BRPI0115794B1 - método para introduzir uma molécula em uma célula, composição farmacêutica, e, uso de uma molécula de transferência associada com um veículo viral e um agente fotossensibilizante ou de uma célula - Google Patents

Abstract

"métodos para introduzir uma molécula em uma célula, e para tratar ou prevenir uma doença, distúrbio ou infecção em um paciente por terapia gênica, célula, composição farmacêutica, e, uso de uma molécula de transferência associada com um veículo viral e um agente fotossensibilizante ou de uma célula". a presente invenção provê um método para introduzir uma molécula no citosol de uma célula, em que a célula é contatada com um agente fotossensibilizante, a célula é irradiada com luz de um comprimento de onda efetivo para ativar o agente fotossensibilizante e, substancialmente ao mesmo tempo ou após a irradiação, a célula é contatada com a molécula a ser introduzida, particularmente para uso no tratamento de câncer, terapia gênica e vacinação.

Description

“MÉTODO PARA INTRODUZIR UMA MOLÉCULA EM UMA CÉLULA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E, USO DE UMA MOLÉCULA DE

TRANSFERÊNCIA ASSOCIADA COM UM VEÍCULO VIRAL E UM AGENTE FOTOSSENSIBILIZANTE OU DE UMA CÉLULA” A presente invenção refere-se a um método de introdução de moléculas em células usando um agente fotossensibilizante e irradiação de células com luz de um comprimento de onda efetivo para ativar o agente fotossensibilizante, em que a molécula a ser introduzida é associada com um veículo viral e particularmente um veículo adenovírus. A presente invenção ainda se refere ao uso deste método em terapia gênica. A terapia gênica, isto é, modificação genética das células em um paciente a fim de combater doença, é reconhecida como tendo um grande potencial terapêutico para o tratamento de várias doenças, como câncer, doenças infecciosas incluindo infecções virais e bacterianas, doenças cardiovasculares, distúrbios herdados como fibrose cística, distúrbios do sistema imune e muitas outras condições. O desenvolvimento clínico de terapia gênica é, no entanto, ainda defrontado com muitos desafios não resolvidos, dos quais um dos mais importantes é encontrar métodos para a liberação eficaz e específica de genes terapêuticos para as células alvo in vivo (Verma & Somia, 1997, Nature, vol. 389, 239-242 e Anderson, 1998, Nature, vol. 392, 25-30). A terapia gênica pode envolver muitas diferentes abordagens possíveis e pode envolver a transferência de genes humanos clonados ou segmentos de genes, genes humanos de filamentos duplos ou segmentos de genes, genes de outros genomas e organismos, oligonucleotídeos e vários genes artificiais ou fragmentos dos mesmos como genes anti-sentido.

Em métodos atuais, muitos veículos ou vetores diferentes foram sugeridos para uso na obtenção de transferência de genes em terapia gênica. Como exemplos de compostos policatiônicos, lipídeos catiônicos e sistemas virais podem ser mencionados, mas mesmo assim a terapia gênica in vivo tem se deparado com pouco sucesso. Dentre os muitos inconvenientes conhecidos dos métodos atuais está uma baixa estabilidade em soro do vetor, especificidade limitada na liberação dos genes, baixa eficácia na liberação de genes, etc. O uso de veículos virais foi abordado com cuidado particular devido à introdução de elementos virais em hospedeiros que podem causar efeitos adversos como inflamação, que não são desviados por melhorada transferência comparada com outros métodos. A maior parte das moléculas não penetra prontamente nas membranas das células. Os métodos para a introdução de moléculas no citosol de células vivas são bem conhecidos dos versados na arte e ferramentas utilizáveis para a manipulação e estudo de processos biológicos. Dentre os métodos mais comumente usados estão micro-injeção, fusão mediada por fantasmas de células de sangue vermelhas, e fusão de lipossomas, lise osmótica de pinossomas, carga de esffegaços, eletroporação, transfecção mediada por vírus e fosfato de cálcio. Estas técnicas são utilizáveis para manipulação de células em cultura, apesar de em muitos casos poderem ser impraticáveis, consumidoras de tempo, ineficientes ou podem induzir morte significante de células. Assim, estas técnicas não são ótimas para uso em pesquisa biológica ou médica, ou em terapias, onde são com frequência não eficientes de modo suficiente, podem ter efeitos tóxicos intoleráveis, ou podem não ser aplicáveis por razoes técnicas. r E bem conhecido que porfirinas e muitos outros compostos fotossensibilizantes podem induzir efeitos citotóxicos em células e tecidos.

Estes efeitos são baseados no fato de que quanto da exposição à luz, o composto fotossensibilizante pode se tomar tóxico ou pode liberar substâncias tóxicas como oxigênio singleto ou outras espécies oxidantes que são danificadoras para o material celular ou biomoléculas, incluindo as membranas de células e estruturas de células, e este dano celular ou à membrana pode eventualmente matar as células. Estes efeitos foram utilizados no tratamento de várias anormalidades ou distúrbios, incluindo especialmente doenças neoplásticas. O tratamento é chamado terapia fotodinâmica (PDT) e envolve a administração de agentes fotossensibilizantes (fotoquimioterapêutico) para a área afetada do corpo, seguido por exposição à luz fotoativante a fim de ativar os agentes fotossensibilizantes e converter os mesmos em forma citotóxica, assim as células afetadas são mortas ou seu potencial proliferativo diminuído. Os agentes fotossensibilizantes são conhecidos que irão localizar preferivelmente ou seletivamente no sítio de marcação de alvo desejado, por exemplo a um tumor ou outra lesão.

Conhecem-se vários agentes fotossensibilizantes, incluindo notadamente psoralenos, porfirinas, clorinas e ftalocianinas. Estas drogas se tomam tóxicas quando expostas à luz.

Os fotossensibilizadores de porfirina atuam indiretamente por geração de espécies tóxicas de oxigênio, e são considerados como candidatos particularmente favoráveis para PDT. As porfirinas são precursores de ocorrência natural na síntese de heme. Particularmente, heme é produzida quando ferro (Fe3+) é incorporado em protoporfirina IX (PpIX) pela ação da enzima ferroquelatase. PpIX é um fotossensibilizador extremamente potente, enquanto heme não tem efeito fotossensibilizante. Vários fotossensibilizadores à base de porfirina ou relacionados com porfirina são conhecidos na arte e descritos na literatura. O efeito citotóxico é mediado principalmente através da formação de oxigênio singleto. Este intermediário reativo tem um tempo de vida muito curto nas células (< 0,04 ps). Assim, o efeito citotóxico primário de PDT é realizado durante exposição à luz e muito próximo dos sítios de formação de ’θ2. *02 reage com e oxida proteínas (histidina, triptofano, metionina, cisteína, tirosina), DNA (guanina), ácidos graxos insaturados e colesterol. Uma das vantagens de PDT é que tecidos não expostos à luz podem ser deixados não afetados, isto é, que um efeito de PDT seletivo pode ser obtido. Se tem uma documentação extensiva com relação ao uso de PDT para destruir populações de células não desejadas, por exemplo células neoplásticas. A literatura de patentes descreve vários compostos fotodinâmicos, sozinhos ou conjugados com agentes de marcação, por exemplo imunoglobulinas dirigidos para determinantes de receptor de células neoplásticas, tomando o complexo mais específico para célula. Alguns compostos fotoquímicos, como derivados de hematoporfirina, tem além disso uma capacidade inerente de se localizar em células malignas. Estes métodos e compostos são descritos na parte norueguesa no. 173319 e pedidos de patente norueguesa 90 0731, 176 645, 176 947, 180 742, 176 786, 301 981, 30 0499 e 89 1491. Estes métodos PDT são assim dependentes da destruição de estruturas de células levando à morte da célula. A WO 96/07432 ou o pedido co-pendente WO 00/54802, por outro lado, são relacionados com métodos que usam o efeito fotodinâmico como um mecanismo para introduzir de outra forma moléculas impermeáveis na membrana no citosol de uma célula em um modo que não resulta necessariamente em destruição de célula espalhada ou morte da célula. Nestes métodos, a molécula a ser internalizada e um composto fotossensibilizador são aplicados simultaneamente ou em uma seqüência às células, sobre as quais o composto fotossensibilizador e a molécula são submetidas a endocitose ou em outros modos translocadas em endossomas, lisossomas, ou outros compartimentos limitados da membrana intracelular. A molécula a ser translocada e o composto fotossensibilizador são aplicados às células juntas ou seqüencialmente (preferivelmente separadamente e seqüencialmente) e são absorvidos pela célula junto nos mesmos compartimentos intracelulares (isto é, são co-translocados). A molécula a ser internalizada dentro da célula é então liberada por exposição das células à luz de comprimentos de onda apropriados para ativar o composto fotossensibilizador que, por sua vez, leva à ruptura das membranas do compartimento intracelular e a subsequente liberação da molécula, que está localizada no mesmo compartimento que o agente fotossensibilizante, no citosol. Este método foi chamado “intemalização fotoquímica” ou PCI.

Assim, nestes métodos, a etapa final de exposição das células a luz resulta na molécula em questão ser liberada do mesmo compartimento intracelular como o agente fotossensibilizante e se tomar presente no citosol.

Acredita-se que a fim de que esta técnica seja efetiva, foi essencial que tanto o composto fotossensibilizador como a molécula a serem liberados no citosol estivessem presentes nos mesmos compartimentos intracelulares quando a irradiação foi realizada. No entanto, foi desde então verificado que as moléculas podem ser introduzidas no citosol de células por métodos PCI similares mas onde a exposição das células à luz não é necessariamente a etapa final e os métodos não são dependentes da molécula de transferência e o agente fotossensibilizante estando localizado nos mesmos compartimentos intracelulares no momento da exposição à luz. Em tais métodos, o agente fotossensibilizante pode ser contatado com as células e ativado por irradiação antes da molécula ser internalizada e assim liberada para o citosol é levada ao contato com as células. Assim, apesar do fato de que a molécula a ser internalizada e o agente fotossensibilizante não estarem necessariamente localizados nos mesmos compartimentos intracelulares no momento da exposição à luz, a molécula ainda entra na célula e é liberada para o citosol. Estes resultados são descritos em detalhes no pedido internacional co-pendente (depositado em 29 de novembro de 2001 em nome de The Norwegian Radium Hospital Research Foundation, intitulado “Method”), do qual uma cópia é anexada aqui e que se incorpora aqui por referência.

De modo surpreendente, verificou-se que o uso de técnicas PCI em combinação com vetores virais pode substancialmente melhorar a liberação de genes mediada por vírus para uma célula. Porque os tratamentos fotoquímicos estão em uso clínico (Dougherty et al, 1998, J. Natl. Câncer Inst. Vol. 90, 889-905), e geralmente são muitos específicos e tem poucos efeitos laterais, a tecnologia descrita tem um potencial claro para melhorar tanto a eficácia como a especificidade de terapia gênica in vivo.

Assim, a presente invenção provê um método para introduzir uma molécula em uma célula, referido método compreendendo contatar referida célula com a molécula a ser introduzida que é associada com um veículo viral, e irradiar referida célula com luz de um comprimento de onda efetivo para ativar o agente fotossensibilizante.

Estas etapas podem ser realizadas em qualquer ordem apropriada desde que o resultado eventual seja a absorção celular do veículo viral e assim que a molécula seja introduzida na célula e a intemalização desta molécula. Não são requeridas outra moléculas, exceto o veículo viral e o agente fotossensibilizante, para a realização da invenção. O termo “célula” como usado aqui inclui todas as células eucarióticas incluindo células de insetos e células fungicas e incluindo células somáticas e germinais. As “células “ representativas incluem assim todos os tipos de células de animais mamíferos e não mamíferos, células de plantas, células de insetos, células fungicas, protozoários e protoplastos, e preferivelmente células de mamíferos como células de humanos, camundongo, rato, cachorro, gato, ovelha, cavalo, vaca ou cabra. “Intemalização” como usado aqui se refere à liberação das moléculas a serem introduzidas nas células (às vezes referida aqui como “transferência de moléculas”) com ou sem o veículo viral ainda fixado ao citosol. No presente caso, “intemalização” assim inclui a etapa de liberação da molécula a ser introduzida, opcionalmente em associação com todo ou parte de seu veículo viral, de compartimentos ligados a membrana/ intracelular no citosol e pode, a seguir, ser transferido para o núcleo. Uma vez internalizada, a molécula é considerada como tendo sido “introduzida” na célula de acordo com o método da invenção. O compartimento limitado a membrana intracelular ode ser qualquer um compartimento deste tipo que está presente em uma célula.

Preferivelmente, o compartimento será uma vesícula de membrana, especialmente um endossoma ou lisossoma. No entanto, o compartimento intracelular também pode incluir o aparelho de Golgi ou o retículo endoplásmico.

Como usado aqui, “absorção celular “ ou “translocação” se refere a uma das etapas da intemalização em que as moléculas ou entidades externas à membrana da célula são tomadas na célula de tal modo que são encontradas no interior para a membrana de célula repousando no exterior, por exemplo por endocitose ou outros mecanismos de absorção apropriados, por exemplo em ou associados com compartimento limitado a membrana intracelular, por exemplo o retículo endoplásmico, corpo de Golgi, lisossomas, endossomas, etc.

As “moléculas” apropriadas a serem introduzidas na célula podem ser qualquer uma que seja associada com os veículos virais, vetores virais ou partículas de vírus e são às vezes referidas aqui como “moléculas de transferência”. Estas moléculas são geralmente moléculas de ácido nucleico e podem compreender um gene de comprimento completo a ser introduzido na célula ou um fragmento funcional do mesmo ou pode ser por exemplo uma seqüência de cDNA contendo a seqüência de codificação completa de um gene ou um fragmento funcional do mesmo. Altemativamente, referidas moléculas de ácido nucleico podem codificar moléculas de RNA anti-sentido, ribozimas, aptâmeros, oligonucleotídeos ou oligonucleotídeos formando triplex, ou compreender DNA “decoy” de fator de transcrição e outros.

Preferivelmente, as moléculas de ácido nucleico tem de 10 a 30 000 bases de comprimento, por exemplo 20-10 000 bases de comprimento. “Associado com” como usado aqui refere-se a uma molécula que é incorporada em ou conectada de algum modo a um veículo viral, vetor viral ou partícula viral, por exemplo incorporada não genoma de referida molécula viral ou separada para referido genoma mas transportada dentro da partícula viral. Geralmente, as moléculas a serem introduzidas nas células serão compactadas ou incorporadas dentro das partículas virais, isto é, encapsuladas ou incorporadas dentro de um revestimento viral ou capsídeo.

Preferivelmente, a molécula a ser transportada é um polinucleotídeo e é preferivelmente inserido dentro de uma construção viral que contém alguns elementos derivados virais necessários para permitir que a construção se tome embalada dentro do veículo viral. A molécula a ser transportada pode, por exemplo, ser clonada em um sítio de clonagem no genoma do veículo viral.

Altemativamente, 2 ou mais moléculas separadas contribuindo para estes aspectos podem ser usados como descrito abaixo. Estas partículas virais podem ser selecionadas de modo que elas podem ou não ser capazes de infectar as células por si próprias e, se elas podem infectar as células por si próprias, uma vez que elas foram internalizadas dentro da célula, elas podem ser selecionadas de modo que elas podem ou não ser capazes de se aproveitar do maquinário celular endógeno a fim de replicar e montar novos pacotes de vírus a serem secretados da célula. No entanto, geralmente, quando usadas para terapia gênica ou em outras aplicações in vivo, por razoes de segurança, os vetores virais são geralmente desabilitados de modo que eles podem infectar as células hospedeiras mas não podem replicar, montar novos virions e infectar novas células, isto é, tomam a replicação incompetente. Esta falta de habilidade pode ser realizada por qualquer meio apropriado, mas é convenientemente feita por deleção de alguns dos genes virais requeridos para replicação viral e opcionalmente inserindo os genes terapêuticos que devem ser transferidos em seu local. No entanto, a tecnologia descrita neste pedido também pode ser usada com vírus competentes para replicação ou limitados na replicação, como por exemplo o ONYX-15 (Khuri, F.R. et al (2000), Nature Med 6, 879- 885) ou timidina quinase de vírus de herpes simplex codificando adenovírus limitados em replicação como descritos por Wildner e colaboradores (Wildner O. et al (1999) Gene Ther. 6, 57-62, Wildner O et al (1999) Câncer Res. 59, 410-413) ou por exemplo replicação de retrovírus como descrito por D. Klatzman (apresentação oral e resumo no 8th. Meeting of The European Society of Gene Terapy, Stockholm 7-10 out. 2000). A entidade molecular completa a ser introduzida na célula, isto é, o veículo viral incorporando ou encapsulando a molécula a ser introduzida é às vezes referida aqui como a “partícula de transferência”.

Geralmente, o ácido nucleico que deve ser introduzido na célula pelos métodos da presente invenção é parte de uma construção de base viral, por exemplo um plasmídeo de base viral que contém alguns elementos derivados virais necessários para permitir que a construção se tome embalada dentro do veículo viral/ capsídeo viral/ vetor viral. Altemativamente, no entanto, o ácido nucleico a ser introduzido pode formar parte de uma molécula, por exemplo um plasmídeo e uma segunda molécula pode estar presente que contém as seqüências necessárias para o desenvolvimento do veículo viral que contém a primeira molécula. Além disso, se a ação do ácido nucleico dentro da célula for dependente da expressão da proteína codificada assim ou a produção de RNA da mesma, o ácido nucleico é convenientemente flanqueado por seqüências regulatórias apropriadas (por exemplo promotores) para assegurar expressão de alto nível na células alvo particular. Estes elementos regulatórios podem ser derivados de víms (por exemplo o promotor CMV de citomegalovíms) ou quaisquer outros organismos apropriados e o desenho de construções virais apropriadas para permitir a boa expressão da proteína codificada pela molécula de ácido nucleico são bem conhecidos dos versados na arte. Por exemplo, promotores reguláveis ou específicos para tecido podem ser usados para obter expressão específica ou regulável para tecido ou doença. Por exemplo, o promotor específico para tecido, promotor tirosinase específico para melanoma, pode ser usado. Os promotores reguláveis como promotores regulados para tetraciclina são bem conhecidos.

Mais exemplos de promotores específicos ou regulados que podem ser empregados na presente invenção podem ser encontrados em Hart, I.R. (Semin. Oncol. 1996, 23, 154- 158), Miller e Whelam (Hum. Gene Therapy, 1997), Nettelbeck e Muller (Trends Genet. 2000, 16, 174- 181) e Spear (Anticancer Res. 1998, 18, 3223-3231) e referências nos mesmos. A molécula de “veículo viral” com a qual a molécula de transferência está associada pode ser qualquer sistema viral desde que os veículos virais deste sistema sejam capazes de associação com, incorporação ou encapsulação das moléculas que devem ser introduzidas nas células.

Assim, geralmente, as moléculas de transferência são embaladas dentro de uma partícula viral ou capsídeo de vírus e os termos “partícula viral”, “capsídeo viral” e “vetor viral” são também usados aqui para significar “veículo viral”. Estes termos são usados aqui para não incluir plasmídeos de base viral ou DNA, apesar deste plasmídeo poder ser usado para criar o veículo viral.

Exemplos de sistemas virais apropriados para uso na presente invenção são adenovírus, vírus adeno-associados, retrovírus, lentivírus, Herpesvirus, bacteriófagos, vírus influenza, vírus Sendai, vírus Vaccínia, e Baculovírus, preferivelmente adenovírus, vírus adeno-associados, retrovírus, lentivírus, e bacteriófagos. Adenovírus é um sistema de vírus preferido para uso nos métodos da presente invenção. Para uso de acordo com a invenção, os veículos virais geralmente formam formas modificadas dos vírus de ocorrência natural para adicionar as propriedades desejadas e minimizar possível patogenicidade ou outros efeitos laterais indesejados. Assim, veículos virais representam variantes de vírus usados como rotina para terapia gênica e são bem conhecidos dos versados na arte, mas retém componentes essenciais e identificáveis do vírus fonte.

Como usado aqui, “agente fotossensibilizante” se refere a um agente que é fotossensível e que, na aplicação de uma luz fotoativante, é convertido na forma citotóxica ou dá lugar a uma espécie citotóxica. O agente fotossensibilizante a ser usado de acordo com a presente invenção (que é distinto e preferivelmente diferente para a molécula de transferência) é convenientemente qualquer tal agente que localiza para compartimentos intracelulares, particularmente endossomas ou lisossomas. Uma faixa destes agentes fotossensibilizantes é conhecida na arte e descrita na literatura, incluindo WO96/07432. Menção pode ser feita neste aspecto a ftalocianina de alumínio di- e tetra-sulfonada (por exemplo AlPcS2a), tetrafenilporfinas sulfonadas (TPPSn), azul Nilo, derivados de chlorin e6, uroporfirina I, filoeritrina, hematoporfirina, e azul de metileno que foram mostrados como localizados em endossomas e lisossomas de células em cultura. Esta localização é, na maior parte dos casos, devido a absorção endocítica. Assim, o agente fotossensibilizante é preferivelmente um agente que é absorvido nos compartimentos internos de lisossomas ou endossomas. No entanto, outros agentes fotossensibilizantes que se localizaram para outros compartimentos intracelulares por exemplo o retículo endoplásmico ou o aparelho de Golgi podem ser usados também. Também é conceptível que mecanismos podem estar a postos onde os efeitos do tratamento fotoquímico é realizado nos outros componentes da célula (isto é, componentes diferentes dos compartimentos limitados na membrana). Assim, por exemplo uma possibilidade pode ser que o tratamento fotoquímico destroi moléculas importantes para transporte intracelular ou fusão de vesícula. Estas moléculas podem não estar necessariamente localizadas em compartimentos limitados à membrana.

Classes de agentes fotossensibilizantes apropriados que podem ser mencionadas incluem, assim, porfírinas, psoralenos, ftalocianinas, purpurinas, clorinas, benzoporfirinas, naftalocianinas, corantes catiônicos, tetraciclinas e bases fracas lisomotrópicas ou derivados das mesmas (Berg et al., J. Photochemistry and Photobiology, 1997, 65, 403-409). Outros agentes fotossensibilizantes apropriados incluem texafirinas, feoforbides, porficenos, bacterioclorinas, cetoclorinas, derivados de hematoporfirina, e derivados dos mesmos, fotossensibilizadores endógenos induzidos por ácido 5- aminolevulínico e derivados dos mesmos, dímeros e outros conjugados entre fotossensibilizadores.

Preferivelmente, o fotossensibilizador está na forma livre, isto é, não conjugado a qualquer outra molécula. Especialmente preferivelmente o agente fotossensibilizante é separado do veículo viral, isto é, é uma entidade discreta. No entanto, o fotossensibilizador pode, altemativamente, estar associado com, fixado em, ou conjugado a um veículo ou outra molécula como descrito abaixo, por exemplo, fixado a um anticorpo de marcação ou copulado a um veículo como polilisina. Altemativamente, em algumas circunstâncias, o agente fotossensibilizante pode ser fixado a, associado com ou conjugado ao veículo viral ou parte do mesmo (por exemplo a membrana de lipídeo circundante, por exemplo de um retrovíms) diretamente.

Agentes fotossensibilizantes preferidos incluem TPPS4, TPPS2a, AlPcS2a e outros fotossensibilizadores anfifílicos.

Em um aspecto preferido, a presente invenção provê métodos em que os agentes fotossensibilizantes que podem ser usados são compostos como ácido 5-aminolevulínico ou ésteres de ácido 5-aminolevulínico ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.

Nestes ésteres, 0 grupo 5-amino pode ser substituído ou não substituído, 0 último caso sendo os ésteres ALA.

Mais particularmente, os ésteres ALA para uso de acordo com a invenção são ésteres de ácidos 5-aminolevulínico com alcanóis opcionalmente substituídos, isto é, ésteres alquílicos ou ésteres alquílicos substituídos.

Convenientemente, ésteres ALA que podem ser usados são compostos de fórmula I, r22n- CH2COCH2 - CH2CO- ORl (I) (em que R1 pode representar alquila opcionalmente substituída por grupos hidróxi, alcóxi, acilóxi, alcoxicarbonilóxi, amino, arila, oxo ou flúor e opcionalmente interrompida por átomos de oxigênio, nitrogênio, enxofre ou fósforo; e R2, cada um dos quais pode ser igual ou diferente, representa um átomo de hidrogênio ou um grupo R1) e sais dos mesmos.

Os grupos R1 alquila substituídos podem ser mono- ou poli- substituídos. Assim, grupos R1 apropriados incluem, por exemplo, alquila não substituídos, alcoxialquila, hidroxialcoxialquila, poli-hidroxialquila, poli hidróxi alquilenooxialquila e outros. O termo “acila”, como usado aqui, inclui ambos os grupos carboxilato e carbonato, assim, grupos alquila substituídos por acilóxi incluem, por exemplo, alcoxicarbonilóxi alquila. Nestes grupos, quaisquer porções alquileno têm, preferivelmente, teores de átomo de carbono definidos para os grupos alquila abaixo. Grupos arila preferidos incluem fenila e heteroaromáticos de 5 a 7 membros, monocíclicos, especialmente fenila e estes grupos podem, por si mesmos, ser opcionalmente substituídos.

Grupos R1 alquila substituídos representativos incluem grupos alcoximetila, alcoxietila e alcoxipropila ou grupos aciloximetila, aciloxietila e aciloxipropila, por exemplo pivaloiloximetila. r Esteres de ALA preferidos para uso como agentes fotossensibilizantes de acordo com a invenção incluem os em que R1 representa um grupo alquila não substituído e/ou cada R2 representa um átomo de hidrogênio.

Como usado aqui, o termo “alquila” inclui qualquer grupo hidrocarboneto insaturado ou saturado, alifático, de cadeia reta ou ramificada, de cadeia longa ou curta. Os grupos alquila insaturados podem ser mono- ou poliinsaturados e incluem ambos os grupos alquenila e alquinila. Estes grupos podem conter até 40 átomos de carbono. No entanto, grupos alquila contendo até 10, por exemplo, 8, mais preferivelmente até 6, e especialmente preferivelmente até 4 átomos de carbono, são preferidos.

Menção particular deve ser feita a éster metílico ALA, éster etílico ALA, éster propílico ALA, éster hexílico ALA, éster heptílico ALA e éster octílico ALA, e sais dos mesmos, que representam agentes fotossensibilizantes preferidos para uso de acordo com a invenção.

Os métodos da presente invenção podem ser usados in vitro ou in vivo, ou por tratamento sistêmico ou local in situ, ou por tratamento ex vivo, seguido por administração das células tratadas ao corpo.

Para a realização do método da invenção, as etapas de “contatar” as células com um agente fotossensibilizante e separadamente com o veículo viral podem ser realizadas em qualquer modo conveniente ou desejado. Assim, se a etapa de contato for realizada in vitro, as células podem ser convenientemente mantidas em um meio aquoso, como, por exemplo, meio de cultura de células apropriado e no ponto de tempo apropriado o agente fotossensibilizante ou veículo viral pode ser simplesmente adicionado ao meio sob condições apropriadas, por exemplo em uma concentração apropriada e para uma extensão de tempo apropriada. O agente fotossensibilizante é levado ao contato com as células em uma concentração apropriada e por uma extensão apropriada de tempo que podem ser facilmente determinados por um versado na arte usando técnicas de rotina e que irão depender do agente fotossensibilizante particular usado e do tipo de célula. A concentração do agente fotossensibilizante deve ser tal que uma vez absorvido na célula (por exemplo em ou associado com um ou mais de seus compartimentos intracelulares) e ativado por irradiação, uma ou mais estruturas das células são rompidas por exemplo um ou mais compartimentos intracelulares são lisados ou rompidos. Por exemplo, os agentes fotossensibilizantes usados nos exemplos aqui podem ser usados em uma concentração de pelo menos 10 a 50 pg/ml. Geralmente, para uso in vitro, a faixa pode ser bem mais ampla, por exemplo 0,05- 500 pg/ml. Para tratamentos humanos in vivo, o agente fotossensibilizante pode ser usado na faixa de 0,05-20 mg/kg peso do corpo quando administrado sistemicamente ou 0,1- 20% em um solvente para aplicação tópica. Em animais menores, a faixa de concentração pode ser diferente e pode ser ajustada consequentemente. O tempo de incubação das células como agente fotossensibilizante (isto é o tempo de “contato”) pode variar de alguns minutos a várias horas, por exemplo mesmo até 48 h ou mais. O tempo de incubação deve ser tal que o agente fotossensibilizante é absorvido pelas células apropriadas. A incubação das células com o agente fotossensibilizante pode ser opcionalmente seguida por um período de incubação com meio isento de fotossensibilizador antes das células serem expostas à luz ou a molécula de transferência ser adicionada. A molécula de transferência pode ser qualquer molécula de ácido nucleico como discutido acima e é levada ao contato com as células em associação com um veículo viral em uma concentração/dosagem apropriada e durante uma extensão apropriada de tempo. Uma concentração apropriada de veículo viral pode ser determinada dependendo da eficácia de absorção do veículo em questão nas células em questão e a concentração final que se deseja alcançar nas células. Uma das vantagens surpreendentes do uso de PCI em conjunto com um veículo viral é que menores doses das partículas de vírus podem ser usadas para obter a mesma eficiência de transcrição por exemplo até 20 vezes menos partículas de vírus. As doses apropriadas de veículos de vírus a serem usadas irão como evidente ser dependentes do tipo de vírus usado, e, para aplicações in vivo, o modo de administração, o tipo de doença a ser tratada, se são usados ou não ligandos de marcação (ver abaixo) etc. tipicamente para injeção intratumoral de um vetor adenoviral não replicativo 103 a 1013 unidades formadoras de placas (pfus, partículas infecciosas) devem ser injetados por injeção. Isto deve geralmente corresponder a cerca de 105 a 1015 partículas físicas de vírus, porque em uma preparação de vírus “comum”, somente cerca de 1% das partículas físicas de vírus dão lugar a infecção. Para doses de vírus competentes para replicação mesmo menos das dadas acima podem ser efetivas, por exemplo tão baixas como 103 partículas, por exemplo 103 a 106, IO10 a 1015 partículas podem ser usadas. Por outro lado, onde a administração sistêmica é usada, pode ser necessário aumentar a dose.

Uma outra vantagem que foi observada é que eficácia muito melhorada de transfecção pode ser obtida, mesmo até que 100% de todas as células na experiência sendo transfectadas. Usando métodos conhecidos, estes níveis não foram previamente possíveis ou requeriam, de modo proibitivo, altas doses de vírus. Assim, preferivelmente, os métodos da invenção obtém transfecção de mais do que 50%, especialmente preferivelmente mais de 75, 85 ou 95% das células totais.

Assim, “tempo de transfecção” ou “tempo de absorção celular” para os veículos virais, isto é o tempo de contato dos veículos com a célula, pode ser de alguns minutos ou até algumas horas, por exemplo um tempo de transfecção de 10 minutos até 10 ou 24 horas, por exemplo 15 min até 10 horas ou por exemplo 15 o 30 minutos até 2, 3, 4, ou 6 horas podem ser usados. Um tempo de transfecção aumentado pode resultar em aumentada absorção do veículo em questão.

Os veículos virais podem ser aplicados antes, após ou simultaneamente com irradiação. Quando aplicados após irradiação, os veículos virais podem ser aplicados, por exemplo, 0 a 4 ou 0 a 24 h após irradiação, por exemplo mais de 1 2, 4, 8, 10 ou mesmo 12 horas após irradiação. Opcionalmente, após contato com o veículo viral, a célula pode ser transferida para meio isento de veículo, por exemplo, antes de irradiação, por exemplo por mais de 5 min, como durante 15 min a 2 h, por exemplo durante 30 min. Quando aplicada antes de irradiação, esta pode, por exemplo, nas 12 h precedendo a irradiação, por exemplo 15min a 2 h antes da irradiação, opcionalmente com um intervalo no meio isento de veículo viral.

Será notado que o tempo permitido para transfecção através de contato do veículo viral com a célula é difícil de controlar em aplicações in vivo. No entanto, o tempo de contato pode ser controlado por contato apropriado e etapa de lavagem quando realizados ex vivo, in vitro ou para alguns tipos de administração local. O agente fotossensibilizante e o veículo viral associado com a molécula a ser introduzida podem ser adicionados separadamente ou juntos às células antes do tratamento com luz/ irradiação como descrito em W096/ 07432, WO 00/54802, e o pedido copendente anexado (pedido de patente internacional depositado em 29 de novembro de 2001 em nome da Norwegian Radium Hospital Research Foundation, intitulado “Method”) ou o agente fotossensibilizante pode ser adicionado às células primeiro, seguido pela etapa de irradiação e então a adição do veículo viral como descrito no pedido co- pendente anexado ao mesmo. No último método, preferivelmente a irradiação é realizada antes de absorção celular da molécula de transferência (aqui o veículo viral), especialmente preferivelmente a molécula de transferência é contatada com a células após irradiação por exemplo 0 a 4 horas após a irradiação. Altemativamente, a célula é contatada com a molécula de transferência em substancialmente o mesmo tempo que a irradiação.

Em outras palavras, a etapa de irradiação pode ser realizada antes da absorção de célula dos veículos virais em qualquer compartimento intracelular ou após esta absorção celular, desde que o agente fotossensibilizante tenha sido absorvido nos compartimentos intracelulares antes da irradiação. Se tanto o agente fotossensibilizante como o veículo viral tiverem sido absorvido nos compartimentos intracelulares da célula no momento da exposição à luz, então o veículo viral e o agente fotossensibilizante podem estar localizados nos mesmos ou diferentes compartimentos intracelulares no momento a exposição à luz. Outros detalhes da sincronização de adição dos vários componentes às células são discutidos nos documentos da arte anterior W096/ 07432 e WOOO/ 54802 acima ou o pedido co-pendente anexo, cujos conteúdos são aqui incorporados por referência.

Em qualquer evento, a janela de tempo em que os veículos virais podem ser levados em contato com as células e ainda ser absorvidos e internalizados pelas células pode depender de vários fatores como, por exemplo, o tipo de célula, o veículo particular em questão, o agente fotossensibilizante particular usado, e a duração do tratamento com luz. Esta janela de tempo pode, se necessário, ser determinada para um conjunto particular de condições e deve estar bem dentro dos limites de uma pessoa versada na arte. O tempo em que o veículo viral é administrado irá variar dependendo de se os métodos estão sendo realizados in vitro ou in vivo. Para métodos in vitro, os veículos virais podem ser geralmente levados ao contato com todas as células alvo simultaneamente, isto é, o tempo de administração coincide com o tempo de contato, por exemplo se as células estão crescente em uma cultura in vitro, e assim é relativamente fácil levar os veículos em contato com as células em um ponto de tempo apropriado. In vivo, no entanto, a etapa de contato das células alvo com os veículos virais é claramente mais complicada e irá depender do modo de administração, o tipo de veículo viral e o local das células alvo. Por exemplo, onde os veículos virais podem ser administrados diretamente às células alvo, por exemplo por injeção, então os veículos virais entrarão em contato com as células alvo (ou pelo menos uma proporção das mesmas) relativamente rapidamente, por exemplo em uma questão de minutos ou horas após administração.

Se, por outro lado, os veículos virais são administrados por injeção intravenosa para um alvo distante então estes veículos podem tomar bem mais tempo para entrar em contato com as células alvo. Por exemplo, podem levar 24 a 96 horas após administração para alcançar as células alvo.

Este “tempo de jornada” terá que ser levado em consideração na decisão do tempo apropriado em que se deve administrar os veículos virais com relação à administração do agente fotossensibilizante e o tempo de irradiação. As mesmas considerações de curso se aplicam ao tempo em que o agente fotossensibilizante é administrado. No entanto, diferente da molécula de transferência, é importante que este agente seja administrado de modo suficiente antes da irradiação de modo que na irradiação referido agente terá absorvido pelo compartimento intracelular. Assim, de modo conveniente, referido agente é aplicado 1 a 72 horas antes da irradiação, por exemplo 4 a 72, como 4 a 48 ou 4 a 24 horas antes da irradiação. Novamente, como discutido acima em conexão com a etapa de colocar os veículos virais (e assim moléculas de transferência) em contato com as células, a sincronização da administração do agente fotossensibilizante em relação ao ponto de tempo de irradiação irá depender do tempo que leva para um agente fotossensibilizante alcançar as células alvo e ser absorvido pelas mesmas.

Este tempo pode variar dependendo de se os métodos estão sendo realizados in vitro ou in vivo, e se a administração é direta para o tecido alvo ou está em um sítio distai. Em todos os casos, é importante que o agente fotossensibilizante seja absorvido pelas células alvo antes da irradiação ocorrer. Referido agente pode ser mantido em contato com as referidas células imediatamente até a irradiação, por exemplo durante 1 a 4 a 72 horas, preferivelmente 4 a 24 horas, por exemplo 12 a 20 horas, ou pode ser removido do contato imediatamente antes da irradiação, por exemplo por mais de 5 min, por exemplo durante 10 min a 8 horas, por exemplo 1 h a 4 ou 6 horas no meio isento de agente e/ou meio contendo a molécula de transferência.

Assim, apesar da situação in vivo ser mais complicada do que in vitro, o conceito subjacente da presente invenção é ainda o mesmo, isto é, que os tempos de administração devem ser tais que antes da irradiação ocorrer, uma quantidade apropriada do agente fotossensibilizante tiver contatado e tiver sido absorvido pelas células alvo e que (i) antes ou durante a irradiação da molécula de transferência (e seu veículo viral) tiver sido absorvido pelas células, ou será absorvido após contato suficiente com as células alvo, no mesmo ou em diferentes compartimentos intracelulares como o agente fotossensibilizante ou (ii) após irradiação da molécula de transferência e seu veículo viral associado está em contato com as células durante um período de tempo suficiente para permitir sua absorção dentro das células.

Opcionalmente, o agente fotossensibilizante pode ser fixado a, associado com ou conjugado com uma ou mais moléculas veículos, moléculas de marcação ou vetores de marcação que podem atuar para facilitar ou aumentar a absorção do agente fotossensibilizante ou pode atuar para marcar ou liberar estas entidades para um tipo de célula particular, tecido ou compartimento intracelular. Exemplos de sistemas veículos incluem polilisina (por exemplo poli-L-lisina ou poli-D-lisina), polietileno imina ou dendrímeros (por exemplo dendrímeros catiônicos como SuperFect®) ou outros policátions, sulfato de dextrano, diferentes lipídeos catiônicos, como DOTAP ou lipofecção ou lipídeos catiônicos formulados com um “lipídeo auxiliador” como DOPE, lipossomas, partículas LDL reconstituídas, lipossomas estereo- quimicamente estabilizados ou diferentes partículas derivadas de sistemas virais como por exemplo adenovírus, lentivírus, e outros retrovírus, vírus adeno-associado, bacteriófagos, etc. Estes sistemas veículo podem geralmente melhorar a farmacocinética e aumentar a absorção celular de agente fotossensibilizante e podem também dirigir o agente fotossensibilizante para compartimentos intracelulares que são especialmente benéficos para obtenção de intemalização fotoquímica, mas eles não tem geralmente a capacidade de marcar o agente fotossensibilizante em células específicas (por exemplo células de câncer) ou tecidos.

Os veículos virais também podem ser fixados a, associados com ou conjugados a uma ou mais destas moléculas veículos, moléculas de marcação ou vetores de marcação. Altemativamente, algumas modificações de superfície da partícula de veículo viral podem ser vantajosas para uso na presente invenção. Os benefícios potenciais provenientes do uso destes veículos e/ou modificações de superfície são : (i) melhora na farmacocinética e bio-distribuição do vetor viral, geralmente por aumento do tempo de circulação; (ii) camuflagem da capacidade do vírus de se ligar ao seu receptor normal para tomar possível o mesmo redirecionar o víms para outros receptores (e assim para tecidos que não são normalmente infectados pelo víms), (iii) provisão de uma carga de superfície positiva sobre o vetor viral de modo que ele irá ligar e infectar uma faixa mais ampla de células do que por seu mecanismo de infecção natural; (iv) “esconder” o víms do sistema imune.

Preferivelmente, o veículo viral é fixado a, associado com ou conjugado a uma molécula veículo, preferivelmente um veículo compreendendo policátions (por exemplo polilisina ou SuperFect ® ou lipídeos catiônicos.

Exemplos de veículos que podem ser usados neste aspecto são policátions (LanutiM. Et al (1999), Gene Ther. 6, 1600- 1610, Arcasoy S.M et al 1997), Gene Ther. 4, 32-8, Dodds E et al (1999), J. Neurochem. 72, 2105- 2122), e lipídeos catiônicos (Clark P.R. et al (1999) Câncer Gene ther. 6, 437- 446). Exemplos de modificações na superfície que podem ser usadas neste aspecto são: polietileno glicol (Croyle M.A. et al (2000) Hum. Gene Ther. 11, 1713- 1722) e polímeros à base de poli-[N- (2-hidroxipropil) - metacrilamida) (Seymour, L. et al, (2000), J. Gene Med. Suppl. A vol 2 (5), pag. 52).

Para obter uma marcação específica ou seletiva das moléculas de veículo viral (e assim a molécula de transferência) e/ou o fotossensibilizador para os tipos de células ou tecidos particulares, estas entidades podem ser associadas com ou conjugadas a molécula de marcação específicas que irão promover a absorção celular específica da molécula de transferência em células ou tecidos desejados. Estas moléculas de marcação também podem dirigir a molécula de transferência e/ou o fotossensibilizador para compartimentos intracelulares que são especialmente benéficos para a obtenção de intemalização fotoquímica.

Muitas diferentes moléculas de marcação podem ser empregadas, como descrito por exemplo em Curiel, D.T. (1999), Ann. New York Acad Sei 886, 158- 171, Bilbao G et al, (1998) em Gene Therapy of Câncer (Walden et al, eds. Plenum Press NY) Peng K.W. e Russell S.J. (1999), Curr. Opin. Biotechnol. 10, 454- 457, Wickham TJ. (2000) Gene Ther. 7, 110-114.

Além disso, é importante notar que em vez de ter que fixar os mesmos a veículos específicos, é bem conhecido na arte que alguns agentes fotossensibilizantes que são apropriados para uso nos métodos da presente invenção mostram uma localização preferencial inerente para alguns sítios de tecido. Por exemplo, alguns agentes fotossensibilizantes, como derivados de hematoporfirina, são conhecidos que localizam preferivelmente ou seletivamente para tecidos de tumores ou outras lesões. Vários outros exemplos são descritos em Boyle e Dolphin (PhotoChem. Photobiol. 64 469- 485 (1996)). Esta localização preferencial pode ser reforçada nos métodos da presente invenção. A molécula de marcação pode ser associada, ligada ou conjugada com o veículo viral, para o agente fotossensibilizante ou ambos, e o mesmo ou diferente veículo ou moléculas de marcação podem ser usados.

Estas moléculas de marcação ou veículos como descritos acima também podem ser usadas para dirigir o veículo ou o agente fotossensibilizante para compartimentos intracelulares particulares especialmente benéficos para o emprego de PCI, por exemplo lisossomas ou endossomas. A molécula de transferência permanece inicialmente, como se pensa, em associação com o veículo viral no citosol das células uma vez que etapa de irradiação tiver ocorrido que libera as partículas de transferência dos compartimentos intracelulares. Uma vez que as partículas de transferência foram internalizadas no citosol das células, os eventos que ocorrem irão depender do sistema de veículo viral escolhido. Por exemplo, no caso de adenovírus, geralmente as partículas de adenovírus (associadas com a molécula de transferência) migram para o núcleo, após o que o DNA viral (e assim a molécula de transferência de ácido nucleico) entre no núcleo da célula. Em qualquer evento, onde a molécula de transferência de ácido nucleico é incorporada em uma partícula ou veículo viral, após intemalização fotoquímica e possivelmente subsequentes eventos dependendo do veículo, a molécula de ácido nucleico deve estar presente no local intracelular correto de modo que o processamento intracelular apropriado possa ocorrer para permitir que a molécula de transferência introduzida realize sua função desejada. Por exemplo, se a molécula de transferência codifica uma proteína desejada, então as etapas de processamento levando à expressão desta proteína são requeridas.

Se a molécula de transferência for uma molécula de DNA que codifica uma molécula de RNA anti-sentido, então as etapas de processamento levando à transcrição do RNA a partir do DNA são requeridas, etc. A etapa de irradiação de luz para ativar o agente fotossensibilizante pode ocorrer de acordo com técnicas e processamentos bem conhecidos dos versados na arte. Por exemplo, o comprimento de onda e intensidade da luz podem ser selecionados de acordo com o agente fotossensibilizante usado, preferivelmente em um nível de dose de 40 a 200 J/cm , por exemplo 100 J/cm e em um comprimento de onda de 300-800 nm, por exemplo 500-700 nm. As fontes de luz apropriadas são bem conhecidas dos versados na arte. O tempo em que as células são expostas à luz e as doses de luz usadas nos métodos da presente invenção podem variar. Geralmente, tempos e doses de irradiação apropriadas podem ser selecionadas pelos versados na arte para permitir a ruptura dos compartimentos intracelulares contendo o fotossensibilizador e a subsequente absorção e/ou liberação de partículas de transferência no citosol. A eficiência da intemalização da partícula de transferência no citosol parece aumentar com aumentada exposição à luz. Uma extensão preferida de tempo para a etapa de irradiação depende do fotossensibilizador, a quantidade do fotossensibilizador acumulado nas células alvo ou tecido e a sobreposição entre o espectro de absorção do fotossensibilizador e o espectro de emissão da fonte de luz.

Geralmente, a extensão de tempo para a etapa de irradiação é da ordem de minutos a várias horas, por exemplo preferivelmente até 60 min por exemplo de 0,5 ou 1 a 30 minutos, por exemplo até 10 ou 15 minutos, por exemplo de 0,5 a 3 minutos ou de 3 a 10 minutos e preferivelmente aproximadamente 7 minutos, por exemplo 6 a 8 minutos. As doses de luz apropriadas podem ser selecionadas por um versado na arte e novamente irão depender do fotossensibilizador e a quantidade de fotossensibilizador acumulada nas células alvo ou tecidos. Por exemplo, as doses de luz tipicamente usadas para o tratamento fotodinâmico de cânceres com o fotossensibilizador Photofrin e o precursor de protoporfirina ácido 5- aminolevulínico está na faixa de 50-150 J/cm2 em uma faixa de fluência de menos que 200 mW/cm2 a fim de evitar hipertermia. As doses de luz são geralmente menores quando os fotossensibilizadores com maiores coeficientes de extinção na área vermelha do espectro visível são usadas. No entanto, para tratamento de tecidos não cancerosos com menos fotossensibilizador acumulado, a quantidade total de luz necessária pode ser substancialmente maior do que para tratamento de cânceres.

Os métodos da invenção ocasionarão, inevitavelmente, algum extermínio de células em virtude do tratamento fotoquímico, isto é, através da ação do agente fotossensibilizante. No entanto, esta morte de células não será elevada e pode, de fato, ser vantajosa para muitas aplicações, por exemplo, tratamento de câncer, e pode em alguns casos melhorar o efeito terapêutico por estímulo de uma resposta imune local. No entanto, os métodos da invenção podem ser modificados de modo que a fração ou proporção de células sobreviventes é regulada selecionando-se a dose de luz em relação à concentração do agente fotossensibilizante. Novamente, estas técnicas são conhecidas na arte. Independente da extensão de morte de células induzida pelo tratamento fotoquímico puro, é importante que a dose de luz seja regulada de modo que algumas das células individuais em que o efeito de PCI é manifestado não sejam exterminadas apenas pelo tratamento fotoquímico (apesar delas poderem ser subseqüentemente exterminadas devido ao efeito de PCI).

Em algumas aplicações, pode ser apropriado reter um grande número de células viáveis após tratamento com PCI. Por exemplo, em alguns métodos de terapia gênica, a quantidade de células viáveis que permitem a expressão da proteína codificada pela molécula de ácido nucleico transferida é importante. Nestas aplicações, é apropriado que uma população ou pluralidade de células, substancialmente todas as células, ou uma maioria significativa (por exemplo, pelo menos 50%, mais preferivelmente pelo menos 60, 70, 80 ou 90% das células) não seja exterminada. Isto, naturalmente, não é sempre desejável, especialmente quando PCI é usado para introduzir moléculas de transferência citotóxica e, além disso, o extermínio de células não é desvantajoso. Efeitos citotóxicos também podem, no entanto, ser obtidos usando, por exemplo terapia gênica, em que um gene terapêutico é internalizado em células de tumor pelo método da invenção, por exemplo, de modo que estas células produzirão substâncias imunologicamente ativas que induzirão extermínio imunológico local de células de câncer remanescentes ou induzirão uma resposta imune sistêmica às células de tumor. Nestes casos, nitidamente após tratamento com PCI, uma proporção de células viáveis é requerida.

As vantagens associadas com métodos PCI de intemalização de moléculas de transferência em associação com veículos virais são 1) não se tem limitação ao tamanho da molécula a ser introduzida em uma célula, desde que a molécula possa ser incorporada em um veículo viral e seu veículo viral pode ser absorvido pela célula alvo; 2) os métodos são específicos para sítio em que somente áreas expostas à luz são afetadas, 3) a intemalização de veículos virais é mais eficiente do que a infecção viral padrão em termos da proporção de células em que a molécula de transferência é introduzida e/ou o nível de expressão da molécula de transferência; 4) menores doses e títulos de vírus são requeridos devido à eficiência aumentada de intemalização; 5) não são oncogênicas.

As formas de realização em que a molécula de transferência (e seu veículo viral) é adicionada às células após a etapa de irradiação de luz tem outras vantagem em que a) dano fotoquímico à molécula de transferência e seu veículo viral é diminuído; b) simplificação do tratamento com PCI de lesões internas em combinação com cirurgia, desde que o tratamento fotoquímico seja realizado após exposição cirúrgica da lesão seguido, por exemplo, por injeção intratumoral ou outra administração local do veículo viral (e sua molécula de transferência associada); c) os métodos são mais independentes da exata sincronização de tratamento, isto é, a sincronização do tempo de adição da molécula a ser absorvida pelas células com relação ao ponto de tempo de iluminação. Isto significa que se dispõe de uma maior “janela de tempo” para tratamento. Isto é importante, uma vez que a absorção de uma molécula terapêutica pode variar amplamente em diferentes situações clínicas e, além disso, a absorção é difícil para avaliar lesões individuais em uma situação clínica, assim tomando extremamente vantajosa uma maior janela de tempo; d) ocorre translocação rápida da molécula de transferência no citosol, desse modo diminuindo substancialmente as possibilidades de degradação lisossômica da molécula de transferência.

Os métodos da presente invenção podem ser usados para introduzir moléculas em células como uma alternativa para técnicas da arte anterior para fusão de lipossomas, transfecção de fosfato de cálcio, etc, como descrito acima.

Em uma forma de realização preferida da invenção, as moléculas são introduzidas nas células para os fins de terapia gênica. A terapia gênica pode ocorrer via várias estratégias, das quais a mais apropriada pode ser selecionada por um versado na arte dependendo da patogenese particular de uma doença.

Uma abordagem envolve o extermínio marcado no alvo de células específicas. Esta abordagem é popular em terapias de câncer e envolve genes sendo dirigidos para marcar células e então expressados de modo a causar o extermínio das células. Este extermínio das células pode ocorrer por um mecanismo direto, por exemplo se os genes que são introduzidos codificam uma toxina letal ou codificam uma pro-droga que confere susceptibilidade sobre as células ao extermínio por uma droga subseqüentemente administrada. Altemativamente, o extermínio das células pode ser indireto, por exemplo por uso de genes imunoestimulatórios, como os genes introduzidos a fim de provocar ou melhorar uma resposta imune contra a células alvo, ou por uso de genes que codificam uma proteína que causa o extermínio das células por interação com uma molécula exogenamente adicionada (por exemplo um gene codificando uma enzima que ativa uma pro-droga como HSV-tk que ativou GCV). Os genes suicida apropriados, genes codificando pro-drogas e genes imunoestimulatórios são bem conhecidos e documentados na arte.

Uma outra abordagem envolve inicialmente marcada no alvo de expressão de genes. Várias diferentes técnicas para especificamente bloquear a expressão de um gene no nível de DNA, RNA ou proteína são bem conhecidos dos versados na arte, e qualquer uma destas técnicas pode ser usada em conjunto com os métodos da presente invenção, que podem ser usadas para introduzir as ferramentas moleculares apropriadas para bloquear a expressão de genes nas células. Assim, em aspectos preferidos da invenção, a molécula a ser introduzida é uma seqüência de DNA compreendendo ou capaz de transcrever ou expressar um produto funcional que irá inibir a expressão dos genes em algum nível nas células alvo, por exemplo ao compreender, expressar ou transcrever moléculas anti-sentido, ribozimas ou anticorpos intracelulares.

Outra abordagem envolve a terapia de aumento de genes, quando um estado doentio é causado por perda de função de um gene, e as doenças podem ser curadas por introdução de cópias extras de gene normal nas células apropriadas de um paciente. Assim, em um outro aspecto preferido a invenção, a molécula a ser introduzida é um gene ou uma porção do mesmo capaz de expressar um produto funcional para compensar uma deficiência em um paciente.

Ainda uma outra abordagem é a de uma correção de mutação marcada no alvo, onde a introdução de um ácido nucleico nas células apropriadas de um paciente leva à correção direta de uma mutação causando doença no DNA do paciente. Os métodos para esta realização são bem conhecidos dos versados na arte e já descritos.

Após a transferência ácido nucleico / gene nas células de acordo com os métodos da presente invenção, os genes/ ácidos nucleicos inseridos podem integrar nos cromossomos da célula hospedeira, ou permanecer como elementos extra-cromossômicos (isto é permanecem epissomais). Os vetores apropriados podem ser escolhidos e projetados para induzir uma destas possibilidades. A vantagem da integração do gene introduzido em um cromossomo é que o gene pode ser perpetuado por replicação cromossômica após a divisão celular. Como as células de progênie também contém os genes introduzidos, expressão estável a longo prazo do gene introduzido pode ser obtida. Como resultado, a terapia gênica usando esta abordagem pode prover a possibilidade de uma cura para alguns distúrbios. Por exemplo, em tecidos compostos de células dividindo ativamente, o objetivo pode ser marcar no alvo as células -tronco (uma população minoritária de células precursoras não diferenciadas que dão lugar às células diferenciadas maduras do tecido). A integração cromossômica tem suas desvantagens, no entanto, que são bem descritas e incluem por exemplo o perigo de desenvolvimento de câncer por exemplo devido a um evento de integração acidental levando à ativação de um oncogene. A terapia gênica ex vivo, em que as células alvo são removidas de um paciente, manipuladas in vitro e então re-introduzidas em um paciente, oferece a oportunidade para selecionar células onde a integração foi obtida com sucesso. Por exemplo, por amplificação de células in vitro e então verificando os fenótipos para qualquer evidência óbvia de transformação neoplástica, antes de transferir as células de volta ao paciente. A terapia ex vivo pode assim ser preferida quando a integração cromossômica é desejada.

Altemativamente, o sistema vetor incorporando o gene/ ácido nucleico a ser introduzido pode ser projetado para introduzir genes em células onde eles permanecem como elementos extracromossômicos e podem ser expressos em altos níveis. Se as células estão dividindo ativamente, o gene introduzido pode não segregar igualmente para as células -filhas e assim a expressão a longo prazo pode ser problemática. Como resultado, tratamentos repetidos envolvendo transferência de genes podem ser necessários para efetuar uma cura para um distúrbio genético. A possibilidade de realizar repetidos tratamentos neste aspecto é, no entanto, bem aumentada com a presença de métodos à base de PCI de transferência que permitem uma transferência marcada de maior eficiência de genes (ver abaixo). Além disso, em alguns casos, pode não ser necessária para expressão a longo prazo estável. Por exemplo, terapias gênicas para câncer com frequência envolvem a transferência e expressão de genes em células de câncer tendo em vista matar as células. Em tais métodos, uma vez que a malignidade foi eliminada, o gene terapêutico provavelmente não será necessário.

Como acima mencionado, sistemas virais apropriados para uso na presente invenção são adenovírus e vírus adeno-associados, retrovírus, lentivírus, Herpesvírus, Sendai vírus, bacteriófagos, vírus de Vaccínia e Baculovírus.

Os retrovírus têm a propriedade vantajosa de serem capazes de integrar no DNA cromossômico mas somente infectar células de divisão ativa. O DNA integrado pode ser estavelmente propagado, oferecendo a possibilidade de uma cura permanente para uma doença. Sua propriedade de somente infectar células de divisão ativa, apesar de desvantajosa para o tratamento de muitas doenças é, no entanto, benéfica para terapia genética para cânceres de tecidos que normalmente tem células que não se dividem como as células de câncer que se dividem ativamente podem ser seletivamente infectadas e exterminadas sem risco maior para as células que não se dividem do tecido normal.

Os vírus adeno-associados requerem co-infecção com um vírus auxiliador como adenovírus ou HSV para infecção produtiva, isto é, infecção que resulta na produção de virions de progênie. No entanto, na ausência de vírus auxiliares, a integração cromossômica do DNA ainda pode ocorrer.

Assim, o tipo apropriado de vetor de vírus adeno-associado pode ser selecionado dependendo da aplicação em questão.

Os adenovírus, por outro lado, infectam também células que não se dividem. A entrada em células ocorre por endocitose mediada por receptor, mas apesar do ácido nucleico inserido migrar para o núcleo, ele não parece integrar e, assim, a expressão dos genes inseridos pode apenas ser mantida durante períodos curtos. Os vetores de adenovírus podem ser produzidos em títulos muito elevados, e tipicamente aceitam tamanhos de insertos de até 7-8 kb, mas desenvolvimentos recentes em tecnologia de vetor de adenovírus permitem o uso de tamanhos de insertos de até cerca de 30 kb em vetores especialmente projetados (Kochanek, (1999), Hum. Gene. Ther. 10, 2451- 2459). Devido à sua capacidade de infectar muitos tipos diferentes de células, os adenovírus tem encontrado aplicações difundidas e são vetores populares para uso em estratégias de terapia gênica in vivo. De fato, os adenovírus são os veículos virais preferidos para uso nos métodos da presente invenção.

No entanto, apesar dos adenovírus estarem dentre os vetores mais eficientes para liberação de genes in vivo, seu uso é complicado por vários problemas sérios, por exemplo reações imunológicas ao vírus, expressão de genes transiente, e má distribuição do tecido levando a uma baixa eficiência de transdução em tecidos alvo. Também a capacidade de limitar a expressão de genes terapêuticos liberados pelos adenovírus para células alvo é difícil mas pode ser muito importante para evitar efeitos laterais adversos, por exemplo devido à expressão de um produto de genes tóxico (por exemplo destinado a matar as células de câncer) em células normais no corpo, por exemplo em órgãos vitais como o fígado. Outros veículos virais para uso em terapia gênica tem inconvenientes similares. O uso de intemalização fotoquímica em conjunto com os métodos da presente invenção pode melhorar vários destes aspectos. Em primeiro lugar, o uso de PCI pode substancialmente aumentar o nível e extensão de expressão de transgenes em tecidos alvo, (isto é, pode levar a um maior número de células expressando maiores níveis do transgene). Além disso, PCI tem demonstrado como aumentando a eficiência de infecção viral de modo que uma dose viral significativamente menor é requerida para produzir a mesma quantidade de transdução de genes vista na ausência de PCI. Esta eficiência de infecção viral melhorada em PCI em menor multiplicidade de valores de infecção (MOIs) deve permitir a transdução viral em áreas de tecido que tem uma baixa penetração de vírus, assim permitindo a transdução em regiões recebendo muito poucas partículas de vírus para serem efetivamente transduzidas com infecção convencional. Porque se espera que com a administração local a concentração de vírus em tecidos ira cair rapidamente com aumentada distância do ponto de aplicação, esta é uma melhora muito importante da tecnologia de infecção viral.

Uma outra vantagem da eficiência melhorada induzida por PCI de infecção viral é que uma menor dose de vírus pode ser usada enquanto mantendo a eficiência de transdução, assim reduzindo os problemas imunológicos associados com adenovírus e outra terapia gênica mediada por vírus. Finalmente, o tratamento fotoquímico pode ser usado para melhorar a especificidade de infecção para as células alvo. Em primeiro lugar, isto é devido ao fato de que somente as áreas iluminadas são submetidas a PCI e, em segundo, alguns fotossensibilizadores inerentemente se acumulam preferivelmente nas áreas doentes. A capacidade de dirigir a atividade de um gene terapêutico para um sítio de doença simplesmente brilhando luz na área doente é um aspecto muito favorável da presente invenção, que em um alto grau deve tomar possível evitar efeitos laterais indesejados devido à expressão do gene terapêutico nos locais “errados” no corpo. A capacidade de PCI de tomar possível o uso de menores doses do agente terapêutico de genes irá também contribuir para diminuir os efeitos laterais. A especificidade que é obtenível é esperada como tomando possível a administração sistêmica de adenovíms e outros veículos virais. Além disso, como discutido acima, PCI também pode ser combinado com vetores marcados, ainda potencialmente melhorando a especificidade de liberação de genes.

Como discutido nas aplicações PCI anteriores, acredita-se que o efeito melhorador da transfecção de PCI em complexos plasmídeo/ polilisina e o efeito melhorador sobre a liberação de outras moléculas como proteínas, é devido a uma ruptura induzida por luz de vesículas endocíticas, e, apesar de não se desejar limitar por teorias, parece razoável que o mesmo mecanismo deve estar envolvido no estímulo de transdução de genes mediada por adenovírus. No entanto, em contraste com complexos plasmídeo/ polilisina, e outras moléculas como proteínas, o escape de adenovírus para endossomas é um processo eficiente, como se acredita, onde mais do que 40% das partículas de vírus ligadas às células foram registradas como alcançando o núcleo da célula (Greber, U.F. et al (1993), Cell 75, 477-486, Leopold P.L. et al, (1998). Hum Gene Ther. 9, 367- 378). Assim, a partir do que foi descrito na literatura, pode-se esperar que PCI no máximo podería aumentar a eficiência de transdução de gene adenovírus 2,5 vezes se PCI fosse capaz de induzir o transporte nuclear de todas as partículas de vírus ligadas à célula.

Foi assim extremamente surpreendente que as melhoras induzidas por PCI em transdução de genes de mais do que 20 vezes puderam ser observadas e atualmente os requerentes não tem uma boa explicação para este efeito inesperadamente elevado. Uma possibilidade é que as partículas de vírus submetidas a PCI podem ter uma maior “eficiência de transdução inerente” do que os vírus em infecção normal, por exemplo devido a um diferente mecanismo de liberação dos endossomas. Também é possível que a liberação endossômica de adenovírus em infecção normal é menos eficiente nos baixos MOIs (multiplicidade de infecção) onde PCI tem o melhor efeito. Também é possível que o tratamento fotoquímica possa afetar outros processos como a absorção do vírus, transporte nuclear ou transcrição do transgene.

Em um outro aspecto, a presente invenção provê composições farmacêuticas compreendendo uma molécula de transferência associada com um veículo viral e um agente fotossensibilizante, preferivelmente para uso em terapia. Opcionalmente, o agente fotossensibilizante nas composições também pode estar associado com moléculas de veículo viral ou outras moléculas de veículo não viral como as descritas acima. Preferivelmente, o veículo viral é ele mesmo fixado a, associado com ou conjugado a uma ou mais moléculas de veículo (preferivelmente policátions ou lipídeos catiônicos), moléculas de marcação ou vetores de marcação. Opcionalmente, um ou ambos dentre o veículo viral e o agente fotossensibilizante podem estar associados com as mesmas ou diferentes moléculas de marcação como descrito acima.

Preferivelmente, as composições são para uso em terapia gênica. Para terapia gênica, uma molécula de veículo viral preferida é adenovírus ou um veículo viral derivado do mesmo. As condições, doenças e infecções que são particularmente apropriadas para terapia gênica incluem tumores cancerosos, por exemplo carcinomas de células basais, displasia ou outros crescimentos, artrite reumatóide, arterosclerose, vírus e outras infecções, psoríase, ceratose solar, cicatrização de feridas, cicatrização de fraturas, verrugas e distúrbios genéticos herdados como fibrose cística, síndrome de Gorlin, ataxia telangiectasia e distúrbios metabólicos.

Os genes preferidos a serem usados como moléculas de transferência para terapia gênica são genes codificando enzimas ativadoras de prodrogas como timidina quinase de herpes simplex ou citosina desaminase; toxinas de proteínas como toxina de difteria ou gelonina, proteínas induzindo apoptose como p53 ou apopoptina; fatores imune-estimulantes como interleucinas (IL-2, IL-12, IL-18 preferidos ), fator α de necrose de tumor, quemocinas, antígenos específicos para tumor como proteínas ras mudadas ou Mart-1; inibidores imunes/ inflamação como interleucina-10, antagonista de receptor de IL-1 ou receptor de TNF solúvel; inibidores de angiogenese como endostatina; proteínas induzindo a formação de vasos como fator de crescimento endotelial vascular; proteínas iniciadoras de coagulação, como fator de tecido; anticorpos intracelulares; imunotoxinas recombinantes, ribozimas ou moléculas de RNA anti-sentido e assim em diante.

Em um outro aspecto assim, a presente invenção provê o uso de uma molécula de transferência associada com um veículo viral e um agente fotossensibilizante como descrito aqui para a preparação de um medicamento para uso em terapia, preferivelmente terapia gênica. Para referidos usos, o agente fotossensibilizante e a molécula de transferência associada viral são contatados com as células e tecidos de um paciente ou juntos ou separadamente por seleção de tempos de administração apropriados e referidas células são irradiadas como descrito acima com luz de um comprimento de onda efetivo para ativar o agente fotossensibilizante.

Os métodos de tratamento e preferivelmente métodos de terapia gênica compreendendo os métodos da invenção formam aspectos alternativos da invenção. Assim, a invenção provê um método de tratamento ou prevenção de uma doença, distúrbio ou infecção em um paciente por terapia gênica compreendendo a introdução de uma molécula de transferência em uma ou mais células in vivo, in vitro ou ex vivo, de acordo com o método como descrito acima e onde necessária a administração (isto é, quando a transfecção é conduzida in vitro ou ex vivo) das referidas células para referido paciente.

Como definido aqui, “tratamento” refere-se à redução, alívio ou eliminação de um ou mais sintomas da doença, distúrbio ou infecção, que está sendo tratada, com relação aos sintomas antes do tratamento. “Prevenção” refere-se ao retardo ou prevenção do início dos sintomas da doença, distúrbio ou infecção.

As composições da presente invenção podem também compreender uma célula ou população de células contendo uma molécula de transferência que foi introduzida na referida célula por métodos da invenção, preferivelmente para uso em terapia, particularmente terapia gênica.

Assim, em ainda outro aspecto, a invenção provê uma célula ou população de células contendo uma molécula de transferência que foi introduzida na referida célula, cuja célula é obtenível pelo método da presente invenção.

Em ainda outro aspecto, a invenção provê o uso de tal célula ou população de células para a preparação de uma composição ou um medicamento para uso em terapia, preferivelmente terapia gênica. A invenção ainda provê um método de tratamento de um paciente compreendendo a administração ao referido paciente de células ou composições da presente invenção. Preferivelmente, referidos métodos são usados em terapia gênica, isto é um método compreendendo as etapas de introduzir uma molécula em uma célula, como descrito acima, e administrar referida célula assim preparada ao referido paciente.

In vivo, qualquer modo de administração dos veículos virais, agentes fotossensibilizantes, células contendo moléculas de transferência, composições etc, comuns ou padrões na arte, podem ser usados, por exemplo intramuscular, subcutâneo, intraperitoneal, intratumoral ou injeção intravenosa, infusão, inalação ou administração tópica, superfícies do corpo tanto internas como externas, etc. Para uso in vivo, a invenção pode ser usada em relação a qualquer tecido que contém as células às quais o agente fotossensibilizante e o veículo viral irão se localizar, incluindo locais de fluido do corpo, assim como tecidos sólidos. Todos os tecidos podem ser tratados desde que o fotossensibilizador seja absorvido pelas células alvo, e a luz possa ser apropriadamente liberada. Com relação à liberação de luz, como evidente isto não apresenta problemas para superfícies externas do corpo humano ou animal. Para superfícies internas, técnicas como por exemplo o uso de dispositivos de fibra óptica podem ser usados para efetivamente iluminar muitas superfícies internas. Além disso, o tratamento pode ser feito em combinação com cirurgia que irá expor superfícies que precisam ser tratadas.

Assim, as composições da invenção podem ser formuladas em qualquer modo conveniente de acordo com as técnicas e procedimentos conhecidos na arte farmacêutica, por exemplo usando um ou mais veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis (isto é compatíveis com outros ingredientes na composição assim como fisiologicamente aceitáveis para o recipiente). A natureza da composição e veículos ou materiais excipientes, dosagens, etc, podem ser selecionados de modo de rotina de acordo com a escolha e via desejada de administração, fim de tratamento, etc. As composições da invenção também podem conter outros agentes apropriados.

Por exemplo, para algumas aplicações terapêuticas e algumas vias de administração, pode ser benéfico o uso por exemplo de agentes que possam aumentar a penetração no tecido do veículo viral, por exemplo proteases (Kuriyama N. et al, 2000, Hum. Gene. Ther. 11: 2219- 2230).

As composições podem ser administradas topicamente (por exemplo por liberação intestinal, bucal, sublingual, gengival, palatal, nasal, pulmonar vaginal, retal, ou ocular) oralmente ou parenteralmente. As composições tópicas são preferidas e incluem géis, cremes, ungüentos, pulverizações, loções, pomadas, bastões, sabões, pós, comprimidos, filmes, emplastros, aerossóis, gotas, soluções e qualquer uma das formas farmacêuticas convencionais na arte.

Ungüentos, géis e cremes podem, por exemplo, ser formulados com uma base aquosa ou oleosa com a adição de agentes espessantes e/ou gelificantes apropriados. As loções podem ser formuladas com uma base aquosa ou oleosa e irão, geralmente, também conter um ou mais agentes emulsificantes, dispersantes, de suspensão, espessantes ou colorantes. Os pós podem ser formados com a ajuda de qualquer base de pó apropriada. As gotas e soluções podem ser formuladas com uma base aquosa ou não aquosa também compreendendo um ou mais agentes dispersantes, solubilizantes ou de suspensão. As pulverizações de aerossol são convenientemente liberadas de embalagens pressurizadas, com o uso de um propelente apropriado.

Altemativamente, as composições podem ser providas em uma forma adaptada para administração oral ou parenteral. As formas farmacêuticas alternativas incluem assim comprimidos simples ou revestidos, cápsulas, suspensões e soluções contendo o componente ativo opcionalmente junto com um ou mais veículos convencionais inertes e/ou diluentes, por exemplo com amido de milho, lactose, sacarose, celulose microcristalina, estearato de magnésio, polivinil pirrolidona, ácido cítrico, ácido tartárico, água, água/ etanol, água/ glicerol, água/ sorbitol, água/ polietileno glicol, propileno glicol, álcool estearílico, carbóxi metilcelulose, ou substâncias graxas como gordura dura ou misturas apropriadas das mesmas.

As composições podem adicionalmente incluir agentes lubrificantes, agentes umectantes, agentes emulsificantes, agentes de suspensão, agentes conservantes, agentes adoçantes, agentes flavorizantes, melhoradores de adsorção, por exemplo agentes de penetração de superfície, como mencionado abaixo, e outros. As composições da invenção podem ser formuladas de modo a prover uma liberação rápida, sustentada ou retardada do ingrediente ativo após administração ao paciente por emprego de procedimentos bem conhecidos dos versados na arte. Os agentes de solubilização e/ou estabilização também podem ser usados, por exemplo ciclodextrinas (CD), α, β, γ e ΗΡ-β ciclodextrina.

As dosagens podem do mesmo modo ser determinadas em modo de rotina e podem depender da natureza da molécula, fim de tratamento, idade do paciente, modo de administração, etc. Em conexão com o agente fotossensibilizante, a potência/ capacidade de romper membranas em irradiação, deve ser levada em consideração. Geralmente, no entanto, para uso in vitro, uma faixa de concentração para o fotossensibilizador de, por exemplo, 0,05 - 500 pg/ml é apropriada. Para tratamentos humanos in vivo, o agente fotossensibilizante pode ser usado na faixa de 0,05 - 20 mg/kg peso do corpo quando administrado sistemicamente ou 0,1 - 20% em um solvente para aplicação tópica. Em menores animais, a faixa de concentração pode ser diferente e pode ser consequentemente ajustada. A molécula a ser introduzida em associação com o veículo viral pode estar presente em uma concentração de lxlO'9 a 50% como 3X10’6 a 50%, por exemplo 0,003 a 30%, por exemplo 0,2 a 10% (p/p) de partículas virais na composição final para uso in vivo, em que p/p se refere ao peso do veículo viral além da molécula a ser introduzida com relação ao peso na composição final. Se usada em injeções de 1 ml, isto deve corresponder a uma dose de aproximadamente 105 a 1015 partículas virais físicas. Par uso in vitro, entre 1- 1 x 105 partículas virais, por exemplo Ixl03-lxl05, podem ser usados. A invenção será agora descrita em maiores detalhes nos seguintes exemplos não limitativos com referência aos seguintes desenhos em que: A figura 1 mostra coloração X-gal de células WiDr fotoquimicamente transduzidas. As células foram tratadas com AlPcS2a (S), infectadas com AdHCMV-lacZ (Ad) a MOI 5 e submetidas a tratamento com luz como indicado na figura. Após 2 dias de incubação para permitir a expressão de gene β-galactosidase transduzido, as células são coloridas com X-gal e analisadas por microscopia como descrito. As células são tratadas como a seguir: A. Sem tratamento, B. adenovírus apenas, C. AlPcS2a + 8 min luz. D AlPcS2a + adenovírus + 8 min luz. A figura 2 mostra análise de citometria de fluxo de transdução fotoquimicamente melhorada em células HCT 116 (painel A) e WiDr (painel B). As células são tratadas com AlPcS2a(S), infectadas com AdHCMV- lacZ (Ad) a MOI5 e iluminadas como descrito. Dois dias depois, as células foram carregadas com fluoresceína di-P-D-galactopiranosídeo e analisadas por citometria de fluxo. A figura 2A mostra um gráfico de pontos de análise de citometria de fluxo de células HCT 116. As células no lado à direita da linha vertical foram consideradas como positivas para transdução de adenovírus porque não se tem virtualmente células nesta áreas ou para células não tratadas (painel superior), ou para células recebendo somente AlPcS2a e luz (painel inferior). Os tratamentos diferentes são indicados em cada painel. A figura 2B mostra eficiência de transdução como uma função a dose de luz para células WiDr. A % de células positivas para β- galactosidase definidas como descrito na figura 2A ((□) S-, Ad+, (A) S+, Ad-; (·) S+, Ad+) e intensidade de fluorescência média ((o) S+, Ad+) foi classificada. As barras representam erro padrão da média (SEM) de 2 a 5 experiências diferentes. A figura 3 mostra transdução melhorada por PCI de células WiDr em diferentes doses de vírus. As células foram infectadas com AdHCMV-lacZ em diferentes MOIs e submetidas a tratamento fotoquímico como descrito. A figura 3A mostra fluorescência média da população de células total. Os tratamentos foram como a seguir: barras não sombreadas, somente AlPcS2a; sombreado cruzado diagonal: MOI = 1, cinza: MOI=5, sombreado cruzado horizontal: MOI=20, preto: MOI= 50. As barras de erro são SEM de 3 experiências. A figura 3B mostra aumento de vezes em atividade β- galactosidase da população de células total. Os símbolos são iguais que na figura 3 A. As barras de erro são erro padrão de 3 ou 4 experiências. A figura 4 mostra o efeito do tratamento fotoquímico em transdução de adenovírus de células THX. A figura 5 mostra o efeito de tratamento fotoquímico em expressão de β- galactosidase em células THX infectadas com AdHCMV- lacZ. Para a estratégia de “luz antes”, as células pré-tratadas com AlPcS2a foram incubadas durante mais 4 h em meio isento de AlPcS2a antes da exposição à luz durante 3 min. Após iluminação, as células foram infectadas com AdHCMV-lacZ (em MOI 1) durante 30 min a 37 °C. Então, 2 ml de meio foram adicionados e as células incubadas durante dois antes da análise de expressão de β- galactosidase. Para a estratégia “luz após” as células tratadas com AlPcS2a foram incubadas em meio isento de AlPcS2a u 3 h antes de uma infecção de 30 min com AdHCMV-lacZ. Após adição de 2 ml de meio de cultura, as células foram incubadas durante mais 30 min antes da iluminação durante 3min, e dois dias depois foram analisadas para expressão de β- galactosidase. A figura 6 mostra o aumento na produção de β- galactosidase como resultado de transdução mediada por PCI com um adenovírus codificando β- galactosidase com aumentados tempos de irradiação. O tratamento (+, - indicando com ou sem) e doses de luz (extensão de irradiação) para as diferentes amostras são indicados na figura. Adv: adenovírus AdHCMV-lacZ, S: o fotossensibilizador AlPcS2a. A figura 7 mostra o efeito de PCI em transdução de células WiDr em diferentes multiplicidades de infecção. □ - sem irradiação, ■ - 90 segundos de irradiação. A figura 8 mostra o efeito de PCI em transdução de adenovírus de células A549. O tratamento (+, - indicando com ou sem) e doses de luz (em minutos) para as diferentes amostras são indicados na figura. A: adenovírus AdHCMV-lacZ, S : o fotossensibilizador AlPcS2a. A figura 9 mostra o efeito de PCI em transdução de linhagens de célula HeLa e FmexIII. Barras não sombreadas - sem irradiação, barras sólidas - 90 segundos de irradiação. A figura 10 mostra o efeito de PCI em transdução de células WiDr com adenovírus associado com um veículo Poli- L-lisina. Ad : adenovírus AdHCMV-lacZ. PLL: Poli-L-lisina. 5PPL/Ad significa que o complexo em média contém 5 PPL moléculas por partícula de vírus. O - Ad MOI 5, ■ - 5 PLL/ Ad, · - 500 PLL/Ad, □ - 250 PLL/ Ad, ▲ - 50 PLL/Ad. A figura 11 mostra o efeito de PCI em transdução de adenovírus de uma linhagem de célula de fibroblastos de pele humana empregando poli-L-lisina como um veículo para o vírus com tempos de irradiação variável. □ - MOI 5, adenovírus não complexado AdHCMV-lacZ. ■ MOI 5/ PLL: AdHCMV-lacZ complexo em 250 molécula de PLL por partícula de vírus. A figura 12 mostra o efeito de PCI em transdução de adenovírus usando o dendrímero policatiônico SuperFect ® como um veículo viral em várias concentrações. Barras não sombreadas - sem irradiação, barras sólidas - 90 segundos irradiação. A figura 13 mostra o efeito de diferentes esquemas de tempo de iluminação e administração de adenovírus. Os pontos no tempo à direita do eixo Y representam vírus adicionado antes da irradiação, pontos de tempo à direita representam adição de vírus após irradiação. ■ 1 min de irradiação, □ sem irradiação. A figura 14 mostra melhora PCI de efeito terapêutico do gene de um vetor de adenovírus codificando timidina quinase de vírus de herpes simplex após vários tempos de irradiação. O extermínio das células foi efetuado por ganciclovir após transdução de genes induzida por PCI com um vetor de adenovírus codificando HSV-tk. Al: AlPcS2a, AdV- TK: adenovírus codificando HSV-tk; GCV: ganciclovir. ♦ - Al apenas, □ - Al + AdV-TK; Δ - AL + GCV a 10 μg/ml (A), 25 μg/ml (B) ou 100 μg/ml (C); ■ - AL + AdV- TK + GCV a 10 μg/ml (A), 25 μg/nll, (B) ou 100 μg/πll (C).

Exemplo 1 Em experiências iniciais, células de adenocarcinoma WiDr humanas foram tratadas com fotossensibilizador AlPcS2a (ftalocianina de alumínio com 2 grupos sulfonato em anéis adjacentes), infectadas com o adenovírus AdHCMV-lacZ contendo um gene repórter de β- galactosidase e submetidas a tratamento com luz como descrito no protocolo experimental.

As células foram coloridas para atividade β- galactosidase, e microscopia mostrou que uma fração substancial das células tratadas com luz expressou o transgene (figura 1D), enquanto somente algumas células positivas foram detectadas dentre as células infectadas com adenovírus não iluminadas (figura 1B). Não foram vistas células positivas em amostras não tratadas (figura IA) ou nas amostras recebendo AlPcS2a e luz, mas sem adenovírus (figura 1C)., assim o aumento induzido por luz observado em expressão de β- galactosidase se originou do transgene liberado por adenovírus, e não de um gene β- galactosidase endógeno.

Exemplo 2 Para análise quantitativa, citometria de fluxo foi empregada, usando o substrato fluoresceína di^-D-galactopiranosídeo que toma as células expressando β- galactosidase fluorescentes. Como se nota na figura 2A, o tratamento fotoquímico substancialmente aumentou a atividade β- galactosidase em células 116 HCT infectadas com adenovíms. Assim, a porcentagem de células positivas para β- galactosidase aumentou de 6,3+ 0,1% (desvio padrão, n = 3) em células normalmente infectadas (Ad+ S-, 0 min luz) para 88 + 17% (n= 3) em células recebendo tratamento ótimo (Ad+, S+, 8 min luz). Do mesmo modo para as amostras, a intensidade de fluorescência média aumentou de 52+ 11% (n = 3) para 632 + 163% (n = 43) unidades de fluorescência relativa (RFU). O tratamento fotoquímico também aumentou levemente a fluorescência média em células não infectadas (figura 2A, painéis superior e inferior) de 6 a 12 FRU. No entanto, devido aos níveis muito baixos de fluorescência e células positivas (0,4% na amostra Ad-, S+, 8 min), isto não gera dificuldades na interpretação dos resultados para células infectadas com vírus.

Em células WiDr de carcinoma de cólon, aumentos dependentes de luz ainda maiores em transdução de genes foram observados (figura 2B). Assim, no máximo, um aumento de 22 vezes na porcentagem de células positivas para β- galactosidase e um aumento de 44 vezes na intensidade de fluorescência média foram encontrados quando células infectadas com vírus iluminadas foram comparadas a células não iluminadas. O tratamento fotoquímico sozinho (figura 2B, Ad- S+, A) não muda de modo significante a porcentagem de células positivas, nem a iluminação sozinha (figura 2B, Ad+, S-, □).

Os resultados de citometria de fluxo foram confirmados por uso de kit de teste de gene repórter β-Gal quimioluminescente (Roche, Cat. NO. 1 758 241) em extratos de células WiDr, mostrando um aumento de 30 vezes em atividade β- galactosidase como um resultado de tratamento fotoquímico (não mostrado).

Exemplo 3 Os requerentes a seguir estudaram o efeito da dose de vírus na eficiência de transdução fotoquimicamente melhorada. Como é evidente na figura 3, o tratamento fotoquímico aumentou a transdução em todas as doses de vírus testadas. No entanto, o efeito foi mais pronunciado nas menores doses de vírus (MOIs (multiplicidade de infecção) 1 e 5) enquanto aumentos na fluorescência média de entre 15- e 35- vezes foram observados, como comparado com aumentos de cerca de 15- e 35 vezes observados, como comparado a aumentos de cerca de 10- e 5 vezes em MOIs 20 e 50, respectivamente (figura 3B). também se pode notar (figura 3A) que a fluorescência média obtida na dose de luz ótima (7 min) em MOI 5 é cerca de duas vezes o nível observado sem tratamento de luz em MOI 50. Do mesmo modo, o nível obtido com tratamento de luz a MOI 1 é cerca de igual para MOI 20 sem tratamento com luz. Assim, com tratamento fotoquímico ótimo, uma dose de vírus 20 vezes menor é suficiente para dar o mesmo nível de transdução de genes como para infecção sem o tratamento fotoquímico. A porcentagem de células positivas para β- galactosidase obtidas em MOI 50 nesta experiência foi de 90 + 3% (n = 3) como comparado a 13%+ 4 (n = 3) para células não iluminadas. Junto com os resultados para células HCT 116 apresentadas acima, isto indica que com adenovírus, PCI pode transduzir a população de células total.

Protocolos experimentais Células e adenovírus Células de carcinoma de cólon humano HCt 116 e WiDr foram obtidas do American Type Culture Collection (ATCC nos. CCL- 247 e CCL- 218, respectivamente). As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 contendo 10% de soro de bezerro fetal, 100 U/ml de penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina e 2 mM glutamina (todos Gibco BRL, Paisley, UK) a 37 °C em 5% atmosfera C02. O AdHCMV-lacZ de adenovírus recombinante codificando gene lacZ de E. coli controlado pelo promotor de citomegalovírus humano foi obtido por recombinação homóloga usando o sistema pJM17 em células 293 (Addison et al, 1997, J. Gen. Virol. 78: 1653- 61). Os vetores recombinantes foram purificados em placas, cultivados em alto título em células 293 e purificados por banda CsCl (Hitt et al, 1995, methods Mol. Genet. 7: 13-30).

A solução de vírus foi diluída em PBS contendo 0,68 MM CaCl2 e 0,5 mM

MgCl2 para os MOIs empregados nas diferentes experiências.

Tratamento fotoquímico 50.000 células por reservatório foram semeadas em placas de 6 reservatórios (Costar) e incubadas durante a noite a 37°C. Um ml de meio contendo 20 mg/ ml AlPcS2a (Phorphyrin Products, Logan UT) foi adicionado, as células foram incubadas durante 18 h a 37 °C, lavadas três vezes com meio e incubadas durante mais 3 h a 37 °C . O meio foi removido e 200 μΐ de AdHCMV-lacZ foram adicionados. Após incubação durante 30 min a 37 °C, 2 ml de meio foram adicionados e as células foram incubadas durante 30 min antes de exposição a luz vermelha (Phillips TL 20 W/ 09, filtradas através de filtro Cinemoid 35, com uma intensidade de luz alcançando as células de 13,5 W/mz). Antes de análise de atividade β- galactosidase, as células foram incubadas a 37 °C durante dois dias.

Coloração com X-gal das células Para coloração com X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil^- D- galactopiranosídeo), o meio foi descartado, 1 ml de solução fixadora (0,05% glutaraldeído em PBS) foi adicionado e as células foram incubadas em temperatura ambiente durante 15 min. A solução fixadora foi descartada e as células foram lavadas três vezes em PBS em temperatura ambiente (segundo enxague foi durante 10 min, primeiro e terceiro enxágües foram realizados rapidamente). 1 mL solução X-gal (5 mM K3Fe (CN)6, 5 mM K^Fe (CN)6, 1 mM MgCl2, 1 mg/ml X-gal) foram adicionados e as células incubadas durante 4 h a durante a noite a 37 °C e observados por microscopia (ampliação de X 100) usando um microscópio Axiovert SI00 (Zeiss) com uma câmera MC 100 Spot (Zeiss).

Análise de citometria de fluxo As células foram tripsinizadas, centrifugadas, recolocadas em suspensão em 25 ml de meio e incubadas durante 5 min a 37 °C. 25 ml de 2 mM di-β D- galactopiranosídeo de fluoresceína (Molecular Probes Eugene, OR) foram adicionados, e as células incubadas durante 1 min a 37 °C antes de serem diluídas por adição de 450 ml de meio de crescimento resfriado com gelo. As amostras foram mantidas em gelo durante 30-60 min, filtradas através de filtro de náilon de malha 50 mm e analisadas em citômetro de fluxo FACS-Calibur (Becton Dickinson). Para cada amostra, 10.000 eventos foram coletados. A fluoresceína - fluorescência foram medidas através de um filtro de 510- 530 nm após excitação com laser de argônio (15 mW, 488 nm). As células mortas foram discriminadas de células viáveis únicas por ligação em difusão dianteira versus difusão lateral. Os dados foram analisados com o software CELLQuest (Becton Dickinson).

Exemplo 4 Efeito de PCI na transdução de adenovírus de células THX

Material Di-p-D-galactopiranosídeo de fluoresceína (FDG) foi adquirido de Molecular Probes (F-l 179). Uma solução de carga de 20 mM foi preparada dissolvendo o pó em uma mistura 1:1 de DMSO/etanol. A mistura foi adicionada gradualmente em um volume apropriado de água gelada para preparar uma solução de H20/DMSO/etanol 8:1:1. O vírus AdCA171acZ recombinante foi formado e propagado na linhagem de células humanas 293, uma linhagem de células do rim embriônica transformada mantida em meio MEM F-l 1 suplementado com 10% de FCS, 100 U/ml de penicilina (Gibco-BRL), 0,1 mg/ml de estreptomicina (Gibco-BRL) e glutamina 2 mM.

Construção de vírus recombinante O adenovírus recombinante AdCA171acZ codificando o gene E. coli lacZ sob controle do promotor CMV humano foi obtido por recombinação homóloga usando o sistema pJM17 em células 293 (Addison et al., 1997, J. Gen. Virol. 78, 1653-1661). Vetores recombinantes foram purificados em placa, cultivados em alto título em células 293 e purificados por banda de cloreto de césio como anteriormente descrito (Hitt et al., 1995, Methods in Mol. Genetics., 7, 15-30).

Sensibilização de células As células THX (4 x IO5 células) foram semeadas em placas de 6 cm e deixadas cultivar durante a noite. Em aproximadamente 60% de confluência, o meio de cultura foi trocado com 2 ml de meio de cultura suplementado com 20 μg/ml de AlPcS2a, e as placas foram colocadas atrás do incubador durante 16-18 h. O meio contendo sensibilizador foi então sugado e as células incubadas em meio de cultura comum pelo menos 4 h antes de tratamento com luz e infecção com vírus.

Infecção de células Tripsina-EDTA foi usada para destacar células de três placas e o número de células médio nas placas foi calculado por contagem em câmara Bürcher. Diluições de adenovírus foram preparadas em PBS com CaCl2 0,68 nM e MgCl2 0,5 mM de acordo com o número de células a infectar.

Geralmente, as células foram infectadas em um m.o.i. (multiplicidade de infecção) de 1 e 10.

Antes do vírus ser adicionado, as células foram expostas à luz vermelha (Philips TL 20W/09, filtradas através de um filtro Cinemoid 35 com uma intensidade de luz alcançando as células de 1,35 mW/cm2) durante 3 min. Subseqüentemente, o meio foi sugado e 200 μΐ de suspensão de vírus (ou PBS com CaCl2 0,68 mM e MgCl2 0,5 mM nos casos de controles não tratados com vírus) foram adicionados a cada placa. Após incubação durante 30 min a 37°C, 5 ml de meio de cultura comum foram adicionados e as células foram deixadas cultivar durante 48 h.

Ensaio com B-galactosidase As células foram destacadas por Tripsina-EDTA e recolocadas em suspensão em 5 ml do meio de cultura. Após centrifugação durante 5 min a 1000 rpm, o meio foi sugado, as pelotas de células recolocadas em suspensão em 50 μΐ do meio de cultura e os tubos colocados em um banho de água a 37°C durante 5 min. Subseqüentemente, 50 μΐ de solução FDG 2 mM pré-aquecida a 37°C foram adicionados e os tubos colocados dentro do banho de água durante 1 min. Finalmente, 900 μΐ do meio de cultura foram adicionados e os tubos incubados em gelo durante 30-60 min antes das amostras serem analisadas por citometria de fluxo como descrito acima.

Células THX foram tratadas com AlPcS2a (indicado como PS na figura 4) e adenovírus (indicado como “vírus” na figura 4) e expostas à luz durante 3 a 4 min, como descrito em Materiais e Métodos e medidas para atividade de β-galactosidase (β -gal) por citometria de fluxo. A atividade de β-gal total foi quantificada integrando as células positivas de β-gal e sua atividade β-gal. Tanto o número de células positivas em β-gal como a atividade de βgal no meio foram aumentados pelo tratamento PCI.

Os resultados mostram que infecção mínima de células THX ocorre quando as células são incubadas com vírus sozinho ou vírus e agente fotossensibilizante, mas o tratamento fotoquímico, isto é, a adição de luz ao agente fotossensibilizante, potência significativamente a transdução de células (como mostrado pelo aumento na atividade β-gal).

Exemplo 5 Estímulo fotoquímico de transdução de genes mediada por adenovírus 5 x 104 células THX por reservatório foram semeadas em placas de 6 reservatórios. No dia seguinte, 20 pg/ml de AlPcS2a foram adicionados e as células incubadas durante 18 h a 37°C. Todos os procedimentos após AlPcS2a foram realizados em luz atenuada. Para a estratégia “luz antes”, as células foram lavadas com AlPcS2a e incubadas em meio isento de AlPcS2a durante 4 h. Então, as células foram expostas à luz durante 3 min antes do tratamento com o vetor adenoviral AdHCMV-lacZ (também referido no exemplo 4 como AdCA171acZ) em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 1 a 20 min. Este vetor contém um gene repórter de β- galactosidase cuja expressão pode ser analisada por citometria de fluxo (ver abaixo).

Para a estratégia “luz após”, células lavadas e tratadas com AlPcS2a foram primeiramente tratadas com adenovírus na mesma concentração e durante o mesmo tempo como indicado acima, lavadas, e, após adição de meio de cultura novo, expostas à luz. Células não iluminadas foram tratadas de um modo similar exceto para iluminação.

As células tratadas foram lavadas uma vez com meio de cultura e, após adição de meio novo, incubadas a 37°C antes de outra análise.

Expressão de β-galactosidase foi analisada por citometria de fluxo dois dias após exposição à luz. Métodos detalhados para construção do vírus (que é referido tanto como AdHCMV-lacZ como AdCA171acZ), tratamento das células, iluminação e análise da expressão de β-galactosidase são descritos no exemplo 4.

Os resultados (figura 5) mostram que o tratamento fotoquímico usando o procedimento “luz antes” (mostrado pelas barras no lado direito da figura 5) aumenta a porcentagem de células expressando β- galactosidase em cerca de 6 vezes; de 2,5% a 15% nestas condições experimentais. Pode ser também observado que o efeito com o procedimento “luz antes” foi quase igual ao que foi obtido com o método “luz após” (mostrado pelas barras no lado esquerdo da figura 5).

Exemplo 6 Aumento em produção de β- galactosidase como um resultado de transducão mediada por PCI com um adenovírus codificando β- galactosidase As células foram cultivadas, incubadas com AlPcS2a, infectadas com o vírus AdHCMV-lacZ e iluminadas como descrito sob “Protocolo Experimental” no exemplo 3. Para medir a produção de proteína de β- galactosidase, um kit de teste de gene repórter β-Gal quimioluminescente (Roche, Cat. No. 1 758 241) foi usado de acordo com as instruções dos fabricantes). Brevemente, as células foram lavadas três vezes com PBS pré-resffiado e 1 ml de reagente de lise de célula foi adicionado a cada reservatório. Após incubação durante 30 min em temperatura ambiente, o extrato de célula foi transferido em um tubo eppendorf, centrifugado a 4 °C durante 2 min a velocidade máxima, e 50 μΐ do extrato de célula (sobrenadante) foram transferidos para um reservatório de placa de microtitulação. 100 μΐ de reagente de substrato foram adicionados, a placa de microtitulação foi coberta por folha e incubada a temperatura ambiente durante 15 min a 1 h com batidas suaves. Após incubação, a placa de microtitulação foi colocada em um luminômetro (Victor 2 Wallac 1420 Multilabel Counter) e 50 μΐ de solução de iniciação foram injetados automaticamente. Após um atraso de 1 segundo, a produção de luz em 5 segundos foi integrada. A quantidade de β- galactosidase foi calculada de uma curva padrão de amostras contendo quantidades conhecidas de β- galactosidase.

Resultados A figura 6 mostra o aumento na produção de proteína de β- galactosidase que pode ser obtido após transdução de adenovírus induzido por PCI de células de carcinoma de cólon humano WiDr.

Assim, da figura 6 pode-se notar que na dose de luz máxima um aumento de aproximadamente 25 vezes na produção de proteína de β- galactosidase pode ser observado nas células transduzidas, correspondendo bem com o que foi obtido por análise de citometria de fluxo (por exemplo exemplos 2 e 3).

Exemplo 7 Efeito de PCI em transdução de células WiDr em diferentes multiplicidades de infecção As células WiDr foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% FCS (soro de bezerro fetal), penicilina/ estreptomicina e L- glutamina. Em luz reduzida, o meio foi removido e meio contendo 1 pg/ ml TPPS2a foi adicionado. As células (protegidas da luz) foram incubadas a 37 °C durante 18 h. As células foram lavadas três vezes com meio e incubadas por mais 3 h. O meio nas placas de 6 reservatórios foi removido, 200 μΐ de solução de adenovírus AdHCMV-lacZ foram adicionados a cada reservatório e as células foram incubadas durante 30 min a 37 °C (protegidas da luz). A solução de vírus foi removida e as células foram lavadas uma vez com meio. Meio 2 ml foi adicionado e as células foram incubadas durante 30 min a 37 °C (protegidas da luz). Algumas das células foram expostas a 90 s de luz azul com uma intensidade de luz alcançando as células de 11 mW/cm . As células foram incubadas durante 2 dias (ainda protegidas da luz) antes da análise para atividade β- galactosidase por análise de citometria de fluxo como descrito sob “Protocolo Experimental” no exemplo 3.

Resultados A figura 7 mostra que com o emprego de PCI é possível obter 100% de células transduzidas mesmo em casos onde não é possível com infecção convencional usando doses de vírus gerenciáveis. Assim, a figura 7 mostra que com células WiDr e uma dose de vírus de 100 MOI com PCI 100, a % de transdução é obtida, enquanto menos que 30% de transdução são obtidos com infecção convencional. Do mesmo modo em MOI 50, > 90% de transdução foram obtidos após PCI, enquanto sem PCI < 20% de transdução podem ser obtidos.

Exemplo 8 Efeito de PCI em transdução de adenovírus de células A549 As células A549 foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% FCS (soro de bezerro fetal), penicilina/ estreptomicina e L- glutamina. Em luz reduzida, o meio foi removido e meio contendo 20 pg/ ml AlPcS2a foi adicionado. As células (protegidas da luz) foram incubadas a 37 °C durante 18 h. As células foram lavadas três vezes com meio e incubadas por mais 3 h. O meio foi removido, 200 μΐ de solução de adenovírus AdHCMV-lacZ (dando um MOI de 5) foram adicionados a cada reservatório e as células foram incubadas durante 30 min a 37 °C (protegidas da luz). A solução de vírus foi removida e as células foram lavadas uma vez com meio. Meio 2 ml foi adicionado e as células foram incubadas durante 30 min a 37 °C (protegidas da luz). Algumas das células foram expostas a luz vermelha como descrito sob “Protocolo Experimental”.

As células foram incubadas durante 2 dias (ainda protegidas da luz) antes de análise para atividade β- galactosidase por citometria de fluxo como descrito sob “Protocolo Experimental” no exemplo 3.

Resultados A figura 8 mostra que PCI pode melhorar substancialmente a transdução de genes mediada por adenovírus de células de câncer de pulmão humano A549. Assim, como comparado com “infecção normal” (A amostra A+ S- com 0 min luz) PCI com um tempo de iluminação de 6 min aumentou o número de células transduzidas em cerca de 11 vezes, de cerca de 3% a cerca de 33% de células positivas.

Exemplo 9 Efeito de PCI em transdução de linhagens de célula HeLa e FmexIII

As células HeLa foram obtidas do American Type Culture Collection, e as células FmexIII de melanoma humano foram estabelecidas no Norwegian Radium Hospital. As células foram cultivadas, incubadas com o fotossensibilizador TPPS2a (1 pg/ml) infectadas com o adenovírus AdHCMV- lacZ, (MOI 5), iluminadas e analisadas como descrito no exemplo 7.

Resultados A figura 9 mostra que PCI aumenta a transdução também em linhagens de célula de células HeLa e FmexIII.

Exemplo 10 Efeito de PCI em transdução com adenovírus associado com um veículo poli- L-lisina As células WiDr foram cultivadas e incubadas com o fotossensibilizador TPPS2a (1 pg/ml) como descrito no exemplo 7. Poli-L- lisina (PLL, MW 20700) foi de Sigma. A concentração de partículas de vírus na preparação de vírus foi determinada por medição de A26o de acordo com Mittereder et al (J. Virol. 1996 11- 7498- 7509).

Os seguintes complexos adenovírus/ PLL foram feitos: 5PLL/Ad: 5 moléculas PLL por partícula de vírus. 500PLL/Ad: 500 moléculas PLL por partícula de vírus. 250PLL/Ad: 250 moléculas PLL por partícula de vírus. 50PLL/Ad: 50 moléculas PLL por partícula de vírus.

Uma diluição de PLL foi adicionada a uma diluição de partícula viral. As amostras foram misturadas com cuidado por inversão ou aspiração suave com ponta de pipeta, e incubada durante 30 min em temperatura ambiente. O meio nas placas de 6 reservatórios foi removido e 200 μΐ da solução de adenovírus ou solução PLL/Ad foram adicionados a cada reservatório em um MOI de 5. As células foram incubadas durante 30 min a 37 °C (protegidas da luz). As placas não infectadas com adenovírus foram adicionadas a 200 μΐ PBS apenas. A solução de 200 μΐ foi removida, e as células foram lavadas uma vez com meio. Meio de 2ml foi adicionado e as células incubadas durante 30 min a 37 °C (protegidas da luz) antes de serem expostas a luz azul, como descrito no exemplo 7. As células foram incubadas durante 2 dias (ainda protegidas da luz) antes de análise para β- galactosidase por citometria de fluxo como descrito sob “Protocolo Experimental” no exemplo 3.

Resultados A figura 10 mostra que PCI trabalha também em um caso onde o adenovírus foi associado com o veículo poli-L-lisina (PLL). Como se nota da figura 10, a infecção sem PCI (isto é, as doses de luz de 0 min) deram uma transdução muito baixa (< 5%) tanto com como sem PLL como um veículo. É evidente que a iluminação das células induz um aumento dependente de dose de luz na transdução tanto com como sem o PLL, devido aos efeitos de PCI.

Apesar da maior eficiência de transdução obtida sem PLL (O na figura 10) foi de 37%, 87% das células positivas puderam ser obtidas com a combinação de PCI e PLL (·) representando um aumento > 20 vezes na porcentagem de células transduzidas como comparado com o que foi obtido sob as mesmas condições sem PCI, e um aumento de 100 vezes como comparado com infecção normal (0 min luz sem PLL). Assim, PCI pode substancialmente aumentar a eficiência de transdução com adenovírus revestido com PLL, e por uso desta combinação uma eficiência de transdução bem maior pode ser obtida do que para a combinação de PCI sem adenovírus não revestido.

Exemplo 11 Efeito de PCI em transdução de adenovírus de uma linhagem de célula de fibroblastos de pele humana empreeando poli-L-lisina como um veículo para o vírus As células de fibroblastos de pele humana HF-16 foram cultivadas e tratadas com o fotossensibilizador TPPS2a como descrito no exemplo 7. Um complexo de PLL e vírus (250 moléculas de PLL por partícula de vírus) foi feito como descrito no exemplo 10, e as células foram infectadas em um MOI de 5, iluminadas e analisadas como descrito no exemplo 10.

Resultados A figura 11 mostra o efeito de usar PCI em combinação com um veículo PLL na transdução de linhagem de célula de fibroblastos de pele humana (HF-160. As células de fibroblastos são conhecidas como muito resistentes a transdução de adenovírus e como se nota da figura 11, a transdução “normal” ( □, 0 s luz sem PLL) destas células é muito baixa e é melhorada em apenas um pequeno grau por PCI. Quando PLL é empregado como um veículo, a eficiência de transdução sem tratamento de luz aumenta levemente, mas pode se visto que PCI neste caso substancialmente melhora a transdução, com um aumento induzido por luz de 7,5% a 44,5% de células transduzidas sendo observado sob condições ótimas. Assim, combinando o uso de um veículo com a tecnologia PCI pode dar uma transdução eficiente de células que são, de outra forma, muito resistentes à transdução.

Exemplo 12 Efeito de PCI em transdução de adenovírus usando o dendrímero nolicatiônico SunerFect ® como um veículo viral As células WiDr foram cultivadas e incubadas com o fotossensibilizador TPPS2a, como descrito no exemplo 7. SuperFect ® foi adquirido de QIAGEN (3 mg/ml). O adenovírus usado foi AdHCMV-lacZ.

Complexos adenovírus / Superfect ® em diferentes concentrações de Superfect ® foram feitos por adição de quantidades diferentes de Superfect ® à solução de adenovírus e incubação durante 30 min em temperatura ambiente. O meio nas placas de 6 reservatórios foi removido e 200 μΐ de complexos adenovírus / Superfect ® foi adicionado a uma dose de adenovírus de MOI 5. As células foram incubadas durante 30 min a 37 °C (protegidas da luz). A solução de 200 μΐ foi removida, e células foram lavadas uma vez com meio. 2 ml de meio foram adicionados e as células incubadas durante 30 min a 37 °C (protegidas da luz), antes sendo expostas à luz azul como descrito no exemplo 7. As células foram incubadas durante 2 dias (ainda protegidas da luz) antes da análise para atividade de β- galactosidase por citometria de fluxo como descrito sob “protocolo experimental”.

Resultados No exemplo 12, foi demonstrado que PCI é efetivo também como veículos virais diferentes de PLL. Assim, como na figura 12, quando o Superfect ® policátion dendrimérico é usado como um veículo, PCI pode substancialmente aumentar a transdução de genes mediada por adenovírus quando o veículo é usado em concentrações abaixo de 50 μg/ml. No máximo, com Superfect ®, PCI foi capaz de aumentar a porcentagem de células transduzidas a quase 50 vezes o valor obtido com infecção “normal” (isto é sem PCI e sem Superfect ®), enquanto PCI sem Superfect ® deu um aumento máximo de 12 vezes e Superfect ® sozinho um aumento de 10 vezes.

Exemplo 13 Diferentes esquemas de tempo para iluminação e administração de adenovírus As células HCT 116 foram cultivadas e tratadas como fotossensibilizador TPPS2a como descrito no exemplo 7. As células foram infectadas com o adenovírus Ad-HCMV-lacZ (MOI 5) durante 30 min em diferentes pontos de tempo antes ou após iluminação (que foi sempre 4 h após a remoção do fotossensibilizador ). As células foram incubadas durante mais 2 dias ((ainda protegidas da luz) antes da análise para atividade de β- galactosidase por citometria de fluxo como descrito sob “protocolo experimental”.

Resultados A figura 13 mostra o efeito da sincronização do tratamento com luz com relação à liberação do vírus no efeito PCI em transdução de genes mediada por adenovírus. Pode-se notar (figura 13) que a iluminação PCI é efetiva para um intervalo de tempo longo tanto quando o vírus é liberado antes e quando ele é liberado após a iluminação. Assim, se tem uma janela de tempo de pelo menos 17 h ( de vírus dado 4 h antes de iluminação a vírus dados 13 h após iluminação) em que o vírus pode ser administrado e a iluminação pode ser realizada e onde o efeito PCI positivo em transdução ainda será mantido. Isto é muito importante de um ponto de vista clínico porque permite que ao clinico uma grande flexibilidade no projeto do tratamento e coordenação do mesmo para outros tratamentos que o paciente possa receber, por exemplo, a procedimentos cirúrgicos.

Exemplo 14 Melhora PCI do efeito terapêutico do gene de um vetor de adenovírus codificando timidina quinase de vírus de herpes simplex As células de adenocarcinoma HCT 116 foram infectadas com um vetor de terapia gênica de adenovírus codificando o gene HSV-tk (AdV- TK) e submetidas ao tratamento PCI. As condições para infecção foram como descritas sob “protocolo experimental” (MOI=5). 2 dias após infecção, diferentes concentrações de ganciclovir (GCV) foram adicionadas, e as células foram incubadas ainda durante 3 dias antes de análise de sobrevivência das células pelo método MTT. Este método é baseado na redução de sal tetrazólio solúvel em água (MTT) a produto formazan insolúvel, púrpura, por desidrogenases mitocondriais presentes em células vivas, metabolicamente ativas. Um ml de meio contendo 0,25 pg MTT é adicionado às células, seguido por incubação de 4 h (37 °C, 5% v/v C02). Os cristais de formazan resultantes são dissolvidos por adição de 200 μΐ de isopropanol (Sigma MO, USA) por reservatório. A solução é transferida para uma placa de 96 reservatórios que é lida em uma leitora de microplacas Multiskan EX (Labsystems, Finlândia) com um filtro de passagem de banda de 570 nm.

Resultados Como se nota a figura 14, um aumento dependente de luz no efeito tóxico de GCV pode ser observado para 3 doses diferentes de GCV em células recebendo o fotossensibilizador AlPS2a, AdV-TK e GCV. Em comparação, nenhum tal efeito foi visto em células de controle recebendo apenas tratamento com fotossensibilizador, em células recebendo fotossensibilizador + GCV ou em células recebendo fotossensibilizador + AdV-Tk, mas sem GCV. Isto mostra que o aumento induzido por luz em extermínio de células mediado por GCV é devido à liberação de genes TK aumentada induzida pelo tratamento PCI, levando a uma ativação aumentada da prodroga GCV. A combinação gene HSV-tk / GCV é amplamente usada em protocolos clínicos de terapia gênica de câncer e assim este exemplo mostra que PCI pode se usado para aumentar os efeitos de extermínio de células desejado de um gene sendo usado em terapia gênica de câncer. Assim, este exemplo mostra que o efeito melhorador de liberação de genes de PCI não é limitado aos genes repórter, mas ele também pode ser usado para genes codificando proteínas que podem executar um efeito terapêutico nas células de câncer.

Claims (29)

1. Método in vitro ou ex vivo para introduzir uma molécula em uma célula, caracterizado pelo fato de compreender contatar referida célula com um agente fotossensibilizante, contatar referida célula com a molécula a ser introduzida (molécula de transferência) que é associada com um veículo viral, em que a referida molécula de transferência foi incorporada ou conectada ao referido veículo viral, e irradiar a referida célula com luz de um comprimento de onda efetivo para ativar o agente fotossensibilizante; em que o referido veículo viral é um adenovírus ou um vírus adenoassociado e o referido agente fotossensibilizante se localiza em compartimentos intracelulares, particularmente endossomas ou lisossomas.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que referida célula é de mamífero.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que referida molécula de transferência é uma molécula de ácido nucleico que compreende um gene de comprimento completo ou cDNA ou outro DNA codificando o mesmo, ou um fragmento funcional do mesmo.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que referida molécula nucleica codifica uma enzima ativadora de prodroga, uma toxina de proteína, uma proteína induzindo apoptose, um fator estimulante imune, um antígeno específico para tumor, um inibidor imune/ inflamação, um inibidor de angiogênese, uma proteína induzindo a formação de vasos, uma proteína iniciando a coagulação, um anticorpo intracelular ou uma imunotoxina recombinante.

5. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que referida molécula de transferência é uma molécula de ácido nucleico que codifica uma molécula de RNA anti-sentido, uma ribozima, um aptâmero, um oligonucleotídeo ou um oligonucleotídeo formando triplex.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizado pelo fato de que referida molécula de ácido nucleico tem 20 a 10.000 bases de comprimento.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a molécula de transferência é um polinucleotídeo e é inserida dentro de uma construção viral que contém elementos derivados virais necessários para permitir que a construção se tome embalada dentro do veículo viral.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o agente fotossensibilizante é separado do veículo viral, e preferivelmente os referidos agente fotossensibilizante e veículo viral são contatados com referida célula sequencialmente.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o agente fotossensibilizante é selecionado dentre o gmpo consistindo de TPPS2a, AlpcS2a, e outros fotossensibilizadores anfifüicos.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que os referidos agentes fotossensibilizantes são compostos sendo ácido 5-aminolevulínico ou ésteres de ácidos 5- aminolevulínicos ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o referido veículo viral é contatado com referida célula durante 15 minutos a 6 horas.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o referido agente fotossensibilizante é contatado com referidas células durante 4 a 24 horas antes da irradiação.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a etapa de irradiação é de 1 a 10 minutos.

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que referido veículo viral é adicionado antes ou após a irradiação.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que um ou ambos dentre o agente fotossensibilizante e o veículo viral é fixado em, associado com, ou conjugado a, uma ou mais moléculas virais, moléculas de marcação ou vetores.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que referido veículo viral é fixado a, associado com ou conjugado a, uma molécula veículo.

17. Método de acordo com a reivindicação 15 ou 16, caracterizado pelo fato de que referida molécula veículo compreende um policátion ou lipídeo catiônico.

18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o referido policátion é poli-L-lisina, poli-D-lisina ou SuperFect®.

19. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o referido lipídeo catiônico é DOTAP.

20. Método de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizado pelo fato de que referida molécula veículo é um lipossoma ou construção à base de lipídeo, preferivelmente contendo pelo menos um lipídeo catiônico.

21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que pelo menos 50% das referidas células nas quais a referida molécula é introduzida não são mortas.

22. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender (i) uma molécula de transferência associada com um veículo viral, em que a referida molécula de transferência foi incorporada ou conectada ao referido veículo viral, e um agente fotossensibilizante ou (ii) uma célula contendo uma molécula de transferência que foi introduzida na referida célula pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 21.

23. Composição de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de ser para uso em terapia.

24. Composição de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de ser para uso em terapia gênica.

25. Uso de (i) uma molécula de transferência associada com um veículo viral e um agente fotossensibilizante usados no método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 21 ou (ii) uma célula contendo uma molécula de transferência que foi introduzida na referida célula pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento para uso em terapia gênica.

26. Uso de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o medicamento é para uso no tratamento ou prevenção de uma doença, distúrbio ou infecção em um paciente por terapia gênica, em que, no referido tratamento ou prevenção, uma molécula de transferência é introduzida em uma ou mais células in vitro, in vivo ou ex vivo, de acordo com o método definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 21, e onde necessário, administrar referidas células no referido paciente.

27. Uso de acordo com a reivindicação 25 ou 26, caracterizado pelo fato de que referida terapia gênica é para ser obtida por extermínio marcado no alvo de células específicas, inibição marcada no alvo de expressão de genes, terapia de aumento, ou correção de mutação pela introdução de um gene ou porção do mesmo capaz de expressar um produto funcional para compensar uma deficiência em um paciente.

28. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 27, caracterizado pelo fato de que referida doença, distúrbio ou infecção é câncer, artrite reumatóide, arterosclerose, uma infecção viral ou outras infecções, psoríase, ceratose solar, uma ferida, uma fratura, uma verruga, ou um distúrbio genético herdado.

29. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 28, caracterizado pelo fato de que 103 a 1015 partículas de vírus são para serem administradas in vivo.