ES2959398T3 - Compuesto y método para vacunación e inmunización - Google Patents

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Abstract

La presente invención se refiere a un método de vacunación o inmunización que implica el uso de un agente fotosensibilizante, una molécula antigénica, por ejemplo un componente de vacuna, y un agente que potencia el efecto de la vacunación mediada por internalización fotoquímica (PCI), en la que el agente es un ligando. para un receptor tipo Toll (TLR) como se define en el presente documento, e irradiación con luz de una longitud de onda eficaz para activar el agente fotosensibilizante. La invención también se refiere a composiciones antigénicas, por ejemplo de vacuna, útiles en tal método. La invención también proporciona un método para generar células presentadoras de antígenos que pueden usarse para generar una respuesta inmune, por ejemplo, para vacunación, que implica usar los mismos componentes que antes para introducir moléculas antigénicas, por ejemplo, componentes de vacunas, en las células para lograr la presentación de antígenos, y a composiciones antigénicas útiles en dicho método. La invención también proporciona el uso de células generadas in vitro mediante tales métodos para administración a un paciente in vivo para provocar una respuesta inmune, por ejemplo para lograr la vacunación. También se proporciona un método para internalizar una molécula antigénica en una célula. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Compuesto y método para vacunación e inmunización
La presente invención se refiere a un método in vitro o ex vivo para expresar un péptido antigénico o una parte del mismo en la superficie de una célula que implica el uso de un agente fotosensibilizante, un péptido antigénico, por ejemplo, un componente de vacuna, y un ligando para un receptor de tipo toll (TLR, del inglés Toll-like receptor) como se define en el presente documento mediante un método mediado por internalización fotoquímica (PCI, del inglés photochemical internalization). La invención también se refiere a estos componentes para usos terapéuticos. La invención también se refiere a composiciones farmacéuticas útiles en dichos usos terapéuticos. La invención también proporciona productos y kits que contienen esos componentes para su uso en la estimulación de una respuesta inmunitaria.
La vacunación implica la administración de moléculas antigénicas para provocar que el sistema inmunitario estimule el desarrollo de una inmunidad adaptativa a un patógeno. Las vacunas pueden prevenir o mejorar la morbilidad por infección. La vacunación es el método más eficaz para prevenir enfermedades infecciosas, y la inmunidad generalizada debida a la vacunación es en gran parte responsable de la erradicación mundial de la viruela y la restricción de enfermedades tales como la poliomielitis, el sarampión y el tétanos en gran parte del mundo.
El agente activo de una vacuna puede ser una forma inalterada pero inactivada (no infecciosa) o atenuada (con infecciosidad reducida) de los patógenos causantes, o componentes purificados del patógeno que se ha encontrado que son inmunógenos (por ejemplo, proteínas de la cubierta externa de un virus). Los toxoides se producen para la inmunización contra enfermedades basadas en toxinas, tales como la modificación de la toxina tetanoespasmina del tétanos para eliminar su efecto tóxico, pero mantener su efecto inmunógeno.
Dado que la mayoría de las vacunas se captan por células presentadoras de antígenos a través de la endocitosis y se transportan a través de los endosomas a los lisosomas para la digestión y presentación del antígeno a través de la vía del MHC de clase II, la vacunación activa principalmente los linfocitos T auxiliares CD4 y los linfocitos B. Para combatir trastornos o enfermedades tales como el cáncer, así como infecciones intracelulares, la estimulación de las respuestas de linfocitos T CD8 citotóxicos es importante. Sin embargo, la inducción de linfocitos T CD8 citotóxicos suele fallar debido a la dificultad de llevar el antígeno al citosol y a la vía de presentación del antígeno del MHC de clase I. La internalización fotoquímica (PCI) mejora la administración de moléculas al citosol y se conocen métodos de vacunación que emplean PCI. La PCI es una técnica que utiliza un agente fotosensibilizante, en combinación con una etapa de irradiación para activar ese agente, y se sabe que logra la liberación de moléculas coadministradas a una célula en el citosol de la misma. Esta técnica permite que las moléculas que son absorbidas por la célula en orgánulos, tales como los endosomas, se liberen de estos orgánulos en el citosol después de la irradiación. La PCI proporciona un mecanismo para introducir moléculas que de otro modo serían impermeables a la membrana (o poco permeables) en el citosol de una célula de una manera que no dé como resultado una destrucción celular generalizada o muerte celular.
El método básico de internalización fotoquímica (PCI) se describe en los documentos WO 96/07432 y WO 00/54802. (Los métodos de PCI también se han descrito en los documentos WO2011/018636; WO02/44395; WO02/44396; GB2420784; WO2008/07073; Baglo et al., 2014, Biomed. Res. Int., vol. 77(3), p759-10; Folini et al., 2003, Cancer Res., vol. 63(13), p3490-3494; Selbo et al., 2006. J. Pharm. Exp. Therap., vol. 319(2), P604-612; Selbo et al., 2009, PLOS One, vol. 4(8), pe6691; y Stratford et al., 2013, Biochim. Et Biophy. Acta, vol. 1830(8), p4235-4243; incluso en algunos casos para usos terapéuticos tales como en vacunas). En dichos métodos de PCI, la molécula a internalizar (que en la presente invención sería el péptido antigénico) y un agente fotosensibilizante se ponen en contacto con una célula. El agente fotosensibilizante y la molécula que se va a internalizar se absorben en un subcompartimento unido a la membrana celular dentro de la célula, es decir, se someten a endocitosis en una vesícula intracelular (por ejemplo, un lisosoma o un endosoma). Al exponer la célula a la luz de la longitud de onda apropiada, se activa el agente fotosensibilizante que genera directa o indirectamente especies reactivas que rompen las membranas de la vesícula intracelular. Esto permite que la molécula internalizada se libere en el citosol.
Se encontró que en dicho método la funcionalidad o la viabilidad de la mayoría de las células no se veía afectada negativamente. Por lo tanto, se propuso la utilidad de dicho método, denominado "internalización fotoquímica", para transportar al citosol, es decir, al interior de una célula, una variedad de moléculas diferentes, incluidos agentes terapéuticos.
El documento WO 00/54802 utiliza dicho método general para presentar o expresar moléculas de transferencia en una superficie celular. Por lo tanto, después del transporte y la liberación de una molécula en el citosol celular, la molécula (o una parte de ella) puede transportarse a la superficie de la célula donde puede presentarse en el exterior de la célula, es decir, en la superficie celular. Dicho método tiene una utilidad particular en el campo de la vacunación, donde los componentes de la vacuna, es decir, antígenos o inmunógenos, pueden introducirse en una célula para su presentación en la superficie de esa celda, para inducir, facilitar o aumentar una respuesta inmunitaria.
Si bien la vacunación ha logrado algunos éxitos notables, sigue existiendo una necesidad de métodos de vacunación alternativos y mejorados. La presente invención aborda esta necesidad.
Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que, de manera ventajosa, un método que implique el uso de un agente fotosensibilizante, un péptido antigénico, por ejemplo, un componente de vacuna, y un ligando de TLR como se define en el presente documento, y la irradiación con luz de una longitud de onda eficaz para activar el agente fotosensibilizante da como resultado una vacunación mejorada o una respuesta inmunitaria mejorada. El alcance de la invención se define por medio de las reivindicaciones. Las referencias a métodos de tratamiento en el sumario y la descripción detallada de la invención en esta descripción deben interpretarse como referencias a los compuestos, las composiciones farmacéuticas y los medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia.
Como se describirá con más detalle en los ejemplos a continuación, se ha demostrado que los usos y métodos de la invención dan como resultado una vacunación mejorada o una respuesta inmunitaria mejorada, por ejemplo, una producción de una mayor cantidad de linfocitos T específicos de antígeno. Por ejemplo, en la figura 1 se demuestra que la vacunación in vivo de ratones usando un antígeno, ligandos de TLR (ya sea un oligonucleótido CpG o una imidazoquinolina), un fotosensibilizador y la irradiación con luz de una longitud de onda eficaz para activar el fotosensibilizador condujo a un porcentaje significativamente mayor de linfocitos T específicos de antígeno en la sangre y el bazo de dichos ratones, en comparación con el tratamiento con el antígeno y fotosensibilizador/irradiación de luz solos. Los efectos sinérgicos también se demuestran en los presentes ejemplos in vivo con una gama de otros ligandos de TLR, por ejemplo poli(IC), imiquimod y MPLA. Por lo tanto, los presentes inventores han demostrado que se pueden lograr mejoras sinérgicas de la respuesta inmunitaria in vivo usando una variedad de ligandos de TLR en los usos de la invención.
Aunque sin el deseo de limitarse a teoría alguna, se cree que los usos y métodos de la invención dan como resultado una mayor presentación de antígenos en las moléculas del MHC de clase I que conducen a un aumento de las respuestas de los linfocitos T CD8+ y, por tanto, a métodos de vacunación mejorados. Como se analiza más adelante, algunos de los ejemplos presentes utilizan un sistema modelo de células OT-1, que se utiliza para evaluar la presentación del MHC de clase I (véase, por ejemplo, Delamarre et al. J. Exp. Med. 198:111-122, 2003). En este sistema modelo, la presentación del MHC de clase I del epítopo antigénico SIINFEKL conduce a la activación de los linfocitos T OT-1, y la activación se puede medir como un aumento en la proliferación de los las linfocitos T específicos del antígeno o como una mayor producción de IFN<y>o IL-2. Los resultados con los métodos y usos de la presente invención muestran un mayor número de linfocitos T específicos de antígeno y una mayor producción de IL-2 e IFNy por parte de los linfocitos T, que se correlaciona con una mayor o mejor presentación de antígenos.
Por lo tanto, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un método in vitro o ex vivo para expresar un péptido antigénico o una parte del mismo en la superficie de una célula, que comprende poner en contacto dicha célula con dicho péptido antigénico, un agente fotosensibilizante y un ligando de TLR, e irradiar la célula con luz de una longitud de onda eficaz para activar el agente fotosensibilizante, en donde dicho péptido antigénico se libera en el citosol de la célula y el péptido antigénico o una parte del mismo se presenta posteriormente en la superficie de la célula, en donde dicho ligando de TLR se selecciona de:
i) un ligando de TLR2 que es un lipopolisacárido;
ii) un ligando de TLR3 que es poli(I:C);
iii) un ligando de TLR4 que es un lipopolisacárido o un monofosforil lípido A (MPLA, del inglés Monophosphoryl Lipid A);
iv) un ligando de TLR7 que es
(a) un compuesto de imidazoquinolina de fórmula (1) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
en donde:
R1 es N-CH2-C(CHa)2-Ra;
R2 es -CH2-X-CH2CH3 o un átomo de hidrógeno;
R3 es OH o un átomo de hidrógeno, y
X es O o NH; o
(b) ssPoliU;
v) un ligando de TLR8 que es ssPoliU; y
vi) un ligando de TLR9 que es un oligonucleótido CpG que es un oligonucleótido monocatenario de 6 a 50 bases que incluye al menos un motivo CpG y al menos una base que flanquea dicho motivo en cada uno de los lados 3' y 5'.
Preferentemente, este método (y los métodos descritos posteriormente) emplean solo los tres principios activos (agentes) descritos anteriormente en dicho método y los agentes están presentes en niveles adecuados (por ejemplo, en los niveles mínimos descritos a continuación) en los métodos de manera que afectan la eficacia del método (es decir, tener un papel activo en la mejora de la estimulación de la respuesta inmunitaria/presentación de antígenos/vacunación por PCI). Por lo tanto, preferentemente, los agentes están presentes en tampones sin otros principios activos.
En dichos métodos, dicho péptido antigénico y dicho agente fotosensibilizante, y opcionalmente dicho ligando de TLR como se define en el presente documento, se absorben en una vesícula intracelular; y cuando se irradia la célula, la membrana de la vesícula intracelular se rompe liberando el péptido antigénico al citosol de la célula.
Los diversos agentes pueden incorporarse en la misma vesícula intracelular o en una diferente entre sí. Se ha encontrado que las especies activas producidas por los fotosensibilizadores pueden extenderse más allá de la vesícula en la que están contenidas y/o que las vesículas pueden fusionarse permitiendo que el contenido de una vesícula se libere al fusionarse con una vesícula alterada. Tal como se hace referencia en el presente documento, "absorbido" significa que la molécula absorbida está totalmente contenida dentro de la vesícula. La vesícula intracelular está limitada por membranas y puede ser cualquier vesícula resultante después de la endocitosis, por ejemplo, un endosoma o lisosoma.
Tal como se utiliza en el presente documento, un compartimento "alterado" se refiere a la destrucción de la integridad de la membrana de ese compartimento de forma permanente o temporal, suficiente para permitir la liberación del péptido antigénico contenido en su interior.
Un "agente fotosensibilizante" como se menciona en el presente documento, es un compuesto que es capaz de traducir la energía de la luz absorbida en reacciones químicas cuando el agente se activa con iluminación a una longitud de onda e intensidad adecuadas para generar una especie activada. Los productos finales altamente reactivos de estos procesos pueden dar como resultado citotoxicidad y toxicidad vascular. De manera conveniente, dicho agente fotosensibilizante puede ser uno que se localice en compartimentos intracelulares, en particular, en endosomas o lisosomas.
Los fotosensibilizadores pueden ejercer sus efectos por una variedad de mecanismos, de manera directa o indirecta. Por lo tanto, por ejemplo, ciertos fotosensibilizadores se vuelven directamente tóxicos cuando se activan por la luz, mientras que otros actúan para generar especies tóxicas, por ejemplo, agentes oxidantes tales como oxígeno singulete u otras especies reactivas de oxígeno, que son extremadamente destructivos para el material celular y biomoléculas tales como lípidos, proteínas y ácidos nucleicos aislados.
Se conoce en la materia una variedad de dichos agentes fotosensibilizantes y se describen en la bibliografía, incluido en el documento WO96/07432, y pueden utilizarse en métodos y usos de la invención. Hay muchos agentes fotosensibilizantes conocidos, incluidos porfirinas, ftalocianinas, purpurinas, clorinas, benzoporfirinas, bases lisosomotrópicas débiles, naftalocianinas, colorantes catiónicos y tetraciclinas o derivados de los mismos (Berg et al., (1997), J. Photochemistry and Photobiology, 65, 403-409). Otros agentes fotosensibilizantes incluyen texafirinas, feoforbidas, porficenos, bacterioclorinas, cetoclorinas, derivados de la hematoporfirina y fotosensibilizadores endógenos inducidos por el ácido 5-aminolevulínico y derivados del mismo, potofrina, dímeros u otros conjugados entre fotosensibilizadores.
Las porfirinas son los agentes fotosensibilizadores más extensamente estudiados. Su estructura molecular incluye cuatro anillos de pirrol unidos mediante puentes de metino. Son compuestos naturales que a menudo son capaces de formar complejos metálicos. Por ejemplo, en el caso de la proteína de transporte de oxígeno hemoglobina, se introduce un átomo de hierro en el núcleo de porfirina del hemo B.
Las clorinas son anillos aromáticos heterocíclicos grandes que consisten, en el núcleo, en tres pirroles y una pirrolina acoplados a través de cuatro enlaces metino. A diferencia de la porfirina, una clorina, por lo tanto, es en gran parte aromática, pero no aromática a través de toda la circunferencia del anillo.
El experto apreciará qué fotosensibilizadores son adecuados para su uso en la presente invención. En particular, se prefieren los agentes fotosensibilizantes que se localizan en endosomas o lisosomas de células. Por lo tanto, el agente fotosensibilizante es preferentemente un agente que se absorbe en los compartimentos internos de los lisosomas o endosomas. Preferentemente, el agente fotosensibilizante se absorbe en compartimentos intracelulares por endocitosis. Los fotosensibilizadores preferidos son ftalocianina de aluminio disulfonada y tetrasulfonada (por ejemplo, AIPcS2a), tetrafenilporfinas sulfonadas (TPPSn), bacterioclorinas de tetrafenilo sulfonadas (por ejemplo, TPBS2a), azul del Nilo, derivados de clorina<6>, uroporfirina I, filoeritrina, hematoporfirina y azul de metileno. Otros fotosensibilizadores adecuados para su uso en la invención se describen en el documento WO03/020309, a saber, clorinas de mesotetrafenil sulfonadas, preferentemente TPCS2a. Los agentes fotosensibilizantes preferidos son fotosensibilizadores anfifílicos (por ejemplo, fotosensibilizadores disulfonados) tales como ftalocianinas anfifílicas, porfirinas, clorinas y/o bacterioclorinas, y en particular incluyen TPPS2a (disulfonato de tetrafenilporfina), AIPcS2a (disulfonato de ftalocianina de aluminio), TPCS2a (disulfonato de tetrafenil clorina) y TPBS2a (disulfonato de tetrafenil bacterioclorina), o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. También se prefieren los agentes fotosensibilizantes hidrófilos, por ejemplo TPPS4 (tetrasulfonato de meso-tetrafenilporfina). Agentes fotosensibilizantes particularmente preferidos son ftalocianinas de aluminio sulfonadas, tetrafenilporfinas sulfonadas, tetrafenilclorinas sulfonadas y tetrafenilbacterioclorinas sulfonadas, preferentemente TPCS2a, AIPcS2a, TPPS4 y TPBS2a. En una realización particularmente preferida de la presente invención, el agente fotosensibilizante es la clorina TPCS2a (tetrafenil clorina disulfonada, por ejemplo, Amphinex®).
Un fotosensibilizador se puede unir a un vehículo para proporcionar el agente fotosensibilizante. Por lo tanto, en un aspecto preferido de la presente realización de la invención, el agente fotosensibilizante es un conjugado de un fotosensibilizador y quitosano como se define en la fórmula (I):
n es un número entero superior o igual a 3;
R aparece n veces en dicho compuesto y, en el 0,1 % al 99,9 % (preferentemente del 0,5 % al 99,5 %) de dichos grupos Rn totales,
cada R es un grupo A seleccionado de:
en donde cada R1, que pueden ser iguales o diferentes, se selecciona de H, CH3 y -(CH<2>)b-CH<3>; a es 1, 2, 3, 4 o 5; y b es 0, 1, 2, 3, 4 o 5 (en el que el contraión puede ser, por ejemplo, Cl-); preferentemente R1 es CH3 y b es 1,
y
en donde Y es O; S; SO2; -NCH3; o -N(CH<2>)dCH<3>; c = 1, 2, 3, 4 o 5; y d = 1, 2, 3, 4 o 5, preferentemente Y es -NCH<3>y c es 1,
en donde cada grupo R puede ser igual o diferente, y, en el 0,1 % al 99,9 % (preferentemente del 0,5 % al 99,5 %) de dichos grupos Rn totales,
cada R es un grupo B seleccionado de:
y
en donde
e es<0>,<1>,<2>,<3>,<4>o<5>; y f es<1>,<2>,<3>,<4>o<5>; preferentemente e y f =<1>,
R2 es un grupo seleccionado de:
W es un grupo seleccionado de O, S, NH o N(CH3); preferentemente NH,
R3 es un grupo seleccionado de:
y
V es un grupo seleccionado de CO, SO2, PO, PO2H o CH2; preferentemente CO, y
R4 es un grupo (sustituido en la posición o, m o p), que pueden ser iguales o diferentes, seleccionado de H, -OH, -OCH3, -CH3, -COCH3, C(CH<3>)<4>, -NH2, -NHCH3, -N(CH<3>)<2>y -NCOCH3, preferentemente H,
en donde cada grupo R puede ser igual o diferente.
El polímero de quitosano tiene al menos 3 unidades (n = 3). Sin embargo, preferentemente n es al menos 10, 20, 50, 100, 500, 1000, por ejemplo, de 10 a 100 o de 10 a 50.
En una realización preferida, R2 se selecciona de
En otra realización preferida, R<3>se selecciona de
Preferentemente R2 o R3 es TPPa, TPCai o TPCci.
El grupo A puede proporcionar del 70 al 95 % de los grupos Rn totales y el grupo B puede proporcionar del 5 al 30 % de los grupos Rn totales.
En una realización más preferida, el conjugado de un fotosensibilizador y quitosano se selecciona de (véase la numeración en los esquemas 1 a 5B en la figura 4):
17: B:25 %, A:75 %
19: B:25 %, A:75 %
33: B:10 %; A:90 %
, y
37: B:10 %; A:90 %
En las estructuras anteriores, los valores de % A/B proporcionados se refieren a la proporción de grupos Rn que son del grupo A o B. Los asteriscos indican el resto del polímero de quitosano.
Estos compuestos pueden prepararse mediante métodos de síntesis que utilizan procedimientos convencionales en la materia, que será familiar para el experto. A modo de ejemplo, la síntesis de los conjugados preferidos analizados a continuación, números 17, 19, 33 y 37, se muestra en los esquemas de reacción 1 a 5B en la figura 4 (y véase también la leyenda de la figura 4).
Una molécula "antígena" como se refiere en el presente documento, es una molécula, o una parte de la misma, que en sí misma es capaz de estimular una respuesta inmunitaria, cuando se presenta al sistema inmunitario de una manera adecuada. La molécula antigénica utilizada de acuerdo con la invención es un péptido antigénico. De manera ventajosa, el péptido antigénico es un antígeno de vacuna o componente de vacuna, tal como una entidad que contiene un polipéptido.
Muchos de tales antígenos o componentes de vacunas antigénicas se conocen en la materia e incluyen todo tipo de antígenos bacterianos o víricos o, de hecho, antígenos o componentes antigénicos de cualquier especie patógena incluyendo protozoos u organismos superiores. Aunque tradicionalmente los componentes antigénicos de las vacunas han comprendido organismos completos (vivos, muertos o atenuados), es decir, vacunas de células completas, además de vacunas de subunidades, es decir, vacunas basadas en componentes antigénicos particulares de organismos, por ejemplo, proteínas o péptidos, o incluso hidratos de carbono, se han investigado ampliamente e informado en la bibliografía. Se puede utilizar cualquier componente de vacuna basada en "subunidades" como la molécula antigénica de la presente invención, siempre que sea un péptido antigénico.
La invención encuentra una utilidad particular en el campo de las vacunas peptídicas. La molécula antigénica para su uso de acuerdo con la invención es un péptido (que se define en el presente documento para incluir péptidos de longitudes tanto más cortas como más largas, es decir, péptidos, oligopéptidos o polipéptidos, y también moléculas proteicas o fragmentos de las mismas, por ejemplo, péptidos de 5 a 500, por ejemplo, de 10 a 250 tal como de 15 a 75, o de 8 a 25 aminoácidos).
Se ha propuesto en la bibliografía un gran número de candidatos de vacunas peptídicas, por ejemplo, en el tratamiento de enfermedades e infecciones víricas tales como infección por VIH/SIDA o gripe, parvovirus canino, virus de la leucemia bovina, hepatitis, etc. (véase, por ejemplo, Phanuphak et al., Asian Pac. J. Allergy. Immunol. 1997, 15(1), 41-8; Naruse, Hokkaido Igaku Zasshi 1994, 69(4), 811-20; Casal et al., J. Virol., 1995, 69(11), 7274-7; Belyakov et a t, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95(4), 1709-14; Naruse et a l, Proc. Natl. Sci. USA, 1994 91(20), 9588-92; Kabeya et a l, Vaccine 1996, 14(12), 1118-22; Itoh et a l, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, 83(23) 9174-8. De forma similar, pueden usarse péptidos bacterianos, como también pueden ser antígenos peptídicos procedentes de otros organismos o especies.
Además de los antígenos procedentes de organismos patógenos, también se han propuesto péptidos para su uso como vacunas contra el cáncer u otras enfermedades tales como esclerosis múltiple. Por ejemplo, los péptidos de oncogenes mutantes son muy prometedores como vacunas contra el cáncer que actúan como antígenos en la estimulación de linfocitos T citotóxicos. (Schirrmacher, Journal of Cancer Research and Clinical Oncology 1995, 121, 443-451; Curtis Cancer Chemotherapy and Biological Response Modifiers, 1997, 17, 316-327). También se ha evaluado una vacuna de péptido sintético para el tratamiento del melanoma metastásico (Rosenberg et al., Nat. Med.
1998, 4(3), 321-7). Se describe una vacuna de péptido receptor de linfocitos T para el tratamiento de la esclerosis múltiple en Wilson et al., J. Neuroimmunol. 1997, 76(1-2), 15-28. Puede utilizarse cualquiera de dichos componentes de vacuna peptídica como el péptido antigénico de la invención, al igual que cualquiera de los péptidos descritos o propuestos como vacunas peptídicas en la bibliografía.
Por lo tanto, el péptido puede ser sintético o aislado o procedente de otro modo de un organismo.
En una realización preferida de la presente invención, el antígeno es un antígeno de melanoma. El "antígeno de melanoma" puede incluir uno o más antígenos diferentes.
Por ejemplo, en un aspecto, el antígeno de melanoma es una proteína o péptido de melanoma, por ejemplo, un péptido antigénico o un epítopo de linfocito T, por ejemplo, uno o más seleccionados de gp100, Melan-A, tirosinasa, MAGE-1, MAGE-3 y proteína 2 relacionada con tirosinasa (TRP-2) o un epítopo peptídico de los mismos. Los detalles de estos y otros antígenos de melanoma adecuados se divulgan en Renkvist et al., Cancer Immunol. Immunother. 50:3-15, 2001 (y referencias en el mismo), y Modi, Clin. Cancer. Res. 12:673-678, 2006. En particular, gp100, Melan-2, tirosinasa, MAGE-1, MAGE-3 y TRP-2 y sus epítopos peptídicos son como se describe en Renkvist et al., citado anteriormente. Por lo tanto, la invención se extiende al uso de gp100, Melan-2, tirosinasa, MAGE-1, MAGE-3 o TRP-2, o un péptido antigénico que comprende o consiste en sus epítopos peptídicos divulgados, tal y como divulga Renkvist et al., citado anteriormente, o una secuencia con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la misma (sobre una ventana de comparación oportuna) utilizando técnicas de comparación convencionales conocidas en la materia. En una realización preferida el antígeno es TRP-2 y/o gp100, preferentemente TRP-2.
Los antígenos peptídicos, por ejemplo de hasta al menos 200 aminoácidos, puede obtenerse de compañías que realizan síntesis de péptidos personalizados, por ejemplo, United BioSystems Inc (anteriormente United Peptide Corp., Herndon, VA, Estados Unidos).
En una realización preferida alternativa, el péptido antigénico procede de un virus del papiloma humano (HPV, del inglés Human Papilloma Virus). El genoma del virus del papiloma se divide en una región temprana (E), que codifica seis (E1, E2, E4, E5, E6 y E7) marcos de lectura abiertos (ORF, del inglés open reading frames) que se expresan inmediatamente después de la infección inicial de una célula hospedadora, y una región tardía (L) que codifica una proteína de cápside principal L1 y una proteína de cápside menor L2. Todos los ORF víricos están codificados en una cadena de ADN.
En una realización preferida, el péptido antigénico comprende una proteína o un péptido, o un fragmento del mismo, es decir, un antígeno de un virus del papiloma humano (HPV) (por ejemplo, procedente de dicho virus) que es preferentemente una proteína o parte de la misma de una de las proteínas tempranas o tardías a las que se hace referencia en el presente documento. Por lo tanto, el antígeno del HPV puede ser uno o más péptidos antigénicos conocidos o epítopos de linfocitos T, por ejemplo, uno o más seleccionados de cualquier antígeno conocido de cualquier tipo de HPV. Los detalles de los tipos y antígenos del HPV se pueden encontrar en Ma et al. Current Cancer Therapy Reviews 6: 81-103, 2010.
Por ejemplo, el péptido antigénico puede proceder del tipo del HPV HPV-16 y/o HPV-18, o del HPV de tipo 31 o tipo 45. Por ejemplo, el antígeno puede proceder de cualquiera de las proteínas E1, E2, E4, E5, E6 o E7, o de cualquiera de las proteínas L1 y L2. El péptido antigénico puede proceder de uno o más de las proteínas E2, E6 y E7 del HPV-16 y 18. En una realización preferida, el péptido antigénico contiene la secuencia GQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIR de E7 del HPV-16 (el epítopo CD8 se muestra en negrita). Por lo tanto, el antígeno del HPV puede ser un péptido de 35 aminoácidos. Como alternativa, el péptido antigénico puede ser solo el epítopo CD8 RAHYNIVTF, es decir, un péptido más corto.
Los antígenos peptídicos del HPV se pueden obtener de empresas que realizan síntesis de péptidos personalizados, por ejemplo, United BioSystems Inc (anteriormente United Peptide Corp., Herndon, VA, Estados Unidos).
Una vez liberado en el citosol celular por el proceso de internalización fotoquímica, el péptido antigénico puede procesarse por la maquinaria de procesamiento de antígenos de la célula. Por lo tanto, el péptido antigénico expresado o presentado en la superficie de la célula puede ser una parte o un fragmento del péptido antigénico que se internaliza (endocitado). Una "parte" de un péptido antigénico que se presenta o expresa comprende preferentemente una parte que se genera mediante maquinaria de procesamiento de antígenos dentro de la célula. Sin embargo, las partes pueden generarse por otros medios que pueden lograrse mediante un diseño de antígeno adecuado (por ejemplo, enlaces sensibles al pH) o a mediante otros medios de procesamiento celular. De manera conveniente, dichas partes tienen un tamaño suficiente para generar una respuesta inmunitaria, por ejemplo, para péptidos mayores de 5, por ejemplo, de más de 10 o 20 aminoácidos de tamaño.
El agente que potencia la vacunación mediada por PCI de acuerdo con la presente invención es un ligando para un receptor de tipo toll (TLR). Los receptores de tipo Toll son una clase de proteínas que desempeñan un papel clave en el sistema inmunitario innato, así como en el sistema digestivo. Los TLR y los receptores de interleucina 1 forman una superfamilia de receptores, denominada superfamilia de receptores de interleucina 1/receptores de tipo toll. Todos los miembros de esta familia tienen un dominio receptor Toll-IL-1 (TIR, del inglés Toll-IL-1 receptor). Los miembros de la familia de receptores de interleucina 1 (IL-1R) se caracterizan por dominios extracelulares similares a inmunoglobulinas y dominio intracelular Toll/Interleucina-1R (TIR). Los receptores con dominios TIR del subgrupo 2 se consideran TLR.
Los TLR son receptores no catalíticos únicos que atraviesan la membrana expresados generalmente en células centinela, tales como macrófagos y células dendríticas, que reconocen moléculas estructuralmente conservadas procedentes de microbios. Una vez que estos microbios han traspasado barreras físicas como la piel o la mucosa del tubo digestivo, se reconocen por los TLR, que activan las respuestas de las células inmunitarias. Estos receptores reconocen moléculas tales como moléculas asociadas a patógenos, que se cree que son fundamentales para la función del patógeno y difíciles de cambiar a través de la mutación. Pueden incluir lipopolisacáridos (LPS) de la superficie celular bacteriana, lipoproteínas, lipopéptidos y lipoarabinomanano; proteínas tales como flagelina de flagelos bacterianos; ARN bicatenario de virus; o las islas CpG no metiladas de ADN bacteriano y vírico; y también de las islas CpG que se encuentran en los promotores del a Dn eucariota; así como determinadas otras moléculas de ARN y ADN. Para la mayoría de los TLR, la especificidad de reconocimiento de ligandos se ha establecido ahora mediante la selección de genes.
Se ha estimado que la mayoría de las especies de mamíferos tienen entre diez y quince tipos de receptores de tipo Toll. Se han identificado trece TLR (llamados simplemente TLR1 a TLR13) en seres humanos y ratones juntos (trece en ratones y diez en seres humanos).
El término "ligando" pretende significar una sustancia que forma un complejo con una biomolécula para cumplir un propósito biológico. En el contexto de un ligando de TLR, es una molécula que desencadena señales, uniéndose a un sitio en un TLR diana. Cuando un ligando se une a su receptor afín, puede alterar la conformación química del receptor. El estado conformacional de una proteína receptora determina su estado funcional.
Por lo tanto, un ligando de TLR de acuerdo con la presente invención (tal como se define en el presente documento) es una molécula que se une a al menos uno, o uno o más, receptor de tipo toll (TLR) y da como resultado la activación del TLR, por ejemplo, la activación de la señalización celular mediada por TLR.
La señalización de TLR se divide en dos vías de señalización distintas, la vía dependiente de MyD88 y la dependiente de TRIF. Un ligando de TLR de acuerdo con la invención activa una o ambas de estas dos rutas. Por lo tanto, un ligando de acuerdo con la presente invención (como se define en el presente documento) es una molécula que se une a uno o más TLR y da como resultado la activación del TLR, por ejemplo, la activación de la señalización de TLR a través de un cambio conformacional del receptor al unirse al ligando.
La respuesta dependiente de MyD88 ocurre en la dimerización del receptor TLR y se utiliza por todos los TLR excepto TLR3, Su efecto principal es la activación de NFkB y de la proteína cinasa activada por mitógenos. La unión del ligando y el cambio conformacional que ocurre en el receptor recluta la proteína adaptadora MyD88, un miembro de la familia TIR. Después, MyD88 recluta a IRAK 4, IRAKI e IRAK2. Después, las cinasas IRAK fosforilan y activan la proteína TRAF6, que a su vez poliubiquina la proteína TAK1, así como a sí misma para facilitar la unión a<i>K<k>U. Al unirse, TAK1 fosforila IKKI3, que a su vez fosforila IkB lo que provoca su degradación y permite que NFkB se difunda en el núcleo celular y active la transcripción y la posterior inducción de citocinas inflamatorias.
La otra vía es la vía dependiente de TRIF, que se utiliza tanto por TLR3 como por TLR4. Para el TLR3, el ARNbc (o similar - véase más abajo) provoca la activación del receptor, reclutando al adaptador TRIF. TRIF activa las cinasas TBK1 y RIP1, lo que crea una ramificación en la vía de señalización. El complejo de señalización TRIF/TBK1 fosforila IRF3 lo que permite su translocación al núcleo y la producción de interferón de tipo I. Mientras tanto, la activación de RIP1 provoca la poliubiquinación y la activación de la transcripción de TAK1 y NFkB de la misma manera que la vía dependiente de MyD88.
Los métodos convencionales para determinar la activación de la señalización de los TLR se conocen en la materia, por ejemplo, la determinación del estado de fosforilación de proteínas de señalización adecuadas. Como alternativa, se puede determinar si un ligando actúa a través de un TLR mediante métodos bien conocidos en la materia, por ejemplo, mediante la eliminación genética del gen que codifica el TLR específico y la determinación de si se mantiene el efecto del ligando. Este método se puede utilizar tanto in vitro como in vivo en ratones transgénicos con genes inactivados, que están disponibles comercialmente (los inactivados TLR2, 3 y 4 están disponibles en The Jackson Laboratory y los inactivados TLR 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 9 de OrientalBioService Inc). Además, las células HEK-Blue™ (Invivogen, San Diego, CA, EE. UU.) están disponibles y están diseñadas para estudiar la estimulación de los TLR mediante el ensayo de la activación de NF-kB/a P i . Dichas células están disponibles para los TLR 2 a 9 y 13. Asimismo, los antagonistas de TLR, tales como los disponibles de Invivogen, se pueden utilizar para determinar si el antagonismo del TLR inhibe la acción de un posible ligando. Por lo tanto, los métodos para determinar si una molécula es un ligando de TLR, por ejemplo, un ligando de TLR específico, son bien conocidos en la materia.
La estructura de un TLR consiste en un ectodominio de repetición rica en leucina (LRR, del inglés leucine-rich repeat), un dominio transmembrana helicoidal y un dominio de señalización intracelular de homología del receptor Toll/IL-1 (TIR). El ectodominio contiene un número variable de LRR y se asemeja a un solenoide doblado en forma de herradura. En ambos extremos hay una LRR terminal que protege el núcleo hidrófobo de la herradura. Estos ectodominios son muy variables. Están directamente implicados en el reconocimiento de una variedad de motivos asociados a patógenos, incluidos lipopolisacáridos, lipopéptidos, ADN de citosina-fosfato-guanina (CpG), flagelina, imidazoquinolina y ARNbc/mc. Tras la activación del receptor, se forma un complejo de señalización TIR entre los dominios TIR del receptor y del adaptador.
Los receptores TLR 7, 8 y 9 son una familia con una secuencia de aminoácidos más larga que otros TLR. Están localizados intracelularmente y señalizan en respuesta a ácidos nucleicos no propios. También contienen un segmento irregular entre su LRR14 y 15.
Las secuencias de los receptores TLR son conocidas y se puede evaluar la unión a esos receptores por los ligandos descritos en el presente documento, por ejemplo, como se describe anteriormente. A modo de ejemplo, las secuencias de aminoácidos de TLR conocidas se muestran en la tabla 1 a continuación.
Tabla 1
La presente invención se refiere a los siguientes ligandos de TLR:
v) un ligando de TLR2 que es un lipopolisacárido;
vi) un ligando de TLR3 que es poli(I:C);
vii) un ligando de TLR4 que es un lipopolisacárido o un monofosforil lípido A (MPLA);
viii) un ligando de TLR7 que es
(a) un compuesto de imidazoquinolina de fórmula (1) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
en donde:
R1 es N-CH2-C(CHa)2-Ra;
R2 es -CH2-X-CH2CH3 o un átomo de hidrógeno;
R3 es OH o un átomo de hidrógeno, y X es O o NH; o
(b) ssPoliU;
v) un ligando de TLR8 que es ssPoliU; y
vi) un ligando de TLR9 que es un oligonucleótido CpG que es un oligonucleótido monocatenario de 6 a 50 bases que incluye al menos un motivo CpG y al menos una base que flanquea dicho motivo en cada uno de los lados 3' y 5'.
Estos ligandos y sus receptores se describen con más detalle a continuación.
TLR2 es un receptor de la superficie celular que se estimula por una amplia gama de moléculas microbianas que representan amplios grupos de especies de bacterias grampositivas y gramnegativas, así como micoplasma y levaduras. TLR2 reconoce componentes de la pared celular, tales como peptidoglucanos, ácido lipoteicoico y lipoproteínas de bacterias grampositivas, lipoarabinomanano de micobacterias y zimosano de la pared celular de levaduras. La bleomicina estimula el TLR2 (Razonable et al., 2006, Tox. Appl. Pharm., vol. 210(3), p181-189.
Los ligandos de TLR2 incluyen lipoglucanos, tales como lipoarabinomanano y lipomanano de Mycobacterium smegmatis. Los ligandos de TLR2 para su uso de acuerdo con la invención son lipopolisacáridos (LPS) específicos para TLR2 (y son lipoglucanos). Estas moléculas tienen un lípido y un polisacárido unidos por un enlace covalente y se encuentran en el miembro externo de bacterias gramnegativas y actúan como endotoxinas. En una característica preferida, el LPS es de Porphyromonas gingivalis. El LPS consiste en una región de polisacárido que está anclada en la membrana bacteriana externa por una fracción lipídica carbohidratada específica denominada lípido A. El lípido A, también conocido como endotoxina, es responsable de la actividad inmunoestimuladora de los LPS.
La forma más activa del lípido A contiene seis grupos de acilo graso y se encuentra en bacterias patógenas, tales como especies de Escherichia coli y Salmonella.
Los ligandos de TLR2 están disponibles comercialmente en Invivogen.
El TLR3 se encuentra en compartimentos celulares. Los ligandos para TLR3 incluyen moléculas de ARN bicatenario que imitan el ARNbc vírico, por ejemplo, ácido poliadenílico-poliuridílico (Poli(A:U)) o ácido poliinosina-policitidílico (Poli(I:C)).
El ARN bicatenario (ARNbc) es ARN con dos cadenas complementarias, similar al ADN que se encuentra en todas las células. El ARNbc forma el material genético de algunos virus (virus de ARN bicatenario). El ARN bicatenario, tal como el ARN vírico, o el ARNip pueden desencadenar la interferencia del ARN en eucariotas, así como una respuesta de interferón en vertebrados.
El ligando de TLR3 para su uso de acuerdo con la invención es Poli(I:C). El poli(I:C) es un ARN bicatenario no emparejado con una cadena que es un polímero de ácido inosínico y la otra es un polímero de ácido citidílico. Dichas moléculas pueden generarse mediante técnicas bien conocidas. Existen varias fuentes comerciales, por ejemplo, los siguientes pueden adquirirse de Invivogen y formar realizaciones preferidas:
- Poli(I:C) (PME) de peso molecular elevado y tamaño medio de 1,5 a 8 kb, y
- Poli(I:C) (PMB) de peso molecular bajo y tamaño medio de 0,2 a 1 kb.
Las formas de peso molecular tanto elevado como bajo son formas preferidas para su uso de acuerdo con la presente invención.
El TLR4 también se encuentra en la superficie celular y tiene varios tipos de ligandos, incluidos, entre otros, lipopolisacáridos (LPS), varias proteínas de choque térmico, fibrinógeno, fragmentos de sulfato de heparina, fragmentos de ácido hialurónico, níquel y varios fármacos opioides. El ligando de TLR4 para su uso de acuerdo con la invención es LPS o un monofosforil lípido A (MPLA). El LPS puede tener su origen en varias especies bacterianas, por ejemplo, de 0111:B4 o K12 de E. coli, o Salmonella (extraído por una mezcla de fenol-agua), en una característica preferida, el LPS es de E. coli o de Salmonella minnesota, por ejemplo, la cepa R595.
El monofosforil lípido A (MPLA) puede aislarse de bacterias (por ejemplo, R595 de Salmonella minnesota) o puede hacerse de manera sintética. En general, los ligandos de TLR4 están disponibles comercialmente, por ejemplo, de Invivogen.
Los ligandos de TLR7 incluyen los pequeños compuestos sintéticos imidazoquinolina, análogos de bases, tales como análogos de adenina y guanosina (por ejemplo, loxoribina) y bropirimina, y también ARN monocatenario.
Los compuestos de imidazoquinolina son moléculas orgánicas cíclicas dobles, por ejemplo con la fórmula indicada a continuación, en la que los grupos en R<1>y R<2>pueden variar.
El ligando de TLR7 para su uso de acuerdo con la invención es un compuesto de imidazoquinolina con la fórmula 1:
en donde
R1 es N-CH<2>-C(CH<3>)<2>-Ra;
R2 es -CH2-X-CH2CH3 o un átomo de hidrógeno;
R3 es OH o un átomo de hidrógeno y X es O o NH;
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En la materia se conocen ejemplos de dichos compuestos, por ejemplo, resiquimod (o R848) (1-[4-amino-2-(etoximetil)imidazo[4,5-c]quinolin-1-il]-2-metilpropan-2-ol), imiquimod (3-(2-metilpropil)-3,5,8-triazatriciclo[7.4.9.0<2>'<6>]trideca-1(9),2(6),4,7,10,12-hexaen-7-amina) y gardiquimod (R1 es N-c H2-C(CH3)2o H; R2 es -CH2-NH-CH2CH3; 1-[4-amino-2-(etilaminometil)imidazo[4,5-c]quinolin-1-il]-2-metilpropan-2-ol) (todos disponibles de InvivoGen (San Diego CA, EE. UU.)). En una realización preferida, el compuesto se selecciona de resiquimod e imiquimod.
Las sales farmacéuticamente aceptables de estos compuestos también se incluyen en la invención. Las sales adecuadas incluyen, por ejemplo, sales de acetato, bromuro, cloruro, citrato, clorhidrato, maleato, mesilato, nitrato, fosfato, sulfato, tartrato, oleato, estearato, tosilato, calcio, meglumina, potasio y sodio.
Los ligandos de TLR7 también pueden ser ARN monocatenario. Como alternativa, el ligando de TLR7 para su uso de acuerdo con la invención es, ssPoliU, en donde preferentemente dicha molécula monocatenaria tiene una longitud de entre 20 y 200 nucleótidos.
Dichas moléculas se pueden generar fácilmente de forma sintética.
Los ligandos de TLR8 son en general compuestos sintéticos pequeños o ARN monocatenario. El ligando de TLR8 para su uso de acuerdo con la invención es una molécula ssPoliU como se describe anteriormente.
Los ligandos de TLR9 incluyen el ADN oligodesoxinucleótido CpG no metilado. El ligando de TLR9 para su uso de acuerdo con la invención es un oligonucleótido CpG que es un oligonucleótido monocatenario de 6 a 50 bases que incluye al menos un motivo CpG y al menos una base que flanquea dicho motivo en cada uno de los lados 3' y 5'.
Un oligonucleótido "CpG" (u ODN CpG) es un ejemplo de dicho ligando, y es una molécula de ADN sintético monocatenario corto que resulta de la unión de un desoxinucleótido trifosfato de citosina ("C)" a un desoxinucleótido trifosfato de guanina ("G"). La "p" se refiere al enlace fosfodiéster entre nucleótidos consecutivos, aunque algunos ODN tienen una cadena principal de fosforotioato (PS) modificada en su lugar. Tal como se menciona en el presente documento, los nucleótidos CpG se denominan motivo CpG. El motivo CpG no está metilado. Las secuencias que contienen motivos CpG se consideran patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP, del inglés pathogenassociated molecularpatterns) debido a su abundancia en los genomas microbianos, pero su rareza en los genomas de vertebrados. El PAMP con CpG es reconocido por el receptor de reconocimiento de patrones (PRR, del inglés pattern recognition receptor) receptor 9 de tipo Toll (TLR9). El TLR9 reconoce secuencias específicas de oligonucleótidos (ODN) CpG no metilados que distinguen el ADN microbiano del ADN de mamíferos.
Se han descrito tres tipos principales de ODN estimulantes: tipo A, B y C. Los ODN CpG de tipo A se construyen a partir de una cadena principal mixta de fosfodiéster/fosforotioato y contienen uno o más motivos CpG como parte de una secuencia palindrómica. Los ODN CpG de tipo A tienen colas poli G en los extremos 3' y 5' (un motivo estructural que facilita la formación de concatémeros). Normalmente, los ODN CpG de tipo A contienen de 7 a 10 bases modificadas con fosforotioato en uno o ambos extremos que resisten la degradación por nucleasas y aumentan la estabilidad del ODN. Por ejemplo, la secuencia palindrómica interna puede tener de 8 a 16 pares de bases de longitud (preferentemente 10, 12 o 14) y varía en el orden de las bases, sin embargo, se prefiere el patrón, 5'-Pu Pu CG Pu : Py CG Py Py-3', en donde las bases Pu y Py equidistantes del centro del palíndromo marcadas con ":" son complementarias. La cola poli G que se encuentra en cualquier extremo de la cadena de ADN puede variar en longitud.
Los ODN CpG de tipo B pueden tener una o más secuencias consenso 6mero que contienen el motivo CpG. Una secuencia consenso humana puede contener la secuencia 5'-Pu Py C G Py Pu-3'. (Las secuencias de ratón pueden ser diferentes). Los ODN CpG de tipo B tienen una cadena principal completamente fosforotioada (modificada con PS) y en general tienen una longitud de 18 a 28 nucleótidos (por ejemplo, 18 a 22). Un ejemplo de un ODN CpG de tipo B es el ODN 1826 que tiene la secuencia 5'-tccatgacgttcctgacgtt-3'.
Los ODN CpG de tipo C combinan características de los tipos A y B. Los ODN CpG de tipo C están compuestos completamente por nucleótidos de fosforotioato y contienen secuencias palindrómicas que contienen uno o más motivos CpG. Un ejemplo de un ODN CpG de tipo C es ODN 2395 que tiene la secuencia 5'-tcgtcqttttcgqcqc:qcgccg-3' (palíndromo subrayado).
Además, también se pueden utilizar los ODN CpG de tipo P que contienen dos secuencias palindrómicas, lo que les permite formar estructuras de orden superior.
Los oligonucleótidos CpG se pueden sintetizar mediante métodos convencionales de síntesis de oligonucleótidos que se conocen en la materia.
Por lo tanto, los oligonucleótidos CpG de la invención se extienden a un oligonucleótido monocatenario de 6 a 50 bases, preferentemente de 18 a 27, preferentemente de 20 a 25 bases, que incluyen al menos un motivo CpG y al menos una base flanqueando dicho motivo en cada uno de los lados 3' y 5', en donde dicho motivo CpG es una citosina seguida de una guanina unida por un enlace fosfato o fosforotioato en el que el anillo de pirimidina de la citosina no está metilado. En una realización, uno o más motivos están flanqueados por secuencias, que junto con uno o más motivos, proporcionan una secuencia palindrómica. Como se denomina en el presente documento, una "secuencia palindrómica" proporciona una secuencia directa unida a la secuencia complementaria en sentido inverso, de modo que la secuencia puede formar una horquilla, por ejemplo, cggcgc:gcgccg (en el que el centro del palíndromo está marcado con ":"). El motivo CpG puede formar el centro de la secuencia y/o estar en otra parte de la secuencia palindrómica. Preferentemente, la secuencia palindrómica (que incluye tanto la secuencia directa como la inversa) es de 8 a 16, preferentemente de 10 a 12 o de 10 a 14, bases de longitud.
En otro aspecto preferido, la secuencia de oligonucleótidos CpG contiene la secuencia palindrómica
5'-Pu Pu CG Pu:Py CG Py Py-3', en donde las bases Pu y Py equidistantes del centro del palíndromo marcadas con ":" son complementarias, y/o una o más de las secuencias consenso 5'-Pu Py CG Py Pu-3'. Opcionalmente, el oligonucleótido CpG puede contener colas poli G en los extremos 3' o 5' de 3 a 8 bases de longitud.
En una realización preferida de la presente invención, el oligonucleótido CpG es un ODN CpG de tipo C, de 18 a 27 bases con una secuencia palindrómica de 10 a 14 bases y una cadena principal de fosforotioato. Particularmente preferido es el ODN 2395 que tiene la secuencia:
5'-tcqtcgttttcggcgc:gcgccg-3' (secuencia palindrómica subrayada).
En una realización preferida alternativa de la presente invención, el oligonucleótido CpG es un ODN CpG de tipo B, de 18 a 22 bases y una cadena principal de fosforotioato. Particularmente preferido es el ODN 1826 que tiene la secuencia:
5'-tccatgacgttcctgacgtt-3'.
Como se utiliza en el presente documento, "que expresa" o "que presenta" se refiere a la presencia del péptido antigénico o de una parte del mismo en la superficie de dicha célula de tal forma que al menos una porción de esa molécula queda expuesta y accesible al entorno que rodea la célula, preferentemente de modo que se pueda generar una respuesta inmunitaria a la molécula o parte de la misma presentada. Puede lograrse la expresión en la "superficie" en la que la molécula que se va a expresar está en contacto con la membrana celular y/o los componentes que pueden estar presentes o que provocan estar presentes en esa membrana.
El término "célula" se usa en el presente documento para incluir todas las células eucariotas (que incluyen células de insecto y células fúngicas). Por lo tanto, las "células" representativas incluyen todos los tipos de células de animales mamíferos y no mamíferos, células vegetales, células de insecto, células fúngicas y protozoos. Preferentemente, sin embargo, las células son mamíferas, por ejemplo, células de gatos, perros, caballos, burros, ovejas, cerdos, cabras, vacas, ratones, ratas, conejos, cobayas, pero mucho más preferentemente de seres humanos. La célula que se somete a los métodos, usos, etc. de la invención puede ser cualquier célula que sea capaz de expresar o presentar en su superficie una molécula que se administra o transporta a su citosol.
La célula es convenientemente una célula inmunitaria, es decir, una célula implicada en la respuesta inmunitaria. Sin embargo, otras células también pueden presentar antígeno para el sistema inmunitario y estas también están dentro del alcance de la invención. Por lo tanto, las células de acuerdo con la presente invención son de manera ventajosa células presentadoras de antígeno como se describe más adelante en el presente documento. La célula presentadora de antígeno puede estar implicada en cualquier aspecto o "parte" de la respuesta inmunitaria.
La estimulación de células citotóxicas requiere que los antígenos se presenten en la célula a estimular de manera particular por las células presentadoras de antígeno, por ejemplo, la presentación mediante el MHC de clase I (por ejemplo, la activación de linfocitos T citotóxicos CD8+ requiere la presentación del antígeno mediante el MHC-1). Las células productoras de anticuerpos también pueden estimularse mediante la presentación de antígenos por parte de las células presentadoras de antígenos.
Los antígenos pueden absorberse por las células presentadoras de antígeno mediante endocitosis y degradarse en las vesículas endocíticas en los péptidos. Estos péptidos se pueden unir a las moléculas del MHC de clase II en los endosomas y transportarse a la superficie celular donde el complejo péptido-MHC de clase II puede ser reconocido por los linfocitos T auxiliares CD4+ e inducir una respuesta inmunitaria. Como alternativa, las proteínas en el citosol pueden degradarse, por ejemplo, por proteasomas y transportarse al retículo endoplasmático mediante TAP (transportador asociado a la presentación de antígenos) donde los péptidos se pueden unir a moléculas del MHC de clase I y transportarse a la superficie celular (Yewdell y Bennink, 1992, Adv. Immunol. 52: 1-123). Si el péptido es de origen antigénico extraño, el complejo péptido-MHC de clase I será reconocido por los linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8+. Los CTL se unirán al complejo péptido-MHC (HLA) de clase I y, por lo tanto, se activarán, comenzarán a proliferar y formarán un clon de CTL.
La célula diana y otras células diana con el mismo complejo péptido-MHC de clase I en la superficie de las células pueden ser destruidas por el clon de CTL. La inmunidad contra el antígeno extraño se puede establecer si se puede introducir una cantidad suficiente del antígeno en el citosol (Yewdell y Bennink, 1992, citado anteriormente; Rock, 1996, Immunology Today 17: 131-137). Esta es la base para el desarrollo de, entre otras cosas, vacunas contra el cáncer. Uno de los mayores problemas prácticos es introducir cantidades suficientes de antígenos (o partes del antígeno) en el citosol. Esto puede resolverse de acuerdo con la presente invención.
Como se ha mencionado anteriormente, una vez liberado en el citosol celular por el proceso de internalización fotoquímica, el péptido antigénico se puede procesar por la maquinaria de procesamiento de antígenos de la célula y presentarse en la superficie celular de una manera adecuada, por ejemplo, mediante el MHC de clase I. Este procesamiento puede implicar la degradación del antígeno, por ejemplo, la degradación de un antígeno proteico o polipeptídico en péptidos, que luego forman complejos con moléculas del MHC para su presentación. Por lo tanto, la molécula antigénica expresada o presentada en la superficie de la célula de acuerdo con la presente invención puede ser una parte o fragmento del péptido antigénico que se internaliza (por endocitosis).
Una variedad de diferentes tipos de células pueden presentar antígenos en su superficie, incluidos, por ejemplo, linfocitos (tanto linfocitos T como B), células dendríticas, macrófagos, etc. Otras incluyen, por ejemplo, células cancerosas, por ejemplo, células de melanoma. Estas células se denominan en el presente documento "células presentadoras de antígenos". Las "células presentadoras de antígenos profesionales", que son células del sistema inmunitario implicadas principalmente en la presentación de antígenos a las células efectoras del sistema inmunitario, se conocen en la materia y se describen en la bibliografía e incluyen linfocitos B, células dendríticas y macrófagos. Preferentemente, la célula es una célula presentadora de antígenos profesional.
Para la presentación de antígenos por una célula presentadora de antígenos a un linfocito T citotóxico (CTL, del inglés cytotoxic T-cell), el péptido antigénico necesita entrar en el citosol de la célula presentadora de antígenos (Germain, Cell, 1994, 76, 287-299).
En realizaciones de la invención, por ejemplo, que implican un método in vitro o ex vivo, o de manera alternativa un uso in vivo, la célula es una célula dendrítica. Las células dendríticas son células inmunitarias que forman parte del sistema inmunitario de los mamíferos. Su función principal es procesar el material antigénico y presentarlo en la superficie a otras células del sistema inmunitario. Una vez activadas, migran a los ganglios linfáticos donde interactúan con los linfocitos T y los linfocitos B para iniciar la respuesta inmunitaria adaptativa.
Las células dendríticas proceden de células progenitoras hematopoyéticas de la médula ósea. Estas células progenitoras se transforman inicialmente en células dendríticas inmaduras que se caracterizan por una actividad endocítica elevada y un potencial de activación de linfocitos T bajo. Una vez que han entrado en contacto con un antígeno presentable, se activan en células dendríticas maduras y comienzan a migrar al ganglio linfático. Las células dendríticas inmaduras fagocitan patógenos y degradan sus proteínas en pequeños fragmentos y, al madurar, presentan esos fragmentos en su superficie celular utilizando moléculas del MHC.
Las células dendríticas pueden proceder de cualquier fuente adecuada de células dendríticas, tales como de la piel, revestimiento interior de la nariz, pulmones, estómago e intestinos o la sangre. En una realización particularmente preferida de la presente invención, las células dendríticas proceden de la médula ósea.
Las células dendríticas pueden aislarse de fuentes naturales para su uso en métodos in vitro de la invención o pueden generarse in vitro. Las células dendríticas surgen de los monocitos, es decir, de los glóbulos blancos que circulan en el cuerpo y, dependiendo de la señal correcta, pueden diferenciarse en células dendríticas o macrófagos. Los monocitos, a su vez, se forman a partir de células madre en la médula ósea. Se pueden generar células dendríticas procedentes de monocitos in vitro a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC, del inglés peripheral blood mononuclear cells). La siembra de PBMC en un matraz de cultivo de tejidos permite la adherencia de los monocitos. El tratamiento de estos monocitos con interleucina 4 (IL-4) y factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF, del inglés granulocyte-macrophage colony stimulating factor) conduce a la diferenciación a células dendríticas inmaduras (iDC, del inglés immature dendritic cells) en aproximadamente una semana. El tratamiento posterior con factor de necrosis tumoral (TNF, del inglés tumor necrosis factor) diferencia aún más las iDC en células dendríticas maduras.
Como se utiliza en el presente documento, "poner en contacto" se refiere a poner en contacto físico entre sí las células y el agente fotosensibilizante y/o el péptido antigénico y/o el ligando de TLR como se define en el presente documento en condiciones adecuadas para la internalización en las células, por ejemplo, preferentemente a 37 °C en un medio nutricional adecuado, por ejemplo, de 25 a 39 °C o in vivo a temperatura corporal, es decir, 36 a 38 °C.
La célula se puede poner en contacto con el agente fotosensibilizante y el péptido antigénico y el ligando de TLR como se define en el presente documento de forma secuencial o simultánea. Preferentemente y convenientemente, los componentes se ponen en contacto con la célula de forma simultánea. El agente fotosensibilizante y el péptido antigénico (y opcionalmente el ligando de TLR) se pueden absorber por la célula en el mismo o en diferentes compartimentos intracelulares (por ejemplo, pueden translocarse conjuntamente).
A continuación, las células se exponen a luz de longitudes de onda adecuadas para activar el compuesto fotosensibilizante que, a su vez, conduce a la rotura de las membranas del compartimento intracelular.
El documento WO 02/44396 describe un método en el que el orden de las etapas del método puede organizarse de modo que, por ejemplo, el agente fotosensibilizante se ponga en contacto con las células y se active por irradiación antes de que la molécula que se va a internalizar (en este caso, el péptido antigénico) se ponga en contacto con las células. Este método aprovecha el hecho de que no es necesario que la molécula esté internalizada para estar presente en el mismo subcompartimento celular que el agente fotosensibilizante en el momento de la irradiación.
Por tanto, en una realización, dicho agente fotosensibilizante y/o dicho péptido antigénico y/o el ligando de TLR como se define en el presente documento se aplican a la célula juntos o por separado entre sí. A continuación, la irradiación se realiza en un momento en el que al menos el agente fotosensibilizante y el péptido antigénico aparecen en el mismo compartimento intracelular. Esto se conoce como un método de "luz posterior".
En una realización alternativa, dicho método se puede realizar poniendo en contacto dicha célula con el agente fotosensibilizante primero, seguido de la puesta en contacto con el péptido antigénico y/o el ligando de TLR como se define en el presente documento, y la irradiación se realiza después de la absorción del agente fotosensibilizante en un compartimento intracelular, pero antes de la absorción celular del péptido antigénico (y opcionalmente del ligando de TLR) en un compartimento intracelular que contiene dicho agente fotosensibilizante (por ejemplo, puede estar presente en un compartimento intracelular diferente en el momento de la exposición a la luz), preferentemente antes de la absorción celular en cualquier compartimento intracelular, por ejemplo, antes de cualquier absorción celular. Por lo tanto, por ejemplo, el agente fotosensibilizante puede administrarse seguido de irradiación y después la administración de los agentes restantes. Este es el llamado método de "luz anterior".
"Internalización", como se utiliza en el presente documento, se refiere a la administración intracelular, por ejemplo, citosólica, de moléculas. En el presente caso, la "internalización" puede incluir la etapa de liberación de moléculas desde los compartimentos intracelulares/unidos a la membrana al citosol de las células.
Tal como se utiliza en el presente documento, "absorción celular" o "translocación" se refiere a uno de las etapas de internalización en el que las moléculas externas a la membrana celular se introducen en la célula de modo que se encuentran en el interior de la membrana celular externa, por ejemplo, por endocitosis u otros mecanismos de absorción adecuados, por ejemplo, dentro o asociado con compartimentos intracelulares restringidos por la membrana, por ejemplo, el retículo endoplásmico, aparato de Golgi, lisosomas, endosomas, etc.
La etapa de poner en contacto las células con los diversos agentes puede llevarse a cabo de cualquier manera conveniente o deseada. Por lo tanto, si se va a realizar la etapa de poner en contacto in vitro, las células pueden mantenerse convenientemente en un medio acuoso, tal como, por ejemplo, un medio de cultivo celular adecuado, y en el momento apropiado, los diversos agentes pueden simplemente añadirse al medio en condiciones adecuadas, por ejemplo, a una concentración adecuada y durante un período de tiempo adecuado. Por ejemplo, las células pueden ponerse en contacto con los agentes en presencia de un medio sin suero o de un medio que contiene suero.
Los comentarios a continuación indican la aplicación de los diversos agentes a las células por separado. Sin embargo, como se indicó anteriormente, estos agentes pueden aplicarse a las células juntos, por separado, de manera simultánea o secuencial. Tal como se cita en el presente documento, la aplicación de los diversos agentes utilizados en los métodos de la invención puede ser a las células in vitro. Los diversos agentes también se pueden utilizar in vivo. A este respecto, la invención proporciona un péptido antigénico, un agente fotosensibilizante y un ligando de TLR (todos como se definen en el presente documento); o una composición que comprende esos agentes y uno o más diluyentes, vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables, para su uso en profilaxis, terapia y/o estimulación de una respuesta inmunitaria en un sujeto, preferentemente para tratar o prevenir una enfermedad, trastorno o infección en dicho sujeto. En los usos in vivo, la aplicación puede ser vía administración directa (es decir, localizada) o indirecta (es decir, sistémica o no localizada) como se describe con más detalle a continuación en el presente documento.
El agente fotosensibilizante se pone en contacto con las células a una concentración adecuada y durante un período de tiempo adecuado que se puede determinar fácilmente por un experto utilizando técnicas de rutina, y dependerá de factores tales como el agente fotosensibilizante particular utilizado, y del tipo y la localización de la célula diana. La concentración del agente fotosensibilizante es convenientemente tal que, una vez absorbido por la célula, por ejemplo, en uno o más de sus compartimentos intracelulares asociados, o asociado a ellos, y activado por irradiación, una o más estructuras celulares se rompen, por ejemplo, uno o más compartimentos intracelulares se lisan o se rompen. Por ejemplo, los agentes fotosensibilizantes, como se describe en el presente documento, se pueden utilizar a una concentración de, por ejemplo, 10 a 50 pg/ml.
Para su uso in vitro, el intervalo puede ser mucho más amplio, por ejemplo, de 0,0005 a 500 pg/ml. Para tratamientos in vivo en seres humanos, el agente fotosensibilizante se puede utilizar en el intervalo de 0,05 a 20 mg/kg de peso corporal cuando se administra sistémicamente. Como alternativa, se puede utilizar un intervalo de 0,005 a 20 mg/kg de peso corporal para la administración sistémica. De manera más conveniente, el agente fotosensibilizante debe administrarse localmente, por ejemplo, mediante administración intradérmica, subcutánea o intratumoral, y en ese caso la dosis puede estar en el intervalo de 1 a 5000 pg, por ejemplo, de 10 a 2500, de 25 a 1000, de 50 a 500, de 10 a 300 o de 100 a 300 pg. Preferentemente, la dosis se selecciona de 100 pg, 150 pg, 200 pg y 250 pg. Preferentemente, la dosis es de 75 a 125 pg, por ejemplo, 100 pg. Las dosis proporcionadas son para un ser humano de peso promedio (es decir, 70 kg). Para inyección intradérmica, la dosis del fotosensibilizador puede disolverse en 100 pl a 1 ml, es decir, la concentración puede estar en el intervalo de 1 a 50000 pg/ml. En animales más pequeños, el intervalo de concentración puede ser diferente y se puede ajustar en consecuencia, aunque cuando se administra localmente, se necesita poca variación en la dosificación para diferentes animales.
La concentración de antígeno a utilizar dependerá del antígeno que se vaya a utilizar. De manera conveniente, puede utilizarse una concentración de antígeno in vitro de 0,001 a 500 pg/ml (por ejemplo, de 20 a 500, de 20 a 300, de 20 a 100 pg/ml, de 20 a 50, de 10 a 50, de 5 a 50, de 1 a 50, de 0,01 a 50 o de 0,001 a 50 pg/ml). Para un antígeno peptídico, puede utilizarse una concentración más baja, por ejemplo, de 0,001 a 500, por ejemplo, de 0,001 a 1, 5, 25, 50 o 100 pg/ml. Para un antígeno proteico, puede utilizarse una concentración más elevada, por ejemplo, de 0,5 a 500 pg/ml. Para un uso in vivo, la dosis de antígeno proteico puede estar en el intervalo de 0,5 a 500 pg, por ejemplo, de 10 a 100 pg o de 10 a 200 pg. Para antígenos peptídicos, puede emplearse una dosis in vivo de 0,1 a 4000 pg, por ejemplo, de 0,1 a 2000 pg, de 0,1 a 1000 pg o de 0,1 a 500 pg, por ejemplo, de 0,1 a 100 pg. Dichas dosis son adecuadas para la administración local. Se puede determinar una concentración adecuada dependiendo de la eficacia de absorción del agente en cuestión en las células en cuestión y la concentración final que se desea lograr en las células.
La concentración del ligando de TLR, como se define en el presente documento, también dependerá de la molécula particular que se va a utilizar, y el experto en la materia conocerá las concentraciones o dosis adecuadas. Ejemplos de concentraciones o dosis in vitro e in vivo adecuadas se muestran en la tabla 2 a continuación.
Tabla 2
continuación
Por lo tanto, por ejemplo, de manera conveniente, se puede utilizar in vitrouna concentración de 1 a 100 |jg/ml (por ejemplo, de 20 a 100 jg/m l o de 20 a 50 jg/ml). Se pueden utilizar in vivo dosis de 10 a 1000 jg del compuesto de imidazoquinolina, por ejemplo, se pueden emplear de 20 a 100 jg en un ratón y en seres humanos de 10 jg a 10 mg. Para la administración tópica de, por ejemplo, imiquimod en seres humanos, se puede utilizar una dosis de 2,5 a 50 mg, por ejemplo, de 1 a 5 mg/cm2, por ejemplo, 2,5 mg/cm2 Para resiquimod, la dosis puede ser de 0,1 a 50 mg, por ejemplo, de 1 a 5 mg, por ejemplo, de 1 a 5 mg/cm2. Una dosis similar es adecuada para gardiquimod. Para la inyección intradérmica del compuesto de imidazoquinolina se puede utilizar una dosis más pequeña, por ejemplo, se podría utilizar al menos 10 jg o 50 jg , por ejemplo, de 10 jg a 1 mg. Pueden utilizarse dosis similares para el oligonucleótido CpG y otros ligandos de TLR. Se puede administrar poli(IC) a una dosis in vivo de 1 a 100 jg en ratones y de 1 jg a 10 mg en seres humanos.
En la mayoría de los casos, el agente fotosensibilizante, el péptido antigénico y el ligando de TLR como se define en el presente documento se administran juntos, pero esto puede variar. Por lo tanto, se contemplan diferentes tiempos o modos o sitios de administración (o de puesta en contacto con la célula) para cada uno de los diferentes componentes, y dichos métodos y usos se incluyen en el alcance de la invención.
En una realización, el ligando de TLR, por ejemplo, un oligonucleótido CpG o un compuesto de imidazoquinolina, un LPS o una molécula poli(IC) como se define en el presente documento, debe administrarse por separado del antígeno, por ejemplo, en una formulación separada, por ejemplo, una crema o gel, o de manera sistémica, por ejemplo, por vía oral (por ejemplo, con resiquimod). Por lo tanto, en una realización, el ligando de TLR, por ejemplo, un oligonucleótido CpG o un compuesto de imidazoquinolina, se debe administrar antes de la administración del antígeno y/o fotosensibilizador, por ejemplo, 24 horas antes, por ejemplo, por pretratamiento local (tópico). En algunos casos, el ligando de TLR, por ejemplo, Poli(IC) o LPS debe administrarse antes, con o después del antígeno.
El ligando de TLR se puede administrar por separado en relación con los otros agentes, por ejemplo, aproximadamente 2 horas antes de la iluminación. En una realización alternativa, el agente se puede administrar con el antígeno o al mismo tiempo, es decir, simultáneamente.
El contacto entre la célula y el agente fotosensibilizante y/o el péptido antigénico y/o el ligando de TLR como se define en el presente documento es convenientemente de 15 minutos a 24 horas, por ejemplo, de 30 minutos a cuatro horas, preferentemente de 1,5 a 2,5 horas. Como alternativa, el intervalo de tiempo puede ser de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 48 horas, por ejemplo, de aproximadamente 2 horas a aproximadamente 40 horas o de aproximadamente 6 horas a aproximadamente 36 horas, por ejemplo, de 12 horas a 30 horas, por ejemplo, de 16 horas a 20 horas, por ejemplo, 18 horas o aproximadamente 18 horas.
En una realización preferida, la incubación inicial de la célula es con el agente fotosensibilizante. En una realización, el tiempo entre la administración del agente fotosensibilizante y el péptido antigénico y/o el ligando de TLR es cuestión de horas. Por ejemplo, el agente fotosensibilizante se puede aplicar de 16 a 20 horas, por ejemplo, 18 horas, antes de la iluminación, y el péptido antigénico y/o el ligando de TLR pueden aplicarse de 1 a 3 horas, por ejemplo, 2 horas, antes de la iluminación. Por lo tanto, el tiempo entre la administración del agente fotosensibilizante y el péptido antigénico y/o el ligando de TLR puede estar en el intervalo de 15 a 23 horas.
Por lo tanto, la célula se incuba a continuación con el antígeno y/o el ligando de TLR como se define en el presente documento después de la incubación con el fotosensibilizador. De manera conveniente, las células pueden colocarse en un medio libre de fotosensibilizador/antígeno después del contacto con el fotosensibilizador/antígeno y antes de la irradiación, por ejemplo, durante 30 minutos a 4 horas, por ejemplo, de 1,5 a 2,5 horas, dependiendo del momento de la incubación con el fotosensibilizador y el péptido antigénico y el ligando de TLR.
Un uso y el tiempo de incubación in vivo adecuados mediante los cuales los diversos agentes se ponen en contacto con las células diana dependerán de factores tales como el modo de administración y el tipo de agentes que se utilizan. Por ejemplo, si los agentes se van a inyectar en un tumor, tejido u órgano que se va a tratar/irradiar, las células cercanas al punto de inyección entrarán en contacto con los agentes y, por lo tanto, tenderán a absorberlos más rápidamente que las células ubicadas a una distancia mayor del punto de inyección, que es probable que entren en contacto con los agentes en un momento posterior y en una concentración más baja. De manera conveniente, puede utilizarse un tiempo de 6 a 24 horas.
Además, los agentes que se administran mediante inyección intravenosa o administración oral pueden tardar algún tiempo en llegar a las células diana y, por lo tanto, pueden tardar más tiempo después de la administración, por ejemplo, varios días, para que una cantidad suficiente u óptima de los agentes se acumule en una célula o tejido diana. El tiempo de administración necesario para células individuales in vivo es probable, por lo tanto, que varíe dependiendo de estos y otros parámetros.
No obstante, aunque la situación in vivo es más complicada que in vitro, el concepto subyacente de la presente invención sigue siendo el mismo, es decir, el momento en que las moléculas entran en contacto con las células diana debe ser tal que antes de que se produzca la irradiación, las células diana hayan absorbido una cantidad adecuada del agente fotosensibilizante y: (i) antes o durante la irradiación, el péptido antigénico (y opcionalmente el ligando de TLR) se ha absorbido o será absorbido después de un contacto suficiente con las células diana, en la célula, por ejemplo, en el mismo o diferentes compartimentos intracelulares en relación con el agente fotosensibilizante o (ii) después de la irradiación, el péptido antigénico (y opcionalmente el ligando de TLR) está en contacto con las células durante un período de tiempo suficiente para permitir su absorción en las células.
Para la administración de los agentes descritos en el presente documento in vivo, puede utilizarse cualquier modo de administración común o convencional en la materia, por ejemplo, inyección, infusión, administración tópica, administración transdérmica, tanto a las superficies corporales internas como externas, etc. Para su uso in vivo, los usos de la invención se puede utilizar en relación con cualquier tejido que contenga células en las que está localizado el agente fotosensibilizante que contiene el compuesto o la molécula a internalizar, incluidas las localizaciones de líquidos corporales, así como los tejidos sólidos. Todos los tejidos se pueden tratar siempre que el fotosensibilizador sea absorbido por las células diana y la luz se pueda administrar adecuadamente. Los modos de administración preferidos son la administración o inyección intradérmica, subcutánea, tópica o intratumoral. Preferentemente, la administración es mediante inyección intradérmica.
Para lograr el resultado deseado, por ejemplo, presentación de antígenos, generación de una respuesta inmunitaria o vacunación, los usos, los métodos o partes de los mismos pueden repetirse, por ejemplo, puede tener lugar una "revacunación". Por lo tanto, el uso o método en su totalidad puede realizarse varias veces (por ejemplo, 2, 3 o más veces) después de un intervalo adecuado, o partes del uso o método pueden repetirse, por ejemplo, administración adicional del ligando de TLR como se define en el presente documento o etapas de irradiación adicionales.
Por ejemplo, el uso, método, o parte del uso o método puede realizarse de nuevo en cuestión de días, por ejemplo, entre 5 y 60 días (por ejemplo, 7, 14, 15, 21, 22, 42 o 51 días), por ejemplo, de 7 a 20 días, preferentemente 14 días, o semanas, por ejemplo, entre 1 y 5 semanas (por ejemplo, 1, 2, 3 o 4 semanas) después de su primera realización. Todo o parte del uso o método puede repetirse múltiples veces en intervalos de tiempo adecuados, por ejemplo, cada dos semanas o 14 días. En una realización preferida, el uso o método se repite al menos una vez. En otra realización, el método se repite dos veces.
En una realización, en la segunda o posterior vez que se lleva a cabo el uso o método, se administra el péptido antigénico en combinación con el fotosensibilizador y la iluminación, es decir, el ligando de TLR no se administra en la segunda o posterior vez que se lleva a cabo el uso o método.
En una realización alternativa, partes del uso o método de la invención pueden llevarse a cabo antes de que se lleve a cabo el uso o método de la invención. Por ejemplo, el uso o método puede llevarse a cabo una o más veces, por ejemplo, dos veces, en ausencia del ligando de TLR antes de llevar a cabo el uso o método de la invención. Como alternativa, el uso o método puede llevarse a cabo una o más veces, por ejemplo, dos veces, en ausencia del fotosensibilizador y la iluminación antes de llevar a cabo el uso o método de la invención. Parte del uso o método puede llevarse a cabo en cuestión de días, por ejemplo, 7 o 14 días, o semanas, por ejemplo, 1, 3 ó 4 semanas antes de llevar a cabo el uso o método de la invención. Parte del uso o método puede repetirse una o más veces en estos intervalos de tiempo antes de que se lleve a cabo el uso o método de la invención. Por lo tanto, en un aspecto preferido, el péptido antigénico debe administrarse (por ejemplo, al sujeto) igual o más de 2 veces (por ejemplo, en los intervalos de tiempo indicados anteriormente), en donde al menos la administración de dicho péptido antigénico se realiza de acuerdo con el uso o método de la invención.
La "irradiación" para activar el agente fotosensibilizante se refiere a la administración de luz directa o indirectamente como se describe en lo sucesivo en el presente documento. Por lo tanto, los sujetos o células pueden iluminarse con una fuente de luz, por ejemplo, directamente (por ejemplo, en células individuales in vitro) o indirectamente, por ejemplo, in vivo cuando las células están debajo de la superficie de la piel o están en forma de una capa de células que no están todas directamente iluminadas, es decir, sin la pantalla de otras células. La iluminación de la célula o del sujeto puede ocurrir aproximadamente de 18 a 24 horas después de la administración del agente fotosensibilizante, péptido antigénico y ligando de TLR como se define en el presente documento.
La etapa de irradiación de la luz para activar el agente fotosensibilizador puede tener lugar de acuerdo con técnicas y procedimientos bien conocidos en la materia. La longitud de onda de la luz a utilizar se selecciona de acuerdo con el agente fotosensibilizante a utilizar. Las fuentes de luz artificial adecuadas son bien conocidas en la materia, por ejemplo, utilizando luz de longitud de onda azul (400 a 475 nm) o roja (620 a 750 nm). Para TPCS<2>a se puede utilizar, por ejemplo, una longitud de onda de entre 400 y 500 nm, más preferentemente entre 400 y 450 nm, por ejemplo, de 430 a 440 nm, y aún más preferentemente aproximadamente 435 nm, o 435 nm. En su caso, el fotosensibilizante, por ejemplo, una porfirina o clorina, se puede activar por luz verde, por ejemplo, el fotosensibilizador KillerRed (Evrogen, Moscú, Rusia) puede activarse con luz verde.
Las fuentes de luz adecuadas son bien conocidas en la materia, por ejemplo, la lámpara LumiSource® de PCI Biotech AS. Como alternativa, se puede utilizar un dispositivo de iluminación basado en LED que tenga una potencia de salida ajustable de hasta 60 mW y un espectro de emisión de 430 a 435 nm. Para luz roja, una fuente de iluminación adecuada es el láser de diodo SN576003 del sistema láser PCI Biotech AS 652 nm, aunque se puede utilizar cualquier fuente de luz roja adecuada.
El tiempo durante el cual las células se exponen a la luz en los usos o métodos de la presente invención puede variar. La eficacia de la internalización de una molécula en el citosol aumenta con una mayor exposición a la luz hasta un máximo más allá del cual aumenta el daño celular y, por lo tanto, la muerte celular.
Un periodo de tiempo preferido para la etapa de irradiación depende de factores tales como la diana, el fotosensibilizante, la cantidad de fotosensibilizador acumulado en las células o tejido diana y la superposición entre el espectro de absorción del fotosensibilizador y el espectro de emisión de la fuente de luz. En general, el periodo de tiempo para la etapa de irradiación es del orden de segundos a minutos o hasta varias horas (incluso hasta 12 horas), por ejemplo, preferentemente hasta 60 minutos, por ejemplo, de 0,25 o 1 a 30 minutos, por ejemplo, de 0,5 a 3 minutos, o de 1 a 5 minutos, o de 1 a 10 minutos, por ejemplo, de 3 a 7 minutos, y preferentemente, aproximadamente 3 minutos, por ejemplo, de 2,5 a 3,5 minutos. También se pueden usar tiempos de irradiación más cortos, por ejemplo, de 1 a 60 segundos, por ejemplo, de 10 a 50, de 20 a 40 o de 25 a 35 segundos.
Las dosis de luz adecuadas se pueden seleccionar por un experto en la materia y de nuevo dependerán del fotosensibilizador utilizado y la cantidad de fotosensibilizador acumulado en las células o tejidos diana. Las dosis de luz suelen ser menores cuando se utilizan fotosensibilizadores con coeficientes de extinción más elevados (por ejemplo, en la zona roja o en la zona azul si se utiliza luz azul, dependiendo del fotosensibilizante utilizado) del espectro visible. Por ejemplo, una dosis de luz en el intervalo de 0,24 a 7,2 J/cm2 en un intervalo de fluencia de 0,05 a 20 mW/cm2, por ejemplo, 2,0 mW/cm2, se puede utilizar cuando se emplea un dispositivo de iluminación basado en LED que tiene una potencia de salida ajustable de hasta 60 mW y un espectro de emisión de 430 a 435 nm. Como alternativa, por ejemplo, si se emplea la lámpara LumiSource®, una dosis de luz en el intervalo de 0,1 a 6 J/cm2 en un intervalo de fluencia de 0,1 a 20 mW/cm2 (por ejemplo, 13 como lo proporciona Lumisource®) es apropiada. Para luz roja, puede utilizarse una dosis de luz de 0,03 a 1 J/cm2, por ejemplo, 0,3 J/cm2, en un intervalo de fluencia de 0,1 a 5 mW/cm2, por ejemplo, 0,81 mW/cm2.
Además, si se quiere mantener la viabilidad celular, se debe evitar la generación de niveles excesivos de especies tóxicas y los parámetros relevantes se pueden ajustar en consecuencia.
Los usos y métodos de la invención pueden dar lugar inevitablemente a algún daño celular en virtud del tratamiento fotoquímico, es decir, por efectos de terapia fotodinámica a través de la generación de especies tóxicas en la activación del agente fotosensibilizante. Dependiendo del uso propuesto, esta muerte celular puede no ser una consecuencia y, de hecho, puede ser ventajosa para algunas aplicaciones (por ejemplo, tratamiento del cáncer). En la mayoría de las realizaciones, sin embargo, se evita la muerte celular para permitir la generación de una respuesta inmunitaria a partir de la célula presentadora. Los usos y métodos de la invención se pueden modificar de tal forma que la fracción o proporción de las células supervivientes se regule mediante la selección de la dosis de luz en relación con la concentración del agente fotosensibilizante. De nuevo, dichas técnicas se conocen en la materia.
Preferentemente, no se destruyen sustancialmente todas las células, o una mayoría significativa (por ejemplo, al menos un 75 %, más preferentemente al menos un 80, 85, 90 o 95 % de las células). La viabilidad celular in vitro después del tratamiento de PCI se puede medir mediante técnicas convencionales conocidas en la materia, tal como la prueba MTS. La muerte celular in vivo de uno o más tipos de células puede evaluarse dentro de un radio de 1 cm del punto de administración (o a determinada profundidad del tejido), por ejemplo, mediante microscopía. Como la muerte celular puede no ocurrir de manera instantánea, el % de muerte celular se refiere al porcentaje de células que permanecen viables a las pocas horas de la irradiación (por ejemplo, hasta 4 horas después de la irradiación), pero preferentemente se refiere al % de células viables 4 o más horas después de la irradiación.
El método se puede realizar in vitro o ex vivo. Preferentemente se utiliza el método in vitro o ex vivo para generar células para la administración in vivo. En la alternativa, los agentes son para su uso en profilaxis, terapia y/o estimulación de una respuesta inmunitaria en un sujeto, como se describe en el presente documento.
En un aspecto preferido, la presente invención proporciona un péptido antigénico, un agente fotosensibilizante y un ligando de TLR; o una composición que comprende esos agentes (todos como se describen en el presente documento) para su uso en profilaxis, terapia y/o estimulación de una respuesta inmunitaria en un sujeto, en donde dicha profilaxis, terapia y/o estimulación de una respuesta inmunitaria comprende la administración a dicho sujeto de dicho péptido antigénico, agente fotosensibilizante y ligando de TLR, e irradiar dicho sujeto con luz de una longitud de onda eficaz para activar dicho agente fotosensibilizante para generar una respuesta inmunitaria, en donde dicho péptido antigénico, agente fotosensibilizante y ligando de TLR deben administrarse a dicho sujeto de manera simultánea, separada o secuencial.
Una "respuesta inmunitaria" que puede generarse puede ser inmunidad humoral y mediada por células, por ejemplo, la estimulación de la producción de anticuerpos, o la estimulación de células citotóxicas o citolíticas, que pueden reconocer y destruir (o eliminar de otra manera) las células que expresan antígenos "extraños" en su superficie. El término "estimular una respuesta inmunitaria" incluye, por tanto, todos los tipos de respuestas inmunitarias y mecanismos para estimularlas y abarca la estimulación de CTL que constituye un aspecto preferido de la invención. Preferentemente, la respuesta inmunitaria que se estimula son los linfocitos T CD8 citotóxicos. El alcance de una respuesta inmunitaria puede evaluarse mediante marcadores de una respuesta inmunitaria, por ejemplo, moléculas secretadas, tales como IL-2 o IFN<y>o la producción de linfocitos T específicos de antígeno (por ejemplo, evaluados como se describe en los ejemplos).
La estimulación de células citotóxicas o de células productoras de anticuerpos requiere que los antígenos se presenten en la célula a estimular de manera particular por las células presentadoras de antígeno, por ejemplo, la presentación mediante el MHC de clase I (por ejemplo, la activación de linfocitos T citotóxicos CD8+ requiere la presentación del antígeno mediante el MHC-I). Preferentemente, la respuesta inmunitaria se estimula a través de la presentación mediante el MHC-I.
Preferentemente, la respuesta inmunitaria se utiliza para tratar o prevenir una enfermedad, trastorno o infección, por ejemplo, cáncer.
En una realización, el cáncer es melanoma. El melanoma es un tumor maligno de los melanocitos, que son las células encargadas de producir melanina, el pigmento oscuro responsable del color de la piel. Estas células se encuentran predominantemente en la piel, pero también se encuentran en otras partes del cuerpo, incluido el intestino y el ojo. El melanoma puede originarse en cualquier parte del cuerpo que contenga melanocitos.
"Melanoma", tal como se hace referencia en el presente documento, incluye todos los tipos de melanoma, incluidos, por ejemplo, melanoma de extensión superficial, melanoma nodular, melanoma sobre lentigo maligno, melanoma desmoplásico, melanoma lentiginoso acral y melanoma amelánico, melanoma polipoide, melanoma con pequeñas células similares a las de un nevus y melanoma con características de un nevus de Spitz.
Mientras que la mayoría de los melanomas ocurren en la piel (melanoma maligno cutáneo), el melanoma también puede ocurrir en otras partes del cuerpo, por ejemplo, en los órganos internos, por ejemplo, en las membranas mucosas. El sarcoma de células claras es un melanoma maligno de los tejidos blandos. El melanoma también puede ocurrir en el ojo (melanoma uveal), la vulva, la vagina o el recto. Estos melanomas también están incluidos en el alcance de la invención. Preferentemente, los melanomas a tratar son melanomas cutáneos. El melanoma también se extiende al melanoma metastásico, es decir, células que se han originado a partir de un melanoma primario pero que han hecho metástasis en una ubicación diferente para producir tumores secundarios. El tratamiento o la prevención del melanoma como se describe en el presente documento se extiende al tratamiento de melanomas primarios y/o tumores secundarios derivados del melanoma primario. Como tal, la invención también tiene utilidad en el tratamiento del melanoma metastásico.
En una realización alternativa, el cáncer está asociado o es provocado/inducido por un virus del papiloma, en particular, un virus del papiloma humano (HPV). Como se ha indicado anteriormente, el genoma del virus del papiloma se divide en una región temprana (E), que codifica seis (E1, E2, E4, E5, E6 y E7) marcos de lectura abiertos (ORF, del inglés open reading frames) que se expresan inmediatamente después de la infección inicial de una célula hospedadora, y una región tardía (L) que codifica una proteína de cápside principal L1 y una proteína de cápside menor<l>2. Todos los ORF víricos están codificados en una cadena de a Dn . El antígeno de HPV que puede utilizarse de acuerdo con la invención, que puede estar asociado con cánceres resultantes de la infección por HPV, puede ser uno o más péptidos antigénicos conocidos o epítopos de linfocitos T como se indica en el presente documento. Como se ha indicado anteriormente, existen varios tipos de HPV, y el cáncer asociado con el HPV de acuerdo con la presente invención puede estar asociado con, o resultar de, cualquier tipo de HPV, por ejemplo HPV-16 y/o HPV-18, o HPV-31 o HPV-45. El antígeno a utilizar de acuerdo con la invención puede proceder de cualquiera de las proteínas E1, E2, E4, E5, E6 o E7, o de cualquiera de las proteínas L1 y L2. Por lo tanto, el péptido antigénico puede proceder de uno o más de las proteínas E2, E6 y E7 del HPV-16 y 18. En una realización preferida, el péptido antigénico contiene la secuencia GQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIR de E7 del HPV-16 (el epítopo CD8 se muestra en negrita). Por lo tanto, el antígeno del HPV puede ser un péptido de 35 aminoácidos. Como alternativa, el péptido antigénico puede ser solo el epítopo CD8 RAHYNIVTF, es decir, un péptido más corto.
En una realización alternativa, la enfermedad, trastorno o infección es una infección vírica, preferentemente una infección por el virus del papiloma, en particular, una infección por el virus del papiloma humano (HPV).
Preferentemente, el uso es para vacunación. Tal como se cita en el presente documento, "vacunación" es el uso de un antígeno (o una molécula que contiene un antígeno) para provocar una respuesta inmunitaria que es profiláctica o terapéutica contra el desarrollo (o desarrollo posterior) de una enfermedad, trastorno o infección, en donde esa enfermedad, trastorno o infección está asociado con la expresión o presencia anormal de ese antígeno. Preferentemente la enfermedad es cáncer, por ejemplo, melanoma, o un cáncer asociado con un virus del papiloma tal como el HPV. En una realización, la vacunación es terapéutica, por ejemplo, en el tratamiento de cánceres indicados en el presente documento. En una realización alternativa, la vacunación es profiláctica, por ejemplo, para prevenir un cáncer o para reducir el desarrollo de nuevos cánceres tras el tratamiento de un cáncer anterior con una vacunación terapéutica. En una realización adicional, cuando se va a generar una respuesta inmunitaria a una infección, por ejemplo, una infección vírica, tal como una infección por HPV, la vacunación es de naturaleza profiláctica.
En una realización preferida de la presente invención, el sujeto del uso, por ejemplo, vacunación, es un mamífero, preferentemente un gato, perro, caballo, burro, oveja, cerdo, cabra, vaca, ratón, rata, conejo o cobaya, pero lo más preferentemente, el sujeto es un ser humano.
Preferentemente, los usos y métodos descritos en el presente documento logran sinergia, es decir, el grado de presentación en la superficie celular o la respuesta inmunitaria generada aumenta más que el aumento combinado observado mediante (i) la realización del uso o método con el péptido antigénico en ausencia del ligando de TLR y (ii) la realización del uso o método con el péptido antigénico en ausencia del agente fotosensibilizante y la etapa de irradiación, es decir, se observa sinergia entre los usos o métodos. El nivel de presentación en la superficie celular o de generación de respuesta inmunitaria puede evaluarse mediante medios adecuados, por ejemplo, el número de células CD8+ específicas de antígeno o los niveles de marcadores de activación de la respuesta inmunitaria, por ejemplo, IFN<y>o IL-2.
"Sinergia", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una mejora cuantitativa sobre los efectos meramente aditivos.
Los diversos agentes utilizados en los usos de la invención pueden administrarse al sujeto por separado, de forma secuencial o simultánea.
Los aspectos y características indicadas anteriormente en relación con el método de expresión de un péptido antigénico o una parte del mismo en la superficie de una célula de la presente invención, cuando sea adecuado, también son aplicables al uso para generar una respuesta inmunitaria anterior.
Los métodos de la invención anteriores se pueden utilizar in vitro (y los usos utilizados in vivo), por ejemplo, para tratamiento ex vivo seguido de la administración de las células tratadas al cuerpo.
Por lo tanto, el método de la invención puede producir una célula que expresa un péptido antigénico, o una parte del mismo, en su superficie, o una población de la misma, célula que se obtiene mediante cualquiera de los métodos definidos en el presente documento. La célula o población celular puede utilizarse en profilaxis o terapia.
La población celular se puede proporcionar en una composición farmacéutica que comprende además uno o más diluyentes, vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables.
La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende un péptido antigénico, un agente fotosensibilizante y un ligando de TLR como se define en el presente documento, y uno o más diluyentes, vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables.
Estas composiciones (y productos de la invención) se pueden formular de cualquier manera conveniente de acuerdo con técnicas y procedimientos conocidos en la técnica farmacéutica, por ejemplo, usando uno o más diluyentes, vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables. "Farmacéuticamente aceptable", como se define en el presente documento, se refiere a ingredientes que son compatibles con otros ingredientes de las composiciones (o productos) así como fisiológicamente aceptables para el receptor. La naturaleza de la composición y los vehículos o materiales excipientes, dosificaciones, etc. se pueden seleccionar de manera rutinaria según la elección y la vía de administración deseada, finalidad del tratamiento, etc. Las dosis también pueden determinarse de manera rutinaria y pueden depender de la naturaleza de la molécula (o de los componentes de la composición o producto), el propósito del tratamiento, la edad del paciente, el modo de administración, etc. En relación con el agente fotosensibilizante, la potencia/capacidad de romper las membranas en la irradiación, también debe tenerse en cuenta.
Las células, por ejemplo, las células presentadoras de antígenos, pueden prepararse in vitro. En los métodos de tratamiento, estas células pueden administrarse a un cuerpo in vivo o a un tejido corporal ex vivo de modo que esas células puedan estimular una respuesta inmunitaria, por ejemplo, con fines profilácticos o terapéuticos.
En una realización alternativa, la presente invención proporciona un péptido antigénico, un agente fotosensibilizante y un ligando de TLR como se define en el presente documento para su uso en la estimulación de una respuesta inmunitaria (por ejemplo, para estimular los CTL) en un sujeto, preferentemente para tratar o prevenir una enfermedad, trastorno o infección en dicho sujeto, en donde dicho uso comprende un método como se define en el presente documento, preferentemente para preparar una población de células, por ejemplo, células dendríticas. A continuación, estas células pueden administrarse al sujeto.
La invención proporciona además un producto que comprende un péptido antigénico, un agente fotosensibilizante y un ligando de TLR como se define en el presente documento como una preparación combinada para uso simultáneo, separado o secuencial para estimular una respuesta inmunitaria en un sujeto (o para expresar un péptido antigénico o una parte del mismo en la superficie de una célula en un método como se define en el presente documento), preferentemente para tratar o prevenir una enfermedad, trastorno o infección en un sujeto.
La presente invención también proporciona un kit para su uso en la estimulación de una respuesta inmunitaria en un sujeto, preferentemente para tratar o prevenir una enfermedad, trastorno o infección en dicho sujeto, por ejemplo, para su uso en vacunación o inmunización, o para expresar un péptido antigénico o una parte del mismo en la superficie de una célula en un método como se define en el presente documento, comprendiendo dicho kit
un primer recipiente que contiene un agente fotosensibilizante como se define en el presente documento;
un segundo recipiente que contiene dicho péptido antigénico como se define en el presente documento; y un tercer recipiente que contiene un ligando de TLR como se define en el presente documento.
Los productos y kits de la invención se pueden utilizar para lograr la presentación en la superficie celular (o métodos terapéuticos) como se define en el presente documento.
La presentación antigénica lograda por la invención reivindicada puede dar como resultado de manera ventajosa la estimulación de una respuesta inmunitaria cuando se administran in vivo las células tratadas. Preferentemente se genera una respuesta inmunitaria que confiere protección contra una exposición posterior por una entidad que comprende o contiene dicho péptido antigénico o parte del mismo y, por consiguiente, la invención encuentra utilidad particular como método de vacunación.
La enfermedad, trastorno o infección es cualquier enfermedad, trastorno o infección que puede tratarse o prevenirse mediante la generación de una respuesta inmunitaria, por ejemplo, mediante la eliminación de células anormales o extrañas que pueden identificarse a partir de un antígeno (o su nivel de expresión) que permite discriminarlas (y eliminarlas) con respecto a las células normales. La selección del péptido antigénico a utilizar determina la enfermedad, trastorno o afección a tratar. A partir de los péptidos antigénicos indicados anteriormente, los métodos, usos, composiciones, productos, kits y demás, descritos en el presente documento pueden utilizarse para tratar o prevenir, por ejemplo, infecciones (por ejemplo, víricas o bacterianas como se mencionó anteriormente), cánceres o la esclerosis múltiple. La prevención de dichas enfermedades, trastornos o infecciones pueden constituir una vacunación.
Como se define en el presente documento, "tratamiento" se refiere a reducir, aliviar o eliminar uno o más síntomas de la enfermedad, trastorno o infección que se está tratando, con respecto a los síntomas antes del tratamiento. "Prevención" (o profilaxis) se refiere a retrasar o prevenir la aparición de los síntomas de la enfermedad, trastorno o infección. La prevención puede ser absoluta (de modo que no se produzca ninguna enfermedad) o puede ser eficaz solo en algunas personas o durante un tiempo limitado.
Para la administración in vivo de las células, se puede utilizar cualquier modo de administración de la población celular que sea común o convencional en la materia, por ejemplo, inyección o infusión, mediante una vía adecuada. De manera conveniente, las células deben administrarse mediante inyección intralinfática. Preferentemente deben administrarse de 1 * 104 a 1 * 108 células por kg de sujeto (por ejemplo, de 1,4 * 104 a 2,8 * 106 por kg en seres humanos). Por lo tanto, por ejemplo, en un ser humano, una dosis de 0,1 a 20 * 107 células se puede administrar en una dosis, es decir, por dosis, por ejemplo, como dosis de vacunación. La dosis puede repetirse en momentos posteriores si es necesario.
La invención se describirá ahora con más detalle en los siguientes ejemplos no limitantes con referencia a los siguientes dibujos en los que:
En la figura 1 se muestra el % de linfocitos T específicos de antígeno en la sangre (A) y el bazo (B y C) después de la vacunación in vivo de ratones con una mezcla del antígeno ovoalbúmina (OVA) y, cuando se indique, TPCS<2>a (PCI) y CpG o R848. El gráfico (A) muestra el % de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno en sangre 7 días después de la vacunación, representando cada círculo un animal. El gráfico (B) muestra el % de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno en el bazo 14 días después de la vacunación, representando cada círculo un animal. El gráfico (C) es una representación de diagrama de barras de los mismos datos que se muestran en (B).
En la figura 2 se muestra el grado de producción de IFN-y en células de bazo CD8+ de ratones vacunados como se describe en la leyenda de la figura 1, después de la estimulación in vitro con el péptido antigénico SIINFEKL. El análisis se realizó mediante tinción intracelular para IFN-y y análisis de las células mediante citometría de flujo. El gráfico B es una representación de diagrama de barras de los datos que se muestran en el gráfico A.
En la figura 3 se muestra la cantidad de producción de IFN-y e IL-2 en células de bazo totales de ratones vacunados como se describe en la leyenda de la figura 1, después de la estimulación in vitro con el péptido antigénico SIINFEKL. El análisis se hizo mediante ELISA. Los gráficos A y C muestran los resultados con y sin reestimulación con SIINFEKL. Los resultados se muestran como la lectura directa del ensayo ELISA sin corrección de acuerdo con las respectivas curvas convencionales. Los gráficos B y D muestran los mismos datos para las muestras estimuladas con SIINFEKL, donde las concentraciones de IFN-y e IL-2 se han calculado según las respectivas curvas convencionales.
En la figura 4 se muestra el esquema 1: Ruta sintética para la síntesis del compuesto 5. Reactivos y condiciones: (a) ácido propiónico, reflujo, 1 h (20 %); (b) NaNO<2>(1,8 eq.), TFA, t.a., 3 min. 67 %); (c) SnCb-2H2O, HCl conc., 60 °C, 1 h (88 %); (d) Bromuro de bromoacetilo, Et3N, CH<2>Cb, t.a., 1 h (64 %) (e) Piperazina, CH<2>Cb, t.a., 1 h (94 %).
Esquema 2. Síntesis de derivados de quitosano N-modificados (TPP-CS-TMA y TPP-CS-MP). Aquí, A representa compuestos del 1.er lote y B presenta compuestos del 2.° lote. Reactivos y condiciones: (a) MeSO3H/ H<2>O, 10 °C-t.a., 1 h, (90 %); (b) TBDMSCl, imidazol, DMSO, t.a., 24 h (96 %); (c) Bromuro de bromoacetilo, EfeN, CH<2>Cb, -20 °C, 1 h (92 %); (d) compuesto 5, es decir, TPP-NH-Pip (0,1 o 0,25 eq.), Et3N, CHCb, t.a., 2 h (92-90 %) (e) NMe3 o 1-metil piperazina, CHCb, t.a., 24 h (f) TBAF, NMP, 55 °C, 24 h o HCl conc./MeOH, t.a., 24 h.
Esquema 3 - Esquema de la síntesis para los compuestos 1, 3, 20 y 21.
Reacciones y condiciones: ((a) Ácido propiónico, reflujo, 1 h, (20 %); (b) NaNO<2>(1,8 eq.), TFA, t.a., 3 min.; (c) SnCb2H2O, HCl conc., 60 °C, 1 h, (54 %); (d<1>) p-Toluenosulfonilhidrazida, K<2>CO<3>, piridina, reflujo, 24 h; (d<2>) o-Cloranilo, CH<2>Cl<2>, t.a., (80 %); (e) Cloruro de cloroacetilo, Et3N, CH<2>Cl<2>, t.a., 2 h, in situ- (f) Piperazina, CH<2>Cl<2>, t.a., 12 h, (61 %). Todos los derivados del compuesto 20 y 21 contendrán el isómero TPCa<1>y el isómero TPCa<2>. Sin embargo, solamente la estructura TPCa<1>se muestra en los esquemas y en los dibujos de estructuras.
Esquema 4 - esquema de la síntesis para los compuestos 22 a 28. Reacciones y condiciones: (a) Cloruro de acetilo, MeOH, reflujo, 24 h, (87 %); (b) BFaEt<2>O, CHCl3, t.a., p-cloranilo,
48 h, (14 %); (c) 2N KOH (en MeOH), THF:Piridina (10:1), reflujo, 24 h (71 %); (d<1>) p-Toluenosulfonilhidrazida, K<2>CO<3>, Piridina, reflujo, 24 h; (d<2>) o-cloranilo, CH<2>Cl<2>: MeOH (75:25), t.a., (70 %); (e) EDCl.HCl, HOBT, EfeN, N-Boc-piperazina 5, DMF, t.a., 24 h (54 %) (f) TFA, CH<2>Cl<2>, t.a., 1 h (89 %). Todos los derivados de los compuestos 26 a 28 contendrán el isómero TPCc<1>y el isómero TPCc<2>. Sin embargo, solamente la estructura TPCc<1>se muestra en los esquemas y en los dibujos de estructuras.
Esquemas 5A y 5B. Reactivos y condiciones (6A): (a) compuesto 21, es decir, TPC-NH-Pip (0,1 eq.), EfeN, CHCb, t.a., 2 h (78 %) (b) NMe3 o 1-metil piperazina, CHCb, t.a., 24 h. Reactivos y condiciones (6b): a) compuesto 28, es decir, TPC-CO-Pip (0,1 eq.), EfeN, NMP, 75 °C, 12 h (89 %) (b) NMe3 o 1-metil piperazina, CHCb, t.a., 24 h.
En la figura 5 se muestra el efecto de los adyuvantes poli(IC) y CpG. Los ratones se inmunizaron con 10 pg de OVA, con 100 pg de OVA, con 10 pg de OVA y 150 pg de TPCS<2>a, con 10 pg de OVA y 50 pg de oligonucleótido de CpG ODN2395, con 10 pg de OVA, 50 pg de oligonucleótido de CpG ODN2395 y 150 pg de TPCS<2>a, con 10 pg Ov A y 50 pg de Poli(IC), con 10 pg de OVA, 50 pg de Poli(IC) y 150 pg de TPCS<2>a o se deja sin tratar. Los ratones que recibieron TPCS<2>a se iluminaron. Se extrajo sangre de los ratones el día 7 y se analizó la frecuencia de linfocitos T CD8 específicos de OVA mediante citometría de flujo. El día 14 se obtuvieron células del bazo y se reestimularon con el péptido SIINFEKL y se analizaron mediante ELISA con interferón-gamma. (A) muestra los valores promedios (% de células CD44+ específicas de antígeno de las células CD8+ totales) en sangre el día 7 para los grupos experimentales (5 animales en cada grupo, barras de error: error estándar de la media). (B) muestra los resultados de ELISA de interferón-gamma (IFN-<y>) después de la reestimulación de las células de bazo el día 14 con el péptido SIINFEKL.
En la figura 6 se muestran los valores promedio (% de células CD44+ específicas de antígeno de las células CD8+ totales) después de la 1.a y 2.a inmunización de ratones con OVA y poli(IC).
En la figura 7 se muestran los valores para los animales individuales en el experimento después de la 2.a inmunización (% de células CD44+ específicas de antígeno de las células CD8+ totales) (las barras de error son desviación típica) después de la 2.a inmunización (día 22).
En la figura 8 se muestran los valores promedio (% de células CD44+ específicas de antígeno de las células CD8+ totales) para los grupos experimentales teñidos con el pentámero TRP-2 después de la 2.a inmunización.
En la figura 9 se muestran los valores promedio (% de células CD44+ específicas de antígeno de las células CD8+ totales) para los grupos experimentales después de la 1.a y 2.a inmunización con iluminación de luz roja para activar el fotosensibilizador.
En la figura 10 se muestran los valores promedio (% de células CD44+ específicas de antígeno de las células CD8+ totales) para los grupos experimentales (las barras de error son el error estándar de la media) después de la 1.a (día 7) y 2.a (día 21) inmunización.
En la figura 11 se muestran los valores promedio (% de células CD44+ específicas de antígeno de las células CD8+ totales) para los grupos experimentales después de la 1.a (día 7) y 2.a (día 21) inmunización.
En la figura 12 se muestran los valores promedio de ELISA en células de bazo con o sin reestimulación con péptido SIINFEKL como se indica en la figura.
En la figura 13 se muestran los valores promedio (% de células CD44+ específicas de antígeno de las células CD8+ totales) para los grupos experimentales (5 animales en cada grupo, las barras de error son desviación típica) después de la 1.a y 2.a inmunización.
En la figura 14 se muestra el % de células CD44+ específicas de antígeno de las células CD8+ totales para los grupos experimentales después de cada una de las tres inmunizaciones.
En la figura 15 se muestra el % de células CD44+ específicas de antígeno de las células CD8+ totales para los grupos experimentales después de tres inmunizaciones.
En la figura 16 se muestran los valores promedio (% de células CD44+ específicas de antígeno de las células CD8+ totales) para los grupos experimentales (5 animales en cada grupo, las barras de error son desviación típica) después de la 1.a y 2.a inmunización.
En la figura 17 se muestra un gráfico de puntos de citometría de flujo después de la 3.a inmunización de un animal típico en los tres grupos experimentales.
En la figura 18 se muestran los valores promedio (% de células CD44+ específicas de antígeno de las células CD8+ totales) después de cada una de las 3 inmunizaciones.
En la figura 19 se muestra el % de células CD44+ específicas de antígeno de las células CD8+ totales para los grupos experimentales después de dos inmunizaciones.
En la figura 20 se muestra el % de células CD44+ específicas de antígeno de las células CD8+ totales /- EEM para los grupos experimentales después de dos inmunizaciones.
Ejemplos
Materiales y métodos
Ratones
Se adquirieron ratones C57BL/6 de Harlan (Horst, Países Bajos). En instalaciones de la Universidad de Zúrich se criaron ratones OT-I transgénicos para el receptor de linfocitos T que reconoce el epítopo restringido OVA257-264 de la ovoalbúmina (OVA) del MHC de clase-1 (adquiridos originalmente a Taconic Europe (Ry, Dinamarca)). Todos los ratones se mantuvieron en condiciones específicas sin patógenos (SPF, del inglés specified pathogen-free) y las autoridades veterinarias suizas aprobaron los procedimientos realizados. En los ratones OT-1, el gen para el receptor de linfocitos T se ha genomanipulado de tal manera que casi todos los linfocitos T CD8+ de estos ratones (llamadas células OT-1) reconocerán específicamente el epítopo peptídico específico (SIINFEKL) del antígeno ovoalbúmina (OVA).
Protocolo de inmunización
El día 0, a los ratones hembra C57BL/6 se les inyectó 1,5 * 10<6>esplenocitos de ratones Rag2/OT-1 por vía intravenosa en la vena de la cola. De esta forma, los ratones que se vacunan tienen una "base" de linfocitos T CD8 que pueden responder al epítopo SIINFEKL de OVA si, y solo si, éste se presenta de manera adecuada en el MHC de clase I de las células presentadoras de antígeno. Por lo tanto, la transferencia de células OT-1 "amplifica" el sistema de detección en los ratones vacunados, lo que permite analizar fácilmente el efecto de la vacunación in vivo mediante la medición de los linfocitos T CD8+ específicos de antígeno y la producción de IFN-y e IL-2.
4 horas más tarde, los animales se vacunaron mediante inyección intradérmica en el abdomen (2 * 50 pl de soluciones que contenían los ingredientes especificados a continuación). 6 grupos de 4 animales recibieron dosis totales de:
Grupo 1: 25 pg de TPCS2a (Amphinex) 10 pg de ovoalbúmina (OVA, Grado V, Sigma-Aldrich).
Grupo 2: 25 pg de TPCS2a 10 pg de ovoalbúmina 60 pg de CpG.
Grupo 3: 25 pg de TPCS2a 10 pg de ovoalbúmina 100 pg de R848 (resiquimod). Grupo 4: 10 pg de ovoalbúmina.
Grupo 5: 10 pg de ovoalbúmina 60 pg de CpG.
Grupo 6: 10 pg de ovoalbúmina 100 pg de R848 (resiquimod).
El oligonucleótido CpG utilizado fue el tipo B 20-mer ODN 1826 (sintetizado por Microsynth (Balgach, Suiza)), con la secuencia (5-TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT-3'), con una cadena principal totalmente fosforotioada (modificado con PS).
El día 1 se anestesiaron los animales de los grupos 1, 2 y 3, y se iluminaron durante 6 minutos con luz azul usando una lámpara LumiSource (PCI Biotech AS). Los animales se iluminaron aproximadamente 18 h después de la inyección de la solución de antígeno, y la tasa de fluencia de la iluminación fue de aproximadamente 13 mW/cm<2>. El día 7 se extrajo sangre de los ratones de la vena de la cola y las células sanguíneas se tiñeron con pentámero SIINFEKL (ProImmune), y anticuerpos CD8 y CD44 para el análisis de citometría de flujo (véanse los protocolos a continuación). El día 14 se sacrificó a los ratones y se recogieron los bazos. Se reestimuló una alícuota de los esplenocitos con el péptido SIINFEKL (EMC microcollections, Tuebingen, Alemania), se tiñó para la expresión de IFN-Y intracelular y se analizó mediante análisis de citometría de flujo (véase a continuación). Otra alícuota de los esplenocitos se resuspendió en medio de cultivo celular, se mantuvo en este medio durante la noche (puramente por razones prácticas) sin reestimulación, se tiñó con pentámero SIINFEKL como se describe anteriormente y se analizó mediante citometría de flujo (véase el protocolo a continuación).
Tinción con pentámero SIINFEKL de células del bazo
La tinción con pentámero SIINFEKL y la citometría de flujo en células de bazo se realizaron en células que se habían resuspendido en medio celular y se habían mantenido en este medio durante la noche (meramente por razones prácticas) sin reestimulación.
Tinción con pentámero SIINFEKL y citometría de flujo
Se recogieron de 5 a 10 gotas de sangre completa de la cola y se añadieron 0,5 ml de solución Red Cell Lyse (Sigma). Después de 5 a 6 minutos, las células se centrifugaron y se lavaron dos veces con 0,5 ml de PBS. El sedimento celular se resuspendió en tampón FACS (FCS/PBS al 2 % con Na-azida al 0,01 %), se transfirió a una placa de 96 pocillos en forma de U y se incubó con anticuerpos bloqueadores de FcR (1,0 pl de anti-CD16/CD32 de Pharmingen) durante 10 min en hielo, (1 pl 49 pl de tampón FACS). Sin lavar, se añadió el pentámero SIINFEKL-PE (Prolmmune; 5 pl por muestra), se mezcló e incubó a 37 °C durante 15 min. Sin lavar, se añadió un CD8 o CD44 marcado con fluorescencia hasta una concentración final de 1:100 y se incubó en hielo durante 25 a 45 min. Las células se lavaron en 100 pl de tampón FACS y se suspendieron en 100 pl de tampón FACS. Las células se analizaron con FACSCanto.
Reestimulación de esplenocitos ex vivo
Los esplenocitos se aislaron y prepararon para la tinción intracelular mediante la trituración del bazo y la separación de las células en FCS/PBS al 2 %, mediante agitación en tampón de lisis (Sigma) durante 1 a 2 minutos y lavado en FCS/PBS al 2 %. Se añadió 1 ml de la suspensión celular en medio completo por pocillo de una placa de 24 pocillos (500.000 células/ml) y a cada pocillo se le añadió 5 pg/ml de SIINFEKL y se incubó durante la noche a 37 °C. Se añadió brefeldina A (1 a 2 pg/ml) a cada pocillo y se incubó durante 4 horas a 37 °C. Las células se transfirieron a placas de 96 pocillos en forma de U, se lavaron en FCS/PBS al 2 % y se resuspendieron en 50 pl de tampón FACS con anticuerpos bloqueadores de FcR (1,0 pl de anti-CD16/CD32 de Pharmingen) y se incubaron en hielo durante 10 minutos. Sin lavar, las células se incubaron con anticuerpos de superficie CD8 o CD44 durante 20 a 45 min en hielo (en oscuridad), se lavaron en tampón FACS y se fijaron mediante la resuspensión en 100 pl de paraformaldehído (PFA) (1 % en PBS) durante 10 a 20 minutos en hielo. Las células se lavaron en tampón FACS, se resuspendieron en 100 pl de NP40 (0,1 % en PBS) y se incubaron durante 3 minutos en hielo. Después de lavar en tampón FACS, se añadió un anticuerpo interferón-gamma marcado con fluorescencia y se incubó durante 35 min en hielo en la oscuridad. Después de lavar y suspender en tampón FACS, las células se analizaron con FACSCanto usando el programa informático FlowJo 8.5.2 (Tree Star, Inc., Ashland, OR).
Citometría de flujo
La frecuencia de linfocitos T específicos de OVA se determinó mediante citometría de flujo (FACSCanto de BD Biosciences, San José, USA). Antes de la citometría de flujo, se realizó una compensación utilizando perlas teñidas con cada anticuerpo por separado. Antes de la tinción de anticuerpos, los glóbulos rojos se lisaron utilizando solución Red Cell Lyse (Sigma). Se registraron 10.000 eventos CD8+ para cada muestra y se calculó el porcentaje de células positivas para el pentámero SIINFEKL utilizando el programa informático FlowJo 8.5.2 de Tree Star, Inc. (Ashland, OR) http://www.flowio.com/.
ELISA
Se realizó ELISA utilizando el kit Ready-set Go! (eBioscience) para las moléculas oportunas de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Ejemplo 1: Efecto de los ligandos de TLR en la vacunación in vivo con OVA
Se vacunaron in vivo ratones mediante el protocolo de inmunización descrito anteriormente. La sangre se aisló después de 7 días y el bazo después de 14 días. La sangre se analizó en busca de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno y las células de bazo se analizaron directamente en busca de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno o para la producción de IFN-y o IL-2 después de la reestimulación in vitro.
Nivel de linfocitos T específicos de antígeno en sangre y bazo
El nivel de linfocitos T específicos de antígeno se midió por citometría de flujo utilizando un "pentámero" específico de antígeno marcado con fluorescencia que se une específicamente a los linfocitos T específicos de antígeno. Se determinó el número de linfocitos T<c>D8+ específicos de antígeno en % de linfocitos T CD8+ totales en el animal (véase el análisis de tinción y de citometría de flujo descrito en el protocolo de inmunización y los detalles de la tinción con SIINFEKL).
Los linfocitos T endógenos sirven como control interno para la especificidad del antígeno del efecto, ya que un efecto de estimulación general sobre los linfocitos T afectará también a los linfocitos T endógenos sin conducir a un aumento en el % de células específicas de antígeno. Normalmente, el % de células OT-1 se midió antes de la vacunación y en puntos temporales después de la vacunación. El efecto del antígeno solo ("vacunación convencional") se comparó con el efecto del antígeno+PCI.
Nivel de producción de IFN-<y>en células de bazo después de la estimulación ex vivo con antígeno (citometría de flujo) Los bazos extraídos el día 14 de la vacunación se sometieron a aislamiento de esplenocitos y a reestimulación con el péptido antigénico SIINFEKL y a tinción intracelular para la producción de IFN-<y>para el análisis de linfocitos T CD8+ mediante citometría de flujo, tal como se describe en los protocolos anteriores.
Nivel de producción de IFN-y e IL-2 en células del bazo después de la estimulación ex vivo con antígeno (ELISA) Los bazos extraídos el día 14 de la vacunación se sometieron a aislamiento de esplenocitos y a reestimulación con el péptido antigénico SIINFEKL y análisis de producción de IFN-y e IL-2 mediante ELISA, tal como se describe en los protocolos anteriores.
Resultados
Nivel de linfocitos T específicos de antígeno en sangre y bazo
Los resultados se muestran en la figura 1. Se puede observar que cuando se ensayó en el día 7, la PCI indujo un efecto significativamente mejor que el antígeno OVA solo (A). El oligonucleótido CpG también mejoró la vacunación con respecto a OVA solo, pero no tanto como PCI. R848 solo no mejoró la vacunación con respecto a OVA solo, más bien parecía inhibir algo el efecto de la vacunación. La combinación de PCI con R848 o CpG mejoró la vacunación en comparación con el efecto de PCI+OVA. Esta mejora fue aún más pronunciada al analizar las células del bazo 14 días después de la vacunación (B y C). Se puede observar que en este momento el efecto del tratamiento PCI+OVA solo había regresado al nivel de base, lo mismo ocurrió con los grupos con R848/CpG+OVA sin PCI. Sin embargo, en los dos grupos en los que R484 o CpG se combinaron con PCI se observó un efecto sustancialmente mejor, especialmente pronunciado para R848.
Nivel de producción de IFN-y en células del bazo después de la estimulación ex vivo con antígeno (citometría de flujo) IFN-<y>e IL-2 son citocinas producidas por linfocitos T CD8+ después de la estimulación con antígeno. Los resultados se muestran en la figura 2. De acuerdo con los resultados mostrados en la figura 1, en la figura 2 se muestra que el mejor efecto se logró con la combinación de CpG/R848 y PCI, siendo CpG+PCI aparentemente mejor que R848+PCI cuando se analiza este parámetro. También se puede ver que el antígeno solo (OVA) no produjo ningún efecto detectable, mientras que OVA+PCI indujo un efecto observable. Los grupos con CpG/R848+OVA sin PCI no produjeron ningún efecto (CpG) o solo un efecto apenas detectable (R848), mientras que las combinaciones de OVA+CpG+PCI y OVA+R848+PCI fueron aproximadamente 6 veces y 2,5 veces mejor que OVA+PCI, respectivamente.
Nivel de producción de IFN-<y>en células del bazo después de la estimulación ex vivo con antígeno (ELISA) Los resultados se muestran en la figura 3. En los gráficos A y C de la figura 3 se muestra que tanto la producción de IFN-y como la de IL-2 fue más elevada en los grupos de OVA+CpG/R848+PCI, y que la producción dependía de la estimulación por el antígeno peptídico SIINFEKL, demostrando que es un efecto específico de antígeno. En los gráficos B y D se muestra que el efecto en los grupos CpG/R848+OVA+PCI fue sustancialmente mejor que en los otros grupos de tratamiento.
Ejemplo 2: Efecto de otros ligandos de TLR en la vacunación in vivo con OVA
Los métodos anteriores se utilizan para realizar la vacunación in vivo. Por lo tanto, los métodos descritos anteriormente pueden realizarse en los que 14 grupos de 4 animales reciben dosis totales de:
Grupo 1: 250 |jg de TPCS2a (Amphinex) 10 |jg de ovoalbúmina (OVA, Grado V, Sigma-Aldrich).
Grupo 2: 250 jg de TPCS2a 10 jg de ovoalbúmina 50 jg de LPS (Porphyromonas gingivalis).
Grupo 3: 250 jg de TPCS2a 10 jg de ovoalbúmina 50 jg de LPS (E. coli).
Grupo 4: 250 jg de TPCS2a 10 jg de ovoalbúmina 50 jg de LPS (Salmonella minnesota).
Grupo 5: 250 jg de TPCS2a 10 jg de ovoalbúmina 100 jg de M<p>L<a>(Salmonella minnesota).
Grupo 6: 250 jg de TPCS2a 10 jg de ovoalbúmina 1 mg de poli(I:C).
Grupo 7: 250 jg de TPCS2a 10 jg de ovoalbúmina 1 mg de ssPoliU.
Grupo 8: 10 jg de ovoalbúmina.
Grupo 9: 10 jg ovoalbúmina 50 jg de LPS (Porphyromonas gingivalis).
Grupo 10: 10 jg de ovoalbúmina 50 jg de LPS (E. coli).
Grupo 11: 10 jg de ovoalbúmina 50 jg de LPS (Salmonella minnesota).
Grupo 12: 10 jg de ovoalbúmina 100 jg de MPLA (Salmonella minnesota).
Grupo 13: 10 jg de ovoalbúmina 1 mg de poli(I:C).
Grupo 14: 10 jg de ovoalbúmina 1 mg de ssPoliU.
Poli(I:C), LPS, MPLA y ssPoliU se obtienen todos de Invivogen.
Ejemplo 3: Efecto de poli(IC) y CpG en la vacunación in vivo con OVA
Materiales y métodos
Animales
Se adquirieron ratones C57BL/6 de Harlan (Horst, Países Bajos). Se adquirieron ratones OT-I transgénicos con receptor de linfocitos T CD8 (B6.129S6-Rag2tm1 Fwa Tg(TcraTcrb)1100Mjb) de Taconic Europe (Ry, Dinamarca) o de Jackson Laboratories (Bar Harbor, Maine). Los linfocitos T CD8 OT-I reconocen el epítopo SIINFEKL restringido a H-2Kb de la ovoalbúmina (OVA, aa257-264). Todos los ratones se mantuvieron en condiciones SPF y las autoridades veterinarias de Suiza y Noruega aprobaron los procedimientos realizados.
Materiales y células
La OVA de pollo se adquirió de Sigma-Aldrich (Buchs, Suiza), el péptido SIINFEKL de EMC microcollections (Tuebingen, Alemania), y poli(IC) (PM elevado) y el oligonucleótido CpG ODN2395 de InvivoGen (San Diego, EE. UU.). El fotosensibilizador disulfonato de tetrafenil clorina (TPCS2a) era de PCI Biotech (Lysaker, Noruega). OVA, TPCS2a y, cuando sea oportuno, Poli(IC) se mezclaron en PBS, se mantuvieron protegidos de la luz y se administraron a ratones dentro de los 60 minutos posteriores a la preparación. TPCS2a se activó mediante iluminación con LumiSource™ (PCI Biotech).
Fotosensibilización intradérmica e inmunización de ratones
Un día antes de la inmunización, se aislaron bazos y ganglios linfáticos de ratones hembra OT-1, y se eliminaron los eritrocitos mediante lisis (RBC Lysing Buffer Hybri-Max de Sigma-Aldrich) de las suspensiones celulares homogeneizadas. Las células restantes se lavaron en PBS, se filtraron a través de filtros de nailon de 70 micrómetros y se administraron 2 * 106 células OT-1 mediante inyección intravenosa en ratones C57BL/6 hembra receptores; la transferencia adoptiva de linfocitos T CD8 específicos de SIINFEKL facilita el seguimiento de la respuesta inmunitaria mediante citometría de flujo. Un día u 8 horas después, se extrajo sangre de los ratones mediante sangrado de la cola y la sangre se recogió en tubos que contenían heparina para el análisis de la frecuencia inicial de linfocitos T CD8 específicos de OVA.
A continuación, se rasuró el área abdominal de los ratones y se inyectaron las vacunas, consistentes en OVA o en diferentes mezclas de OVA, TPCS2a, Poli(IC) (50 |jg) u oligonucleótido CpG (50 |jg), por vía intradérmica usando jeringas con agujas 29G. Las vacunas se mantuvieron protegidas de la luz y se utilizan en los 60 minutos posteriores a la preparación. Las vacunas se administraron en dos inyecciones de 50 j l cada una, en el lado izquierdo y derecho de la línea media abdominal. Se utilizó OVA en dosis de 10 o 100 jg , y la dosis de TPCS2a fue de 150 jg . 18 horas después de la inyección de la vacuna, los ratones se anestesiaron mediante inyección intraperitoneal de una mezcla de ketamina (25 mg/kg de peso corporal) y xilazina (4 mg/kg) y se colocaron en la fuente de luz LumiSource (para iluminación y activación del fotosensibilizador TPCS2a). El tiempo de iluminación fue de 6 minutos.
En los días 7 y 14 a partir de entonces, se extrajo sangre de los ratones mediante sangrado de la cola y los eritrocitos se eliminaron por lisis antes del análisis de los linfocitos T CD8 específicos de antígeno mediante citometría de flujo. Al final del experimento (día 14), se sacrificaron los ratones y se analizaron los esplenocitos ex vivo.
Análisis de las respuestas inmunitarias
La frecuencia de linfocitos T CD8 específicos de OVA en la sangre se controló mediante la tinción de las células con anticuerpos anti-CD8 y H-2K.b/pentámero SIINFEKL Pro5 (Proinmune, Oxford, Reino Unido) para análisis mediante citometría de flujo. El estado de activación de las células se analizó adicionalmente mediante el análisis de la expresión de CD44 mediante citometría de flujo. Las células se analizaron utilizando FACSCanto (BD Biosciences, San José, EE. UU.) y con el programa informático FlowJo 8.5.2 (Tree Star, Inc., Ashland, OR).
Para el análisis ELISA, se reestimularon 2 * 105 esplenocitos en placas de 96 pocillos con 0,005 jg/m l del péptido SIINFEKL. Después de 72 horas, se recogieron los sobrenadantes y se analizaron para IFN-<y>mediante ELISA (eBioscience, realizado de acuerdo con las instrucciones del fabricante).
Experimento con poli(IC) y CpG.
El experimento se realizó como se describe en materiales y métodos, y las muestras de sangre de ratón del día 7 después de la vacunación se analizaron mediante citometría de flujo como se describe. Las células del bazo del día 14 se reestimularon con el péptido SIINFEKL y se analizaron mediante ELISA con interferón-gamma como se describe. Todos los ratones recibieron células OT-1 como se describe.
Se incluyeron los siguientes grupos experimentales: 123456
1. Sin tratamiento: Los ratones recibieron células OT-1, pero no se vacunaron ni iluminaron.
2. OVA: Los ratones se vacunaron con 10 jg de OVA. No se iluminaron.
3. OVA 100 |jg: Los ratones se vacunaron con una mezcla de 100 jg de OVA. No se iluminaron.
4. OVA 10 jg PCI: Los ratones se vacunaron con una mezcla de 10 jg de OVA 150 jg de TPCS2a. Iluminado como se describe.
5. CpG OVA: Los ratones se vacunaron con una mezcla de 10 jg de OVA 50 jg de oligonucleótido CpG ODN2395. No se iluminaron.
6. CpG OVA/PCI: Los ratones se vacunaron con una mezcla de 10 jg de OVA 50 jg de oligonucleótido CpG ODN2395 150 |jg de TPCS<2>a. Iluminado como se describe.
7. Poli(IC) OVA: Los ratones se vacunaron con una mezcla de 10 jg de OVA 50 jg de poli(IC). No se iluminaron.
8. Poli(lC) OVA/PCI: Los ratones se vacunaron con una mezcla de 10 jg de OVA 50 jg de poli(IC) 150 jg de TPCS<2>a. Iluminado como se describe.
En la figura 5A se muestran los valores promedio (% de células CD44+ específicas de antígeno de las células CD8+ totales) para los grupos experimentales. Se puede observar que los adyuvantes CpG y poli(IC) cuando se utilizaron solos tuvieron un efecto muy modesto (para CpG) o no significativo (para poli(IC), y que PCI utilizado solo fue sustancialmente más potente que cualquiera de estos adyuvantes. Sin embargo, se observó un claro efecto sinérgico cuando se utilizó PCI en combinación con CpG o poli(IC), y fue más prominente para la combinación PCI+Poli(IC).
En la figura 5B se muestran los resultados del ELISA de interferón-gamma (IFN-y) después de la reestimulación de las células del bazo con el péptido SIINFEKL. En primer lugar, se puede observar que la producción de IFN-y dependía totalmente de la reestimulación (las barras de las células no estimuladas apenas son visibles), lo que demuestra que la producción era estrictamente específica de antígeno. También se puede observar que si bien no hubo prácticamente ningún efecto con las células de los grupos CpG o Poli(IC) (ni con OVA solo), en todos los grupos tratados con PCI se pudo observar un fuerte efecto de reestimulación, de nuevo con un efecto sinérgico en los grupos PCI+CpG y PCI+Poli(IC), con este último representando la mejor combinación.
Para los ejemplos 4 a 16 se emplearon los siguientes materiales y métodos: Animales
Se adquirieron ratones C57BL/6 de Harlan (Horst, Países Bajos). Los ratones OT-I transgénicos con receptor de linfocitos T CD8 (B6.129S6-Rag2tm1 Fwa Tg(TcraTcrb)1100Mjb) fueron de Taconic Europe (Ry, Dinamarca) o de Jackson Laboratories (Bar Harbor, Maine). Los linfocitos T CD8 OT-I reconocen el epítopo SIINFEKL restringido a H-2Kb de la ovoalbúmina (OVA, aa257-264). Todos los ratones se mantuvieron en condiciones SPF y las autoridades veterinarias de Suiza y Noruega aprobaron los procedimientos realizados.
Materiales y células
La OVA de pollo se adquirió de Sigma-Aldrich (Buchs, Suiza), el péptido SIINFEKL de EMC microcollections (Tuebingen, Alemania), y el TRP-2 (secuencia SVYDFFVWL), gp100 (secuencia KVPRNQDWL) y HPV 16 E7 (secuencia GQAEPDR<a>H<y>NIVTFC<c>K<c>DSTLRLCVQSTHVDIR, el epítopo CD8 está subrayado) se obtuvieron de United Peptides (Herndon, VA). El poli IC, oligonucleótido CpG ODN2395, MPLA-SM, imiquimod y resiquimod eran de InvivoGen (San Diego, EE. UU.). El fotosensibilizador disulfonato de tetrafenil clorina (TPCS<2>a) era de PCI Biotech (Lysaker, Noruega).
Los pentámeros SIINFEKL, TRP-2 y HPV eran de Proimmune (Oxford, Reino Unido), (códigos de péptido Proinmune 093, 185 y 502H, respectivamente).
Fotosensibilización intradérmica e inmunización de ratones con células OT-1 transferidas de manera adoptiva. Un día antes de la inmunización, se aislaron bazos y ganglios linfáticos de ratones hembra OT-1, y se eliminaron los eritrocitos mediante lisis (RBC Lysing Buffer Hybri-Max de Sigma-Aldrich) de las suspensiones celulares homogeneizadas. Las células restantes se lavaron en PBS, se filtraron a través de filtros de nailon de 70 micrómetros y se administraron 2 * 106 células OT-1 mediante inyección intravenosa en ratones C57BL/6 hembra receptores; la transferencia adoptiva de linfocitos T CD8 específicos de SIINFEKL facilita el seguimiento de la respuesta inmunitaria mediante citometría de flujo. Un día u 8 horas después, se extrajo sangre de los ratones mediante sangrado de la cola y la sangre se recogió en tubos que contenían heparina para el análisis de la frecuencia inicial de linfocitos T CD8 específicos de OVA.
Para la inmunización intradérmica, se rasuró la zona abdominal de los ratones y las vacunas, consistentes en OVA o en mezclas de OVA, TPCS<2>a y diferentes adyuvantes, se inyectaron por vía intradérmica utilizando jeringas con agujas 29G. Las vacunas se mantuvieron protegidas de la luz y se utilizan en los 60 minutos posteriores a la preparación. Las vacunas se administraron en dos inyecciones de 50 j l cada una, en el lado izquierdo y derecho de la línea media abdominal. 18 horas después de la inyección de la vacuna, los ratones se anestesiaron mediante inyección intraperitoneal con una mezcla de ketamina (25 mg/kg de peso corporal) y xilazina (4 mg/kg), y se iluminaron como se describe a continuación de acuerdo con los experimentos individuales.
El día 7 se extrajo sangre de los ratones mediante sangrado de la cola y los eritrocitos se eliminaron por lisis antes del análisis de los linfocitos T CD8 específicos de antígeno mediante citometría de flujo. Al final del experimento (día 14), se sacrificaron los ratones y se analizaron los esplenocitos ex vivo.
Fotosensibilización intradérmica e inmunización de ratones normales.
Se rasuró la zona abdominal de los ratones y las vacunas, consistentes en proteína OVA o diferentes antígenos peptídicos (especificados en experimentos individuales), TPCS<2>a y distintos adyuvantes vacunales, se inyectaron por vía intradérmica utilizando jeringas con agujas 29G. Las vacunas se mantuvieron protegidas de la luz y se utilizan en los 60 minutos posteriores a la preparación. Las vacunas se administraron en dos inyecciones de 50 j l cada una, en el lado izquierdo y derecho de la línea media abdominal. Se utilizaron el antígeno y TPCS<2>a en diferentes dosis (especificadas en los experimentos individuales). En un momento específico después de la inyección de la vacuna (generalmente 18 horas, pero diferente en algunos experimentos), los ratones se anestesiaron mediante inyección intraperitoneal con una mezcla de ketamina (25 mg/kg de peso corporal) y xilazina (4 mg/kg), y se iluminaron como se describe de acuerdo con los experimentos individuales.
El día 7 (o en algunos casos el día 6) después de la inmunización, se extrajo sangre de los ratones mediante sangrado de la cola y los eritrocitos se eliminaron por lisis antes del análisis de los linfocitos T CD8 específicos de antígeno mediante citometría de flujo. En algunos experimentos, los ratones recibieron inmunizaciones múltiples (2 o 3) en puntos temporales especificados de acuerdo con los experimentos individuales. En estos casos, se extrajeron muestras de sangre 6 o 7 días después de la inmunización y se analizaron mediante citometría de flujo como se describe a continuación.
Iluminación de ratones inmunizados.
En algunos experimentos, TPCS2a se activó mediante iluminación con LumiSource™ (PCI Biotech). En general, la iluminación con LumiSource se realizó durante 6 min, 18 horas después de la inmunización, pero con alguna variación en algunos experimentos como se describe a continuación. En otros experimentos, se utilizó un dispositivo de iluminación basado en LED que emite luz azul como se describe a continuación (PCI Biotech AS), y en algunos experimentos se utilizó el láser de diodo PCI 652 nm del sistema de láser SN 576003 (PCI Biotech AS) para la iluminación.
Análisis de las respuestas inmunitarias mediante tinción de pentámeros.
La frecuencia de linfocitos T CD8 específicos de antígeno en la sangre se controló mediante citometría de flujo después de teñir las células con anticuerpos anti-CD8 y anti-CD44 y diferentes pentámeros correspondientes al antígeno utilizado. El estado de activación de las células se analizó mediante el análisis de la expresión de CD44 mediante citometría de flujo. Las células se analizaron utilizando FACSCanto (BD Biosciences, San José, EE. UU.) y con el programa informático FlowJo 8.5.2 (Tree Star, Inc., Ashland, OR).
Análisis de las respuestas inmunitarias mediante ELISA.
Para el análisis ELISA, se reestimularon 2 * 10<5>esplenocitos en placas de 96 pocillos con 0,005 pg/ml del péptido SIINFEKL. Después de 72 horas, se recogieron los sobrenadantes y se analizaron para IFN-<y>mediante ELISA (eBioscience, realizado de acuerdo con las instrucciones del fabricante).
Ejemplo 4: Efecto de PCI con OVA y poli(IC) en ratones normales.
El experimento se realizó como se describe anteriormente para la vacunación de ratones normales. Los animales se inmunizaron el día 0 y el día 14 con una mezcla de 200 pg de proteína OVA, 150 pg de TPCS2a y 50 pg de poli(IC) como se especifica a continuación. La iluminación durante 6 minutos se realizó con el dispositivo de iluminación LumiSource, 18 horas después de la inmunización. Las muestras de sangre del día 7 después de cada inmunización se tiñeron con el pentámero SIINFEKL, anticuerpos CD8 y CD44, y se analizaron mediante citometría de flujo como se describe. Se incluyeron los siguientes grupos experimentales:
1. Sin tratamiento: Los ratones no se inmunizaron ni se iluminaron.
2. OVA 200: Los ratones se inmunizaron con 200 pg de OVA. No se iluminaron.
3. OVA 200/PCI: Los ratones se inmunizaron con una mezcla de 200 pg de OVA y 150 pg de TPCS2a, y se iluminaron.
4. OVA 200/poli(IC): Los ratones se inmunizaron con una mezcla de 200 pg de OVA y 50 pg de poli(IC). No se iluminaron.
5. OVA 200/poli(IC): Los ratones se inmunizaron con una mezcla de 200 pg de OVA, 150 pg de TPCS2a y 50 pg de poli(IC), y se iluminaron.
En la figura 6 se muestran los valores promedio (% de células CD44+ específicas de antígeno de las células CD8+ totales) para los grupos experimentales (5 animales en cada grupo) después de la 1.a y 2.a inmunización. En particular, se puede observar que después de la 2.a inmunización, la combinación de PCI y poli(IC) (grupo 5) proporcionó una inmunización sustancialmente mejor que solo poli(IC) (grupo 4) o solo PCI (grupo 3).
Ejemplo 5: Efecto de PCI con SIINFEKL y poli(IC) en ratones normales.
El experimento se realizó como se describe anteriormente para la vacunación de ratones normales. Los animales se inmunizaron el día 0 y el día 15 con una mezcla de 100 pg del péptido SIINFEKL, 100 pg de TPCS2a y 10 pg de poli(IC) como se especifica a continuación. La iluminación durante 6 minutos se realizó con el dispositivo de iluminación LumiSource, 18 horas después de la inmunización. Las muestras de sangre del día 7 después de cada inmunización se tiñeron con el pentámero SIINFEKL, anticuerpos CD8 y CD44, y se analizaron mediante citometría de flujo como se describe. Se incluyeron los siguientes grupos experimentales: 1234
1. Sin tratamiento: Los ratones no se inmunizaron ni se iluminaron.
2. SIIN 100: Los ratones se inmunizaron con 100 pg de péptido SIINFEKL. No se iluminaron.
3. SIIN 100/PCI: Los ratones se inmunizaron con una mezcla de 100 pg de péptido SIINFEKL y 100 pg de TPCS2a, y se iluminaron.
4. SIIN 100/poli(IC): Los ratones se inmunizaron con una mezcla de 100 pg de péptido SIINFEKL y 10 pg de poli(IC). No se iluminaron.
5. SIIN 100/poli(IC)/PCI: Los ratones se inmunizaron con una mezcla de 100 |jg de péptido SIINFEKL, 100 |jg de TPCS<2>a y 10 jg de poli(IC), y se iluminaron.
En la figura 7 se muestran los valores para los animales individuales en el experimento después de la 2.a inmunización, que muestra que con la combinación de PCI+Poli(IC) (grupo 5) todos los animales respondieron a la inmunización, mientras que en los otros grupos solo hubo un animal con respuesta débil (en el grupo SIIN 100/PCI).
Ejemplo 6: Efecto de PCI con péptidos antigénicos de melanoma y poli(IC) en ratones normales.
El experimento se realizó como se describe anteriormente para la vacunación de ratones normales. Los animales se inmunizaron el día 0 y el día 14 con una mezcla de péptido TRP-2 y péptido gp-100 (50 jg de cada uno), 100 jg de TPCS<2>a y 10 jg de poli(IC) como se especifica a continuación. La iluminación durante 6 min se realizó con el dispositivo de iluminación LumiSource, 18 horas después de la inmunización. Las muestras de sangre del día 7 después de cada inmunización se tiñeron con pentámeros TRP-2, anticuerpos CD8 y CD44, y se analizaron mediante citometría de flujo como se describe. Se incluyeron los siguientes grupos experimentales:
1. Sin tratamiento TRP-2: Los ratones no se inmunizaron ni se iluminaron, las muestras de sangre se tiñeron con pentámero TRP-2.
2. TRP-2/poli(IC): Los ratones se inmunizaron con la mezcla de péptidos TRP-2 y gp100 y 10 jg de poli(IC). No se iluminaron. Las muestras de sangre se tiñeron con pentámero TRP-2.
3. TRP-2/PCI: Los ratones se inmunizaron con la mezcla de péptidos TRP-2 y gp100 y 100 jg de TPCS<2>a, y se iluminaron. Las muestras de sangre se tiñeron con pentámero TRP-2.
4. TRP-2/poli(IC)/PCI: Los ratones se inmunizaron con la mezcla de péptidos TRP-2 y gp100, 100 jg de TPCS<2>a y 10 jg de poli(IC), y se iluminaron. Las muestras de sangre se tiñeron con pentámero TRP-2.
En la figura 8 se muestran los valores promedio (% de células CD44+ específicas de antígeno de las células CD8+ totales) para los grupos experimentales teñidos con el pentámero TRP-2 después de la 2.a inmunización. Se puede observar que cuando se utilizó el antígeno TRP-2 con poli(IC) solo (grupo 2) o con PCI solo (grupo 3) no se observó un aumento significativo de células específicas de antígeno con respecto a lo que se observó en animales no tratados. En comparación, la combinación de poli(IC) y PCI (grupo 4) produjo un claro efecto sinérgico que condujo a un aumento significativo en el número de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno.
Ejemplo 7: Análisis de PCI con OVA y poli(IC) en ratones normales con iluminación de luz roja.
El experimento se realizó como se describe para la vacunación de ratones normales en materiales y métodos. Los animales se inmunizaron el día 0 y el día 14 con una mezcla de 10 o 100 jg de proteína OVA, 150 jg de TPCS<2>a y 10 o 50 jg de poli(IC) como se especifica a continuación. La iluminación se realizó con el láser de diodo SN 576003 del sistema de láser de PCI 652 nm con una dosis de luz de 0,3 J/cm2, administrada con una tasa de fluencia de 0. 81.mW/cm2 (es decir, tiempo de iluminación de aproximadamente 6 min). Las muestras de sangre del día 7 después de cada inmunización se tiñeron con el pentámero SIINFEKL, anticuerpos CD8 y CD44, y se analizaron mediante citometría de flujo como se describe. Se incluyeron los siguientes grupos experimentales:
1. Sin tratamiento: Los ratones no se inmunizaron ni se iluminaron.
2. OVA 10: Los ratones se inmunizaron con 10 jg de OVA. No se iluminaron.
3. OVA 100: Los ratones se inmunizaron con 100 jg de OVA. No se iluminaron.
4. OVA 10/PCI con luz roja: Los ratones se inmunizaron con una mezcla de 10 jg de OVA y 150 jg de TPCS<2>a, y se iluminaron.
5. OVA 100/PCI con luz roja: Los ratones se inmunizaron con una mezcla de 100 jg de OVA y 150 jg de TPCS<2>a, y se iluminaron.
6. OVA 10/PCI con luz roja+poli(IC): Los ratones se inmunizaron con una mezcla de 10 jg de OVA, 150 jg de TPCS<2>a y 50 jg de poli(IC) (1.a vacunación) o 10 jg de poli(IC) (2.a vacunación), y se iluminaron.
7.<o>V<a>100/PCI con luz roja+poli(IC): Los ratones se inmunizaron con una mezcla de 100 jg de OVA, 150 jg de TPCS<2>a y 50 jg de poli(IC) (1.a inmunización) o 10 jg de poli(IC) (2.a inmunización), y se iluminaron.
En la figura 9 se muestran los valores promedio (% de células CD44+ específicas de antígeno de las células CD8+ totales) para los grupos experimentales después de la 1.a y 2.a inmunización con iluminación de luz roja para activar el fotosensibilizador. Se puede observar que con 10 jg de antígeno OVA se necesitaba la combinación de poli(IC) y PCI (grupo 6) para lograr una respuesta inmunitaria, el antígeno solo o combinado con PCI (grupo 4) no produjo ningún efecto de inmunización. Con 100 jg de antígeno OVA hubo un ligero efecto con el antígeno solo (grupo 3), pero el efecto con la combinación de poli(IC)+PCI (grupo 7) fue sustancialmente mejor.
Ejemplo 8: Análisis de PCI con SIINFEKL y poli(IC) en ratones normales.
El experimento se realizó como se describe anteriormente para la vacunación de ratones normales. Los animales se inmunizaron el día 0 y el día 14 con una mezcla de 50 jg del péptido SIINFEKL, 100 jg de TPCS<2>a y 10 jg de poli(IC) como se especifica a continuación. La iluminación durante 6 min se realizó con el dispositivo de iluminación LumiSource, 18 horas después de la inmunización. Las muestras de sangre del día 7 después de cada inmunización se tiñeron con el pentámero SIINFEKL, anticuerpos CD8 y CD44, y se analizaron mediante citometría de flujo como se describe. Se incluyeron los siguientes grupos experimentales:
1. Sin tratamiento: Los ratones no se inmunizaron ni se iluminaron.
2. SIIN 50: Los ratones se inmunizaron con 50 |jg de péptido SIINFEKL. No se iluminaron.
3. SIIN 50/PCI: Los ratones se inmunizaron con una mezcla de 50 jg de péptido SIINFEKL y 100 jg de TPCS<2>a, y se iluminaron.
4. SIIN 50/poli(IC): Los ratones se inmunizaron con una mezcla de 100 jg de péptido SIINFEKL y 10 jg de poli(IC). No se iluminaron.
5. SIIN 50/poli(IC)/PCI: Los ratones se inmunizaron con una mezcla de 50 jg de péptido SIINFEKL, 100 jg de TPCS<2>a y 10 jg de poli(IC), y se iluminaron.
En la figura 10 se muestran los valores promedio (% de células CD44+ específicas de antígeno de las células CD8+ totales) para los grupos experimentales (las barras de error son el error estándar de la media) después de la 1.a (día 7) y 2.a (día 21) inmunización. Se puede observar que la combinación de poli(IC) y PCI (grupo 5) dio una respuesta de inmunización fuerte mientras que no se observó respuesta en ninguno de los otros grupos. La combinación de poli(IC)+PCI proporciona así un fuerte efecto sinérgico.
Ejemplo 9: Análisis de PCI con SIINFEKL y poli(IC) en ratones normales.
El experimento se realizó como se describe anteriormente para la vacunación de ratones normales. Los animales se inmunizaron el día 0 y el día 14 con una mezcla de 100 jg del péptido SIINFEKL, 150 jg de TPCS<2>a y 50 jg de poli(IC) (este último solo en la 1.a inmunización) como se especifica a continuación. La iluminación durante 6 min se realizó con el dispositivo de iluminación LumiSource, 18 horas después de la inmunización. Las muestras de sangre del día 7 después de cada inmunización se tiñeron con el pentámero SIINFEKL, anticuerpos CD8 y CD44, y se analizaron mediante citometría de flujo como se describe. El día 28 se sacrificaron los animales, se recogieron los bazos y las células del bazo se reestimularon con péptido SIINFEKL y se analizaron mediante ELISA como se describe en los métodos. Se incluyeron los siguientes grupos experimentales:
1. Sin tratamiento: Los ratones no se inmunizaron ni se iluminaron.
2. 2 x SIIN 100: Los ratones se inmunizaron con 100 jg de péptido SIINFEKL en ambas inmunizaciones. No se iluminaron.
3. 2 x SIIN 100/PCI: Los ratones se inmunizaron con 100 jg de péptido SIINFEKL y 150 jg de TPCS<2>a en ambas inmunizaciones, y se iluminaron.
4. 1 x SIIN 100/poli(IC) / 1x SIIN 100: Los ratones se inmunizaron con una mezcla de 100 jg de péptido SIINFEKL y 50 jg de poli(IC) (1.a inmunización); y 100 jg de péptido SIINFEKL (2.a inmunización). No se iluminaron.
5. 1 x SIIN 100/poli(IC)/PCI; 1x SI<i>N 100/PCI: Los ratones se inmunizaron con una mezcla de 100 jg de péptido SIINFEKL, 150 jg de TpCS<2>a y 50 jg de poli(IC) (1.a inmunización); y 100 jg de péptido SIINFEKL y 150 jg de TpCS<2>a (2.a inmunización). Se iluminaron en ambas inmunizaciones.
En la figura 11 se muestran los valores promedio (% de células CD44+ específicas de antígeno de las células CD8+ totales) para los grupos experimentales después de la 1.a (día 7) y 2.a (día 21) inmunización. Se puede observar que la combinación de poli(IC) y PCI (grupo 5) da una muy buena respuesta inmunitaria, incluso si esta combinación se utiliza solo en la 1.a inmunización, con solo PCI para la 2.a inmunización.
En la figura 12 se muestran los valores promedio de ELISA en células de bazo con o sin reestimulación con péptido SIINFEKL como se indica en la figura. Se puede observar que mientras el tratamiento realizado en el grupo experimental 5 (1.a inmunización con la combinación de PCI y poli(IC); 2.a inmunización con PCI solo) indujo un aumento sustancial en la producción de interferón-gamma después de la reestimulación, esto no pudo observarse en ningún otro de los grupos experimentales.
Ejemplo 10: Análisis de los efectos de MPLA o imiquimod
El experimento se realizó como se describe anteriormente para la vacunación de ratones normales. Los animales se inmunizaron el día 0 y el día 14 con una mezcla de 200 jg de proteína OVA, 100 jg de TPCS<2>a y 50 jg de imiquimod o 10 jg de MPLA-SM como se especifica a continuación. La iluminación durante 6 min se realizó con el dispositivo de iluminación LumiSource, 18 horas después de la inmunización. Las muestras de sangre del día 7 después de cada inmunización se tiñeron con el pentámero SIINFEKL, anticuerpos CD8 y CD44, y se analizaron mediante citometría de flujo como se describe. Se incluyeron los siguientes grupos experimentales: 1234567
1. Sin tratamiento: Los ratones no se inmunizaron ni se iluminaron.
2. OVA 200: Los ratones se inmunizaron con 200 jg de OVA. No se iluminaron.
3. OVA 200/PCI: Los ratones se inmunizaron con una mezcla de 200 jg de OVA y 100 jg de TPCS<2>a, y se iluminaron.
4. OVA 200/imiquimod: Los ratones se inmunizaron con una mezcla de 200 jg de OVA y 50 jg de imiquimod. No se iluminaron.
5. OVA 200/imiquimod/PCI: Los ratones se inmunizaron con una mezcla de 200 jg de OVA, 100 jg de TPCS<2>a y 50 jg de imiquimod, y se iluminaron.
6. OVA 200/MPLA: Los ratones se inmunizaron con una mezcla de 200 jg de OVA y 10 jg de MPLA-SM. No se iluminaron.
7. OVA 200/MPLA/PCI: Los ratones se inmunizaron con una mezcla de 200 jg de OVA, 100 jg de TPCS<2>a y 10 jg de MPLA-SM, y se iluminaron.
En la figura 13 se muestran los valores promedio (% de células CD44+ específicas de antígeno de las células CD8+ totales) para los grupos experimentales (5 animales en cada grupo, las barras de error son desviación típica) después de la 1.a y 2.a inmunización. Se puede observar que cuando se utiliza la proteína OVA como antígeno tanto para el imiquimod (grupo 5) como para los adyuvantes de MPLA (grupo 7), la combinación con PCI indujo un efecto de inmunización sustancialmente mejor que el que se logró usando los adyuvantes solos (grupos 4 y 6, respectivamente).
Ejemplo 11: PCI con SIINFEKL y poli(IC) en ratones normales, respuesta de memoria después de la 3.a inmunización. El experimento se realizó como se describe para la vacunación de ratones normales en materiales y métodos. Los animales se inmunizaron el día 0 y el día 14 con una mezcla de 50 |jg del péptido SIINFEKL, 100 |jg de TPCS<2>a y 10 jg de poli(IC) como se especifica a continuación. La generación de memoria inmunitaria se probó mediante una 3.a inmunización el día 51 con un tratamiento de PCI+poli(IC). La iluminación durante 6 min se realizó con el dispositivo de iluminación LumiSource, 18 horas después de la inmunización. Las muestras de sangre del día 8 (1.a inmunización), 7 (2.a inmunización) o 6 (3.a inmunización) después de cada inmunización se tiñeron con pentámero SIINFEKL, anticuerpos CD8 y CD44, y se analizaron mediante citometría de flujo como se describe. Se incluyeron los siguientes grupos experimentales:
1. Sin tratamiento: Los ratones no se inmunizaron ni se iluminaron.
2. SIIN50 Poli(IC)/Poli(IC)+PCI: En las dos primeras inmunizaciones, los ratones se inmunizaron con 50 jg de péptido SIINFEKL y 10 jg de poli(IC). No se iluminaron. En la 3.a inmunización, los ratones se inmunizaron con 50 jg de péptido SIINFEKL, 100 jg de TPCS<2>a y 10 jg de poli(IC). Los ratones se iluminaron.
3. SIIN50 Poli(IC)+PCI/SIIN 50 PCI: En las dos primeras inmunizaciones, los ratones se inmunizaron con 50 jg de péptido SIINFEKL, 100 jg de TPCS<2>a y 10 jg de poli(IC). En la 3.a inmunización, los ratones se inmunizaron con 50 jg de péptido SIINFEKL y 100 jg de TPCS<2>a. Los ratones se iluminaron en las tres inmunizaciones.
En la figura 14 se muestra el % de células CD44+ específicas de antígeno de las células CD8+ totales para los grupos experimentales después de cada una de las tres inmunizaciones. Se puede observar que la combinación de poli(IC) y PCI indujo una respuesta inmunitaria muy fuerte y un aumento significativo debido a la 3.a inmunización, incluso cuando la 3.a inmunización se realizó sólo con PCI (grupo 3). Por el contrario, cuando solo se utilizó poli(IC) en las dos primeras inmunizaciones, prácticamente no hubo respuesta inmunitaria, y cuando se realizó la 3.a inmunización con poli(IC)+PCI no pareció potenciar la inmunización en ningún grado significativo. Junto con los resultados que se muestran en la figura 11 y la figura 12, los resultados indican que con los antígenos peptídicos, la combinación de poli(IC) y PCI es necesaria y suficiente para iniciar una respuesta inmunitaria, pero que esta respuesta inmunitaria puede potenciarse posteriormente con PCI solo. Por el contrario, el poli(IC) por sí solo no puede iniciar una respuesta inmunitaria, incluso después de dos inmunizaciones con poli(IC) y no se observó respuesta inmunitaria y el intento de reforzar la respuesta mediante una tercera vacunación con poli(IC)+PCI no tuvo éxito, lo que indica la falta total de iniciación de una respuesta inmunitaria con poli(IC) solo. Los datos también muestran que la respuesta inmunitaria generada con la combinación de poli(IC)+PCI es duradera, ya que podría potenciarse fuertemente con una 3.a inmunización administrada 37 días después de la 2.a inmunización.
Ejemplo 12: Efecto de PCI con antígeno peptídico de HPV y poli(IC) en ratones normales.
El experimento se realizó como se describe para la vacunación de ratones normales en materiales y métodos. Los animales se inmunizaron el día 0 y el día 14 con una mezcla de 50 jg de los antígenos peptídicos h Pv o SIINFEKL, 100 jg de TPCS<2>a y 10 jg de poli(IC) como se especifica a continuación. Los animales se sometieron a 3 inmunizaciones en los días 7, 14 y 51 como se especifica a continuación. La iluminación durante 6 min se realizó con el dispositivo de iluminación LumiSource, 18 horas después de la inmunización. Las muestras de sangre del día 8 (1.a inmunización), 7 (2.a inmunización) o 6 (3.a inmunización) después de cada inmunización se tiñeron con el pentámero HPV o SIINFEKL, anticuerpos CD8 y CD44, y se analizaron mediante citometría de flujo como se describe. Se incluyeron los siguientes grupos experimentales:
1. Sin tratamiento SIIN: Los ratones no se inmunizaron ni se iluminaron. Las muestras de sangre se tiñeron con el pentámero SIINFEKL.
2. Sin tratamiento HPV: Los ratones no se inmunizaron ni se iluminaron. Las muestras de sangre se tiñeron con pentámero de HPV.
3. SIIN50 Poli(IC)/Poli(IC)+PCI: En las dos primeras inmunizaciones, los ratones se inmunizaron con 50 jg de péptido SIINFEKL y 10 jg de poli(IC). No se iluminaron. En la 3.a inmunización, los ratones se inmunizaron con 50 jg de péptido SIINFEKL, 100 jg de TPCS<2>a y 10 jg de poli(IC). Los ratones se iluminaron.
4. HPV 50: Los ratones se inmunizaron con 50 jg de péptido de HPV en las tres inmunizaciones. Los ratones no se iluminaron.
5. HPV 50/PCI/ HPV 50 poli(IC)+PCI (3.a): En las dos primeras inmunizaciones, los ratones se inmunizaron con 50 jg de péptido HPV y 100 jg de TPCS<2>a. En la 3.a inmunización, los ratones se inmunizaron con 50 jg de péptido HPV, 100 jg de TPCS<2>a y 10 jg de poli(IC). Los ratones se iluminaron en las tres inmunizaciones.
6. HPV 50/Poli(IC) / HPV 50 poli(IC)+PCI (3.a): En las dos primeras inmunizaciones, los ratones se inmunizaron con 50 jg de péptido HPV y 10 jg de poli(IC). No se iluminaron. En la 3.a inmunización, los ratones se inmunizaron con 50 jg de péptido HPV, 100 jg de TPCS<2>a y 10 jg de poli(IC). Los ratones se iluminaron.
En la figura 15 se muestra el % de células CD44+ específicas de antígeno de las células CD8+ totales para los grupos experimentales después de tres inmunizaciones. Se puede observar que en el grupo 6 se indujo una respuesta inmunitaria específica de HPV, de aproximadamente la misma magnitud que la lograda con el péptido SIINFEKL con idénticas condiciones de inmunización (grupo 3). Esto indica que la combinación de PCI y poli(IC) también es eficaz para inducir una respuesta inmunitaria frente al antígeno E7 del HPV vírico y asociado al cáncer, y también que PCI+Poli(IC) induce una respuesta inmunitaria frente a un antígeno peptídico largo (35 aminoácidos), que probablemente necesita absorción intracelular y procesamiento proteolítico antes de poder presentarse en el MHC de clase I. Esto contrasta con el SIINFEKL y los antígenos peptídicos del melanoma que pueden presentarse sin procesamiento.
Ejemplo 13: Efecto del tiempo de iluminación
El experimento se realizó como se describe anteriormente para la vacunación de ratones normales. Los animales se inmunizaron el día 0 y el día 14 con 200 |jg de proteína OVA, 150 |jg de TPCS<2>a y 10 |jg de poli(IC) como se especifica a continuación. En todos los grupos, se inyectó TPCS<2>a 18 h antes de la iluminación, mientras que el antígeno OVA y el poli(IC) se inyectaron 18 h antes de la iluminación en una mezcla con TPCS<2>a, o 2 h antes de la iluminación como una inyección separada. La iluminación fue durante 6 min con el dispositivo de iluminación LumiSource. Las muestras de sangre del día 7 después de cada inmunización se tiñeron con el pentámero SIINFEKL, anticuerpos CD8 y CD44, y se analizaron mediante citometría de flujo como se describe. Se incluyeron los siguientes grupos experimentales:
1. Sin tratamiento: Los ratones no se inmunizaron ni se iluminaron.
2. OVA 200: Los ratones se inmunizaron con 200 jg de OVA. No recibieron TPCS<2>a y no se iluminaron.
3. OVA 200 PCI (2 h): Se inyectaron los ratones con TPCS<2>a 18 h antes de la iluminación y se inmunizaron con 200 jg de OVA 2 h antes de la iluminación.
4. OVA 200 PCI (18 h): Los ratones se inmunizaron con TPCS<2>a y OVA 18 h antes de la iluminación.
5. OVA 200 PCI P(IC) (2 h): Los ratones se inyectaron con TPCS<2>a 18 h antes de la iluminación y se inmunizaron con 200 jg de OVA 10 jg Poli(IC) 2 h antes de la iluminación.
En la figura 16 se muestran los valores promedio (% de células CD44+ específicas de antígeno de las células CD8+ totales) para los grupos experimentales (5 animales en cada grupo, las barras de error son desviación típica) después de la 1.a y 2.a inmunización. Se puede observar que la respuesta inmunitaria se potencia mediante la combinación de poli(IC)+PCI también cuando se administra el antígeno+poli(IC) sólo 2 horas antes de la iluminación.
Ejemplo 14: Efecto de PCI con el péptido SIINFEKL y poli(IC) en ratones normales. PCI+poli(IC) en comparación con poli(IC) con tres inmunizaciones.
El experimento se realizó como se describe para la vacunación de ratones normales en materiales y métodos. Los animales se inmunizaron el día 0, el día 14 y el día 42 con una mezcla de 50 jg de péptido SIINFEKL y 100 jg de TPCS<2>a y 10 jg de poli(IC) como se especifica a continuación. La iluminación durante 6 min se realizó con el dispositivo de iluminación LumiSource, 18 horas después de la inmunización. Las muestras de sangre del día 7 después de cada inmunización se tiñeron con el pentámero SIINFEKL, anticuerpos CD8 y CD44, y se analizaron mediante citometría de flujo como se describe. Se incluyeron los siguientes grupos experimentales:
1. Sin tratamiento SIIN: Los ratones no se inmunizaron ni se iluminaron, las muestras de sangre se tiñeron con pentámero SIIN.
2. SIIN/poli(IC): Los ratones se inmunizaron tres veces con una mezcla de 50 jg de péptido SIINFEKL y 10 jg de poli(IC). No se iluminaron.
3. SIIN/poli(IC)/PCI: Los ratones se inmunizaron con una mezcla de 50 jg de péptido SIINFEKL, 100 jg de TPCS<2>a y 10 jg de poli(IC), y se iluminaron.
En la figura 17 se muestra un diagrama de puntos de citometría de flujo después de la 3.a inmunización de un animal típico en los tres grupos experimentales que muestra claramente la respuesta muy fuerte inducida por la combinación de poli(IC)+PCI.
En la figura 18 se muestran los valores promedio (% de células CD44+ específicas de antígeno de las células CD8+ totales) después de cada una de las 3 inmunizaciones. Se puede observar que la combinación PCI+Poli(IC) indujo una respuesta inmunitaria muy fuerte que dio como resultado aproximadamente un 30 % de linfocitos T<c>D8 específicos de antígeno en las muestras de sangre después de la 3.a inmunización. En comparación, 3 inmunizaciones con antígeno y el adyuvante poli(IC) solo tuvieron un efecto muy pequeño (0,28 % de células positivas después de la 3.a inmunización).
Ejemplo 15: Efecto de PCI con antígeno peptídico largo de HPV y poli(IC) en ratones normales.
El experimento se realizó como se describe anteriormente para la vacunación de ratones normales. Se utilizó la secuencia del HPV 16 E7 GQAEPD RAHYNIVTFCCKCDSTLLRLCVQSTHVDIR como antígeno peptídico "largo". Los animales se inmunizaron el día 0 y el día 14 con una mezcla de 50 jg de antígeno de péptido largo de HPV, 100 jg de TPCS<2>a y 10 jg de poli(IC) (p(IC) como se especifica a continuación). Los animales se sometieron a 2 inmunizaciones en los días 7 y 14 como se especifica a continuación. La iluminación durante 6 min se realizó con el dispositivo de iluminación LumiSource, 18 horas después de la inmunización. Las muestras de sangre del día 6 después de cada inmunización se tiñeron con el pentámero de HPV, anticuerpos CD8 y CD44, y se analizaron mediante citometría de flujo como se describe. Se incluyeron los siguientes grupos experimentales:
1. 2 x HPV: Los ratones se inmunizaron 2 veces con 50 |jg de péptido largo de HPV. Los ratones no se iluminaron 2. 2 x HPV+p(IC): Los ratones se inmunizaron 2 veces con una mezcla de 50 jg de péptido largo de HPV y 10 jg de poli(IC). Los ratones no se iluminaron.
3. 2 x HPV+p(IC)+PCI: Los ratones se inmunizaron 2 veces con una mezcla de 50 jg de péptido largo de HPV, 10 jg de poli(IC) y 100 jg de TPCS<2>a. Los ratones se iluminaron en ambas inmunizaciones.
4. 1: HPV+p(IC)+PCI. 2: HPV+ PCI: Los ratones se inmunizaron con una mezcla de 50 jg de péptido largo de HPV, 10 jg de poli(ic) y 100 jg de TPCS<2>a (1.a inmunización), y 50 jg de péptido largo de HPV y 100 jg de TPCS<2>a (2.a inmunización). Los ratones se iluminaron en ambas inmunizaciones.
5. 1: HPV+PCI. 2: HPV+p(IC)+ PCI: Los ratones se inmunizaron con una mezcla de 50 jg de péptido largo de HPV y 100 jg de TPCS<2>a (1.a inmunización), y 50 jg de péptido largo de HPV, 10 jg de poli(IC) y 100 jg de TPCS<2>a (2.a inmunización). Los ratones se iluminaron en ambas inmunizaciones.
En la figura 19 se muestra el % de células CD44+ específicas de antígeno de las células CD8+ totales para los grupos experimentales después de dos inmunizaciones. Se puede observar que en el grupo 3 (2 inmunizaciones con la combinación PCI+p(lC)) se indujo una fuerte respuesta inmunitaria específica de HPV, mientras que en los grupos 4 y 5 (una inmunización con combinación de PCI+p(IC), una con PCI solo) se observó una respuesta inmunitaria más débil, pero aún significativa, en comparación con los grupos experimentales donde no se empleó PCI (grupos 1 y 2). Esto demuestra que la combinación de PCI y poli(IC) es eficaz para inducir una respuesta inmunitaria frente al antígeno de HPV E7 vírico y asociado al cáncer, y que dos inmunizaciones con esta combinación son más eficaces que una inmunización de este tipo combinada con una inmunización con PCI solo. También muestra que con el antígeno peptídico largo de HPV, el adyuvante p (IC) no tiene efecto cuando se utiliza sin la combinación con PCI.
Ejemplo 16: Efecto de PCI con antígeno peptídico corto de HPV y poli(IC) en ratones normales.
El experimento se realizó como se describe anteriormente para la vacunación de ratones normales. El epítopo E7 CD8 de HPV 16 RAHYNIVTF se utilizó como antígeno peptídico "corto". Los animales se inmunizaron el día 0 y el día 13 con una mezcla de 50 jg de antígeno peptídico corto de HPV, 100 jg de TPCS<2>a y 10 jg de poli(IC) (p(IC) como se especifica a continuación). Los animales se sometieron a 2 inmunizaciones en los días 7 y 13 como se especifica a continuación. La iluminación durante 6 min se realizó con el dispositivo de iluminación LumiSource, 18 horas después de la inmunización. Las muestras de sangre del día 6 después de cada inmunización se tiñeron con el pentámero de HPV, anticuerpos CD8 y CD44, y se analizaron mediante citometría de flujo como se describe. Se incluyeron los siguientes grupos experimentales:
1. Sin tratamiento. Los ratones no si inmunizaron ni se iluminaron.
2. 2 x corto de HPV: Los ratones se inmunizaron 2 veces con 50 jg de péptido corto de HPV. Los ratones no se iluminaron
3. 2 x corto de HPV p(IC): Los ratones se inmunizaron 2 veces con una mezcla de 50 jg de péptido corto de HPV y 10 jg de poli(IC). Los ratones no se iluminaron.
4. 2 x corto de HPV+PCI: Los ratones se inmunizaron 2 veces con una mezcla de 50 jg de péptido corto de HPV, 10 jg de poli(IC) y 100 jg de TPCS<2>a. Los ratones se iluminaron en ambas inmunizaciones.
5. 2 x corto de h Pv p(IC) PCI: Los ratones se inmunizaron 2 veces con una mezcla de 50 jg de péptido corto de HPV, 10 jg de poli(IC) y 100 jg de TPCS<2>a. Los ratones se iluminaron en ambas inmunizaciones.
6. 1: corto de HPV p(IC)+PCI. 2: corto de HPV PCI: Los ratones se inmunizaron con una mezcla de 50 jg de péptido corto de HPV, 10 jg de poli(IC) y 100 jg de TPCS<2>a (1.a inmunización), y 50 jg de péptido corto de HPV y 100 jg de TPCS<2>a (2.a inmunización). Los ratones se iluminaron en ambas inmunizaciones.
En la figura 20 se muestra el % de células CD44+ específicas de antígeno de las células CD8+ totales /- EEM para los grupos experimentales después de dos inmunizaciones. Se puede observar que en ambos grupos (5 y 6) inmunizados con la combinación p(IC)+PCI se indujo una respuesta inmunitaria significativa, el mejor efecto se logró en el grupo 5 donde se empleó esta combinación para ambas inmunizaciones. En comparación, en los grupos en los que se utilizó solo p(IC) o solo PCI para ambas inmunizaciones, no se observó respuesta inmunitaria (en comparación con los animales no tratados (grupo 1) y los animales inmunizados solo con el antígeno (grupo 2)). Esto demuestra que la combinación de PCI y poli(IC) es eficaz para inducir una respuesta inmunitaria al antígeno E7 de HPV vírico y asociado al cáncer también cuando se administra como un péptido corto, y que dos inmunizaciones con la combinación p(IC)+PCI proporciona un fuerte efecto sinérgico en comparación con p(IC) solo o PCI solo.

Claims (14)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un método in vitro o ex vivo para expresar un péptido antigénico o una parte del mismo en la superficie de una célula, que comprende poner en contacto dicha célula con dicho péptido antigénico, un agente fotosensibilizante y un ligando de TLR, e irradiar la célula con luz de una longitud de onda eficaz para activar el agente fotosensibilizante, en donde dicho péptido antigénico se libera en el citosol de la célula y el péptido antigénico o una parte del mismo se presenta posteriormente en la superficie de la célula; en donde dicho ligando de TLR se selecciona de: i) un ligando de TLR2 que es un lipopolisacárido; ii) un ligando de TLR3 que es poli(I:C); iii) un ligando de TLR4 que es un lipopolisacárido o un monofosforil lípido A (MPLA); iv) un ligando de TLR7 que es (a) un compuesto de imidazoquinolina de fórmula (1) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
    en donde: R<1>es N-CH<2>-C(CHa)<2>-Ra; R<2>es -CH<2>-X-CH<2>CH<3>o un átomo de hidrógeno; R<3>es OH o un átomo de hidrógeno, y X es O o NH; o (b) ssPoliU; v) un ligando de TLR8 que es ssPoliU; y vi) un ligando de TLR9 que es un oligonucleótido CpG que es un oligonucleótido monocatenario de 6 a 50 bases que incluye al menos un motivo CpG y al menos una base que flanquea dicho motivo en cada uno de los lados 3' y 5'.
  2. 2. Un método como se reivindica en la reivindicación 1 en donde dicho ligando de TLR2 es un lipopolisacárido de Porphyromonas gingivalis.
  3. 3. Un método como se reivindica en la reivindicación 1 en donde dicho ligando de TLR4 es un lipopolisacárido de E. coli o de Salmonella minnesota o un monofosforil lípido A (MPLA) de Salmonella minnesota.
  4. 4. Un método como se reivindica en la reivindicación 1 en donde dicho ligando de TLR7 se selecciona de resiquimod, imiquimod y gardiquimod o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
  5. 5. Un método como se reivindica en la reivindicación 1 en donde dicho ligando de TLR7 es ssPoliU, que tiene una longitud de entre 20 y 200 nucleótidos.
  6. 6. Un método como se reivindica en la reivindicación 1 en donde dicho ligando de TLR9 es un oligonucleótido CpG que contiene una secuencia palindrómica de 8 a 16 bases de longitud, preferentemente en donde dicho oligonucleótido CpG tiene la secuencia: 5'-tcgtcgttttcggcgcgcgccg-3' o 5'-tccatgacgttcctgacgtt-3.
  7. 7. El método como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en donde: (a) el péptido antigénico es un antígeno de vacuna o componente de vacuna; (b) el péptido antigénico es un péptido de melanoma o un péptido del virus del papiloma humano (HPV); (c) la presentación antigénica de dicho péptido antigénico da como resultado la estimulación de una respuesta inmunitaria; y/o (d) el agente fotosensibilizante se selecciona de TPCS<2>a, AIPcS<2>a, TPPS<4>y TPBS<2>a, preferentemente TPCS<2>a.
  8. 8. El método como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en donde la célula es una célula presentadora de antígeno, preferentemente una célula dendrítica, y/o en donde dicha célula se pone en contacto con dicho péptido antigénico, agente fotosensibilizante y ligando de TLR de manera simultánea, separada o secuencial.
  9. 9. Una composición farmacéutica que comprende un péptido antigénico, un agente fotosensibilizante y un ligando de TLR, y uno o más diluyentes, vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables, en donde dicho péptido antigénico es como se define en la reivindicación 1 o 7, dicho agente fotosensibilizante es como se define en la reivindicación 1 o 7 y dicho ligando de TLR es como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
  10. 10. Un péptido antigénico, un agente fotosensibilizante y un ligando de TLR; o una composición que los comprende, para su uso en profilaxis, terapia y/o estimulación de una respuesta inmunitaria en un sujeto, en donde dicho péptido antigénico es como se define en la reivindicación 1 o 7, dicho agente fotosensibilizante es como se define en la reivindicación 1 o 7, dicho ligando de TLR es como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y dicha composición es como se define en la reivindicación 9, preferentemente para tratar o prevenir una enfermedad, trastorno o infección en dicho sujeto.
  11. 11. El péptido antigénico, agente fotosensibilizante y ligando de TLR para su uso como se reivindica en la reivindicación 10, en donde dicha profilaxis, terapia y/o estimulación de una respuesta inmunitaria comprenderá: (a) un método como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde preferentemente dicho método se utilizará para preparar una población de células, en donde preferentemente las células son células dendríticas y en donde preferentemente dicha población de células se administrará a dicho sujeto; o (b) administrar a dicho sujeto dicho péptido antigénico, agente fotosensibilizante y ligando de TLR, e irradiar dicho sujeto con luz de una longitud de onda eficaz para activar dicho agente fotosensibilizante para generar una respuesta inmunitaria, en donde dicho péptido antigénico, agente fotosensibilizante y ligando de TLR deben administrarse a dicho sujeto de manera simultánea, separada o secuencial; en donde preferentemente dicho sujeto es un mamífero, preferentemente un gato, perro, caballo, burro, oveja, cerdo, cabra, vaca, ratón, rata, conejo o cobaya, preferentemente un ser humano.
  12. 12. Un producto que comprende un péptido antigénico, un agente fotosensibilizante y un ligando de TLR como una preparación combinada para uso simultáneo, separado o secuencial para estimular una respuesta inmunitaria en un sujeto, en donde dicho péptido antigénico es como se define en la reivindicación 1 o 7, dicho agente fotosensibilizante es como se define en la reivindicación 1 o 7 y dicho ligando de TLR es como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, preferentemente para tratar o prevenir una enfermedad, trastorno o infección en dicho sujeto o para expresar un péptido antigénico o una parte del mismo en la superficie de una célula en un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
  13. 13. Un kit para su uso en la estimulación de una respuesta inmunitaria en un sujeto, preferentemente para tratar o prevenir una enfermedad, trastorno o infección en dicho sujeto o para expresar un péptido antigénico o una parte del mismo en la superficie de una célula en un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, comprendiendo dicho kit un primer recipiente que contiene un agente fotosensibilizante como se define en la reivindicación 1 o 7; un segundo recipiente que contiene dicho péptido antigénico como se define en la reivindicación 1 o 7; y un tercer recipiente que contiene un ligando de TLR como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
  14. 14. El péptido antigénico, agente fotosensibilizante y ligando de TLR para su uso como se reivindica en la reivindicación 10 u 11, el producto para su uso como se reivindica en la reivindicación 12 o el kit para su uso como se reivindica en la reivindicación 13, en donde el uso es para vacunación y/o para tratar o prevenir cáncer.
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