製備磁性病毒粒子之方法，例如本文所述之鐵化病毒粒子，其中， 該方法包含在一種或多種交聯劑的存在下，將磁氧化奈米粒子(如：氧化鐵奈米粒子)化學共軛於病毒粒子。於一些具體實施例中，該化學共軛涉及乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)介導的共軛。
於一些實施例中，本文所述之製備方法包含：(i)在羧基活化劑的存在下，將諸如氧化鐵奈米粒子之磁氧化奈米粒子與羧酸混合，以形成混合物；(ii)將能夠使羧基轉化成胺反應性NHS酯之試劑置入該混合物中，以形成經該胺反應性NHS酯修飾之磁氧化奈米粒子；以及(iii)將該經修飾之磁氧化奈米粒子與病毒粒子培養，以形成該磁性病毒粒子。該羧基活化劑可為碳二亞胺化合物，如：EDC。或者或此外，在步驟(ii)之試劑為N-羥基磺基琥珀醯亞胺(Sulfo-NHS)。
又，於本揭露之範圍內者係(i)用於治療腫瘤之醫藥組成物，其中該醫藥組成物包含本文所述的任一磁性病毒粒子及醫藥上可接受之載體；以及(ii)該磁性病毒粒子用於製備治療腫瘤之藥劑的用途。
本發明之一或多個具體實施例的細節係於下述中闡述。本發明之其他特徵或優點將從下述附圖、具體實施例，以及所附申請專利範圍的詳細描述中為顯而易見。
第1圖包括顯示遠端控制“鐵化”病毒之示意圖。第1A圖：藉由單次尾靜脈注射進行微病毒療法的遠端定向鐵化病毒之概念。當鐵化AAV2經磁場強制遞送定 向時，迅速累積於標的腫瘤部位。此處，KillerRed係由受AAV2-KillerRed感染的腫瘤細胞所表現。光啟動了病毒療法。KillerRed蛋白質的照射產生ROS及隨後的細胞內損傷，促使細胞死亡。第1B圖：利用涉及EDC/Sulfo-NHS的兩階段共軛方法，將鐵化AAV2與氧化鐵奈米粒子共軛的例示性方法之示意圖。照片顯示鐵化AAV2的透明黃色溶液。第1C圖：具有羧酸的氧化鐵奈米粒子之TEM圖像。比例尺=50nm。第1D圖：以奈米粒子/EDC的莫耳比(1/20)所製備的鐵化AAV2展現氧化鐵奈米粒子與病毒相關聯之TEM圖像。比例尺=200nm。第1E圖：藉由流式細胞術分析經不同莫耳比的奈米粒子/EDC與鐵化AAV2轉導6天後GFP-表現細胞的百分比(#,P>0.25；##,P<0.005；基於雙尾t檢定，假設變異數不相等)。數據顯示重複六次±s.d.測量之平均值。第1F圖：HEK293細胞暴露於不同莫耳比的奈米粒子/EDC之鐵化AAV2後的存活率。細胞存活率係由與未暴露之細胞相比較，處理24小時後所剩餘之活細胞的百分比而獲得。細胞數目係藉由標準MTS分析法測定(*,P>0.2；**,P>0.5；基於雙尾t檢定，假設變異數不相等)。數據顯示重複六次±s.d.測量之平均值。
第2圖包括顯示微轉導之遠端控制“鐵化”病毒的照片及圖表。第2A圖：於磁場暴露期間(5、10或30分鐘)，AAV2分佈的代表性共焦圖像，其係藉由使用抗AAV2抗體及共軛至Alexa Fluor®488之二級抗體進行免疫染色。第2B圖：將磁化30分鐘且未修飾的AAV2作為對 照組。比例尺=1000μm。經鐵化AAV2(第2C及2D圖)或AAV2(第2E圖)感染的GFP表現細胞暴露於磁場(直徑：1,500μm)培養30分鐘，並隨後6天轉導的螢光強度的概況曲線。藉由共軛焦顯微鏡觀察經鐵化AAV2或AAV2感染的GFP陽性細胞之圖像。藉由共軛焦顯微鏡分析來自圖像的所有螢光強度。使用DAPI染色細胞以標記細胞核(調整為選擇紅色螢光)。數據顯示重複六次測量之平均值。比例尺=1,000μm。
第3圖包括顯示活體外光觸發病毒療法之照片及圖表。第3A圖：pAAV-KillerRed之序列圖。AAV2-KillerRed係藉由pAAV-KillerRed之表現質體及包裝質體(pHelper及pAAV-RC2)而製備。第3B至3D圖：經KillerRed蛋白質照射後，經鐵化AAV2(第3B及3C圖)或AAV2(第3D圖)感染之細胞的死亡及細胞核分佈之螢光強度的概況。照射前，以鐵化AAV2或AAV2感染6天後，使用磁場(直徑：1,500μm)培養細胞30分鐘。照射20分鐘後，利用Live/Dead®可固定的遠紅死亡細胞染色試劑盒觀察受感染的細胞。第3B至3D圖之右圖：顯示紅色螢光(細胞死亡)之代表性共軛焦圖像。此外，該經處理的細胞經由DAPI染色以顯示細胞核，且共軛焦圖像係與紅色螢光融合。所有圖像之螢光強度係藉由共軛焦顯微鏡測定。數據顯示重複六次測量之平均值。比例尺=1,000μm.
第4圖包括顯示活體內全身性遠端控制病毒 療法之圖表及照片。第4A圖：治療療程評估遠端控制之傳遞，使用不同條件進行光觸發病毒療法。第4B圖：於磁化(M)及/或光照射(L)下，藉由尾靜脈注射經不同病毒處理的EGFR-TKI抗性H1975(EGFRL858R/T790M)異種移植腫瘤之腫瘤生長。腫瘤的尺寸係於所述日期藉由測徑器測量(*,P<0.015；**,P<0.001；基於雙尾t檢定，假設變異數不相等)。數據顯示重複六次±s.e.m.測量之平均值。第4C至4F圖：於第15天的不同治療後，每組(n=6)小鼠的腫瘤切片之代表性圖像，該腫瘤切片係藉由蘇木素及伊紅(H & E)(第4C圖)、終端去氧核苷酸轉移酶dUTP切口末端標記(TUNEL)分析(第4D圖)、DAPI(第4E圖)以及普魯士藍(第4F圖)染色。比例尺=500μm。第4G圖：在第0天、第2天、第7天及第14天，當鐵化AAV2-KillerRed施予至無胸腺BALB/c裸鼠後，從血液獲得的血清中執行麩胺酸草乙酸轉胺酶(GOT)、麩胺酸丙酮酸轉胺基酶(GPT)、總膽紅素(TBIL)及肌酐(CRE)的生化分析。數據顯示重複三次±s.d.測量之平均值。第4H圖：小鼠經過多種治療後之體重。於所述日期測量小鼠的體重，對應於暴露及不暴露於M或L的情況下，藉由尾靜脈注射多種製劑的治療。結果顯示重複六次±s.d.測量之平均值。第4I圖：在利用AAV2編碼的螢光酵素作為檢測信號並進行尾靜脈注射不同製劑後，在第14天拍攝小鼠的代表性IVIS圖像。第4J圖：來自於第14天透過靜脈注射以進行多種治療之小鼠之器官的代表性IVIS圖像。
第5圖包括顯示於磁場下經定位的病毒轉導之照片。第5A至5B圖：顯示藉由共軛焦顯微鏡觀察，受鐵化AAV2(第5A圖)或AAV2(第5B圖)感染的KillerRed陽性細胞之圖像。細胞係藉由DAPI染色以標記細胞核(藍色螢光)。比例尺=1,000μm。
第6圖包括顯示小鼠經由不同治療後，腫瘤生長之照片。經不同治療後，於第15天切除H1975腫瘤的H1975異種移植腫瘤之代表性照片。比例尺=1cm。
第7圖係顯示活體內監測生物螢光活性水平之照片。在尾靜脈注射不同製劑後，並利用AAV2-螢光酵素作為檢測信號，於第7天拍攝的小鼠之代表性IVIS圖像。
第8圖包括顯示凝膠電泳及pAAV-KillerRed構建之照片。質體pAAV-KillerRed係由pKillerRed-dMito及pAAV-MCS所構建。KillerRed片段(0.71kb)係藉由利用聚合酶鏈式反應(PCR)及方法章節所述之引子序列，而被添加至KillerRed序列中的EcoRI及SalI位點。
第9圖係顯示鐵化AAV2混合溶液之例示性純化及溶劑交換過程之示意圖。鐵化AAV2的合成係依據第1B圖中的化學共軛而製備。共軛反應後，使用以PBS溶液為交換溶劑之粒徑脫鹽管柱(截留分子量：100K)以純化鐵化AAV2之黃色混合溶液。
第10圖包括顯示確定相對之病毒效價之圖。AAV-KillerRed DNA係藉由如方法章節所述之引子序列以進行反轉錄PCR(RT-PCR)而測定。藉由瓊脂糖凝膠電泳 (上圖)分析AAV2-KillerRed於不同基因體拷貝數(GC)下之RT-PCR產物。所獲得的片段對應於預期尺寸539bp。標準曲線顯示AAV-KillerRed之GC編號的數據點以及由Image J軟體所獲得的條帶強度(下圖)。然後藉由線性回歸定量校準純化及溶劑交換後具有未知含量的鐵化AAV2-KillerRed之RT-PCR樣品(源自第9圖)。梯狀條帶：分子尺寸標記；NTC：無模板控制。
本文所述之磁化(如：鐵化)病毒粒子，例如AAV2病毒粒子，證實於一磁場內可成功地復位至位點。此種磁性病毒粒子帶有諸如KillerRed之光敏劑蛋白質，當其藉由磁場誘導而復位至腫瘤部位時，展現對於腫瘤之光觸發毒性。
磁性病毒粒子及其製備方法
本文所述之磁性病毒粒子可為附著於諸如氧化鐵奈米粒子之磁化粒子之任何病毒粒子。於一些情況下，該病毒粒子可包含封裝病毒遺傳物質(如：取決於病毒類型之DNA或RNA)之病毒蛋白質，其可促進病毒粒子之組裝。該病毒遺傳物質相較於野生型對應者，較佳為殘缺物質，使得使用於本文所述之方法的病毒粒子無法自行複製。又，該病毒粒子可被修飾以使其無法感染天然宿主細胞，舉例言之，病毒蛋白質之殘缺涉及與細胞受體之相互作用。或者，本文所述之病毒粒子不具病毒遺傳物質。此種病毒粒子亦稱為類病毒粒子(viral-like particles, VLPs)，其可藉由習知方法製備。該病毒粒子可源自合適的病毒來源。於一些具體實施例中，該病毒粒子係源自慢病毒、腺病毒或腺相關病毒。
磁氧化奈米粒子，例如氧化鐵奈米粒子係磁氧化粒子(如：氧化鐵粒子)。本文所述之術語“奈米粒子”意指，舉例言之，100nm或以下之粒子尺寸，例如，從約0.5nm至約100nm、從約1nm至約50nm、從約1nm至約25nm，或從約1nm至約10nm。該粒子尺寸意指金屬粒子之平均直徑，其可藉由諸如TEM(穿透式電子顯微鏡)之習知方法確定。一般而言，由本文所述之方法所獲得的金屬奈米粒子可存在著複數個粒子尺寸。於一些具體實施例中，存在著不同尺寸的含金屬奈米粒子係可被接受的。
本文所述之磁氧化奈米粒子，例如氧化鐵奈米粒子，可具有從1至100nm之直徑。於一些情況下，該氧化鐵奈米粒子可為磁鐵礦(Fe3O4)或其氧化型。鐵氧體氧化物(磁鐵礦)係一種天然存在的礦物質，其廣泛地以超順磁性奈米粒子的形式使用於多種生物之應用，例如MRI、磁分離及磁性藥物遞送(Mody et al.,Applied Nanoscience,2014,4(4)：pp 385-392)。本揭露使用之氧化鐵奈米粒子可具有從1至80nm之直徑，如：1至60nm、1至50nm、1至40nm、1至30nm、1至20nm、1至10nm、3至10nm或5至10nm。於一特定實施例中，本揭露使用之氧化鐵奈米粒子具有20nm、15nm、10nm、5nm 或2nm之平均直徑。於一些具體實施例中，整體中之氧化鐵奈米粒子的直徑係於平均直徑的50%(例如，40%、30%、20%或10%)內變化。
本文所述之磁性病毒粒子可藉由任何習知磁氧化奈米粒子與病毒粒子(如：病毒蛋白質或病毒核酸)之共軛方法，並使用一種或多種交聯劑而製得。蛋白質、核酸及藥物可依據本領域習知的多種程序而與奈米粒子共軛，例如使用1-乙基-3-[3-二甲基胺基丙基]碳二亞胺或使用1-乙基-3-[3-二甲基胺基丙基]碳二亞胺與聚乙烯亞胺一層一層地層壓。第1B圖提供製備鐵化AAV2病毒粒子之例示性流程圖。於該例示性流程中，諸如氧化鐵奈米粒子之磁氧化奈米粒子可在羧基活化劑(如：EDC)的存在下，以合適的條件與羧酸一起培養一段合適的時間。可將能夠將羧基轉化成胺反應性NHS酯的試劑，例如N-羥基磺基琥珀醯亞胺(Sulfo-NHS)加入反應混合物中，其可在合適的條件下培養一段合適的時間，以形成經胺基反應性NHS酯修飾之磁性氧化物奈米粒子，該磁性氧化物奈米粒子對病毒蛋白質之某些胺基酸側鏈具有反應性以形成共價鍵。然後，該經修飾之磁氧化奈米粒子於合適之溶液(如：PBS)中與重組病毒粒子混合，例如磁氧化奈米粒子係藉由化學共軛而與病毒粒子進行共軛。
本文所述之磁性病毒粒子可帶有治療劑，其可藉由習知方法封裝於病毒粒子內。於一些實施例中，該治療劑係光敏劑，其係可藉由光化學過程，如：在光照射 時轉化為細胞毒性劑之分子。光敏劑可用於光動力療法以治療各種疾病，例如，癌症。
於一些具體實施例中，本文所述之磁性病毒粒子帶有諸如光毒性螢光蛋白之蛋白質型光敏劑(光敏劑蛋白)。實例包含KillerRed蛋白質(參閱如：Fransen et al.,Methods Mol.Biol.,1595：165-179；2017)、KillerOrange蛋白質(參閱如：Sarkisyan et al.,Plos One,10(12)：e0145287；2015)或Supernova蛋白質(參閱如：Takemoto et al.,Sci.Rep.3：2629；2013)。下述為例示性KillerRed蛋白質之胺基酸序列。
Figure 106137916-A0202-12-0012-1
(SEQ ID NO：1)
在光照射時，KillerRed蛋白質可產生活性氧物質(ROS)，其可用以殺死諸如癌細胞之疾病細胞。KillerRed蛋白質之光毒性係受540至580nm之綠光照射而被誘導，並取決於光強度照射時間及蛋白質濃度，而該時間及濃度可藉由操作規程來確定。
本揭露所使用之KillerRed蛋白質可與SEQ ID NO：1具有至少75%(如：80%、85%、90%、95%、98 %或99%)之序列同一性，並保留光毒性之活性。兩個胺基酸序列之“百分比同一性”係藉由Karlin及Altschul演算法測定(Karlin and Altschul Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-68,1990)，並依據Karlin及Altschul(Karlin and Altschul Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-77,1993)修飾。此種演算法被納入Altschul等人(Altschul,et al.J.Mol.Biol.215：403-10,1990)之NBLAST及XBLAST程式(版本2.0)中。可執行XBLAST程式進行BLAST蛋白質搜索，得分=50、字長=3，以獲得與本發明之蛋白質分子同源的胺基酸序列。當兩個序列之間存在間隙時，可使用Altschul等人(Altschul et al.,Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402,1997)所述之間隙的BLAST(Gapped BLAST)。當使用BLAST及間隙的BLAST程式時，可使用各個程式(如：XBLAST及NBLAST)之預設參數。
其他例示性KillerRed蛋白質及光毒性螢光蛋白質係本領域所習知者，且其等胺基酸序列可從公開的基因庫獲得，舉例言之，GenBank，使用SEQ ID No：1作為查詢。實例包括，但不限於以GenBank登錄號AAY40168、3A8S_A、2WIQ_A、BAN81984、3GB3_A、4B30_B及4B30_A所述者。例示性KillerOrange蛋白質可於GenBank內，以登錄號AQY79141、4ZFS_A及4ZBL_A獲尋。例示性Supernova蛋白質可於GenBank內，以登錄號3WCK_A獲尋。
本文所述之任一磁性病毒粒子可與醫藥上可 接受之載體(賦形劑)混合，以形成用於本文所述之治療方法的醫藥組成物。術語“可接受”意指該載體必須與組成物的活性成分相容(且優選地，能夠穩定該活性成分)，並對接受治療之受試者無害。醫藥上可接受之賦形劑(載體)包括本領域習知的緩衝劑(參閱如：Remington：The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed.(2000)Lippincott Williams and Wilkins,Ed.K.E.Hoover)。醫藥上可接受之載體的非限制性實例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、澱粉、阿拉伯樹膠、磷酸鈣、藻酸鹽、西黃蓍膠、明膠、矽酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、鹽水、糖漿、甲基纖維素、乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚丙烯酸、潤滑劑(例如滑石粉、硬脂酸鎂及礦物油)、潤濕劑、乳化劑、懸浮劑、防腐劑(例如羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸乙酯及羥基苯甲酸丙酯)、pH調節劑(例如無機及有機酸和鹼)、甜味劑及調味劑。
本方法所使用之醫藥組成物可包含凍乾製劑或水溶液形式的醫藥上可接受之載體、賦形劑或穩定劑(Remington：The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed.(2000)Lippincott Williams and Wilkins,Ed.K.E.Hoover)。可接受之載體、賦形劑或穩定劑在使用的劑量及濃度對受試者係無毒的，且可包含諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸之緩衝劑、包括抗壞血酸及甲硫胺酸之抗氧化劑、防腐劑(例如十八烷基二甲基芐基氯化銨、氯化六甲銨、羥基氯苯銨、氯化本索寧(benzethonium chloride)、 苯酚、丁醇或苯甲醇、諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯之對羥基苯甲酸烷基酯、鄰苯二酚、間苯二酚、環己醇、3-戊醇及間甲酚)、低分子量(少於約10個殘基)之多肽、諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白之蛋白質、諸如聚乙烯吡咯烷酮之親水聚合物、諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸之胺基酸、包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖之單醣、雙醣及其他碳水化合物、諸如EDTA之螯合劑、諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇酐之糖，、諸如鈉之鹽型相對離子(salt-forming counter-ion)、金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)、及/或諸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)之非離子界面活性劑。
使用於活體內投予之醫藥組成物必須經由消毒處理。消毒方法，舉例言之，可藉由通過無菌濾膜過濾。治療性病毒粒子組成物一般係放在具有無菌入口之容器中，舉例言之，具有透過皮下注射針之可刺穿之瓶塞的靜脈注射液袋或小瓶。
本文所述之醫藥組成物可呈單位劑量形式，例如膠囊、粉劑、顆粒、溶液或懸浮劑，或如非經腸道給藥之栓劑。
為製備諸如片劑之固體組成物，可將主要活性成分與藥物載體混合，例如：諸如玉米澱粉、乳糖、蔗糖、山梨醇酐、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸鎂、磷酸二鈣或樹膠之常規片劑成分，及諸如水之其他藥物稀釋劑，以形 成包含本發明化合物的均質混合物或其無毒之醫藥上可接受鹽的固體預製劑組成物。當稱此等預配製組成物為均質時，其意指活性成分均勻地分散在整個組成物中，使得組成物可容易地再分成等效的單位劑型，例如片劑、丸劑及膠囊。然後，將該固體預製劑組成物再分成上述類型的單位劑型，其中包含從0.1至約500mg之本發明的活性成分。新組成物的片劑或丸劑可被包覆或以其他方式合成以提供賦予長效優點之劑型。舉例言之，該片劑或丸劑可包含內部劑量組分及外部劑量組分，後者係以作為前者之包膜形式存在。這兩種組分可藉由腸溶層分開，該腸溶層係用來抵抗於胃中崩解，並允許內部組分完整地進入十二指腸或延緩釋放。多種物質可用於此種腸溶層或包衣，此類物質包括許多聚合物酸，以及聚合酸與紫膠、鯨蠟醇及醋酸纖維素等物質的混合物。
合適的界面活性劑包括，特別地，非離子型劑，例如聚氧乙烯山梨醇酐(如：TweenTM 20、40、60、80或85)及其他山梨醇酐(如：SpanTM 20、40、60、80或85)。含界面活性劑之組成物可方便地包含0.05至5%之界面活性劑，亦可包含0.1至2.5%之界面活性劑。可理解的是，若有需要，可加入其他成分，例如甘露糖醇或其他醫藥上可接受之載體。
可使用市售之脂肪乳劑製備合適的乳劑，例如IntralipidTM、LiposynTM、InfonutrolTM、LipofundinTM及LipiphysanTM。該活性成分可溶於預混合的乳劑組成物 中，或者可溶於油(如：大豆油、紅花油、棉籽油、芝麻油、玉米油或杏仁油)以及與磷脂(如：卵磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)和水混合形成的乳劑。可理解的是，可加入其他成分，例如甘油或葡萄糖，以調節乳劑的張力。合適的乳劑典型地含有高達20%的油，舉例言之，介於5至20%之間。
該乳劑組成物可為由磁性病毒粒子與IntralipidTM或其成分(大豆油、卵磷脂、甘油及水)混合而製備者。
使用磁性病毒粒子進行腫瘤之光觸發病毒療法
磁性病毒粒子可經由磁場靶向或用於磁熱療法(Chan(2005)；Ito(2005))。帶有一種或多種光敏劑之任何磁性病毒粒子皆可藉由磁場靶向至所需部位(如：腫瘤部位)。當光照射時，該光敏劑將產生細胞毒性劑，其可於所需部位殺死患病細胞，例如腫瘤細胞。
為實現本文所揭示之方法，可藉由合適的途徑向有需要治療的受試者(如：人)施予有效量的醫藥組成物，所述合適的途徑例如靜脈內給藥，如：藉由肌內、腹膜內、腦脊髓內、皮下、關節內、滑膜內或鞘內途徑推注或連續輸注一段時間。用於液體製劑的市售霧化器，包括噴射霧化器及超聲波霧化器皆適用於給藥。液體製劑可直接霧化，而凍乾粉末可在復水後霧化。另外，本文所述之含有磁性病毒粒子的醫藥組成物可利用碳氟化合物製劑及定量吸入器霧化，或者經凍乾及研磨成粉末後吸入。
藉由本文所述方法治療的受試者可為哺乳動物，更佳為人類。哺乳動物包括，但不限於，農場動物、運動動物、寵物、靈長類、馬、狗、貓、小鼠及大鼠。需要治療的人類受試者可為有患病風險或疑似患有諸如癌症之目標疾病/病症的人類患者。具有目標疾病或病症的受試者可藉由常規醫學檢查，如：實驗室檢查、器官功能檢查、CT掃描或超音波來鑑定。疑似患有任何此種目標疾病/病症之受試者可能顯示疾病/病症之一種或多種症狀。處於該疾病/病症風險中之受試者可係具備該疾病/病症之一種或多種風險因子的受試者。
本文所述之“有效量”意指與單獨或與一種或多種其他活性劑組合，以給予受試者治療效果所需的各種活性劑的量。如所屬技術領域中具有通常知識者所認可的，該有效量係依據所治療的特定病症、病況的嚴重程度、個體患者參數(包括年齡、身體狀況、體型、性別及體重、治療持續時間、並行治療的性質(若有)、特定的給藥途徑及於醫療人員的知識及專長之內的其他因素而有所不同。這些因素對於所屬技術領域中具有通常知識者來說係眾所周知的，且可使用不超過常規之實驗來解決。一般優選為使用單個成分之最大劑量或其組合，亦即，依據合理的醫學判斷之最高安全劑量。
經驗考量，例如半衰期，通常將有助於確定劑量。施予的頻率可於治療過程中確定及調整，且一般而言，但不一定，係基於治療及/或抑制、及/或改善、及/或 延緩目標疾病/病症。
一般而言，為施予本文所述之任何磁性病毒粒子，初始候選劑量可為包含於磁性病毒粒子內約2mg/kg光敏劑。為達到本揭露之目的，典型的劑量範圍可為約0.1μg/kg至3μg/kg至30μg/kg至300μg/kg至3mg/kg至30mg/kg至100mg/kg或更多，此乃取決於上述所提及之因素。當有需要時，可依據病情重複施予磁性病毒粒子，持續治療直至預期的症狀抑制，或直至達到足夠緩解目標疾病或病症或其症狀的治療水平。一例示性之給藥方案包含施予約2mg/kg的初始劑量，接著每周約1mg/kg光敏劑之維持劑量，或者接著每隔一周約1mg/kg之維持劑量。惟，其他劑量方案亦可能係有用的，此乃取決於從業者希望實現的藥物動力學衰減模式。舉例言之，可考慮每週給藥1至4次。於一些具體實施例中，該劑量範圍可為從3μg/mg至約2mg/kg(例如約3μg/mg、約10μg/mg、約30μg/mg、約100μg/mg、約300μg/mg、約1mg/kg及約2mg/kg)。於一些具體實施例中，該給藥頻率係每周一次、每兩周一次、每四周一次、每五周一次、每六周一次、每七周一次、每八周次、每九周一次或每十周一次；或每月一次、每兩個月一次或每三個月一次或更久。此種療程很容易藉由常規技術及分析進行監控。該給藥方案(包括使用的光敏劑)可隨時間而更換。
於一些具體實施例中，對於正常體重的成年患者，可施予約0.3至5.00mg/kg的劑量。於一些實施例 中，本文所述之磁性病毒粒子的光敏劑(如：KillerRed)之劑量可為10mg/kg。特定劑量方案，例如劑量、給藥次數及重複次數將取決於特定個體及該個體的病史，以及個別藥劑的性質(例如藥劑的半衰期以及所屬技術領域中眾所周知的其他考量)。
為本揭露之目的，本文所述之光敏劑的適當劑量將取決於所使用的特定光敏劑(或其組成物)、疾病/病症的類型及嚴重性、先前的療法、患者的臨床病史及對光敏劑的反應，以及主治醫師的判斷。典型地，臨床醫生將施予含有光敏劑的磁性病毒粒子直到達到期望結果的劑量為止。於一些具體實施例中，該期望結果係降低血栓形成。確定劑量是否達到期望結果的方法對於所屬領域技術人員具有通常知識者而言係顯而易見的。可連續或間歇的施予帶有相同或不同光敏劑之一種或多種磁性病毒粒子，此乃取決於，舉例言之，受試者的生理狀況以及技術從業人員已知的其他因素。基本上可於預選的時段內連續，或者可以一系列的間隔劑量施予磁性病毒粒子，如：在產生目標疾病或病症之前，期間或之後。
可使用醫學領域中具有通常知識者已知的常規方法，將醫藥組成物施予受試者，此乃取決於待治療疾病的類型或疾病的部位。該組成物亦可藉由其他常規途徑，如：口服給藥、非消化道給藥、吸入噴霧給藥、局部給藥、直腸給藥、鼻腔給藥、口腔給藥、陰道給藥或藉由植入的儲藥器給藥。本文使用之術語“非消化道”包括皮 下、皮內、靜脈內、肌內、關節內、動脈內、滑膜內、胸骨內、鞘內、病灶內及顱內注射或輸注技術。此外，可藉由注射途徑給藥至受試者，例如使用1個月、3個月或6個月的長效注射方式或生物可降解物質及方法。於一些實施例中，該醫藥組成物可藉由眼內或眼球玻璃體內給藥。
注射組成物可含有各種載體，例如植物油、二甲基乙醯胺、二甲基甲醯胺、乳酸乙酯、碳酸乙酯、肉荳蔻酸異丙酯、乙醇及多元醇(甘油、丙二醇、液體聚乙二醇等)。對於靜脈內注射，可藉由滴注方法施予水溶性抗體，由此注入含帶有光敏劑及生理上可接受之賦形劑的磁性病毒粒子的藥物製劑。生理上可接受之賦形劑可包括，舉例言之，5%右旋糖、0.9%鹽水、林格氏溶液或其他合適的賦形劑。可將肌內製劑(如：合適的可溶性鹽形式之光敏劑的無菌製劑)溶解並施用於藥物賦形劑，例如注射用水、0.9%鹽水或5%葡萄糖溶液中。
在將磁性病毒粒子施用於有需要治療的受試者(舉例言之，癌症患者)之後，可在該受試者的所需部位，例如腫瘤部位，施加磁場，使磁性病毒粒子可被吸引至所需部位。用於產生磁場之例示性磁體包括，但不限於，帶電磁體將電脈衝遞送到所需部位並靜止(不帶電)，且在治療區域上滯留一段時間以遞送連續治療。可在合適的時間內施加磁場至所需部位，以使磁性病毒粒子歸位至所需部位。隨後，可在相同的部位施加適當的光照，激發包含在該磁性病毒粒子之光敏劑，以釋放細胞毒性分子來殺死 患病細胞(如：腫瘤細胞)。光照射的合適波長、強度及持續時間係取決於在治療中所使用的光敏劑之類型及/或劑量(如：光毒性螢光蛋白質)。於一實施例中，使用KillerRed蛋白質，且可使用綠光(如：於540至580nm的波長下)來誘導KillerRed蛋白質的光毒性。亦可使用其他光毒性螢光蛋白質，包括如上述之KillerOrange及Supernova。
本文所述之光觸發病毒療法的方法可用於治療癌症，例如固體腫瘤。本文所用之術語“治療”意指將包含一種或多種活性劑的組成物應用或施予至患有目標疾病或病症、疾病/病症的症狀、或有疾病/病症的傾向之受試者，旨在治癒、痊癒、緩和、緩解、改變、補救、改善、改進或影響該疾病、疾病的症狀、或疾病或病症的傾向。
緩和目標疾病/病症包括延遲疾病的發展或進展，或減輕疾病的嚴重程度。緩和該疾病不一定需要治癒的結果。本文所使用之術語“延遲”目標疾病/病症的發展意指拖延、阻礙、減緩、推遲、穩定及/或延緩疾病的進展。此種延遲的時間長短可能有所不同，其係具體的取決於疾病及/或正在接受治療的個體的歷史。“延遲”或緩和疾病發展，或延遲疾病發作的方法，相較於不使用該方法者，係在給定的時間範圍內降低發展症狀的可能性及/或在給定的時間範圍內降低症狀程度的方法。此種比較典型地係基於使用多個受試者以足以提供統計上顯著的結果之臨床研究。
疾病的“發展”或“進展”意指疾病的初始表現 及/或確定的進展。疾病的發展可使用習知的標準臨床技術檢測及評估。然而，發展亦意指無法檢測的進展。為本揭露之目的，發展或進展意指症狀的生物學過程。“發展”包括發生、復發及發作。本文所使用之目標疾病或病症的“發作”或“發生”包括初始發作及/或復發。
用於光觸發病毒療法之試劑盒
本揭露亦提供用於治療涉及諸如癌症之疾病細胞的疾病/病症之試劑盒。該試劑盒可包括一種或多種包含任何本文所述之磁性病毒粒子之容器，該磁性病毒粒子係帶有至少一種光敏劑。
於一些具體實施例中，該試劑盒可包含遵循本文所述任何方法之使用說明書。所包含的說明書可包括用於針對目標疾病(例如癌症)的光觸發病毒療法之磁性病毒粒子的施用說明。該試劑盒可進一步包含基於鑑定該個體是否具有目標疾病來選擇適於治療之個體的說明。於另一具體實施例中，該說明書包含對處於目標疾病風險中之個體施予磁性病毒粒子的說明。
有關使用磁性病毒粒子及/或其所包含之光敏劑的說明書，一般包括關於預期治療的劑量、給藥時程及給藥途徑的資訊。該容器可為單位劑量、散裝包裝(如：多劑量包裝)或次單位劑量。本發明之試劑盒中所提供的說明通常係在標籤或包裝夾頁(如：包括在試劑盒內的紙張)上的書面指示，但亦可接受機器可讀指示(如：在磁化或光儲存碟上承載的指示)。
標籤或包裝夾頁上的說明書指示該組成物係用於治療、延遲發作及/或緩和諸如癌症之目標疾病，。說明書可提供實現本文所述之任何方法。
本揭露之試劑盒係經合適的包裝。合適的包裝包括，但不限於，小玻璃瓶、瓶子、罐子、軟性包裝(如：密封的聚脂膠膜或塑料袋)等。亦可考慮用於與特定裝置，例如吸入器、鼻腔給藥裝置(如：霧化器)或輸注裝置(例如微型真空泵)結合使用的包裝。試劑盒可具有無菌入口(例如，容器可為靜脈內溶液袋或具有可透過皮下注射針刺穿之瓶塞的小玻璃瓶)。容器可具有無菌入口(例如，容器可為靜脈內溶液袋或具有可透過皮下注射針刺穿之瓶塞的小玻璃瓶)。組成物中之至少一種活性劑係如本文所述之帶有光敏劑的磁性病毒粒子。
試劑盒可選擇性的提供諸如緩衝液之額外成分及解說資訊。通常該試劑盒包含容器以及在容器上或與容器相關聯的標籤或包裝夾頁。於一些具體實施例中，本發明提供了包含上述試劑盒內容物的製品。
一般技術
除非另有說明，否則本發明的實施將採用本領域技術範圍內的分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學及免疫學的常規技術。此種技術在文獻中皆有充分的解釋，例如，Molecular Cloning：A Laboratory Manual,second edition(Sambrook,et al.,1989)Cold Spring Harbor Press、Oligonucleotide Synthesis (M.J.Gait,ed.,1984)、Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology：A Laboratory Notebook(J.E.Cellis,ed.,1998)Academic Press、Animal Cell Culture(R.I.Freshney,ed.,1987)、Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather and P.E.Roberts,1998)Plenum Press、Cell and Tissue Culture：Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths,and D.G.Newell,eds.,1993-8)J.Wiley and Sons、Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.)、Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir and C.C.Blackwell,eds.)、Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller and M.P.Calos,eds.,1987)、Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel,et al.,eds.,1987)、PCR：The Polymerase Chain Reaction(Mullis,et al.,eds.,1994)、Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan et al.,eds.,1991)、Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons,1999)、Immunobiology(C.A.Janeway and P.Travers,1997)、Antibodies(P.Finch,1997)、Antibodies：a practical approach(D.Catty.,ed.,IRL Press,1988-1989)；Monoclonal antibodies：a practical approach(P.Shepherd and C.Dean,eds.,Oxford University Press,2000)、Using antibodies：a laboratory manual(E.Harlow and D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)、The Antibodies(M.Zanetti and J.D.Capra,eds.,Harwood Academic Publishers,1995)。
雖本文沒有進一步的闡述，但相信所屬技術領域中具有通常知識者可基於上述說明而將本發明使用至最大範圍。因此，下述具體實施例應被解釋為僅係用於說明，而非以任何方式限制本揭露的其餘部分。對於本文引用之目的或標的，本文所引用之所有刊物均以引用的方式併入本文。
實施例
臨床的病毒療法已被美國食品及藥物管理局(FDA)成功地批准用於癌症治療，然而仍須多種改進以更廣泛地發展病毒療法。特別的挑戰為全身性地給予病毒療法，並克服腫瘤內注射的限制，尤其是敏感器官內的複雜腫瘤。為達成目的，構建與氧化鐵奈米粒子(~5nm)化學共軛的重組腺相關病毒血清型2(AAV2)，其於磁場下展現顯著的遠端引導能力。轉導係藉由微型精度而實現。此外，將用於產生光敏蛋白質KillerRed的基因引入AAV2基因體中以實現光動力治療(PDT)；或光觸發病毒療法。活體內實驗顯示尾靜脈注射“鐵化”之AAV2-KillerRed的磁性引導與PDT結合，透過細胞凋亡，顯著地降低腫瘤生長。此原理驗證證實了引導及高度定位的微型光觸發病毒療法。
材料及方法 材料及細胞培養
氧化鐵奈米粒子與羧酸(批號：051413A；尺 寸：5nm；ζ電位：-30mV至-50mV)係從Ocean NanoTech(San Diego,CA)所購得。(1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽)(EDC)、N-羥基磺基琥珀醯亞胺(Sulfo-NHS)及2-(N- 啉基)乙磺酸(MES)緩衝鹽水係從Thermo Scientific Inc.(Rockford,IL)所購得。磷酸鹽緩衝液(PBS)係從Sigma Co.(St.Louis,MO)所購得。支化聚乙亞胺(PEI,Mw=25,000)係從Aldrich(Milwaukee,MI)所購得。pKillerRed-dMito之質體DNA係從Evrogen JSC(Moscow,Russia)所購得。病毒(AAV2-螢光酵素)及pHelper、pAAV-RC2、pAAV-GFP及pAAV-MCS之質體DNA係從Cell Biolabs(San Diego,CA)所購得。質體pAAV-KillerRed係依據下述方式建構。首先，藉由聚合酶鏈式反應(PCR)並使用以下引子序列：5’-GGCGAATTCGCCACCATGGGTTCAGAGGGCGGCCCCGCCC-3’(SEQ ID NO：5)及5’-ACGCGTCGACTTAATCCTCGTCGCTACCGATGGCGCTGGT-3’(SEQ ID NO：2)，將EcoRI及SalI位點加入來自於pKillerRed-dMito之KillerRed片段。然後，將PCR產生的KillerRed cDNA(0.71kb)複製到pAAV-MCS的EcoRI-SalI位點上，以產生pAAV-KillerRed(第3A圖及第8圖)。
將人胚胎腎293(HEK293、CRL-1573、ATCC)及293T(CRL-3216、ATCC)細胞株培養在含10%胎牛血清(FBS)、100UmL-1青黴素及100μgmL-1鏈黴素的杜 皮克氏改良愛哥爾氏培養基(Dulbecco's Modified Eagle’Medium,DMEM))內。細胞係於含有5%CO2的37℃培養箱中培養。
病毒的生產、純化及效價
利用AAV-2 Helper Free包裝系統(Cell Biolabs)生產AAV2-GFP或AAV2-KillerRed。簡言之，藉由PEI介導的質體DNA(pHelper、pAAV-RC2及pAAV-轉基因)共轉染於293T細胞中以產生AAV2-報導因子。對於每個100-mm培養皿，將20μg的pHelper、10μg的pAAV-RC2及pAAV-GFP(或pAAV-KillerRed)轉染至293T細胞。將三種質體DNA在無血清的培養基內與40μg的PEI混合，然後藉由渦旋混合徹底的混合30至60秒，並放置至少20至30分鐘。轉染時間僅執行30分鐘。轉染後3天即穫得經轉染的細胞。依據ViraBindTM AAV純化試劑盒(Cell Biolabs)及QuickTiterTM AAV定量試劑盒(Cell Biolabs)的計畫書對AAV2-GFP或AAV2-KillerRed執行純化及效價以進行病毒轉導。在每毫升的AAV2-GFP或AAV2-KillerRed原液中，各批次的病毒產量(8×100-mm培養皿)的基因體拷貝數(GC)為1011至1012。直至使用前，純化的病毒係儲存於-80℃。
製備及鐵化病毒之特徵
鐵化AAV2係藉由化學共軛之方法而製備(第1B圖)。製備在MES緩衝鹽水溶液內含有氧化鐵奈米粒子、羧酸(25μg，0.1725nmol)、EDC(0.1725、0.865、 1.73、3.46、4.325、8.65或17.3nmol)之反應混合物，且於該混合物中輕輕加入Sulfo-NHS並在25℃下攪拌15分鐘，以獲得氧化鐵奈米粒子與胺反應性Sulfo-NHS酯的均勻溶液。將在PBS中的AAV2原液(0.5μL，1×1012GCmL-1)滴加到混合物中，然後在25℃恆溫下反應120分鐘。於化學共軛步驟後，藉由使用PBS平衡及溶劑交換為PBS的粒徑脫鹽管柱(截留分子量：100K)純化該黃色溶液(第9圖)。於純化步驟後，藉由使用PCR與下述AAV2-KillerRed之引子序列：5'-GCCCATGAGCTGGAAGCC-3'(SEQ ID NO：3)及5'-CGATGGCGCTGGTGATGC-3'(SEQ ID NO：4)；第10圖)以獲得高達~90%之回收率。所獲得的AAV2-KillerRed之PCR片段與預期的539bp尺寸一致。
對於穿透式電子顯微鏡(TEM,JEOL JEM-1400)分析，將一滴鐵化AAV2溶液在Formvar-碳塗覆之200篩目銅網上以空氣乾燥。然後，以100kV之加速電壓，在JEOL-1400顯微鏡上獲得TEM圖像。
轉導
所有病毒感染及轉導之實驗皆係使用含有10% FBS、100UmL-1青黴素及100μgmL-1鏈黴素之培養基。使用AAV2-GFP(綠色螢光蛋白質)作為信號指標，以測定鐵化病毒或無鐵化病毒在無任何磁場環境的轉導能力。將HEK293細胞以每孔1×105個細胞接種於24孔盤中，並在第二天進行感染。將各種莫耳比的奈米粒子/EDC及AAV2-GFP的鐵化AAV2樣品分別加入含有10%FBS的 DMEM培養基中轉導6天。
藉由流式細胞術(Beckman Coulter,Fullerton,CA,USA)定量評估經病毒轉導之GFP表現細胞。藉由0.025%胰蛋白酶將細胞脫離，並將懸浮液轉移至微管，且藉由4%多聚甲醛固定。藉由正向及側向散射適當地閘控細胞，且每個樣品收集10,000個結果(event)。未感染的細胞係作為陰性對照組使用。
鐵化病毒之毒性
將7×104個HEK293細胞接種於24孔盤的各孔中，並使用培養基培養12小時。然後，將細胞用於測試不同莫耳比之奈米粒子/EDC的鐵化AAV2，並在pH 7.4下培養24小時。培養24小時後，移除包含測試樣品的轉染培養基。此外，該氧化鐵奈米粒子或AAV2係僅在pH 7.4下培養24小時。使用CellTiter96®AQueous單溶液細胞增殖分析系統(Promega，Madison，WI，USA)並按照先前的研究來確定細胞的增殖。甲臘(formazan)係於490nm的光密度(OD)定量細胞的活力。該試劑包含四唑鎓化合物3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑、內鹽(MTS)，以及設定未感染細胞所達到之減少的MTS為100%，且測試細胞的MTS減少係以未感染細胞的百分比表示。
藉由外部磁場之微轉導
從第1E及1F圖的結果可知，隨後選擇用於優化鐵化病毒之奈米粒子/EDC莫耳比為1/20之鐵化 AAV2，進行下述體外及活體內研究。將HEK293細胞以每孔2.5×105個細胞接種於35-mm培養皿中，並於第二天感染。僅將鐵化AAV2或AAV2的試驗樣品與在含有10%FBS的DMEM內之細胞一起培養，然後於直徑1500μm之外部磁場(2,000至2,200高斯)的不同時間點(0、5、10或30分鐘)進行分析。隨後，以4%多聚甲醛(PFA)固定樣品，並使用對AAV2之主要外殼蛋白VP3的胺基酸75至86特異性的抗AAV抗體(abcam，Cambridge，MA)進行病毒之免疫染色，藉以觀察AAV2的分佈。使用與Alexa Fluor®488(abcam)共軛的山羊抗兔IgG H & L將信號放大，並以共聚焦顯微鏡觀察。或者，於6天轉導後，使用共聚焦顯微鏡觀察並分析受感染之細胞的GFP表現。該受感染的細胞係藉由DAPI染色以標記細胞核。
根據先前的KillerRed激活研究(Tseng et al.，Nat.Commun.，2015)，選用561nm氬激光照射20分鐘以優化ROS生成及KillerRed光毒性。在KillerRed照射後，如製造商所述，使用Live/Dead®可固定的遠紅死細胞染色試劑盒(Thermo Fisher Scientific Inc.)觀察感染細胞。該受感染的細胞係藉由DAPI染色以標記細胞核。
小鼠研究
涉及動物的所有方法均獲得中央研究院實驗動物管理與使用委員會(AS IUCUC)的許可。無胸腺BALB/c裸鼠(6週齡雄性)係由國家實驗動物中心(台灣)所提供。小鼠係養護在受控制的12小時/12小時之光照/ 黑暗週期的環境中，並以最多5組的方式飼養，且允許隨意獲取食物及水。
活體內光觸發病毒療法之效能
依據第4圖的試驗製備方式，將帶有L858R及T790M的EGFR-TKI抗性H1975細胞藉由皮下注射方式注射2×106個細胞至6週齡雄性無胸腺裸鼠的腹部，以建立異體移植腫瘤，並評估鐵化AAV2或未經修飾的AAV2(於有或沒有外部磁場的情況下)在腫瘤部位上之光觸發病毒療法的療效。一旦腫瘤達到~200mm3體積，將小鼠隨機分成五組，藉由尾靜脈注射100μL含有鐵化AAV2(5×109GC小鼠-1)或AAV2(5×109GC小鼠-1)的PBS。以PBS注射處理作為控制組小鼠。在將磁場應用於靶向腫瘤的治療時，將H1975(EGFRL858R/T790M)異體移植腫瘤在1.5T高斯的磁場中暴露2小時。
於第3天時，使用1.5mW mm-2的總輻照度治療動物以活化KillerRed。雷射光纖的尖端係裝載在腫瘤的上方，垂直於動物。此方案係於初始優化實驗後所確定者(Tseng et al.,Nat.Commun.,2015)。如第4A圖所述，從注射後第3天開始，每天給予腫瘤20分鐘的雷射治療，並持續5天。在每天治療後，利用測徑器測量腫瘤生長。測量腫瘤的長度(L)及寬度(W)，並依據下式計算腫瘤體積：腫瘤體積=(0.5L2)W。於最後一次治療的24小時後，進行腫瘤尺寸的檢查。
組織學及免疫組織化學分析
接種15天後，可收集H1975(EGFRL858R/T790M)異體移植腫瘤。將所收集的異體移植腫瘤在10%福爾馬林中固定，並以石蠟包埋，以及使用蘇木素及伊紅(H & E)將5mm之切片進行染色，並藉由顯微鏡檢測。異種移植腫瘤切片亦使用Alexa 594®(Molecular Probes，Eugene，Oregon)及普魯士藍或Click-iT® Plus TUNEL分析進行染色，以檢測腫瘤內鐵化AAV2之氧化鐵奈米粒子或觀察所偵測的原位細胞凋亡。
血液分析
於第0天、第2天、第7天及第14天施用鐵化AAV2-KillerRed後，藉由使用眼窩採血方式採集無胸腺BALB/c裸鼠的血清。從獲得的血清中進行麩胺酸草乙酸轉胺酶(GOT)、麩胺酸丙酮酸轉胺基酶(GPT)、總膽紅素(TBIL)及肌酐(CRE)水平的生化分析。使用測量相對天冬胺酸轉胺酶(AST)及丙胺酸轉胺酶(ALT)活性的酵素方法，以測定GOT及GPT的水平。又，依據製造商的說明，使用Randox診斷檢驗套組測定TBIL的水平，其係包括肝癌及肝炎的肝細胞損傷的指標。使用Randox診斷檢驗套組檢測CRE水平作為腎功能的指標。
活體內生物螢光影像
將經無菌過濾的PBS溶液中的鐵化AAV2-螢光酵素或AAV2-螢光酵素(100μL總體積中含有5×109GC AAV2)藉由尾靜脈注射至經或未經外部磁場處理之異種移植腫瘤的小鼠中。生物螢光影像係於治療後的第7天及第 14天取得。小鼠於充滿2%異氟醚(isoflurance)的氧氣室中麻醉。以腹膜內(IP)注射螢光素(~240μL，Caliper Life Sciences Inc.，Hopkinton，MA)後，並於培育後5至10分鐘，藉由IVIS影像系統(具有Living Image軟體的Xenogen IVIS-50)以5分鐘之恆定的影像擷取時間為5分鐘(Bin：16/4，FOV：12)擷取螢光影像。活體內生物螢光信號之計算係在扣除各小鼠全身體感興趣區域的背景(光子通量sec-1cm-2sr-1)後，每隻小鼠俯臥及仰臥所採集的螢光信號之總和。
統計分析
數據顯示為平均值±實驗重複六次之數據之標準偏差。於活體內腫瘤體積的測量中，數據顯示為平均值±實驗重複六次之平均值之標準誤差。於統計顯著性檢驗中，假設變異數不相等，使用雙尾t檢定計算P值。
結果 (1)病毒鐵製劑之製備
為嚴格驗證此種新概念，將腺相關病毒血清型2(AAV2)以各種莫耳比的奈米粒子/1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)，與具有羧酸的氧化鐵奈米粒子進行共軛(尺寸：5nm)，該共軛係經由EDC/N-羥基磺基琥珀醯亞胺(Sulfo-NHS)透過AAV表面蛋白質的胺基進行共軛(第1B圖)而成者。氧化鐵奈米粒子或鐵化AAV2之穿透電子顯微鏡(TEM)的影像具有ca.5nm(第1C圖)或30至40nm(第1D圖)的直徑。
於完全培養基(10%胎牛血清、100UmL-1青黴素及100μgmL-1鏈黴素)中進行病毒感染的體外表徵及分析。使用AAV2-GFP(綠色螢光蛋白質)分析及流式細胞術以評估化學共軛對於AAV2轉導效率的影響(第1E圖)。相對於AAV2的對照治療，於沒有磁場之轉導後的第6天，經鐵化AAV2治療之細胞維持恆定的GFP表現，其莫耳比為1/1至1/20(P>0.25)。當莫耳比為1/25時，轉導效率下降至55.6%(P<0.005)，而當莫耳比為1/100時，轉導效率下降至38.7%(P<0.005)。此等數據清楚地顯示，用於將氧化鐵奈米粒子與羧酸共價偶聯至AAV2表面蛋白質之化學鍵的性質，由於表面配體的競爭而影響了病毒轉導之效率(Lochrie et al.,J.Virol.,2006)。任何莫耳比的鐵化AAV2與人胚胎腎(HEK293)細胞培養後，並未觀察到細胞毒性(第1F圖)。總體而言，優化的1/20莫耳比之鐵化AAV2，係適合於藉由低毒性的AAV2進行磁性引導的轉導及光敏化而有效地感染細胞。
(2)鐵化AAV2分佈之遠端磁化控制
為進一步評估鐵化AAV2遠端磁化控制的能力，使用免疫染色測定法與抗AAV2抗體及與螢光染劑ALEXA FLUOR®488共軛的第二抗體來觀察細胞培養物中AAV2的分佈。在暴露於磁場(2,000至2,200高斯)5、10或30分鐘的時間內累積可見的螢光，以產生AAV2分佈的局部控制(第2A圖)。反之，未修飾的AAV2在暴露於磁場30分鐘時，具有均勻的隨機分佈(第2B圖)。同 樣地，感染後的細胞暴露於直徑為1,500μm的圓柱形磁體之相同磁場中培養最長持續30分鐘後，並於轉導6天後檢測經鐵化AAV2感染之細胞的GFP表現。第2C及2D圖中的螢光強度闡明表現GFP細胞之分佈顯示直徑為2,000μm的“微轉導”分佈。反之，表現GFP之未經修飾的AAV2感染的細胞則係隨機分佈(第2E圖)。
(3)使用鐵化AAV2-KillerRed之光觸發病毒療法
以數據證實細胞微轉導的成功性，利用AAV2-KillerRed(第3A圖)與對應波長為561nm的光照射20分鐘(Tseng et al.,Nat.Commun.,2015)以實施光觸發病毒療法。與所觀察到的經鐵化AAV2感染的GFP表現細胞一致，KillerRed表現僅產生於圓形區域(第5A圖)。亦與GFP表現一致，AAV2-KillerRed對照組並無偏向的空間轉導(第5B圖)。由於KillerRed具有光誘導毒性，因此在表現KillerRed蛋白質的細胞中，使用黃光照射後可觀察到細胞死亡的情形。在未經AAV2-KillerRed感染的情況下，死亡細胞之分佈係有效地累積於磁場微點中，且並不會產生光毒性(第3B及3C圖)，顯示相對於未經修飾之AAV2之遠端控制的鐵化AAV2用於光觸發病毒療法(第3D圖)。
(4)藉由血流進行抗腫瘤活性及生物分佈的臨床前研究
在具有EGFR-TKI抗性H1975(EGFRL858R/T790M)異種移植腫瘤的無胸腺BALB/c裸鼠中，使用遠端鐵化AAV2-KillerRed執行光觸發病毒療法治 療(第4A圖)。值得注意的是，對比於由H & E(蘇木素及伊紅)染色指示的大面積腫瘤壞死(第4C圖)、藉由TUNEL(末端脫氧核苷酸轉移酶dUTP缺口末端標記)分析進行廣泛的陽性染色(第4D圖)，以及經由DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)染色標記的核酸(第4E圖)，相較於其他治療，使用鐵化AAV2-KillerRed治療係與強烈抑制腫瘤生長相關(第4B圖及第6圖)。此外，以普魯士藍染色的淺藍色區域，顯示暴露於磁場及鐵化AAV2的樣品中鐵的分佈及鐵存在量的增加(第4F圖)。經由尾靜脈注射，單次施予鐵化AAV2-KillerRed會導致顯著地抑制腫瘤生長，然而其欠缺長期抑制。令人印象深刻的是，當在第8天再次注射鐵化AAV2-KillerRed時，在額外的5天內可完全中止腫瘤體積的增長，並在此之後顯著抑制腫瘤的生長(P<0.015)。反之，在沒有磁化場或光照的情況下，僅傳遞AAV2-KillerRed或鐵化AAV2-KillerRed並不會導致任何統計相關的抗腫瘤作用。同步遞送與其他研究一致，皆為協助克服實現全身性遞送固有的困難挑戰(Ledford,Nature,2015；Bell et al.,Cell Host Microbe,2014；Russell et al.,Nat.Biotechnol.,2012；Miest et al.,Nat.Rev.Microbiol.,2014；Kotterman et al.,Nat.Rev.Genet.,2014)。
使用鐵化AAV2-KillerRed治療的動物亦須評估麩胺酸草乙酸轉胺酶(GOT)、麩胺酸丙酮酸轉胺基酶(GPT)、總膽紅素(TBIL)及肌酐(CRE)之水平，以檢 測肝及腎功能。該等生化分析並未顯示任何顯著的肝臟或腎臟毒性(第4G圖)。於所有實驗組中，並未檢測到顯著的體重損失，這表示無任何嚴重的鐵化病毒、磁場暴露或光照相關的毒性存在(第4H圖)。除了使用鐵化AAV2-螢光酵素以外，利用與活體內研究相同的方式，使用生物螢光之動物治療，於第7天(第7圖)及第14天(第4I圖)探討生物的分佈。與該等發現一致的是，在使用磁性引導的第7天及第14天時，在腫瘤中觀察到顯著的生物螢光，且與第4B圖所示的腫瘤抑制一致。這加強了在遞送中，對遠端控制特異性的動態依賴性。如預期，在肝臟中亦觀察到與病毒及奈米粒子的清除途徑一致的生物螢光(第4J圖)(Tseng et al.,Nat.Commun.,2015)。
綜上所述，已證實藉由遠端引導的“鐵化”病毒遞送，達到光觸發病毒療法之抗腫瘤效果的特異性。此種技術概念可用於藉由血流的全身性遞送，以改善治療功效及準確性。本發明之鐵化AAV2有幾個區別的技術特徵，例如靶向遞送、光觸發激活病毒療法、缺乏重組與基因體整合(Kotterman et al.,Nat.Rev.Genet.,2014)以及強大的臨床前安全性數據(Kotterman et al.,Nat.Rev.Genet.,2014)，其等特徵定義了本發明的潛在優點。又，可應用磁振造影(MRI)儀器以在預期的方位建立脈衝磁場梯度(Muthana et al.,Nat.Commun.,2015)，且可提供在內部3D體積內形成積聚的前景。
其他具體實施例
本說明書中公開的所有技術特徵可以任何組合方式進行組合。本說明書中公開的每個技術特徵可被替換為提供相同、等同或相似目的之替代的技術特徵。故，除非另有明確說明，否則所公開的每個技術特徵僅係一系列等同或類似技術特徵的實施例。
從上述描述中，所屬技術領域中具有通常知識者可容易地確定本發明之基本特徵，並在不脫離本發明之精神及範疇下，可對本發明進行各種改變與修改，以使其適應於各種用途及條件。故，其他具體實施亦在本發明之申請專利範圍內。
等效
雖然本文已描述及說明了若干發明具體實施例，惟所屬技術領域中具有通常知識者將容易聯想到用於執行該功能及/或獲得結果的多種其他手段、及/或結構、及/或一或多個本文所述之優點，且每種變化及/或修改被認為係在本文所述之本發明之實施例範疇內。更一般言之，所屬技術領域中具有通常知識者將容易理解，本文所述之所有參數、尺寸、物質及配置都係例示性的，且實際參數、尺寸、物質及/或配置將取決於具體的應用或使用於本發明所教示之應用。所屬技術領域中具有通常知識者將認定，或使用常規實驗就能夠確定本文所述之具體實施例中的許多等同物。因此，應該理解的是，上述具體實施例僅係以實例的方式呈現，並在所述申請專利範圍及其等同物之範疇內，可以不同於具體的描述及請求保護的方式來 實施本發明具體實施例。本揭露之發明具體實施例係針對本發明所述之每一個別技術特徵、系統、物品、物質、試劑盒及/或方法。此外，若此種特徵、系統、物品、物質、試劑盒及/或方法不相互矛盾，那麼兩種或更多此種特徵、系統、物品、物質、試劑盒及/或方法的任何組合皆包含於本揭露之發明範疇內。
如本文所界定及使用的所有定義應理解為受控於字典之定義、藉由引用方式併入的文獻中之定義，及/或所界定之術語的普通含義。
藉由引用方式併入本文中所公開的所有參考文獻、專利及專利申請案中關於每個被引用的標的，其於一些情況下可涵蓋整體文獻。
在說明書及申請專利範圍中使用之不定冠詞“一”(a)及“一”(an)，除非有相反的明確說明，其應理解為表示“至少一個”。
本文在說明書及申請專利範圍中使用之詞組“及/或”應當理解為意指元素中的“一或兩種”的結合，即，在某些情況下結合存在的元素及在其他情況下分離存在的元素。以“及/或”列出的多個元素應以相同的方式解釋，即，“一或多種”元素的連接。不管與具體標識的元素相關與否，非由“及/或”子句具體標識的其他元素亦可選擇性的存在。因此，作為非限制性實例，當與諸如“包含”之開放式語言結合使用時，參比“A及/或B”，在一個具體實施例中可僅限於A(可選擇性地包括B以外之元素)；在另一 具體實施例中，僅限於B(可選擇性地包括A以外之元素)；在另一具體實施例中，涉及A及B(可選擇性地包括其他要素)；等等。
如在本說明書及申請專利範圍中所使用的“或”應被理解為具有與如上述所定義之“及/或”相同的含義。舉例言之，當於列表中分開項目時，“或”或“及/或”應被解釋為包含性的，即在一些元素或元素列表中意指包含至少一個，但亦包含超過一個，且可選擇性地包括未列出之其他項目。只有清楚地表明相反的術語，諸如“僅一個”或“恰好一個”，或者當在申請專利範圍中使用“由...組成(consisting of)”將意指包含數個或列表元素中的恰好一個元素。一般而言，當在如本文所使用之術語“或”之前放置諸如“其中(either)”、“其中之一(one of)”、“僅為其中之一(only one of)”或“洽為其中之一(exactly one of)”之排他性術語，僅當被解釋為排他性選擇(即，“兩者中的其中一個或另一個，而非兩者”)。當於申請專利範圍中使用“基本上係由...組成(consisting essentially of)”具有其於專利法領域中使用之普通含義。
如在本文之說明書及申請專利範圍中所使用之在一或多個元素列表中的詞組“至少一者(at least one)”，應該理解為意指自元素列表中的任何一個或多個元素選取至少一元素，但不一定包括元素列表內具體列出的每個元素中的至少一者，且不排除元素列表中元素之任何組合。不管與具體標識的該等元素相關與否，該“至少一者” 的定義亦可為元素可選擇性的存在，而非在元素列表內具體標識的元素。因此，作為非限制性實例，“A及B中之至少一者”(或者等同地，“A或B中之至少一者”，或者等效地“A及/或B中之至少一者”)可在一個具體實施例中，意指至少一個，可選擇性的包括多於一個A，但無B(並且可選擇性的包括除B之外的元素)；於另一具體實施例中，涉及至少一個，可選擇性的包括多於一個B，但無A(並且可選擇性的包括除A之外的元素)；於另一具體實施例中，涉及至少一個，可選地包括多於一個A，及涉及至少一個可選擇性的包括多於一個B(以及可選擇性的包括其他元素)；等等。
亦應該理解的是，除非有相反的明確說明，否則於此申請專利範圍之任何方法，包括多於一個的步驟或動作，該方法的步驟或動作的順序不一定侷限於所述之該方法之步驟或動作。
<110> 中央研究院
<120> 光觸發病毒療法之遠端控制
<130> A0988.70079WO00
<140> 尚未分配
<141> 與此同時
<150> US 62/417,946
<151> 2016-11-04
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 239
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<400> 1
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Figure 106137916-A0202-12-0044-3
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<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
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<223> 合成的多肽
<400> 5
Figure 106137916-A0202-12-0045-7

Claims (18)

  1. 一種磁性病毒粒子，包含與磁氧化奈米粒子化學共軛形成共價鍵之病毒粒子，其中，該病毒粒子包含光敏劑，且該磁氧化奈米粒子與乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽的莫耳比係1/1至1/20。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之磁性病毒粒子，其中，該磁氧化奈米粒子係氧化鐵奈米粒子，以及該磁性病毒粒子係包含與該氧化鐵奈米粒子化學共軛形成共價鍵之病毒粒子的鐵化病毒粒子。
  3. 如申請專利範圍第1或2項所述之磁性病毒粒子，其中，該磁氧化奈米粒子具有從1至100nm之直徑範圍。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之磁性病毒粒子，其中，該磁氧化奈米粒子具有從1至20nm之直徑範圍。
  5. 如申請專利範圍第1或2項所述之磁性病毒粒子，其中，該病毒粒子係腺相關病毒(AAV)粒子、慢病毒粒子或腺病毒粒子。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之磁性病毒粒子，其中，該病毒粒子係AAV粒子，且係AAV血清型1至9中之任一者。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之磁性病毒粒子，其中，該光敏劑包含KillerRed蛋白質。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之磁性病毒粒子，其中，該KillerRed蛋白質包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列。
  9. 一種如申請專利範圍第1至8項中任一項所述之磁性病毒粒子用於製備治療肺腫瘤之藥物的用途，包含：(i)對有需要之受試者施予有效量之該磁性病毒粒子，其中，該磁性病毒粒子帶有光敏劑；(ii)對該受試者的肺腫瘤部位施予磁場，以誘導該磁性病毒粒子定位於該肺腫瘤部位；以及(iii)於步驟(ii)之後，對該受試者的該肺腫瘤部位執行光照射。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之用途，其中，步驟(iii)係以540至580nm之波長執行。
  11. 一種製備磁性病毒粒子之方法，包含在一種或多種交聯劑的存在下，將磁氧化奈米粒子與病毒粒子化學共軛形成共價鍵，其中，該病毒粒子帶有包含KillerRed蛋白質之光敏劑。
  12. 如申請專利範圍第11項所述之方法，其中，該磁氧化奈米粒子係氧化鐵粒子。
  13. 如申請專利範圍第11項所述之方法，其中，該化學共軛涉及乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)介導的共軛。
  14. 如申請專利範圍第11項所述之方法，其中，該化學共軛的步驟包含：(i)在羧基活化劑的存在下，將磁氧化奈米粒子與羧酸混合，以形成混合物；(ii)將能夠使羧基轉化成胺反應性N-羥基琥珀 醯亞胺(NHS)酯之試劑置入該混合物中，以形成經該胺反應性NHS酯修飾之該磁氧化奈米粒子；以及(iii)將經修飾之該磁氧化奈米粒子與該病毒粒子培養，以形成該磁性病毒粒子。
  15. 如申請專利範圍第14項所述之方法，其中，該羧基活化劑係碳二亞胺化合物。
  16. 如申請專利範圍第15項所述之方法，其中，該碳二亞胺化合物係EDC。
  17. 如申請專利範圍第14項所述之方法，其中，於該步驟(ii)中之該試劑係N-羥基磺基琥珀醯亞胺(Sulfo-NHS)。
  18. 如申請專利範圍第11項所述之方法，其中，該KillerRed蛋白質包含SEQ ID No：1之胺基酸序列。
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