KR20160068751A - 백신접종 및 면역화를 위한 화합물 및 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 감광화 작용제, 항원 분자, 예를 들어, 백신 성분 및 광화학 내재화(PCI)-매개의 백신접종의 효과를 증진시키는 작용제의 사용 및 감광화 작용제를 활성화하기에 유효한 파장의 광으로의 조사를 포함하는 백신접종 또는 면역화 방법에 관한 것이며, 여기서, 작용제는 본원에 정의된 바와 같은 톨-유사 수용체(TLR)에 대한 리간드이다. 또한, 본 발명은 그러한 방법에 유용한 항원, 예를 들어, 백신 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기와 동일한 성분을 사용하여 항원 분자, 예를 들어, 백신 성분을 세포 내로 도입하여 항원 제시를 달성하는 단계를 포함하는, 면역 반응을 생성하기 위해, 예를 들어, 백신접종을 위해 사용될 수 있는 항원 제시 세포의 생성 방법 및 그러한 방법에 유용한 항원 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 면역 반응을 유도하기 위하여, 예를 들어, 백신접종을 달성하기 위하여 생체내에서 환자에게 투여하기 위한, 그러한 방법에 의해 시험관내에서 생성된 세포의 용도를 제공한다. 세포 내로의 항원 분자의 내재화 방법도 또한 제공된다.

Description

백신접종 및 면역화를 위한 화합물 및 방법{COMPOUND AND METHOD FOR VACCINATION AND IMMUNISATION}
본 발명은 감광화 작용제, 항원 분자, 예를 들어, 백신 성분 및 광화학 내재화(PCI)-매개의 백신접종(vaccination)의 효과를 증진시키는 작용제로서, 본원에 정의된 바와 같은 톨-유사 수용체(TLR)에 대한 리간드인 작용제의 사용, 및 감광화 작용제를 활성화시키는데 유효한 파장의 광으로의 조사를 포함하는 백신접종 또는 면역화 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 그러한 방법에 유용한 항원, 예를 들어, 백신 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기와 동일한 성분을 사용하여 항원 분자, 예를 들어, 백신 성분을 세포 내로 도입하여, 항원 제시를 달성하는 단계를 포함하는, 면역 반응을 생성하기 위해, 예를 들어, 백신접종을 위해 사용될 수 있는 항원 제시 세포의 생성 방법, 및 그러한 방법에 유용한 항원 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 면역 반응을 유도하기 위해, 예를 들어, 백신접종을 달성하기 위해 생체내에서 환자로 투여하기 위한, 그러한 방법에 의해 시험관내에서 생성되는 세포의 용도를 제공한다. 세포 내로의 항원 분자의 내재화 방법도 또한 제공된다.
백신접종은 면역계가 병원체에 대한 적응 면역의 발생을 자극하게 하기 위한 항원 분자의 투여를 포함한다. 백신은 감염을 예방하거나 그로부터의 이환율을 개선시킬 수 있다. 백신접종은 감염성 질환의 가장 효율적인 예방 방법이며, 백신접종으로 인한 보편화된 면역성은 세계적인 천연두의 근절과, 세계 다수 지역으로부터의 소아마비, 홍역 및 파상풍과 같은 질환의 제한의 주된 원인이다.
백신의 활성제는 온전하지만, 원인이 되는 병원체의 불활성화(비-감염성) 또는 약독화(감염성이 감소됨) 형태 또는 면역원성인 것으로 밝혀진 병원체의 정제된 성분(예를 들어, 바이러스의 외부 코트 단백질)일 수 있다. 독성 효과를 제거하지만 면역원성 효과를 유지하도록 하는 파상풍의 테타노스파스민(tetanospasmin) 독소의 변형과 같이 톡소이드는 독소-기반 질환에 대한 면역화를 위해 생성된다.
대부분의 백신이 세포내이입(endocytosis)을 통해 항원 제시 세포에 의해 흡수되며, 항원 분해 및 MHC 클래스-II 경로를 통한 제시를 위해 엔도좀을 통해 리소좀으로 운반되기 때문에, 백신접종은 주로 CD4 T-헬퍼 세포 및 B 세포를 활성화시킨다. 암 및 세포내 감염과 같은 장애 또는 질환과 싸우기 위하여, 세포독성 CD8 T-세포 반응의 자극이 중요하다. 그러나 세포독성 CD8 T 세포의 유도는 보통 항원을 시토졸로, 그리고 MHC 클래스-I 경로의 항원 제시로 전달함에 있어서의 어려움으로 인하여 실패한다. 광화학 내재화(PCI)는 시토졸로의 분자의 전달을 향상시키며, PCI를 사용한 백신접종 방법이 알려져 있다. PCI는 감광화 작용제를 활성화시키기 위한 조사 단계와 병용하여 감광화 작용제를 사용하는 기술이며, 세포에 동시-투여되는 분자가 세포의 시토졸로 방출되는 것을 달성하는 것으로 알려져 있다. 이러한 기술은 세포에 의해 세포소기관, 예를 들어, 엔도좀으로 흡수되는 분자가 조사 후에 이들 세포소기관으로부터 시토졸로 방출되게 한다. PCI는 다르게 막-불투과성(또는 약한 투과성) 분자를 광범위한 세포 파괴 또는 세포사를 야기하지 않는 방식으로 세포의 시토졸 내로 도입하기 위한 메커니즘을 제공한다.
광화학 내재화(PCI)의 기본 방법은 WO 96/07432호 및 WO 00/54802호에 기재되어 있으며, 이들은 본원에 참조로 포함된다. 그러한 방법에서, 내재화될 분자(본 발명에서 항원 분자일 것임) 및 감광화 작용제를 세포와 접촉시킨다. 감광화 작용제 및 내재화될 분자는 세포 내의 세포막-결합 하위구획(subcompartment) 내로 흡수되며, 다시 말하면, 그들은 세포내 소낭(예를 들어, 리소좀 또는 엔도좀) 내로 세포내이입된다. 적절한 파장의 광으로의 세포의 노출시에, 감광화 작용제가 활성화되며, 이는 직접적으로 또는 간접적으로 세포내 소낭의 막을 파괴하는 반응성 화학종을 생성한다. 이것은 내재화된 분자가 시토졸 내로 방출되게 한다.
그러한 방법에서, 세포의 대다수의 기능성 또는 생존력이 불리하게 영향을 받지 않는 것이 관찰되었다. 따라서, "광화학 내재화"로 명명되는 그러한 방법은 치료제를 포함하는 다양한 상이한 분자를 시토졸 내로, 즉, 세포의 내부로 운반하는데 유용한 것이 제안되었다.
WO 00/54802호는 세포 표면상에 전달 분자를 제시하거나 또는 발현하기 위해 그러한 일반 방법을 이용한다. 따라서, 세포 시토졸 내로의 분자의 운반 및 방출 후에, 그것(또는 상기 분자의 일부)은 세포의 표면으로 운반될 수 있으며, 여기서, 그것은 세포의 외측에, 즉, 세포 표면상에 제시될 수 있다. 백신 성분, 즉, 항원 또는 면역원이 상기 세포의 표면상의 제시를 위해 세포로 도입되어, 면역 반응을 유도하거나 촉진시키거나 보강할 수 있는 그러한 방법은 백신접종의 분야에서 특히 유용하다.
백신접종이 일부 주목할만한 성공을 달성하였지만, 대안적인 개선된 백신접종 방법이 여전히 필요하다. 본 발명은 이러한 필요에 대해 다루고 있다.
본 발명자들은 놀랍게도 감광화 작용제, 항원 분자, 예를 들어, 백신 성분 및 본원에 정의된 바와 같은 TLR 리간드의 사용 및 감광화 작용제를 활성화시키는데 유효한 파장의 광으로의 조사를 포함하는 방법이 유리하게 개선된 백신접종 또는 개선된 면역 반응을 야기하는 것을 발견하였다.
하기 실시예에 더욱 상세하게 기재되는 바와 같이, 본 발명의 방법이 개선된 백신접종 또는 개선된 면역 반응, 예를 들어, 증가된 양의 항원-특이적 T 세포의 생성을 야기하는 것이 입증되었다. 예를 들어, 도 1은 항원, TLR 리간드(CpG 올리고뉴클레오티드 또는 이미다조퀴놀린 중 어느 하나), 감광제 및 감광제를 활성화시키는데 유효한 파장의 광으로의 조사를 사용하는 마우스(mouse)의 생체내 백신접종이 단독의 항원 및 감광제/광 조사로의 처리에 비하여 상기 마우스의 혈액 및 비장에서 상당히 증가된 백분율의 항원-특이적 T 세포를 야기하는 것을 보여준다. 또한, 생체내에서 다양한 다른 TLR 리간드, 예를 들어, 폴리(IC), 이미퀴모드 및 MPLA를 사용하여 상승 효과가 본 발명의 실시예에 입증되어 있다. 따라서, 본 발명자들은 면역 반응의 상승적 개선이 본 발명의 방법에서 생체내에서 다양한 TLR 리간드를 사용하여 달성될 수 있음을 입증하였다.
이론에 구속시키고자 하는 것은 아니지만, 본 발명의 방법이 MHC 클래스 I 분자상의 증가된 항원 제시를 야기하여, 증가된 CD8+ T 세포 반응과, 그에 따른 개선된 백신접종 방법을 야기하는 것으로 여겨진다. 하기 논의된 바와 같이, 본 발명의 실시예의 일부는 MHC 클래스 I 제시를 평가하기 위해 사용되는 OT-1 세포의 모델계를 사용한다(예를 들어, 문헌[Delamarre et al. J. Exp. Med. 198:111-122, 2003] 참조). 이러한 모델계에서, 항원 에피토프 SIINFEKL의 MHC 클래스 I 제시는 OT-1 T-세포의 활성화를 야기하며, 활성화는 항원-특이적 T 세포의 증식의 증가, 또는 IFNγ 또는 IL-2의 생성 증가로 측정될 수 있다. 본 발명의 방법을 사용한 결과는 증가된 수의 항원-특이적 T 세포, 및 증가되거나 개선된 항원 제시와 상호관련이 있는 T 세포에 의한 증가된 IL-2 및 IFNγ 생성을 보여준다.
이에 따라, 제1 양태에서, 본 발명은 세포를 항원 분자, 감광화 작용제 및 TLR 리간드와 접촉시키는 단계 및 감광화 작용제를 활성화시키기에 유효한 파장의 광으로 세포를 조사하는 단계로서, 항원 분자가 세포의 시토졸 내로 방출된 다음, 항원 분자 또는 그의 부분이 세포의 표면상에 제시되는 단계를 포함하는 세포의 표면상의 항원 분자 또는 그의 부분의 발현 방법을 제공한다.
바람직하게는, 이 방법(및 이후에 기재되는 방법)은 상기 방법에서 상기 기재된 3개의 활성 성분(작용제)만을 사용하며, 작용제는 그들이 방법의 효능에 영향을 미치도록(즉, PCI 백신접종/항원 제시/면역 반응 자극을 증진시키는데 활동적인 역할을 갖도록) 방법에서 적절한 수준으로(예를 들어, 하기 기재되는 최소 수준으로) 존재한다. 따라서, 바람직하게는, 작용제는 다른 활성 성분이 없는 완충제 중에 존재한다.
그러한 방법에서, 상기 항원 분자 및 상기 감광화 작용제 및 임의로, 본원에 정의된 바와 같은 상기 TLR 리간드는 각각 세포내 소낭 내로 흡수되며; 세포가 조사되는 경우, 세포내 소낭의 막이 파괴되어, 항원 분자가 세포의 시토졸 내로 방출된다.
다양한 작용제는 서로 동일하거나 상이한 세포내 소낭 내로 흡수될 수 있다. 감광제에 의해 생성되는 활성 화학종은 그들이 함유되어 있는 소낭 너머까지 미칠 수 있고/거나 소낭이 유착되어 파괴된 소낭과의 유착에 의해 소낭의 내용물을 방출되게 할 수 있는 것이 관찰되었다. 본원에 언급된 바와 같이, "흡수된"은 흡수된 분자가 완전히 소낭 내에 함유되는 것을 의미한다. 세포내 소낭은 막으로 구획되어 있으며, 세포내이입 후에 야기되는 임의의 그러한 소낭, 예를 들어, 엔도좀 또는 리소좀일 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "파괴된" 구획은 구획 내에 함유된 항원 분자의 방출을 가능하게 하기에 충분한, 영구적인 또는 일시적인 상기 구획의 막의 온전성의 파괴를 말한다.
본원에 언급된 바와 같은 "감광화 작용제"는 감광화 작용제가 활성화된 화학종을 생성하기에 적절한 파장 및 세기의 조명에서 활성화되는 경우, 흡수된 광 에너지를 화학 반응으로 변환시킬 수 있는 화합물이다. 이들 과정의 고도의 반응성 최종 산물은 세포- 및 혈관 독성을 야기할 수 있다. 통상적으로, 그러한 감광화 작용제는 세포내 구획, 특히 엔도좀 또는 리소좀으로 국소화시킨 것일 수 있다.
감광제는 직접적으로 또는 간접적으로 다양한 메커니즘에 의해 그들의 효과를 가할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 특정 감광제는 광에 의해 활성화되는 경우 직접적으로 독성이 되는 반면, 다른 것들은 독성 화학종, 예를 들어 산화제, 예를 들어, 일중항 산소(singlet oxygen) 또는 세포 물질 및 생체분자, 예를 들어, 지질, 단백질 및 핵산에 대해 매우 파괴적인 다른 반응성 산소 화학종을 생성하는 작용을 한다.
다양한 그러한 감광화 작용제가 당업계에 알려져 있으며, 본원에 참조로 포함되는 WO96/07432호를 포함하는 문헌에 기재되어 있고, 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 포르피린(porphyrin), 프탈로시아닌(phthalocyanine), 푸르푸린(purpurin), 클로린(chlorin), 벤조포르피린, 리소좀 투과성 약염기(lysomotropic weak bases), 나프탈로시아닌(naphthalocyanine), 양이온성 염료 및 테트라사이클린 또는 그의 유도체를 포함하는 많은 공지된 감광화 작용제가 존재한다(문헌[Berg et al., (1997), J. Photochemistry and Photobiology, 65, 403-409]). 다른 감광화 작용제는 텍사피린(texaphyrin), 페오포비드(pheophorbide), 포르피센(porphycene), 박테리오클로린(bacteriochlorin), 케토클로린(ketochlorin), 헤마토포르피린 유도체(hematoporphyrin derivative), 및 5-아미노레불린산(5-aminolevulinic acid) 및 그의 유도체에 의해 유도된 내인성 감광제, 포토프린(Photofrin), 감광제 간의 이량체 또는 다른 컨쥬게이트를 포함한다.
포르피린은 가장 광범위하게 연구된 감광화 작용제이다. 그들의 분자 구조는 메틴 가교를 통해 서로 연결된 4개의 피롤 고리를 포함한다. 그들은 종종 금속-복합체를 형성할 수 있는 천연 화합물이다. 예를 들어, 산소 운반 단백질 헤모글로빈의 경우, 철 원자는 헴(heme) B의 포르피린 코어 내로 도입된다.
클로린은 코어에서 4개의 메틴 결합을 통해 결합된 3개의 피롤 및 1개의 피롤린으로 이루어진 커다란 헤테로사이클릭 방향족 고리이다. 따라서, 클로린은 포르피린과는 달리, 대부분 방향족이나 고리의 전체가 방향족은 아니다.
숙련자는 어떤 감광제가 본 발명에 사용하기에 적합한지를 알 것이다. 세포의 엔도좀 또는 리소좀에 위치하는 감광화 작용제가 특히 바람직하다. 따라서, 감광화 작용제는 바람직하게는 리소좀 또는 엔도좀의 내부 구획 내로 흡수되는 작용제이다. 바람직하게는, 감광화 작용제는 세포내이입에 의해 세포내 구획 내로 흡수된다. 바람직한 감광제는 디- 및 테트라술폰화 알루미늄 프탈로시아닌(예를 들어, AlPcS2a), 술폰화 테트라페닐포르핀(TPPSn), 술폰화 테트라페닐 박테리오클로린(예를 들어, TPBS2a), 나일 블루(nile blue), 클로린 e6 유도체, 유로포르피린 I, 필로에리트린, 헤마토포르피린 및 메틸렌 블루이다. 본 발명에 사용하기 위한 추가의 적절한 감광제, 즉, 술폰화 메소-테트라페닐 클로린, 바람직하게는 TPCS2a는 또한 본원에 참조로 포함되는 WO03/020309호에 기재되어 있다. 바람직한 감광화 작용제는 양친매성 감광제(예를 들어, 디술폰화 감광제), 예를 들어, 양친매성 프탈로시아닌, 포르피린, 클로린 및/또는 박테리오클로린이며, 특히, TPPS2a(테트라페닐포르핀 디술포네이트), AlPcS2a(알루미늄 프탈로시아닌 디술포네이트), TPCS2a(테트라페닐 클로린 디술포네이트) 및 TPBS2a(테트라페닐 박테리오클로린 디술포네이트) 또는 그들의 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다. 또한, 친수성 감광화 작용제, 예를 들어, TPPS4(메소-테트라페닐포르핀 테트라술포네이트)가 바람직하다. 특히 바람직한 감광화 작용제는 술폰화 알루미늄 프탈로시아닌, 술폰화 테트라페닐포르핀, 술폰화 테트라페닐클로린 및 술폰화 테트라페닐박테리오클로린, 바람직하게는 TPCS2a, AlPcS2a, TPPS4 및 TPBS2a이다. 본 발명의 특히 바람직한 구현예에서, 감광화 작용제는 클로린 TPCS2a(디술폰화 테트라페닐 클로린, 예를 들어, 암피넥스(Amphinex)®)이다.
감광제는 담체에 연결되어, 감광화 작용제를 제공할 수 있다. 따라서, 본 발명의 이러한 구현예의 바람직한 양태에서, 감광화 작용제는 화학식 (I)에 정의된 바와 같은 감광제 및 키토산의 컨쥬게이트이다:
Figure pct00001
상기 식에서,
n은 3 이상의 정수이고;
R은 상기 화합물에서 n회 나타내며;
상기 전체 Rn 기의 0.1% 내지 99.9%(바람직하게는 0.5% 내지 99.5%)에서, 각 R은
Figure pct00002
및
Figure pct00003
로부터 선택되는 기 A이고;
각 R1은 동일하거나 상이할 수 있으며, H, CH3 및 -(CH2)b-CH3로부터 선택되고; a는 1, 2, 3, 4 또는 5이며; b는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이고(여기서, 반대-이온은 예를 들어, Cl-일 수 있음); 바람직하게는 R1은 CH3이며, b는 1이고,
Y는 O; S; SO2; -NCH3; 또는 -N(CH2)dCH3이며; c는 1, 2, 3, 4 또는 5이고; d는 1, 2, 3, 4 또는 5이며, 바람직하게는 Y는 NCH3이고, c는 1이며,
각 R 기는 동일하거나 상이할 수 있고,
상기 전체 Rn 기의 0.1% 내지 99.9%(바람직하게는 0.5% 내지 99.5%)에서, 각 R은
Figure pct00004
로부터 선택되는 기 B이며;
e는 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이고; f는 1, 2, 3, 4 또는 5이며; 바람직하게는 e 및 f는 1이고;
R2는
Figure pct00005
로부터 선택되는 기이며;
W는 O, S, NH 또는 N(CH3)로부터 선택되는 기; 바람직하게는 NH이고;
R3은
Figure pct00006
로부터 선택되는 기이며;
V는 CO, SO2, PO, PO2H 또는 CH2로부터 선택되는 기; 바람직하게는 CO이고;
R4는 H, -OH, -OCH3, -CH3, -COCH3, C(CH3)4, -NH2, -NHCH3, -N(CH3)2 및 -NCOCH3로부터 선택되는, 동일하거나 상이할 수 있는 기(o, m 또는 p 위치에서 치환), 바람직하게는 H이며;
각 R 기는 동일하거나 상이할 수 있다.
키토산 폴리머는 적어도 3개의 단위(n=3)를 갖는다. 그러나 바람직하게는, n은 적어도 10, 20, 50, 100, 500, 1000, 예를 들어, 10 내지 100 또는 10 내지 50이다.
바람직한 구현예에서, R2는
Figure pct00007
로부터 선택된다.
추가의 바람직한 구현예에서, R3은
Figure pct00008
로부터 선택된다.
바람직하게는, R2 또는 R3은 TPPa, TPCa1 또는 TPCc1이다.
기 A는 전체 Rn 기의 70 내지 95%를 제공할 수 있으며, 기 B는 전체 Rn 기의 5 내지 30%를 제공할 수 있다.
가장 바람직한 구현예에서, 감광제 및 키토산의 컨쥬게이트는 하기로부터 선택된다(도 4의 반응식 1 내지 5B에서의 넘버링 참조):
17: B:25%, A:75%
Figure pct00009
,
19: B:25%, A:75%
Figure pct00010
,
33: B:10%; A:90%
Figure pct00011
37: B:10%; A:90%
Figure pct00012
.
상기 구조에서, 제공된 A/B % 값은 기 A 또는 B인 Rn 기의 비를 말한다. 별표는 키토산 폴리머의 나머지를 표시한다.
이들 화합물은 숙련자에게 친숙할 해당 분야에 표준인 절차를 사용하는 합성 방법에 의해 제조될 수 있다. 예로써, 하기 논의된 바람직한 컨쥬게이트, 번호 17, 19, 33 및 37의 합성은 도 4의 반응식 1 내지 5B(도 4 범례도 또한 참조)에 나타나 있다.
본원에 언급된 바와 같은 "항원" 분자는 적절한 방식으로 면역계 또는 면역 세포에 제시되는 경우, 그 자체 또는 그의 부분이 면역 반응을 자극할 수 있는 분자이다. 따라서, 유리하게, 항원 분자는 백신 항원 또는 백신 성분, 예를 들어, 폴리펩티드 함유 엔티티(entity)일 것이다.
많은 그러한 항원 또는 항원 백신 성분은 해당 분야에 알려져 있으며, 모든 방식의 박테리아 또는 바이러스 항원 또는 실제로 원생동물 또는 고등 생물을 포함하는 임의의 병원성 종의 항원 또는 항원 성분을 포함한다. 통상적으로 백신의 항원 성분은 전체 생물(살아있던지, 죽어 있던지 또는 약화되어 있던지), 즉 전체 세포 백신으로 구성되지만, 또한 서브-유닛(sub-unit) 백신, 즉, 생물의 특정 항원 성분, 예를 들어 단백질 또는 펩티드, 또는 심지어 탄수화물을 기반으로 한 백신도 광범위하게 연구되었고 문헌에 보고되었다. 임의의 그러한 "서브-유닛"-기반의 백신 성분은 본 발명의 항원 분자로서 사용될 수 있다.
그러나 본 발명은 펩티드 백신 분야에서 특히 유용하다. 따라서, 본 발명에 따른 바람직한 항원 분자는 펩티드(보다 짧은 길이 및 보다 긴 길이의 펩티드, 즉, 펩티드, 올리고펩티드 또는 폴리펩티드, 및 또한, 단백질 분자 또는 그의 단편, 예를 들어 5 내지 500개, 예를 들어 10 내지 250개, 예컨대 15 내지 75개, 또는 8 내지 25개 아미노산의 펩티드를 포함하는 것으로 본원에 정의됨)이다.
예를 들어, AIDS/HIV 감염 또는 인플루엔자, 개 파르보바이러스, 소 백혈병 바이러스, 간염 등과 같은 바이러스 질환 및 감염의 치료에서 다수의 펩티드 백신 후보물질이 문헌에 제안되었다(예를 들어, 문헌[Phanuphak et al., Asian Pac. J. Allergy. Immunol. 1997, 15(1), 41-8]; 문헌[Naruse, Hokkaido Igaku Zasshi 1994, 69(4), 811-20]; 문헌[Casal et al., J. Virol., 1995, 69(11), 7274-7]; 문헌[Belyakov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95(4), 1709-14]; 문헌[Naruse et al., Proc. Natl. Sci. USA, 1994 91(20), 9588-92]; 문헌[Kabeya et al., Vaccine 1996, 14(12), 1118-22]; 문헌[Itoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, 83(23) 9174-8] 참조). 유사하게, 박테리아 펩티드는 실제로 다른 생물 또는 종으로부터 유래된 펩티드 항원처럼 사용될 수 있다.
병원성 생물로부터 유래된 항원에 더하여, 펩티드도 암 또는 다발성 경화증과 같은 다른 질환에 대한 백신으로서의 사용이 제안되었다. 예를 들어, 돌연변이체 종양유전자(oncogene) 펩티드는 세포독성 T-림프구의 자극에서 항원으로서 작용하는 암 백신으로서 전망이 밝다(문헌[Schirrmacher, Journal of Cancer Research and Clinical Oncology 1995, 121, 443-451]; 문헌[Curtis Cancer Chemotherapy and Biological Response Modifiers, 1997, 17, 316-327]). 또한, 합성 펩티드 백신도 전이성 흑색종의 치료에 대해 평가되었다(문헌[Rosenberg et al., Nat. Med. 1998, 4(3), 321-7]). 다발성 경화증의 치료에 대한 T-세포 수용체 펩티드 백신은 문헌[Wilson et al., J. Neuroimmunol. 1997, 76(1-2), 15-28]에 기재되어 있다. 임의의 그러한 펩티드 백신 성분은 실제로 문헌에서 펩티드 백신으로서 기재되거나 또는 제안된 펩티드 중 임의의 것처럼, 본 발명의 항원 분자로서 사용될 수 있다. 따라서, 펩티드는 합성이거나 생물로부터 분리되거나 다르게는 유래될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 항원은 흑색종 항원이다. "흑색종 항원"은 하나 이상의 상이한 항원을 포함할 수 있다.
예를 들어, 일 양태에서, 흑색종 항원은 흑색종 단백질 또는 펩티드, 예를 들어, 항원 펩티드 또는 T-세포 에피토프, 예를 들어, gp100, 멜란(Melan)-A, 티로시나제, MAGE-1, MAGE-3 및 티로시나제 관련 단백질-2(TRP-2) 또는 그의 펩티드 에피토프로부터 선택되는 하나 이상이다. 이들 및 추가의 적합한 흑색종 항원의 상세사항은 문헌[Renkvist et al., Cancer Immunol. Immunother. 50:3-15, 2001](및 그 안의 참고문헌) 및 문헌[Hodi, Clin. Cancer. Res. 12:673-678, 2006]에 개시되어 있으며, 이들은 본원에 참조로 포함된다. 특히, gp100, Melan-2, 티로시나제, MAGE-1, MAGE-3 및 TRP-2 및 그들의 펩티드 에피토프는 상기 문헌[Renkvist et al.]에 기재되어 있다. 따라서, 본 발명은 상기 문헌[Renkvist et al.]에 개시된 바와 같이 gp100, 멜란-2, 티로시나제, MAGE-1, MAGE-3 또는 TRP-2, 또는 그들의 개시된 펩티드 에피토프를 포함하거나 그로 이루어진 항원 또는 해당 분야에 알려져 있는 표준 비교 기술을 사용하여 (관련있는 비교 창에 걸쳐) 그와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열의 사용까지 확대된다. 바람직한 구현예에서, 항원은 TRP-2 및/또는 gp100, 바람직하게는 TRP-2이다.
펩티드 항원, 예를 들어, 최대 적어도 200개 아미노산이 주문 펩티드 합성을 수행하는 회사, 예를 들어, 유나이티드 바이오시스템즈 인코포레이티드(United BioSystems Inc)(이전에는 유나이티드 펩티드 코포레이션(United Peptide Corp.)(Herndon, VA, USA))로부터 수득될 수 있다.
대안적인 바람직한 구현예에서, 항원 분자는 인유두종 바이러스(HPV)로부터 유래된다. 유두종 바이러스 게놈은 숙주 세포의 초기 감염 직후 발현되는 6개(E1, E2, E4, E5, E6 및 E7) 오픈 리딩 프레임(ORF)을 인코딩하는 초기 영역(E), 및 주 캡시드 단백질 L1 및 부 캡시드 단백질 L2를 인코딩하는 후기 영역(L)으로 나뉜다. 모든 바이러스 ORF는 하나의 DNA 가닥상에 인코딩된다.
바람직한 구현예에서, 항원 분자는 단백질 또는 펩티드 또는 그의 단편, 즉, 바람직하게는 본원에 언급되는 초기 또는 후기 단백질 중 하나의 단백질 또는 그의 부분인 인유두종 바이러스(HPV) 유래의(예를 들어, 상기 바이러스로부터 유래된) 항원을 포함한다. 따라서, HPV 항원은 하나 이상의 알려져 있는 항원 펩티드 또는 T-세포 에피토프, 예를 들어, 임의의 유형의 HPV 유래의 임의의 알려져 있는 항원으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. HPV 유형 및 항원의 상세사항은 문헌[Ma et al. Current Cancer Therapy Reviews 6: 81-103, 2010]에서 찾을 수 있다.
예를 들어, 항원 펩티드는 HPV-16 및/또는 HPV-18형 HPV 또는 31형 또는 45형 HPV로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 항원은 E1, E2, E4, E5, E6 또는 E7 단백질 중 임의의 것 또는 L1 및 L2 단백질 중 임의의 것으로부터 유래될 수 있다. 항원 펩티드는 HPV-16 및 18의 E2, E6 및 E7 단백질 중 하나 이상으로부터 유래될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 항원 분자는 HPV-16 E7 서열 GQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIR(CD8 에피토프는 볼드체로 나타나 있음)을 함유한다. 따라서, HPV 항원은 35개 아미노산 펩티드일 수 있다. 대안적으로, 항원 분자는 오직 CD8 에피토프 RAHYNIVTF, 즉, 더 짧은 펩티드일 수 있다.
HPV 펩티드 항원은 주문 펩티드 합성을 수행하는 회사, 예를 들어, 유나이티드 바이오시스템즈 인코포레이티드(이전에는 유나이티드 펩티드 코포레이션(Herndon, VA, USA))로부터 수득될 수 있다.
항원 분자는 일단 광화학 내재화 과정에 의해 세포 시토질에 방출되면, 세포의 항원-처리 기구에 의해 처리될 수 있다. 따라서, 세포의 표면상에 발현되거나 제시되는 항원 분자는 내재화(세포내이입)되는 항원 분자의 부분 또는 단편일 수 있다. 제시되거나 발현되는 항원 분자의 "부분"은 바람직하게는 세포 내의 항원-처리 기구에 의해 생성되는 부분이다. 그러나 부분은 적절한 항원 설계(예를 들어, pH 감수성 결합)를 통해 또는 다른 세포 처리 수단을 통해 달성될 수 있는 다른 수단에 의해 생성될 수 있다. 편리하게, 그러한 부분은 예를 들어, 5개 초과, 예를 들어, 10 또는 20개 초과의 아미노산 크기의 펩티드의 경우에, 면역 반응을 생성하기에 충분한 크기의 것이다.
본 발명에 따른 PCI-매개의 백신접종을 증진시키는 작용제는 톨-유사 수용체(TLR)에 대한 리간드이다. 톨-유사 수용체는 선천 면역계 및 소화계에서 중요한 역할을 수행하는 단백질의 부류이다. TLR 및 인터류킨-1 수용체는 인터류킨-1 수용체/톨-유사 수용체 상과로 지칭되는 수용체 상과를 형성한다. 이러한 과의 모든 구성원은 톨-IL-1 수용체 도메인(TIR)을 갖는다. 인터류킨-1 수용체(IL-1R) 과의 구성원은 세포외 면역글로불린-유사 도메인 및 세포내 톨/인터류킨-1R(TIR) 도메인을 특징으로 한다. 하위그룹 2 TIR 도메인을 갖는 수용체는 TLR로 여겨진다.
TLR은 미생물로부터 유래되는 구조적으로 보존된 분자를 인식하는 센티넬(sentinel) 세포, 예를 들어, 대식구 및 수지상 세포에서 통상 발현되는 단일의 막-스패닝, 비-촉매 수용체이다. 일단 이들 미생물이 물리적 장벽, 예를 들어, 피부 또는 장관 점막을 침입하면, 그들은 TLR에 의해 인식되며, 이는 면역 세포 반응을 활성화시킨다. 이들 수용체는 병원체의 기능에 중요한 것으로 여겨지며 돌연변이를 통해 변하기 어려운 병원체-관련 분자와 같은 분자를 인식한다. 그들은 박테리아 세포-표면 지질다당류(LPS), 지질단백질, 지질펩티드 및 지질아라비노만난; 단백질, 예를 들어, 박테리아 편모 유래의 플라젤린; 바이러스의 이중-가닥 RNA; 또는 박테리아 및 바이러스 DNA의 비메틸화 CpG 섬(island); 및 또한, 진핵 DNA의 프로모터에서 관찰되는 CpG 섬; 및 특정 다른 RNA 및 DNA 분자를 포함할 수 있다. TLR의 대부분에 있어서, 리간드 인식 특이성은 이제 유전자 표적화에 의해 확립되었다.
대부분의 포유류 종이 10 내지 15가지 유형의 톨-유사 수용체를 갖는 것으로 추정되었다. 13가지의 TLR(간단히 TLR1 내지 TLR13으로 명명)은 인간 및 마우스에서 함께 확인되었다(마우스에서 13가지 및 인간에서 10가지).
TLR 수용체에 대한 모든 리간드는 본 발명에 포함된다. 용어 "리간드"는 생물학적 목적을 제공하기 위해 생체분자와 복합체를 형성하는 물질을 의미하는 것으로 의도된다. TLR 리간드의 맥락에서, 그것은 표적 TLR상의 위치에 결합하는 신호 촉발 분자이다. 리간드가 그의 동족 수용체에 결합하는 경우, 그것은 수용체의 화학적 입체형태를 변경시킬 수 있다. 수용체 단백질의 입체형태 상태는 그의 기능적 상태를 결정한다.
따라서, 본 발명에 따른 TLR 리간드는 적어도 하나의 또는 하나 이상의 톨-유사 수용체(TLR)에 결합하며, TLR의 활성화, 예를 들어, TLR-매개의 세포 신호전달의 활성화를 야기하는 분자이다.
TLR 신호전달은 2개의 별개의 신호전달 경로, MyD88-의존성 및 TRIF-의존성 경로로 나뉜다. 본 발명에 따른 TLR 리간드는 이들 2개의 경로 중 하나 또는 둘 모두를 활성화시킨다. 따라서, 본 발명에 따른 리간드는 하나 이상의 TLR에 결합하고, 리간드의 결합시의 수용체의 입체형태 변화를 통해 TLR의 활성화, 예를 들어, TLR 신호전달의 활성화를 야기하는 분자이다.
MyD88-의존성 반응은 TLR 수용체의 이량체화 시에 발생하며, TLR3을 제외한 모든 TLR에 의해 사용된다. 그의 주요 효과는 NFκB 및 미토겐-활성화 단백질 키나제의 활성화이다. 리간드 결합 및 수용체에서 발생하는 입체형태 변화는 어댑터 단백질 MyD88, TIR 과의 구성원을 동원한다. 이어서, MyD88은 IRAK 4, IRAKI 및 IRAK2를 동원한다. 이어서, IRAK 키나제는 단백질 TRAF6을 인산화시키고 활성화시키며, 이는 차례로 단백질 TAK1 및 그 자체를 폴리유비퀴닌화시켜 IKKβ로의 결합을 촉진시킨다. TAK1은 결합시에 IKKβ를 인산화하고, 이어서 IκB를 인산화하여 그 분해를 야기하고 NFκB가 세포 핵으로 확산되어 전사를 활성화하고, 결과적으로 염증성 사이토카인의 유도를 가능하게 한다.
다른 경로는 TRIF-의존성 경로이며, 이는 TLR3 및 TLR4 둘 모두에 의해 사용된다. TLR3에 있어서, dsRNA(또는 유사 - 하기 참조)는 수용체의 활성화를 야기하여, 어댑터 TRIF를 동원한다. TRIF는 키나제 TBK1 및 RIP1을 활성화하며, 이는 신호전달 경로에서 한 분지를 생성한다. TRIF/TBK1 신호전달 복합체는 IRF3을 인산화시켜, 그것이 핵으로 이동되게 하고, 인터페론 I형이 생성되게 한다. 한편, RIP1의 활성화는 MyD88-의존성 경로와 동일한 방식으로 폴리유비퀴틴화 및 TAK1 및 NFκB 전사의 활성화를 야기한다.
TLR 신호전달의 활성화를 결정하기 위한 표준 방법, 예를 들어, 적절한 신호전달 단백질의 인산화 상태의 결정이 해당 분야에 알려져 있다. 대안적으로, 해당 분야에 널리 알려져 있는 방법에 의하여, 예를 들어, 특정 TLR을 인코딩하는 유전자를 유전학적으로 결실시키고, 리간드의 효과가 유지되는지를 결정함으로써 리간드가 TLR을 통해 작용하는지를 결정할 수 있다. 이러한 방법은 구매가능한 트랜스제닉 낙-아웃(knock-out) 마우스에서 시험관내 및 생체내에서 사용될 수 있다(TLR2, 3 및 4 낙-아웃은 더 잭슨 래보러터리(The Jackson Laboratory)로부터 입수가능하며, TLR 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 9 낙-아웃은 오리엔탈바이오서비스 인코포레이티드(OrientalBioService Inc)로부터 입수가능함). 또한, NF-κB/AP1 활성화의 분석을 통하여 TLR의 자극을 연구하기 위하여 설계된 HEK-Blue™ 세포(인비보겐(Invivogen)(San Diego, CA, USA))가 이용가능하다. 그러한 세포는 TLR 2 내지 9 및 13에 대하여 이용가능하다. 또한, TLR 길항제, 예를 들어, 인비보겐으로부터 입수가능한 것들을 사용하여 TLR의 길항작용이 추정의 리간드의 작용을 억제하는지를 결정할 수 있다. 따라서, 분자가 TLR 리간드, 예를 들어, 특이적인 TLR 리간드인지를 결정하는 방법이 해당 분야에 널리 알려져 있다.
TLR의 구조는 류신-풍부 반복(LRR) 엑토도메인, 나선형 막횡단 도메인 및 세포내 톨/IL-1 수용체 상동성(TIR) 신호전달 도메인으로 이루어진다. 엑토도메인은 다양한 수의 LRR을 함유하며, 편자 형상으로 굽혀진 솔레노이드와 비슷하다. 양 말단에, 편자의 소수성 코어를 보호하는 말단 LRR이 존재한다. 이들 엑토도메인은 매우 가변적이다. 그들은 지질다당류, 지질펩티드, 시토신-포스페이트-구아닌(CpG) DNA, 플라젤린, 이미다조퀴놀린 및 ds/ssRNA를 포함하는 다양한 병원체-관련 모티프의 인식에 직접 연루된다. TIR 신호전달 복합체는 수용체 활성화 시에, 수용체와 어댑터 TIR 도메인 간에 형성된다.
수용체 TLR 7, 8 및 9는 다른 TLR보다 더 긴 아미노산 서열을 갖는 과이다. 그들은 세포내로 국소화되며, 비-자가 핵산에 반응하여 신호를 낸다. 또한, 그들은 그들의 LRR14과 15 사이에 불규칙한 세그먼트를 함유한다.
TLR 수용체의 서열이 알려져 있으며, 본원에 기재된 리간드에 의한 그들 수용체로의 결합은 예를 들어, 전술된 바와 같이 평가될 수 있다. 예로써, 알려져 있는 TLR 아미노산 서열이 하기 표 1에 나타나 있다.
Figure pct00013
TLR1은 리간드가 지질단백질 및 다중의 트리아실 지질펩티드, 예를 들어, 박테리아로부터 유래되는 것들을 포함하는 세포-표면 수용체이다. TLR1은 그것 자체에서 리간드를 인식하지 않고, 오히려, 그것은 TLR2와의 복합체로 작용한다. 따라서, 리간드는 TLR1과 TLR2 간의 복합체를 인식한다. TLR1은 TLR2와 조합되어(이종이량체로서), 펩티도글리칸 및 (트리아실) 지질단백질을 인식한다.
지질단백질/펩티드는 단백질/펩티드에 연결된 지질로 이루어진 분자이다. 박테리아는 그러한 분자를 발현한다. 트리아실 지질단백질/펩티드는 3개의 아실기를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에 따라 사용하기 위한 TLR1 리간드는 트리아실 지질펩티드이다.
TLR1 리간드는 인비보겐 또는 엔조 라이프 사이언스즈(Enzo Life Sciences)(Farmingdale, NY, USA)로부터 구매할 수 있다. 예를 들어, Pam3CSK4(인비보겐)는 박테리아 LP의 아실화 아미노 말단을 모방하는 합성 트리아실화 지질펩티드(LP)이다.
대안적으로, TLR2와 복합체화된 TLR1의 선택적 효능제인 Pam3Cys-Ser-(Lys)4 트리하이드로클로라이드(엔조 라이프 사이언스즈)가 사용될 수 있다.
TLR2는 넓은 그룹의 그람(Gram)-양성 및 그람-음성 박테리아 둘 모두의 종, 및 마이코플라스마 및 효모를 대표하는 매우 다양한 미생물 분자에 의해 자극되는 세포 표면 수용체이다. TLR2는 그람-양성 박테리아 유래의 세포-벽 성분, 예를 들어, 펩티도글리칸, 지질테이코산 및 지질단백질, 마이코박테리아 유래의 지질아라비노만난 및 효모 세포벽 유래의 지모산을 인식한다.
바람직한 TLR2 리간드는 마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis) 유래의 지질글리칸, 예를 들어, 지질아라비노만난 및 지질만난이다. 특히 바람직한 지질글리칸은 TLR2에 특이적인 지질다당류(LPS)이다. 이들 분자는 공유 결합에 의해 연결되는 지질 및 다당류를 가지며, 그람-음성 박테리아의 외측 멤버에서 관찰되고, 내독소로서 작용한다. 바람직한 특징에서, LPS는 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas Gingivalis) 유래의 것이다. LPS는 지질 A로 명명된 특정 탄수화물 지질 모이어티에 의해 박테리아 외막에 부착된 다당류 영역으로 이루어진다. 내독소로도 알려져 있는 지질 A는 LPS의 면역자극 활성의 원인이 된다.
Figure pct00014
가장 활성이 있는 형태의 지질 A는 6개의 지방 아실기를 함유하며, 병원성 박테리아, 예를 들어, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 및 살모넬라(Salmonella) 종에서 관찰된다.
다른 바람직한 TLR2 리간드는 예를 들어, 상이한 박테리아 종, 예를 들어, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터 기원한 지질테이코산; 예를 들어, 박테리아 종, 예를 들어, 바실러스 서브틸리스, 에스케리키아 콜라이 균주(예를 들어, 0111:B4 또는 K12), 스타필로코커스 아우레우스 등 유래의 펩티도글리칸; 합성 지질단백질, 예를 들어, 합성 디아실화 지질단백질 또는 합성 트리아실화 지질단백질 및 β-1,3-글리코시드 결합에 의해 연결된 반복 글루코스 단위를 갖는 글루칸인 지모산(예를 들어, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 유래)이다. TLR2 리간드는 인비보겐으로부터 구매가능하다.
TLR3은 세포 구획 내에서 관찰된다. 본 발명에 따른 바람직한 리간드는 바이러스 dsRNA를 모방하는 이중-가닥 RNA 분자, 예를 들어, 폴리아데닐-폴리우리딜산(폴리A:U)) 또는 폴리이노신-폴리시티딜산(폴리(l:C))이다. 폴리(I:C)가 특히 바람직하다.
이중-가닥 RNA(dsRNA)는 모든 세포에서 관찰되는 DNA와 유사한 2개의 상보적인 가닥을 갖는 RNA이다. dsRNA는 일부 바이러스(이중-가닥 RNA 바이러스)의 유전 물질을 형성한다. 이중-가닥 RNA, 예를 들어, 바이러스 RNA 또는 siRNA는 진핵생물에서 RNA 간섭, 및 척추동물에서 인터페론 반응을 촉발시킬 수 있다.
바람직한 특징에서, 리간드는 폴리(l:C)이다. 폴리 l:C는 하나의 가닥이 이노신산의 폴리머이고, 다른 가닥이 시티딜산의 폴리머인 미스매치된 이중 가닥 RNA이다. 그러한 분자는 널리 알려져 있는 기술에 의해 생성될 수 있다. 다양한 상업적 공급처가 존재하며, 예를 들어, 하기의 것은 인비보겐으로부터 구매가능하며, 바람직한 구현예를 형성한다:
- 고분자량 및 1.5 내지 8 kb의 평균 크기를 갖는 폴리(I:C)(HMW) 및
- 저분자량 및 0.2 내지 1 kb의 평균 크기를 갖는 폴리(I:C) (LMW). 고분자량 및 저분자량 형태 둘 모두는 본 발명에 따라 사용하기에 바람직한 형태이다.
TLR4는 또한, 세포 표면상에서 관찰되며, 특히 지질다당류(LPS), 몇몇의 열 충격 단백질, 피브리노겐, 헤파린 설페이트 단편, 히알루론산 단편, 니켈 및 다양한 오피오이드 약물을 포함하는 몇몇의 리간드 유형을 갖는다. 바람직한 양태에서, 리간드는 LPS이다. LPS는 다양한 박테리아 종으로부터, 예를 들어, 에스케리키아 콜라이 0111:B4 또는 K12 또는 살모넬라로부터 기원할 수 있으며(페놀-물 혼합물에 의해 추출), 바람직한 특징에서, LPS는 에스케리키아 콜라이 또는 살모넬라 미네소타(Salmonella minnesota), 예를 들어, 균주 R595 유래의 것이다. 다른 바람직한 양태에서, TLR4 리간드는 박테리아(예를 들어, 살모넬라 미네소타 R595)로부터 분리되거나 합성에 의해 제조될 수 있는 모노포스포릴 지질 A( MPLA )이다. 일반적으로, TLR4 리간드는 예를 들어, 인비보겐으로부터 구매가능하다.
TLR5는 그람-양성 및 그람-음성 박테리아 둘 모두, 예를 들어, 바실러스 서브틸리스, 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium) 등 유래의 리간드 플라젤린에 결합한다. 플라젤린은 중공 관상으로 스스로 정렬되어 박테리아 편모에서 잔섬유를 형성하는 구형 단백질이다. 그것은 약 30,000 내지 60,000 달톤의 질량을 갖는다. 플라젤린은 박테리아 편모의 주요 치환체이며, 거의 모든 편모 박테리아에 다량 존재한다. 따라서, 바람직한 TLR5 리간드는 바람직하게는 상기 기재된 바와 같은 박테리아 유래의 플라젤린이다. TLR5 리간드는 예를 들어, 인비보겐으로부터 구매가능하다.
TLR6은 다수의 디아실 지질펩티드에 결합한다. 상기 논의된 바와 같이, 지질펩티드는 박테리아에서 관찰되며, 펩티드에 연결된 지질을 포함한다. 디아실 지질펩티드는 2개의 아실기를 가지며, 본 발명에 따라 사용하기에 바람직한 TLR6 리간드를 형성한다. TLR6 리간드는 인비보겐으로부터 구매가능하다. 예를 들어, FSL-1(Pam2CGDPKHPKSF)은 MALP-2, 마이코플라스마 퍼멘탄스(M. fermentans) 유래의 지질단백질(LP)과 유사한 마이코플라스마 살리바리움(Mycoplasma salivarium)으로부터 유래된 합성 지질단백질이다. 마이코플라스마 LP, 예를 들어, FSL-1은 디아실화 시스테인 잔기를 함유하는 한편, 박테리아 LP는 트리아실화 잔기를 함유한다. FSL-1은 TLR2와 조합된 TLR6에 의해 인식되는 한편, 박테리아 LP는 상기 논의된 바와 같은 TLR2 및 TLR1의 조합에 의해 인식된다.
TLR7 리간드는 작은 합성 화합물 이미다조퀴놀린, 염기 유사체, 예를 들어, 아데닌 및 구아노신 유사체(예를 들어, 록소리빈(loxoribine)) 및 브로피리민(bropirimine) 및 또한 단일-가닥 RNA를 포함한다.
이미다조퀴놀린 화합물은 바람직하게는 하기에 나타낸 화학식을 갖는 이중 환상 유기 분자이며, 여기서, R1 및 R2에서 기는 달라질 수 있다.
바람직하게는, 이미다조퀴놀린 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염은 화학식 1을 갖는다:
Figure pct00015
상기 식에서,
R1은 예를 들어, 하이드록실기로 임의로 치환된 아미노-알킬기이고, R2는 산소 또는 질소기가 임의로 개재된 알킬기이며; 바람직하게는
R1은 N-CH2-C(CH3)2-R3이고;
R2는 -CH2-X-CH2CH3 또는 수소 원자이며;
R3은 OH 또는 수소 원자이고, X는 O 또는 NH이다.
상기 화학식에서, 알킬기는 C1-C10 기일 수 있다.
이들 화합물의 예는 해당 분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 레시퀴모드(Resiquimod)(또는 R848)(1-[4-아미노-2-(에톡시메틸)이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일]-2-메틸프로판-2-올), 이미퀴모드(Imiquimod)(3-(2-메틸프로필)-3,5,8-트리아자트리사이클로[7.4.9.02,6]트리데카-1(9),2(6),4,7,10,12-헥사엔-7-아민) 및 가디퀴모드(gardiquimod)(R1은 N-CH2-C(CH3)2OH이고; R2는 -CH2-NH-CH2CH3임; 1-[4-아미노-2-(에틸아미노메틸)이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일]-2-메틸프로판-2-올)(모두 인비보겐(San Diego CA, USA)으로부터 입수가능)가 있다. 바람직한 구현예에서, 화합물은 레시퀴모드 및 이미퀴모드로부터 선택된다.
또한, 이들 화합물의 약제학적으로 허용되는 염도 본 발명에 포함된다. 적절한 염은 예를 들어, 아세트산염, 브롬화물, 염화물, 시트르산염, 염산염, 말레산염, 메실산염, 질산염, 인산염, 황산염, 주석산염, 올레산염, 스테아르산염, 토실레이트, 칼슘, 메글루민, 칼륨 및 나트륨 염을 포함한다.
록소리빈은 위치 N7 및 C8에서 유도체화된 구아노신 유사체이다. 이러한 뉴클레오시드는 면역계의 매우 강력한 자극제이다. 브로피리민은 하기에 나타낸 바와 같은 구조를 갖는 항암 및 항바이러스 특성을 갖는 실험 약물이다:
Figure pct00016
단일 가닥 RNA는 바람직한 TLR7 리간드, 예를 들어, ssPolyU이며, 바람직하게는 상기 단일 가닥 분자는 20 내지 200개 뉴클레오티드 길이이다. 그러한 분자는 합성에 의해 용이하게 생성될 수 있다.
TLR8 리간드는 일반적으로 작은 합성 화합물 또는 단일-가닥 RNA이다. 바람직하게는 상기 TLR8 리간드는 상기 기재된 바와 같은 ssPolyU 분자이다.
TLR9 리간드는 비메틸화 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 DNA를 포함한다. "CpG" 올리고뉴클레오티드(또는 CpG ODN)는 그러한 리간드의 일 예이며, 구아닌 트리포스페이트 데옥시뉴클레오티드("G")로의 시토신 트리포스페이트 데옥시뉴클레오티드("C")의 결합으로부터 야기되는 짧은 단일-가닥 합성 DNA 분자이다. "p"는 연속 뉴클레오티드 간의 포스포디에스테르 결합을 말하지만, 일부 ODN은 대신에 변형된 포스포로티오에이트(PS) 백본을 갖는다. 본원에 언급된 바와 같이, CpG 뉴클레오티드는 CpG 모티프로 지칭된다. CpG 모티프는 비메틸화된다. CpG 모티프를 함유하는 서열은 그들이 미생물 게놈에서 풍부하나 그들이 척추동물 게놈에서 희귀하기 때문에, 병원체-관련 분자 패턴(PAMP)으로 여겨진다. CpG PAMP는 패턴 인식 수용체(PRR) 톨-유사 수용체 9(TLR9)에 의해 인식된다. TLR9는 포유류 DNA로부터 미생물 DNA를 구별하는 특정 비메틸화 CpG 올리고뉴클레오티드(ODN) 서열을 인식한다.
자극성 ODN의 3가지 주요 유형이 기재되어 있다: A, B 및 C형. A형 CpG ODN은 혼합된 포스포디에스테르/포스포로티오에이트 백본으로 구성되며, 팔린드롬 서열의 부분으로서 하나 이상의 CpG 모티프를 함유한다. A형 CpG ODN은 3' 및 5' 말단에 폴리 G 테일을 갖는다(연쇄체(concatemer)의 형성을 용이하게 하는 구조적 모티프). A형 CpG ODN은 전형적으로 한 말단 또는 양 말단에 7 내지 10개의 포스포로티오에이트-변형 염기를 함유하며, 이는 뉴클레아제에 의한 분해에 저항하고, ODN의 안정성을 증가시킨다. 예를 들어, 내부 팔린드롬 서열은 8 내지 16개(바람직하게는 10, 12 또는 14개) 염기 쌍 길이일 수 있으며, 염기의 순서가 달라질 수 있으나, 패턴, 5'-Pu Pu CG Pu : Py CG Py Py-3'이 바람직하며, 여기서, ":"으로 표시된 팔린드롬 중심으로부터 등거리의 Pu, Py 염기는 상보적이다. DNA 가닥의 어느 하나의 말단에서 관찰되는 폴리 G 테일은 길이가 달라질 수 있다.
B형 CpG ODN은 CpG 모티프를 함유하는 하나 이상의 6mer 컨센서스 서열을 가질 수 있다. 인간 컨센서스 서열은 서열 5'-Pu Py C G Py Pu-3'을 함유할 수 있다(마우스 서열은 상이할 수 있다). B형 CpG ODN은 완전히 포스포로티오에이트화된(PS-변형된) 백본을 가지며, 일반적으로 18 내지 28개(예를 들어, 18 내지 22개) 뉴클레오티드 길이이다. B형 CpG ODN의 예는 서열 5'-tccatgacgttcctgacgtt-3'을 갖는 ODN 1826이다.
C형 CpG ODN은 A 및 B형 둘 모두의 특징을 조합한다. C형 CpG ODN은 전적으로 포스포로티오에이트 클레오티드로 구성되며, 하나 이상의 CpG 모티프를 함유하는 팔린드롬 서열을 함유한다. C형 CpG ODN의 일 예는 서열 5'-tcgtcgttttcggcgc:gcgccg-3'(팔린드롬은 밑줄이 그어 있음)을 갖는 ODN 2395이다.
또한, 고도로 정렬된 구조를 형성하게 하는 2개의 팔린드롬 서열을 함유하는 P형 CpG ODN도 또한 사용될 수 있다.
CpG 올리고뉴클레오티드는 해당 분야에 알려져 있는 표준 올리고뉴클레오티드 합성 방법에 의해 합성될 수 있다.
따라서, 본 발명의 CpG 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 CpG 모티프 및 3' 및 5' 측 각각에서 상기 모티프의 측면에(flanking) 적어도 하나의 염기를 포함하는 6 내지 50개 염기, 바람직하게는 18 내지 27개, 바람직하게는 20 내지 25개 염기의 단일-가닥 올리고뉴클레오티드까지 확대되며, 상기 CpG 모티프는 시토신에 이어서 포스페이트 또는 포스포로티오에이트 결합에 의해 결합된 구아닌이고, 시토신의 피리미딘 고리는 비메틸화된다. 일 구현예에서, 하나 이상의 모티프는 하나 이상의 모티프와 함께 팔린드롬 서열을 제공하는 서열이 측면에 배치된다. 본원에 언급된 바와 같이, "팔린드롬 서열", 예를 들어, cggcgc:gcgccg(여기서, 팔린드롬의 중심은 ":"로 표시되어 있음)는 서열이 헤어핀을 형성할 수 있도록 역으로 상보적 서열에 결합된 정방향 서열을 제공한다. CpG 모티프는 서열의 중심을 형성할 수 있고/거나 팔린드롬 서열 내의 다른 곳에 존재할 수 있다. 바람직하게는, 팔린드롬 서열(정방향 및 역방향 서열 둘 모두 포함)은 8 내지 16개, 바람직하게는 10 내지 12개 또는 10 내지 14개 염기 길이이다.
추가의 바람직한 양태에서, CpG 올리고뉴클레오티드 서열은 팔린드롬 서열 5'-Pu Pu CG Pu:Py CG Py Py-3' 및/또는 컨센서스 서열 5'-Pu Py CG Py Pu-3' 중 하나 이상을 함유하며, 여기서, ":"으로 표시된 팔린드롬 중심으로부터 등거리의 Pu, Py 염기는 상보적이다. 임의로, CpG 올리고뉴클레오티드는 3' 또는 5' 말단에 3 내지 8개 염기 길이의 폴리 G 테일을 함유할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, CpG 올리고뉴클레오티드는 10 내지 14개 염기의 팔린드롬 서열 및 포스포로티오에이트 백본을 갖는 18 내지 27개 염기의 C형 CPG ODN이다. 하기의 서열을 갖는 ODN 2395가 특히 바람직하다:
5'-tcgtcgttttcggcgc:gcgccg-3'(팔린드롬 서열은 밑줄이 그어져 있음).
본 발명의 대안적인 바람직한 구현예에서, CpG 올리고뉴클레오티드는 18 내지 22개 염기 및 포스포로티오에이트 백본의 B형 CPG ODN이다. 하기의 서열을 갖는 ODN 1826이 특히 바람직하다:
5'-tccatgacgttcctgacgtt-3'.
TLR11 및 12 리간드는 동적 전환 및 액틴 세포골격의 재구성에 수반되는 액틴-결합 단백질인 프로필린(profilin)을 포함한다. 따라서, 바람직한 TLR11/12 리간드는 톡소플라스마증 질환을 야기하는 절대적, 세포내, 기생 원생동물인 톡소플라스마 곤디이(Toxoplasma gondii)로부터 유래된 프로필린이다. 프로필린은 예를 들어, 엔조 라이프 사이언스즈로부터 구매할 수 있다.
TLR13 리간드는 박테리아 리소좀 RNA 서열 "CGGAAAGACC" 및 이러한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함하며, 이러한 리간드는 본 발명의 바람직한 양태를 형성한다. 서열 5'-GGACGGAAAGACCCCGUGG-3'을 갖는 올리고뉴클레오티드는 TLR13 리간드이며, 예를 들어, 인비보겐으로부터 구매할 수 있다.
따라서, 바람직하게는, 상기 TLR 리간드는 TLR 2, 3, 4, 7, 8 또는 9 리간드, 바람직하게는 상기 기재된 바와 같은 리간드이다. 바람직한 구현예에서, TLR 리간드는 바람직하게는 상기 기재된 바와 같은 TLR 3 리간드이다. 대안적인 바람직한 구현예에서, TLR 리간드는 바람직하게는 상기 기재된 바와 같은 TLR 4 리간드이다. 또 다른 대안적인 바람직한 구현예에서, TLR 리간드는 바람직하게는 상기 기재된 바와 같은 TLR7 내지 9 리간드, 또는 TLR7 리간드 또는 TLR8 리간드 또는 TLR 9 리간드이다.
본원에 사용되는 "발현하는" 또는 "제시하는"은 분자의 적어도 일부분이 세포의 주변의 환경에 노출되거나 접근가능하게 하는, 바람직하게는, 면역 반응이 제시된 분자 또는 그의 부분에 대하여 생성될 수 있게 하는 상기 세포의 표면상의 항원 분자 또는 그의 부분의 존재를 말한다. "표면"상의 발현이 달성될 수 있으며, 여기서, 발현될 분자는 세포막 및/또는 상기 막에 제시되거나 상기 막에 제시되게 하는 성분과 접촉된다.
용어 "세포"는 본원에서 (곤충 세포 및 진균 세포를 포함하여) 모든 진핵 세포를 포함하는 것으로 사용된다. 따라서, 대표적인 "세포"는 모든 유형의 포유류 및 비-포유류 동물 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 진균 세포 및 원생동물을 포함한다. 그러나 바람직하게는, 세포는 포유류, 예를 들어, 고양이, 개, 말, 당나귀, 양, 돼지, 염소, 소, 마우스, 랫트(rat), 토끼, 기니피그 유래의 세포이나, 가장 바람직하게는 인간 유래의 세포이다. 본 발명의 방법, 용도 등으로 처리되는 세포는 투여되거나 그의 시토졸로 운반되는 분자를 그의 표면에 발현하거나 제시할 수 있는 임의의 세포일 수 있다.
세포는 편리하게 면역 세포, 즉, 면역 반응에 수반되는 세포이다. 그러나 다른 세포도 면역계에 항원을 제시할 수 있으며, 이들도 또한 본 발명의 범주에 속한다. 따라서, 본 발명에 따른 세포는 유리하게는 하기에 기재된 바와 같은 항원-제시 세포이다. 항원-제시 세포는 본원에 정의된 바와 같은 임의의 양태 또는 "아암(arm)"의 면역 반응에 수반될 수 있다.
세포독성 세포의 자극은 항원-제시 세포에 의해 특정 방식으로 항원이, 자극될 세포에 제시되는 것, 예를 들어, MHC 클래스 I 제시를 필요로 한다(예를 들어, CD8+ 세포독성 T-세포의 활성화는 MHC-1 항원 제시를 필요로 한다). 또한, 항체-생성 세포는 항원-제시 세포에 의한 항원의 제시에 의해 자극될 수 있다.
항원은 세포내이입에 의해 항원-제시 세포에 의해 흡수되고, 세포내이입 소낭에서 펩티드로 분해될 수 있다. 이들 펩티드는 엔도좀에서 MHC 클래스 II 분자에 결합하고, 세포 표면으로 운반될 수 있고, 여기서, 펩티드-MHC 클래스 II 복합체는 CD4+ T 헬퍼 세포에 의해 인식되고 면역 반응을 유도할 수 있다. 대안적으로, 시토졸 내의 단백질은 예를 들어, 프로테아좀에 의해 분해되고 TAP(항원 제시와 관련된 운반체)의 수단에 의해 소포체로 운반될 수 있으며, 여기서, 펩티드는 MHC 클래스 I 분자에 결합하고, 세포 표면으로 운반될 수 있다(문헌[Yewdell and Bennink, 1992, Adv. Immunol. 52: 1-123]). 펩티드가 외래 항원 기원의 것이면, 펩티드-MHC 클래스 I 복합체는 CD8+ 세포독성 T-세포(CTL)에 의해 인식될 것이다. CTL은 펩티드-MHC(HLA) 클래스 I 복합체에 결합하여, 활성화되며, 증식하기 시작하고 CTL의 클론을 형성할 것이다. 표적 세포 및 세포 표면상에 동일한 펩티드-MHC 클래스 I 복합체를 갖는 다른 표적 세포는 CTL 클론에 의해 사멸될 수 있다. 충분한 양의 항원이 시토졸로 도입될 수 있다면, 외래 항원에 대한 면역성이 확립될 수 있다(상기 문헌[Yewdell and Bennink, 1992]; 문헌[Rock, 1996, Immunology Today 17: 131-137]). 이것은 특히 암 백신의 개발을 위한 기반이다. 현실적인 가장 큰 문제 중 하나는 충분한 양의 항원(또는 항원의 부분)을 시토졸 내로 도입하는 것이다. 이는 본 발명에 따라 해결될 수 있다.
이전에 언급된 바와 같이, 항원 분자는 일단 광화학 내재화 과정에 의해 세포 시토질에 방출되면, 세포의 항원-처리 기구에 의해 처리되고, 적절한 방식으로, 예를 들어, 클래스 I MHC에 의해 세포 표면상에 제시될 수 있다. 이러한 처리는 항원의 분해, 예를 들어, 단백질 또는 폴리펩티드 항원의 펩티드로의 분해를 포함할 수 있으며, 이어서, 펩티드는 제시를 위하여 MHC의 분자와 복합체화된다. 따라서, 본 발명에 따른 세포의 표면상에 발현되거나 제시되는 항원 분자는 내재화(세포내이입)되는 항원 분자의 부분 또는 단편일 수 있다.
예를 들어, 림프구(T 및 B 세포 둘 모두), 수지상 세포, 대식구 등을 포함하는 다양한 상이한 세포 유형은 그들의 표면상에 항원을 제시할 수 있다. 다른 것들은 예를 들어, 암 세포, 예를 들어, 흑색종 세포를 포함한다. 이들 세포는 본원에 "항원-제시 세포"로 지칭된다. 면역계의 이펙터 세포로의 항원의 제시에 주로 수반되는 면역계의 세포인 "전문 항원-제시 세포"는 해당 분야에 알려져 있으며, 문헌에 기재되어 있고, B 림프구, 수지상 세포 및 대식구를 포함한다. 바람직하게는 세포는 전문 항원-제시 세포이다.
세포독성 T-세포(CTL)로의 항원-제시 세포에 의한 항원 제시를 위하여, 항원 분자는 항원-제시 세포의 시토졸에 유입될 필요가 있다(문헌[Germain, Cell, 1994, 76, 287-299]).
예를 들어, 시험관내 또는 생체외 방법 또는 대안적으로 생체내 방법을 포함하는 본 발명의 구현예에서, 세포는 수지상 세포이다. 수지상 세포는 포유류 면역계의 부분을 형성하는 면역 세포이다. 그들의 주요 기능은 항원 물질을 처리하고, 표면상의 항원 물질을 면역계의 다른 세포에 제시하는 것이다. 그들은 일단 활성화되면, 림프절로 이동하며, 여기서, 그들은 T 세포 및 B 세포와 상호작용하여, 적응 면역 반응을 개시한다.
수지상 세포는 조혈 골수 전구 세포로부터 유래된다. 이들 전구 세포는 처음에 높은 세포내이입 활성 및 낮은 T-세포 활성화능을 특징으로 하는 미성숙 수지상 세포로 전환한다. 일단 그들이 제시가능한 항원과 접촉하면, 그들은 성숙 수지상 세포로 활성화되고, 림츠절로 이동하기 시작한다. 미성숙 수지상 세포는 병원체를 식세포 작용시키고, 그들의 단백질을 작은 조각으로 분해하고, 성숙시에 MHC 분자를 사용하여 그들의 세포 표면에 그들 단편을 제시한다.
수지상 세포는 임의의 적절한 수지상 세포의 공급원으로부터, 예를 들어, 피부, 코, 폐, 위 및 장의 내면 라이닝 또는 혈액으로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 특히 바람직한 구현예에서, 수지상 세포는 골수로부터 유래된다.
수지상 세포는 본 발명의 시험관내 방법에 사용하기 위하여 천연 공급원으로부터 분리되거나, 시험관내에서 생성될 수 있다. 수지상 세포는 단핵구, 즉, 체내에서 순환하고, 올바른 신호에 따라, 수지상 세포 또는 대식구 중 어느 하나로 분화할 수 있는 백혈구로부터 발생한다. 차례로, 단핵구는 골수에서 줄기 세포로부터 형성된다. 단핵구-유도 수지상 세포는 시험관내에서 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 생성될 수 있다. 조직 배양 플라스크에 PBMC를 플레이팅하면, 단핵구가 부착하게 된다. 이들 단핵구를 인터류킨-4(IL-4) 및 과립구-대식구 콜로니 자극 인자(GM-CSF)로 처리하면, 약 1주 내에 미성숙 수지상 세포(iDC)로의 분화가 야기된다. 종양 괴사 인자(TNF)로의 이후의 처리에 의해, iDC가 성숙 수지상 세포로 추가로 분화한다.
본원에 사용되는 "접촉하는"은 세포 및 감광화 작용제 및/또는 항원 분자 및/또는 본원에 정의된 바와 같은 TLR 리간드가 세포로의 내재화에 적절한 조건하에, 예를 들어, 바람직하게는 적절한 영양 배지 중 37℃에서, 예를 들어, 25 내지 39℃에서, 또는 생체내에서 체온, 즉 36 내지 38℃에서 서로 물리적으로 접촉되게 하는 것을 말한다.
세포는 감광화 작용제 및 항원 분자 및 본원에 정의된 바와 같은 TLR 리간드와 순차적으로 또는 동시에 접촉될 수 있다. 바람직하게는, 편리하게, 성분은 동시에 세포와 접촉된다. 감광화 작용제 및 항원 분자(및 임의로 TLR 리간드)는 세포에 의해 동일하거나 상이한 세포내 구획으로 흡수될 수 있다(예를 들어, 그들은 동시-전위될 수 있다).
그 다음, 세포는 감광화 화합물을 활성화하기에 적합한 파장의 광에 노출되며, 이는 차례로 세포내 구획 막의 파괴를 야기한다.
WO 02/44396호(본원에 참조로 포함됨)에는 예를 들어, 감광화 작용제가 세포와 접촉되고, 내재화되어야 하는 분자(이러한 경우에 항원 분자)가 세포와 접촉되기 전에 조사에 의해 활성화되도록 방법의 단계의 순서가 배열될 수 있는 방법이 기재되어 있다. 이러한 방법은 내재화되어야 하는 분자가 조사시에 감광화 작용제와 동일한 세포 하위구획에 존재할 필요가 없다는 사실을 이용한다.
따라서, 일 구현예에서, 상기 감광화 작용제 및/또는 상기 항원 분자 및/또는 본원에 정의된 바와 같은 TLR 리간드는 함께 또는 서로 개별적으로 세포에 적용된다. 이어서, 조사는 적어도 감광화 작용제 및 항원 분자가 동일한 세포내 구획에 나타나는 시기에 수행된다. 이것은 "이후 광(light after)" 방법으로 지칭된다.
대안적인 구현예에서, 상기 방법은 상기 세포를 먼저 감광화 작용제와 접촉시킨 다음 항원 분자 및/또는 본원에 정의된 바와 같은 TLR 리간드와 접촉시킴으로써 수행될 수 있으며, 조사는 세포내 구획으로의 감광화 작용제의 흡수 이후에, 그러나, 상기 감광화 작용제를 함유하는 세포내 구획으로의 항원 분자(및 임의로 TLR 리간드)의 세포 흡수 이전에(예를 들어, 그것은 광 노출시에 상이한 세포내 구획에 존재할 수 있음), 바람직하게는 임의의 세포내 구획으로의 세포 흡수 이전에, 예를 들어, 임의의 세포 흡수 이전에 수행된다. 따라서, 예를 들어, 감광화 작용제가 투여된 다음 조사 이후 잔여 작용제의 투여가 행해질 수 있다. 이것은 소위 "이전 광(light before)" 방법이다.
본원에 사용되는 "내재화"는 분자의 세포내, 예를 들어, 시토졸 전달을 말한다. 본 발명의 경우에, "내재화"는 세포내/막 결합 구획으로부터 세포의 시토졸로의 분자의 방출 단계를 포함할 수 있다.
본원에 사용되는 "세포 흡수" 또는 "전위"는 세포막의 외부에 있는 분자가 예를 들어, 세포내이입 또는 다른 적절한 흡수 메커니즘에 의해 외측에 있는 세포막의 내부에서 관찰되도록 세포 내로, 예를 들어, 세포내 막-한정 구획, 예를 들어, 소포체, 골지체, 리소좀, 엔도좀 등 내로 흡수되거나 또는 그와 회합되는 내재화 단계 중 하나를 말한다.
세포를 다양한 작용제와 접촉시키는 단계는 임의의 편리한 또는 요망되는 방식으로 수행될 수 있다. 따라서, 접촉 단계가 시험관내에서 수행되어야 한다면, 세포는 편리하게 수성 배지, 예를 들어, 적절한 세포 배양 배지 중에 유지될 수 있으며, 적절한 시점에 다양한 작용제가 적절한 조건하에, 예를 들어, 적절한 농도에서 적절한 기간 동안 간단하게 배지에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 세포는 무혈청 배지의 존재하에 또는 혈청-함유 배지와 함께 작용제와 접촉될 수 있다.
하기의 언급은 세포로의 다양한 작용제의 개별적인 적용을 논의한다. 그러나 상기 논의된 바와 같이, 이들 작용제는 함께, 개별적으로, 동시에 또는 순차적으로 세포에 적용될 수 있다. 본원에 언급된 바와 같이, 본 발명의 방법에 사용되는 다양한 작용제의 적용은 시험관내 또는 생체내에서 세포에 대하여 이루어질 수 있다. 후자의 경우에, 적용은 하기에 더욱 상세하게 기재된 바와 같이 직접적인(즉, 국소화) 또는 간접적인(즉, 전신 또는 비-국소화) 투여를 통해 이루어질 수 있다.
감광화 작용제는 통상의 기술을 사용하여 숙련자에 의해 용이하게 결정될 수 있으며, 사용되는 특정 감광화 작용제 및 표적 세포 유형 및 위치와 같은 인자에 좌우될 것인 적절한 농도 및 적절한 기간 동안 세포와 접촉된다. 감광화 작용제의 농도는 편리하게 일단 세포 내로, 예를 들어 그의 세포내 구획 중 하나 이상 내로 흡수되거나 그와 회합되고 조사에 의해 활성화되면, 하나 이상의 세포 구조가 파괴되도록, 예를 들면 하나 이상의 세포내 구획이 용해되거나 파괴되도록 하는 정도이다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 감광화 작용제는, 예를 들면 10 내지 50 ㎍/㎖의 농도로 사용될 수 있다.
시험관내 이용을 위하여, 범위는 훨씬 더 넓은 범위, 예를 들어 0.0005 내지 500 ㎍/㎖일 수 있다. 생체내 인간 처치를 위하여, 감광화 작용제는 전신 투여되는 경우 0.05 내지 20 ㎎/㎏(체중)의 범위로 사용될 수 있다. 대안적으로, 전신 투여를 위하여 0.005 내지 20 ㎎/㎏(체중)의 범위가 사용될 수 있다. 더욱 편리하게, 감광화 작용제는 예를 들어, 피내, 피하 또는 종양내 투여에 의해 국소 투여되며, 상기 경우에, 용량은 1 내지 5000 ㎍, 예를 들어, 10 내지 2500, 25 내지 1000, 50 내지 500, 10 내지 300 또는 100 내지 300 ㎍의 범위일 수 있다. 바람직하게는, 용량은 100 ㎍, 150 ㎍, 200 ㎍ 및 250 ㎍으로부터 선택된다. 바람직하게는 용량은 75 내지 125 ㎍, 예를 들어, 100 ㎍이다. 제공되는 용량은 평균 체중(즉, 70 ㎏)의 인간에 대한 것이다. 피내 주사를 위하여, 감광제 용량은 100 ㎕ 내지 1 ㎖ 중에 용해될 수 있으며, 즉, 농도는 1 내지 50000 ㎍/㎖의 범위일 수 있다. 국소 투여되는 경우 상이한 동물에 대하여 용량의 적은 변동이 필요하지만, 보다 작은 동물에서, 농도 범위는 상이할 수 있으며, 이에 따라 조정될 수 있다.
사용될 항원의 농도는 사용될 항원에 좌우될 것이다. 편리하게, 0.001 내지 500 ㎍/㎖(예를 들어, 20 내지 500, 20 내지 300, 20 내지 100 ㎍/㎖, 20 내지 50, 10 내지 50, 5 내지 50, 1 내지 50, 0.01 내지 50 또는 0.001 내지 50 ㎍/㎖)의 항원의 농도가 시험관내에서 사용될 수 있다. 펩티드 항원에 있어서, 예를 들어, 0.001 내지 500, 예를 들어, 0.001 내지 1, 5, 25, 50 또는 100 ㎍/㎖의 더 낮은 농도가 사용될 수 있다. 단백질 항원에 있어서, 예를 들어, 0.5 내지 500 ㎍/㎖의 더 높은 농도가 사용될 수 있다. 생체내 이용을 위하여, 단백질 항원 용량은 0.5 내지 500 ㎍, 예를 들어, 10 내지 100 ㎍ 또는 10 내지 200 ㎍ 범위일 수 있다. 펩티드 항원에 있어서, 0.1 내지 4000 ㎍, 예를 들어, 0.1 내지 2000 ㎍, 0.1 내지 1000 ㎍ 또는 0.1 내지 500 ㎍, 예를 들어, 0.1 내지 100 ㎍의 생체내 용량이 사용될 수 있다. 그러한 용량은 국소 투여에 적절하다. 적절한 농도는 대상 세포로의 대상 작용제의 흡수의 효율 및 세포에서 달성하도록 요망되는 최종 농도에 따라 결정될 수 있다.
또한, 본원에 정의된 TLR 리간드의 농도는 사용될 특정 분자에 따라 달라질 것이며, 숙련자는 적합한 농도 또는 용량을 알 것이다. 적합한 시험관내 및 생체내 농도 또는 용량의 예는 하기 표 2에 나타나 있다.
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따라서, 예를 들어, 편리하게 1 내지 100 ㎍/㎖(예를 들어, 20 내지 100 ㎍/㎖ 또는 20 내지 50 ㎍/㎖)의 농도가 시험관내에서 사용될 수 있다. 10 내지 1000 ㎍의 생체내 용량의 이미다조퀴놀린 화합물이 사용될 수 있으며, 예를 들어, 마우스에서 20 내지 100 ㎍ 및 인간에서 10 ㎍ 내지 10 ㎎이 사용될 수 있다. 인간에서 예를 들어, 이미퀴모드의 국소 투여를 위하여, 2.5 내지 50 ㎎의 용량, 예를 들어, 1 내지 5 ㎎/㎠, 예를 들어, 2.5 ㎎/㎠가 사용될 수 있다. 레시퀴모드를 위하여, 용량은 0.1 내지 50 ㎎, 예를 들어, 1 내지 5 ㎎, 예를 들어, 1 내지 5 ㎎/㎠일 수 있다. 유사한 용량이 가디퀴모드에 대하여 적합하다. 이미다조퀴놀린 화합물의 피내 주사를 위하여, 더 작은 용량이 사용될 수 있으며, 예를 들어, 적어도 10 ㎍ 또는 50 ㎍, 예를 들어, 10 ㎍ 내지 1 ㎎이 사용될 수 있다. 유사 용량이 CpG 올리고뉴클레오티드 및 다른 TLR 리간드에 대하여 사용될 수 있다. 폴리(IC)는 마우스에서 1 내지 100 ㎍, 및 인간에서 1 ㎍ 내지 10 ㎎의 생체내 용량으로 투여될 수 있다.
대부분의 경우에, 감광화 작용제, 항원 분자 및 본원에 정의된 바와 같은 TLR 리간드는 함께 투여되나, 이것은 달라질 수 있다. 따라서, 각각의 상이한 성분에 대하여 상이한 투여(또는 세포와 접촉되는) 시간 또는 방식 또는 부위가 고려되며, 그러한 방법은 본 발명의 범주 내에 포함된다.
일 구현예에서, 본원에 정의된 바와 같은 TLR 리간드, 예를 들어, CpG 올리고뉴클레오티드 또는 이미다조퀴놀린 화합물, LPS 또는 폴리(IC) 분자는 항원과 개별적으로, 예를 들어, 개별 제형, 예를 들어, 크림 또는 겔로, 또는 전신으로, 예를 들어, 경구 투여(예를 들어, 레시퀴모드를 사용)를 통해 투여된다. 따라서, 일 구현예에서, TLR 리간드, 예를 들어, CpG 올리고뉴클레오티드 또는 이미다조퀴놀린 화합물은 예를 들어, 국소(국부) 전처리에 의하여 항원 및/또는 감광제의 투여 전에, 예를 들어, 24시간 전에 투여될 수 있다. 일부 경우에, TLR 리간드, 예를 들어, 폴리(IC) 또는 LPS는 항원 이전에, 그와 함께 또는 그 이후에 투여된다.
TLR 리간드는 다른 작용제에 상대적으로 개별적으로 예를 들어, 조명하기 대략 2시간 전에 투여될 수 있다. 대안적인 구현예에서, 작용제는 항원과 함께 또는 항원과 동시에, 즉 동시 투여될 수 있다.
세포와 감광화 작용제 및/또는 항원 분자 및/또는 본원에 정의된 바와 같은 TLR 리간드 간의 접촉은 편리하게 15분 내지 24시간, 예를 들어, 30분 내지 4시간, 바람직하게는 1.5 내지 2.5시간이다. 대안적으로, 시간의 범위는 약 1시간 내지 약 48시간, 예를 들어, 약 2시간 내지 약 40시간 또는 약 6시간 내지 약 36시간, 예를 들어, 12시간 내지 30시간, 예를 들어, 16시간 내지 20시간, 예를 들어, 18시간 또는 약 18시간일 수 있다.
바람직한 구현예에서, 세포의 초기 인큐베이션은 감광화 작용제와 함께 이루어진다. 일 구현예에서, 감광화 작용제 및 항원 분자 및/또는 TLR 리간드의 투여 사이의 시간은 약 수 시간이다. 예를 들어, 감광화 작용제는 조명 이전 16 내지 20시간, 예를 들어, 18시간에 적용될 수 있으며, 항원 분자 및/또는 TLR 리간드는 조명 이전 1 내지 3시간, 예를 들어, 2시간에 적용될 수 있다. 따라서, 감광화 작용제 및 항원 분자 및/또는 TLR 리간드의 투여 사이의 시간은 15 내지 23시간의 범위일 수 있다.
따라서, 세포를 이어서 감광제와의 인큐베이션 후에 항원 및/또는 본원에 정의된 바와 같은 TLR 리간드와 인큐베이션시킨다. 편리하게, 세포를 감광제/항원과의 접촉 후에, 그리고 조사 전에, 감광제 및 항원 분자 및 TLR 리간드와의 인큐베이션 시기에 따라, 예를 들어, 30분 내지 4시간, 예를 들어, 1.5 내지 2.5시간 동안 감광제/항원-부재 배지에 배치할 수 있다.
생체 내에서, 다양한 작용제를 표적 세포와 접촉시키는 적절한 방법 및 인큐베이션 시간은 투여 방식 및 사용되는 작용제의 유형과 같은 인자에 좌우될 것이다. 예를 들어, 작용제가 치료/조사될 종양, 조직 또는 기관 내로 주사된다면, 주사 지점 근처의 세포는 주사 지점으로부터 더 먼 거리에 위치한 세포보다 더욱 신속하게 작용제와 접촉하게 되고, 이에 따라 이를 흡수하는 경향이 있을 것이며, 주사 지점으로부터 더 먼 거리에 위치한 세포는 아마도 이후의 시점에 더 낮은 농도로 작용제와 접촉하게 될 것이다. 편리하게 6 내지 24시간이 사용될 수 있다.
또한, 정맥내 주사에 의해 또는 경구로 투여되는 작용제는 표적 세포에 도달하는데 시간이 다소 걸릴 수 있으며, 이에 따라, 충분량 또는 최적량의 작용제가 표적 세포 또는 조직에 축적되기 위해서는 더 긴 투여후 시간, 예를 들면 수 일이 걸릴 수 있다. 따라서, 생체내에서 개별 세포에 필요한 투여 시간은 아마도 이들 및 다른 파라미터에 따라 변할 것이다.
그럼에도 불구하고, 생체내 상황이 시험관내 보다 더욱 복잡하긴 하지만, 본 발명의 기본 개념은 여전히 동일하며, 다시 말하면, 분자가 표적 세포와 접촉하게 되는 시간은, 조사가 발생하기 전에 적절한 양의 감광화 작용제가 표적 세포에 의해 흡수되고, (i) 조사 전에 또는 그 동안에 항원 분자(및 임의로 TLR 리간드)가 표적 세포와 충분히 접촉한 후에 세포 내로, 예를 들어, 감광화 작용제와 비교하여 동일하거나 상이한 세포내 구획 내로 흡수되었거나, 그에 흡수될 것이거나, 또는 (ii) 조사 후에 항원 분자(및 임의로 TLR 리간드)가 그의 세포 내로의 흡수를 가능하게 하기에 충분한 기간 동안 세포와 접촉하도록 하는 시간이어야 한다.
본원에 기재된 작용제의 생체내의 투여를 위하여, 해당 분야에 통상적이거나 표준인 임의의 투여 방식, 예를 들어, 주사, 주입, 국소 투여, 경피 투여, 체표면 내부 및 외부 둘 모두로의 투여 등이 사용될 수 있다. 생체내 이용을 위하여, 본 발명은 체액 위치 및 고상 조직을 포함한, 감광화 작용제 함유 화합물 또는 내재화될 분자가 국소화되는 세포를 함유하는 임의의 조직과 관련하여 사용될 수 있다. 감광제가 표적 세포에 의해 흡수되고 광이 적절하게 전달될 수 있는 한은 모든 조직이 처리될 수 있다. 바람직한 투여 방식은 피내, 피하, 국소 또는 종양내 투여 또는 주사이다. 바람직하게는, 투여는 피내 주사에 의한다.
요망되는 결과, 예를 들어, 항원 제시, 면역 반응의 생성 또는 백신접종을 달성하기 위하여, 상기 방법 또는 그의 부분이 반복될 수 있으며, 예를 들어, "재-백신접종"이 일어날 수 있다. 따라서, 상기 방법은 그 전체가 적절한 간격 후에 다수회(예를 들어, 2, 3회 이상) 수행될 수 있거나, 상기 방법의 부분, 예를 들어, 본원에 정의된 바와 같은 TLR 리간드의 추가의 투여 또는 추가의 조사 단계가 반복될 수 있다. 예를 들어, 상기 방법 또는 상기 방법의 부분은 그것이 처음 수행되고, 약 수 일, 예를 들어, 5 내지 60일(예를 들어, 7, 14, 15, 21, 22, 42 또는 51일), 예를 들어, 7 내지 20일, 바람직하게는 14일 또는 수 주, 예를 들어, 1 내지 5주(예를 들어, 1, 2, 3 또는 4주) 후에 다시 수행될 수 있다. 상기 방법의 전부 또는 그의 부분이 적절한 시간 간격으로, 예를 들어, 2주 또는 14일마다 다수회 반복될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 방법은 적어도 1회 반복된다. 다른 구현예에서, 상기 방법은 2회 반복된다.
일 구현예에서, 상기 방법이 수행되는 2번째 또는 이후의 회차에서, 항원 분자가 감광제 및 조명과 조합하여 투여되며, 즉, 상기 방법이 수행되는 2번째 또는 이후의 회차에서 TLR 리간드가 투여되지 않는다.
대안적인 구현예에서, 본 발명의 방법의 부분은 본 발명의 방법이 수행되기 전에 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 본 발명의 방법이 수행되기 전에 TLR 리간드의 부재하에 1회 이상, 예를 들어, 2회 수행될 수 있다. 대안적으로, 상기 방법은 본 발명의 방법이 수행되기 전에 감광제 및 조명의 부재하에 1회 이상, 예를 들어, 2회 수행될 수 있다. 상기 방법의 부분은 본 발명의 방법이 수행되기 약 수 일, 예를 들어, 7 또는 14일 또는 수 주, 예를 들어, 1, 3 또는 4주 전에 수행될 수 있다. 상기 방법의 부분은 본 발명의 방법이 수행되기 전에 이들 시간 간격에서 1회 이상 반복될 수 있다. 따라서, 바람직한 양태에서, 항원 분자는 (예를 들어, 상기 논의된 시간 간격으로) 2회 이상 (예를 들어, 대상체에게) 투여되며, 여기서, 적어도 상기 항원 분자의 투여는 본 발명의 방법에 따라 수행된다.
감광화 작용제를 활성화시키기 위한 "조사"는 하기에 기재된 바와 같이 직접적인 또는 간접적인 광의 투여를 말한다. 따라서, 대상체 또는 세포는 예를 들어, 직접적으로(예를 들어, 시험관내에서 단일 세포에) 또는 간접적으로, 예를 들어, 생체내에서 세포가 피부의 표면 아래 있거나 또는 모두가 다른 세포의 차단이 없는, 즉, 직접 조명되는 것이 아닌 세포층의 형태인 경우에 광원으로 조명될 수 있다. 세포 또는 대상체의 조명은 감광화 작용제, 항원 분자 및 본원에 정의된 바와 같은 TLR 리간드를 투여하고 대략 18 내지 24시간 후에 일어날 수 있다.
감광화 작용제를 활성화시키기 위한 광 조사 단계는 해당 분야에 잘 알려진 기술 및 절차에 따라 일어날 수 있다. 사용되는 광의 파장은 사용되는 감광화 작용제에 따라 선택된다. 적합한 인공 광원, 예를 들어, 청색(400 내지 475 ㎚) 또는 적색(620 내지 750 ㎚) 파장 광의 이용이 해당 분야에 잘 알려져 있다. TPCS2a에 있어서, 예를 들어, 400 내지 500 ㎚, 더욱 바람직하게는 400 내지 450 ㎚, 예를 들어, 430 내지 440 ㎚, 더더욱 바람직하게는 대략 435 ㎚ 또는 435 ㎚의 파장이 이용될 수 있다. 적절한 경우, 감광제, 예를 들어, 포르피린 또는 클로린은 녹색 광에 의해 활성화될 수 있으며, 예를 들어, 킬러레드(KillerRed)(Evrogen, Moscow, Russia) 감광제는 녹색 광에 의해 활성화될 수 있다.
적합한 광원, 예를 들어, 피씨아이 바이오테크 에이에스(PCI Biotech AS)의 루미소스(LumiSource)® 램프가 해당 분야에 잘 알려져 있다. 대안적으로, 최대 60 ㎽의 조정가능한 출력 전력 및 430 내지 435 ㎚의 발광 스펙트럼을 갖는 LED-기반의 조명 장치가 사용될 수 있다. 적색 광에 있어서, 적합한 조명원은 피씨아이 바이오테크 에이에스 652 ㎚ 레이저 시스템 SN576003 다이오드 레이저이지만, 임의의 적합한 적색 광원이 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에서 세포가 광에 노출되는 시간은 달라질 수 있다. 시토졸 내로의 분자의 내재화 효율은 광에 대한 노출 증가와 함께 최대치로 증가하며, 이를 넘어서면, 세포 손상 및 이에 따른 세포사가 증가한다.
조사 단계를 위한 바람직한 기간은 표적, 감광제, 표적 세포 또는 조직에 축적되는 감광제의 양 및 감광제의 흡수 스펙트럼과 광원의 방출 스펙트럼 사이의 중첩과 같은 인자에 좌우된다. 일반적으로, 조사 단계를 위한 기간은 대략 수 초 내지 수 분 또는 최대 수 시간(심지어 최대 12시간), 예를 들어, 바람직하게는 최대 60분, 예를 들어, 0.25 또는 1 내지 30분, 예를 들어, 0.5 내지 3분 또는 1 내지 5분 또는 1 내지 10분, 예를 들어, 3 내지 7분, 바람직하게는 대략 3분, 예를 들어, 2.5 내지 3.5분이다. 더 짧은 조사 시간, 예를 들어, 1 내지 60초, 예를 들어, 10 내지 50, 20 내지 40 또는 25 내지 35초가 사용될 수도 있다.
적절한 광 선량은 해당 분야의 숙련자에 의해 선택될 수 있으며, 다시 사용되는 감광제 및 표적 세포 또는 조직에 축척된 감광제의 양에 좌우될 것이다. 광 선량은 통상 가시 스펙트럼의 (예를 들어, 사용되는 감광제에 따라, 적색 영역에서 또는 청색 광이 사용된다면 청색 영역에서) 더 높은 흡광계수를 갖는 감광제가 사용되는 경우 더 낮다. 예를 들어, 최대 60 ㎽의 조정가능한 출력 전력 및 430 내지 435 ㎚의 발광 스펙트럼을 갖는 LED-기반의 조명 장치가 사용되는 경우, 0.05 내지 20 ㎽/㎠, 예를 들어, 2.0 ㎽/㎠의 영향 범위에서 0.24 내지 7.2 J/㎠ 범위의 광 선량이 사용될 수 있다. 대안적으로, 예를 들어, 루미소스® 램프가 사용된다면, 0.1 내지 20(예를 들어, 루미소스®에 의해 제공되는 바와 같이 13) ㎽/㎠의 영향 범위에서 0.1 내지 6 J/㎠의 범위의 광 선량이 적절하다. 적색 광에 있어서, 0.1 내지 5 ㎽/㎠, 예를 들어, 0.81 ㎽/㎠의 영향 범위에서 0.03 내지 1 J/㎠, 예를 들어, 0.3 J/㎠의 광 선량이 사용될 수 있다.
또한, 세포 생존력이 유지되어야 한다면, 과도한 수준의 독성 화학종의 생성이 회피되어야 하고, 그에 따라 관련 파라미터가 조정될 수 있다.
본 발명의 방법은 광화학 치료, 즉, 감광화 작용제의 활성화 시의 독성 화학종의 생성을 통한 광역학 치료법 효과에 의해 불가피하게 일부 세포 손상을 야기할 수 있다. 제안된 용도에 따라, 이러한 세포사는 중요하지 않을 수 있으며 실제로 일부 응용(예를 들어, 암 치료)에 유리할 수 있다. 그러나 대부분의 구현예에서, 제시 세포로부터 면역 반응의 생성을 가능하게 하도록 세포사가 회피된다. 생존 세포의 분율 또는 비율이 감광화 작용제의 농도에 비하여 광 선량을 선택함으로써 조절되도록 본 발명의 방법은 변형될 수 있다. 다시, 그러한 기술은 해당 분야에 알려져 있다.
바람직하게는, 실질적으로 모든 세포, 또는 상당한 대다수(예를 들어, 세포의 적어도 75%, 더욱 바람직하게는 적어도 80, 85, 90 또는 95%)는 죽지 않는다. PCI 치료 후의 시험관내 세포 생존율은 MTS 시험과 같은 해당 분야에 알려진 표준 기술에 의해 측정될 수 있다. 하나 이상의 세포 유형의 생체내 세포사는 예를 들어, 현미경 관찰에 의해 투여 지점의 1 ㎝ 반경(또는 조직의 소정의 깊이) 내에서 평가될 수 있다. 세포사가 즉시 발생하지 않을 수 있기 때문에, 세포사%는 수 시간의 조사(예를 들어, 조사 후 최대 4시간) 내에 생존가능하게 남아 있는 세포의 백분율을 말하나, 바람직하게는 조사하고 4시간 이상 후에 생존가능한 세포%를 말한다.
상기 방법은 생체내에서, 시험관내에서 또는 생체외에서 수행될 수 있다. 바람직하게는, 상기 방법은 시험관내 또는 생체외에서 사용되어, 생체내에서의 투여를 위해 세포를 생성하거나, 상기 방법은 생체내에서 사용된다. 따라서, 바람직한 특징에서, 상기 방법은 대상체에서 면역 반응을 생성하기 위해 사용될 수 있다.
따라서, 추가의 양태에서, 본 발명은 대상체에게 항원 분자, 감광화 작용제 및 본원에 상기 정의된 바와 같은 TLR 리간드를 투여하는 단계 및 상기 감광화 작용제를 활성화하기에 유효한 파장의 광으로 상기 대상체를 조사하는 단계로서, 면역 반응이 생성되는 단계를 포함하는, 대상체에서의 면역 반응의 생성 방법을 제공한다.
생성될 수 있는 "면역 반응"은 체액성 및 세포-매개의 면역, 예를 들어, 항체 생성의 자극 또는 세포독성 또는 킬러(killer) 세포의 자극일 수 있으며, 이는 그들의 표면상에 "외래" 항원을 발현하는 세포를 인식하고 파괴(또는 다르게는 제거)할 수 있다. 따라서, 용어 "면역 반응의 자극"은 모든 유형의 면역 반응 및 면역 반응을 자극하기 위한 메커니즘을 포함하며, CTL의 자극을 포함하고, 이는 본 발명의 바람직한 양태를 형성한다. 바람직하게는, 자극되는 면역 반응은 세포독성 CD8 T 세포이다. 면역 반응의 정도는 면역 반응의 마커, 예를 들어, 분비된 분자, 예를 들어, IL-2 또는 IFNγ 또는 항원 특이적 T 세포의 생성에 의해 평가(예를 들어, 실시예에 기재된 바와 같이 평가)될 수 있다.
세포독성 세포 또는 항체-생성 세포의 자극은 항원-제시 세포에 의해, 예를 들어, MHC 클래스 I 제시에 의해 특정 방식으로 항원이, 자극될 세포에 제시되는 것이 필요하다(예를 들어, CD8+ 세포독성 T-세포의 활성화는 MHC-I 항원 제시를 필요로 한다). 바람직하게는, 면역 반응은 MHC-I 제시를 통해 자극된다.
바람직하게는, 질환, 장애 또는 감염, 예를 들어, 암을 치료하거나 예방하기 위하여 면역 반응이 사용된다.
일 구현예에서, 암은 흑색종이다. 흑색종은 멜라닌, 피부색의 원인이 되는 어두운 색소의 생성에 책임이 있는 세포인 멜라닌세포의 악성 종양이다. 이들 세포는 주로 피부에서 발생하지만, 장 및 눈을 포함하는 신체의 다른 부분에서도 관찰된다. 흑색종은 멜라닌세포를 함유하는 신체의 임의의 부분에서 기원할 수 있다.
본원에 언급된 "흑색종"은 예를 들어, 표재 확산 흑색종, 결절성흑색종, 악성 흑점자 흑색종, 결합조직형성흑색종, 말단흑자흑색종 및 무색소흑색종, 폴립성 흑색종(polypoid melanoma), 작은 신경-유사 세포가 있는 흑색종 및 스피츠모반의 특징이 있는 흑색종을 포함하는 모든 유형의 흑색종을 포함한다.
흑색종 중 대다수가 피부에 의해 발생하지만(피부 악성 흑색종), 흑색종은 또한, 신체 내의 다른 곳에서, 예컨대, 내부 기관에서, 예를 들어, 점막에서 발생할 수 있다. 투명 세포 육종은 연조직의 악성 흑색종이다. 흑색종은 또한, 눈(포도막 흑색종), 외음부, 질 또는 직장에서도 발생할 수 있다. 이들 흑색종도 또한 본 발명의 범주에 포함된다. 바람직하게는, 치료될 흑색종은 피부 흑색종이다. 또한, 흑색종은 전이 흑색종, 즉, 1차 흑색종으로부터 기원하지만, 상이한 위치로 전이되어 2차 종양을 제공하는 세포까지 확대된다. 본원에 기재된 흑색종의 치료 또는 예방은 1차 흑색종 및/또는 1차 흑색종으로부터 유래하는 2차 종양의 치료까지 확대된다. 이와 같이, 본 발명은 또한 전이성 흑색종의 치료에 유용하다.
대안적인 구현예에서, 암은 유두종 바이러스, 특히 인유두종 바이러스(HPV)와 관련이 있거나, 그에 의해 유발/유도된다. 상기 논의된 바와 같이, 유두종 바이러스 게놈은 숙주 세포의 초기 감염 직후에 발현되는 6개(E1, E2, E4, E5, E6 및 E7)의 오픈 리딩 프레임(ORF)을 인코딩하는 초기 영역(E), 및 주 캡시드 단백질 L1 및 부 캡시드 단백질 L2를 인코딩하는 후기 영역(L)으로 나뉜다. 모든 바이러스 ORF는 하나의 DNA 가닥상에 인코딩된다. HPV 감염으로부터 야기되는 암과 관련이 있을 수 있는, 본 발명에 따라 사용될 수 있는 HPV 항원은 본원에 논의된 바와 같은 하나 이상의 알려져 있는 항원 펩티드 또는 T-세포 에피토프일 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, 몇몇 유형의 HPV가 존재하며, 본 발명에 따른 HPV와 관련된 암은 임의의 유형의 HPV, 예를 들어, HPV-16 및/또는 HPV-18, 또는 HPV-31 또는 HPV-45와 관련이 있거나 그로부터 야기될 수 있다. 본 발명에 따라 사용될 항원은 E1, E2, E4, E5, E6 또는 E7 단백질 중 임의의 것 또는 L1 및 L2 단백질 중 임의의 것으로부터 유도될 수 있다. 따라서, 항원 분자는 HPV-16 및 18의 E2, E6 및 E7 단백질 중 하나 이상으로부터 유도될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 항원 분자는 HPV-16 E7 서열 GQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIR(CD8 에피토프는 볼드체로 나타나 있음)을 함유한다. 따라서, HPV 항원은 35개 아미노산 펩티드일 수 있다. 대안적으로, 항원 분자는 오직 CD8 에피토프 RAHYNIVTF, 즉, 더 짧은 펩티드일 수 있다.
대안적인 구현예에서, 질환, 장애 또는 감염은 바이러스 감염, 바람직하게는 유두종 바이러스 감염, 특히 인유두종 바이러스(HPV) 감염이다.
바람직하게는, 상기 방법은 백신접종을 위해 사용된다. 본원에 언급되는 "백신접종"은 질환, 장애 또는 감염의 발생(또는 추가의 발생)에 대하여 예방적이거나 치료적인 면역 반응을 유도하기 위한 항원(또는 항원을 함유하는 분자)의 사용이며, 상기 질환, 장애 또는 감염은 항원의 비정상적인 발현 또는 존재와 관련이 있다. 바람직하게는, 질환은 암, 예를 들어, 흑색종 또는 유두종 바이러스, 예를 들어, HPV와 관련이 있는 암이다. 일 구현예에서, 백신접종은 예를 들어, 본원에 논의된 암의 치료에서 치료적 백신접종이다. 대안적인 구현예에서, 백신접종은 예를 들어, 암을 예방하거나, 치료적 백신접종을 사용한 더 조기의 암의 치료 후에 발생하는 추가의 암을 줄이기 위한 예방적 백신접종이다. 추가의 구현예에서, 감염, 예를 들어, 바이러스 감염, 예를 들어, HPV 감염에 대한 면역 반응이 생성되어야 하는 경우, 백신접종은 성질이 예방적이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 방법, 예를 들어, 백신접종의 대상체는 포유류, 바람직하게는 고양이, 개, 말, 당나귀, 양, 돼지, 염소, 소, 마우스, 랫트, 토끼 또는 기니피그이나, 가장 바람직하게 대상체는 인간이다.
바람직하게는, 본원에 기재된 방법은 상승효과를 달성하며, 즉, 세포 표면 제시 또는 생성된 면역 반응의 정도는 (i) TLR 리간드의 부재하에 항원 분자를 사용하여 상기 방법을 수행하는 것 및 (ii) 감광화 작용제 및 조사 단계의 부재하에 항원 분자를 사용하여 상기 방법을 수행하는 것에 의해 관찰되는 향상을 합한 것보다 더 크게 향상되며, 즉, 방법 간의 상승효과가 관찰된다. 세포 표면 제시 또는 면역 반응 생성의 수준은 적절한 수단, 예를 들어, 항원-특이적 CD8+ 세포의 개수 또는 면역 반응 활성화 마커, 예를 들어, IFNγ 또는 IL-2의 수준에 의해 평가될 수 있다.
본원에 사용되는 "상승효과"는 단지 상가적인 효과를 넘어서는 양적인 개선을 말한다.
본 발명의 방법에 사용되는 다양한 작용제는 개별적으로, 순차적으로 또는 동시에 대상체에게 투여될 수 있다.
본 발명의 세포의 표면상의 항원 분자 또는 그의 부분의 발현 방법과 관련하여 상기 논의된 양태 및 특징은 적절한 경우, 상기 면역 반응의 생성 방법에도 적용가능하다.
또한, 본 발명은 세포를 도입되어야 하는 항원 분자, 감광화 작용제 및 본원에 정의된 바와 같은 TLR 리간드와 접촉시키는 단계 및 감광화 작용제를 활성화시키는데 유효한 파장의 광으로 세포를 조사하는 단계를 포함하는 세포의 시토졸 내로의 항원 분자의 도입 방법을 제공한다. 상기 화합물을 함유하는 상기 세포 내의 세포내 구획은 일단 활성화되면, 이들 구획에 함유된 분자를 시토졸 내로 방출한다.
상기 본 발명의 방법은 예를 들어, 동소 처리 또는 생체외 처리에 이어서, 신체로의 처리된 세포의 투여를 위해 시험관내 또는 생체내에서 사용될 수 있다.
본 발명은 추가로 표면상에 항원 분자 또는 그의 부분을 발현하는 세포 또는 그의 집단을 제공하며, 이 세포는 본원에 정의된 바와 같은 방법 중 임의의 것에 의해 수득가능하다(또는 수득된다). 또한, 본원에 하기에 기재된 바와 같이, 예방 또는 치료에 사용하기 위한 세포 또는 세포 집단이 제공된다.
세포 집단은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 희석제, 담체 또는 부형제도 또한 포함하는 약제학적 조성물에 제공될 수 있다.
또한, 본 발명은 항원 분자, 감광화 작용제 및 본원에 정의된 바와 같은 TLR 리간드, 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 희석제, 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
이들 조성물(및 본 발명의 제품)은 예를 들어, 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 희석제, 담체 또는 부형제를 이용하여 약제 기술분야에 알려진 기술 및 방법에 따라 임의의 편리한 방식으로 제형화될 수 있다. 본원에 언급된 "약제학적으로 허용되는"은 조성물(또는 제품)의 다른 성분과 상용성이며, 수여자에게 생리학적으로 허용되는 성분을 말한다. 조성물의 성질 및 담체 또는 부형제 물질, 용량 등은 선택 및 요망되는 투여 경로, 치료 목적 등에 따라 통상적인 방식으로 선택될 수 있다. 용량도 마찬가지로 통상적인 방식으로 결정될 수 있으며, 분자(또는 조성물 또는 제품의 성분)의 성질, 치료 목적, 환자의 연령, 투여 방식 등에 좌우될 수 있다. 감광화 작용제와 관련하여, 조사시 막을 파괴하는 효력/능력도 고려하여야 한다.
세포, 예를 들어, 항원 제시 세포는 시험관내에서 제조될 수 있다. 치료 방법에서, 이들 세포는 그들 세포가 예를 들어, 예방적 또는 치료적 목적을 위해 면역 반응을 자극할 수 있도록 생체내에서 신체로 투여되거나 생체외에서 신체 조직으로 투여될 수 있다.
따라서, 본 발명은 추가로 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 또는 면역 반응을 자극하는데 사용하기 위한, 예를 들어, 백신접종 목적을 위한, 예를 들어, 대상체에서 CTL을 자극하기 위한, 바람직하게는 상기 대상체에서 질환, 장애 또는 감염을 치료하거나 예방하기 위한, 특히, 암, 예를 들어, 흑색종 또는 유두종 바이러스, 예를 들어, HPV와 관련된 암을 치료하거나 예방하기 위한 본원에 정의된 바와 같은 세포 집단(또는 세포 집단을 함유하는 조성물) 또는 항원 분자, 감광화 작용제 및 본원에 정의된 바와 같은 TLR 리간드를 제공한다. 다르게 정의하면, 본 발명은 대상체에서 면역 반응을 자극하는데 사용하기 위한(예를 들어, CTL을 자극하기 위한), 바람직하게는 상기 대상체에서 질환, 장애 또는 감염을 치료하거나 예방하기 위한, 바람직하게는 백신접종을 위한 및/또는 암, 예를 들어, 흑색종 또는 유두종 바이러스, 예를 들어, HPV와 관련된 암을 치료하거나 예방하기 위한 약제의 제조를 위한 (i) 세포 집단, (ii) 본원에 정의된 바와 같은 조성물 또는 (iii) 항원 분자 및/또는 감광화 작용제 및/또는 TLR 리간드의 용도를 제공하며, 바람직하게는 상기 면역 반응은 본원에 정의된 바와 같은 방법에 의해 자극된다.
상기 자극, 치료 또는 예방은 바람직하게는 상기 약제를 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
항원 분자, 감광화 작용제 및 TLR 리간드가 조합되고, 조성물로 존재할 수 있다. 다르게 표현하면, 본 발명은 면역 반응을 자극하기 위한(예를 들어, 대상체에서 CTL을 자극하기 위한), 바람직하게는 상기 대상체에서 질환, 장애 또는 감염을 치료하거나 예방하기 위한, 특히 백신접종 목적을 위한 약제의 제조에서의 항원 분자 및/또는 감광화 작용제 및/또는 본원에 정의된 바와 같은 TLR 리간드의 용도를 제공하며, 상기 약제는 상기 대상체로의 투여를 위한, 본원에 정의된 바와 같은 방법에 의해 수득가능한 세포의 표면상에 항원 분자 또는 그의 부분을 발현하는 세포의 집단을 포함한다. 바람직하게는, 세포 집단은 그러한 방법에 의해 수득된다. 집단은 대상체에게 투여하기 위한 것이다.
대안적인 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 면역 반응을 자극하기 위해(예를 들어, CTL을 자극하기 위해), 바람직하게는 상기 대상체에서 질환, 장애 또는 감염을 치료하거나 예방하기 위해, 세포의 표면상에 항원 분자 또는 그의 부분을 발현하데 이용하기 위한 항원 분자, 감광화 작용제 및 본원에 정의된 바와 같은 TLR 리간드를 제공하며, 상기 이용은 바람직하게는 세포의 집단, 예를 들어, 수지상 세포를 제조하기 위한 본원에 정의된 바와 같은 방법을 포함한다. 그 다음, 이들 세포는 대상체에게 투여될 수 있다.
본 발명은 추가로 바람직하게는 대상체에서 질환, 장애 또는 감염을 치료하거나 예방하기 위하여, 본원에 정의된 바와 같은 방법에서 대상체 내의 면역 반응의 자극에서의 동시의, 개별적인 또는 순차적인 이용을 위한(또는 세포의 표면상에 항원 분자 또는 그의 부분을 발현하기 위한 또는 항원 분자를 세포의 시토졸 내로 내재화하기 위한), 항원 분자, 감광화 작용제 및 본원에 정의된 바와 같은 TLR 리간드를 포함하는 제품을 조합된 제제로서 제공한다.
또한, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 방법에서, 대상체에서 면역 반응을 자극하는데 사용하기 위한, 바람직하게는 상기 대상체에서 질환, 장애 또는 감염을 치료하거나 예방하기 위한, 예를 들어, 백신접종 또는 면역화에 사용하기 위한, 또는 세포의 표면상에 항원 분자 또는 그의 부분을 발현하기 위한, 또는 항원 분자를 세포의 시토졸 내로 내재화시키기 위한 키트를 제공하며, 상기 키트는
본원에 정의된 바와 같은 감광화 작용제를 함유하는 제1 용기;
본원에 정의된 바와 같은 상기 항원 분자를 함유하는 제2 용기; 및
본원에 정의된 바와 같은 TLR 리간드를 함유하는 제3 용기를 포함한다.
본 발명의 제품 및 키트는 본원에 정의된 바와 같은 세포 표면 제시(또는 치료 방법)를 달성하기 위하여 사용될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 본원에 정의된 방법에 따라 세포의 집단을 제조하는 단계 및 이후에 상기 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 바람직하게는 상기 대상체에서 질환, 장애 또는 감염을 치료하거나 예방하기 위한 대상체에서의 (예를 들어, CTL을 자극하기 위한) 면역 반응의 생성 방법을 제공한다.
청구된 발명에 의해 달성되는 항원 제시는 처리된 세포가 생체내에서 투여되는 경우, 유리하게 면역 반응의 자극을 야기할 수 있다. 바람직하게는, 상기 항원 분자 또는 그의 부분을 포함하거나 함유하는 엔티티(entity)에 의한 이후의 시험감염(challenge)에 대하여 보호를 부여하는 면역 반응이 생성되며, 결과적으로, 본 발명은 백신접종 방법으로서 특히 유용하다.
질환, 장애 또는 감염은 면역 반응의 생성에 의해, 예를 들어, 정상 세포에 비한 식별(및 제거)을 가능하게 하는 항원(또는 그의 발현 수준)에 기초하여 확인될 수 있는 비정상 또는 외래 세포를 제거함으로써 치료되거나 예방될 수 있는 임의의 질환, 장애 또는 감염이다. 사용될 항원 분자의 선택은 치료될 질환, 장애 또는 감염을 결정한다. 상기 논의된 항원 분자에 기초하여, 본원에 기재된 방법, 용도, 조성물, 제품, 키트 등은 예를 들어, 감염(예를 들어, 본원에 상기 언급된 바와 같은 바이러스 또는 박테리아), 암 또는 다발성 경화증에 대해 치료하거나 예방하기 위해 사용될 수 있다. 그러한 질환, 장애 또는 감염의 예방이 백신접종을 구성할 수 있다.
본원에 정의된 "치료"는 치료 전에 증상에 비하여, 치료 중인 질환, 장애 또는 감염의 하나 이상의 증상을 감소, 완화 또는 제거하는 것을 말한다. "예방"은 질환, 장애 또는 감염의 증상의 개시를 지연 또는 예방하는 것을 말한다. 예방은 절대적이거나(질환이 발생하지 않게 함) 일부 개체에서만 또는 제한된 시간 동안만 유효할 수 있다.
세포의 생체내 투여를 위하여, 해당 분야에 통상적이거나 표준인 세포 집단의 임의의 투여 방식, 예를 들어, 적절한 경로에 의한 주사 또는 주입이 사용될 수 있다. 편리하게, 세포는 림프절내 주사에 의해 투여된다. 바람직하게는, 대상체의 ㎏당 1×104 내지 1×108개(예를 들어, 인간에서 ㎏당 1.4×104 내지 2.8×106개)의 세포가 투여된다. 따라서, 예를 들어, 인간에서, 0.1 내지 20×107개 세포의 용량이 1회 용량으로, 즉, 용량마다, 예를 들어, 1회 백신접종 용량으로서 투여될 수 있다. 용량은 필요에 따라 이후의 회차에 반복될 수 있다.
본 발명은 하기 도면을 참조하여 하기의 비제한적인 실시예에 더욱 상세하게 기재될 것이며, 여기서:
도 1은 항원 오브알부민(OVA), 및 언급된 경우 TPCS2a(PCI) 및 CpG 또는 R848의 혼합물을 사용한 마우스의 생체내 백신접종 후의 혈액(A) 및 비장(B 및 C) 내의항원 특이적 T-세포%를 보여준다. 패널 (A)는 백신접종 7일 후의 혈중 항원 특이적 CD8+ T-세포의 %를 보여주며, 각 원은 1마리의 동물을 나타낸다. 패널 (B)는 백신접종 14일 후의 비장에서의 항원 특이적 CD8+ T-세포의 %를 보여주며, 각 원은 1마리의 동물을 나타낸다. 패널 (C)는 (B)에 나타낸 바와 동일한 데이터의 막대 도표 표현이다.
도 2는 SIINFEKL 항원 펩티드를 사용한 시험관내 자극 후의, 도 1에 대한 범례에 기재된 바와 같이 백신접종된 마우스 유래의 CD8+ 비장 세포에서의 IFN-γ 생성의 정도를 보여준다. IFN-γ에 대한 세포내 염색 및 유세포분석에 의한 세포의 분석에 의해 분석을 행하였다. 패널 B는 패널 A에 나타낸 데이터의 막대 도표 표현이다.
도 3은 SIINFEKL 항원 펩티드를 사용한 시험관내 자극 후의, 도 1에 대한 범례에 기재된 바와 같이 백신접종된 마우스 유래의 전체 비장 세포에서의 IFN-γ 및 IL-2의 생성량을 보여준다. ELISA에 의해 분석을 행하였다. 패널 A 및 C는 SIINFEKL 재자극이 있거나 없는 결과를 보여주며, 결과는 각각의 표준 곡선에 따른 보정 없이 ELISA 검정으로부터의 직접 판독치로서 나타나 있다. 패널 B 및 D는 SIINFEKL 자극된 시료에 대한 동일한 데이터를 보여주며, 여기서, IFN-γ 및 IL-2의 농도를 각각의 표준 곡선에 기초하여 계산하였다.
도 4는 반응식 1: 화합물 5의 합성을 위한 합성 경로를 보여준다. 시약 및 조건: (a) 프로피온산, 환류, 1시간(20%); (b) NaNO2(1.8 당량), TFA, 실온, 3분 (67%); (c) SnCl2.2H2O, 진한 HCl, 60℃, 1시간(88%); (d) 브로모아세틸 브로마이드, Et3N, CH2Cl2, 실온, 1시간(64%); (e) 피페라진, CH2Cl2, 실온, 1시간(94%).
반응식 2. N-변형된 키토산 유도체(TPP-CS-TMA & TPP-CS-MP)의 합성. 여기서, A는 1차 뱃치 화합물을 나타내고, B는 2차 뱃치 화합물을 나타낸다. 시약 및 조건: (a) MeSO3H/H2O, 10℃-실온, 1시간, (90%); (b) TBDMSCl, 이미다졸, DMSO, 실온, 24시간(96%); (c) 브로모아세틸 브로마이드, Et3N, CH2Cl2, -20℃, 1시간(92%); (d) 화합물 5, 즉, TPP-NH-Pip(0.1 또는 0.25 당량), Et3N, CHCl3, 실온, 2시간(92 내지 90%); (e) NMe3 또는 1-메틸 피페라진, CHCl3, 실온, 24시간; (f) TBAF, NMP, 55℃, 24시간 또는 진한 HCl/MeOH, 실온, 24시간.
반응식 3 - 화합물 1, 3, 20 및 21을 위한 합성 반응식
반응 및 조건: (a) 프로피온산, 환류, 1시간, (20%); (b) NaNO2(1.8 당량), TFA, 실온, 3분; (c) SnCl2.2H2O, 진한 HCl, 60℃, 1시간, (54%); (d1) p-톨루엔술포닐하이드라지드, K2CO3, 피리딘, 환류, 24시간; (d2) o-클로라닐, CH2Cl2, 실온, (80%); (e) 클로로아세틸 클로라이드, Et3N, CH2Cl2, 실온, 2시간, 동소-(f) 피페라진, CH2Cl2, 실온, 12시간, (61%). 화합물 20 및 21의 모든 유도체는 TPCa1 및 TPCa2 이성질체를 함유할 것이다. 그러나 오직 TPCa1 구조만이 반응식 및 구조 도면에 나타나 있다.
반응식 4 - 화합물 22 내지 28을 위한 합성 반응식. 반응 및 조건: (a) 염화아세틸, MeOH, 환류, 24시간, (87%); (b) BF3.Et2O, CHCl3, 실온, p-클로라닐, 48시간, (14%); (c) 2N KOH(MeOH 중), THF:피리딘(10:1), 환류, 24시간(71%); (d1) p-톨루엔술포닐하이드라지드, K2CO3, 피리딘, 환류, 24시간; (d2) o-클로라닐, CH2Cl2: MeOH(75:25), 실온, (70%); (e) EDCI.HCl, HOBT, Et3N, N-Boc-피페라진 5, DMF, 실온, 24시간(54%) (f) TFA, CH2Cl2, 실온, 1시간(89%). 화합물 26 내지 28의 모든 유도체는 TPCc1 및 TPCc2 이성질체를 함유할 것이다. 그러나 오직 TPCc1 구조만이 반응식 및 구조 도면에 나타나 있다.
반응식 5A 및 5B. 시약 및 조건(6A): (a) 화합물 21, 즉, TPC-NH-Pip(0.1 당량), Et3N, CHCl3, 실온, 2시간(78%) (b) NMe3 또는 1-메틸 피페라진, CHCl3, 실온, 24시간. 시약 및 조건(6b): a) 화합물 28, 즉, TPC-CO-Pip(0.1 당량), Et3N, NMP, 75℃, 12시간(89%) (b) NMe3 또는 1-메틸 피페라진, CHCl3, 실온, 24시간.
도 5는 애쥬번트 폴리(IC) 및 CpG의 영향을 보여준다. 마우스를 10 ㎍의 OVA, 100 ㎍의 OVA, 10 ㎍의 OVA 및 150 ㎍의 TPCS2a, 10 ㎍의 OVA 및 50 ㎍의 ODN2395 CpG 올리고뉴클레오티드, 10 ㎍의 OVA, 50 ㎍의 ODN2395 CpG 올리고뉴클레오티드 및 150 ㎍의 TPCS2a, 10 ㎍의 OVA 및 50 ㎍의 폴리(IC), 10 ㎍의 OVA, 50 ㎍의 폴리(IC) 및 150 ㎍의 TPCS2a로 면역화시키거나 처리하지 않고 놔두었다. TPCS2a를 제공한 마우스를 조명하였다. 마우스를 제7일에 채혈하고, OVA-특이적 CD8 T-세포의 빈도를 유세포분석에 의해 분석하였다. 제14일에, 비장 세포를 수득하고, SIINFEKL 펩티드에 의해 재자극하고, 인터페론-감마 ELISA에 의해 분석하였다. (A)는 실험군(각 그룹에서 5마리 동물, 오차 막대: 평균의 표준 오차)에 대한 제7일의 혈중 평균값(전체 CD8+ 세포 중 항원-특이적 CD44+ 세포%)을 보여준다. (B)는 SIINFEKL 펩티드를 사용한 제14일의 비장 세포의 재자극 후의 인터페론-감마(IFN-감마) ELISA로부터의 결과를 보여준다.
도 6은 OVA 및 폴리(IC)로의 마우스의 1차 및 2차 면역화 후의 평균값(전체 CD8+ 세포 중 항원-특이적 CD44+ 세포%)을 보여준다.
도 7은 2차(제22일) 면역화 후에, 2차 면역화 후의 실험에서의 개별 동물에 대한 값(전체 CD8+ 세포 중 항원-특이적 CD44+ 세포%)(오차 막대는 표준 편차임)을 보여준다.
도 8은 2차 면역화 후의 TRP-2 펜타머 염색 실험군에 대한 평균값(전체 CD8+ 세포 중 항원-특이적 CD44+ 세포%)을 보여준다.
도 9는 감광제를 활성화시키기 위해 적색광 조명을 사용하는 1차 및 2차 면역화 후의 실험군에 대한 평균값(전체 CD8+ 세포 중 항원-특이적 CD44+ 세포%)을 보여준다.
도 10은 1차(제7일) 및 2차(제21일) 면역화 후의 실험군(오차 막대는 평균의 표준 오차임)에 대한 평균값(전체 CD8+ 세포 중 항원-특이적 CD44+ 세포%)을 보여준다.
도 11은 1차(제7일) 및 2차(제21일) 면역화 후의 실험군에 대한 평균값(전체 CD8+ 세포 중 항원-특이적 CD44+ 세포%)을 보여준다.
도 12는 도면에 나타낸 바와 같이 SIINFEKL 펩티드로의 재자극이 있거나 없는 비장 세포에서의 평균 ELISA 값을 보여준다.
도 13은 1차 및 2차 면역화 후의 실험군(각 그룹에 5마리의 동물, 오차 막대는 표준 편차임)에 대한 평균값(전체 CD8+ 세포 중 항원-특이적 CD44+ 세포%)을 보여준다.
도 14는 각각의 3회의 면역화 후의 실험군에 대한 전체 CD8+ 세포 중 항원-특이적 CD44+ 세포%를 보여준다.
도 15는 3회의 면역화 후의 실험군에 대한 전체 CD8+ 세포 중 항원-특이적 CD44+ 세포%를 보여준다.
도 16은 1차 및 2차 면역화 후의 실험군(각 그룹에 5마리의 동물, 오차 막대는 표준 편차임)에 대한 평균값(전체 CD8+ 세포 중 항원-특이적 CD44+ 세포%)을 보여준다.
도 17은 3개의 실험군에서 전형적인 동물로부터의 3차 면역화 후의 유세포분석 점 도표를 보여준다.
도 18은 각각의 3회의 면역화 후의 평균값(전체 CD8+ 세포 중 항원-특이적 CD44+ 세포%)을 보여준다.
도 19는 2회의 면역화 후의 실험군에 대한 전체 CD8+ 세포 중 항원-특이적 CD44+ 세포%를 보여준다.
도 20은 2회의 면역화 후의 실험군에 대한 전체 CD8+ 세포 중 항원-특이적 CD44+ 세포% +/- SEM를 보여준다.
실시예
재료 및 방법
마우스
C57BL/6 마우스를 할란(Harlan)(Horst, The Netherlands)으로부터 구입하였다. 오브알부민(OVA) 유래의 MHC 클래스-I 제한 에피토프 OVA257 -264를 인식하는 T-세포 수용체에 대하여 트랜스제닉인 OT-I 마우스를 취리히 대학의 시설에서 사육하였다(원래 타코닉 유럽(Taconic Europe)(Ry, Denmark)으로부터 구매). 모든 마우스를 특정 병원체-부재(SPF) 조건 하에 유지하고, 수행된 절차를 스위스 수의 당국에 의해 승인받았다. OT-1 마우스에서, T-세포 수용체에 대한 유전자를, 이들 마우스에서 거의 모든 CD8+ T-세포(OT-1 세포로 지칭)가 오브알부민(OVA) 항원 유래의 특정 펩티드 에피토프(SIINFEKL)를 특이적으로 인식할 방식으로 조작하였다.
면역화 프로토콜
제0일에, 암컷 C57BL/6 마우스에 Rag2/OT-1 마우스 유래의 1.5 × 106개의 비장세포를 꼬리 정맥에 정맥 내로 주사하였다. 이러한 방식으로, 백신접종된 마우스는 항원 제시 세포 상의 MHC 클래스 I에 적절하게 제시되는 경우 그리고 그러한 경우에만, OVA 유래의 SIINFEKL-에피토프에 반응할 수 있는 CD8 T-세포의 "백그라운드"를 갖는다. 따라서, OT-1 세포의 전달은 백신접종된 마우스에서 검출 시스템을 "증폭시켜" 항원 특이적 CD8+ T-세포 및 IFN-γ 및 IL-2 생성을 측정함으로써 생체내 백신접종의 효과에 대하여 용이하게 검정할 수 있게 한다.
4시간 후에, 동물을 피내 주사에 의해 복부에 백신접종하였다(하기 특정된 성분을 함유하는 2 × 50 ㎕의 용액). 4마리 동물의 6개 그룹에 하기의 총 용량을 제공하였다:
그룹 1: 25 ㎍의 TPCS2a(암피넥스(Amphinex)) + 10 ㎍의 오브알부민(OVA, V 등급, 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)).
그룹 2: 25 ㎍의 TPCS2a + 10 ㎍의 오브알부민 + 60 ㎍의 CpG.
그룹 3: 25 ㎍의 TPCS2a + 10 ㎍의 오브알부민 + 100 ㎍의 R848(레시퀴모드).
그룹 4: 10 ㎍의 오브알부민.
그룹 5: 10 ㎍의 오브알부민 + 60 ㎍의 CpG.
그룹 6: 10 ㎍의 오브알부민 + 100 ㎍의 R848(레시퀴모드).
사용되는 CpG 올리고뉴클레오티드는 완전 포스포로티오에이트화된(PS-변형된) 백본과 함께, 서열(5'-TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT-3')을 갖는 B형 20-mer ODN 1826(마이크로신트(Microsynth)(Balgach, Switzerland)에 의해 합성)이었다.
제1일에, 그룹 1, 2 및 3의 동물을 마취시키고, 루미소스 램프(피씨아이 바이오테크 에이에스)를 사용하여 6일 동안 청색광으로 조명하였다. 항원 용액을 주사하고 약 18시간 후에 동물을 조명하였으며, 조명의 광강도(fluence rate)는 약 13 ㎽/㎠였다. 제7일에, 마우스를 꼬리 정맥으로부터 채혈하고, 혈액 세포를 유세포분석(하기 프로토콜 참고)을 위하여 SIINFEKL 펜타머(프로이뮨(ProImmune)), 및 CD8 및 CD44 항체로 염색하였다. 제14일에, 마우스를 안락사시키고, 비장을 수집하였다. 비장세포의 한 분취물을 SIINFEKL 펩티드(EMC 마이크로콜렉션즈(EMC microcollections), Tuebingen, Germany)로 재자극하고, 세포내 IFN-γ 발현에 대하여 염색하고, 유세포분석(하기 참조)에 의해 분석하였다. 비장세포의 다른 분취물을 세포 배양 배지에 재현탁화시키고, 이러한 배지에서 재자극 없이 하룻밤 유지시키고(순수하게 현실적인 이유로), 상기 기재된 바와 같이 SIINFEKL-펜타머로 염색하고, 유세포분석(하기 프로토콜 참조)에 의해 분석하였다.
비장 세포의 SIINFEKL - 펜타머 -염색
비장 세포에 대한 SIINFEKL-펜타머 염색 및 유세포분석을 세포 배지 중에 재현탁화되고, 이러한 배지에서 재자극 없이 하룻밤 유지시킨(순수하게 현실적인 이유로) 세포에서 수행하였다.
SIINFEKL - 펜타머 염색 및 유세포분석
5 내지 10방울의 꼬리 전혈을 수집하고, 0.5 ㎖의 레드 셀 라이스(Red Cell Lyse) 용액(시그마)을 첨가하였다. 5 내지 6분 후에, 세포를 회전 침강시키고, 0.5㎖의 PBS로 2회 세척하였다. 세포 펠렛을 FACS 완충제(2% FCS/0.01% Na-아지드가 있는 PBS) 중에 재현탁화시키고, U-형 96 웰 플레이트로 옮기고, 얼음에서 10분 동안 FcR-블로킹 항체(파민젠(Pharmingen)로부터의 항-CD16/CD32 1.0 ㎕)와 인큐베이션시켰다(1 ㎕ + 49 ㎕ FACS 완충제). 세척 없이, SIINFEKL-펜타머-PE(프로이뮨; 시료마다 5 ㎕)를 첨가하고, 혼합하고, 37℃에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. 세척 없이, 형광-표지된 CD8 또는 CD44를 1:100의 최종 농도로 첨가하고, 얼음상에서 25 내지 45분 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 100 ㎕의 FACS 완충제에서 세척하고, 100 ㎕의 FACS 완충제 중에 재현탁화시켰다. 세포를 FACSCanto를 사용하여 분석하였다.
생체외에서의 비장세포 재자극
비장세포를 분리하고, 비장을 으깨고 용해 완충제(시그마)에서의 1 내지 2분 동안의 교반에 의해 2% FCS/PBS 중 세포를 분리하고, 2% FCS/PBS에서 세척함으로써 세포내 염색을 위해 준비하였다. 완전 배지 중 세포 현탁액 1 ㎖을 24-웰 플레이트의 웰마다 첨가하고(500,000개 세포/㎖), 5 ㎍/㎖의 SIINFEKL을 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 하룻밤 인큐베이션시켰다. 브레펠딘(brefeldin) A(1 내지 2 ㎍/㎖)를 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 U-형 96 웰 플레이트로 옮기고, 2% FCS/PBS 중에 세척하고, FcR-블로킹 항체(파민젠으로부터의 항-CD16/CD32 1.0 ㎕)가 있는 50 ㎕의 FACS 완충제 중에 재현탁화시키고, 얼음상에 10분 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 세척 없이, 얼음상에서 20 내지 45분 동안 표면 항체 CD8 또는 CD44와 인큐베이션시키고(암 중에), FACS 완충제에 세척하고, 얼음상에서 10 내지 20분 동안 100 ㎕의 파라포름알데히드(PFA)(PBS 중 1%)에 재현탁화시킴으로써 고정하였다. 세포를 FACS 완충제에서 세척하고, 100 ㎕의 NP40(PBS 중 0.1%) 중에 재현탁화시키고, 얼음상에 3분 동안 인큐베이션시켰다. FACS 완충제에서의 세척 후에, 형광-표지된 인터페론-감마 항체를 첨가하고, 암 중에 얼음상에서 35분 동안 인큐베이션시켰다. FACS 완충제에서의 세척 및 현탁화 후에, 세포를 플로우조(FlowJo) 8.5.2 소프트웨어(트리 스타, 인코포레이티드(Tree Star, Inc.), Ashland, OR)를 사용하여 FACSCanto로 분석하였다.
유세포분석
OVA-특이적 T-세포의 빈도를 유세포분석(비디 바이오사이언스즈(BD Biosciences)로부터의 FACSCanto, San Jose, USA)에 의해 결정하였다. 유세포분석 시행 전에, 개별적으로 각 항체로 염색된 비드를 사용하여 보정을 수행하였다. 항체 염색 이전에, 적혈구를 레드 셀 라이스 용액(시그마)을 사용하여 용해시켰다. 10 000건의 CD8+ 사건을 각 시료에 대하여 기록하고, SIINFEKL-펜타머 양성 세포의 백분율을 트리 스타, 인코포레이티드(Ashland, OR) http://www.flowjo.com/로부터의 플로우조 8.5.2 소프트웨어를 사용하여 계산하였다.
ELISA
ELISA를 제조처의 지침에 따라 관련 분자에 대하여 레디-세트 고(Ready-set Go)! 키트(이바이오사이언스(eBioscience))를 사용하여 수행하였다.
실시예 1: OVA를 사용한 생체내 백신접종에 대한 TLR 리간드의 효과
마우스를 상기 기재된 면역화 프로토콜에 의해 생체내에서 백신접종하였다. 혈액을 7일 후에 분리하고, 비장을 14일 후에 분리하였다. 혈액을 항원-특이적 CD8+ T 세포에 대하여 분석하고, 비장 세포를 시험관내에서의 재자극 후에 항원-특이적 CD8+ T-세포 또는 IFN-γ 또는 IL-2 생성에 대하여 직접 분석하였다.
혈액 및 비장에서의 항원-특이적 T-세포의 수준
항원-특이적 T-세포의 수준을 항원-특이적 T-세포에 특이적으로 결합하는 형광으로 표지된 항원-특이적 "펜타머"를 사용하여 유세포분석에 의해 측정하였다. 동물에서 전체 CD8+ T-세포의 %로, 항원 특이적 CD8+ T-세포의 수를 결정하였다(면역화 프로토콜에 기재된 염색 및 유세포분석 및 SIINFEKL 염색의 상세사항 참조).
내인성 T-세포는 T-세포에 대한 일반적인 자극 효과가 내인성 T-세포에 영향을 미쳐 항원-특이적 세포의 %의 증가를 야기하지 않을 것이기 때문에, 항원-특이성의 효과에 대한 내부 대조군으로 제공된다. 전형적으로, OT-1 세포의 %를 백신접종 이전 및 백신접종 이후의 시점(들)에 측정하였다. 단독의 항원("통상적인 백신접종")의 효과를 항원+PCI의 효과와 비교하였다.
항원을 사용한 생체외 자극 후에 비장 세포에서의 IFN -γ 생성의 수준( 유세포분석 )
백신접종 제14일에 제거된 비장을 비장세포 분리 및 SIINFEKL 항원 펩티드를 사용한 재자극 및 상기 프로토콜에 기재된 바와 같은 유세포분석에 의한 CD8+ T 세포의 분석을 위한 IFN-γ 생성에 대한 세포내 염색으로 처리하였다.
항원을 사용한 생체외 자극 후의 비장 세포에서의 IFN -γ 및 IL-2 생성의 수준(ELISA)
백신접종 제14일에 제거된 비장을 비장세포 분리 및 SIINFEKL 항원 펩티드를 사용한 재자극 및 상기 프로토콜에 기재된 바와 같은 ELISA에 의한 IFN-γ 및 IL-2 생성 분석으로 처리하였다.
결과
혈액 및 비장에서의 항원-특이적 T-세포의 수준
결과는 도 1에 나타나 있다. 제7일에 검정되는 경우, PCI가 단독의 OVA 항원보다 유의미하게 더 나은 효과를 유도하는 것을 알 수 있다(A). 또한, CpG 올리고뉴클레오티드는 PCI만큼은 아니지만, 단독의 OVA보다 백신접종을 개선시켰다. 단독의 R848은 단독의 OVA보다 백신접종을 개선시키지 않고, 오히려, 백신접종의 효과를 다소 억제하는 것으로 보인다. PCI와, R848 또는 CpG의 조합은 PCI+OVA의 효과에 비하여 백신접종을 개선시켰다. 이러한 개선은 백신접종 후 제14일에 비장 세포를 분석하는 경우 훨씬 더 현저하였다(B 및 C). 이러한 시점에 단독의 PCI+OVA 처리의 효과가 백그라운드 수준으로 복귀되었으며, PCI 없이 R848/CpG+OVA를 사용한 그룹에 대한 경우도 그러함을 알 수 있다. 그러나 R484 또는 CpG가 PCI와 조합되는 2개의 그룹에서, 상당히 더 나은 효과가 관찰되었으며, 특히 R848에 대하여 확연하였다.
항원을 사용한 생체외 자극 후의 비장 세포에서의 IFN -γ 생성의 수준( 유세포분석 )
IFN-γ 및 IL-2는 항원을 사용한 자극 후에 CD8+ T-세포에 의해 생성되는 사이토카인이다. 결과는 도 2에 나타나 있다. 도 1에 나타낸 결과에 따라, 도 2는 CpG/R848 및 PCI의 조합에 의해 최적의 효과가 달성되었으며, 이러한 파라미터에 대하여 분석하는 경우, CpG+PCI가 보기에 R848+PCI보다 더 나은 것을 보여준다. 또한, 단독의 항원(OVA)이 검출가능한 효과를 제공하지 않는 한편, OVA+PCI가 관찰가능한 효과를 유도하였음을 알 수 있다. PCI 없이 CpG/R848+OVA를 사용한 그룹은 검출가능하지 않거나(CpG) 단지 겨우 검출가능한(R848) 효과를 제공하는 한편, OVA+CpG+PCI 및 OVA+R848+PCI의 조합은 각각 OVA+PCI보다 약 6배 및 2.5배 더 나았다.
항원을 사용한 생체외 자극 후의 비장 세포에서의 IFN -γ 생성의 수준(ELISA)
결과는 도 3에 나타나 있다. 도 3은 패널 A 및 C에서 IFN-γ 및 IL-2 생성 둘 모두가 OVA+CpG/R848+PCI 그룹에서 가장 높았으며, 생성이 SIINFEKL 펩티드 항원에 의한 자극에 좌우되는 것을 보여주며, 이는 그것이 항원 특이적 효과임을 보여준다. 패널 B 및 D는 CpG/R848+OVA+PCI 그룹에서 효과가 다른 처리군에서보다 상당히 더 나았음을 보여준다.
실시예 2: OVA를 사용한 생체내 백신접종에 대한 다른 TLR 리간드의 효과
상기 방법을 사용하여 생체내에서 백신접종을 수행하였다. 따라서, 4마리 동물의 14개 그룹에 하기의 총 용량을 제공하는 상기 기재된 방법을 수행할 수 있다:
그룹 1: 250 ㎍의 TPCS2a(암피넥스) + 10 ㎍의 오브알부민(OVA, V 등급, 시그마-알드리치).
그룹 2: 250 ㎍의 TPCS2a + 10 ㎍의 오브알부민 + 50 ㎍의 LPS(포르피로모나스 진지발리스).
그룹 3: 250 ㎍의 TPCS2a + 10 ㎍의 오브알부민 + 50 ㎍의 LPS(에스케리키아 콜라이).
그룹 4: 250 ㎍의 TPCS2a + 10 ㎍의 오브알부민 + 50 ㎍의 LPS(살모넬라 미네소타).
그룹 5: 250 ㎍의 TPCS2a + 10 ㎍의 오브알부민 + 100 ㎍의 MPLA(살모넬라 미네소타).
그룹 6: 250 ㎍의 TPCS2a + 10 ㎍의 오브알부민 + 1 ㎎의 폴리(I:C).
그룹 7: 250 ㎍의 TPCS2a + 10 ㎍의 오브알부민 + 1 ㎎의 ssPolyU.
그룹 8: 10 ㎍의 오브알부민.
그룹 9: 10 ㎍의 오브알부민 + 50 ㎍의 LPS(포르피로모나스 진지발리스).
그룹 10: 10 ㎍의 오브알부민 + 50 ㎍의 LPS(에스케리키아 콜라이).
그룹 11: 10 ㎍의 오브알부민 + 50 ㎍의 LPS(살모넬라 미네소타).
그룹 12: 10 ㎍의 오브알부민 + 100 ㎍의 MPLA(살모넬라 미네소타).
그룹 13: 10 ㎍의 오브알부민 + 1 ㎎의 폴리(I:C).
그룹 14: 10 ㎍의 오브알부민 + 1 ㎎의 ssPolyU.
폴리(I:C), LPS, MPLA 및 ssPolyU를 모두 인비보겐으로부터 수득한다.
실시예 3: OVA를 사용한 생체내 백신접종에 대한 폴리 (IC) 및 CpG의 효과
재료 및 방법
동물
C57BL/6 마우스를 할란(Horst, The Netherlands)으로부터 구입하였다. CD8 T-세포 수용체 트랜스제닉 OT-I 마우스(B6.129S6-Rag2tm1Fwa Tg(TcraTcrb)1100Mjb)를 타코닉 유럽(Ry, Denmark)으로부터 또는 잭슨 래보러터리즈(Jackson Laboratories)(Bar Harbor, Maine)로부터 구입하였다. OT-I CD8 T 세포는 오브알부민 유래의 H-2Kb-제한 에피토프 SIINFEKL(OVA, aa257-264)을 인식한다. 모든 마우스를 SPF 조건 하에 유지하고, 수행된 절차를 스위스 및 노르웨이의 수의 당국에 의해 승인받았다.
재료 및 세포
닭 OVA를 시그마-알드리치(Buchs, Switzerland)로부터, SIINFEKL 펩티드를 EMC 마이크로콜렉션즈(Tuebingen, Germany)로부터, 폴리(IC)(고분자량) 및 CpG 올리고뉴클레오티드 ODN2395를 인비보겐(San Diego, USA)으로부터 구입하였다. 감광제 테트라페닐 클로린 디설포네이트(TPCS2a)를 피씨아이 바이오테크(Lysaker, Norway)의 것이었다. OVA, TPCS2a 및 관련이 있는 경우 폴리(IC)를 PBS 중에 혼합하고, 광 보호하여 유지하고, 제조 60분 내에 마우스에게 투여하였다. TPCS2a를 루미소스™(피씨아이 바이오테크)를 사용한 조명에 의해 활성화하였다.
마우스의 피내 감광화 및 면역화
면역화 1일 전에, 비장 및 림프절을 암컷 OT-1 마우스로부터 분리하고, 균질화된 세포 현탁액으로부터 용해(시그마-알드리치로부터의 RBC 용해 완충제 하이브리-맥스(Hybri-Max))에 의해 적혈구를 제거하였다. 나머지 세포를 PBS 중에 세척하고, 70 미크론 나일론 여과기를 통해 여과하고, 2×106개 OT-1 세포를 정맥내 주사에 의해 수여자 암컷 C57BL/6 마우스 내로 투여하였으며; SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포의 입양 전달로, 유세포분석에 의한 면역 반응의 모니터링을 용이하게 한다. 1일 또는 8시간 후에, 마우스를 꼬리 채혈에 의해 채혈하고, OVA-특이적 CD8 T 세포의 기준선 빈도의 분석을 위해 혈액을 헤파린-함유 튜브에 수집하였다.
그 다음, 마우스의 복부 영역을 면도하고, OVA 또는 OVA, TPCS2a, 폴리(IC)(50 ㎍) 또는 CpG 올리고뉴클레오티드(50 ㎍)의 상이한 혼합물로 이루어진 백신을 29G 주사바늘이 있는 주사기를 사용하여 피내로 주사하였다. 백신을 광을 보호하여 유지시키고, 제조 60분 내에 사용하였다. 백신을 복부 중앙선의 좌측 및 우측에 각각 50 ㎕의 2회 주사로 제공하였다. OVA를 10 또는 100 ㎍의 용량으로 사용하였으며, TPCS2a 용량은 150 ㎍이었다. 백신을 주사하고 18시간 후에, 마우스를 케타민(25 ㎎/㎏(체중)) 및 자일라진(4 mg/kg)의 혼합물의 복강내 주사에 의해 마취시키고, 루미소스 광원(조명 및 감광제 TPCS2a의 활성화를 위함)에 두었다. 조명 시간은 6분이었다.
그 후 제7일 및 제14일에, 마우스를 꼬리 채혈에 의해 채혈하고, 유세포분석에 의한 항원-특이적 CD8 T 세포의 분석 전에 적혈구를 용해에 의해 제거하였다. 실험의 마지막(제14일)에, 마우스를 안락사시키고, 비장세포를 생체외에서 분석하였다.
면역 반응의 분석
유세포분석에 의한 분석을 위해 세포를 항-CD8 항체 및 H-2Kb/SIINFEKL Pro5 펜타머(프로이뮨, Oxford, UK)로 염색함으로써, 혈중 OVA-특이적 CD8 T-세포의 빈도를 모니터링하였다. 유세포분석에 의해 CD44의 발현을 시험함으로써 세포의 활성화 상태를 추가로 분석하였다. 세포를 FACSCanto(비디 바이오사이언스즈, San Jose, USA)를 사용하여 분석하고, 플로우조 8.5.2 소프트웨어(트리 스타, 인코포레이티드, Ashland, OR)를 사용하여 분석하였다.
ELISA 분석을 위하여, 2×105개 비장세포를 96-웰 플레이트에서 0.005 ㎍/㎖의 SIINFEKL 펩티드를 사용하여 재자극시켰다. 72시간 후에, 상청액을 수집하고, ELISA(이바이오사이언스-제조처의 지침에 따라 수행)에 의해 IFN-γ에 대해 분석하였다.
폴리 (IC) 및 CpG 실험.
실험을 재료 및 방법하에 기재된 바와 같이 수행하였으며, 백신접종 7일 후의 마우스 혈액 시료를 기재된 바와 같은 유세포분석에 의해 분석하였다. 제14일로부터의 비장 세포를 SIINFEKL 펩티드에 의해 재자극하고, 기재된 바와 같은 인터페론-감마 ELISA에 의해 분석하였다. 모든 마우스에는 기재된 바와 같은 OT-1 세포를 제공하였다.
하기의 실험군을 포함시켰다:
1. 미처리: 마우스에 OT-1 세포를 제공하였지만, 백신접종하거나 조명하지 않았다.
2. OVA: 마우스를 10 ㎍의 OVA로 백신접종하였다. 그들을 조명하지 않았다.
3. OVA 100 ㎍: 마우스를 100 ㎍의 OVA의 혼합물로 백신접종하였다. 그들을 조명하지 않았다.
4. OVA 10 ㎍ PCI: 마우스를 10 ㎍의 OVA + 150 ㎍의 TPCS2a의 혼합물로 백신접종하였다. 기재된 바와 같이 조명하였다.
5. CpG OVA: 마우스를 10 ㎍의 OVA + 50 ㎍의 ODN2395 CpG 올리고뉴클레오티드의 혼합물로 백신접종하였다. 그들을 조명하지 않았다.
6. CpG OVA/PCI: 마우스를 10 ㎍의 OVA + 50 ㎍의 ODN2395 CpG 올리고뉴클레오티드 + 150 ㎍의 TPCS2a의 혼합물로 백신접종하였다. 기재된 바와 같이 조명하였다.
7. 폴리(IC) OVA: 마우스를 10 ㎍의 OVA + 50 ㎍의 폴리(IC)의 혼합물로 백신접종하였다. 그들을 조명하지 않았다.
8. 폴리(IC) OVA/PCI: 마우스를 10 ㎍의 OVA + 50 ㎍의 폴리(IC) + 150 ㎍의 TPCS2a의 혼합물로 백신접종하였다. 기재된 바와 같이 조명하였다.
도 5A는 실험군에 대한 평균값(전체 CD8+ 세포 중 항원-특이적 CD44+ 세포%)을 보여준다. 단독으로 사용되는 경우 CpG 및 폴리(IC) 애쥬번트가 오직 매우 온건한(CpG에 대하여) 또는 유의미하지 않은(폴리(IC)에 대하여) 효과를 가졌으며, 단독으로 사용되는 PCI가 이들 애쥬번트 중 어느 하나보다 상당히 더 강력하였음을 알 수 있다. 그러나 PCI가 CpG 또는 폴리(IC)와 조합하여 사용되는 경우 명백한 상승 효과가 관찰되었으며, 조합 PCI+폴리(IC)에 대하여 가장 현저하였다.
도 5B는 SIINFEKL 펩티드를 사용한 비장 세포의 재자극 후의 인터페론-감마(IFN-감마) ELISA로부터의 결과를 보여준다. 먼저, IFN-감마 생성이 전적으로 재자극에 좌우되었음을 알 수 있으며(자극되지 않은 세포로부터의 막대는 간신히 알아볼 수 있음), 이는 생성이 엄격히 항원 특이적이었음을 보여준다. 또한, CpG 또는 폴리(IC) 그룹(또는 단독의 OVA 사용)으로부터의 세포에서 사실상 효과가 없었지만, 모든 PCI-처리된 그룹에서 강력한 재자극의 효과가 관찰될 수 있으며, 다시 PCI+CpG 및 PCI+폴리(IC) 그룹에서 상승적 효과가 있고, 후자가 더 나은 조합을 나타내는 것을 알 수 있다.
실시예 4 내지 실시예 16에 있어서 , 하기의 재료 및 방법을 사용하였다:
동물
C57BL/6 마우스를 할란(Horst, The Netherlands)으로부터 구입하였다. CD8 T-세포 수용체 트랜스제닉 OT-I 마우스(B6.129S6-Rag2tm1Fwa Tg(TcraTcrb)1100Mjb)를 타코닉 유럽(Ry, Denmark)으로부터 또는 잭슨 래보러터리즈(Bar Harbor, Maine)로부터 구입하였다. OT-I CD8 T 세포는 오브알부민(OVA, aa257-264)으로부터의 H-2Kb-제한 에피토프 SIINFEKL을 인식한다. 모든 마우스를 SPF 조건하에 유지시키고, 수행된 절차를 스위스 및 노르웨이의 수의 당국에 의해 승인받았다.
재료 및 세포
닭 OVA를 시그마-알드리치(Buchs, Switzerland)로부터 구입하고, SIINFEKL 펩티드를 EMC 마이크로콜렉션즈(Tuebingen, Germany)로부터 구입하고, TRP-2(서열 SVYDFFVWL), gp100(서열 KVPRNQDWL) 및 HPV 16 E7(서열 GQAEPD RAHYNIVTF CCKCDSTLRLCVQSTHVDIR, CD8 에피토프는 밑줄이 그어 있음)을 유나이티드 펩티즈(United Peptides)(Herndon, VA)로부터 수득하였다. 폴리(IC), CpG 올리고뉴클레오티드 ODN2395, MPLA-SM, 이미퀴모드 및 레시퀴모드는 인비보겐(San Diego, USA)으로부터의 것이었다. 감광제 테트라페닐 클로린 디설포네이트(TPCS2a)는 피씨아이 바이오테크(Lysaker, Norway)로부터의 것이었다.
SIINFEKL, TRP-2 및 HPV 펜타머는 프로이뮨(Oxford, UK)(각각 프로이뮨 펩티드 코드 093, 185 및 502H)으로부터의 것이었다.
입양 전달된 OT -1 세포를 사용한 마우스의 피내 감광화 및 면역화
면역화 1일 전에, 비장 및 림프절을 암컷 OT-1 마우스로부터 분리하고, 균질화된 세포 현탁액으로부터 용해(시그마-알드리치로부터의 RBC 용해 완충제 하이브리-맥스)에 의해 적혈구를 제거하였다. 나머지 세포를 PBS에서 세척하고, 70 미크론 나일론 여과기를 통해 여과하고, 2×106개 OT-1 세포를 정맥내 주사에 의해 수여자 암컷 C57BL/6 마우스 내로 투여하였으며; SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포의 입양 전달로, 유세포분석에 의한 면역 반응의 모니터링을 용이하게 한다. 1일 또는 8시간 후에, 마우스를 꼬리 채혈에 의해 채혈하고, OVA-특이적 CD8 T 세포의 기준선 빈도의 분석을 위해 혈액을 헤파린-함유 튜브에 수집하였다.
피내 면역화를 위하여, 마우스의 복부 영역을 면도하고, OVA 또는 OVA, TPCS2a 및 상이한 애쥬번트의 혼합물로 이루어진 백신을 29G 주사바늘이 있는 주사기를 사용하여 피내로 주사하였다. 백신을 광을 보호하여 유지시키고, 제조 60분 내에 사용하였다. 백신을 복부 중앙선의 좌측 및 우측에 각각 50 ㎕의 2회 주사로 제공하였다. 백신을 주사하고 18시간 후에, 마우스를 케타민(25 ㎎/㎏(체중)) 및 자일라진(4 mg/kg)의 혼합물의 복강내 주사에 의해 마취시키고, 개별 실험에 따라 하기 기재된 바와 같이 조명하였다.
제7일에, 마우스를 꼬리 채혈에 의해 채혈하고, 유세포분석에 의한 항원-특이적 CD8 T 세포의 분석 전에 적혈구를 용해에 의해 제거하였다. 실험의 마지막(제14일)에, 마우스를 안락사시키고, 비장세포를 생체외에서 분석하였다.
정상 마우스의 피내 감광화 및 면역화
마우스의 복부 영역을 면도하고, OVA 단백질 또는 상이한 펩티드 항원(개별 실험하에 특정됨), TPCS2a 및 상이한 백신 애쥬번트로 이루어진 백신을 29G 주사바늘이 있는 주사기를 사용하여 피내로 주사하였다. 백신을 광을 보호하여 유지시키고, 제조 60분 내에 사용하였다. 백신을 복부 중앙선의 좌측 및 우측에 각각 50 ㎕의 2회 주사로 제공하였다. 항원 및 TPCS2a를 상이한 용량(개별 실험하에 특정됨)으로 사용하였다. 백신을 주사한 후 특정 시점에(통상 18시간이나, 일부 실험에서는 상이함), 마우스를 케타민(25 ㎎/㎏(체중)) 및 자일라진(4 mg/kg)의 혼합물의 복강내 주사에 의해 마취시키고, 개별 실험에 따라 기재된 바와 같이 조명하였다.
면역화 후 제7일(또는 일부 경우에는 제6일)에, 마우스를 꼬리 채혈에 의해 채혈하고, 유세포분석에 의한 항원-특이적 CD8 T 세포의 분석 전에 적혈구를 용해에 의해 제거하였다. 일부 실험에서, 마우스에는 개별 실험에 따라 특정된 시점에, 다수의(2 또는 3회의) 면역화를 제공하였다. 이들 경우에, 혈액 시료를 면역화 후 제6일 또는 제7일에 빼내고, 하기 기재된 바와 같은 유세포분석에 의해 분석하였다.
면역화된 마우스의 조명
일부 실험에서, TPCS2a를 루미소스™(피씨아이 바이오테크)를 사용한 조명에 의해 활성화시켰다. 일반적으로, 면역화하고 18시간 후에 루미소스를 사용한 조명을 6분 동안 수행하였으나, 하기 기재된 바와 같이 일부 실험에는 몇몇 변형이 있다. 다른 실험에서, 청색광을 방출하는 LED-기반의 조명 장치를 하기 기재된 바와 같이 사용하였으며(피씨아이 바이오테크 에이에스), 일부 실험에서, PCI 652 ㎚ 레이저 시스템 SN 576003 다이오드 레이저(피씨아이 바이오테크 에이에스)를 조명을 위해 사용하였다.
펜타머 염색에 의한 면역 반응의 분석
세포를 항-CD8 및 항-CD44 항체 및 사용된 항원에 상응하는 상이한 펜타머로 염색한 후에, 혈중 항원 특이적 CD8 T-세포의 빈도를 유세포분석에 의해 모니터링하였다. 유세포분석에 의해 CD44의 발현을 시험함으로써 세포의 활성화 상태를 분석하였다. 세포를 FACSCanto(비디 바이오사이언스즈, San Jose, USA)를 사용하여 분석하고, 플로우조 8.5.2 소프트웨어(트리 스타, 인코포레이티드, Ashland, OR)를 사용하여 분석하였다.
ELISA에 의한 면역 반응의 분석
ELISA 분석을 위하여, 2×105개 비장세포를 96-웰 플레이트에서 0.005 ㎍/㎖의 SIINFEKL 펩티드를 사용하여 재자극시켰다. 72시간 후에, 상청액을 수집하고, ELISA(이바이오사이언스-제조처의 지침에 따라 수행)에 의해 IFN-γ에 대해 분석하였다.
실시예 4: 정상 마우스에서의 OVA 및 폴리(IC)를 사용한 PCI의 효과
정상 마우스의 백신접종을 위해 상기 기재된 바와 같이 실험을 수행하였다. 동물을 제0일 및 제14일에 하기 특정된 바와 같은 200 ㎍의 OVA 단백질, 150 ㎍의 TPCS2a 및 50 ㎍의 폴리(IC)의 혼합물로 면역화시켰다. 면역화시키고 18시간 후에, 조명을 6분 동안 루미소스 조명 장치를 사용하여 수행하였다. 각 면역화 후 제7일로부터의 혈액 시료를 SIINFEKL 펜타머, CD8 및 CD44 항체에 의해 염색하고, 기재된 바와 같이 유세포분석에 의해 분석하였다. 하기의 실험군을 포함시켰다:
1. 미처리: 마우스를 면역화시키거나 조명하지 않았다.
2. OVA 200: 마우스를 200 ㎍의 OVA로 면역화시켰다. 그들을 조명하지 않았다.
3. OVA 200/PCI: 마우스를 200 ㎍의 OVA 및 150 ㎍의 TPCS2a의 혼합물로 면역화시키고, 조명하였다.
4. OVA 200/폴리(IC): 마우스를 200 ㎍의 OVA 및 50 ㎍의 폴리(IC)의 혼합물로 면역화시켰다. 그들을 조명하지 않았다.
5. OVA 200/폴리(IC): 마우스를 200 ㎍의 OVA, 150 ㎍의 TPCS2a 및 50 ㎍의 폴리(IC)의 혼합물로 면역화시키고, 조명하였다.
도 6은 1차 및 2차 면역화 후의 실험군(각 그룹에 5마리 동물)에 대한 평균값(전체 CD8+ 세포 중 항원-특이적 CD44+ 세포%)을 보여준다. 특히 2차 면역화 후에, PCI 및 폴리(IC)의 조합(그룹 5)이 단독의 폴리(IC)(그룹 4) 또는 단독의 PCI(그룹 3)보다 상당히 더 나은 면역화를 제공하는 것을 알 수 있다.
실시예 5: 정상 마우스에서의 SIINFEKL 및 폴리(IC)를 사용한 PCI의 효과
정상 마우스의 백신접종을 위해 상기 기재된 바와 같이 실험을 수행하였다. 동물을 제0일 및 제15일에 하기에 특정된 바와 같은 100 ㎍의 SIINFEKL 펩티드, 100 ㎍의 TPCS2a 및 10 ㎍의 폴리(IC)의 혼합물로 면역화시켰다. 면역화시키고 18시간 후에, 조명을 6분 동안 루미소스 조명 장치를 사용하여 수행하였다. 각 면역화 후 제7일로부터의 혈액 시료를 SIINFEKL 펜타머, CD8 및 CD44 항체에 의해 염색하고, 기재된 바와 같이 유세포분석에 의해 분석하였다. 하기의 실험군을 포함시켰다:
1. 미처리: 마우스를 면역화시키거나 조명하지 않았다.
2. SIIN 100: 마우스를 100 ㎍의 SIINFEKL 펩티드로 면역화시켰다. 그들을 조명하지 않았다.
3. SIIN 100/PCI: 마우스를 100 ㎍의 SIINFEKL 펩티드 및 100 ㎍의 TPCS2a의 혼합물로 면역화시키고, 조명하였다.
4. SIIN 100/폴리(IC): 마우스를 100 ㎍의 SIINFEKL 펩티드 및 10 ㎍의 폴리(IC)의 혼합물로 면역화시켰다. 그들을 조명하지 않았다.
5. SIIN 100/폴리(IC)/PCI: 마우스를 100 ㎍의 SIINFEKL 펩티드, 100 ㎍의 TPCS2a 및 10 ㎍의 폴리(IC)의 혼합물로 면역화시키고, 조명하였다.
도 7은 2차 면역화 후에 실험에서 개별 동물에 대한 값을 보여주며, 이는 PCI+폴리(IC) 조합(그룹 5)에서, 모든 동물이 면역화에 반응하는 한편, 다른 그룹에는 오직 1마리의 약하게 반응하는 동물(SIIN 100/PCI 그룹에서)이 존재하였음을 보여준다.
실시예 6: 정상 마우스에서의 흑색종 항원 펩티드 및 폴리(IC)를 사용한 PCI의 효과
정상 마우스의 백신접종을 위해 상기 기재된 바와 같이 실험을 수행하였다. 동물을 제0일 및 제14일에 하기 특정된 바와 같이 TRP-2 펩티드 및 gp-100 펩티드(각각 50 ㎍), 100 ㎍의 TPCS2a 및 10 ㎍의 폴리(IC)의 혼합물로 면역화시켰다. 면역화시키고 18시간 후에, 조명을 6분 동안 루미소스 조명 장치를 사용하여 수행하였다. 각 면역화 후 제7일로부터의 혈액 시료를 TRP-2 펜타머, CD8 및 CD44 항체로 염색하고, 기재된 바와 같이 유세포분석에 의해 분석하였다. 하기의 실험군을 포함시켰다:
1. 미처리 TRP-2: 마우스를 면역화시키거나 조명하지 않고, 혈액 시료를 TRP-2 펜타머로 염색하였다.
2. TRP-2/폴리(IC): 마우스를 TRP-2 및 gp100 펩티드 및 10 ㎍의 폴리(IC)의 혼합물로 면역화시켰다. 그들을 조명하지 않았다. 혈액 시료를 TRP-2 펜타머로 염색하였다.
3. TRP-2/PCI: 마우스를 TRP-2 및 gp100 펩티드 및 100 ㎍의 TPCS2a의 혼합물로 면역화시키고, 조명하였다. 혈액 시료를 TRP-2 펜타머로 염색하였다.
4. TRP-2/폴리(IC)/PCI: 마우스를 TRP-2 및 gp100 펩티드, 100 ㎍의 TPCS2a 및 10 ㎍의 폴리(IC)의 혼합물로 면역화시키고, 조명하였다. 혈액 시료를 TRP-2 펜타머로 염색하였다.
도 8은 2차 면역화 후에 TRP-2 펜타머 염색된 실험군에 대한 평균값(전체 CD8+ 세포 중 항원-특이적 CD44+ 세포%)을 보여준다. TRP-2 항원이 단독의 폴리(IC)(그룹 2) 또는 단독의 PCI(그룹 3)와 함께 사용되는 경우, 미처리 동물에서 관찰되는 것을 넘는 항원-특이적 세포의 유의미한 증가가 관찰되지 않았음을 알 수 있다. 비교하여, 폴리(IC) 및 PCI의 조합(그룹 4)은 항원-특이적 CD8+ T-세포의 수의 유의미한 증가를 야기하는 명백한 상승 효과를 제공하였다.
실시예 7: 적색광 조명을 사용하는 정상 마우스에서의 OVA 및 폴리(IC)를 사용한 PCI의 분석
정상 마우스의 백신접종을 위해 재료 및 방법하에 기재된 바와 같이 실험을 수행하였다. 동물을 제0일 및 제14일에 하기 특정된 바와 같은 10 또는 100 ㎍의 OVA 단백질, 150 ㎍의 TPCS2a 및 10 또는 50 ㎍의 폴리(IC)의 혼합물로 면역화시켰다. 0.81 ㎽/㎠의 광강도로 전달되는 0.3 J/㎠의 광 선량과 함께 PCI 652 ㎚ 레이저 시스템 SN 576003 다이오드 레이저를 사용하여 조명을 수행하였다(즉, 조명 시간 약 6분). 각 면역화 후 제7일로부터의 혈액 시료를 SIINFEKL 펜타머, CD8 및 CD44 항체에 의해 염색하고, 기재된 바와 같이 유세포분석에 의해 분석하였다. 하기의 실험군을 포함시켰다:
1. 미처리: 마우스를 면역화시키거나 조명하지 않았다.
2. OVA 10: 마우스를 10 ㎍의 OVA로 면역화시켰다. 그들을 조명하지 않았다.
3. OVA 100: 마우스를 100 ㎍의 OVA로 면역화시켰다. 그들을 조명하지 않았다.
4. OVA 10/적색광 PCI: 마우스를 10 ㎍의 OVA 및 150 ㎍의 TPCS2a의 혼합물로 면역화시키고, 조명하였다.
5. OVA 100/적색광 PCI: 마우스를 100 ㎍의 OVA 및 150 ㎍의 TPCS2a의 혼합물로 면역화시키고, 조명하였다.
6. OVA 10/적색광 PCI+폴리(IC): 마우스를 10 ㎍의 OVA, 150 ㎍의 TPCS2a 및 50 ㎍의 폴리(IC)(1차 백신접종) 또는 10 ㎍의 폴리(IC)(2차 백신접종)의 혼합물로 면역화시키고, 조명하였다.
7. OVA 100/적색광 PCI+폴리(IC): 마우스를 100 ㎍의 OVA, 150 ㎍의 TPCS2a 및 50 ㎍의 폴리(IC)(1차 면역화) 또는 10 ㎍의 폴리(IC)(2차 면역화)의 혼합물로 면역화시키고, 조명하였다.
도 9는 감광제를 활성화시키기 위하여 적색광 조명을 사용하는 1차 및 2차 면역화 후의 실험군에 대한 평균값(전체 CD8+ 세포 중 항원-특이적 CD44+ 세포%)을 보여준다. 10 ㎍의 OVA 항원과 함께, 폴리(IC) 및 PCI의 조합(그룹 6)이 면역 반응을 달성하는데 필요하였으며, 단독의 또는 PCI와 조합된(그룹 4) 항원이 면역화 효과를 제공하지 않았음을 알 수 있다. 100 ㎍의 OVA 항원을 사용하여, 단독의 항원(그룹 3)으로 약간의 효과가 존재하였으나, 폴리(IC)+PCI 조합(그룹 7)을 사용한 효과가 상당히 더 나았다.
실시예 8: 정상 마우스에서의 SIINFEKL 및 폴리(IC)를 사용한 PCI의 분석
정상 마우스의 백신접종을 위해 상기 기재된 바와 같이 실험을 수행하였다. 동물을 제0일 및 제14일에 하기 특정된 바와 같은 50 ㎍의 SIINFEKL 펩티드, 100 ㎍의 TPCS2a 및 10 ㎍의 폴리(IC)의 혼합물로 면역화시켰다. 면역화시키고 18시간 후에, 조명을 6분 동안 루미소스 조명 장치를 사용하여 수행하였다. 각 면역화 후 제7일로부터의 혈액 시료를 SIINFEKL 펜타머, CD8 및 CD44 항체로 염색하고, 기재된 바와 같이 유세포분석에 의해 분석하였다. 하기의 실험군을 포함시켰다:
1. 미처리: 마우스를 면역화시키거나 조명하지 않았다.
2. SIIN 50: 마우스를 50 ㎍의 SIINFEKL 펩티드로 면역화시켰다. 그들을 조명하지 않았다.
3. SIIN 50/PCI: 마우스를 50 ㎍의 SIINFEKL 펩티드 및 100 ㎍의 TPCS2a의 혼합물로 면역화시키고, 조명하였다.
4. SIIN 50/폴리(IC): 마우스를 100 ㎍의 SIINFEKL 펩티드 및 10 ㎍의 폴리(IC)의 혼합물로 면역화시켰다. 그들을 조명하지 않았다.
5. SIIN 50/폴리(IC)/PCI: 마우스를 50 ㎍의 SIINFEKL 펩티드, 100 ㎍의 TPCS2a 및 10 ㎍의 폴리(IC)의 혼합물로 면역화시키고, 조명하였다.
도 10은 1차(제7일) 및 2차(제21일) 면역화 후의 실험군(오차 막대는 평균의 표준 오차임)에 대한 평균값(전체 CD8+ 세포 중 항원-특이적 CD44+ 세포%)을 보여준다. 폴리(IC) 및 PCI의 조합(그룹 5)이 강력한 면역화 반응을 제공하는 한편, 임의의 다른 그룹에서 반응이 관찰되지 않았음을 알 수 있다. 따라서, 폴리(IC)+PCI 조합은 강력한 상승 효과를 제공한다.
실시예 9: 정상 마우스에서의 SIINFEKL 및 폴리(IC)를 사용한 PCI의 분석
정상 마우스의 백신접종을 위하여 상기 기재된 바와 같이 실험을 수행하였다. 동물을 제0일 및 제14일에 하기 특정된 바와 같은 100 ㎍의 SIINFEKL 펩티드, 150 ㎍의 TPCS2a 및 50 ㎍의 폴리(IC)(후자는 오직 1차 면역화에서만)의 혼합물로 면역화시켰다. 면역화시키고 18시간 후에 루미소스 조명 장치를 사용하여 6분 동안 조명을 수행하였다. 각 면역화 후 제7일로부터의 혈액 시료를 SIINFEKL 펜타머, CD8 및 CD44 항체로 염색하고, 기재된 바와 같이 유세포분석에 의해 분석하였다. 제28일에, 동물을 희생시키고, 비장을 수집하고, 비장 세포를 SIINFEKL 펩티드로 재자극하고, 방법하에 기재된 바와 같이 ELISA에 의해 분석하였다. 하기의 실험군을 포함시켰다:
1. 미처리: 마우스를 면역화시키거나 조명하지 않았다.
2. 2 × SIIN 100: 마우스를 둘 모두의 면역화에서 100 ㎍의 SIINFEKL 펩티드로 면역화시켰다. 그들을 조명하지 않았다.
3. 2 × SIIN 100/PCI: 마우스를 둘 모두의 면역화에서 100 ㎍의 SIINFEKL 펩티드 및 150 ㎍의 TPCS2a로 면역화시키고, 조명하였다.
4. 1 × SIIN 100/폴리(IC)/1 × SIIN 100: 마우스를 100 ㎍의 SIINFEKL 펩티드 및 50 ㎍의 폴리(IC)의 혼합물(1차 면역화); 및 100 ㎍의 SIINFEKL 펩티드(2차 면역화)로 면역화시켰다. 그들을 조명하지 않았다.
5. 1 × SIIN 100/폴리(IC)/PCI; 1 × SIIN 100/PCI: 마우스를 100 ㎍의 SIINFEKL 펩티드, 150 ㎍의 TPCS2a 및 50 ㎍의 폴리(IC)의 혼합물(1차 면역화); 및 100 ㎍의 SIINFEKL 펩티드 및 150 ㎍의 TPCS2a(2차 면역화)로 면역화시켰다. 그들을 둘 모두의 면역화에서 조명하였다.
도 11은 1차(제7일) 및 2차(제21일) 면역화 후의 실험군에 대한 평균값(전체 CD8+ 세포 중 항원-특이적 CD44+ 세포%)을 보여준다. 폴리(IC) 및 PCI의 조합(그룹 5)은 이러한 조합이 1차 면역화에서만 사용되고, 2차 면역화를 위하여 오직 PCI만을 사용할지라도 매우 우수한 면역 반응을 제공하는 것을 알 수 있다.
도 12는 도면에 나타낸 바와 같이 SIINFEKL 펩티드를 사용한 재자극이 있거나 그것이 없는 비장 세포에서의 평균 ELISA 값을 보여준다. 실험군 5에서 수행된 처리(PCI 및 폴리(IC)의 조합을 사용한 1차 면역화; PCI만을 사용한 2차 면역화)가 재자극 후에 인터페론-감마 생성의 상당한 증가를 유도하는 한편, 이것은 임의의 다른 처리군에서 관찰될 수 없었음을 알 수 있다.
실시예 10: MPLA 또는 이미퀴모드의 효과의 분석
정상 마우스의 백신접종을 위하여 상기 기재된 바와 같이 실험을 수행하였다. 동물을 제0일 및 제14일에 하기 특정된 바와 같은 200 ㎍의 OVA 단백질, 100 ㎍의 TPCS2a 및 50 ㎍의 이미퀴모드 또는 10 ㎍의 MPLA-SM의 혼합물로 면역화시켰다. 면역화시키고 18시간 후에 루미소스 조명 장치를 사용하여 6분 동안 조명을 수행하였다. 각 면역화 후 제7일로부터의 혈액 시료를 SIINFEKL 펜타머, CD8 및 CD44 항체로 염색하고, 기재된 바와 같이 유세포분석에 의해 분석하였다. 하기의 실험군을 포함시켰다:
1. 미처리: 마우스를 면역화시키거나 조명하지 않았다.
2. OVA 200: 마우스를 200 ㎍의 OVA로 면역화시켰다. 그들을 조명하지 않았다.
3. OVA 200/PCI: 마우스를 200 ㎍의 OVA 및 100 ㎍의 TPCS2a의 혼합물로 면역화시키고, 조명하였다.
4. OVA 200/이미퀴모드: 마우스를 200 ㎍의 OVA 및 50 ㎍의 이미퀴모드의 혼합물로 면역화시켰다. 그들을 조명하지 않았다.
5. OVA 200/이미퀴모드/PCI: 마우스를 200 ㎍의 OVA, 100 ㎍의 TPCS2a 및 50 ㎍의 이미퀴모드의 혼합물로 면역화시키고, 조명하였다.
6. OVA 200/MPLA: 마우스를 200 ㎍의 OVA 및 10 ㎍의 MPLA-SM의 혼합물로 면역화시켰다. 그들을 조명하지 않았다.
7. OVA 200/MPLA/PCI: 마우스를 200 ㎍의 OVA, 100 ㎍의 TPCS2a 및 10 ㎍의 MPLA-SM의 혼합물로 면역화시키고, 조명하였다.
도 13은 1차 및 2차 면역화 후의 실험군(각 그룹에 5마리 동물, 오차 막대는 표준 편차임)에 대한 평균값(전체 CD8+ 세포 중 항원-특이적 CD44+ 세포%)을 보여준다. OVA 단백질을 이미퀴모드(그룹 5) 및 MPLA 애쥬번트(그룹 7) 둘 모두에 대한 항원으로 사용하는 경우, PCI와의 조합이 단독의 애쥬번트(각각 그룹 4 및 6)를 사용하여 달성하였던 것보다 상당히 더 나은 면역화 효과를 유도하였음을 알 수 있다.
실시예 11: 정상 마우스에서의 SIINFEKL 및 폴리(IC)를 사용한 PCI, 3차 면역화 후의 메모리 반응
정상 마우스의 백신접종을 위해 재료 및 방법하에 기재된 바와 같이 실험을 수행하였다. 동물을 제0일 및 제14일에 하기 특정된 바와 같이 50 ㎍의 SIINFEKL 펩티드, 100 ㎍의 TPCS2a 및 10 ㎍의 폴리(IC)의 혼합물로 면역화시켰다. 면역학적 메모리의 생성을 폴리(IC)+PCI 처리를 사용한 제51일의 3차 면역화에 의해 시험하였다. 면역화하고 18시간 후에, 조명을 루미소스 조명 장치를 사용하여 6분 동안 수행하였다. 각 면역화 후 제8일(1차 면역화), 제7일(2차 면역화) 또는 제6일(3차 면역화)로부터의 혈액 시료를 SIINFEKL 펜타머, CD8 및 CD44 항체로 염색하고, 기재된 바와 같이 유세포분석에 의해 분석하였다. 하기의 실험군을 포함시켰다:
1. 미처리: 마우스를 면역화시키거나 조명하지 않았다.
2. SIIN50 폴리(IC)/폴리(IC) + PCI : 처음 2회의 면역화에서, 마우스를 50 ㎍의 SIINFEKL 펩티드 및 10 ㎍의 폴리(IC)로 면역화시켰다. 그들을 조명하지 않았다. 3차 면역화에서, 마우스를 50 ㎍의 SIINFEKL 펩티드, 100 ㎍의 TPCS2a 및 10 ㎍의 폴리(IC)로 면역화시켰다. 마우스를 조명하였다.
3. SIIN50 폴리(IC) + PCI/SIIN 50 PCI: 처음 2회의 면역화에서, 마우스를 50 ㎍의 SIINFEKL 펩티드, 100 ㎍의 TPCS2a 및 10 ㎍의 폴리(IC)로 면역화시켰다. 3차 면역화에서, 마우스를 50 ㎍의 SIINFEKL 펩티드 및 100 ㎍의 TPCS2a로 면역화시켰다. 마우스를 모든 3회의 면역화에서 조명하였다.
도 14는 각각의 3회의 면역화 후의 실험군에 대한 (전체 CD8+ 세포 중 항원-특이적 CD44+ 세포%)을 보여준다. 폴리(IC) 및 PCI의 조합이 매우 강력한 면역 반응을 유도하였으며, 3차 면역화가 오직 PCI만으로 수행되더라도(그룹 3), 3차 면역화로 인한 유의미한 증가를 유도하였음을 알 수 있다. 오직 폴리(IC)만을 처음 2회의 면역화에 사용하는 경우와 대조적으로, 사실상 면역 반응이 존재하지 않았으며, 폴리(IC)+PCI를 사용한 3차 면역화의 수행은 임의의 유의미한 정도로 면역화를 부스팅시키는 것으로 보이지 않았다. 도 11 및 도 12에 나타낸 결과와 함께, 결과는 펩티드 항원을 사용하여 폴리(IC) 및 PCI의 조합이 면역 반응을 개시하는데 필요하고 충분하나 이러한 면역 반응이 이후에 오직 PCI만으로 부스팅될 수 있음을 나타낸다. 역으로, 단독의 폴리(IC)는 심지어 폴리(IC)를 사용한 2회의 면역화 후에도 면역 반응을 개시할 수 없으며, 면역 반응이 관찰되지 않았고, 폴리(IC)+PCI를 사용한 3차 백신접종에 의해 반응을 부스팅하려는 시도는 성공적이지 않았으며, 이는 단독의 폴리(IC)의 사용으로 면역 반응의 개시가 완전히 결여됨을 나타낸다. 또한, 데이터는 2차 면역화 후 제37일에 제공되는 3차 면역화에 의해 면역 반응이 강력하게 부스팅될 수 있기 때문에, 폴리(IC)+PCI 조합을 사용하여 생성된 면역 반응이 장기간-지속되는 것을 보여준다.
실시예 12: 정상 마우스에서의 HPV 펩티드 항원 및 폴리(IC)를 사용한 PCI의 효과
정상 마우스의 백신접종을 위해 재료 및 방법하에 기재된 바와 같이 실험을 수행하였다. 동물을 제0일 및 제14일에 하기 특정된 바와 같이 50 ㎍의 HPV 또는 SIINFEKL 펩티드 항원, 100 ㎍의 TPCS2a 및 10 ㎍의 폴리(IC)의 혼합물로 면역화시켰다. 동물을 하기 특정된 바와 같이 제7일, 제14일 및 제51일에 3회의 면역화로 처리하였다. 면역화하고 18시간 후에, 루미소스 조명 장치를 사용하여 조명을 6분 동안 수행하였다. 각 면역화 후 제8일(1차 면역화), 제7일(2차 면역화) 또는 제6일(3차 면역화)로부터의 혈액 시료를 HPV 또는 SIINFEKL 펜타머, CD8 및 CD44 항체로 염색하고, 기재된 바와 같이 유세포분석에 의해 분석하였다. 하기의 실험군을 포함시켰다:
1. 미처리 SIIN: 마우스를 면역화시키거나 조명하지 않았다. 혈액 시료를 SIINFEKL 펜타머로 염색하였다.
2. 미처리 HPV: 마우스를 면역화시키거나 조명하지 않았다. 혈액 시료를 HPV 펜타머로 염색하였다.
3. SIIN50 폴리(IC)/폴리(IC) + PCI: 처음 2회의 면역화에서, 마우스를 50 ㎍의 SIINFEKL 펩티드 및 10 ㎍의 폴리(IC)로 면역화시켰다. 그들을 조명하지 않았다. 3차 면역화에서, 마우스를 50 ㎍의 SIINFEKL 펩티드, 100 ㎍의 TPCS2a 및 10 ㎍의 폴리(IC)로 면역화시켰다. 마우스를 조명하였다.
4. HPV 50: 마우스를 모든 3회의 면역화에서 50 ㎍의 HPV 펩티드로 면역화시켰다. 마우스를 조명하지 않았다.
5. HPV 50/PCI/HPV 50 폴리(IC) + PCI(3차): 처음 2회의 면역화에서, 마우스를 50 ㎍의 HPV 펩티드 및 100 ㎍의 TPCS2a로 면역화시켰다. 3차 면역화에서, 마우스를 50 ㎍의 HPV 펩티드, 100 ㎍의 TPCS2a 및 10 ㎍의 폴리(IC)로 면역화시켰다. 마우스를 모든 3회의 면역화에서 조명하였다.
6. HPV 50/폴리(IC)/HPV 50 폴리(IC) + PCI(3차): 처음 2회의 면역화에서, 마우스를 50 ㎍의 HPV 펩티드 및 10 ㎍의 폴리(IC)로 면역화시켰다. 그들을 조명하지 않았다. 3차 면역화에서, 마우스를 50 ㎍의 HPV 펩티드, 100 ㎍의 TPCS2a 및 10 ㎍의 폴리(IC)로 면역화시켰다. 마우스를 조명하였다.
도 15는 3회의 면역화 후의 실험군에 대한 (전체 CD8+ 세포 중 항원-특이적 CD44+ 세포%)를 보여준다. 그룹 6에서, 동일한 면역화 조건을 사용하여 SIINFEKL 펩티드로 달성되는 것(그룹 3)과 대략 동일한 세기의 HPV-특이적 면역 반응이 유도되었음을 알 수 있다. 이는 PCI 및 폴리(IC)의 조합도 또한 바이러스 및 암 관련 HPV E7 항원에 대한 면역 반응을 유도하는데 효율적이며, 또한, PCI+폴리(IC)가 긴 펩티드 항원(35개 아미노산)에 대한 면역 반응을 유도함을 나타내며, 긴 펩티드 항원은 아마도 그것이 MHC 클래스 I 상에 제시될 수 있기 전에, 세포내 흡수 및 단백질분해 과정을 필요로 할 것이다. 이것은 처리 없이 제시될 수 있는 SIINFEKL 및 흑색종 펩티드 항원과 대조적이다.
실시예 13: 조명 시기의 효과
정상 마우스의 백신접종을 위해 상기 기재된 바와 같이 실험을 수행하였다. 동물을 제0일 및 제14일에 하기 특정된 바와 같은 200 ㎍의 OVA 단백질, 150 ㎍의 TPCS2a 및 10 ㎍의 폴리(IC)로 면역화시켰다. 모든 그룹에서, TPCS2a를 조명하기 18시간 전에 주사하는 한편, OVA 항원 및 폴리(IC)를 조명하기 18시간 전에 TPCS2a와의 혼합물로 주사하거나, 조명하기 2시간 전에 개별 주사로서 주사하였다. 조명은 루미소스 조명 장치를 사용하여 6시간 동안 이루어졌다. 각 면역화 후 제7일로부터의 혈액 시료를 SIINFEKL 펜타머, CD8 및 CD44 항체로 염색하고, 기재된 바와 같이 유세포분석에 의해 분석하였다. 하기의 실험군을 포함시켰다:
1. 미처리: 마우스를 면역화시키거나 조명하지 않았다.
2. OVA 200: 마우스를 200 ㎍의 OVA로 면역화시켰다. 그들에 TPCS2a를 제공하지 않았으며, 조명하지 않았다.
3. OVA 200 PCI(2시간): 마우스를 조명하기 18시간 전에 TPCS2a를 주사하고, 조명하기 2시간 전에 200 ㎍의 OVA로 면역화시켰다.
4. OVA 200 PCI(18시간): 마우스를 조명하기 18시간 전에 TPCS2a 및 OVA로 면역화시켰다.
5. OVA 200 PCI P(IC)(2시간): 마우스를 조명하기 18시간 전에 TPCS2a를 주사하고, 조명하기 2시간 전에 200 ㎍의 OVA + 10 ㎍의 폴리(IC)로 면역화시켰다.
도 16은 1차 및 2차 면역화 후의 실험군(각 그룹에 5마리 마우스, 오차 막대는 표준 편차임)에 대한 평균값(전체 CD8+ 세포 중 항원-특이적 CD44+ 세포%)을 보여준다. 면역 반응이 또한, 항원+폴리(IC)가 조명하기 2시간 전에 투여되는 경우에 폴리(IC)+PCI 조합에 의해 증진되는 것을 알 수 있다.
실시예 14: 정상 마우스에서의 SIINFEKL 펩티드 및 폴리(IC)를 사용한 PCI의 효과. 3회의 면역화를 사용하여 폴리(IC)에 비한 PCI+ 폴리 (IC).
정상 마우스의 백신접종을 위해 재료 및 방법하에 기재된 바와 같이 실험을 수행하였다. 동물을 제0일, 제14일 및 제42일에 하기 특정된 바와 같이 50 ㎍의 SIINFEKL 펩티드 및 100 ㎍의 TPCS2a 및 10 ㎍의 폴리(IC)의 혼합물로 면역화시켰다. 면역화하고 18시간 후에, 루미소스 조명 장치를 사용하여 조명을 6분 동안 수행하였다. 각 면역화 후 제7일로부터의 혈액 시료를 SIINFEKL 펜타머, CD8 및 CD44 항체로 염색하고, 기재된 바와 같이 유세포분석에 의해 분석하였다. 하기의 실험군을 포함시켰다:
1. 미처리 SIIN: 마우스를 면역화시키거나 조명하지 않고, 혈액 시료를 SIIN 펜타머로 염색하였다.
2. SIIN/폴리(IC): 마우스를 50 ㎍의 SIINFEKL 펩티드 및 10 ㎍의 폴리(IC)의 혼합물로 3회 면역화시켰다. 그들을 조명하지 않았다.
3. SIIN/폴리(IC)/PCI: 마우스를 50 ㎍의 SIINFEKL 펩티드, 100 ㎍의 TPCS2a 및 10 ㎍의 폴리(IC)의 혼합물로 면역화시키고, 조명하였다.
도 17은 3개의 실험군에서 3차 면역화 후의 전형적인 동물로부터의 유세포분석 점도표를 보여주며, 이는 명백하게 폴리(IC)+PCI 조합에 의해 유도되는 매우 강력한 반응을 보여준다.
도 18은 각각의 3회의 면역화 후의 평균값(전체 CD8+ 세포 중 항원-특이적 CD44+ 세포%)을 보여준다. PCI+폴리(IC) 조합이 매우 강력한 면역 반응을 유도하였으며, 이는 3차 면역화 후에 혈액 시료 중 약 30%의 항원 특이적 CD8 T-세포를 야기하였음을 알 수 있다. 비교하여, 항원 및 단독의 폴리(IC) 애쥬번트를 사용한 3회의 면역화는 오직 매우 작은 효과만을 가졌다(3차 면역화 후에 0.28% 양성 세포).
실시예 15: 정상 마우스에서의 긴 HPV 펩티드 항원 및 폴리(IC)를 사용한 PCI의 효과
정상 마우스의 백신접종을 위하여 상기 기재된 바와 같이 실험을 수행하였다. HPV 16 E7 서열 GQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIR을 "긴" 펩티드 항원으로 사용하였다. 동물을 제0일 및 제14일에 50 ㎍의 긴 HPV 펩티드 항원, 100 ㎍의 TPCS2a 및 10 ㎍의 폴리(IC)(하기에 특정된 바와 같은 p(IC))의 혼합물로 면역화시켰다. 동물을 하기에 특정된 바와 같이 제7일 및 제14일에 2회의 면역화로 처리하였다. 면역화하고 18시간 후에, 루미소스 조명 장치를 사용하여 조명을 6분 동안 수행하였다. 각 면역화 후 제6일로부터의 혈액 시료를 HPV 펜타머, CD8 및 CD44 항체로 염색하고, 기재된 바와 같이 유세포분석에 의해 분석하였다. 하기의 실험군을 포함시켰다:
1. 2 × HPV: 마우스를 50 ㎍의 긴 HPV 펩티드로 2회 면역화시켰다. 마우스를 조명하지 않았다.
2. 2 × HPV + p(IC): 마우스를 50 ㎍의 긴 HPV 펩티드 및 10 ㎍의 폴리(IC)의 혼합물로 2회 면역화시켰다. 마우스를 조명하지 않았다.
3. 2 × HPV + p(IC) + PCI: 마우스를 50 ㎍의 긴 HPV 펩티드, 10 ㎍의 폴리(IC) 및 100 ㎍의 TPCS2a의 혼합물로 2회 면역화시켰다. 마우스를 둘 모두의 면역화시에 조명하였다.
4. 1: HPV + p(IC) + PCI. 2: HPV + PCI: 마우스를 50 ㎍의 긴 HPV 펩티드, 10 ㎍의 폴리(IC) 및 100 ㎍의 TPCS2a(1차 면역화), 및 50 ㎍의 긴 HPV 펩티드 및 100 ㎍의 TPCS2a(2차 면역화)의 혼합물로 면역화시켰다. 마우스를 둘 모두의 면역화시에 조명하였다.
5. 1: HPV + PCI. 2: HPV + p(IC) + PCI: 마우스를 50 ㎍의 긴 HPV 펩티드 및 100 ㎍의 TPCS2a(1차 면역화), 및 50 ㎍의 긴 HPV 펩티드, 10 ㎍의 폴리(IC) 및 100 ㎍의 TPCS2a(2차 면역화)의 혼합물로 면역화시켰다. 마우스를 둘 모두의 면역화시에 조명하였다.
도 19는 2회의 면역화 후의 실험군에 대한 (전체 CD8+ 세포 중 항원-특이적 CD44+ 세포%)를 보여준다. 그룹 3(PCI+p(IC) 조합을 사용한 2회의 면역화)에서 강력한 HPV-특이적 면역 반응이 유도되는 한편, 그룹 4 및 5(1회의 면역화는 PCI+p(IC) 조합을 사용하고, 1회는 오직 PCI만을 사용)에서, PCI가 사용되지 않았던 실험군(그룹 1 및 2)에 비하여 더 약하지만, 여전히 유의미한 면역 반응이 관찰되었음을 알 수 있다. 이것은 PCI 및 폴리(IC)의 조합이 바이러스 및 암 관련 HPV E7 항원에 대한 면역 반응을 유도하는데 효과적이며, 이러한 조합을 사용한 2회의 면역화가 1회의 그러한 면역화를 오직 PCI만을 사용한 1회의 면역화와 조합하는 것보다 더욱 효과적임을 보여준다. 또한, 긴 HPV 펩티드 항원에서, p(IC) 애쥬번트가 PCI와의 조합 없이 사용되는 경우 효과를 갖지 않음을 보여준다.
실시예 16: 정상 마우스에서의 짧은 HPV 펩티드 항원 및 폴리(IC)를 사용한 PCI의 효과
정상 마우스의 백신접종을 위하여 상기 기재된 바와 같이 실험을 수행하였다. HPV 16 E7 CD8 에피토프 RAHYNIVTF를 "짧은" 펩티드 항원으로 사용하였다. 동물을 제0일 및 제13일에 50 ㎍의 짧은 HPV 펩티드 항원, 100 ㎍의 TPCS2a 및 10 ㎍의 폴리(IC)(하기 특정된 바와 같은 p(IC))의 혼합물로 면역화시켰다. 동물을 하기 특정된 바와 같이 제7일 및 제13일에 2회의 면역화로 처리하였다. 면역화하고 18시간 후에, 조명을 루미소스 조명 장치를 사용하여 6분 동안 수행하였다. 각각의 면역화 후 제6일로부터의 혈액 시료를 HPV 펜타머, CD8 및 CD44 항체로 염색하고, 기재된 바와 같이 유세포분석에 의해 분석하였다. 하기의 실험군을 포함시켰다:
1. 미처리. 마우스를 면역화시키거나 조명하지 않았다.
2. 2 × 짧은 HPV: 마우스를 50 ㎍의 짧은 HPV 펩티드로 2회 면역화시켰다. 마우스를 조명하지 않았다.
3. 2 × 짧은 HPV + p(IC): 마우스를 50 ㎍의 짧은 HPV 펩티드 및 10 ㎍의 폴리(IC)의 혼합물로 2회 면역화시켰다. 마우스를 조명하지 않았다.
4. 2 × 짧은 HPV + PCI: 마우스를 50 ㎍의 짧은 HPV 펩티드, 10 ㎍의 폴리(IC) 및 100 ㎍의 TPCS2a의 혼합물로 2회 면역화시켰다. 마우스를 둘 모두의 면역화시에 조명하였다.
5. 2 × 짧은 HPV + p(IC) + PCI: 마우스를 50 ㎍의 짧은 HPV 펩티드, 10 ㎍의 폴리(IC) 및 100 ㎍의 TPCS2a의 혼합물로 2회 면역화시켰다. 마우스를 둘 모두의 면역화시에 조명하였다.
6. 1: 짧은 HPV + p(IC) + PCI. 2: 짧은 HPV + PCI: 마우스를 50 ㎍의 짧은 HPV 펩티드, 10 ㎍의 폴리(IC) 및 100 ㎍의 TPCS2a(1차 면역화), 및 50 ㎍의 짧은 HPV 펩티드 및 100 ㎍의 TPCS2a(2차 면역화)의 혼합물로 면역화시켰다. 마우스를 둘 모두의 면역화시에 조명하였다.
도 20은 2회의 면역화 후의 실험군에 대한 (전체 CD8+ 세포 중 항원-특이적 CD44+ 세포% +/- SEM)을 보여준다. p(IC)+PCI 조합으로 면역화된 둘 모두의 그룹(5 및 6)에서, 상당한 면역 반응이 유도되었으며, 이러한 조합을 둘 모두의 면역화를 위해 사용한 그룹 5에서 더 나은 효과가 달성되었음을 알 수 있다. 비교하여, 오직 p(IC)만 또는 오직 PCI만이 둘 모두의 면역화를 위해 사용되었던 그룹에서, (미처리 동물(그룹 1) 및 오직 항원으로만 면역화된 동물(그룹 2)과 비교하여) 면역 반응이 관찰되지 않았다. 이것은 PCI 및 폴리(IC)의 조합이 바이러스 및 암 관련 HPV E7 항원이 짧은 펩티드로서 전달되는 경우에도 이것에 대하여 면역 반응을 유도하는데 효율적이며, p(IC)+PCI 조합을 사용한 2회의 면역화가 단독의 p(IC) 또는 단독의 PCI에 비하여 강력한 상승 효과를 제공함을 보여준다.

Claims (45)

  1. 세포를 항원 분자, 감광화 작용제(photosensitizing agent) 및 TLR 리간드와 접촉시키는 단계, 및 상기 감광화 작용제를 활성화시키기에 유효한 파장의 광으로 상기 세포를 조사하는 단계로서, 상기 항원 분자가 상기 세포의 시토졸 내로 방출된 다음, 상기 항원 분자 또는 그의 부분이 세포의 표면상에 제시되는 단계를 포함하는 세포의 표면상의 항원 분자 또는 그의 부분의 발현 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 TLR 리간드가 TLR1 리간드, 바람직하게는 트리아실 지질펩티드인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 TLR 리간드가 TLR2 리간드, 바람직하게는 지질글리칸, 바람직하게는 지질다당류, 바람직하게는 포르피로모나스 진지발리아(Porphyromonas Gingivalia) 유래의 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 TLR 리간드가 TLR3 리간드, 바람직하게는 이중 가닥 RNA 분자, 바람직하게는 폴리(I:C)인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 TLR 리간드가 TLR4 리간드, 바람직하게는 지질다당류(예를 들어, 에스케리키아 콜라이(E. coli) 또는 살모넬라 미네소타(Salmonella minnesota) 유래) 또는 모노포스포릴 지질 A(MPLA)(예를 들어, 살모넬라 미네소타 유래), 바람직하게는 MPLA인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 TLR 리간드가 TLR5 리간드, 바람직하게는 플라젤린(flagellin)인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 TLR 리간드가 TLR6 리간드, 바람직하게는 디아실 지질펩티드인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 TLR 리간드가 TLR7 리간드, 바람직하게는 화학식 (1)의 이미다조퀴놀린 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염인 방법:
    Figure pct00018

    상기 식에서,
    R1은 예를 들어, 하이드록실기로 임의로 치환된 아미노-알킬기이고, R2는 산소 또는 질소기가 임의로 개재된 알킬기이며; 바람직하게는,
    R1은 N-CH2-C(CH3)2-R3이고;
    R2는 -CH2-X-CH2CH3 또는 수소 원자이며;
    R3은 OH 또는 수소 원자이고;
    X는 O 또는 NH이다.
  9. 제8항에 있어서, 상기 이미다조퀴놀린 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염이 레시퀴모드(resiquimod), 이미퀴모드(imiquimod) 및 가디퀴모드(gardiquimod)로부터 선택되는 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 TLR7 리간드가 단일 가닥 RNA 분자, 바람직하게는 ssPolyU, 바람직하게는 20 내지 200개 뉴클레오티드 길이인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 TLR 리간드가 TLR8 리간드, 바람직하게는 ssPolyU 분자인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 TLR 리간드가 TLR9 리간드, 바람직하게는 적어도 하나의 CpG 모티프, 및 3' 및 5' 측의 각각에서 상기 모티프의 측면에(flanking) 적어도 하나의 염기를 포함하는 6 내지 50개 염기의 단일-가닥 올리고뉴클레오티드인 CpG 올리고뉴클레오티드인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 CpG 올리고뉴클레오티드가 8 내지 16개 염기 길이의 팔린드롬 서열을 함유하는 방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 CpG 올리고뉴클레오티드가 하기의 서열을 갖는 방법:
    5'-tcgtcgttttcggcgcgcgccg-3' 또는 5'-tccatgacgttcctgacgtt-3'.
  15. 제1항에 있어서, 상기 TLR 리간드가 TLR11 또는 TLR12 리간드, 바람직하게는 프로필린(profilin)인 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 TLR 리간드가 TLR13 리간드, 바람직하게는 5 내지 30개 뉴클레오티드 길이의 RNA 분자이며, 바람직하게는 상기 RNA 분자가 서열 "CGGAAAGACC"를 포함하는 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 분자가 면역 반응을 자극할 수 있는 분자, 바람직하게는 백신 항원 또는 백신 성분인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 항원 제시가 면역 반응의 자극을 야기하는 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 시험관내 또는 생체외에서 수행되는 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 감광화 작용제가 TPCS2a, AlPcS2a, TPPS4 및 TPBS2a, 바람직하게는 TPCS2a로부터 선택되는 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 분자가 펩티드, 바람직하게는 흑색종 펩티드 또는 인유두종 바이러스(HPV) 펩티드인 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 항원 제시 세포, 바람직하게는 수지상 세포인 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 상기 항원 분자, 감광화 작용제 및 TLR 리간드와 동시에, 개별적으로 또는 순차적으로 접촉되는 방법.
  24. 제1항, 제17항 또는 제21항에 정의된 바와 같은 항원 분자, 제1항 또는 제20항에 정의된 바와 같은 감광화 작용제 및 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 TLR 리간드를 대상체에게 투여하는 단계, 및 상기 감광화 작용제를 활성화시키기에 유효한 파장의 광으로 상기 대상체를 조사하는 단계로서, 면역 반응이 생성되는 단계를 포함하는 대상체에서의 면역 반응의 생성 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 방법이 백신접종(vaccination) 방법인 방법.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 질환, 장애 또는 감염, 바람직하게는 암, 바람직하게는 흑색종 또는 유두종 바이러스와 관련된 암을 치료하거나 예방하기 위한 방법.
  27. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 포유류, 바람직하게는 고양이, 개, 말, 당나귀, 양, 돼지, 염소, 소, 마우스(mouse), 랫트(rat), 토끼 또는 기니피그이며, 가장 바람직하게는 상기 대상체가 인간인 방법.
  28. 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 분자, 감광화 작용제 및 TLR 리간드가 동시에, 개별적으로 또는 순차적으로 상기 대상체에게 투여되는 방법.
  29. 제1항, 제17항 또는 제21항에 정의된 바와 같은 항원 분자, 제1항 또는 제20항에 정의된 바와 같은 감광화 작용제 및 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 TLR 리간드 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 희석제, 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  30. 항원 분자 또는 그의 부분을 표면상에 발현하는 세포 또는 그의 집단으로서, 상기 세포가 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 방법에 의해 수득가능하며, 바람직하게는 상기 세포가 수지상 세포인 세포 또는 그의 집단.
  31. 제30항에 정의된 바와 같은 세포 또는 세포의 집단 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 희석제, 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  32. 예방 또는 치료법에 사용하기 위한, 제30항에 정의된 바와 같은 세포 또는 세포 집단, 또는 제29항 또는 제31항에 정의된 바와 같은 조성물.
  33. 대상체에서 면역 반응을 자극하는데 사용하기 위한, 바람직하게는 상기 대상체에서 질환, 장애 또는 감염을 치료하거나 예방하기 위한, 바람직하게는 백신접종을 위한 및/또는 암을 치료하거나 예방하기 위한, 제30항에 정의된 바와 같은 세포 또는 세포 집단, 또는 제29항 또는 제31항에 정의된 바와 같은 조성물.
  34. 대상체에서의 면역 반응의 자극용, 바람직하게는 상기 대상체에서의 질환, 장애 또는 감염의 치료 또는 예방용, 바람직하게는 백신접종용 및/또는 암의 치료 또는 예방용 약제의 제조를 위한, 제30항에 정의된 바와 같은 세포 집단, 또는 제29항 또는 제31항에 정의된 바와 같은 조성물의 용도.
  35. 제34항에 있어서, 상기 자극, 치료 또는 예방이 상기 약제를 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 용도.
  36. 예방 또는 치료법에서의 용도를 위한, 제1항, 제17항 또는 제21항에 정의된 바와 같은 항원 분자, 제1항 또는 제20항에 정의된 바와 같은 감광화 작용제 및 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 TLR 리간드.
  37. 제36항에 있어서, 대상체에서 면역 반응을 자극하는데 사용하기 위한, 바람직하게는 상기 대상체에서 질환, 장애 또는 감염을 치료하거나 예방하기 위한, 바람직하게는 백신접종을 위한 및/또는 암을 치료하거나 예방하기 위한 항원 분자, 감광화 작용제 및 TLR 리간드로서, 바람직하게는 상기 용도가 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 방법을 포함하는 항원 분자, 감광화 작용제 및 TLR 리간드.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서, 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 항원 분자, 감광화 작용제 및 TLR 리간드로서, 상기 용도가 세포의 집단을 제조하기 위한 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 방법을 포함하며, 바람직하게는 상기 세포가 수지상 세포인 항원 분자, 감광화 작용제 및 TLR 리간드.
  39. 제38항에 있어서, 상기 세포의 집단이 상기 대상체에게 투여되어야 하는 항원 분자, 감광화 작용제 및 작용제.
  40. 대상체에서의 면역 반응의 자극용, 바람직하게는 상기 대상체에서의 질환, 장애 또는 감염의 치료 또는 예방용, 바람직하게는 백신접종용 및/또는 암의 치료 또는 예방용 약제의 제조에서의, 제1항, 제17항 또는 제21항에 정의된 바와 같은 항원 분자 및/또는 제1항 또는 제20항에 정의된 바와 같은 감광화 작용제 및/또는 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 TLR 리간드의 용도로서, 바람직하게는 상기 면역 반응이 제24항 내지 제28항 중 어느 한 항에 기재된 바와 같은 방법에 의해 자극되는 용도.
  41. 제40항에 있어서, 상기 약제가 상기 대상체로의 투여를 위한, 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 방법에 의해 수득가능한 세포의 표면상에 항원 분자 또는 그의 부분을 발현하는 세포의 집단을 포함하는 용도.
  42. 제41항에 있어서, 상기 항원 분자 및/또는 감광화 작용제 및/또는 TLR 리간드를 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 방법에서 사용하여, 상기 약제의 제조를 위해 상기 세포의 집단을 수득하는 용도.
  43. 대상체의 면역 반응의 자극에서의 동시의, 개별적인 또는 순차적인 이용을 위한, 바람직하게는 상기 대상체에서 질환, 장애 또는 감염을 치료하거나 예방하기 위한, 바람직하게는 백신접종을 위한 및/또는 암을 치료하거나 예방하기 위한, 또는 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 방법에서 항원 분자 또는 그의 부분을 세포의 표면상에 발현하기 위한 조합된 제제로서, 제1항, 제17항 또는 제21항에 정의된 바와 같은 항원 분자, 제1항 또는 제20항에 정의된 바와 같은 감광화 작용제 및 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 TLR 리간드를 포함하는 제품.
  44. 대상체에서 면역 반응을 자극하는데 사용하기 위한, 바람직하게는 대상체에서 질환, 장애 또는 감염을 치료하거나 예방하기 위한, 바람직하게는 백신접종을 위한 및/또는 암을 치료하거나 예방하기 위한, 또는 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 방법에서 항원 분자 또는 그의 부분을 세포의 표면상에 발현하기 위한 키트로서,
    제1항 또는 제20항에 정의된 바와 같은 감광화 작용제를 함유하는 제1 용기;
    제1항, 제17항 또는 제21항에 정의된 바와 같은 항원 분자를 함유하는 제2 용기; 및
    제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 TLR 리간드를 함유하는 제3 용기를 포함하는 키트.
  45. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 방법에 따라 세포의 집단을 제조하는 단계, 및 이후에 상기 세포를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 바람직하게는 대상체에서 질환, 장애 또는 감염을 치료하거나 예방하기 위한, 바람직하게는 백신접종을 위한 및/또는 암을 치료하거나 예방하기 위한 대상체에서의 면역 반응의 생성 방법.
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