KR101501583B1 - 리포펩티드 및 폴리(ｉ:ｃ)를 포함하는 아쥬반트 및 이를 이용한 개선된 제형의 백신 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 리포펩티드 및 폴리(I:C)를 포함하는 수용액 제형의 백신 아쥬반트에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명의 리포펩티드 및 폴리(I:C)를 포함하는 수용액 제형의 백신 아쥬반트는 기존의 오일 에멀전 제형과 동일한 효과를 보이고, 상기 아쥬반트에서 리포펩티드 및 폴리(I:C)의 최적의 효과를 위한 조성비를 확립하였으며, 본 발명의 아쥬반트를 포함하는 백신 조성물이 투여부위에 데포를 형성하여 지속적으로 면역원성을 유지하고, 상기 백신 조성물이 HIV 및 인플루엔자(influenza) 항원을 이용하였을 때에도 유의적인 효과가 있음을 확인함으로써, 본 발명의 아쥬반트가 기존의 오일 에멀전 제형이 갖고 있는 단점을 보완하여 상업적으로도 보다 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

Description

리포펩티드 및 폴리(Ｉ:Ｃ)를 포함하는 아쥬반트 및 이를 이용한 개선된 제형의 백신 조성물{An adjuvant comprising lipopeptide and poly(I:C), and improved form of vaccine composition using thereof}

본 발명은 리포펩티드 및 폴리(I:C)를 포함하는 아쥬반트(adjuvant) 및 이를 이용한 개선된 제형의 백신 조성물에 관한 것이다.

현재 다양한 종양성 질환 및 감염 질환에 대한 새로운 백신들이 지속적으로 개발되고 있다. 약독화된 병원균 또는 복제를 하지 않는 비활성화된 병원균을 이용했던 예전의 백신과는 대조적으로 요즘의 백신은 합성, 재조합, 또는 정제된 소단위 항원으로 이루어진다.

백신 조성물은 현재 미생물을 감쇄시키거나 사망시키는 효능을 가진 병원성 미생물, 약화된 미생물, 불활성화된 미생물, 이들 미생물로부터 정제된 분절 및 유전자 재조합에 의해 생성시킨 병원균의 단백질 아단위(subunit) 또는 그의 조합이 백신 제제에 적합하게 제조되어 사용될 수 있다. 불활성화된 미생물 또는 정제된 단백질 아단위를 백신 접종용 항원으로서 사용하는 경우, 이런 항원에 의한 면역성의 유발이 미흡하고, 따라서 면역반응을 향상시키기 위한 보조물질 즉, 아쥬반트(adjuvant)가 첨가되어야 한다.

아쥬반트는 일반적으로 백신 항원과 조합되었을 때, 항원만에 의해 유도된 반응에 비해 백신 항원에 대한 면역반응을 증가시키는 임의의 화합물이다. 아쥬반트는 체액성 면역반응 및 세포성 면역반응 또는 이들 두 가지의 수위를 증가시키는 기능을 하면서, 다른 한편으로는 이들 반응을 지속시키는 기능을 한다.

아쥬반트의 상업적 유용성은 제형의 특성에 의해 결정되며, 수산화 알루미늄이나 카보폴을 함유한 백신이 물을 기반으로 하는 현탁액인 반면, 오일 아쥬반트를 함유한 백신은 유체와 혼합한 에멀젼으로 제조된다. 일반적으로 백신 조성물에 사용되는 유화액은 오일, 수용액 및 계면활성제의 혼합물을 포함하며, 일부 에멀젼은 친유성 계면활성제 및 친수성 계면활성제를 혼입하여 제조하거나, 이온성 계면활성제로서 알려진 레시틴(lecithin) 또는 사포닌(saponin)을 함유할 수 있다.

아쥬반트로서 오일 에멀젼은 제형의 형태가 어떠한 것이라 할지라도 주로 주사에 의해 투여된다. 오일 에멀전이 주사 가능하기 위해서 제형은 충분한 유동성을 가져야하지만, 특히 오일 에멀젼의 한 종류인 유중수적형(water-in-oil; W/O) 에멀젼은 주사투여가 어려울 정도로 점성이 높다. 또한, 대사가능한 오일 중 합성, 반합성 및 식물성 오일들은 실온에서 점도가 높고, 유중수적형 에멀젼에 이용되었을 때 에멀젼은 오일 자체의 점도와 유사한 점도를 갖는다. 그리고, 물 함량의 감소 즉, 오일 함량의 증가는 종종 주사투여가 불가능할 정도까지 유화액의 점도를 증가시키며, 상호계면의 면적을 증가시켜 유화액의 안정성에 영향을 미친다.

한편, 상업적 유용성의 관점에서 저장 또는 수송 동안에 아쥬반트로서 사용되는 에멀젼의 안정성은 매우 중요하게 고려되어야 하며, 또한 주사 투여가 가능할 정도의 충분한 유동성을 유지할 필요가 있다. 일반적으로 에멀젼의 불안정성은 유상과 수상의 상분리, 침강 또는 응집 등의 현상으로 나타난다. 이는 백신 조성물에서 유상과 수상의 비중이 다르거나 대부분 분산상의 액적의 크기가 크거나 불균일하기 때문에 발생한다. 이러한 불안정성은 조성물이 농축 면역원, 특히 비-정제된 농축 면역원을 함유하고 있는 경우에 주로 발생하며, 사멸된 불활화 백신에 사용되는 아쥬반트의 경우 및 면역원이 동일한 부피의 희석제 내에서 더욱 잘 농축되기 때문에 다가 백신 조성물의 경우에 더욱 잘 발생한다. 이러한 불안정성을 극복하기 위해, 또는 주사 부위에서의 부작용을 감소시키기 위해 에멀젼 내의 계면활성제 및 기타 성분을 감소시킬 수 있으나, 이러한 감소는 백신 조성물의 안정성 감소를 유발할 수 있다. 또한, 오일 에멀젼 제형의 경우 제조 단가가 더 높다는 점에서 산업적 유용성이 수용액 제형보다 낮고, 주사제로 사용할 경우 투여 부위에 통증이 있을 수 있는 부작용이 있다. 따라서 주사 투여가 가능하고 충분한 유동성을 가지면서 장기간 안정성을 가진 아쥬반트 및 상기 아쥬반트를 함유하는 백신 조성물에 대한 연구가 계속되고 있다.

적합한 양질의 항체 형성은 예방목적 또는 치료목적의 강력한 백신을 만드는데 중요한 요소이다. 예를 들면, 종양을 제거하는 데 있어 IgG 이소타입들은 서로 다른 효력을 나타내는데 그 중 IgG2a는 IgG1, IgG2b 또는 IgG3에 비하여 가장 효과적이다(Nimmerjahn, F., and J. V. Ravetch. 2005. Divergent immunoglobulin G subclass activity through selective Fc receptor binding. Science 310: 1510-1512). 또한, 항바이러스 면역에는 IgG2a와 IgG2b가 가장 효과적인 것으로 알려져 있는데(J.-P. Coutelier et al., 1987. Ig G2a restriction of murine antibodies elicited by viral infections. J. Exp. Med. 165: 64-69., Markine-Gorianoff, D. and J.-P. Coutelier. 2002. Increased efficacy of the immunoglobulin G2a subclass in antibody-mediated protection against lactate dehydrogenase-elevating virus-induced polioencephalomyelitis revealed with switch mutants. J. of Virol 76: 432-435) 이들은 도움 T 세포 1(Th1 세포)이 생산하는 사이토카인의 영향으로 생성된다. 그러므로 본 발명에서 강력한 백신 조성물은 생산되는 항원특이적 항체의 양과 IgG2a/IgG1 및 IgG2b/IgG1의 비율에 의하여 판단된다.

항원의 분자패턴은 면역반응의 결과에 영향을 준다. 이는 특히 병원성 미생물 전체가 항원으로 사용될 경우 중요한데 이러한 항원은 리포폴리사카라이드, 핵산, 지질단백질 또는 단백질과 같은 여러 종류의 PAMP(pathogen associated molecular pattern) 리간드가 섞여있게 된다. 항원제시 세포(antigen presenting cell) 표면에 있는 PRR(pathogen recognition receptor)은 PAMP을 인지하여 다양한 공동자극 분자와 사이토카인을 유도하기 위한 신호를 일으켜서 어떠한 면역반응이 유도되는지에 영향을 주게 된다. 예를 들면, 인터페론 감마와 IL-12는 바이러스 감염에 대한 면역반응에 중요한 Th1 세포 반응을 유도하게 된다. Th1 타입 면역반응은 더 많은 IgG2a 또는 IgG2b 생성과 강력한 세포성 면역반응으로 나타난다. 그러므로 본 발명에서 좋은 아쥬반트의 기준은 강력한 항체반응을 유도하고, 면역글로불린 클래스를 변경하여 IgG2a 및 IgG2b를 생산하는 것이다.

이에 본 발명자들은 기존에 알려진 오일 에멀젼 형태의 백신 조성물의 문제점을 극복하고 상업적으로 유용성을 갖도록 하기 위해 노력한 결과, 리포펩티드와 폴리(I:C)의 복합 아쥬반트를 수용액 제형으로 조제한 후, 상기 조제된 아쥬반트가 기존에 알려진 오일 에멀젼 형태와 효과가 동일하고, 수용액 제형일 경우에 최대 효과를 나타낼 수 있는 리포펩티드 및 폴리(I:C)의 최적의 조성비율을 확인하였으며, 상기 백신이 투여되었을 때 투여부위에 데포를 형성함으로써 지속적으로 면역원성을 유지할 수 있음을 확인하였다. 또한, 본 발명의 아쥬반트를 포함하는 백신 조성물이 HBV 바이러스의 전체 표면항원뿐 아니라 HIV 및 인플루엔자(influenza) 항원을 이용하였을 때에도 유의적인 효과를 보임을 확인함으로써 본 발명의 리포펩티드 및 폴리(I:C) 복합 아쥬반트의 수용액 제형이 상업적으로 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 리포펩티드 및 폴리(I:C)를 포함하는 수용액 제형의 백신 아쥬반트, 이를 포함하는 백신 조성물 및 이의 용도를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 리포펩티드 및 폴리(I:C)를 포함하는 수용액 제형의 백신 아쥬반트를 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 아쥬반트 및 항원을 포함하는 백신 조성물을 제공한다.

아울러, 본 발명은 본 발명의 백신 조성물을 유효성분으로 함유하는 바이러스 감염 및 암의 예방 및 치료제를 제공한다.

본 발명의 리포펩티드 및 폴리(I:C)를 포함하는 수용액 제형의 백신 아쥬반트는 기존의 오일 에멀전 제형과 동일한 효과를 보이고, 상기 아쥬반트에서 리포펩티드 및 폴리(I:C)의 최적의 효과를 위한 조성비를 확립하였으며, 본 발명의 아쥬반트를 포함하는 백신 조성물이 투여부위에 데포를 형성하여 지속적으로 면역원성을 유지하고, 상기 백신 조성물이 HIV 및 인플루엔자(influenza) 항원을 이용하였을 때에도 유의적인 효과가 있음을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 아쥬반트가 기존의 오일 에멀전 제형이 갖고 있는 단점을 보완하여 상업적으로도 보다 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 B형 간염 전체 표면항원인 L-HBsAg 및 아쥬반트로 제조된 시험백신의 항체가 및 상기 유도된 항원 특이적 항체의 이소타입을 확인한 도이다:
A: L-HBsAg 항원에 대한 항체가 분석,
B: 유도된 항원 특이적 항체의 이소타입 분석,
G1: L-HBsAg를 수산화 알루미늄에 흡착한 시험백신(대조군),
G2: L-HBsAg를 Pam3Cys-SKKKK 및 폴리(I:C)와 혼합한 후 오일 에멀젼 제형으로 제조한 시험백신,
G3: L-HBsAg를 수산화 알루미늄에 흡착한 후 Pam3Cys-SKKKK 및 폴리(I:C)와 혼합하여 수용액 제형으로 제조한 시험백신, 및
G4: L-HBsAg를 Pam3Cys-SKKKK 및 폴리(I:C)와 혼합한 후 수용액 제형으로 제조한 시험백신.
도 2는 항원과 복합체를 형성하는 Pam3Cys-SKKKK 및 폴리(I:C)의 최적 조성비율을 은 염색법(silver staining)을 통하여 확인한 도이다:
A: 항원 및 폴리(I:C)를 25 ㎍/㎖ 및 100 ㎍/㎖으로 각각 고정하고 Pam3Cys-SKKKK의 양을 변화시켜 복합체 형성 확인(1: 100 ㎍/㎖의 Pam3Cys-SKKKK를 사용한 경우의 상층액, 2: 100 ㎍/㎖의 Pam3Cys-SKKKK를 사용한 경우의 침전물, 3: 125 ㎍/㎖의 Pam3Cys-SKKKK를 사용한 경우의 상층액, 4: 125 ㎍/㎖의 Pam3Cys-SKKKK를 사용한 경우의 침전물, 5: 150 ㎍/㎖의 Pam3Cys-SKKKK를 사용한 경우의 상층액, 6: 150 ㎍/㎖의 Pam3Cys-SKKKK를 사용한 경우의 침전물, 7: 175 ㎍/㎖의 Pam3Cys-SKKKK를 사용한 경우의 상층액, 8: 175 ㎍/㎖의 Pam3Cys-SKKKK를 사용한 경우의 침전물, 9: 200 ㎍/㎖의 Pam3Cys-SKKKK를 사용한 경우의 상층액, 10: 200 ㎍/㎖의 Pam3Cys-SKKKK를 사용한 경우의 침전물), 및
B: 항원을 100 ㎍/㎖으로 고정하고 Pam3Cys-SKKKK 및 폴리(I:C)의 양을 변화시켜 복합체 형성 확인(1: 25 ㎍/㎖의 Pam3Cys-SKKKK 및 20 ㎍/㎖의 폴리(I:C)를 사용한 경우의 상층액, 2: 25 ㎍/㎖의 Pam3Cys-SKKKK 및 20 ㎍/㎖의 폴리(I:C)를 사용한 경우의 침전물, 3: 75 ㎍/㎖의 Pam3Cys-SKKKK 및 50 ㎍/㎖의 폴리(I:C)를 사용한 경우의 상층액, 4: 75 ㎍/㎖의 Pam3Cys-SKKKK 및 50 ㎍/㎖의 폴리(I:C)를 사용한 경우의 침전물, 5: 125 ㎍/㎖의 Pam3Cys-SKKKK 및 100 ㎍/㎖의 폴리(I:C)를 사용한 경우의 상층액, 6: 125 ㎍/㎖의 Pam3Cys-SKKKK 및 100 ㎍/㎖의 폴리(I:C)를 사용한 경우의 침전물, 7: 312.5 ㎍/㎖의 Pam3Cys-SKKKK 및 250 ㎍/㎖의 폴리(I:C)를 사용한 경우의 상층액, 8: 312.5 ㎍/㎖의 Pam3Cys-SKKKK 및 250 ㎍/㎖의 폴리(I:C)를 사용한 경우의 침전물, 9: 500 ㎍/㎖의 Pam3Cys-SKKKK 및 400 ㎍/㎖의 폴리(I:C)를 사용한 경우의 상층액, 10: 500 ㎍/㎖의 Pam3Cys-SKKKK 및 400 ㎍/㎖의 폴리(I:C)를 사용한 경우의 침전물).
도 3은 본 발명의 백신 조성물이 생체 내에서 데포(depot)를 형성하는지 확인한 도이다:
시험군 1: L-HBsAg 항원만을 투여한 경우, 및
시험군 5: L-HBsAg 항원, 및 Pam3Cys-SKKKK 및 폴리(I:C) 아쥬반트로 구성된 시험백신을 투여한 경우.
도 4는 HIV 항원 또는 인플루엔자(influenza) 항원과 Pam3Cys-SKKKK 및 폴리(I:C) 아쥬반트로 제조된 시험백신의 항체가를 확인한 도이다.
A: HIV 항원을 이용하여 제조한 시험백신의 항체가(G1: 음성대조군, G2: HIV 항원 및 수산화 알루미늄을 포함한 시험백신, G3: HIV 항원 및 불완전 프라우트 아쥬반트(incomplete freund adjuvant)를 포함한 시험백신, G4: HIV 항원, Pam3Cys-SKKKK 및 폴리(I:C)를 포함한 시험백신), 및
B: 인플루엔자 항원을 이용하여 제조한 시험백신의 항체가(Flu: 인플루엔자 항원만 투여한 음성대조군, Flu+alum: 인플루엔자 항원 및 수산화 알루미늄을 포함한 시험백신, Flu+L-pampo: 인플루엔자 항원, Pam3Cys-SKKKK 및 폴리(I:C)를 포함한 시험백신).

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 리포펩티드 및 폴리(I:C)의 조성비를 1:1 내지 2:1로 포함하는 수용액 제형의 백신 아쥬반트를 제공한다.

상기 리포펩티드는 박테리아와 마이코플라즈마에서 유래한 리포펩티드의 합성유사체(synthetic analogue)로 J. Metzger 등에 의해 처음 합성되었다(Metzger, J. et al., 1991, Synthesis of novel immunologically active tripalmitoyl-S-glycerylcysteinyl lipopeptides as useful intermediates for immunogen preparations. Int. J. Peptide Protein Res. 37: 46-57). 하기 화학식 (1)의 분자구조는 N-palmitoyl-S-[2,3-bis(palmitoyloxy)-(2RS)-propyl]-[R]-cystein-SKKKK (pam3Cys-SKKKK)이며, 다양한 유사체들이 합성되었다(EMC microcollections GmbH Sindelfinger Str. 3 72070 Tubingen, Germany).

H. Schild 등에 따르면 Pam3Cys-Ser-Ser을 인플루엔자 바이러스 T 세포 에피토프와 결합시켜 마우스에 투여한 경우 바이러스 특이적인 세포독성 T 세포(cytotoxic T lymphocyte, CTL)가 유도되었다(Schild, H. et al., 1991, Efficiency of peptides and lipopeptides for in vivo priming of virus-specific cytotoxic T cells Eur. J. Immunol. 21: 2649-2654.). 본 발명에서도 Pam3Cys-SKKKK가 기존 아쥬반트인 수산화 알루미늄보다 HBV 표면항원의 면역원성을 보다 효과적으로 증가시켰다. 일반적으로 리포펩티드는 TLR2에 대한 리간드로 알려져 있다(Trinchieri, G. and A. Sher. 2007. Cooperation of Toll-like receptor signals in innate immune defence. Nat. Rev. Immunol 7: 179-190).

또한, 리포펩티드의 사용은 Pam3Cys-SKKKK에 한정되지 않으며, 리포펩티드는 글리세롤 분자에 결합된 지방산과 여러 아미노산으로 구성될 수 있다. 그 예로 PHC-SKKKK, Ole2PamCys-SKKKK, Pam2Cys-SKKKK, PamCys(Pam)-SKKKK, Ole2Cys-SKKKK, Myr2Cys-SKKKK, PamDhc-SKKKK, PamCSKKKK, Dhc-SKKKK 등이 포함된다. 분자 내에 지방산의 숫자는 한 개이거나 그 이상 일 수 있다. 리포펩티드에 아미노산의 수는 하나이거나 그 이상일 수 있다. 또한 지방산과 아미노산은 화학적으로 변형될 수 있다. 또한 리포펩티드는 그람 양성이나 그람 음성인 박테리아나 마이코플라즈마로부터 유래한 분자 일부이거나 분자 전체 형태로 된 지질 단백질일 수 있다.

또한, 상기 폴리(I:C)는 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo) 연구에서 타입1 인터페론의 강력한 유도체로 사용되어왔다(Magee, M. E. and M. J. Griffith. 1972. The liver as a site for interferon production in response to poly I: poly C. life Science II, 11: 1081-1086, Manetti, YR., F. Annunziato, L. Tomasevic, V, Gianno, P. Parronchi, S. Romagnani and E. Maggi. 1995. poly inosinic acid: polycytidylic acid promotes T helper type 1-specific immune responses bu stimulating macrophage production of interferon-alpha and interleukin-12. Eur. J. Immunol. 25: 2656-2660). 더욱이 폴리(I:C)는 포유류에서 가장 강력한 항원 제시 세포인 수지상세포(dendritic cell)를 안정적이고 성숙하게 형성하는 것으로 알려졌다(Rous, R. et al 2004. poly(I:C) used for human dendritic cell maturationpreserves their ability to secondarily secrete bioactive Il-12, International Immunol. 16: 767-773). 이러한 기존보고에 따르면 폴리(I:C)는 강력한 IL-12 유도물질이며, IL-12는 면역반응을 Th1이 발달하도록 추진하여 세포성 면역반응과 IgG2a 또는 IgG2b항체 형성을 유도하는 중요한 사이토카인이다. 또한 폴리(I:C)는 펩티드 항원에 대한 강력한 아쥬반트 활성을 갖는 것으로 알려졌다 (Cui, Z. and F. Qui. 2005. Synthetic double stranded RNA poly I:C as a potent peptide vaccine adjuvant: Therapeutic activity against human cervical cancer in a rodent model. Cancer Immunol. Immunotherapy 16: 1-13). 폴리(I:C)는 그 길이가 본 발명의 바람직한 실시예에 의하면 50 내지 5,000 bp인 것이 가장 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

상기 리포펩티드 및 폴리(I:C)의 조성비는 1:1 내지 2:1일 수 있고, 1:1 미만인 경우 제조된 시험백신에서 복합체를 형성하지 못하는 자유(free) 항원 및 폴리(I:C)가 생성되는 문제점이 있으며, 2:1을 초과하는 경우 자유 리포펩티드가 생성되고, 복합체의 크기가 너무 커진다는 문제점이 있다. 더욱 바람직하게 상기 리포펩티드 및 폴리(I:C)의 조성비는 1.25:1 내지 2:1이고, 본 발명의 바람직한 실시예에 의하면 1.25:1인 것이 가장 바람직하다. 또한, 상기 아쥬반트에서 리포펩티드는 0.01 내지 0.5 중량%의 중량비로 포함되는 것이 바람직하나, 0.01 내지 0.1 중량%의 중량비로 포함되는 것이 가장 바람직하고, 폴리(I:C)는 0.01 내지 0.4 중량%의 중량비로 포함되는 것이 바람직하며 0.01 내지 0.08 중량%의 중량비로 포함되는 것이 가장 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

본 발명은 본 발명의 아쥬반트 및 항원을 포함하는 수용액 제형의 백신 조성물을 제공한다.

본 발명의 강력한 백신 조성물은 항원, 및 합성 리포펩티드(synthetic lipopeptide) 및 폴리(I:C)의 수용액 제형을 구성요소로 포함한다.

상기 항원은 숙주의 체내에 들어왔을 때, 숙주의 면역계에 의해 인식되어 면역반응을 일으킬 수 있는 모든 물질을 포함하고, 이는 병원체의 단백질, 재조합 단백질, 당단백질, 펩티드, 다당류, 지질다당류 또는 폴리뉴클레오티드인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

하기 항원 목록은 실시예의 수단으로 제공될 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다: 인플루엔자 바이러스(influenza virus) 항원(haemagglutinin 및 neuraminidase 항원), 백일해균(Bordetella pertussis) 항원(pertussis toxin, filamentous haemagglutinin, pertactin), 인간 파필로마 바이러스(human papilloma virus, HPV) 항원, 헬리코박터파이로리(Helicobacterpylori) 항원(capsula polysaccharides of serogrup A, B, C, Y 및 W-135), 파상풍균 항원(tetanus toxoid), 디프테리아균(diphtheria) 항원(diphtheria toxoid), 폐렴균(pneumococcal) 항원(Streptococcus pnemoniae type 3 capsular polysaccharide), 결핵균(tuberculosis) 항원, 인간 면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus, HIV) 항원(GP-120, GP-160), 콜레라(cholera) 항원(cholera toxin B subunit), 포도상구균(staphylococcal) 항원(staphylococcal enterotoxin B), 적리균(shigella) 항원(shigella polysaccharides), 소수포성 입안염 바이러스(vesicular stomatitis virus) 항원(vesicular stomatitis virus glycoprotein), 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus, CMV) 항원, 간염바이러스(hepatitis) 항원(hepatitis A(HAV), B(HBV), C(HCV), D(HDV) 및 G(HGV) 항원), 호흡기 다핵체 바이러스(respiratory synctytial virus, RSV) 항원, 허피스 심플렉스(herpes simplex) 항원 또는 그의 조합(예를 들면, 디프테리아, 백일해균 및 파생풍균, DPT).

상기 백신 조성물은 부가적으로 완충제, 등장화제, 보존제, 안정화제 및 용해보조제를 포함할 수 있으나 이에 한정하지 않는다. 상기 조성물을 포함하는 전체 백신 조성물의 조성비에 있어서, 리포펩티드 및 폴리(I:C) 아쥬반트에서 리포펩티드는 0.01 내지 0.5 중량%의 중량비로 포함되는 것이 바람직하나, 0.01 내지 0.1 중량%의 중량비로 포함되는 것이 가장 바람직하고, 폴리(I:C)는 0.01 내지 0.4 중량%의 중량비로 포함되는 것이 바람직하며 0.01 내지 0.08 중량%의 중량비로 포함되는 것이 가장 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 아울러, 등장화제로는 염화나트륨이 0.1 내지 0.8 중량%의 중량비로 포함되는 것이 바람직하고, 0.2 내지 0.6 중량%의 중량비로 포함되는 것이 더욱 바람직하며, 본 발명의 바람직한 실시예에 의하면 0.44 중량%의 중량비로 포함되는 것이 가장 바람직하다. 또한, 완충제로는 인산염, 초산염, 인산암모늄, 탄산암모늄, 구연산염 등이 사용되는 것이 바람직하고, 본 발명의 바람직한 실시에에 의하면 인산염 및 초산염이 사용되는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 상기 인산염은 0.01 내지 0.4 중량%의 중량비로 포함되는 것이 바람직하고, 0.01 내지 0.2 중량%의 중량비로 포함되는 것이 더욱 바람직하나, 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면 0.13 중량%의 중량비로 포함되는 것이 가장 바람직하다. 또한, 상기 초산염은 0.01 내지 0.3 중량 %의 중량비로 포함되는 것이 바람직하고, 0.01 내지 0.2 중량%의 중량비로 포함되는 것이 더욱 바람직하나, 본 발명의 바람직한 실시에에 따르면 0.08 중량%의 중량비로 포함되는 것이 가장 바람직하다. 따라서, 본 발명의 백신 조성물에 완충제는 0.02 내지 0.6 중량%의 중량비로 포함되는 것이 바람직하나, 본 발명의 바람직한 실시예에 의하면 0.15 내지 0.25 중량%의 중량비로 포함되는 것이 가장 바람직하다.

상기 백신은 Th1 면역반응을 증진시키는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. Th1 면역반응을 증진시키는 IgG1a 또는 IgG2b의 항체는 항바이러스 및 항암 면역반응에 가장 효과적이고, 도움 T 세포 1(helper T cell 1; Th1)에 의해서 생산되는 사이토카인의 영향으로 생산된다. 본 발명의 백신 조성물은 리포펩티드 및 폴리(I:C)를 아쥬반트로 사용하여 면역반응이 Th1 반응쪽으로 치우쳐져서 상기 IgG2b를 형성시키므로 바이러스 감염 및 암의 예방 및 치료제로 사용할 수 있다. 또한, 상기 백신은 투여부위에 데포(depot)를 형성하여 지속적인 면역원성을 유지할 수 있고, 전신적인 면역반응을 급작스럽게 유도하지 않는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

또한, 본 발명은 백신 조성물을 유효성분으로 함유하는 바이러스 감염 또는 암의 예방 및 치료제를 제공한다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, 본 발명자들은 기존의 오일 에멀젼 제형 및 본 발명의 수용액 제형의 백신 아쥬반트를 혼합하여 제조된 시험백신의 항체가 및 상기 시험백신으로 유도된 항원 특이적 항체의 이소타입(isotype)을 분석한 결과, 제형에 따른 시험백신의 항체가 및 이로부터 유도되는 항원 특이적 항체 이소타입은 두 제형에서 동일하게 나타났다(도 1 참조). 아울러, 상기 유도된 항원 특이적 항체 이소타입은 IgG2b로 상기 시험백신이 투여되었을 때, 면역반응을 Th1 쪽으로 전환할 수 있음을 확인하였다.

또한, 본 발명의 아쥬반트의 최적 조성비를 확인하기 위하여 다양한 조성비로 시험백신을 제조하여 복합체를 형성하지 않은 항원, Pam3Cys-SKKKK 및 폴리(I:C)의 양을 확인한 결과, Pam3Cys-SKKKK 및 폴리(I:C)의 비율이 1.25:1 내지 2:1인 것이 적절함을 확인하였다(도 2 참조).

또한, 본 발명의 아쥬반트를 혼합하여 제조된 시험백신이 투여시 생체 내에서 어떻게 흡수되는지 확인한 결과, 투여부위에 데포(depot)를 형성하고, 투여 36일 후까지 투여부위에 일부 남아있어 지속적인 면역원성을 유지할 수 있고, 전신적인 면역반응을 급작스럽게 유도하지 않으므로 효능 및 안정성에서 우수함을 확인하였다(도 3 참조).

또한, 본 발명의 아쥬반트가 HIV 및 인플루엔자(influenza) 항원을 사용하여 제조되었을 때에도 효과를 나타내는지 확인한 결과, 상기 아쥬반트를 혼합한 시험백신의 경우 기존에 사용되고 있는 백신 조성물과 비교하여, HIV 항원의 경우 항체가가 3 내지 10배 이상, 인플루엔자 항원의 경우 10배 내지 100 이상 높게 유도됨을 확인하였다(도 4 참조).

따라서, 본 발명의 리포펩티드 및 폴리(I:C) 수용액 제형을 아쥬반트로 포함하는 강력한 백신 조성물은 기존의 오일 에멀전 제형이 갖고 있는 단점을 보완하여 상업적으로도 보다 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 백신 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있고, 인체 또는 수의용으로 제형화되어 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여 경로는 경구, 복강, 정맥, 근육, 피하, 피내 등의 경로로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 주사제로 제형화하여 투여하는 것이다. 주사제는 생리식염액, 링겔액 등의 수성 용제, 식물유, 고급 지방산 에스텔(예, 올레인산에칠 등), 알코올류(예, 에탄올, 벤질알코욜, 프로필렌글리콘, 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제(예, 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, 피로아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제(예, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등) 등의 약제학적 담체를 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물을 약제학적 유효량으로 투여한다. 용어 "약제학적 유효량"이란 백신효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용이나 심각한 또는 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 정확한 투여 농도는 투여될 항원에 따라 달라지며, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법 등 의학분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있으며, 1회 내지 수회 투여가능하다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해서 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해서 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 백신의 오일 에멀젼 ( oil emersion ) 제형과 수용액 제형의 효과 비교

<1-1> 시험 백신의 제조 및 투여

백신의 오일 에멀젼 제형과 수용액 제형의 효과를 비교하기 위하여 기출원된 특허출원 제 2007-0010167호에서 기술된 B형 간염 바이러스 전체 표면 항원(L-HBsAg) 및 하기 아쥬반트(adjuvant)를 혼합하여 시험백신을 제조하였다.

구체적으로, 오일 에멀젼 제형의 시험 백신은 대두유 24 ㎕, 글리세롤 16 ㎕ 및 레시틴(lecithin) 2.4 ㎎을 넣고 잘 섞어준 후, 상기 혼합물에 전체 표면 항원 L-HBsAg 0.5 ㎍ 및 Pam3Cys-SKKKK 및 폴리(I:C)를 20 ㎍ 씩 순서대로 첨가하고, 5초씩 2분간 초음파처리(sonication)하여 에멀젼 제형의 시험백신을 균질하게 만들어 주었다(시험군 2). 또한, 수용액 제형의 시험 백신은 전체 표면 항원 L-HBsAg 0.5 ㎍에 폴리(I:C) 20 ㎍을 첨가하여 잘 섞어준 후, 상기 혼합물에 Pam3Cys-SKKKK 20 ㎍(혹은 25 ㎍)을 첨가한 후, 볼텍싱(vortexing) 및 교반기(rotator)로 충분히 섞어주었다. 이때, 동량의 항원, Pam3Cys-SKKKK 및 폴리(I:C)를 혼합하거나(시험군 4), 항원을 수산화 알루미늄(알룸)에 흡착한 뒤 이를 Pam3Cys-SKKKK 및 폴리(I:C)와 혼합(시험군 3)하여 제조하였다. 대조군으로는 항원을 수산화 알루미늄(알룸)에 흡착하여 시험 백신을 제조하였다(시험군 1). 각 시험 백신은 투여량(dose) 당 항원 0.5 ㎍을 사용하여 6 주령 C57BL/6 마우스 암컷(오리엔트 바이오, 한국)에 2주 간격으로 3회에 걸쳐서 근육 주사하였다.

<1-2> 체액성 면역반응 분석

상기 실시예 <1-1>의 방법으로 제조 및 투여된 시험 백신의 체액성 면역반응을 분석하기 위하여, 면역 전(pre-immune serum)과 면역투여 완료 후 2주째에 혈청(serum)을 분리하여 항원특이적인 항체 형성을 ELISA법으로 분석하여 항체가를 결정하였다.

구체적으로, 항체를 분석하기 위해 정제된 재조합 HBsAg을 96웰 마이크로플레이트(microplate)에 100 ng/웰의 농도로 코팅한 뒤, 비특이적 결합을 막기 위하여 소혈청 알부민(bovine serum albumin) 1%에 1시간 동안 반응시켰다. 상기 마이크로플레이트를 세척하고 각 웰에 순차적으로 희석된 혈청을 넣고 37℃에서 2시간 동안 반응시켰으며, 2차 항체로 항-마우스 염소 IgG-HRP(horse radish heroxidase, Sigma, 미국)를 넣고 1시간 동안 동일한 조건에서 반응시켰다. 상기 반응시킨 마이크로플레이트를 세척하고 발색시약 TMB(3,3',5,5'-tetramethyl benzidine) 페록시다아제 기질(peroxidase substrate, KPL, 미국)을 첨가하고 5분간 상온에서 반응시킨 다음 ELISA 리더기를 이용하여 450 nm에서 OD를 측정하였다. 항체가는 음성대조군의 OD 값에 3배에 해당하는 OD 값을 나타내는 항체 희석배수의 역수로 정의하였다.

아울러 HBsAg 항원 특이적인 항체의 이소타입(isotype) 중 IgG1, IgG2a 및 IgG2b를 ELISA 방법으로, 마우스 클론항체 이소타이핑 키트(mouse monoclonal antibody isotyping kits, Sigma, 미국)을 사용하여 결정하였다.

그 결과, 도 1A에 나타난 바와 같이 대조군인 시험군 1의 경우 최종 항체가가 8.4 × 10⁵이었고, Pam3Cys-SKKKK와 폴리(I:C)를 항원과 혼합하여 오일에멀젼 형태로 투여한 시험군 2의 경우 7.1 × 10⁶으로 높은 항체가를 나타내었으며, 항원을 수산화 알루미늄으로 흡착 후, Pam3Cys-SKKKK와 폴리(I:C)를 혼합하여 수용액상으로 투여한 시험군 3은 5.1 × 10⁶이었고, Pam3Cys-SKKKK와 폴리(I:C)를 항원과 혼합하여 수용액상으로 투여한 시험군 4의 경우 항체가가 6.3 × 10⁶이었다. 시험군 2 내지 4의 경우 수산화 알루미늄을 아쥬반트로 사용한 대조군인 시험군 1과 비교하여 약 6 내지 8배 정도 높은 항체가를 유도한 반면, Pam3Cys-SKKKK 및 폴리(I:C)를 오일에멀젼 제형 또는 수용액 제형으로 제조하여 투여한 경우에는 항체가에 큰 차이를 보이지 않았으며, 오차범위 내에서 동일한 효과를 보였다(도 1A).

또한, 유도된 항원특이적 항체의 이소타입 분석 결과는 도 1B에 나타난 바와 같이 IgG1, IgG2a 및 IgG2b가 유도되었고, 그 중에서 수산화 알루미늄을 아쥬반트로 사용한 시험군 1에서는 IgG1항체가 주로 유도되었고, Pam3Cys-SKKKK와 폴리(I:C)를 아쥬반트로 사용한 시험군 2 내지 4에서는 IgG2b가 특이적으로 높게 유도되는 것을 확인함으로써(도 1B), 아쥬반트에 의한 항체 이소타입 변화를 확인할 수 있었다. 즉, Pam3Cys-SKKKK와 폴리(I:C)를 혼합하여 아쥬반트로 사용한 경우, 면역반응을 Th1 쪽으로 전환할 수 있고, 상기 효과는 오일 에멀젼 또는 수용액상의 제형에서 동일한 결과를 나타내었다.

< 실시예 2> 항원과 복합체를 형성하는 Pam3Cys - SKKKK 및 폴리(I:C)의 최적 조성비율 확인

<2-1> 다양한 Pam3Cys - SKKKK 및 폴리(I:C)의 혼합비율로 시험백신의 제조

수용액상으로 시험백신을 제조할 경우, 최적의 면역원성을 갖기 위한 항원과 아쥬반트의 혼합비율을 결정하기 위하여 B형 간염바이러스 전체 표면항원 L-HBsAg의 양을 25 ㎍/㎖로 고정하고 폴리(I:C)의 양을 100 ㎍/㎖로 고정한 조건에서 Pam3Cys-SKKKK의 양을 100, 125, 150, 175 및 200 ㎍/㎖로 변화시켜 시험백신을 제조하였고, 항원 L-HBsAg의 양을 100 ㎍/㎖로 사용한 조건에서 아쥬반트 Pam3Cys-SKKKK 및 폴리(I:C)의 양을 변화시켜 시험백신을 제조하였다.

구체적으로, 항원과 폴리(I:C) 혼합액을 준비한 후, 농도를 달리하여 준비한 각각의 Pam3Cys-SKKKK 용액을 수용액 형태로 혼합하였다. 상기 혼합된 수용액을 볼텍싱(vortexing)하여 섞고, 교반기(rotator)를 이용하여 2 내지 8℃에서 하룻밤동안 반응시켜 시험백신을 제조하였다. 그리고나서, 상기 제조된 시험백신에서 항원, 폴리(I:C) 및 Pam3Cys-SKKKK가 복합체를 형성하는지 확인하기 위하여 상기 시험백신을 12000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상층액과 침전물을 분리한 후, 각각의 분획을 SDS-PAGE하여 은 염색법(silver staining)으로 분석하였다. 이때 상층액에는 복합체를 형성하지 못한 자유(free) 항원 및 아쥬반트가 포함되고 침전물에는 항원 및 아주반트 복합체가 포함된다.

<2-2> 항원과 복합체를 형성하는 Pam3Cys - SKKKK 및 폴리(I:C)의 최적 조성비율 확인

상기 실시예 <2-1>의 방법으로 제조된 다양한 혼합비율의 시험백신 중 최적 조성비를 결정하기 위하여 은 염색법을 수행하였다.

구체적으로, 상기 실시예 <2-1>의 방법으로 제조된 시험백신의 상층액을 분리하고, 침전물은 1x SEC 완충액으로 재현탁하였다. 상기 상층액 및 재현탁시킨 침전물에 5x 샘플 완충액(sample buffer)을 가하고 5분간 끓인 후, NuPAGE 4 내지 12% Bis-Tris 겔(Invitrogen, 미국)을 이용하여 전기영동한 후 제조사의 사용설명서에 따라 은 염색법 키트(Silver Stain Kit, BioRad, 미국)을 이용하여 염색하였다.

그 결과, 도 2A에 나타난 바와 같이 Pam3Cys-SKKKK 및 폴리(I:C)의 비율을 1:1로 사용하여 제조된 수용액 제형의 시험백신의 경우 상층액에서 복합체를 형성하지 못한 항원 L-HBsAg 및 폴리(I:C)가 확인되었다. 그러나 Pam3Cys-SKKKK 및 폴리(I:C)의 비율을 1.25:1 내지 2:1로 사용하여 제조된 수용액 제형의 시험백신의 경우 상층액에서 항원 L-HBsAg 및 폴리(I:C)가 확인되지 않았다(도 2A). 상기 결과로, 수용액상에서 항원 L-HBsAg 및 폴리(I:C)가 자유(free) 형태로 존재하지 않고 모두 복합체를 형성하기 위해서는 Pam3Cys-SKKKK가 오일 에멀젼 제형과 비교하여 더 많은 양이 필요한 것으로 판단되었다. 따라서 복합체를 형성하는 항원 L-HBsAg 25 ㎍/㎖와 복합체를 형성하는 아쥬반트의 최소량은 Pam3Cys-SKKKK 125 ㎍/㎖과 폴리(I:C) 100 ㎍/㎖로 결정하였다.

또한, 같은 방법으로 항원 L-HBsAg의 양을 100 ㎍/㎖로 증가시킨 경우, 복합체를 형성하는데 필요한 아쥬반트 Pam3Cys-SKKKK 및 폴리(I:C)의 양은 상기 결과와 비례적으로 증가하여 Pam3Cys-SKKKK 500 ㎍/㎖ 및 폴리(I:C) 400 ㎍/㎖이 필요함을 확인하였다(도 2B).

< 실시예 3> 시험백신의 생체 내 흡수과정 확인

상기 <실시예 2>의 결과로 적정된 최적 조성비의 Pam3Cys-SKKKK 및 폴리(I:C) 시험백신이 투여시 생체 내에서 어떻게 흡수되는지를 확인하기 위하여 투여부위의 데포형성(depot formation)을 관찰하였다.

구체적으로, 시험백신의 구성분인 B형 간염바이러스 전체 표면항원 L-HBsAg과 아쥬반트로 사용한 Pam3Cys-SKKKK 및 폴리(I:C)를 각각 구분할 수 있도록 하기 표 1과 같이 형광물질을 사용하여 염색하였다. 그리고나서 상기 염색된 시험백신의 각 구성분을 혼합한 후, 볼텍싱하여 잘 섞고, 2 내지 8℃에서 교반기를 이용하여 하룻밤 동안 반응시켰다. 반응 후, 원심분리를 수행하여 복합체를 이룬 시험백신 및 자유 형태의 L-HBsAg, Pam3Cys-SKKKK 및 폴리(I:C)를 분리한다. 상기 분리된 상층액을 제거하고, 침전된 복합체를 1x SEC 완충액으로 재현탁하였으며, 이렇게 재현탁된 시험백신은 L-HBsAg, Pam3Cys-SKKKK 및 폴리(I:C)의 복합체로 구성되어 있기 때문에 자주색을 나타내게 된다. 상기 염색된 시험백신을 시험군 당 15마리씩 C57BL/6 마우스(암컷, 6주령)(오리엔트바이오, 한국)의 오른쪽 옆구리에 피하주사하였다. 투여 후 1, 7, 14, 28 및 36일에 시험군 당 각 3마리씩 투여부위를 절개하여 가시광선 및 UV광선하에서 관찰하였다.

성분명	사용된 형광물질	관찰되는 색
L-HBsAg	Fluorescein-EX(Invitrogen, 미국)	노랑
Pam3Cys-SKKKK	6-TAMRA NHS ester(Invitrogen, 미국)	빨강
폴리(I:C)	Alexa fluor 647 carboxylic acid(Invitrogen, 미국)	파랑

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 항원만 투여한 시험군 1에서는 투여 후 관찰 1일째에 이미 주변으로 분산 또는 흡수되어 발색이 관찰되지 않았다. 또한, 항원과 폴리(I:C)의 혼합물을 투여한 시험군 2에서는 관찰 1일째까지는 투여 부위에서 발색이 관찰되었으나, 관찰 7일째에는 확인할 수 없었다. 그러나, Pam3Cys-SKKKK가 포함된 시험물질을 투여한 시험군 3 내지 5에서는 하기 표2에서 나타난 바와 같이 관찰 36일째까지 투여 부위에서 붉은 색을 관찰할 수 있었다(표 2). 이때, 관찰 1 및 7일째에는 진한 자주색으로 관찰되던 투여부위가 28 및 36일째에는 엷은 색으로 관찰되는 것으로 보아 투여부위 주변으로 천천히 방출되는 것을 확인하였다(도 3). 따라서, 본 발명의 아쥬반트와 혼합하여 제조된 시험백신은 지속적인 면역원성을 유지하고, 전신적인 면역반응을 급작스럽게 유도하지 않으므로 효능 및 안전성이 우수함을 확인하였다.

시험군	투여물질	관찰결과
		1일	7일	14일	28일	36일
1	항원 L-HBsAg	-	-	-	-	-
2	항원 L-HBsAg + 폴리(I:C)	+	-	-	-	-
3	항원 L-HBsAg + Pam3Cys-SKKKK	+	+	+	+	+
4	Pam3Cys-SKKKK + 폴리(I:C)	+	+	+	+	+
5	항원 L-HBsAg + Pam3Cys-SKKKK + 폴리(I:C)	+	+	+	+	+

또한, 상기 염색된 시험물질 및 시험백신의 염색이 안정적으로 유지되는지를 확인하기 위하여 36일 동안 별도로 관찰하여 염색이 자연적으로 사라지지 않고 안정적으로 유지됨을 확인하였다.

< 실시예 4> Pam3Cys - SKKKK 및 폴리(I:C)가 다른 바이러스의 항원에 대한 아쥬반트 효과 확인

<4-1> HIV 항원을 이용한 Pam3Cys - SKKKK 및 폴리(I:C)의 효과 확인

Pam3Cys-SKKKK 및 폴리(I:C)의 수용액 제형 아쥬반트와 죽은 HIV 바이러스(HIV killed virus)(스마젠)를 항원으로 혼합하여 시험백신을 제조하여 이의 효과를 확인하였다.

구체적으로, HIV 항원 1.0 ㎍을 수산화 알루미늄 25 ㎍에 흡착하여 제조된 시험백신(시험군 2), 동량의 항원에 불완전 프라우트 아쥬반트(incomplete freund adjuvant; IFA)를 혼합하여 제조된 시험백신(시험군 3), 및 상기 <실시예 2>에서 결정된 최적의 혼합비율인 Pam3Cys-SKKKK 25 ㎍ 및 폴리(I:C) 20 ㎍을 항원과 혼합하여 제조된 수용액 제형의 시험백신을 투여량(dose) 당 항원 1.0 ㎍을 사용하여 6주령 C57BL/6 마우스 암컷에 3주 간격으로 3회에 걸쳐 근육 주사하였다. 항체가 분석은 상기 실시예 <1-2>의 방법으로 ELISA를 수행하여 얻었다.

그 결과, 도 4A에 나타난 바와 같이 수산화 알루미늄을 아쥬반트로 사용한 경우(시험군 2)에는 항체가가 2.2 × 10⁵으로 유도되고, IFA를 항원과 같이 투여한 경우(시험군 3)에는 항체가가 7.3 × 10⁵으로 유도되었으며, Pam3Cys-SKKKK 및 폴리(I:C)를 아쥬반트로 사용한 경우(시험군 4)에는 항체가가 2.5 × 10⁶으로 유도되었다(도 4A). 즉, Pam3Cys-SKKKK 및 폴리(I:C)를 아쥬반트로 사용한 경우 항체가가 기존에 많이 사용되는 알룸보다 약 10배 이상 높게 유도되었고, 강력한 아쥬반트로 알려진 IFA를 사용한 경우보다 3배 이상 더 높은 항체가를 유도함을 확인하였다. 따라서, Pam3Cys-SKKKK 및 폴리(I:C)를 수용액 제형에서 아쥬반트로 사용할 경우에도 유의적인 효과를 보임을 확인하였다.

<4-2> 인플루엔자( influenza ) 백신 항원을 이용한 Pam3Cys - SKKKK 및 폴리(I:C)의 효과 확인

Pam3Cys-SKKKK 및 폴리(I:C)의 수용액 제형 아쥬반트와 인플루엔자 백신의 항원인 HA와 혼합하여 시험백신을 제조하여 이의 효과를 확인하였다.

구체적으로, 인플루엔자 백신은 일반적으로 아쥬반트를 사용하지 않으므로 항원만을 포함한 시험군, 수산화 알루미늄을 사용한 시험군 및 Pam3Cys-SKKKK 및 폴리(I:C)를 아쥬반트로 사용한 시험군으로 나누어 동물 면역시험을 실시하였다. 이때, 항원은 H1N1, H3N2 및 B1F의 세 가지 HA 종(strain)을 각각 투여량 당 0.025 ㎍부터 2배씩 증가시켜 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.8 및 1.6 ㎍까지 사용하여 6주령 C57BL/6 마우스 암컷에 3주 간격으로 2회에 걸쳐 근육 주사하였다. 항체가 분석은 상기 실시예 <1-2>의 방법으로 ELISA를 수행하여 얻었다. 이때, 코팅항원은 면역에 사용한 세 가지 HA 종의 항원 혼합액을 사용하였으며, 각각의 항원이 100 ng/웰이 되도록 코팅하였다.

인플루엔자 HA 항원을 이용한 동물 면역실험에서는 기존 백신과 같이 아쥬반트를 사용하지 않은 시험군, 수산화 알루미늄을 아쥬반트로 사용한 시험군, 및 Pam3Cys-SKKKK 및 폴리(I:C)를 아쥬반트로 사용한 시험군에서 아쥬반트 효과를 비교하였으며, 특히 강력한 아쥬반트를 사용할 경우 인플루엔자 HA 항원의 양을 줄일 수 있는지 여부를 확인하기 위하여 항원 투여량을 0.025 내지 1.6 ㎍으로 사용하였다. 그 결과, 도 4B에서 나타난 바와 같이 Pam3Cys-SKKKK 및 폴리(I:C)를 아쥬반트로 사용하는 경우 항체가가 10 내지 100배까지 증가하였으므로(도 4B) 이를 아쥬반트로 사용할 경우 필요한 항원 투여량을 줄일 수 있는 가능성을 발견하였다.

따라서, 상기 두 가지 다른 백신항원을 사용하여 동물 면역실험을 수행한 결과, 본 발명의 아쥬반트는 오일 에멀젼 제형뿐만 아니라 수용액 제형에서도 유의적인 효과를 나타내며, 이는 B형 간염바이러스 전체 표면항원 외에 다른 항원과도 유의적인 아쥬반트 효과를 나타냄을 확인하였다.

Claims (13)

1. 리포펩티드 및 폴리(I:C)의 조성비를 1.25:1 내지 2:1로 포함하고, 여기서 리포펩티드는 0.01 중량% 내지 0.1 중량%, 및 폴리(I:C)는 0.01 중량% 내지 0.08 중량%의 중량비로 포함하는 수용액 제형의 백신 아쥬반트.
   
2. 제 1항에 있어서, 상기 리포펩티드는 Pam3Cys-SKKKK, PHC-SKKKK, Ole2PamCys-SKKKK, Pam2Cys-SKKKK, PamCys(Pam)-SKKKK, Ole2Cys-SKKKK, Myr2Cys-SKKKK, PamDhc-SKKKK, PamCSKKKK, Dhc-SKKKK인 것을 특징으로 하는 수용액 제형의 백신 아쥬반트.
   
3. 제 1항에 있어서, 상기 폴리(I:C)는 그 길이가 50 내지 5,000 bp인 것을 특징으로 하는 수용액 제형의 백신 아쥬반트.
   
4. 삭제
5. 제 1항의 아쥬반트 및 항원을 포함하는 수용액 제형의 백신 조성물.
   
6. 제 5항에 있어서, 상기 항원은 병원체의 단백질, 재조합 단백질, 당단백질, 펩티드, 다당류, 지질다당류 또는 폴리뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 수용액 제형의 백신 조성물.
   
7. 제 5항에 있어서, 상기 항원은 세포 또는 바이러스인 것을 특징으로 하는 수용액 제형의 백신 조성물.
   
8. 제 5항에 있어서, 상기 항원은 HBV 바이러스의 전체 표면항원(L-HBsAg), 죽은 HIV 바이러스(HIV killed virus), 인플루엔자(influenza) HA 항원으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 수용액 제형의 백신 조성물.
   
9. 제 5항에 있어서, 상기 백신은 항원에 특이적이며 세포성 면역반응을 유도하는 IgG2a 또는 IgG2b 타입의 항체를 다량 생산할 수 있는 것을 특징으로 하는 수용액 제형의 백신 조성물.
   
10. 제 5항에 있어서, 상기 백신은 Th1 면역반응을 증진시키는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
    
11. 제 5항에 있어서, 상기 백신은 투여부위에 데포를 형성하는 것을 특징으로 하는 수용액 제형의 백신 조성물.
    
12. 제 5항의 백신 조성물을 유효성분으로 함유하는 바이러스 감염 예방 및 치료제.
    
13. 제 5항의 백신 조성물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 및 치료제.
    
    
    
    

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