WO2022250416A1 - 리포펩타이드와 폴리(i:c) 아쥬번트를 이용하는 면역항암치료제 조성물 - Google Patents

리포펩타이드와 폴리(i:c) 아쥬번트를 이용하는 면역항암치료제 조성물 Download PDF

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염정선
조정기
안병철
정수경
허윤기
전홍재
김찬
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Definitions

  • the present invention relates to an immunotherapeutic composition
  • an immunotherapeutic composition comprising a lipopeptide and a poly(I:C) adjuvant as active ingredients.
  • the present invention relates to an immunotherapeutic agent composition in which anticancer immunoactivity is increased by co-administering a lipopeptide and a poly(I:C) adjuvant with an immune checkpoint inhibitor or another TLR ligand.
  • TLR Toll-like receptor
  • PAMP pathogen-related molecular pattern
  • TLRs known to be expressed in most immune cells are also known to be expressed in various cancer cells (Non-Patent Document 1, Cancer Microenvironment (2009) 2 (Suppl 1): S205-S214, Cancer Cells Expressing Toll-like Receptors and the Tumor Microenvironment).
  • TLRs expressed in cancer cells can induce the infiltration of immune cells into cancer cells through the secretion of cytokines and chemokines in cancer cells, thereby increasing the immune response in the tumor microenvironment.
  • TLR stimulators TLR ligands
  • TLR ligands activate TLR stimulators
  • Caspase pathway in cancer cells, thereby inducing apoptosis in cancer cells and causing cell death.
  • Type I IFN activated by TLR ligand further promotes apoptosis through activation of immune cells.
  • cancer cells are killed by TLR ligands, endogenous proteins and immunogenic cell death markers are secreted from dead cancer cells, and dendritic cells are activated by these factors, and cancer cell-specific NK cells and T cells become cancer cells play a role in killing
  • TLR ligands are expected to be developed as immuno-anticancer agents by inducing cancer cell death and cancer antigen-specific immune responses.
  • Immune checkpoint proteins are cell membrane proteins that function to inhibit the differentiation, proliferation, and activity of immune cells, but are expressed not only in immune cells but also in cancer cells.
  • Immune checkpoint proteins such as PD-L1 expressed in cancer cells are known to play an important role in protecting cancer cells from immune attack by T cells by inactivating cancer-specific T cells, thereby inducing immune evasion mechanisms in cancer.
  • Immune checkpoint inhibitors inhibit the function of these immune checkpoint proteins, thereby helping immune anti-cancer drugs to remove cancer cells.
  • Immune checkpoint inhibitors are known to have a high therapeutic effect in about 30% of patients treated when treated alone, but have no therapeutic effect in the rest of the patients. It is known that the reason for the limited effect of immune checkpoint inhibitors is the low response rate and resistance to immune checkpoint inhibitors.
  • the low response rate of immune checkpoint inhibitors shows a low response rate for carcinomas with a low expression level, as the expression level of the immune checkpoint protein varies depending on the type of carcinoma.
  • the evasion mechanism is suppressed through an immune checkpoint inhibitor, the exposure of cancer antigens is low, so a cancer-specific immune response capable of killing cancer cells is not induced, resulting in a low response rate. Therefore, the limitations of immune checkpoint inhibitors can be overcome only when a method capable of increasing exposure of cancer antigens and increasing cancer-specific immune responses is used in combination.
  • a method for converting a low-immunogenic tumor environment into a high-immunogenic tumor environment is required, which can be expected to be solved by enhancing immunogenicity using TLR ligands.
  • the present inventors developed a vaccine composition containing a TLR2 ligand lipopeptide and a TLR3 ligand poly(I:C) in a previous study, and confirmed that the vaccine composition induced a strong immune response (Republic of Korea Patent No. 10-0900837 No., Republic of Korea Patent Registration No. 10-1501583), the vaccine composition was named L-pampo.
  • L-Pampo causes a strong immuno-anticancer response
  • by administering L-Pampo to tumor cells using the anti-cancer effect and cancer antigen-specific immune response induction effect due to changes in the tumor microenvironment, It was confirmed that it inhibits the growth of cancer cells, induces apoptosis, and inhibits metastasis, and when L-Pampo is administered in combination with other TLR ligands, saponin, or immune checkpoint inhibitors, it overcomes immune evasion of cancer cells and dramatically improves anticancer efficacy. By confirming that, the present invention was completed.
  • An object of one aspect of the present invention is,
  • compositions for preventing or treating cancer comprising a lipopeptide and a poly(I:C) adjuvant as active ingredients.
  • Another object of the present invention is,
  • a method for generating an immune response against cancer in a subject comprising administering a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer containing a lipopeptide and poly(I:C) as active ingredients to a non-human subject is to provide
  • Another object of the present invention is,
  • Another object of the present invention is,
  • It is to provide a combination preparation for preventing or treating cancer comprising a lipopeptide, a poly(I:C) adjuvant, and a TLR ligand as active ingredients.
  • compositions for preventing or treating cancer comprising lipopeptide and poly(I:C) as active ingredients.
  • a method for generating an immune response against cancer in a subject comprising administering a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer containing a lipopeptide and poly(I:C) as active ingredients to a non-human subject provides
  • a combined preparation for the prevention or treatment of cancer comprising a lipopeptide, a poly(I:C) adjuvant, and an immune checkpoint inhibitor as active ingredients.
  • a combination preparation for preventing or treating cancer including a second component including a lipopeptide, a poly(I:C) adjuvant, and a Toll-like receptor (TLR) ligand as active ingredients.
  • a second component including a lipopeptide, a poly(I:C) adjuvant, and a Toll-like receptor (TLR) ligand as active ingredients.
  • TLR Toll-like receptor
  • a combination preparation for preventing or treating cancer containing lipopeptide and poly(I:C) adjuvant and saponin as active ingredients.
  • An immunotherapeutic agent composition comprising lipopeptide and poly(I:C) adjuvant as active ingredients provided in one aspect of the present invention can induce a high therapeutic effect on various cancer types, and is a chemical anticancer agent with a different mechanism, anticancer agent. It significantly enhances the anticancer effect through combined administration with existing anticancer drugs such as vaccines and immune checkpoint inhibitors.
  • FIG. 1 is a diagram confirming the Caspase-3 activity of an immunotherapeutic agent in a mouse colon cancer cell line.
  • Figure 2 is a diagram confirming the tumor suppression efficacy of immuno-anticancer therapy in a melanoma tumor mouse model.
  • Figure 3 is a diagram confirming the tumor suppression efficacy of immuno-anticancer therapy in a mouse model of colorectal cancer tumor.
  • FIG. 4 is a diagram illustrating the infiltration of immune cells into a tumor of an anti-cancer immunotherapeutic agent using immunofluorescence staining in a mouse model of colorectal cancer.
  • FIG. 5 is a diagram illustrating the infiltration of immune cells into a tumor of an immunotherapeutic agent using a flow cytometer in a mouse model of colorectal cancer.
  • FIG. 6 is a diagram illustrating the induction of a tumor-specific cellular immune response of an immunotherapeutic agent using an ELISPOT assay in a mouse model of colorectal cancer.
  • Figure 7 is a diagram analyzing the abscopal efficacy of immuno-anticancer drugs in a mouse model of colorectal cancer tumors.
  • Figure 8 is a diagram confirming the tumor suppression efficacy of immuno-anticancer therapy in bladder cancer mouse model.
  • FIG. 9 is a diagram confirming the tumor suppression efficacy of immuno-anticancer therapeutic agents in a pancreatic cancer mouse model.
  • FIG. 10 is a diagram confirming the combined efficacy of an immune checkpoint inhibitor of an immunotherapeutic agent in a mouse model of colorectal cancer.
  • 11a is a diagram confirming the combination efficacy (tumor size) of an immunotherapeutic agent with another TLR ligand or saponin in a mouse model of colorectal cancer.
  • Figure 11b is a diagram confirming the combination efficacy (tumor weight) of immunotherapies with other TLR ligands or saponins in a mouse model of colorectal cancer.
  • compositions for preventing or treating cancer comprising lipopeptide and poly(I:C) as active ingredients.
  • the lipopeptide is a synthetic analogue of a lipopeptide derived from bacteria and mycoplasma and was first synthesized by J. Metzger et al. (Metzger, J. et al ., 1991, Synthesis of novel immunologically active tripalmitoyl- S-glycerylcysteinyl lipopeptides as useful intermediates for immunogen preparations. Int. J. Peptide Protein Res. 37: 46-57).
  • the molecular structure of the compound represented by the following formula (1) is N-palmitoyl-S-[2,3-bis(palmitoyloxy)-(2RS)-propyl]-[R]-cystein-SKKKK (pam3Cys-SKKKK), in addition to Various analogues have been synthesized.
  • Lipopeptides are generally known as ligands for TLR2. The use of such a lipopeptide is not limited to Pam3Cys-SKKKK, and the lipopeptide may consist of a fatty acid and several amino acids bound to a glycerol molecule.
  • the number of fatty acids in a molecule can be one or more.
  • the number of amino acids in a lipopeptide can be one or more.
  • fatty acids and amino acids can be chemically modified.
  • the lipopeptide may be a lipoprotein in the form of a whole molecule or part of a molecule derived from a gram-positive or gram-negative bacterium or mycoplasma.
  • poly(I:C) has been used as a potent derivative of type 1 interferon in in vitro and in vivo studies.
  • poly(I:C) is known to stably and mature dendritic cells, which are the most powerful antigen-presenting cells in mammals (Rous, R. et al 2004. poly(I:C) used for human dendritic cells). cell maturation preserves their ability to secondarily secrete bioactive Il-12, International Immunol. 16: 767-773).
  • poly(I:C) is a potent IL-12 inducer, and IL-12 is an important cytokine that induces cellular immune responses and IgG2a or IgG2b antibody formation by promoting the development of Th1 immune responses.
  • poly(I:C) is known to have potent adjuvant activity against peptide antigens (Cui, Z. and F. Qui. 2005. Synthetic double stranded RNA poly I:C as a potent peptide vaccine adjuvant: Therapeutic activity against human cervical cancer in a rodent model. Cancer Immunol. Immunotherapy 16: 1-13).
  • Poly(I:C) is known as a representative TLR3 ligand. Poly(I:C) may range in length from 50 to 5,000 bp, preferably from 50 to 2,000 bp, preferably from 100 to 500 bp, but is not particularly limited thereto.
  • the lipopeptide and poly(I:C) may be included in the pharmaceutical composition at a weight ratio of 0.1 to 10:1, a weight ratio of 1.25 to 2:1, a weight ratio of 1.25 to 1.5:1, or a weight ratio of 1.25:1, but particularly It is not limited thereto, and may be adjusted to an appropriate level according to the condition of the patient.
  • the pharmaceutical composition may be an aqueous solution formulation.
  • the pharmaceutical composition may further include one or more selected from the group consisting of pharmaceutically acceptable carriers, diluents and adjuvants.
  • the pharmaceutical composition may include a pharmaceutically acceptable carrier, and may be formulated for human or veterinary use and administered through various routes.
  • the route of administration may be oral, intraperitoneal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, or intradermal administration. Preferably, it is formulated and administered as an injection.
  • Injectables include aqueous solvents such as physiological saline and IV, vegetable oils, higher fatty acid esters (e.g., ethyl oleate, etc.), non-aqueous solvents such as alcohols (e.g., ethanol, benzyl alcohol, propylene glycol, glycerin, etc.), etc. It can be manufactured using a stabilizer (e.g., ascorbic acid, sodium hydrogen sulfite, sodium pyrosulfite, BHA, tocopherol, EDTA, etc.) to prevent deterioration, an emulsifier, a buffer to control pH, and to inhibit the growth of microorganisms.
  • a stabilizer e.g., ascorbic acid, sodium hydrogen sulfite, sodium pyrosulfite, BHA, tocopherol, EDTA, etc.
  • the pharmaceutical composition may be administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount refers to an amount sufficient to exhibit an immuno-anticancer effect and an amount sufficient to not cause side effects or severe or excessive immune reactions, and the exact dosage concentration varies depending on the composition to be administered, and the patient It can be easily determined by a person skilled in the art according to factors well known in the medical field, such as age, weight, health, sex, sensitivity to a drug of a patient, route of administration, and method of administration, and can be administered once or several times.
  • Another aspect of the present invention is,
  • a method for generating an immune response against cancer in a subject comprising administering a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer containing a lipopeptide and poly(I:C) as active ingredients to a non-human subject provides
  • the pharmaceutical composition is administered to a human (patient), it can be administered in an amount effective to stimulate an immune response in vivo, for example, it can be administered to humans once or several times, and the dosage is 0.25 It may be -3.6 mg, more preferably 0.45-1.8 mg, but is not particularly limited thereto.
  • Another aspect of the present invention is,
  • a pharmaceutical combination preparation for preventing or treating cancer including lipopeptide and poly(I:C) and an immune checkpoint inhibitor as active ingredients.
  • At least one selected from the group consisting of an anti-CTLA4 antibody, an anti-PD-L1 antibody, and an anti-PD-1 antibody may be used.
  • the immune checkpoint inhibitor is an anti-CTLA4 antibody, a derivative thereof or an antigen-binding fragment thereof; an anti-PD-L1 antibody, derivative thereof or antigen-binding fragment thereof; anti-LAG-3 antibodies, derivatives or antigen-binding fragments thereof; an anti-OX40 antibody, derivative thereof or antigen-binding fragment thereof; an anti-TIM3 antibody, derivative thereof or antigen-binding fragment thereof; and anti-PD-1 antibodies, derivatives thereof, or antigen-binding fragments thereof.
  • an immune checkpoint inhibitor targeting CTLA-4 may use Yervoy (ipilimumab);
  • Immune checkpoint inhibitors targeting PD-L1 include Tecentriq (atezolizumab), Avelumab (Bavencio), and Imfinzi (Durvalumab), either alone or in combination of two or more. available;
  • Immune checkpoint inhibitors targeting PD-1 include Keytruda (Pembrolizumab), Opdivo (Nivolumab), and Libtayo (Semiplimab) alone or in combination of two or more. and can be used.
  • Another aspect of the present invention is,
  • a combination preparation for preventing or treating cancer including a lipopeptide and poly(I:C) and a Toll-like receptor (TLR) ligand as active ingredients.
  • TLR Toll-like receptor
  • TLR7 ligands Imiquimod, etc.
  • TLR7/8 ligands Imidazoquinoline, etc.
  • TLR9 ligands CpG ODN, etc.
  • Another aspect of the present invention is,
  • a combination preparation for preventing or treating cancer containing lipopeptide and poly(I:C) and saponin as active ingredients.
  • the saponin may be selected from the group consisting of QS21, Quil A, QS7, QS17, and combinations thereof.
  • An immunotherapeutic agent composition comprising lipopeptide and poly(I:C) adjuvant as active ingredients provided in one aspect of the present invention can induce a high therapeutic effect on various cancer types, and is a chemical anticancer agent with a different mechanism, anticancer agent. It significantly enhances the anticancer effect through combined administration with existing anticancer drugs such as vaccines and immune checkpoint inhibitors.
  • the immuno-anticancer composition (hereinafter referred to as L-pampo) comprising the lipopeptide and poly(I:C) of the present invention is a caspase in cancer cells, more than when the lipopeptide or poly(I:C) is treated alone. It was confirmed that apoptosis of cancer cells could be induced by further activating Caspase-3 of the first pathway (see FIG. 1). Accordingly, it was confirmed that L-pampo most strongly induces apoptosis of colon cancer cells.
  • L-pampo reduced the size of tumors in the melanoma mouse model (see FIG. 2), and it was confirmed that L-pampo reduced the size of tumors in the colorectal cancer mouse model, indicating that it has anticancer efficacy. could (see Figure 3).
  • the L-pampo of the present invention induces the infiltration of many CD8 T cells into the tumor of the colorectal cancer mouse model and suppresses Treg+ cells, thereby inducing immune activity capable of killing the tumor (FIG. 4 and FIG. see 5).
  • the L-pampo of the present invention strongly induces a tumor-specific cellular immune response by increasing the secretion of IFN- ⁇ in a mouse model of colorectal cancer (see FIG. 6).
  • the L-pampo of the present invention has an abscopal effect of reducing the size of not only tumors to which L-pampo was administered but also to tumors to which L-pampo was not administered (see FIG. 7).
  • L-pampo reduced the size of tumors in a mouse model of bladder cancer (see FIG. 8), and it was confirmed that L-pampo also reduced the size of tumors in a mouse model of pancreatic cancer (see FIG. 9).
  • the above results suggest that the L-pampo of the present invention exhibits anticancer efficacy in various cancers.
  • L-pampo containing the lipopeptide and poly(I:C) of the present invention induces a cancer-specific cellular immune response, infiltrates many CD8+ T cells into tumors, and has strong anti-cancer effects that strongly inhibit tumor growth.
  • intratumoral administration of the immuno-anticancer composition containing L-pampo kills cancer cells and can be used as an immuno-anticancer agent showing strong anti-cancer efficacy through cancer-specific immune response and infiltration of immune cells into tumors.
  • Colon cancer cell line MC38 cells were seeded in a 12-well culture plate at 1.5 ⁇ 10 5 cells/well, and the next day, TLR2 ligand (Pam3CSK4), TLR3 ligand (Poly (I:C)), or TLR2 (Pam3CSK4) and TLR3 ligand ( After treatment with L-pampo mixed with Poly(I:C)), it was cultured for 24 hours. At this time, L-pampo was prepared by mixing 50 ⁇ g of TLR2 ligand (Pam3CSK4) and 40 ⁇ g of TLR3 ligand (Poly(I:C)).
  • the cells were recovered, resuspended in about 100 ⁇ L of lysis buffer, and incubated on ice for 5 minutes. After centrifugation at 1000 x g for 10 minutes at 4°C, the lysate of the supernatant was taken and transferred to a new e-tube. After measuring the concentration of each sample through BCA analysis, adjust the concentration of all samples equally. These cell extract samples are stored at 4°C for immediate use and at -20°C for long-term storage.
  • the assay was performed according to the instructions of the caspase-3 cell activity assay kit (Millipore, #235419). Blank, negative control (caspase-3 inhibitor-treated cell extract), positive control (purified caspase-3), and cell extract of each sample were reacted with caspase substrate (Ac-DEVD-pNA) for a minimum of 30 minutes to a maximum For 120 minutes, the O.D. (405 nm) value was measured through color development at intervals of 5 to 10 minutes. Through the substrate standard, the conversion factor is calculated and the activity of each sample is expressed in terms of p mol/min.
  • caspase-3 The activity of caspase-3 was compared and analyzed in the negative and positive control groups and cell extract samples treated with TLR2 ligand, TLR3 ligand, and L-pampo.
  • Figure 1 is a diagram confirming the Caspase-3 activity of an immunotherapeutic agent in a mouse colon cancer cell line.
  • L-pampo is a colorectal cancer cell line MC38 It was confirmed that apoptosis was most strongly induced in cells.
  • L-pampo an immuno-anticancer drug
  • a buffer administration group was set as a negative control group, and when the tumor size of the melanoma tumor mouse model constructed in [2-1] reached about 100 mm 3 , 90 ⁇ g/dose of L-pampo was injected into the tumor at 3-day intervals. was administered 3 times.
  • Tumor sizes of all experimental groups were measured every 2 to 3 days.
  • the long and short axes of the tumor were measured, and the size of the tumor was calculated as [1/2 ⁇ long axis size ⁇ (short axis size) 2 ].
  • the tumor suppression efficacy of the immunotherapy agent was analyzed.
  • Figure 2 is a diagram confirming the tumor suppression efficacy of immuno-anticancer therapy in a melanoma tumor mouse model.
  • test group administered with the immuno-anticancer drug L-pampo suppressed the tumor size by about 52.8% on D22, 12 days after the start of administration, compared to the buffer test group, which is a negative control group. It was confirmed that L-pampo has melanoma tumor suppression effect.
  • mice 7-week-old female C57BL/6 mice (Orient Bio, Korea) were subcutaneously injected with 5 ⁇ 10 4 MC38 mouse colorectal cancer cell line into the right flank to generate tumors in the mice.
  • L-pampo an immuno-anticancer drug
  • a buffer administration group was set as a negative control group.
  • the tumor size of all experimental groups was measured every 3 days.
  • the long and short axes of the tumor were measured, and the size of the tumor was calculated as [1/2 ⁇ long axis size ⁇ (short axis size) 2 ].
  • the tumor suppression efficacy of the immunotherapy agent was analyzed.
  • Figure 3 is a diagram confirming the tumor suppression efficacy of immuno-anticancer therapy in a mouse model of colorectal cancer tumor.
  • the D19 L-pampo test group 12 days after the start of administration, showed a strong level of anticancer efficacy with 85.2% tumor suppression. This shows that the immuno-anticancer drug L-pampo can strongly inhibit the growth of colorectal cancer tumors.
  • mice tumors collected were fixed in 1% paraformaldehyde and then dehydrated using a 20% sucrose solution.
  • the tumor tissue was frozen in an optimal cutting temperature (OCT) compound, and the frozen tumor tissue was cut to a thickness of 50 ⁇ m using a cryotome and fixed to a slide.
  • OCT optimal cutting temperature
  • the tumor tissue fixed on the slide was reacted with a blocking solution for 1 hour.
  • the CD8 antibody and the CD31 antibody were diluted 1:200 and reacted at 4°C for 24 hours.
  • the fluorescent antibody and DAPI solution were reacted at room temperature for 2 hours.
  • fluorescence images were analyzed using a confocal microscope.
  • FIG. 4 is a diagram illustrating the infiltration of immune cells into a tumor of an anti-cancer immunotherapeutic agent using immunofluorescence staining in a mouse model of colorectal cancer.
  • the L-pampo test group showed that significantly more CD8 T cells (green fluorescence) were infiltrated into the tumor than the CD8+ T cells infiltrated in the negative control buffer test group. This shows that L-pampo can induce tumor suppression effect by immune cells by inducing the infiltration of many CD8 T cells into the tumor.
  • Mouse tumors collected for flow cytometry were cut into small pieces, treated with collagenase D and DNase I, and reacted at 37° C. for 1 hour. Filtered with a 70 ⁇ m cell strainer, lysed red blood cells, and then filtered again with a nylon mesh. The single cell suspension was blocked with CD16/32 antibody and then stained with cell viable dye. After staining with fluorescent dyes such as CD45, CD3, CD8, CD4, Foxp3, and CD25, the cells were measured using a CytoFLEX flow cytometer. The measured results were quantitatively compared and analyzed using FlowJo software.
  • FIG. 5 is a diagram illustrating the infiltration of immune cells into a tumor of an immunotherapeutic agent using a flow cytometer in a mouse model of colorectal cancer.
  • the L-pampo test group had a lot of CD8+ T cells infiltrated into the tumor.
  • the number of Treg+ cells suppressing the activity of T cells in the tumor was significantly lower than that of the negative control group. This shows that L-pampo can induce immune activity capable of killing tumors by infiltrating many CD8+ T cells into tumors and suppressing Treg+ cells.
  • mice On D19, 12 days after the start of administration, the spleens of all mice were collected and tumor-specific immune activity was analyzed by ELISPOT analysis.
  • the collected spleen was ground in a cell strainer, and then spleen cells were isolated and dead cells were removed.
  • Splenocytes and MC39 colon cancer cells were mixed and cultured in a 10:1 ratio in a 96-well plate encoded with mouse IFN- ⁇ . After incubation with detection antibody for 2 hours at room temperature, it was incubated with streptavidin-ALP for 1 hour at room temperature. After incubation, a substrate solution was added to confirm the spot. Spots were analyzed using Image J software.
  • FIG. 6 is a diagram illustrating the induction of tumor-specific cellular immune responses of immuno-anticancer therapeutics using ELIPOT analysis in a mouse model of colorectal cancer.
  • 5 ⁇ 10 4 MC38 mouse colon cancer cell line was subcutaneously injected into the right flank of 7-week-old female C57BL/6 mice (Orient Bio, Korea), and 4 days later, 5 ⁇ 10 4 MC38 colon cancer cell line was injected into the right flank. Subcutaneous injection was performed on the left flank to form tumors on both sides. 180 ⁇ g/dose of L-pampo prepared in [3-2] was administered only to the tumor generated on the right side. The size of the tumors generated on both sides was measured every 3 days to analyze the tumor suppression efficacy.
  • Figure 7 is a diagram analyzing the abscopal efficacy of immuno-anticancer drugs in a mouse model of colorectal cancer tumors.
  • the L-pampo test group significantly reduced the size of tumors (right side) to which L-pampo was administered, as well as tumors (left side) to which the immuno-anticancer drug was not administered (left side). showed that it did. From this, it was confirmed that when L-pampo, an immuno-anticancer drug, is administered to tumors, L-pampo not only kills cancer cells but also induces strong tumor-specific immune activity, thereby killing tumors not administered with L-pampo. It shows that immuno-anticancer drug L-pampo can treat metastasized cancer cells.
  • 5 ⁇ 10 5 MB49 mouse bladder cancer cell line was subcutaneously injected into the right flank of 7-week-old female C57BL/6 mice (Orient Bio, Korea) to generate tumors in the mice.
  • L-pampo an immuno-anticancer drug
  • a buffer administration group was set as a negative control group, and when the tumor size of the bladder cancer mouse model constructed in [4-1] reached about 50 mm 3 , 180 ⁇ g/dose of L-pampo was injected into the tumor 4 times at 3-day intervals. administered.
  • the tumor size of all experimental groups was measured every 3 days.
  • the long and short axes of the tumor were measured, and the size of the tumor was calculated as [1/2 ⁇ long axis size ⁇ (short axis size) 2 ].
  • the tumor suppression efficacy of the immunotherapy agent was analyzed.
  • Figure 8 is a diagram confirming the tumor suppression efficacy of immuno-anticancer therapy in bladder cancer mouse model.
  • the test group administered with the immuno-anticancer drug L-pampo was confirmed to suppress the size of tumors by about 60.3% on D24, 18 days after the start of administration, compared to the buffer test group, which is a negative control group. It was confirmed that L-pampo can strongly inhibit the growth of bladder cancer.
  • 5 ⁇ 10 5 KPC mouse pancreatic cancer cell line was subcutaneously injected into the right flank of 8-week-old female C57BL/6 mice (Orient Bio, Korea) to generate tumors in the mice.
  • L-pampo an immuno-anticancer drug
  • a buffer administration group was set as a negative control group, and when the tumor size of the pancreatic cancer mouse model constructed in [5-1] reached about 50 mm 3 , 180 ⁇ g/dose of L-pampo was injected into the tumor 4 times at 3-day intervals. administered.
  • the tumor size of all experimental groups was measured every 3 days.
  • the long and short axes of the tumor were measured, and the size of the tumor was calculated as [1/2 ⁇ long axis size ⁇ (short axis size) 2 ].
  • the tumor suppression efficacy of the immunotherapy agent was analyzed.
  • FIG. 9 is a diagram confirming the tumor suppression efficacy of immuno-anticancer therapeutic agents in a pancreatic cancer mouse model.
  • the test group administered with immuno-anticancer drug L-pampo showed a reduction in tumor size by about 82.9% on D21, 13 days after the start of administration, compared to the buffer test group, which is a negative control group. It was confirmed that pampo can strongly inhibit the growth of pancreatic cancer.
  • mice 8-week-old female C57BL/6 mice (Orient Bio, Korea) were subcutaneously injected with 1 ⁇ 10 5 MC38 mouse colorectal cancer cell line into the right flank to generate tumors in the mice.
  • L-pampo an immuno-anticancer drug.
  • a buffer administration group was set as a negative control group, and when the tumor size of the colorectal cancer mouse model constructed in [6-1] reached about 50 mm 3 , 50 ⁇ g/dose of L-pampo was injected into the tumor every 3 days for 4 administered twice.
  • Mouse PD-1 antibody an immune checkpoint inhibitor, was purchased from BioXCell.
  • a mouse PD-1 antibody monotherapy group was set as a combination control group, and 200 ⁇ g/dose of mouse PD-1 antibody was intraperitoneally administered 4 times at 3-day intervals when L-pampo was administered intratumorally.
  • the tumor size of all experimental groups was measured every 3 days.
  • the long and short axes of the tumor were measured, and the size of the tumor was calculated as [1/2 ⁇ long axis size ⁇ (short axis size) 2 ].
  • Tumor suppression efficacy was analyzed through the calculated tumor size.
  • FIG. 10 is a diagram confirming the combined efficacy of an immune checkpoint inhibitor of an immunotherapeutic agent in a mouse model of colorectal cancer.
  • the test group administered with the PD-1 antibody suppressed the tumor size by about 19.2% on D19, 12 days after the start of administration, compared to the negative control buffer test group.
  • the test group administered with immuno-anticancer drug L-pampo about 60.3% reduction in tumor size was confirmed on D19, showing a stronger tumor suppression effect than PD-1 antibody, an immune checkpoint inhibitor.
  • the tumor size was reduced by about 80.7% on D19, and it was confirmed that the tumor disappeared completely in 1 of 8 animals. It was confirmed that the combined treatment of L-pampo and immune checkpoint inhibitors can show strong anticancer efficacy.
  • mice 8-week-old female C57BL/6 mice (Orient Bio, Korea) were subcutaneously injected with 1 ⁇ 10 5 MC38 mouse colorectal cancer cell line into the right flank to generate tumors in the mice.
  • L-pampo an immuno-anticancer drug
  • a buffer administration group was set as a negative control group, and when the tumor size of the colorectal cancer mouse model constructed in [7-1] reached about 50 mm 3 , 45 ⁇ g/dose of L-pampo was injected into the tumor every 3 days for 4 administered twice.
  • the tumor size of all experimental groups was measured every 3 days.
  • the long and short axes of the tumor were measured, and the size of the tumor was calculated as [1/2 ⁇ long axis size ⁇ (short axis size) 2 ].
  • Tumor suppression efficacy was analyzed through the calculated tumor size.
  • FIG. 11 is a diagram confirming the combined efficacy of immunotherapies with other TLR ligands or saponins in a mouse model of colorectal cancer.
  • the test group administered with another TLR ligand, imiquimod (TLR 7 ligand), showed suppression of tumor size by about 39% on D20, 12 days after the start of administration, compared to the negative control buffer test group. . Also, in the test group administered with saponin, QS-21, it was confirmed that about 57% of the tumor size was suppressed on D20. On the other hand, the L-pampo-administered test group showed the strongest tumor growth inhibitory effect among the single-administered groups by confirming a reduction in tumor size by about 78% on D20.
  • the tumor size was reduced by about 84% or more on D20 in all experimental groups in which the immuno-anticancer drugs L-pampo, imiquimod, or QS-21 were administered in combination.
  • the results of measuring the tumor weight of each test group on D20 also confirmed a similar trend to tumor size inhibition. It was confirmed that it can show an effect and show a strong anticancer effect.

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Abstract

본 발명의 일 측면에서 제공하는 리포펩타이드와 폴리(I:C) 아쥬번트를 유효성분으로 포함하는 면역항암치료제 조성물은 다양한 암종에 대한 치료효과를 높게 유도할 수 있으며, 기전이 다른 화학 항암제, 항암 백신, 면역관문억제제 등과 같은 기존의 항암제와 병용투여를 통해 항암 효과를 현저히 증진시킴으로써 항암 치료에 유용하게 사용 가능한 효과가 있다.

Description

리포펩타이드와 폴리(I:C) 아쥬번트를 이용하는 면역항암치료제 조성물
본 발명은 리포펩타이드와 폴리(I:C) 아쥬번트를 유효성분으로 포함하는 면역항암치료제 조성물에 관한 것이다.
또한 본 발명은 리포펩타이드와 폴리(I:C) 아쥬번트에 면역관문 억제제 또는 다른 TLR 리간드를 병용투여하여 항암면역활성을 증가시킨 면역항암치료제 조성물에 관한 것이다.
TLR (Toll-like receptor)은 선천성 면역반응을 유도하는 세포 수용체로 초기의 병원체로부터 유래된 병원체 관련 분자 패턴 (PAMP)를 인지하여 신호전달 경로를 통해 선천성 면역 방어 기전을 활성화시켜 병원체 침입 초기부터 방어하는 역할을 하며, 수지상 세포를 활성화시키고 T cell과 B cell 등 적응성 면역반응까지도 활성화시키는 중요한 면역기능을 수행하고 있다.
대부분의 면역세포에서 발현된다고 알려져 있는 TLR는 다양한 암세포에서도 발현되는 것으로 알려져 있다(비특허문헌 1, Cancer Microenvironment (2009) 2 (Suppl 1):S205-S214, Cancer Cells Expressing Toll-like Receptors and the Tumor Microenvironment).
Type of cancer TLR
Gastric cancer TLR2, TLR4, TLR5, TLR9
Colorectal cancer TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR9
Ovarian cancer TLR2, TLR3, TLR4, TLR5
Cervical cancer TLR3, TLR4, TLR5, TLR9
Lung cancer TLR2, TLR3, TLR4, TLR9
Prostate cancer TLR4, TLR9
Melanomas TLR2, TLR3, TLR4
Brain cancer TLR2, TLR4
Brest cancer TLR2, TLR3, TLR4, TLR9
Hepatocellular carcinoma TLR2, TLR3, TLR4, TLR6, TLR9
Laryngeal cancer TLR2, TLR3, TLR4
암세포에 발현되는 TLR은 암세포에서 사이토카인(cytokine)과 케모카인(chemokine)의 분비를 통해 면역세포의 암세포로의 침윤을 유도하여 종양 미세환경에서 면역반응을 높일 수 있다.
또한, TLR 자극물질 (TLR ligands)을 암세포에 직접 처리하였을 경우 세포 사멸을 유도한다고 보고되었다. TLR 리간드는 암세포 내에서 카스파제(Caspase) 경로를 활성화시킴으로써 암세포의 아포프토시스(apoptosis)를 유도해 세포 사멸을 일으키게 되며, TLR 리간드에 의해 활성화된 Type I IFN은 면역세포의 활성화를 통해 아포프토시스를 더욱 촉진시키게 된다.
TLR 리간드에 의해 암세포의 사멸이 일어나게 되면 죽은 암세포에서 내재 단백질과 면역원성 세포 사멸 인자 (Immunogenic cell death marker)들이 분비되고 이러한 인자들에 의해 수지상 세포가 활성화되며 암세포 특이적 NK cell, T cell이 암세포를 죽이는 역할을 하게 된다.
또한, TLR 리간드에 의해 암세포가 사멸되면 암세포에서 유래된 암 항원의 노출과 DAMP (Damage associated molecular pattern)의 분비를 촉진하게 되며, 노출된 암 항원은 TLR 리간드의 아쥬번트 효과에 의해 암 항원 특이적인 면역반응이 유도될 수 있다. 따라서 TLR 리간드는 암세포 사멸과 암 항원 특이적인 면역반응을 유도함으로써 면역항암제로의 개발이 가능할 것으로 기대된다.
면역관문단백질은 세포막 단백질로서 면역세포의 분화, 증식, 활성을 억제하는 기능을 하지만 면역세포뿐 아니라 암세포에서도 발현되어 있다. 암세포에 발현된 PD-L1 등의 면역관문단백질은 암 특이적인 T 세포를 비활성화 시킴으로써 T 세포의 면역공격으로부터 암세포를 보호해 주는 중요한 역할을 수행하여 암의 면역회피 기전을 유도하는 것으로 알려져 있다. 면역관문억제제는 이러한 면역관문단백질의 기능을 억제함으로써 면역항암치료제가 암세포를 제거할 수 있도록 도와준다.
면역관문억제제는 단독 치료 시 치료 대상 환자의 약 30%에서는 높은 치료 효과를 보이지만 나머지 환자에서는 치료 효과가 없는 것으로 알려져 있다. 이와 같이 면역관문억제제의 효과가 제한적인 이유는 낮은 반응률과 면역관문억제제에 대한 내성 때문인 것으로 알려져 있다.
면역관문억제제의 낮은 반응률은 암종에 따라 면역관문단백질의 발현 정도가 달라 낮은 발현도를 가진 암종에 대하여 낮은 반응율을 보인다. 또한, 면역관문억제제를 통해 회피기전을 억제하여도 암항원의 노출이 적어 암세포를 죽일 수 있는 암 특이적인 면역반응이 유도가 되지 않기 때문에 낮은 반응율을 보이게 된다. 따라서 암항원의 노출을 증가시키고 암 특이적인 면역반응을 증가시킬 수 있는 방법을 병용하여야 면역관문억제제의 한계를 극복할 수 있다.
면역관문억제제의 내성은 종양 특이적인 면역세포들이 암조직내로 유입되지 않아서 암조직내 면역세포의 침윤이 없는 이른 저면역원성 환경을 형성하게 되어 면역치료에 내성을 보이기 때문에 생기게 된다.
이러한 면역관문억제제의 낮은 반응률과 내성 극복을 위해 저면역원성 종양 환경을 고면역원성 종양 환경으로 전환하는 방법이 필요하며, 이는 TLR 리간드를 이용한 면역원성 증강을 통해 해결 가능하다고 기대할 수 있다.
본 발명자들은 선행연구에서 TLR2 리간드인 리포펩타이드와 TLR3 리간드인 폴리(I:C)를 포함하는 백신 조성물을 개발하였고, 상기 백신 조성물이 강력한 면역 반응을 유도함을 확인하였고 (대한민국 등록특허 제10-0900837호, 대한민국 등록특허 제10-1501583호), 상기 백신조성물을 L-pampo라고 명명하였다.
본 발명에서 본 연구자들은 L-Pampo가 강력한 면역항암반응을 일으키는 것을 발견하였고, L-Pampo를 종양세포에 투여함으로써 종양미세환경의 변화에 의한 항암효과와 암 항원 특이적인 면역반응 유도효과를 이용하여 암세포의 성장을 억제하고 사멸을 유도하며 전이를 억제하는 것을 확인하였으며, L-Pampo와 다른 TLR 리간드, 사포닌 또는 면역관문억제제 등을 병용 투여하면 암세포의 면역회피를 극복하여 항암 효능을 획기적으로 향상시키는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 측면에서의 목적은,
리포펩타이드와 폴리(I:C) 아쥬번트를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 일 측면에서의 목적은,
리포펩타이드 및 폴리(I:C)를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을, 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체에서 암에 대한 면역 반응을 생성하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 일 측면에서의 목적은,
리포펩타이드와 폴리(I:C) 아쥬번트 및 면역관문 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 병용제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 일 측면에서의 목적은,
리포펩타이드와 폴리(I:C) 아쥬번트 및 TLR 리간드를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 병용제제를 제공하는 것이다.
리포펩타이드와 폴리(I:C) 아쥬번트 및 사포닌을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 병용제제를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명의 일 측면은,
리포펩타이드 및 폴리(I:C)를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 일 측면은,
리포펩타이드 및 폴리(I:C)를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을, 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체에서 암에 대한 면역 반응을 생성하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 또 다른 일 측면은,
리포펩타이드와 폴리(I:C) 아쥬번트 및 면역관문 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 병용제제를 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 일 측면은,
리포펩타이드와 폴리(I:C) 아쥬번트 및 TLR(Toll-like receptor) 리간드를 유효성분으로 포함하는 제2성분을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 병용제제를 제공한다.
나아가, 본 발명의 또 다른 일 측면은,
리포펩타이드 및 폴리(I:C) 아쥬번트 및 사포닌을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 병용제제를 제공한다.
본 발명의 일 측면에서 제공하는 리포펩타이드와 폴리(I:C) 아쥬번트를 유효성분으로 포함하는 면역항암치료제 조성물은 다양한 암종에 대한 치료효과를 높게 유도할 수 있으며, 기전이 다른 화학 항암제, 항암 백신, 면역관문억제제 등과 같은 기존의 항암제와 병용투여를 통해 항암 효과를 현저히 증진시킨다.
도 1은 마우스 대장암 세포주에서 면역항암치료제의 Caspase-3 활성을 확인한 도이다.
도 2는 흑색종 종양 마우스 모델에서의 면역항암치료제의 종양 억제 효능을 확인한 도이다.
도 3은 대장암 종양 마우스 모델에서의 면역항암치료제의 종양 억제 효능을 확인한 도이다.
도 4는 대장암 종양 마우스 모델에서 면역형광염색법을 이용하여 면역항암치료제의 종양 내 면역세포 침윤 효능을 분석한 도이다.
도 5는 대장암 종양 마우스 모델에서 유세포 분석기를 이용하여 면역항암치료제의 종양 내 면역세포 침윤 효능을 분석한 도이다.
도 6은 대장암 종양 마우스 모델에서 ELISPOT 분석을 이용하여 면역항암치료제의 종양 특이적인 세포성 면역반응 유도를 분석한 도이다.
도 7은 대장암 종양 마우스 모델에서 면역항암치료제의 Abscopal 효능을 분석한 도이다.
도 8은 방광암 마우스 모델에서의 면역항암치료제의 종양 억제 효능을 확인한 도이다.
도 9은 췌장암 마우스 모델에서의 면역항암치료제의 종양 억제 효능을 확인한 도이다.
도 10은 대장암 마우스 모델에서의 면역항암치료제의 면역관문억제제와의 병용 효능을 확인한 도이다.
도 11a은 대장암 마우스 모델에서 면역항암치료제의 다른 TLR 리간드 또는 사포닌과의 병용 효능 (종양 크기)을 확인한 도이다.
도 11b는 대장암 마우스 모델에서 면역항암치료제의 다른 TLR 리간드 또는 사포닌과의 병용 효능 (종양 무게)을 확인한 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
한편, 본 발명의 실시 형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 실시 형태는 당해 기술분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다.
나아가, 명세서 전체에서 어떤 구성요소를 "포함"한다는 것은 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있다는 것을 의미한다.
본 발명의 일 측면은,
리포펩타이드 및 폴리(I:C)를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
상기 리포펩타이드(lipopeptide)는 박테리아와 마이코플라즈마에서 유래한 리포펩타이드의 합성유사체(synthetic analogue)로 J. Metzger 등에 의해 처음 합성되었다(Metzger, J. et al., 1991, Synthesis of novel immunologically active tripalmitoyl-S-glycerylcysteinyl lipopeptides as useful intermediates for immunogen preparations. Int. J. Peptide Protein Res. 37: 46-57). 하기 화학식 (1)로 표시되는 화합물 분자구조는 N-palmitoyl-S-[2,3-bis(palmitoyloxy)-(2RS)-propyl]-[R]-cystein-SKKKK(pam3Cys-SKKKK)이며, 이외에도 다양한 유사체들이 합성된 바 있다.
[화학식 (1)]
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H. Schild 등에 따르면 Pam3Cys-Ser-Ser을 인플루엔자 바이러스 T 세포 에피토프와 결합시켜 마우스에 투여한 경우, 바이러스 특이적인 세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocyte, CTL)가 유도되었다. 일반적으로 리포펩타이드는 TLR2에 대한 리간드로 알려져 있다. 이러한 리포펩타이드의 사용은 Pam3Cys-SKKKK에 한정되지 않으며, 리포펩타이드는 글리세롤 분자에 결합된 지방산과 여러 아미노산으로 구성될 수 있다. 그 구체예로 PHC-SKKKK, Ole2PamCys-SKKKK, Pam2Cys-SKKKK, PamCys(Pam)-SKKKK, Ole2Cys-SKKKK, Myr2Cys-SKKKK, PamDhc-SKKKK, PamCSKKKK, Dhc-SKKKK 등이 포함된다. 분자 내에 지방산의 숫자는 한 개이거나 그 이상일 수 있다. 리포펩타이드에 아미노산의 수는 하나이거나 그 이상일 수 있다. 또한, 지방산과 아미노산은 화학적으로 변형될 수 있다. 나아가, 리포펩타이드는 그람 양성이나 그람 음성인 박테리아나 마이코플라즈마로부터 유래한 분자 일부이거나 분자 전체 형태로 된 지질 단백질일 수 있다.
또한, 상기 폴리(I:C)는 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo) 연구에서 타입1 인터페론의 강력한 유도체로 사용되어 왔다. 더욱이 폴리(I:C)는 포유류에서 가장 강력한 항원 제시 세포인 수지상세포(dendritic cell)를 안정적이고 성숙하게 형성하는 것으로 알려졌다(Rous, R. et al 2004. poly(I:C) used for human dendritic cell maturation preserves their ability to secondarily secrete bioactive Il-12, International Immunol. 16: 767-773). 이러한 기존보고에 따르면 폴리(I:C)는 강력한 IL-12 유도물질이며, IL-12는 면역반응을 Th1이 발달하도록 추진하여 세포성 면역반응과 IgG2a 또는 IgG2b 항체 형성을 유도하는 중요한 사이토카인이다. 또한, 폴리(I:C)는 펩티드 항원에 대한 강력한 아쥬번트 활성을 갖는 것으로 알려졌다(Cui, Z. and F. Qui. 2005. Synthetic double stranded RNA poly I:C as a potent peptide vaccine adjuvant: Therapeutic activity against human cervical cancer in a rodent model. Cancer Immunol. Immunotherapy 16: 1-13). 폴리(I:C)는 대표적인 TLR3 리간드로 알려져 있다. 폴리(I:C)는 길이가 50 내지 5,000 bp 범위일 수 있고, 50 내지 2,000 bp인 것이 적합하며, 100 내지 500 bp가 바람직하나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 리포펩타이드 및 폴리(I:C)는 0.1 내지 10 : 1의 중량비, 1.25 내지 2 : 1의 중량비, 1.25 내지 1.5 : 1의 중량비, 1.25 : 1의 중량비로 약제학적 조성물에 포함될 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니고, 환자의 상태에 따라 적절한 수준으로 조절할 수 있다. 또한, 상기 약제학적 조성물은 수용액 제형일 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및 아쥬번트로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 더 포함할 수 있다. 일례로, 상기 약제학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있고, 인체 또는 수의용으로 제형화되어 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여 경로는 경구, 복강, 정맥, 근육, 피하, 피내 등의 경로로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 주사제로 제형화하여 투여하는 것이다. 주사제는 생리식염액, 링겔액 등의 수성 용제, 식물유, 고급 지방산 에스텔(예, 올레인산에칠 등), 알코올류(예, 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콘, 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제(예, 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, 피로아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제(예, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등) 등의 약제학적 담체를 포함할 수 있다. 상기 약제학적 조성물은 약제학적 유효량으로 투여할 수 있다. 이때, 용어 "약제학적 유효량"이란 면역항암 효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용이나 심각한 또는 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 정확한 투여 농도는 투여될 구성에 따라 달라지며, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여경로, 투여 방법 등 의학분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있으며, 1회 내지 수회 투여가 가능하다.
본 발명의 다른 일 측면은,
리포펩타이드 및 폴리(I:C)를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을, 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체에서 암에 대한 면역 반응을 생성하는 방법을 제공한다.
단, 만약 상기 약제학적 조성물을 인간(환자)에게 투여할 경우, 생체 내 면역반응을 자극하기에 유효한 양으로 투여할 수 있으며, 일례로 인간에게 일회 내지 수회로 투여할 수 있고, 투여량은 0.25-3.6 mg, 더욱 바람직하게는 0.45-1.8 mg일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 일 측면은,
리포펩타이드 및 폴리(I:C) 및 면역관문억제제를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약제학적 병용제제를 제공한다.
이때, 상기 면역관문억제제는,
항-CTLA4 항체, 항-PD-L1 항체 및 항-PD-1 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있다.
더욱 구체적으로, 상기 면역관문억제제는 항-CTLA4 항체, 이의 유도체 또는 이의 항원-결합 단편; 항-PD-L1 항체, 이의 유도체 또는 이의 항원-결합 단편; 항-LAG-3 항체, 이의 유도체 또는 이의 항원-결합 단편; 항-OX40 항체, 이의 유도체 또는 이의 항원-결합 단편; 항-TIM3 항체, 이의 유도체 또는 이의 항원-결합 단편; 및 항-PD-1 항체, 이의 유도체 또는 이의 항원-결합 단편 중에서 선택되는 것을 사용할 수 있다. 구체예로, CTLA-4를 표적으로 하는 면역관문억제제는 여보이(Yervoy, 이필리무맙)을 사용할 수 있고; PD-L1을 표적으로 하는 면역관문억제제는 티쎈트릭(Tecentriq, 아테졸리주맙), 아벨루맙(바벤시오 Bavencio), 임핀지(Imfinzi, 더발루맙) 등을 단독으로, 또는 2종 이상을 조합하여 사용할 수 있고; PD-1을 표적으로 하는 면역관문억제제는 키트루다(Keytruda, 펨브롤리주맙), 옵디보(Opdivo, 니볼루맙), 립타요(Libtayo, 세미플리맙) 등을 단독으로, 또는 2종 이상을 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 일 측면은,
리포펩타이드 및 폴리(I:C) 및 TLR(Toll-like receptor) 리간드를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 병용제제를 제공한다.
이때, 상기 TLR(Toll-like receptor) 리간드는 TLR 1 내지 13으로부터 선택되는 하나 이상의 리간드를 사용할 수 있다. 구체예로, TLR7 리간드 (Imiquimod 등), TLR7/8 리간드 (Imidazoquinoline 등), TLR9 리간드 (CpG ODN 등)를 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 측면은,
리포펩타이드 및 폴리(I:C) 및 사포닌을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 병용제제를 제공한다.
이때, 상기 사포닌은 QS21, Quil A, QS7, QS17 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 사용할 수 있다.
본 발명의 일 측면에서 제공하는 리포펩타이드와 폴리(I:C) 아쥬번트를 유효성분으로 포함하는 면역항암치료제 조성물은 다양한 암종에 대한 치료효과를 높게 유도할 수 있으며, 기전이 다른 화학 항암제, 항암 백신, 면역관문억제제 등과 같은 기존의 항암제와 병용투여를 통해 항암 효과를 현저히 증진시킨다.
구체적으로, 본 발명의 리포펩타이드 및 폴리(I:C)를 포함하는 면역항암제 조성물 (이하, L-pampo)은, 리포펩타이드 또는 폴리(I:C)를 각각 단독으로 처리한 경우보다 암세포 내에 카스파제 경로의 Capspase-3를 더 활성화함으로써 암세포의 사포사멸을 유도할 수 있음을 확인하였다 (도 1 참조). 따라서, L-pampo는 가장 강하게 대장암 세포의 세포사멸을 유도함을 확인하였다.
또한, 흑색종 마우스 모델에서 L-pampo는 종양의 크기를 감소시킴을 확인하였고 (도 2 참조), 대장암 마우스 모델에서도 L-pampo가 종양의 크기를 감소시킴을 확인하여 항암 효능이 있음을 알 수 있었다 (도 3 참조). 또한, 본 발명의 L-pampo는 대장암 종양 마우스 모델의 종양 내로 많은 CD8 T 세포의 침윤을 유도하고, Treg+ 세포는 억제시킴으로써 종양을 사멸시킬 수 있는 면역활성을 유도함을 확인하였다 (도 4 및 도 5 참조).
또한, 본 발명의 L-pampo는 대장암 종양 마우스 모델에서 IFN-γ의 분비를 증가시킴으로써 종양 특이적인 세포성 면역 반응을 강력하게 유도함을 확인하였다 (도 6 참조). 또한, 본 발명의 L-pampo는 L-pampo를 투여한 종양 뿐만 아니라 투여하지 않은 종양의 크기도 감소시키는 Abscopal 효능이 있음을 확인하였다 (도 7 참조).
한편, 방광암 마우스 모델에서도 L-pampo가 종양의 크기를 감소시킴을 확인하였고 (도 8 참조), 췌장암 마우스 모델에서도 L-pampo가 종양의 크기를 감소시킴을 확인하였다 (도 9 참조). 상기의 결과들은 본 발명의 L-pampo가 다양한 암에서 항암 효능을 보임을 시사한다.
한편, 본 발명의 L-pampo와 면역관문억제제인 PD-1 항체를 병용 투여한 경우, 단독 처리군에 비하여 종양의 크기를 월등히 감소시킴을 확인하였다 (도 10 참조). 따라서, L-pampo와 면역관문억제제의 병용 치료는 강력한 항암 효능이 있음을 시사한다. 또한, 본 발명의 L-pampo와 다른 TLR 리간드 (imiquimod) 또는 사포닌 (QS-21)을 병용 투여한 경우에도 단독 처리군에 비하여 종양의 크기와 무게가 월등히 감소함을 확인하였다 (도 11a 및 도 11b 참조). 따라서 본 발명의 면역항암치료제 L-pampo와 다른 TLR 리간드 또는 사포닌과의 병용 치료는 시너지 효과를 보이며 강력한 항암 효능을 보일 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 리포펩타이드 및 폴리(I:C)를 포함하는 L-pampo는 암 특이적인 세포성 면역반응을 유도하고 많은 CD8+ T 세포를 종양 내로 침윤시키며 종양의 성장을 강력하게 억제하는 강력한 항암 효능을 보였다. 이를 통해, L-pampo를 포함하는 면역항암제 조성물의 종양 내 투여는 암세포를 사멸하고 암 특이적인 면역반응과 면역세포의 종양 내 침윤을 통해 강력한 항암효능을 보이는 면역항암제로 사용될 수 있음을 확인하였다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용과 범위가 하기 내용으로 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 대장암 세포주 MC38 세포에서 리포펩타이드와 폴리(I:C)가 포함된 면역항암치료제의 caspase-3 활성 분석
[1-1] 세포 시딩 및 자극
대장암 세포주 MC38 세포를 12 웰 배양 플레이트에 1.5×105 세포/웰로 시딩한 후, 익일에 TLR2 리간드(Pam3CSK4), TLR3 리간드(Poly(I:C)), 또는 TLR2(Pam3CSK4) 및 TLR3 리간드(Poly(I:C))가 혼합된 L-pampo를 처리한 뒤 24시간 배양하였다. 이때, L-pampo는 TLR2 리간드(Pam3CSK4) 50 ㎍과 TLR3 리간드(Poly(I:C)) 40 ㎍을 혼합하여 제조하였다.
[1-2] 세포 추출물 준비
24시간 동안의 자극이 완료되면 세포를 회수하여 용해 버퍼(lysis buffer) 약 100 μL로 재현탁(resuspension)한 후, 얼음에서 5분간 배양하였다. 1000×g로 10분간 4℃로 원심 분리한 뒤, 상층액의 용해물(lysate)을 취해, 새로운 e-튜브로 옮긴다. BCA 분석을 통해 각 샘플의 농도를 측정한 뒤, 모든 샘플의 농도를 동일하게 맞춰준다. 이 세포 추출물 샘플은 바로 사용할 시 4℃, 장기 보관 시 -20℃에 보관한다.
[1-3] Caspase-3 세포 활성 분석
분석은 caspase-3 세포 활성 분석 키트(Millipore, #235419)의 지침에 따라 진행하였다. Blank, 음성 대조군 (caspase-3 억제제를 처리한 세포 추출물), 양성 대조군 (정제된 caspase-3), 각 샘플의 세포 추출물을 caspase 기질(Ac-DEVD-pNA)과 반응시켜, 최소 30분 내지 최대 120분 동안, 5분 내지 10분 간격으로 발색을 통한 O.D.(405nm)값을 측정하였다. 기질 표준(Substrate standard)을 통해, 변환 계수(conversion factor)를 계산하여 각 샘플의 활성을 p mol/분으로 환산하여 나타낸다.
[1-4] Caspase-3 활성 비교 분석
음성대조군 및 양성대조군과 TLR2 리간드, TLR3 리간드, L-pampo를 처리한 세포 추출물 샘플에서 caspase-3의 활성을 비교 분석하였다.
그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1은 마우스 대장암 세포주에서 면역항암치료제의 Caspase-3 활성을 확인한 도이다.
도 1에 나타난 바와 같이, TLR2 리간드와 TLR3 리간드를 처리한 실험군에 비해, L-pampo를 처리한 실험군에서 caspase-3 활성이 상대적으로 더 높게 유도되는 것으로 확인함으로써, L-pampo가 대장암 세포주 MC38 세포에서 가장 강하게 사포사멸을 유도함을 확인하였다.
[실시예 2] 흑색종(Melanoma) 마우스 모델에서 리포펩타이드와 폴리(I:C)가 포함된 면역항암치료제의 효능 확인
[2-1] 흑색종 종양 마우스 모델 제작
7주령 암컷 C57BL/6 마우스(오리엔트 바이오, 한국)의 오른쪽 측면에 2×105 B16F10 마우스 흑색종 세포주를 피하 주사하여 마우스에 종양을 생성하였다.
[2-2] 면역항암치료제의 제조 및 투여
Pam3CSK4 50 ㎍과 폴리(I:C) 40 ㎍을 혼합하여 면역항암치료제 L-pampo를 제조하였다. 음성대조군으로 buffer 투여군을 설정하였으며, 상기 [2-1]에서 구축한 흑색종 종양 마우스 모델의 종양 크기가 약 100 mm3에 도달하였을 때, 90 ㎍/dose의 L-pampo를 종양 내로 3일 간격으로 3회 투여하였다.
[2-3] 종양 억제 효능 분석
모든 실험군의 종양 크기를 2 내지 3일 간격으로 측정하였다. 종양의 장·단축을 측정하고 [1/2 × 장축의 크기 × (단축의 크기)2]로 종양의 크기를 계산하였다. 계산된 종양의 크기를 통해 면역함암치료제의 종양 억제 효능을 분석하였다.
그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2는 흑색종 종양 마우스 모델에서의 면역항암치료제의 종양 억제 효능을 확인한 도이다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 면역항암치료제 L-pampo를 투여한 시험군은 음성대조군인 buffer 시험군에 비해 투여 시작 후 12일 후인 D22에 약 52.8% 종양의 크기가 억제는 것을 확인됨으로써 면역항암치료제 L-pampo가 흑색종 종양 억제 효능이 있음을 확인하였다.
[실시예 3] 대장암 마우스 모델에서 리포펩타이드와 폴리(I:C)가 포함된 면역항암치료제의 효능 확인
[3-1] 마우스 모델 제작
7 주령 암컷 C57BL/6 마우스(오리엔트 바이오, 한국)의 오른쪽 측면에 5×104 MC38 마우스 대장암 세포주를 피하 주사하여 마우스에 종양을 생성하였다.
[3-2] 면역항암치료제의 제조 및 투여
Pam3CSK4 100 ㎍과 폴리(I:C) 80 ㎍을 혼합하여 면역항암치료제 L-pampo를 제조하였다. 음성대조군으로 buffer 투여군을 설정하였다. 상기 [3-1]에서 구축한 대장암 마우스 모델의 종양 크기가 약 50 mm3에 도달하였을 때, 180 ㎍/dose의 L-pampo를 종양 내로 3일 간격으로 4회 투여하였다.
[3-3] 종양 억제 효능 분석
모든 실험군의 종양 크기를 3일 간격으로 측정하였다. 종양의 장·단축을 측정하고 [1/2 × 장축의 크기 × (단축의 크기)2]로 종양의 크기를 계산하였다. 계산된 종양의 크기를 통해 면역함암치료제의 종양 억제 효능을 분석하였다.
그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3은 대장암 종양 마우스 모델에서의 면역항암치료제의 종양 억제 효능을 확인한 도이다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 음성대조군인 buffer 시험군에 비해 투여 시작 후 12일 후인 D19 L-pampo 시험군은 85.2% 종양이 억제되어 강력한 수준의 항암 효능을 보였다. 이는 면역항암치료제 L-pampo가 대장암 종양의 성장을 강력하게 억제할 수 있음을 보여준다.
[3-4] 종양 내 면역세포 침윤 분석
투여 시작 후 12일 후인 D19에 모든 마우스의 종양을 채취하여 면역형광염색법(Immunofluorescence staining)과 유세포분석(Flow-cytometry analysis)를 이용하여 종양 내 면역세포 침윤을 분석하였다.
면역형광염색법을 수행하기 위해 채취한 마우스 종양을 1% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)에 고정한 후 20% 수크로스 용액을 이용하여 탈수를 시켰다. OCT(optimal cutting temperature) 화합물에 종양 조직을 넣어 냉동시키고 크리오톰(cryotome)을 사용하여 냉동된 종양 조직을 50 ㎛ 두께로 절단하여 슬라이드에 고정시켰다. 슬라이드에 고정된 종양 조직을 블라킹 용액(blocking solution)으로 1시간 동안 반응시켰다. CD8 항체 및 CD31항체를 1:200으로 희석하여 4℃에서 24시간동안 반응시켰다. 반응시킨 후 PBST 용액으로 세척한 후 형광항체 및 DAPI 용액을 2시간 동안 상온에서 반응시켰다. 마운팅(Mounting)을 진행한 후 공초점 현미경을 이용하여 형광 이미지를 분석하였다.
그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4는 대장암 종양 마우스 모델에서 면역형광염색법을 이용하여 면역항암치료제의 종양 내 면역세포 침윤 효능을 분석한 도이다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 음성대조군인 buffer 시험군에 침윤된 CD8+ T cell 보다 L-pampo 시험군은 종양 내로 월등히 많은 CD8 T 세포(녹색형광)가 침윤됨을 보여주었다. 이는 L-pampo는 종양 내로 많은 CD8 T 세포의 침윤을 유도함으로써 면역세포에 의한 종양 억제 효능을 유도할 수 있음을 보여준다.
유세포분석을 수행하기 위해 채취한 마우스 종양을 잘게 자른 후 콜라겐분해효소(collagenase) D와 DNase I을 처리하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 70 ㎛ 세포 여과기(strainer)로 필터하고, 적혈구를 용해시킨 다음 나일론 메쉬로 다시 필터를 진행하였다. 단일 세포 부양액을 CD16/32 항체로 블라킹을 진행한 후 세포 생존 염료(cell viable dye)로 염색을 시켰다. 형광 염료가 붙은 CD45, CD3, CD8, CD4, Foxp3, 그리고 CD25로 염색한 후 CytoFLEX 유세포 분석기로 측정하였다. 측정된 결과는 FlowJo 소프트웨어를 이용하여 정량적으로 비교 분석하였다.
그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5는 대장암 종양 마우스 모델에서 유세포 분석기를 이용하여 면역항암치료제의 종양 내 면역세포 침윤 효능을 분석한 도이다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 음성대조군인 buffer 시험군에 비해 L-pampo 시험군은 CD8+ T 세포가 종양 내로 많이 침윤되었다. 또한, L-pampo 시험군은 음성대조군과 비교하여 종양 내에 T 세포의 활성을 억제하는 Treg+ 세포가 현저히 낮은 것을 확인하였다. 이를 통해 L-pampo는 종양 내로 많은 CD8+ T 세포가 침윤하고 Treg+ 세포는 억제됨으로써 종양을 사멸시킬 수 있는 면역활성을 유도할 수 있음을 보여준다.
[3-5] 종양 특이적인 세포성 면역 활성 분석
투여 시작 후 12일 후인 D19에 모든 마우스의 비장을 채취하여 ELISPOT 분석을 통해 종양 특이적인 면역 활성을 분석하였다.
종양 특이적인 ELISPOT 분석을 수행하기 위해, 채취한 비장을 세포 여과기(strainer)로 갈은 후 비장세포를 분리하고 죽은 세포를 제거하였다. 마우스 IFN-γ가 코딩된 96 웰 플레이트에 10:1 비율로 비장세포와 MC39 대장암 세포를 같이 혼합하여 배양하였다. 검출 항체(detection antibody)와 상온에서 2시간동안 배양시킨 후 스트렙타비딘(streptavidin)-ALP와 상온에서 1시간동안 배양시켰다. 배양시킨 후 기질 용액을 첨가하여 Spot을 확인하였다. Spot은 Image J software를 사용하여 분석하였다.
그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6은 대장암 종양 마우스 모델에서 ELIPOT 분석을 이용하여 면역항암치료제의 종양 특이적인 세포성 면역반응 유도를 분석한 도이다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 음성대조군인 buffer 시험군에 비해 L-pampo 시험군은 월등히 많은 IFN-γ spot 형성이 유도되었다. 이를 통해 면역항암치료제 L-pampo는 종양 내 투여방법은 종양 특이적인 세포성 면역 반응을 강력하게 유도함을 확인하였다.
[3-6] 대장암 마우스 모델에서의 Abscopal 효능 분석
Abscopal 모델을 구축하기 위해, 7 주령 암컷 C57BL/6 마우스(오리엔트 바이오, 한국)의 오른쪽 측면에 5×104 MC38 마우스 대장암 세포주를 피하주사한 후 4일 뒤에 5×104 MC38 대장암 세포주를 왼쪽 측면에 피하주사하여 양쪽에 종양이 생성되도록 하였다. 상기 [3-2]에서 제조한 180 ㎍/dose의 L-pampo를 오른쪽 측면에 생성된 종양에만 투여하였다. 양쪽에 생성된 종양의 크기를 3일 간격으로 측정하여 종양 억제 효능을 분석하였다.
그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7은 대장암 종양 마우스 모델에서 면역항암치료제의 Abscopal 효능을 분석한 도이다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 음성대조군인 buffer 시험군과 달리 L-pampo 시험군은 면역항암치료제 L-pampo를 투여한 종양(오른쪽 측면)뿐 아니라 투여하지 않은 종양(왼쪽 측면)의 크기도 월등히 감소하였음을 보여주었다. 이로부터 면역항암치료제 L-pampo를 종양에 투여할 경우, L-pampo는 암세포 사멸뿐만 아니라 강력한 종양 특이적인 면역 활성을 유도함으로써 L-pampo를 투여하지 않은 종양도 사멸시킬 수 있음을 확인하였고, 이는 면역항암치료제 L-pampo가 전이된 암세포도 치료할 수 있음을 보여준다.
[실시예 4] 방광암 마우스 모델에서 리포펩타이드와 폴리(I:C)가 포함된 면역항암치료제의 효능 확인
[4-1] 방광암 마우스 모델 제작
7 주령 암컷 C57BL/6 마우스(오리엔트 바이오, 한국)의 오른쪽 측면에 5×105 MB49 마우스 방광암 세포주를 피하 주사하여 마우스에 종양을 생성하였다.
[4-2] 면역항암치료제의 제조 및 투여
Pam3CSK4 100 ㎍과 폴리(I:C) 80 ㎍을 혼합하여 면역항암치료제 L-pampo를 제조하였다. 음성대조군으로 buffer 투여군을 설정하였으며 상기 [4-1]에서 구축한 방광암 마우스 모델의 종양 크기가 약 50 mm3에 도달하였을 때, 180 ㎍/dose의 L-pampo를 종양 내로 3일 간격으로 4회 투여하였다.
[4-3] 종양 억제 효능 분석
모든 실험군의 종양 크기를 3일 간격으로 측정하였다. 종양의 장·단축을 측정하고 [1/2 × 장축의 크기 × (단축의 크기)2]로 종양의 크기를 계산하였다. 계산된 종양의 크기를 통해 면역함암치료제의 종양 억제 효능을 분석하였다.
그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8은 방광암 마우스 모델에서의 면역항암치료제의 종양 억제 효능을 확인한 도이다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 면역항암치료제 L-pampo를 투여한 시험군은 음성대조군인 buffer 시험군에 비해 투여 시작 후 18일 후인 D24에 약 60.3% 종양의 크기가 억제되는 것을 확인됨으로써 면역항암치료제 L-pampo가 방광암의 성장을 강력하게 억제할 수 있음을 확인하였다.
[실시예 5] 췌장암 마우스 모델에서 리포펩타이드와 폴리(I:C)가 포함된 면역항암치료제의 효능 확인
[5-1] 췌장암 마우스 모델 제작
8 주령 암컷 C57BL/6 마우스(오리엔트 바이오, 한국)의 오른쪽 측면에 5×105 KPC 마우스 췌장암 세포주를 피하 주사하여 마우스에 종양을 생성하였다.
[5-2] 면역항암치료제의 제조 및 투여
Pam3CSK4 100 ㎍과 폴리(I:C) 80 ㎍을 혼합하여 면역항암치료제 L-pampo를 제조하였다. 음성대조군으로 buffer 투여군을 설정하였으며 상기 [5-1]에서 구축한 췌장암 마우스 모델의 종양 크기가 약 50 mm3에 도달하였을 때, 180 ㎍/dose의 L-pampo를 종양 내로 3일 간격으로 4회 투여하였다.
[5-3] 종양 억제 효능 분석
모든 실험군의 종양 크기를 3일 간격으로 측정하였다. 종양의 장·단축을 측정하고 [1/2 × 장축의 크기 × (단축의 크기)2]로 종양의 크기를 계산하였다. 계산된 종양의 크기를 통해 면역함암치료제의 종양 억제 효능을 분석하였다.
그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9은 췌장암 마우스 모델에서의 면역항암치료제의 종양 억제 효능을 확인한 도이다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 면역항암치료제 L-pampo를 투여한 시험군은 음성대조군인 buffer 시험군에 비해 투여 시작 후 13일 후인 D21에 약 82.9% 종양 크기의 감소가 확인됨으로써 면역항암치료제 L-pampo가 췌장암의 성장을 강력하게 억제할 수 있음을 확인하였다.
[실시예 6] 대장암 마우스 모델에서 리포펩타이드와 폴리(I:C)가 포함된 면역항암치료제의 면역관문억제제와의 병용 효능 확인
[6-1] 대장암 마우스 모델 제작
8 주령 암컷 C57BL/6 마우스(오리엔트 바이오, 한국)의 오른쪽 측면에 1×105 MC38 마우스 대장암 세포주를 피하 주사하여 마우스에 종양을 생성하였다.
[6-2] L-pampo 면역항암치료제의 제조 및 투여
Pam3CSK4 27.8 ㎍과 폴리(I:C) 22.2 ㎍을 혼합하여 면역항암치료제 L-pampo를 제조하였다. 음성대조군으로 buffer 투여군을 설정하였으며 상기 [6-1]에서 구축한 대장암 마우스 모델의 종양 크기가 약 50 mm3에 도달하였을 때, 50 ㎍/dose의 L-pampo를 종양 내로 3일 간격으로 4회 투여하였다.
[6-3] 면역관문억제제의 투여
면역관문억제제인 mouse PD-1 항체를 BioXCell사에서 구입하였다. 병용대조군으로 mouse PD-1 항체 단독투여군을 설정하였으며 병용투여군은 L-pampo의 종양 내 투여 시 200 ㎍/dose의 mouse PD-1 항체를 복강으로 3일 간격으로 4회 투여하였다.
[6-4] 종양 억제 효능 분석
모든 실험군의 종양 크기를 3일 간격으로 측정하였다. 종양의 장·단축을 측정하고 [1/2 × 장축의 크기 × (단축의 크기)2]로 종양의 크기를 계산하였다. 계산된 종양의 크기를 통해 종양 억제 효능을 분석하였다.
그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10은 대장암 마우스 모델에서의 면역항암치료제의 면역관문억제제와의 병용 효능을 확인한 도이다.
도 10에 나타낸 바와 같이, PD-1 항체를 투여한 시험군은 음성대조군인 buffer 시험군에 비해 투여 시작 후 12일 후인 D19 약 19.2% 종양 크기가 억제됨을 확인하였다. 반면에 면역항암치료제 L-pampo를 투여한 시험군은 D19에 약 60.3% 종양 크기의 감소가 확인됨으로써 면역관문억제제인 PD-1 항체보다 강력한 종양 억제 효과를 보였다. 또한 면역항암치료제 L-pampo와 면역관문억제제 PD-1 항체를 같이 병용 투여한 시험군은 D19에 종양 크기가 약 80.7%가 감소되며 8마리 중 1마리는 종양이 완전소실됨을 확인함으로써 면역항암치료제 L-pampo와 면역관문억제제의 병용 치료는 강력한 항암 효능을 보일 수 있음을 확인하였다.
[실시예 7] 대장암 마우스 모델에서 리포펩타이드와 폴리(I:C)가 포함된 면역항암치료제의 다른 TLR 리간드 또는 사포닌의 병용 효능 확인
[7-1] 대장암 마우스 모델 제작
8 주령 암컷 C57BL/6 마우스(오리엔트 바이오, 한국)의 오른쪽 측면에 1×105 MC38 마우스 대장암 세포주를 피하 주사하여 마우스에 종양을 생성하였다.
[7-2] L-pampo 면역항암치료제의 제조 및 투여
Pam3CSK4 25 ㎍과 폴리(I:C) 20 ㎍을 혼합하여 면역항암치료제 L-pampo를 제조하였다. 음성대조군으로 buffer 투여군을 설정하였으며 상기 [7-1]에서 구축한 대장암 마우스 모델의 종양 크기가 약 50 mm3에 도달하였을 때, 45 ㎍/dose의 L-pampo를 종양 내로 3일 간격으로 4회 투여하였다.
[7-3] L-pampo 면역항암치료제의 병용 투여 물질 제조 및 투여
상기 [7-2]에서 제조한 45 ㎍/dose의 L-pampo 면역항암치료제와 QS21(Creative biolabs) 10㎍/dose 또는 Imiquimod(Invivogen) 10㎍/dose을 각각 vortex로 혼합하여 병용 투여 물질을 제조하였다. 이를 종양 내로 3일 간격으로 4회 투여하였다.
[7-4] 종양 억제 효능 분석
모든 실험군의 종양 크기를 3일 간격으로 측정하였다. 종양의 장·단축을 측정하고 [1/2 × 장축의 크기 × (단축의 크기)2]로 종양의 크기를 계산하였다. 계산된 종양의 크기를 통해 종양 억제 효능을 분석하였다.
그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11은 대장암 마우스 모델에서 면역항암치료제의 다른 TLR 리간드 또는 사포닌과의 병용 효능을 확인한 도이다.
도 11a에 나타낸 바와 같이, 다른 TLR 리간드인 imiquimod (TLR 7 리간드)를 투여한 시험군은 음성대조군인 buffer 시험군에 비해 투여 시작 후 12일 후인 D20에 약 39%의 종양 크기가 억제됨을 확인하였다. 또한 사포닌인 QS-21을 투여한 시험군은 D20에 약 57%의 종양 크기가 억제됨을 확인하였다. 반면에 L-pampo를 투여한 시험군은 D20에 약 78% 종양 크기의 감소가 확인됨으로써 단독 투여군 중 가장 강력한 종양 성장 억제 효과를 보였다. 면역항암치료제 L-pampo와 imiquimod, 또는 QS-21을 각각 병용 투여한 모든 실험군에서 D20에 종양 크기가 약 84% 이상 감소되었음을 확인하였다. 또한, 도 11b에 나타낸 바와 같이, D20에 각 시험군의 종양 무게를 측정한 결과에서도 종양 크기 억제와 유사한 경향성을 확인하였다 따라서 면역항암치료제 L-pampo와 다른 TLR 리간드 또는 사포닌과의 병용 치료는 시너지 효과를 보이며 강력한 항암 효능을 보일 수 있음을 확인하였다.

Claims (20)

  1. 리포펩타이드 및 폴리(I:C)를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물은 T세포 면역반응 활성화를 통해 암을 예방 또는 치료하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 리포펩타이드는,
    Pam3Cys-SKKKK, PHC-SKKKK, Ole2PamCys-SKKKK, Pam2Cys-SKKKK, PamCys(Pam)-SKKKK, Ole2Cys-SKKKK, Myr2Cys-SKKKK, PamDhc-SKKKK, PamCSKKKK 및 Dhc-SKKKK로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 리포펩타이드 및 폴리(I:C)는 0.1 내지 10 : 1의 중량비인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물은 수용액 제형인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  6. 리포펩타이드 및 폴리(I:C)를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을, 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체에서 암에 대한 면역 반응을 생성하는 방법.
  7. 리포펩타이드 및 폴리(I:C) 및
    면역관문억제제를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약제학적 병용제제.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 면역관문억제제는,
    항-CTLA4 항체, 항-PD-L1 항체 및 항-PD-1 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 병용제제.
  9. 리포펩타이드 및 폴리(I:C) 및
    TLR(Toll-like receptor) 리간드를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 병용제제.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 TLR(Toll-like receptor) 리간드는 TLR 1 내지 13으로부터 선택되는 하나 이상의 리간드인 것을 특징으로 하는 병용제제.
  11. 리포펩타이드 및 폴리(I:C) 및
    사포닌을 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 병용제제.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 사포닌은 QS21, Quil A, QS7, QS17 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 병용제제.
  13. 리포펩타이드 및 폴리(I:C)를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암을 예방 또는 치료하는 방법.
  14. 리포펩타이드, 폴리(I:C) 및 면역관문억제제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암을 예방 또는 치료하는 방법.
  15. 리포펩타이드, 폴리(I:C) 및 TLR(Toll-like receptor) 리간드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암을 예방 또는 치료하는 방법.
  16. 리포펩타이드, 폴리(I:C) 및 사포닌을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암을 예방 또는 치료하는 방법.
  17. 암의 예방, 개선 또는 치료를 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 리포펩타이드 및 폴리(I:C)의 용도.
  18. 암의 예방, 개선 또는 치료를 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 리포펩타이드, 폴리(I:C) 및 면역관문억제제의 용도.
  19. 암의 예방, 개선 또는 치료를 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 리포펩타이드, 폴리(I:C) 및 TLR(Toll-like receptor) 리간드의 용도.
  20. 암의 예방, 개선 또는 치료를 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 리포펩타이드, 폴리(I:C) 및 사포닌의 용도.
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