KR20070029111A - 백신접종에 있어서의 개선 - Google Patents

Abstract

본 발명은 개선된 핵산 백신, 애쥬번트 시스템, 및 이러한 백신 및 애쥬번트 시스템의 제조 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 핵산 백신 및 애쥬번트 시스템은 GM-CSF를 암호화하는 누클레오티드 서열 또는 이의 유도체와 톨형 수용체(toll-like receptor: TLR) 효능제 또는 이의 유도체를 포함한다.

Description

백신접종에 있어서의 개선{Improvements in vaccination}

본 발명은 개선된 핵산 백신, 애쥬번트 시스템 및 이러한 백신 및 애쥬번트 시스템의 제조 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 핵산 백신 및 애쥬번트 시스템은 GM-CSF를 암호화하는 누클레오티드 서열, 또는 이의 유도체, 및 톨형 수용체(toll-like receptor: TLR) 효능제, 또는 이의 유도체의 조합물을 포함한다.

동물에서 면역 반응을 유도함으로써 감염에 대해 동물을 보호할 수 있는 항원을 동물 시스템내로 도입시킴을 포함하는 전통적인 백신접종 기술은 수년동안 알려져왔다. 1990년대 초반 플라스미드 DNA가 생체내에서 동물 세포를 직접 감염시킬 수 있다는 관측 이후에, 현저한 연구 노력이 이루어져 항원성 펩티드를 암호화하는 DNA를 동물내로 직접 도입시킴에 의해 DNA 플라스미드를 사용하여 면역 반응을 유발하는 것을 기초로 하는 백신접종 기술이 개발되어 왔다. "DNA 면역화" 또는 "DNA 백신접종"이라고 불리는 이러한 기술은 현재 바이러스, 세균 및 기생충 질병에 대한 광범위한 전-임상 모델에서 보호성 항체(체액성) 및 세포-매개된(세포) 면역 반응을 유발하는데 사용되고 있다. 또한 암, 알레르기 및 자가면역병에 대한 치료 및 보호에 있어서 DNA 백신접종 기술의 사용과 관련하여 연구가 진행중에 있다.

DNA 백신접종을 일반적으로 세균 플라스미드 벡터로 이루어지며, 당해 벡터내로 강력한 프로모터, 항원성 펩티드를 암호화하는 목적 유전자 및 폴리아데닐화/전사 종결 서열이 삽입되어 있다. 목적 유전자가 암호화하고 있는 면역원은 병원체, 종양 또는 보호하고자 하는 기타 제제와 관련된 단순한 항원성 펩티드 서열이거나 완전한 단백질일 수 있다. 플라스미드는 예를 들면, 대장균(E. coli)과 같은 세균에서 성장시킬 수 있으며 이후 분리하여 숙주내로 투여되기 전에 의도된 투여 경로에 따라 적절한 배지에서 제조될 수 있다.

DNA 백신접종과 관련하여 도움이 되는 기본 정보는 이의 기술내용 전문이 본원에서 참조로 인용된 문헌[참조: Donnelly, J et al Annual Rev. Immunol. (1997) 15: 617-648; Ertl P. and Thomsen L., Technical issues in construction of nucleic acid vaccines Methods. 2003 Nov; 31 (3): 199-206]에 제공되어 있다.

전통적인 백신접종 기술과 관련하여 DNA 백신접종은 다수의 잇점이 있다. 우선, DNA 서열에 의해 암호화된 단백질은 숙주내에서 합성되므로, 이러한 단백질의 구조 또는 입체형태는 질병 상태와 연관된 천연 단백질과 유사할 것이다. 또한 DNA 백신접종은 보존된 단백질로부터 에피토프를 인지하는 세포독성 T 림프구 반응을 생성시킴으로서 상이한 바이러스 균주에 대해서도 보호할 것이다. 또한, 플라스미드는 항원 단백질이 생산될 수 있는 숙주 세포에 직접 도입되므로, 장기적으로 지속되는 면역 반응이 유발될 것이다. 당해 기술은 또한 단일 제제내로 다양한 면역원을 결합함으로써 다수의 질병 상태와 관련하여 동시 면역화를 촉진시킬 가능성을 제공한다.

전통적인 백신접종 치료법에 비해 DNA 백신접종과 연관된 다수의 잇점에도 불구하고, 동물내로 투여된 플라스미드 DNA에 의해 암호화된 단백질에 의해 유도된 면역 반응을 증가시키기 위해 제공될 애쥬번트 화합물을 개발하는 것이 요구되고 있다.

DNA 백신접종은 때때로, 특히 DNA가 표피에 직접 투여되는 경우 Th1으로부터 Th2 반응으로의 면역 반응의 편위와 관련된다[참조: Fuller and Haynes, Hum. Retrovir. (1994) 10: 1433-41]. 핵산 백신으로부터의 목적한 면역 프로파일은 표적화되는 질병에 의존함이 인지되어 있다. Th1 반응의 우선적인 자극은 많은 바이러스 질병 및 암에 대한 백신 효능을 제공하는 것으로 여겨지며, 반응의 우세한 Th2 유형의 반응은 일부 자가면역 질병과 연관된 알레르기 및 염증을 제한시키는데 있어 효과적일 수 있다. 따라서, 면역 반응을 적량적으로 상승시키거나 반응의 유형을 질병 증상에 가장 효과적일 수 있는 반응으로 이동시키는 방법이 유용할 수 있다.

수지 세포는 조직에서 미숙형으로 존재한다. 조직의 감염 또는 다른 조직 손상에 대한 반응시, 수지 세포는 손상된 조직으로 이주하며, 여기서, 이들은 손상된 조직으로부터 펩티드를 흡수하고, 프로세싱하며 발현하여 림프절로 이주시킨다. 펩티드는 수지 세포에 의해 동시자극 분자(costimulatory molecule)와 함께, 표면 주요 조직적합성 착물(MHC) 분자내에서 수지 세포에 의해 발현된다. MHC에서 동시자극 분자와 함께 펩티드를 발현하는 수지 세포는 "성숙한" 수지 세포라 명명된다. 성숙한 수지 세포는 T 세포와 상호작용할 수 있으며 발현된 펩티드를 인지하는 T 세포를 활성화시켜 면역 반응을 상승시킴으로써 조직 손상의 원인(예를 들면, 침입하는 세균)을 제거한다.

과립구-포식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)는 면역학적 작용을 하는 광범위한 세포의 분화, 증식 및 활성화를 유도할 수 있는 시토카인이다. GM-CSF는 골수 전구체로부터 수지 세포의 증식을 유도하여 미숙 수지 세포 상태에 이르도록 하는데, 즉, 세포는 낮은 수준의 동시-자극 마커 및 항원 흡수를 위한 높은 수준의 수용체를 발현한다.

톨-형 수용체(TLR)는 곤충과 사람 사이에서 진화적으로 보존된 제I형 막전위 수용체이다. 지금까지 10개의 TLR(TLR 1-10)이 확립되어 있다(참조: Sabroe et al, JI 2003 p1630-5). TLR과의 구성원은 유사한 세포외 및 세포내 도메인을 지니는데; 이들의 세포외 도메인은 류신이 풍부한 반복 서열을 지니며, 이들의 세포내 도메인은 인터루킨-1 수용체(IL-1R)의 세포내 영역과 유사한 것으로 밝혀졌다. TLR 세포는 면역 세포 및 기타 세포(혈관 내피 세포, 지방세포, 심근세포 및 장 내피 세포 포함)에서 차등적으로 발현된다. TLR의 세포내 도메인은 어댑터(adaptor) 단백질 Myd88과 상호작용할 수 있는데, 이는 또한 세포질 영역내에 IL-1R 도메인을 지님으로써, 시토카인의 NF-KB 활성화를 가져오고; 이러한 Myd88 경로는, 시토카인 방출이 TLR 활성화에 의해 수행되는 하나의 방법이다. TLR의 주요 발현은 항원 전달 세포(예: 수지 세포, 대식세포 등)와 같은 세포 유형내에서 일어난다.

TLR을 통한 자극에 의한 수지 세포의 활성화는 수지 세포의 성숙 및 IL-12와 같은 염증성 시토카인의 생성을 초래한다. 지금까지 수행된 연구에서 TLR은, 비록 일부 효능제가 수개의 TLR에 대해 일반적이라 해도, 상이한 유형의 효능제를 인지하는 것으로 밝혀졌다. TLR 효능제는 주로 세균 또는 바이러스로부터 기원하며, 편모 또는 세균 리포다당류(LPS)와 같은 분자를 포함한다.

이미다조퀴놀린 화합물인 이미퀴모드 및 레지퀴모드는 작은 항-바이러스 단백질이다. 이미퀴모드는 사람 파필로마 바이러스에 의해 유발된 항문 성기 사마귀의 국소 치료에 사용되어 왔으며; 레지퀴모드는 또한 항문 성기 사마귀의 치료시 사용하기 위해 시험되어 왔다. 이미퀴모드 및 레지퀴모드는 TLR-7 및/또는 TLR-8 신호체계 경로 및 Myd88 활성화 경로의 활성화를 통해 작용하는 것으로 여겨진다.

본 발명자들은 DNA 백신접종에서 애쥬번트로서 사용하는 경우, 개선된 면역 반응, 특히, 개선된 세포 면역 반응을 촉진시키는데 효과적인 특정의 면역 반응 조합물을 확인하였다.

본 발명의 하나의 양태에 따라서,

(i) TLR 효능제, 또는 TLR 효능제를 암호화하는 누클레오티드 서열; 및

(ii) GM-CSF를 암호화하는 누클레오티드 서열을 포함하며, 여기서, 성분 (i) 및 (ii)는 작용적인 상호-협동(co-operation)으로 작용하여 포유동물에서 항원에 대한 면역 반응을 증진시키는 애쥬번트 조성물이 제공된다.

GM-CSF는, GM-CSF의 전체 분자 또는 골수 전구체 세포의 증식을 유도하여 성숙 수지 세포 상태에 이르도록 할 수 있는 어떠한 이의 단편을 의미한다. 마우스 GM-CSF의 폴리누클레오티드 유전자 서열은 도 2에 나타낸다. 사람 GM-CSF에 대한 DNA 서열은 진뱅크 데이타 베이스(Genbank database: 수탁 번호: M11220- 참조: Lee, F. et al PNAS 82 (13) 4360-4364 (1985)]로 부터 수득하였다.

하나의 양태에서, 애쥬번트가 사람 백신에서 사용되는 경우, GM-CSF 서열은 사람 서열이다(참조: 도 22).

본 발명의 누클레오티드 서열, 예를 들어, GM-CSF를 암호화하는 누클레오티드 서열은 조절 대조군 서열을 포함하는 플라스미드내에서 제공될 수 있다. 예를 들어, 누클레오티드 서열은 사람 사이토메갈로바이러스(CMV) 이미디에이트 얼리(immediate early: IE) 프로모터의 조절성 제어하에 백신 벡터 p7313(상세한 것은 WO02/08435 참조)내에 존재할 수 있다.

"TLR 효능제"는, TLR 신호전달 경로를 통해 신호전달 반응을 직접적인 리간드로서, 또는 내인성 또는 외인성 리간드의 생성을 통해 간접적으로 신호전달 반응을 유발할 수 있다(참조: Sabroe et al, JI 2003 p1630-5).

본 발명의 하나의 양태에서, 성분 (i)은 TLR-1을 통해 신호전달 반응을 유발할 수 있는 TLR 효능제이다(참조: Sabroe et al, JI 2003 p1630-5). 하나의 양태에서, TLR-1을 통해 신호전달 반응을 유발할 수 있는 TLR 효능제는 트리-아실화된 지질펩티드(LP); 페놀-가용성 모듈린; 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) LP; S-(2,3-비스(팔미토일옥시)-(2-RS)-프로필)-N-팔미토일-(R)-Cys-(S)-Ser-(S)-Lys(4)-OH, 트리하이드로클로라이드(Pam₃Cys)LP[이는 보렐리아 부르그도르페이(Borrelia burgdorfei)로부터 세균 지질단백질 및 OspA LP의 아실화된 아미노 말단을 모사한다] 중에서 선택된다.

다른 양태에서, 성분 (i)은 TLR-2를 통해 신호전달 반응을 유발할 수 있는 TLR 효능제이다(참조: Sabroe et al, JI 2003 p1630-5). 하나의 양태에서, TLR-2를 통해 신호전달 반응을 유발할 수 있는 TLR 효능제는 엠. 투베르쿨로시스(M. tuberculosis), 비. 부르그도르페리(B. burgdorferi), 티. 팔리둠(T. pallidum)으로부터의 하나 이상의 세균 지질펩티드; 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)를 포함하는 종으로부터의 펩티도글리칸; 지질타이코산, 만누론산, 네세리아 포린, 세균 핌브리아에(bacterial fimbriae), 예르시나 발병력 인자(yersina virulence factor), CMV 비리온, 풍진 혈구응집소 및 효모로부터의 지모산이다.

다른 양태에서, 성분 (i)은 TLR-3을 통해 신호전달 반응을 유발할 수 있는 TLR 효능제이다(참조: Sabroe et al, JI 2003 p1630-5). 하나의 양태에서, TLR-3을 통해 신호전달 반응을 유발할 수 있는 TLR 효능제는 이본쇄(이중가닥) RNA, 또는 폴리이노신성-폴리사이티딜산(Poly IC), 바이러스 감염과 연관된 분자 핵산 패턴이다.

다른 양태에서, 성분 (i)은 TLR-4를 통해 신호전달 반응을 유발할 수 있는 TLR 효능제이다(참조: Sabroe et al, JI 2003 p1630-5). 하나의 양태에서, TLR-4를 통해 신호전달 반응을 유발할 수 있는 TLR 효능제는 그람-음성 세균으로부터의 하나 이상의 지질다당류(LPS), 또는 이의 단편; 열 쇽 단백질(HSP) 10, 60, 65, 70, 75 또는 90; 표면활성 단백질 A, 하이알루로난 올리고사카라이드, 헤파란 설페이트 단편, 피브로넥틴 단편, 피브리노겐 펩티드 및 b-데펜신-2이다. 하나의 양태에서, TLR 효능제는 HSP 60, 70 또는 90이다. 다른 양태에서, TLR-4를 통해 신호전달 반응을 유발할 수 있는 TLR 효능제는 LPS의 비-독성 유도체이다. 모노포스포릴 지질 A(MPL)는 환원-말단 글루코사민으로부터 포스페이트와 코어 탄수화물 그룹을 제거시킴으로써 생산된 이러한 무독성 유도체중 하나이다. MPL은 리비(Ribi) 등의 문헌(참조: 1986, Immunology and Immunopharmacology of bacterial endotoxins, Plenum Publ. Corp. , NY, p407-419)에 기술되어 있다. 본 발명에서 TLR 효능제로서 사용될 수 있는 MPL은 하기 구조를 지닌다:

MPL의 추가의 해독된 버젼은 이당류 주쇄의 3-위치로부터 아실 쇄를 제거함으로써 생성되며 3-O-데아실화된 모노포스포릴 지질 A(3D-MPL)로 불리운다. 3D-MPL은 본 발명에서 사용될 수 있는 TLR 효능제이다. 이는 디포스포릴 지질 A, 및 이의 3-O-데아실화된 변형체의 제조를 기술하고 있는 문헌인 GB 2122204B에 교시된 방법으로 정제 및 제조할 수 있다. 3D-MPL의 형태는 입자 크기가 0.2㎛ 미만의 직경인 유액의 형태이며, 이의 제조 방법은 WO 94/21292에 기술되어 있다. 모노포스포릴 지질 A 및 표면활성제를 포함하는 수성 제형은 WO9843670A2에 기술되어 있다. LPS의 다른 정제된 및 합성의 비-독성 유도체도 기술되어 있다(참조: US 6,005,099 및 EP 0 729 473 B1 ; Hilgers et al., 1986, Int. Arch. Allergy Immunol., 79 (4): 392-6; Hilgers et al., 1987, Immunology, 60 (1) : 141-6; 및 EP 0 549 074 B1).

본 발명에서 TLR 효능제로서 사용될 수 있는 LPS의 비-독성 유도체, 또는 세균 지질다당류는 세균 공급원으로부터 정제 및 가공될 수 있거나, 달리는 이들을 합성할 수 있다. 예를 들면, 정제된 모노포스포릴 지질 A는 리비 등의 문헌(Ribi et al 1986; 상기 참조)에 기술되어 있으며, 살모넬라 아종(Salmonella spp.)으로부터 기원한 3-O-데아실화된 모노포스포릴 또는 디포스포릴 지질 A는 GB 2220211 및 US 4912094에 기술되어 있다. 다른 정제되고 합성된 지질다당류도 기술되어 있다[참조: US 6,005,099 및 EP 0 729 473 B1 ; Hilgers et al., 1986, Int. Arch. Allergy. lmmunol., 79 (4): 392-6; Hilgers et al., 1987, Immunology, 60(1) : 141-6; 및 EP 0 549 074 B1]. 세균 지질다당류 애쥬번트는 US 6,005,099 및 EP 0 729 473 B1에 기술된 β(1-6)글루코사민 이당류 및 3D-MPL일 수 있다.

따라서, 본 발명에서 TLR 효능제로서 사용될 수 있는 다른 LPS 유도체는 LPS 또는 MPL 또는 3D-MPL의 구조와 유사한 면역자극인자이다. 본 발명의 다른 양태에서, LPS 유도체는 아실화된 단당류일 수 있으며, 이는 MPL의 상기 구조에 대해 하위-부위이다.

이당류 효능제는 다음 화학식의 정제되거나 합성의 지질 A일 수 있다:

상기 식에서,

R²는 H 또는 P0₃H₂일 수 있고;

R³는 아실 쇄 또는 β-하이드록시미리스토일 또는 하기 화학식의 3-아실옥시아실 잔기일 수 있으며:

여기서, R⁴는

이고;

여기서, X 및 Y는 0 내지 약 20의 값이다.

LPS와 구조적 상동성을 거의 공유하지 않고 순수하게 합성인 LPS의 추가의 비-독성 유도체는 본원에 전문이 참조로 인용된 WO 00/00462에 기술되어 있는 것이다.

대안적인 양태에서, 성분 (i)은 TLR-5를 통해 신호전달 반응을 유발할 수 있는 TLR 효능제이다(참조: Sabroe et al, JI 2003 p1630-5). 하나의 양태에서, TLR-5를 통해 신호전달 반응을 유발할 수 있는 TLR 효능제는 세균 플라겔린이다.

대안적 양태에서, 성분 (i)은 TLR-6을 통해 신호전달 반응을 유발할 수 있는 TLR 효능제이다(참조: Sabroe et al, JI 2003 p1630-5). 하나의 양태에서, TLR-6을 통해 신호전달 반응을 유발할 수 있는 TLR 효능제는 마이코박테이아 지질단백질, 디-아실화된 LP, 및 페놀-가용성 모듈린이다. 또한 TLR6 효능제는 WO2003043572에 기술되어 있다.

대안적 양태에서, 성분 (i)은 TLR-7을 통해 신호전달 반응을 유발할 수 있는 TLR 효능제이다(참조: Sabroe et al, JI 2003 p1630-5). 하나의 양태에서, TLR-7을 통해 신호전달 반응을 유발할 수 있는 TLR 효능제는 N7 및 C8 위치에서 구아노신 유사체인 록소리빈, 또는 이미다조퀴놀린 화합물 또는 이의 유도체이다. 하나의 양태에서, TLR 효능제는 이미퀴모드이다. 추가의 TLR7 효능제는 WO02085905에 기술되어 있다.

대안적 양태에서, 성분 (i)은 TLR-8을 통해 신호전달 반응을 유발할 수 있는 TLR 효능제이다(참조: Sabroe et al, JI 2003 p1630-5). 하나의 양태에서, TLR-8을 통해 신호전달 반응을 유발할 수 있는 TLR 효능제는 항-바이러스 활성을 지닌 이미다조퀴놀린 분자, 예를 들면, 레지퀴모드(R848)이며; 레지퀴모드는 또한 TLR-7에 의해 인지될 수 있다. 사용될 수 있는 다른 TLR-8 효능제는 WO2004071459에 기술되어 있다.

대안적 양태에서, TLR 효능제는 이미퀴모드이다. 다른 양태에서 TLR 효능제는 레지퀴모드이다.

대안적 양태에서, 성분 (i)은 TLR-9를 통해 신호전달 반응을 유발할 수 있는 TLR 효능제이다(참조: Sabroe et al, JI 2003 p1630-5). 하나의 양태에서, TLR-9를 통해 신호전달 반응을 유발할 수 있는 TLR 효능제는 HSP90이다. 달리, TLR-9를 통해 신호전달 반응을 유발할 수 있는 TLR 효능제는 메틸화되지 않은 CpG 누클레오티드, 특히 CpG 모티프로 공지된 서열 구성을 함유하는 DNA이다.

CpG-함유 올리고누클레오티드는 Th1 반응을 우세하게 유도한다. 이러한 올리고누클레오티드는 잘 공지되어 있으며 예를 들면, WO 96/02555, WO 99/33488 및 미국 특허 6,008,200 및 5,856,462에 기술되어 있다.

하나의 양태에서, CpG 누클레오티드는 CpG 올리고누클레오티드이다.

하나의 양태에서, CpG 누클레오티드는 하나 이상의 CG 메틸화되지 않은 디누클레오티드 모티프를 함유하는 면역자극 올리고누클레오티드 영역을 지닌 올리고누클레오티드 조성물이다. 면역자극 서열은 흔히, 퓨린, 퓨린, C, G, 피리미딘, 피리미딘이며; 여기서, 디누클레오티드 CG 모티프는 메틸화되어 있지 않다.

하나의 양태에서, CpG 누클레오티드는 적어도 3개, 또는 적어도 6개 또는 그 이상의 누클레오티드에 의해 분리된 2개 이상의 디누클레오티드 CpG 모티프를 함유한다. 본 발명의 CpG 누클레오티드는 통상적으로 데옥시누클레오티드이다.

하나의 양태에서, 올리고누클레오티드내에서 누클레오티드간 결합(internucleotde bond)은 포스포로디티오에이트이다. 추가의 양태에서, 비록 포스포디에스테르 및 다른 누클레오티드간 결합이 혼합된 누클레오티드간 결합을 지닌 올리고누클레오티드를 포함하는 본 발명의 영역내에 있다고 해도, 올리고누클레오티드내 누클레오티드간 결합은 포스포로티오에이트 결합이다. 포스포로티오에이트 올리고누클레오티드 또는 포스포로디티오에이트를 생산하는 방법은 US5,666,153, US5,278,302 및 W095/26204에 기술되어 있다.

CpG 누클레오티드의 예는 다음 서열을 지닌다. 당해 서열들은 포스포로티오에이트 개질된 누클레오티드간 결합을 함유할 수 있다.

올리고 1 (서열: 17): TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826)

올리고 2 (서열: 18): TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758)

올리고 3 (서열: 19): ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG

올리고 4 (서열: 20): TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006)

올리고 5 (서열: 21): TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668)

대안적인 CpG 올리고누클레오티드도 상기 서열을 포함할 수 있으며, 여기서, 이들은 비필수적인 결실 또는 첨가를 지닐 수 있다.

본 발명에 이용된 CpG 누클레오티드는 당해 분야에 공지된 어떠한 방법(예: EP 468520)에 의해서도 합성할 수 있다. 편리하게는, 이러한 CpG 누클레오티드는 자동화된 합성기를 이용하여 합성할 수 있다.

본 발명에 이용된 CpG 누클레오티드는 통상적으로 데옥시누클레오티드이다. 하나의 양태에서, 올리고누클레오티드내 누클레오티드간 결합은 포스포로디티오에이트이다. 추가의 양태에서, 올리고누클레오티드내 누클레오티드간 결합은, 비록 포스포디에스테르가 본 발명의 영역내에 있다고 해도, 포스포로티오에이트 결합이다. 상이한 누클레오티드간 결합을 포함하는 올리고누클레오티드, 예를 들면, 혼합된 포스포로티오에이트 포스포디에스테르가 고찰된다. 올리고누클레오티드를 안정화시키는 다른 누클레오티드간 결합도 이용될 수 있다.

대안적 양태에서, 성분 (i)은 TLR-10을 통해 신호전달 반응을 유발할 수 있는 TLR 효능제이다. 달리는, TLR 효능제는 2개 이상의 상기 TLR의 어떠한 조합을 통해서도 신호전달 반응을 유발할 수 있다.

본 발명에서 사용될 수 있는 특정의 TLR 효능제는 TLR 2, 4, 7 또는 8의 효능제를 포함한다.

추가의 대안적 양태에서, 하나 이상의 TLR 효능제의 조합이 사용될 수 있다. 본 발명의 하나의 양태에서, TLR-4의 효능제 및 TLR-7의 효능제가 사용된다.

본 발명의 하나의 양태에서, 성분 (i)은 TLR-9를 통해 신호전달 반응을 유발할 수 없다.

본 발명은 본원에 나열된 TLR-효능제에 한정되지 않으며, 다른 천연 리간드 또는 합성 TLR 효능제를 또한 본 발명에서 사용할 수 있다.

본 발명의 양태에서, TLR 효능제는 TLR-7을 통해 신호전달 반응을 유발할 수 있다. 본 발명의 하나의 양태에서, TLR 효능제는 이미다조퀴놀린 화합물 또는 이의 유도체이다. 추가의 양태에서, 이미다조퀴놀린 또는 이의 유도체는 본원에 정의된 바와 같은 화학식 I 내지 VI중 어느 하나에 의해 정의된 화합물이다. 추가의 양태에서, 이미다조퀴놀린 또는 이의 유도체는 화학식 VI로 정의된 화합물이다. 하나의 양태에서, 이미다조퀴놀린 또는 이의 유도체는

1-(2-메틸프로필)-1H-이미다조[4,5-c] 퀴놀린-4-아민;

1-(2-하이드록시-2-메틸프로필)-2-메틸-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민;

1-(2-하이드록시-2-메틸프로필)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민;

1-(2-하이드록시-2-메틸프로필)-2-에톡시메틸-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 화학식 VI의 화합물이다.

추가의 양태에서, 이미다조퀴놀린 또는 이의 유도체는 이미퀴모드 또는 레지퀴모드이다. 이미다조퀴놀린 또는 이의 유도체는 이미퀴모드이다. 본 발명의 하나의 양태에서, 이미다조퀴놀린 또는 이의 유도체가 이미퀴모드인 경우, 이미퀴모드는 국소 투여용 크림 제형으로 제공된다. 사용될 수 있는 이미퀴모드의 크림 제형은 Aldara^TM 크림 5%(3M)이다. 본 발명의 대안적 양태에서, 이미다조퀴놀린 또는 이의 유도체가 레지퀴모드인 경우, 레지퀴모드는 경구 투여용, 또는 경피 투여용 제형으로 제공된다. 본 발명의 하나의 양태에서, 성분 (ii) 및 (iii)은 동시에 투여되는 폴리누클레오티드 서열이고, 성분 (i)은 이미다조퀴놀린, 예를 들면, 이미퀴모드이며, 이는 국소적으로, 예를 들면 크림 제형으로서 성분 (ii) 및 (iii)의 투여 후 12 내지 36시간 사이에, 예를 들면, 성분 (ii) 및 (iii)의 투여 후 24시간째 또는 약 24시간째에 투여된다.

본 발명의 하나의 양태에서, 본 발명의 성분 (i), (ii) 또는 (iii)을 암호화하는 누클레오티드 서열은 DNA이다. 추가의 양태에서, 누클레오티드 서열 또는 폴리누클레오티드 분자는 플라스미드 DNA내에 암호화되어 있다.

본 발명의 애쥬번트 조성물의 하나의 양태에서, 성분 (i) 및 성분 (ii)를 암호화하는 누클레오티드 서열은 하나의 플라스미드내에 동시-암호화(co-encode)되어 있다.

하나의 양태에서, 애쥬번트 성분 (i)은 다음 중 하나 이상을 암호화하거나, 또는 TLR 효능제로서 작용할 수 있는 다음 성분들을 암호화하는 누클레오티드 서열이다: β-데펜신; HSP60; HSP70; HSP90 또는 TLR 효능제로서 작용할 수 있는 다른 저 분자량 HSP; 피브로넥틴; 및 플라겔린 단백질.

대안적 양태에서, 애쥬번트 성분 (i)의 TLR 효능제는 다음중 하나 이상, 또는 TLR 효능제로서 작용할 수 있는 다음 성분이다: 트리-아실화된 지질펩티드(LP)와 같은 TLR-1 효능제; 페놀-가용성 모듈린; 마이코박테리움 투베르큘로시스 LP; S-(2,3-비스(팔미토일옥시)-(2-RS)-프로필)-N-팔미토일-(R)-Cys-(S)-Ser-(S)-Lys(4)-OH, 세균 지질 단백질의 아세틸화된 아미노 말단 및 보렐리아 부르그도르페이(Borrelia burgdorfei)로부터의 OspA LP를 모사하는 트리하이드로클로라이드(Pam₃Cys) LP; 엠 튜베르큘로시스, 비 부르그도르페리, 티 팔리둠으로부터의 세균 지질 펩티드; 스타필로코쿠스 아우레우스를 포함하는 종으로부터의 펩티도글리칸; 리포테이콘산, 만누론산, 나이세리아 포린, 세균 핌브리아에, 예르시나 발병력 인자, DMV 비리온, 풍진 혈구응집소 및 효모로부터의 자이모산; 이중 가닥 RNA 또는 폴리이노신-폴리사이티딜산(Poly IC), 바이러스 감염과 연관된 분자 핵산 패턴과 같은 TLR-3 효능제; 그람-음성 세균으로부터의 지질다당류(LPS), 또는 이의 단편; 열 쇽 단백질(HSP) 10, 60, 65, 70, 75 또는 90; 표면활성 단백질 A, 하이알루로난 올리고사카라이드, 헤파란 설페이트 단편, 피브로넥틴 단편, 피브리노겐 펩티드 및 b-데펜신-2, 또는 모노포스포릴 지질 A(MPL)과 같은 LPS의 비-독성 유도체와 같은 TLR-4 효능제; 세균 플라겔린과 같은 TLR-5 효능제; 마이코박테리아 지질단백질, 디-아실화된 LP 및 페놀-가용성 모듈린과 같은 TLR-6 효능제; 록소리빈, N7 및 C8 위치에서 구아노신 유사체, 또는 이미다조퀴놀린 화합물, 또는 이미퀴모드 또는 레지퀴모드와 같은 이의 유도체와 같은 TLR-7 효능제; 레지퀴모드와 같은, 항-바이러스 활성을 지닌 이미다조퀴놀린 분자와 같은 TLR-8 효능제; 메틸화되지 않은 CpG 누클레오티드를 함유하는 HSP90 또는 DNA, 특히 CpG 모티프로 공지된 서열 구성과 같은 TLR-9 효능제.

성분 (ii)와 동시 또는 연속 투여하기 위해, 하나의 양태에서, 성분 (i)은 상기 TLR 효능제중 하나이다.

본 발명은 또한 본원에 기술된 바와 같은 애쥬번트 성분 (i) 및 (ii)와, 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 면역원 성분을 포함하는 면역원성 조성물 또는 조성물들을 제공한다.

본 발명의 하나의 양태에서, 성분 (i)은 누클레오티드 서열에 의해 암호화되며, 성분 (i), (ii) 및 (iii)을 암호화하는 누클레오티드 서열은 하나의 또는 동일한 폴리누클레오티드 분자내에서 포함되거나 이루어진다.

본 발명의 추가의 양태에서, 성분 (i)은 누클레오티드 서열에 의해 암호화되며, 성분 (i), (ii) 및 (iii)을 암호화하는 누클레오티드 서열은 동시 또는 연속 투여용의 별개 폴리누클레오티드 분자내에 포함되거나 이루어진다.

달리는, 성분 (i), (ii) 및 (iii)중 어떠한 2개를 암호화하는 누클레오티드 서열은, 동시 또는 연속 투여를 위해, 하나 또는 동일한 폴리누클레오티드 분자내에 포함되거나 이루어질 수 있으며, 나머지 폴리누클레오티드 서열은 추가의 폴리누클레오티드내에 암호화될 수 있다. 성분 (ii) 및 (iii)을 암호화하는 누클레오티드 서열은 하나 또는 동일한 폴리누클레오티드 분자내에 포함될 수 있거나 이루어질 수 있으며, 성분 (i)을 암호화하는 누클레오티드 서열은, 동시 또는 연속 투여를 위해, 추가의 폴리누클레오티드 분자내에 암호화될 수 있다.

본 발명의 양태에서, 성분 (i), (ii) 및/또는 (iii)이 별개의 폴리누클레오티드 서열내에 포함되거나 이루어진 경우, 폴리누클레오티드 분자는 각각 동시 또는 연속 전달용의 별개 플라스미드내에 존재할 수 있다. 하나의 양태에서, 동시 전달이 사용될 수 있다.

본 발명의 하나의 양태에서, 성분 (i)을 암호화하는 누클레오티드 서열 및 성분 (ii)를 암호화하는 누클레오티드 서열은 하나 또는 동일한 폴리누클레오티드 분자내에 포함되거나 이루어진다.

대안적 양태에서, 성분 (i)을 암호화하는 누클레오티드 서열 및 성분 (ii)를 암호화하는 누클레오티드 서열은 동시 또는 연속 투여를 위한 상이한 누클레오티드 분자내에 포함되거나 이루어진 누클레오티드 서열에 의해 암호화된다.

동시 투여는 실질적으로 동시에 투여하는 것을 의미하는데; 즉, 성분들이 동일한 시간에 투여되거나, 그렇지 않을 경우 각각 서로 적어도 수분 내에 투여된다. 달리는, 성분들을 각각 서로 1분, 2분, 3분, 4분, 5분 또는 10분내에 투여한다. 하나의 치료 프로토콜에서, 항원 보강제 성분 (i) 및 (ii)는 면역원 (iii)을 암호화하는 누클레오티드 서열의 투여에 대해 실질적으로 동시에 투여한다. 명백하게는, 당해 프로토콜은 경우에 따라 변할 수 있다.

본 발명의 하나의 양태에서, 성분 (i)은 이미다조퀴놀린 또는 이의 유도체이며, 동시 또는 연속 투여를 위해 성분 (ii) 및 (iii)으로부터 별개 조성물로 제공된다. 하나의 양태에서, 이미다조퀴놀린 화합물 또는 이의 유도체는 연속적으로 , 즉 별개의 조성물로 성분 (ii) 및 (iii)의 투여 후 투여된다. 추가의 양태에서, 이미다조퀴놀린 화합물 또는 이의 유도체는 성분 (ii) 및 (iii)의 투여 후 2, 4, 6, 8, 12 또는 24시간 추에 제공된다. 하나의 양태에서, 이미다조퀴놀린 화합물 또는 이의 유도체는 성분 (ii) 및 (iii)의 투여 후 24시간 째 또는 약 24시간 째에 제공된다. 추가의 양태에서, 이미다조퀴놀린 화합물 또는 이의 유도체가 크림 제형으로서 국소 투여인 경우, 크림은 성분 (ii) 및 (iii)의 투여 후 24시간째에 적용된다. 본 발명의 대안적인 양태에서, 이미다조퀴놀린 화합물 또는 이의 유도체가 투여용 가용성 제형으로 제공되나, 예를 들어, 피하 투여에 한정되지 않는 경우, 이미다조퀴놀린 화합물 또는 이의 유도체는 성분 (ii) 및 (iii)의 투여 후 6 내지 24시간내에 투여될 수 있거나, 성분 (ii) 및 (iii)의 투여 후 다음 작업일에 투여될 수 있다. 성분 (ii) 및 (iii)은 금 비드상에 포장될 수 있으며 예를 들면, EP0500799에 기술된 바와 같이 "유전자 건(gene gun)"을 사용하여 입자 매개된 약물 전달을 사용하여 환자의 피부내로 투여된다.

본 발명의 추가의 양태에서, 인터페론(IFNγ)를 암호화하는 누클레오티드 서열이 또한 제공된다. IFNγ는 성분 (i), (ii) 또는 (iii)중 어느 것에 별개의 누클레오티드 서열로 제공될 수 있다. 성분 (i)이 TLR 효능제를 암호화하는 누클레오티드 서열인 본 발명의 양태에서, IFNγ는 하나 이상의 성분 (i), (ii) 또는 (iii)을 암호화하는 누클레오티드 서열내에 동시-암호화될 수 있다. 어떠한 나머지 성분들도 별개의 누클레오티드 서열내에 암호화될 수 있거나, 단일의 추가 누클레오티드 서열내에 동시-암호화될 수 있다.

하나의 양태에서, IFNγ는 성분 (ii) 및 (iii), 또는 성분 (ii) 및 (iii)을 암호화하는 누클레오티드 서열내에 암호화되며 IFNγ는 동일하거나 별개의 플라스미드 분자내에 암호화되고, 성분 (i)은 동시 또는 연속 투여를 위해 별개의 조성물로 제공된다. 예를 들어, 성분 (ii) 및 (iii)은 별개의 플라스미드 분자내에 암호화된다. 하나의 양태에서, 성분 (i)은 이미다조퀴놀린 분자 또는 이의 유도체, 예를 들면, 이미퀴모드일 수 있다.

본 발명의 추가의 양태에서, CD40 리간드(CD40L)를 암호화하는 누클레오티드 서열이 또한 제공된다. CD40L은 별개의 누클레오티드 서열로 성분 (i), (ii) 또는 (iii)중 어느 것에 제공될 수 있다. 성분 (i)이 TLR 효능제를 암호화하는 누클레오티드 서열인 본 발명의 양태에서, CD40L은 하나 이상의 성분 (i), (ii) 또는 (iii)을 암호화하는 누클레오티드 서열내에 동시-암호화될 수 있다. 나머지 성분중 어느 것도 별개의 누클레오티드 서열내에 암호화될 수 있거나, 또는 단일의 추가 누클레오티드 서열내에 동시-암호화될 수 있다.

하나의 양태에서, CD40L은 성분 (ii) 및 (iii), 또는 성분 (ii) 및 (iii)을 암호화하는 누클레오티드 서열내에 암호화되며 CD40L은 동일하거나 별개의 플라스미드 분자내에 암호화되고, 성분 (i)은 동시 또는 연속 투여를 위해 별개의 조성물로 제공된다. 예를 들어, 성분 (ii) 및 (iii), 및 CD40L은 별개의 플라스미드 분자내에 암호화된다. 하나의 양태에서, 성분 (i)은 이미다조퀴놀린 분자, 또는 이의 유도체, 예를 들면, 이미퀴모드일 수 있다.

본원에서 언급된 모든 누클레오티드 서열은 RNA 또는 DNA 서열일 수 있다. 또한, 모든 누클레오티드 서열은 플라스미드 DNA내에 포함되거나 플라스미드 DNA내에서 이루어질 수 있다.

성분 (ii) 및 (iii)이 동시 투여용으로 제공되는 양태에서, 성분 (ii) 및 (iii)을 암호화하는 누클레오티드를 포함하는 플라스미드는 동일한 세포내로 전달되거나, 또는 이웃하는 세포로 전달될 수 있다. 하나의 양태에서, 플라스미드가 이웃하는 세포로 전달되는 경우, 발현은, 성분들이 동일한 미세-환경내로 방출되도록 한다. 하나의 양태에서, 성분 (i)은 동시 또는 연속 전달용의 별개의 조성물로 제공된다. 추가의 양태에서, 전달은 동시이다. 대안적 양태에서, 성분 (i)은 성분 (ii) 및 (iii)의 전달 후 12 또는 24시간 전달동안 별개의 조성물로 제공된다. 성분 (i)의 전달은 성분 (ii) 및 (iii)의 전달과 동일한 부위에서 이루어질 수 있다. 동일한 부위는, 성분 (i)이 전달 부위의 15cm내, 5cm내, 1cm내에서 전달될 수 있음을 의미하거나, 또는 성분 (ii) 및 (iii)의 주사 부위에서 전달될 수 있음을 의미한다. 본 발명의 대안적 양태에서, 하나 이상의 성분은 상이한 주사 부위에서 전달될 수 있다. 하나의 양태에서, 성분들은 동일한 림프절 또는 림프절들내로 유출되는 부위로 모두 투여된다.

본 발명의 하나의 양태에서, (iii)을 암호화하는 누클레오티드 서열은 생체내에서 면역 반응을 상승시킬 수 있는 MUC-1 단백질 또는 이의 유도체를 암호화하며, 당해 면역 반응은 종양 세포 또는 종양을 발현하는 MUC-1을 인지할 수 있다.

본 발명의 추가의 양태에서, (iii)을 암호화하는 누클레오티드 서열은 생체내에서 면역 반응을 상승시킬 수 있는 P501S 단백질 또는 유도체를 암호화하며, 당해 면역 반응은 종양 세포 또는 종양을 발현하는 P501S를 인지할 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 면역원성 조성물 또는 조성물들, 및 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 백신 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 애쥬번트 성분 (i) 및 (ii)를 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 면역원 성분 (iii)을 혼합함을 포함하는 면역원성 조성물의 제조 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 본 발명은 애쥬번트 성분 (ii)과 면역원 성분 (iii)을 암호화하는 누클레오티드를 혼합하고, 애쥬번트 성분 (i) 또는 항원 보강제 성분 (i)을 암호화하는 누클레오티드 서열을 동시 또는 연속 투여용 별개 조성물을 제공함을 포함한다. 달리는, 당해 방법은 애쥬번트 성분 (ii)을 암호화하는 누클레오티드 분자와 면역원 성분 (iii)을 암호화하는 누클레오티드를 동시-암호화함으로써 단일의 폴리누클레오티드 분자를 형성시키고, 애쥬번트 성분 (i) 또는 애쥬번트 성분 (i)을 암호화하는 누클레오티드 서열을 동시 또는 연속 투여용의 별개 조성물로 제공함을 포함한다.

대안적 양태에서는, 성분 (i), (ii) 및 (iii)을 암호화하는 누클레오티드 서열이 동시 또는 연속 투여를 위해 별개의 폴리누클레오티드 분자내에 암호화시킨 방법이 제공된다. 추가의 양태에서, 2개의 성분 (i), (ii) 및 (iii)중 어느 것을 암호화하는 누클레오티드 서열이 동시-암호화되어 단일의 폴리누클레오티드 분자를 형성하고, 나머지 누클레오티드 서열이 동시 또는 연속 투여를 위해 추가의 폴리누클레오티드 서열내에서 암호화된 방법이 제공된다. 달리는, 성분 (i), (ii) 및 (iii)을 암호화하는 누클레오티드 서열은 동시-암호화되어 단일의 폴리누클레오티드 분자를 형성한다.

하나의 양태에서, 당해 방법에 사용된 누클레오티드 서열은 DNA이고, 당해 방법에 사용될 수 있는 누클레오티드는 플라스미드 DNA내에 암호화된다. 대안적 양태에서, 성분 (ii) 및 (iii)을 암호화하는 누클레오티드 분자가 플라스미드내에 혼입되고, 애쥬번트 성분 (i)이 동시 또는 연속 투여용의 별개 조성물로 제공되는 방법이 제공된다.

추가의 양태에서, 당해 방법은 또한 약제학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체내에 성분을 혼입시킴을 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 애쥬번트 성분 (i) 및 (ii); 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 면역원 성분 (iii); 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체를 포함하는 약제학적 조성물 또는 조성물들을 제공한다.

달리는, 본 발명은 본원에 기술된 면역원성 조성물 또는 조성물들, 및 약제학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체를 포함하는 약제학적 조성물 또는 조성물들을 제공한다.

본 발명은 또한 애쥬번트 성분 (ii); 면역원 성분 (iii), 및 약제학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담제를 포함하는 약제학적 조성물; 및 애쥬번트 성분 (i), 및 약제학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체를 포함하는 추가의 약제학적 조성물을 포함하는 키트를 제공하며, 여기서, 애쥬번트 성분 (i)은 TLR 효능제, 또는 TLR 효능제를 암호화하는 누클레오티드, GM-CSF를 암호화하는 누클레오티드를 포함하는 애쥬번트 성분 (ii); 및 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 면역원 성분 (iii)을 포함한다. 하나의 양태에서, 하나 이상의 담체는 금 비드이며 하나 이상의 약제학적 조성물을 입자 매개된 약물 전달에 의해 전달하도록 조정가능하다. 추가의 양태에서, 성분 (ii) 및 (iii)에 대한 담체는 금 비드이고 동시 또는 연속 투여용으로 제형화된다. 본 발명의 하나의 측면에서, 하나 이상의 성분 (ii) 및 (iii)을 암호화하는 누클레오티드 서열을 금 비드상에 포장함을 포함하는 방법을 제공한다. 본 발명의 하나의 양태에서, 성분들은 금 비드의 별개 집단위에 포장된 후, 당해 금 비드의 집단은 투여전에 합해진다. 다른 양태에서, 성분들은 금 비드의 동일한 집단위에 포장된다. 추가의 양태에서, 성분 (ii) 및 (iii)은 금 비드상에 포장되며, 성분 (i)은 동시 또는 연속 투여용의 별개 조성물로 제공된다.

본 발명은 또한 안전하고 유효한 양의 본원에 기술된 면역원성, 백신 또는 약제학적 조성물을 투여함으로써 종양을 지니거나 생길 위험이 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 치료할 종양은 MUC-1 또는 P501S 발현 종양이다. 치료될 종양은 유방 암종; 비-소세포 폐 암종을 포함하는 폐 암종; 또는 전립선, 위 및 기타 위장 암종일 수 있다.

본 발명은 또한 항원에 대한 포유동물의 면역 반응을 증가시키는 방법을 제공하며, 당해 방법은 포유 동물에게

(i) TLR 효능제, 또는 TLR 효능제를 암호화하는 누클레오티드;

(ii) GM-CSF를 암호화하는 누클레오티드; 및

(iii) 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 면역원 성분을 투여함을 포함한다.

하나의 양태에서, 당해 방법은 성분 (i), (ii) 및 (iii)중 어느 2개를 동시 투여하고, 나머지 성분을 연속 투여하는 것을 포함한다. 달리는, 당해 방법은 성분 (i), (ii) 및 (iii)을 연속 투여함을 포함한다. 추가의 양태에서, 동시 투여용 성분은 별개의 조성물로 제형화된다. 본 발명의 하나의 방법에서, 성분 (ii) 및 (iii)은 동시에 투여되고, 성분 (i)은 동시 또는 연속 투여용의 별개 조성물로 제공된다. 하나의 양태에서, 성분 (i)은 이미다조퀴놀린 또는 이의 유도체이다. 성분 (i)은 이미퀴모드이고 성분 (ii) 및 (iii)의 투여 부위에서 또는 투여 부위 근처에서 국소 투여용의 Aldara^TM 크림(3M) 형태로 제공될 수 있다.

본 발명은 또한 MUC-1 또는 P501S 발현 종양의 치료 또는 예방시 사용하기 위한 의약의 제조시 하기 성분 (i) 내지 (iii)을 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다:

(i) TLR 효능제, 또는 TLR 효능제를 암호화하는 누클레오티드;

(ii) GM-CSF를 암호화하는 누클레오티드; 및

(iii) MUC-1 또는 P501 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 면역원 성분.

본 발명은 또한 적절한 벡터내에 질병 상태와 연관된 항원성 펩티드를 암호화하는 누클레오티드 서열을 포유동물에게 투여하고; 추가로 적절한 벡터내에 GM-CSF를 암호화하는 누클레오티드 서열을 투여하며; 추가로 면역 반응을 상응시키기 위한 이미다조퀴놀린 또는 이의 유도체를 포유동물에게 투여함을 포함하여 질병 상태에 대해 포유동물에서 면역 반응을 상승시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 포유동물에게 적절한 벡터내에 면역 반응을 자극시키는데 효과적인 양의 면역원을 암호화하는 누클레오티드 서열 및 GM-CSF를 암호화하는 누클레오티드 서열을 투여하고 포유동물에게 면역 반응을 증가시키기에 효과적인 양의 이미다조퀴놀린 또는 이의 유도체를 추가로 투여하는 단계를 포함하여, 면역원에 대해 포유동물의 면역 반응을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 본원에 기술한 바와 같은 특정의 조성물을 투여하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 펩티드를 암호화하는 누클레오티드 서열을 포유동물에게 투여한 결과로서 발현되는 항원성 펩티드 또는 단백질에 의해 개시된 면역 반응을 증진시키기 위한 의약의 제조시 이미다조퀴놀린 또는 이의 유도체 및 GM-CSF의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한 누클레오티드 서열에 의해 암호화된 항원에 대한 면역 반응을 증진시키기 위한 의약의 제조시 하기 성분들 (i) 내지 (iii)의 용도를 제공한다:

(i) TLR 효능제, 또는 TLR 효능제를 암호화하는 누클레오티드;

(ii) GM-CSF를 암호화하는 누클레오티드; 및

(iii) 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 면역원 성분.

본 발명은 또한 누클레오티드 서열에 의해 암호화된 항원에 대한 면역 반응을 증진시키기 위해 포유동물에게 동시 또는 연속 투여하기 위한 2개 이상의 의약의 제조시 하기 성분 (i) 내지 (iii)의 용도를 제공한다:

(i) TLR 효능제, 또는 TLR 효능제를 암호화하는 누클레오티드;

(ii) GM-CSF를 암호화하는 누클레오티드; 및

(iii) 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 면역원 성분.

본 발명은 또한 누클레오티드 서열에 의해 암호화된 항원에 대한 면역 반응을 증진시키기 위해 포유동물에게 동시 또는 연속 투여하기 위한 의약의 제조시 다음 성분 (i) 내지 (iii)의 용도를 제공한다:

(i) TLR 효능제 또는 TLR 효능제를 암호화하는 누클레오티드;

(ii) GM-CSF를 암호화하는 누클레오티드; 및

(iii) 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 면역원 성분.

본원에 기술된 애쥬번트 조성물 또는 조성물들은 "초기(prime)" 및/또는 "초기-단독(prime-only)" 방법의 "부스트(boost)" 단계에서, 또는 "초기-부스트(prime-boost)" 시도에서 사용될 수 있다. 사용된 "초기-부스트" 시도는 2개의 핵산 백신을 포함할 수 있거나, 또는 2개의 명백한 백신 제제(하나는 핵산, 하나는 단백질)을 포함할 수 있다. "초기-부스트" 시도의 예는 문헌[참조: Barnett et al., Vaccine 15: 869-873 (1997)]에 기술되어 있으며, 여기서, 2개의 명백한 제제(하나는 DNA, 하나는 단백질)가 제조되어 상이한 시기에 및 특정 순서로 별도로 투여된다.

하나의 양태에서, 본원에 기술된 성분은 백신접종 방법의 "초기" 단계에서 사용된다.

발명의 상세한 설명

명세서 및 첨부된 청구의 범위를 통하여, 달리 언급되지 않는 한, 단어 "포함하다(comprise 및 include)" 및 "포함(comprising, comprises, including, includes)" 등과 같은 변형은 포함되는 것으로 고려되며, 즉 이러한 용어의 사용은 특별히 인용하지 않은 성분들 또는 정수를 가능한한 포함하는 것으로 의도될 것이다. 달리는, 본원의 용어 "포함", 및 "포함하다"는 모든 예에서 각각 용어 '로 이루어진(consisting of, consist of 및 consists of)'에 의해 임의 치환가능한 것으로 의도된다.

또한, 명세서 및 첨부된 청구의 범위를 통하여, 시험 데이타, 실시예 및 도면과 관련한 것을 제외하고는, 용어 "GM-CSF"은 모든 예에서 용어 "INFγ"에 의해, 또한 역으로 임의 치환가능하다. 본 발명의 하나의 양태에서, 성분 (ii)는 IFNγ를 암호화하는 누클레오티드 서열이고, 성분 (i)은 TLR-2, 4, 7 또는 8의 TLR 효능제일 수 있다.

상기 기술된 바와 같이, 본 발명은 면역원성 조성물, 백신 조성물, 백신접종 방법, 및 항원 단백질 또는 펩티드인 면역원을 암호화하는 누클레오티드 서열을 포유동물내로 도입함으로써 단백질 또는 펩티드를 포유동물 체내에서 발현시켜 항원 단백질 또는 펩티드에 대해 포유동물내에서 면역 반응을 유도함을 포함하는 백신접종의 개선 방법에 관한 것이다. 이러한 백신접종 방법은 잘 알려져 있으며 상기 언급한 도넬리(Donnelly) 등 및 에틀(Ertl) 등의 문헌에 상세히 기술되어 있다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 면역원성 조성물은

(i) TLR 효능제, 또는 TLR 효능제를 암호화하는 누클레오티드 서열;

(ii) GM-CSF를 암호화하는 누클레오티드 서열; 및

(iii) 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 면역원 성분의 조합물을 말하며, 여기서, 성분 (i) 및 (ii)는 작용적 상호-협동으로 작용하여 포유동물에서 면역원 성분 (iii)에 대한 면역 반응을 증강시킨다.

조합물은 예를 들면, 단일의 약제학적으로 허용되는 제형 또는 별개의 개개 성분의 형태의 3개 성분의 혼합물 형태, 예를 들면, 애쥬번트 성분 (i) 및 (ii)와 면역원 성분 (iii)(여기서, 3개의 성분은 별개의, 연속적인 또는 동시 투여용이다)을 포함하는 키트의 형태이다. 하나의 양태에서, 3개 성분의 투여는 동시에 이루어진다. 본 발명의 추가의 양태에서, 성분 (ii) 및 (iii)은 동시에 투여되며, 성분 (i)은 성분 (ii) 및 (iii)을 투여하기 전에 별개로 투여된다. 본 발명의 추가의 양태에서, 성분 (ii) 및 (iii)은 동시에 투여되고, 성분 (i)은 성분 (ii) 및 (iii)의 투여 후에 별개로 투여된다.

명세서 및 청구의 범위를 통해 언급된 것으로서 이미다조퀴놀린 또는 이의 유도체는 하기 화학식 I 내지 VI중 하나로 정의된 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염일 수 있다:

상기 화학식 I에서,

R₁₁은 직쇄 또는 측쇄 알킬, 하이드록시알킬, 아실옥시알킬, 벤질, (페닐)에틸 및 페닐로 이루어진 그룹 중에서 선택되고, 당해 벤질, (페닐)에틸 또는 페닐 치환기는 벤젠 환상에서 탄소수 1 내지 약 4의 알킬, 탄소수 1 내지 약 4의 알콕시 및 할로겐으로 이루어진 그룹 중에서 독립적으로 선택된 1개 또는 2개의 잔기로 임의 치환되며, 단, 벤젠 환이 2개의 잔기로 치환되는 경우, 당해 잔기는 함께 6개 이하의 탄소 원자를 함유하며; R₂₁은 수소, 탄소수 1 내지 약 8개의 알킬, 벤질, (페닐)에틸 및 페닐로 이루어진 그룹 중에서 선택되고, 당해 벤질, (페닐)에틸 또는 페닐 치환기는 벤젠 환상에서 탄소수 1 내지 4개의 알킬, 탄소수 1 내지 약 4개의 알콕시 및 할로겐으로 이루어진 그룹 중에서 독립적으로 선택된 1개 또는 2개의 잔기로 임의 치환되며, 단, 벤젠 환이 2개의 잔기로 치환되는 경우, 당해 잔기들은 함께 6개 이하의 탄소 원자를 함유하고; 각각의 R₁은 수소, 탄소수 1 내지 약 4개의 알콕시, 할로겐 및 탄소수 1 내지 약 4개의 알킬로 이루어진 그룹 중에서 독립적으로 선택되며; n은 0 내지 2의 정수이고, 단, n이 2인 경우, R₁₁ 그룹은 함께 6개 이하의 탄소 원자를 함유한다;

상기 식에서,

R₁₂는 탄소수 2 내기 약 10의 직쇄 또는 측쇄 알케닐 및 탄소수 2 내지 약 10의 직쇄 또는 측쇄 알케닐로 이루어진 그룹 중에서 선택되고, 여기서, 당해 치환기는 탄소수 1 내지 약 4의 직쇄 또는 측쇄 알킬 및 탄소수 3 내지 약 6의 사이클로알킬로 이루어진 그룹 중에서 선택되며; 사이클로알킬은 탄소수 1 내지 약 4의 직쇄 또는 측쇄 알킬로 치환된 3 내지 약 6개의 탄소 원자를 함유하며; R₂₂는 수소, 탄소수 1 내지 약 8의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 벤질, (페닐)에틸 및 페닐로 이루어진 그룹 중에서 선택되며, 당해 벤질, (페닐)에틸 또는 페닐 치환기는 벤젠 환에서 탄소수 1 내지 약 4개의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 탄소수 1 내지 약 4의 직쇄 또는 측쇄 알콕시 및 할로겐으로 이루어진 그룹 중에서 독립적으로 선택된 1개 또는 2개의 잔기로 임의 치환되며, 단, 벤젠 환이 이러한 2개의 잔기로 치환되는 경우, 당해 잔기는 함께 6개 이하의 탄소 원자를 함유하며; 각각의 R₂는 탄소수 1 내지 약 4의 직쇄 또는 측쇄 알콕시, 할로겐 및 탄소수 1 내지 약 4의 직쇄 또는 측쇄 알킬로 이 루어진 그룹 중에서 독립적으로 선택되고; n은 0 내지 2의 정수이며, 단, n이 2인 경우 R₂ 그룹은 함께 6개 이하의 탄소 원자를 함유한다;

상기 화학식 III에서,

R₂₃은 수소, 탄소수 1 내지 약 8의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 벤질, (페닐)에틸 및 페닐로 이루어진 그룹 중에서 선택되고, 당해 벤질, (페닐)에틸 또는 페닐 치환기는 벤젠 환상에서 탄소수 1 내지 약 4의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 탄소수 1 내지 약 4의 직쇄 또는 측쇄 알콕시 및 할로겐으로 이루어진 그룹 중에서 독립적으로 선택된 1개 또는 2개의 잔기로 임의 치환되고, 단, 벤젠 환이 이러한 2개의 잔기로 치환된 경우, 당해 잔기는 함께 6개 이하의 탄소 원자를 함유하고; 각각의 R₅는 탄소수 1 내지 약 4의 직쇄 또는 측쇄 알콕시, 할로겐 및 탄소수 1 내지 약 4의 직쇄 또는 측쇄 알킬로 이루어진 그룹 중에서 독립적으로 선택되며; n은 0 내지 2의 정수이고, 단, n이 2인 경우 R₃ 그룹은 함께 6개 이하의 탄소 원자를 함유한다;

상기 화학식 IV에서,

R₁₄는 -CHR_AR_B(여기서, R_B는 수소 또는 탄소-탄소 결합이고, 단, R_B가 수소인 경우 R_A는 탄소수 1 내지 4의 알콕시, 탄소수 1 내지 약 4의 하이드록시알콕시, 탄소수 2 내지 약 10의 1-알키닐, 테트라하이드로피라닐, 알콕시알킬(여기서, 알콕시 잔기는 1 내지 약 4개의 탄소 원자를 함유하고 알킬 잔기는 1 내지 약 4개의 탄소 원자를 함유한다), 2-, 3- 또는 4-피리딜이고, 단, R_B가 탄소-탄소 결합인 경우 R_B 및 R_A는 함께 하이드록시 및 탄소수 1 내지 약 4의 알킬로 이루어진 그룹 중에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환된 테트라하이드로푸라닐 그룹을 형성하며; R₂₄는 수소, 탄소수 1 내지 4의 알킬, 페닐 및 치환된 페닐로 이루어진 그룹 중에서 선택되며, 여기서, 당해 치환기는 탄소수 1 내지 약 4개의 알킬, 탄소수 1 내지 약 4개의 알콕시 및 할로겐으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고; R₄는 수소, 탄소수 1 내지 약 4개의 직쇄 또는 측쇄 알콕시, 할로겐 및 탄소수 1 내지 약 4개의 직쇄 또는 측쇄 알킬로 이루어진 그룹 중에서 선택된다;

상기 화학식 V에서,

R₁₅는 수소, 탄소수 1 내지 약 10의 직쇄 또는 측쇄 알킬 및 탄소수 1 내지 약 10의 치환된 직쇄 또는 측쇄 알킬(여기서, 당해 치환기는 탄소수 3 내지 약 6의 사이클로알킬 및 탄소수 1 내지 약 4의 직쇄 또는 측쇄 알킬에 의해 치환된 3개 내지 약 6개의 탄소 원자를 함유하는 사이클로알킬로 이루어진 그룹 중에서 선택된다), 탄소수 2 내지 약 10의 직쇄 또는 측쇄 알케닐 및 탄소수 2 내지 약 10의 치환된 직쇄 또는 측쇄 알케닐(여기서, 당해 치환기는 탄소수 3 내지 약 6의 사이클로알킬 및 탄소수 1 내지 약 4의 직쇄 또는 측쇄 알킬로 치환된 탄소수 3 내지 약 6의 사이클로알킬이다), 탄소수 1 내지 약 6의 하이드록시알킬, 알콕시 잔기가 1 내지 약 4개의 탄소 원자를 함유하고 알킬 잔기가 1 내지 약 6개의 탄소 원자를 함유하는 알콕시알킬, 아실옥시알킬(여기서, 아실옥시 잔기는 탄소수 2 내지 약 4의 알카노일옥시 또는 벤조일옥시이고 알킬 잔기는 1 내지 약 6개의 탄소 원자를 함유 한다), 벤질, (페닐)에틸 및 페닐[여기서, 벤질, (페닐)에틸 또는 페닐 치환기는 벤젠 환상에서 탄소수 1 내지 약 4의 알킬, 탄소수 1 내지 약 4의 알콕시 및 할로겐으로 이루어진 그룹 중에서 독립적으로 선택된 1개 또는 2개의 잔기로 임의 치환된다]로 이루어진 그룹 중에서 선택되고, 단, 벤젠 환이 2개의 잔기로 치환된 경우, 당해 잔기들은 함께 6개 이하의 탄소 원자를 함유하며;

R₂₅는 화학식

[여기서, R_X 및 R_Y는 수소, 탄소수 1 내지 약 4의 알킬, 페닐 및 치환된 페닐로 이루어진 그룹 중에서 독립적으로 선택되며, 여기서, 당해 치환기는 탄소수 1 내지 약 4의 알킬, 탄소수 1 내지 약 4의 알콕시 및 할로겐으로 이루어진 그룹 중에서 선택되고; X는 탄소수 1 내지 약 4의 알콕시, 알콕시 잔기가 1 내지 약 4개의 탄소 원자를 함유하며 알킬 잔기가 1 내지 약 4개의 탄소 원자를 함유하는 알콕시알킬, 탄소수 1 내지 약 4의 할로알킬, 알킬 그룹이 1 내지 약 4개의 탄소 원자, 아미노, 치환된 아미노(여기서, 치환기는 알킬 또는 탄소수 1 내지 약 4의 하이드록시알킬이다), 아지도, 탄소수 1 내지 약 4의 알킬티오로 이루어진 그룹 중에서 선택된다]이고; R₅는 수소, 탄소수 1 내지 약 4개의 직쇄 또는 측쇄 알콕시, 할로겐 및 1 내지 약 4개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄 또는 측쇄 알킬로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.

알킬 그룹은 C₁-C₄ 알킬, 예를 들면, 메틸, 에틸, 프로필, 2-메틸프로필 및 부틸일 수 있다. 알킬 그룹은 메틸, 에틸 및 2-메틸-프로필일 수 있다. 알콕시 그룹은 메톡시, 에톡시 및 에톡시메틸일 수 있다.

위에서 인용한 화합물 및 이의 제조 방법은 PCT 특허원 공보 WO 94/17043에 기술되어 있다.

예를 들어, n이 0, 1 또는 2일 수 있는 경우, n은 0 또는 1일 수 있다.

상기 치환기 R₁ 내지 R₅는 본원에서 "벤조 치환기"로 일반적으로 정의된다. 벤조 치환기는 수소일 수 있다.

상기 치환기 R₁₁ 내지 R₁₅는 일반적으로 본원에서 "1-치환기"로 지정한다. 1-치환기는 2-메틸프로필 또는 2-하이드록시-2-메틸프로필일 수 있다.

상기 치환기 R₂₁ 내지 R₂₅는 본원에서 일반적으로 "2-치환기"로 지정된다. 2-치환기는 수소, 탄소수 1 내지 6의 알킬, 알콕시 잔기가 1 내지 약 4개의 탄소 원자를 함유하고 알킬 잔기가 1 내지 약 4개의 탄소 원자를 함유하는 알콕시알킬이다. 2-치환기는 수소, 메틸 또는 에톡시메틸일 수 있다.

1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민은 하기 화학식 VI의 화합물, 또는 경우에 따라 상기 화합물 중 어느 것의 생리학적으로 허용되는 염일 수 있다:

상기 화학식 VI에서,

R_t는 수소, 탄소수 1 내지 약 4의 직쇄 또는 측쇄 알콕시, 할로겐 및 탄소수 1 내지 약 4의 직쇄 또는 측쇄 알킬이고;

R_u는 2-메틸프로필 또는 2-하이드록시-2-메틸프로필이며;

R_V는 수소, 탄소수 1 내지 약 6의 알킬, 또는 알콕시 잔기가 1 내지 약 4개의 탄소 원자를 함유하고 알킬 잔기가 1 내지 약 4개의 탄소 원자를 함유하는 알콕시알킬이다.

화학식 VI에서, R_t는 수소일 수 있고, R_u는 2-메틸프로필 또는 2-하이드록시-2-메틸프로필이며, R_V는 수소, 메틸 또는 에톡시메틸일 수 있다.

1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민은 다음 화합물 및 이의 생리학적으로 허용되는 염을 포함할 수 있다:

1-(2-메틸프로필)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민(R_t가 수소이고, R_u가 2- 메틸프로필이며 R_v가 수소인 화학식 VI의 화합물);

1-(2-하이드록시-2-메틸프로필)-2-메틸-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민(R_t가 수소이고, R_u가 2-하이드록시-2-메틸프로필이며, R_v가 메틸인 화학식 VI의 화합물);

1-(2-하이드록시-2-메틸프로필)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민(R_t가 수소이고, R_u가 2-하이드록시-2-메틸프로필이며, R_v가 수소인 화학식 VI의 화합물) 및

1-(2-하이드록시-2-메틸프로필)-2-에톡시메틸-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민(R_t가 수소이고, R_u가 2-하이드록시-2-메틸프로필이며, R_v가 에톡시메틸인 화학식 VI의 화합물).

질병 상태

본원에 따른 백신접종 방법 및 조성물을 예를 들면, 바이러스, 세균 또는 기생충 감염, 암, 알레르기 및 자가면역 질환과 같은 각종의 질병 상태에 대해 포유동물을 보호 또는 치료하는데 적용시킬 수 있다. 본 발명에 따른 방법 또는 조성물을 사용하여 치료하거나 보호할 수 있는 질환 또는 질병 상태의 일부 특정 예는 다음과 같다:

바이러스 감염

A형, B형, C형, D형 및 E형 간염 바이러스, HIV, 헤르페스 바이러스 1, 2, 6 및 7, 사이토메갈로바이러스, 바리셀라 조스터 바이러스, 유두종 바이러스, 엡슈타 인 바르 바이러스(Epstein Barr virus), 인플루엔자 바이러스, 파라-인플루엔자 바이러스, 아데노바이러스, 콕사키에 바이러스(coxsakie viruse), 피코르나 바이러스(picorna virus), 로타바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 폭스 바이러스, 리노바이러스(rhinoviruse), 루벨라 바이러스(rubella virus), 파포바이러스(papovirus), 볼거리 바이러스, 풍진 바이러스.

세균 감염

TB 및 나병 유발 마이코박테리아, 뉴모키(pneumocci), 호기성 그람 음성 바실러스, 미코플라스마, 스타필로코커스 감염, 스트렙토코커스 감염, 살모넬라, 클라미디아에(chlamydiae).

기생충 감염

말라리아, 리슈만편모충증, 파동편모충증, 톡소포자충증, 주혈흡충증, 사상충증

암

유방암, 결장암, 직장암, 두부 및 경부암, 신장암, 악성 흑색종, 후두 암, 난소 암, 경부 암, 전립선 암.

알레르기

집 먼지 진드기, 꽃가루 및 기타 환경 알레르기 항원에 기인한 비염.

자가면역 질환

전신홍반루프스

하나의 양태에서, 본 발명의 벙법 또는 조성물은 바이러스 목, B형 간염, C 형 간염, 사람 유두종 바이러스, 사람 면역결핍 바이러스 또는 단순 헤르페스 바이러스; 세균 질병 TB; 유방, 결장, 난소, 자궁경부 및 전립선 암; 또는 천식, 류마치스 관절염 및 알츠하이머의 자가면역 질병에 대해 보호하거나 이들을 치료하는데 사용된다.

이러한 특정 질병 상태는 단지 실시예로써 언급되며, 및 본 발명의 영역을 한정하는 것으로 의도되지 않는다는 것이 인지되어야 한다.

항원 또는 면역원

항원 반응을 유도하기 위하여 포유동물 시스템내에서 발현될 항원 또는 면역원을 암호화하는, 본원에서 언급된 성분 (iii)의 누클레오티드 서열은 전체 단백질, 또는 항원 반응을 개시할 수 있는 보다 짧은 펩티드 서열을 암호화할 수 있다. 본 명세서 및 첨부된 청구의 범위를 통하여, 어구 "항원성 펩티드" 또는 "면역원"은 관련 동물내에서 면역 반응을 유도할 수 있는 모든 펩티드 또는 단백질 서열을 포함하는 것으로 의도된다. 그러나, 하나의 양태에서, 누클레오티드 서열은 질병 상태와 연관된 전체 단백질을 암호화할 것이며, 이는 동물 시스템내 전체 단백질의 발현이 천연 항원 발현을 모사함으로써 완전한 면역 반응을 유발하기 때문이다. 특정 질병 상태와 관련하여 공지된 항원성 펩티드의 일부 비-제한적 예는 다음을 포함한다:

사람 병원체에 대해 면역 반응을 유발할 수 있는 항원, 당해 항원 또는 항원 조성물은 HIV-1(예: tat, nef, gp120 또는 gp160, gp40, p24, gag, env, vif, vpr, vpu, rev), 사람 헤르페스 바이러스, 예를 들면, gH, gL, gM, gB, gC, gK, gE 또는 gD, 또는 이의 유도체, 또는 이미디에이트 얼리 단백질(Immediate Early protein), 예를 들면, ICP27, ICP 47, ICP 4, HSV1 또는 HSV2로 부터의 ICP36, 사이토메갈로바이러스, 특히 사람(예: gB 또는 이의 유도체), 엡슈타인 바르 바이러스(예: gp350 또는 이의 유도체), 바리셀라 조스터 바이러스(예: gpl, II, III 및 IE63), 또는 B형 간염 바이러스(예 B형 간염 표면 항원 또는 간염 코어 항원 또는 pol), C형 간염 바이러스 항원 및 E형 간염 바이러스 항원와 같은 간염 바이러스, 또는 기타 바이러스 병원체, 예를 들면, 파라믹소바이러스: 호흡기 세포융합 바이러스(예: F 및 G 단백질 또는 이의 유도체), 또는 파라인플루엔자 바이러스, 풍진 바이러스, 볼거리 바이러스, 사람 유두종 바이러스(예: HPV6, 11, 16, 18, eg L1, L2, E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7), 플라비바이러스(예: 황열병 바이러스, 뎅기 바이러스(Dengue Virus), 진드기매개 뇌염 바이러스, 일본 뇌염 바이러스) 또는 인플루엔자 바이러스 세포(예를 들면, HA, NP, NA, 또는 M 단백질, 또는 이의 조합물), 엔. 고노레아(N. gonorrhea) 및 엔. 메닌기티디스(N. meningitidis)를 포함하는 나이세리아 아종(Neisseria spp.)과 같은 세균 병원체로부터 기원한 항원(예를 들면, 트랜스페린-결합 단백질, 락토페린 결합 단백질, PilC, 에데신); 에스. 피오게네스(S. pyogenes)(예를 들면, M 단백질 또는 이의 단편, C5A 프로테아제), 에스. 아갈라티아에(S. agalactiae), 에스. 뮤탄스(S. mutans); 에이치. 듀크레이(H. ducreyi); 브란하멜라 카타랄리스(Branhamella catarrhalis)로 또한 공지된 엠. 카타랄리스(M. catarrhalis)를 포함하는 모락셀라 아종(Moraxella spp.)(예를 들면, 고 및 저 분자량 아데신 및 인바신); 비 페르투시스(B. pertussis)를 포함하는 보 르데텔라 아종(Bordetella spp.)(예: 페르탁신, 페르투시스 독소 또는 이의 유도체, 선형 헤마글루티닌(filamenteous hemagglutinin), 아데닐레이트 사이클라제, 핌브리아에), 비. 파라페르투시스(B. parapeltussis) 및 비. 브론키셉티카(B. bronchiseptica); 엠. 투베르쿨로시스(M. tuberculosis)를 포함하는 마이코박테리움 아종(Mycobacterium spp.)(예: ESAT6, 항원 85A, -B 또는 -C, MPT 44, MPT59, MPT45, HSP10, HSP65, HSP70, HSP 75, HSP90, PPD 19kDa [Rv3763], PPD 38kDa [Rv0934] ), 엠. 보비스(M. bovis), 엠. 레프라에(M, leprae), 엠. 아비움(M. avium), 엠. 파라투베르쿨로시스(M. paratuberculosis), 엠. 스메그마티스(M. smegmatis)를 포함하는 마이코박테리움 아종; 엘. 뉴모필라(L. pneumophila)를 포함하는 레지오넬라 아종(Legionella spp.); 장독소 대장균(enterotoxic E. coli)를 포함하는 에스체리치아 아종(Escherichia spp.)(예: 집락형성 인자, 열 민감 독소 또는 이의 유도체, 열안정 독소 또는 이의 유도체), 창자출혈 대장균(enterohemorragic E. coli), 창자병원성 대장균(enteropathogenic E. coli)(예: 시가 독소형 독소(shiga toxin-like toxin) 또는 이의 유도체); 비. 콜레라(V. cholera)(예: 콜레라 독소 또는 이의 유도체)를 포함하는 비브리오 아종; 에스. 손네이(S. sonnei), 에스 다이센테리아에(S. dysenteriae), 에스. 플렉스네리(S. flexnerii)를 포함하는 시겔라 아종(Shigella spp); 와이. 엔테로콜리티카(Y. enterocolitica)(예: Yop 단백질), 와이. 페스티스(Y. pestis), 와이. 슈도투베르쿨로시스(Y. pseudotuberculosis)를 포함하는 에르시니아 아종(Yersinia spp.); 씨. 제주니(C. jejuni)(예: 독소, 아데신 및 인바신) 및 씨. 콜라이(C. coli)를 포함 하는 캄필로박터 아종(Campylobacter spp.); 에스. 티피(S. typhi), 에스. 파라티피(S. paratyphi), 에스. 콜레라에수이스(S. choleraesuis), 에스. 엔테리티디스(S. enteritidis)를 포함하는 살모넬라 아종(Salmonella spp.); 엘. 모노사이토게네스(L. monocytogenes)를 포함하는 리스테리아 아종(Listeria spp.); 에이치. 파이로리(H. pylori)를 포함하는 헬리코박터 아종(Helicobacter spp.)(예: 우레아제, 카탈라제, 공포성 독소(vacuolating toxin)); 피. 아에루기노사(P. aeruginosa)를 포함하는 슈도모나스 아종(Pseudomonas spp.); 에스. 아우레우스(S. aureus), 에스. 에피더미디스(S. epidermidis)를 포함하는 스타필로코쿠스 아종(Staphylococcus spp.); 이. 파에칼리스(E. faecalis), 이. 파에슘(E. faecium)을 포함하는 엔테로코쿠스 아종(Enterococcus spp.); 씨. 테타니(C. tetani)(예: 테타누스 독소 및 이의 유도체), 씨. 보툴리늄(예: 보툴리늄 독소 및 이의 유도체), 씨. 디피킬(C. difficile)(예; 클로스트리디움 독소 A 또는 B 및 이의 유도체)를 포함하는 클로스트리디움 아종(Clostridium spp.); 비. 안트라키스(B. anthracis)(예: 보툴리늄 독소 및 이의 유도체)를 포함하는 바실루스 아종(Bacillus spp.); 씨. 디프테리아에(C. diphtheriae)(예: 디프테리아 독소 및 이의 유도체)를 포함하는 코리네박테리움 아종(Corynebacterium spp.); 비. 부르그도르페리(B. burgdorferi)(예: OspA, OspC, DbpA, DbpB), 비. 가리니(B, garinii)(예: OspA, OspC, DbpA, DbpB), 비. 아프젤리(B. afzelii)(예: OspA, OspC, DbpA, DbpB), 비. 안데소니(B. andersonii)(예: OspA, OspC, DbpA, DbpB), 비. 헤름시(B. hermsii)를 포함하는 보렐리아 아종(Borrelia spp.); 이. 에퀴(E. equi) 및 사람 과립세포 에 를리히증(Human Granulocytic Ehrlichiosis)의 제제를 포함하는 에를리키아 아종(Ehrlichia spp.); 알. 리케치(R. rickettsii)를 포함하는 리케챠 아종(Rickettsia spp.); 씨. 트라코마티스(C. trachomatis)(예: MOMP, 헤파린 결합 단백질), 씨. 뉴모니아에(C. pneumoniae)(예: MOMP, 헤파린 결합 단백질), 시 프시타키(C. psittaci)를 포함하는 클라미디아 아종(Chlamydia spp.); 엘. 인테로간스(L. interrogans)를 포함하는 렙토스피라 아종(Leptospira spp.); 티. 팔리둠(예: 드믄 외막 단백질), 티. 덴티콜라(T. denticola), 티, 효디센테리아에(T hyodysenteriae)를 포함하는 트레포네마 아종(Treponema spp.); 또는 피. 팔키파룸(P. falciparum)을 포함하는 플라스모디움 아종(Plasmodium spp.); 티. 곤디(T. gondii)(예: SAG2, SAG3, Tg34)를 포함하는 톡소플라스마 아종(Toxoplasma spp.);이. 히스톨리티카(E. histolytica)를 포함하는 엔타모에바 아종(Entamoeba spp.); 비. 미크로티(B. microti)를 포함하는 바베시아 아종(Babesia spp.); 티. 크루지(T. cruzi)를 포함하는 트리파노소마 아종(Trypanosoma spp.); 지. 람블리아(G. lamblia)를 포함하는 지아르디아 아종(Giardia spp.); 엘. 마이오(L. major)를 포함하는 레이슈마니아 아종(leishmania spp.); 피. 카리니(P. carinii)를 포함하는 뉴모키스티스 아종(Pneumocystis spp.); 티. 바기날리스(T. vaginalis)를 포함하는 트리코모나스 아종(Trichomonas spp.); 에스. 만소니(S. mansoni)를 포함하는 스키소스토마 아종(Schisostoma spp.)과 같은 기생충, 또는 시. 알비칸스(C. albicans)를 포함하는 칸디다 아종(Candida spp.); 씨. 네오포르만스(C. neoformans)를 포함하는 크립토코쿠스 아종(Cryptococcus spp.)과 같은 효모로부터 기원한다.

엠. 투베르쿨로시스(M. tuberculosis)에 대한 기타 특이적인 항원은 예를 들면, Rv2557, Rv2558, RPFs : Rv0837c, Rv1884c, Rv2389c, Rv2450, Rv1009, aceA (Rv0467), PstS1, (Rv0932), SodA (Rv3846), Rv2031c 16kDal., Tb Ra12, Tb H9, Tb Ra35, Tb38-1, Erd 14, DPV, MTI, MSL, mTTC2 및 hTCC1(WO 99/51748)를 포함한다. 엠. 투베르쿨로시스(M. tuberculosis)에 대한 단백질은 또한 융합 단백질 및 이의 변이체를 포함하며, 여기서, 엠. 투베르쿨로시스(M. tuberculosis)의 2개 또는 3개의 폴레펩티드는 거대한 단백질내로 융합된다. 융합은 Ra12-TbH9-Ra35, Erd14-DPV-MTI, DPV-MTI-MSL, Erd14-DPV-MTI-MSL-mTCC2, Erd14-DPV-MTI-MSL, DPV-MTI-MSL-mTCC2, TbH9-DPV-MTI (WO 99/51748)를 포함한다.

하나의 양태에서, 클라미디아에 대한 항원은 예를 들면, 고 분자량 단백질(HWMP)(WO 99/17741), ORF3 (EP 366412), 및 잠정 막 단백질(Pmps)을 포함한다. 백신 제형의 다른 클라미디아 항원은 WO 99/28475에 기술된 그룹 중에서 선택될 수 있다.

하나의 양태에서, 세균 백신은 에스. 뉴모니아에(S. pneumoniae)를 포함하는 스트렙토코쿠스 아종(Streptococcus spp.)(PsaA, PspA, 스트렙톨라이신, 콜린-결합 단백질) 및 단백질 항원 뉴몰라이신(참조: Biochem Biophys Acta, 1989, 67, 1007; Rubins et al., Microbial Pathogenesis, 25, 337-342), 및 이의 돌연변이체 해독 변이체(WO 90/06951; WO 99/03884)로부터 기원한 항원을 포함한다. 다른 세균 백신은 에이치. 인플루엔자 B형(H. influenzae type B)(예: PRP 및 이의 컨쥬게이트), 비 타이피어블 에이치. 인플루엔자를 포함하는 해모필루스 아종으로부터 기원한 항원, 예를 들면, OMP26, 고 분자량 아데신, P5, P6, 단백질 D 및 지질단백질 D, 및 핌브린 및 핌브린 기원 펩티드(US 5,843,464) 또는 다중 복사 변이체 또는 이의 융합 단백질을 포함한다.

본 발명에서 사용될 수 있는 항원은 또한 말라리아를 유발하는 기생충으로부터 기원한 항원을 포함할 수 있다. 예를 들어, 플라스모디아 팔키파룸(Plasmodia falciparum)으로부터의 항원은 RTS, S 및 TRAP를 포함한다. RTS는 B형 간염 표면 항원의 프레 S2 부위의 4개의 아미노산을 통해 B형 간염 바이러스의 표면(S) 항원에 결합된 피. 팔키파룸의 포자소체항원(CS) 단백질의 C-말단 부분 모두를 실질적으로 포함하는 하이브리드 단백질이다. 이의 전체 구조는 영국 특허원 제9124390.7호로부터의 우선권을 청구하고 있는 WO93/10152하에 공지된 국제 특허원 제PCT/EP92/02591호에 기술되어 있다. 효모 RTS에서 발현되는 경우 지질단백질 입자로서 생산되며, HBV로부터의 S 항원과 함께 발현되는 경우 이는 RTS,S로서 공지된 혼합 입자를 생산한다. TRAP 항원은 WO90/01496하에 발표된 국제 특허원 제PCT/GB89/00895호에 기술되어 있다. 본 발명의 양태는, 항원 제제가 RTS, S 및 TRAP 항원의 조합물을 포함하는 말라리아 백신이다. 다단계 말라리아 백신의 성분이 되는 후보물인 다른 클라스모디아 항원은 피. 파시파룸(P. faciparum) MSP1, AMA1, MSP3, EBA, GLURP, RAP1, RAP2, 세퀴스트린, PfEMP1, Pf332, LSA1, LSA3, STARP, SALSA, PfEXP1, Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfs16, Pfs48/45, Pfs230 및 플라스모디움 아종에서 이들의 유사체이다.

본 발명은 항-종양 항원의 용도를 고려하며 암의 면역치료에 유용하다. 예 를 들어, 전립선, 유방, 결직장, 폐, 췌장, 신장 또는 흑색종 암에 대한 것들과 같은 종양 거부 항원을 고려한다. 예시적인 항원은 MAGE 1, 3 및 MAGE 4 또는 W099/40188에 기술된 바와 같은 기타 MAGE 항원, PRAME, BAGE, Lage(또한 NY Eos 1으로서 공지됨) SAGE 및 HAGE(WO 99/53061) 또는 GAGE(참조: Robbins and Kawakami, 1996, Current Opinions in Immunology 8, pps 628-636; Van den Eynde et al., International Journal of Clinical & Laboratory Research (submitted 1997); Correale et al. (1997), Journal of the National Cancer Institute 89, p293)를 포함한다. 또한 이들 항원은 흑색종, 폐암종, 육종 및 방광암종과 같은 광범위한 종양 유형에서 발현된다.

본 발명에서 사용하기 위한 MAGE 항원은 발현 증진인자 또는 면역학적 융합 파트너로서 발현될 수 있다. 특히, Mage 단백질은 B형 해모필루스 인플루엔자로부터의 단백질 D에 융합될 수 있다. 특히, 융합 파트너는 단백질 D의 처음 1/3을 포함할 수 있다. 이러한 작제물은 W099/40188에 기술되어 있다. 암 특이적인 에피토프를 함유할 수 있는 융합 단백질의 다른 예는 bcr/abl 융합 단백질을 포함한다.

하나의 양태에서, 전립선 특이적인 항원(PSA), PAP, PSCA(참조: PNAS 95 (4) 1735-1740 1998), PSMA 또는 프로스타제로 공지된 항원과 같은 전립선 항원이 이용된다.

프로스타제는 254 아미노산 길이의, 보존된 세린 프로테아제 촉매 트리아드 H-D-S 및 아미노 말단 프레-프로펩티드 서열을 지님으로써 잠정적인 분비 기능[참조: P. Nelson, Lu Gan, C. Ferguson, P. Moss, R. Gelinas, L. Hood & K. Wand, "Molecular cloning and characterisation of prostase, an androgen-regulated serine protease with prostate restricted expression, In Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999) 96,3114-3119]을 나타내는 전립선 특이적 세린 프로테아제(트립신 형)이다. 추정적인 글리코실화 부위가 기술되어 있다. 예측 구조는 다른 공지된 세린 프로테아제와 매우 유사하며, 성숙한 폴리펩티드가 단일의 도메인내로 폴딩됨을 나타낸다. 성숙한 단백질은 224 아미노산 길이이고 하나의 A2 에피토프는 천연적으로 프로세싱되는 것으로 밝혀졌다.

프로테아제 누클레오티드 서열 및 유추된 폴리펩티드 서열 및 유사체는 퍼구슨(Ferguson) 등의 문헌(참조: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96, 3114-3119) 및 국제 특허원 WO 98/12302(및 또한 상응하는 승인된 특허 US 5,955,306), WO 98/20117(및 또한 상응하는 승인된 특허 US 5,840,871 및 US 5,786,148) (전립선 특이적인 칼리크레인) 및 WO 00/04149 (P703P)에 기술되어 있다.

본 발명은 프로스타제 단백질 및 이의 단편과 유사체("유도체")를 기본으로 하는 프로스타제 단백질 융합체를 포함하는 항원을 제공한다. 이러한 유도체는 전립선 종양의 치료에 적합한 치료학적 백신 제형에서 사용하기에 적합하다. 통상적으로, 당해 단편은 상기 언급된 특허 및 특허원에 기술된 바와 같이 적어도 20, 50 또는 100개의 인접한 아미노산을 함유할 것이다.

추가의 전립선 항원은 P501S, 본원에 참조로 인용된 W098/37814의 서열 113으로 알려져있다. P501S은 세포 표면 수용체와 상호작용하는 막 단백질이다. 이는 단백질의 전체 길이에 연장되어 있는 9 내지 11개의 막전위 영역을 지닌 IIIa형 혈장 막으로 추정된다. P501S는 시금치 당 결합 단백질과 일부 상동성을 공유한다(참조: Riesmeier JW, Willmitzer L, Frommer WB, 1992, EMBO J 11,4705-13).

인접한 및 부분적으로 오버랩된 P501S cDNA 단편 및 이에 의해 암호화된 폴리펩티드, 더욱 특히 255개 아미노산 길이의 C-말단 단편이 기술되어 있다(WO 98/50567). WO 99/67384에 기술된 231개 아미노산 길이의 펩티드는 강력한 막전위 도메인, 2개의 강력한 카제인 키나제 II 포스포릴화 부위, 하나의 강력한 단백질 키나제 C 포스포릴화 부위 및 전위 세포 부착 서열을 포함하는 것으로 보고되어 있다.

P501S 및 이의 작제물은 또한 본원에 참조로 인용된 US 6,329,505에 기술되어 있다. 상기 언급된 특허원에 기술된 적어도 20, 50 또는 인접한 아미노산을 포함하는, 면역원 단편 및 이의 유전자에 의해 암호화된 부위가 고려된다. 특정 단편은 PS108이다(본원에 참조로 인용된 WO 98/50567).

다른 전립선 특이적 항원은 WO98/37418, 및 WO/004149에 공지되어 있다. 다른 것은 문헌(참조: STEAP PNAS 96 14523 14528 7-12 1999)에 공지되어 있다.

본 발명에 유용한 다른 종양 관련 항원은 Plu-1(참조: J Biol. Chem 274 (22) 15633-15645, 1999), HASH-1, HasH-2, 크립토(Cripto)(참조: Salomon et al Bioessays 199, 21 61-70, 미국 특허 5654140) 크립틴(참조: US 특허 5981215)를 포함한다. 또한 암의 치료요법에서 백신과 특히 관련된 항원은 또한 타이로시나제 및 수르비빈을 포함한다.

본 발명은 또한 Muc-1, Muc-2, EpCAM, her 2/Neu, 맘마글로빈(참조: US5,668,267) 또는 WO00/52165, W099/33869, W099/19479, W098/45328에 기술된 것들과 같은 유방암 항원과의 조합시 유용하다.

내피 세포 뮤신 MUC-1(에피시알린 또는 다형태 내피 뮤신, PEM)은 많은 내피 세포상에서 발현된 거대 분자량 당단백질이며, 이는 W001/46228 및 W003/100060에 기술되어 있다.

하나의 양태에서, 성분 (iii)은 어떠한 반복 단위(완전하거나 완전하지 않은)도 결여하고 있는 MUC-1 단백질 또는 유도체를 암호화한다. 추가의 양태에서, MUC-1 단백질 또는 유도체는 완전한 반복 단위만을 결여하고 있다. 추가의 양태에서, MUC-1 단백질 또는 유도체는 1개 내지 15개의 반복 단위; 7개의 완전한 반복 단위를 함유한다.

본 발명의 양태에서, MUC-1 유도체는 야생형 MUC-1으로부터 코돈-개질될 수 있다. 특히, 완전하지 않은 반복 영역을 적어도 0.6, 또는 적어도 0.65의 RSCU(상대적인 동일 코돈 용도)를 지닐 수 있다. MUC-1 단백질 또는 유도체의 완전하지 않은 반복 단위를 암호화하는 누클레오티드 서열은 85% 미만 또는 80% 미만의 상응하는 반복되지 않은 영역에 걸쳐 야생형 MUC-1 DNA와 관련하여 동일성 레벨을 지닐 수 있다. DNA 코드는 4개의 문자(A, T, C 및 G)를 지니며 유기체의 유전자내 암호화된 아미노산 단백질을 나타내는 3개의 문자 "코돈"을 나타내기 위해 이들을 사용한다. DNA 분자를 따라 코돈의 선형 서열은 이들 유전자가 암호화한 단백질에서 아미노산의 선형 서열내로 해독된다. 코드는 20개의 천연 아미노산을 암호화하는 61개의 코돈 및 "정지" 신호를 나타내는 3개의 코돈으로 고도로 변성된다. 따라 서, 대부분의 아미노산은 하나 이상의 코돈으로 암호화되어 있는데, 실제로 몇개는 4개 또는 그 이상의 상이한 코돈에 의해 암호화된다.

하나 이상의 코돈이 제공된 아미노산을 암호화하는데 유용한 경우, 유기체의 코돈 이용 패턴은 고도로 비-무작위인 것으로 관측되어왔다. 상이한 종은 이들의 코돈 선택에 있어서 상이한 치우침(bias)을 나타내며, 또한 코돈의 이용은 높은 수준 및 낮은 수준에서 발혀되는 유전자간의 단일 종에서도 현저히 상이할 수 있음을 나타낸다. 이러한 치우침은 바이러스, 식물, 세균 및 포유동물 세포에서 상이하며, 일부 종은 다른 것보다 무작위적인 코돈 선택으로부터 더욱 강력한 치우침을 나타낸다. 예를 들어, 사람 및 기타 포유동물은 특정의 세균 또는 바이러스보다 강하게 치우쳐져 있지 않다. 이러한 이유로, 대장균에서 발현된 포유동물 유전자 또는 포유동물 세포에서 발현된 바이러스 유전자는 효율적인 발현을 위한 코돈의 부적절한 분포를 지닐 것이다. 발현이 일어나는 숙주에서 드물게 관측되는 코돈의 집단의 이종 DNA 서열에 있어서의 존재는 이러한 숙주에서 낮은 이종 발현 수준의 척도인 것으로 여겨진다.

결론적으로, 특정 원핵 세포(예: 대장균 또는 효모) 또는 진핵 세포에 의해 선호되는 코돈을 개질시켜 동일한 MUC1 단백질을 암호화하나 야생형 서열과는 상이하도록 할 수 있다. 코돈 개질의 과정은 수동으로 또는 컴퓨터 소프트웨어에 의해 생성된 특정 서열을 포함할 수 있으며, 여기서, MUC1의 천연 서열의 코돈 일부 또는 모두는 개질된다. 몇몇 방법이 공지되어 있다(참조: Nakamura et. al., Nucleic Acids Research 1996, 24:214-215; W098/34640). 한가지 방법은 신진법 (Syngene method), 칼크젠법(Calcgene method)(참조: R. S. Hale and G Thompson (Protein Expression and Purification Vol. 12 pp. 185-188 (1998))의 개질법이다.

MUC1의 코돈 개질의 당해 방법은 일부 또는 모든 다음의 잇점을 지닐 수 있다: 1) 더욱 흔히 사용된 코돈으로 드물게 또는 흔하지 않게 사용된 코돈을 교체함으로써 유전자 산물의 발현을 증진시키고, 2) 하부 클로닝을 용이하게 하기 위해 제한 효소 부위를 제거하거나 포함하며, 3) DNA 벡터와 게놈 서열내 삽입 서열사이에 동종 재조합에 대한 전위를 감소시키고 4) 사람에서 면역 반응을 증진시킨다. MUC1의 서열은 유리하게 재조합 효능을 감소시키나, 야생형 서열과 적어도 동일한 수준으로 발현한다. 코돈 개질된 서열을 생성시키기 위한 신진 프로그램에 의해 사용된 알고리듬의 특성으로 인해, 유사한 작용을 수행할 다수의 상이한 코돈 개질된 서열을 생성하는 것이 가능하다. 요약하면, 코돈은 β-액틴과 같은 고도로 발현된 사람 유전자에서 천연적으로 발견되는 것보다 더욱 밀접한 코돈 발생율을 갖는 합성 유전자를 제공하기 위한 통계 방법을 사용하여 지정된다.

본 발명에서 사용하기 위한 면역원을 암호화하는 폴리누클레오티드의 양태에서, 면역원이 MUC-1인 경우, 코돈 이용 패턴은 MUC-1의 대표적인 것으로부터 표적 고도로 발현된 사람 유전자의 코돈 치우침을 더욱 잘 나타내기 위해 변경된다. "코돈 이용 계수"는, 제공된 폴리누클레오티드 서열의 코돈 패턴이 표적 종의 것을 닮은 정도의 척도이다. 코돈 발생율은 많은 종의 고도로 발현된 유전자에 대한 문헌으로부터 기원할 수 있다(참조: Nakamura et al. Nucleic Acids Research 1996, 24:214-215). 61개 코돈 각각에 대한 코돈 발생율(유전자의 선택된 부류의 1000개 코돈당 발생 출현수로서 표시)은 각각의 20개의 천연 아미노산에 대해 표준화됨으로써 각각의 아미노산에 대해 가장 흔히 사용된 코돈에 대한 값이 1로 설정되고 거의 일반적이지 않은 코돈에 대한 발생이 0과 1사이에 놓이도록 설계된다. 즉, 각각으 61개 코돈은 표적 종의 고도로 발현된 유전자에 대해 1 또는 보다 낮은 값으로 지정된다. 종의 고도로 발현된 유전자에 대해 상대적인, 특이적인 폴리누클레오티드에 대한 코돈 이용 계수를 계산하기 위하여, 특정 폴리누클레오티드의 각각의 코돈에 대한 축적치를 주목하고 모든 이들 값의 기하학적 평균을 취한다(이들 값의 천연 대수의 합을 코돈의 총 수로 나누고 역-log를 취한다). 계수는 0 내지 1 사이의 값일 수 있고 계수가 높을 수록, 폴리누클레오티드내 더욱 많은 코돈이 더욱 흔히 사용된 코돈이다. 폴리누클레오티드 서열이, 코돈 이용 계수가 1인 경우, 모든 코돈은 표적 종의 고도로 발현된 유전자에 대해 "가장 흔한" 코돈이다.

본 발명에서 사용하기 위한 면역원의 하나의 예에서, 폴리누클레오티드의 코돈 이용 패턴은 특정 아미노산에 대해 사용된 코돈의 <10%를 나타내는 코돈을 제외시킬 수 있다. 상대적인 동의 코돈 이용(RSCU) 값은 아미노산에 대한 모든 코돈이 동일하게 흔히 사용되었는지를 예측한 수로 나눈 코돈의 관측된 수이다. 본 발명의 폴리누클레오티드는 표적 유기체의 고도로 발현된 유전자에서 0.2 미만의 RSCU 값을 지닌 코돈을 제외시킬 수 있다. 본 발명의 폴리누클레오티드는 일반적으로 0.6 초과, 0.65 초과, 또는 0.7 초과의 고도로 발현된 사람 유전자에 대한 코돈 이용 계수를 지닐 것이다. 사람에 대한 코돈 이용 표는 또한 진뱅크(Genbank)에서 찾을 수 있다.

비교시, 고도로 발현된 베타 액틴 유전자는 0.747의 RSCU 값을 갖는다.

호모 사피엔스에 대한 코돈 이용 표는 하기에 설정한다:

사람(고도로 발현된) 유전자에 대한 코돈 이용 1/24/91 (human-high. cod)

따라서, 본 발명의 하나의 양태에서 면역원 성분을 암호화하는 누클레오티드 분자가 MUC-1 면역원을 암호화하는 경우, 누클레오티드 서열은 개질되어 β 액틴과 같은 고도로 발현된 사람 유전자의 이용을 더욱 근접하게 모방한다.

사용될 수 있는 MUC-1 면역원 성분의 어떠한 비-VNTR 단위도 코돈 개질시킬 수 있다. VNTR 단위는 존재하는 경우 개질시키거나 개질시키지 않을 수 있다. 하나의 양태에서, 코돈-개질된 서열은 Muc-1의 상응하는 비-VNTR 단위에 대해 80% 미만으로 동질이다.

폴리누클레오티드 서열과 비교하는 경우, 2개의 서열은, 2개 서열내 누클레오티드 서열이 하기 기술하는 바와 같이 최대 상응성으로 정렬되는 경우에 동일하다면 "동일한" 것으로 언급된다.

2개 서열간의 비교는 통상적으로 비교 윈도우에 걸쳐 서열을 비교하여 서열 유사성의 국부 영역을 확인하고 비교함으로써 수행한다. 본원에 사용된 것으로서 "비교 윈도우"는 약 20개 이상의 인접 위치, 일반적으로 30 내지 약 75, 40 내지 약 50의 근접 위치의 분절을 말하며, 여기서, 서열은 2개 서열이 최적으로 정렬된 후 근접 위치의 동일한 수의 참조 서열과 비교할 수 있다.

즉, 본 발명에서 사용하기 위한 면역원의 경우, 비교를 위한 서열의 코돈-개질된 비-반복 영역 및 서열의 최적 정렬의 비-반복 영역을 스미쓰(Smith) 및 워터맨(Waterman)의 국부 동일성 알코리즘[참조: (1981) Add. APL. Math 2:482, by the identity alignment algorithm of Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443]에 의해, 피어슨(Pearson) 및 림맨(Lipman)의 유사성 고찰법[참조: (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444]에 의해, 이러한 알코리듬의 컴퓨터처리된 보완[참조: GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI]에 의해, 또는 검사에 의해 수행할 수 있다.

서열 동일성 및 서열 유사성을 측정하기에 적합한 알고리즘의 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이 있으며 이는 문헌[참조: Altschul et al. (1977) Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402 and Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410]에 각각 기술되어 있다. BLAST 및 BLAST 2.0은 예를 들면, 본원에 기술된 매개변수를 이용함으로써 본 발명의 폴리누클레오티드에 대한 서열 동일성 퍼센트를 측정하는데 사용할 수 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 기관(National Center for Biotechnology Information)을 통해 입수한다.

이러한 작제물은 MUC-1 발현 종양 세포를 인지하는 세포 및 또한 항체 반응 둘다를 상승시킬 수 있다. 본 발명에 따른 애쥬번트 조성물의 혼입은 MUC-1에 대한 면역 반응의 역학 및 작용성을 증진시킬 수 있다.

작제물은 또한 WO01/46228에 기술된 바와 같은 환원된 글리코실화 돌연변이체와 같은 변경된 반복단위(VNTR 단위)를 함유할 수 있다.

또한 사용될 수 있는 MUC-1 작제물은 본원에 기술된 돌연변이체와 함께, WO03/100060에 기술된 바와 같은 다음 1) 내지 8)을 포함한다:

1) 7 VNTR MUC-1 (즉, 단지 7개의 완전한 반복 단위를 갖는 전체 Muc-1)

2) 7 VNTR MUC-1 △ss (As I, 그러나 또한 시그날 서열은 결여함)

3) 7 VNTR MUC-1 △TM △CYT (As 1, 그러나 막전위 및 세포질 도메인을 결여함)

4) 7 VNTR MUC-1 △ss △TM △CYT (As 3, 그러나 또한 시그날 서열도 결여함)

5) 절단된-MUC-1 (즉, 완전한 반복단위가 없는 전체 MUC-1)

6) 절단된-MUC-1 △ss (As 5, 그러나 시그날 서열을 결여함)

7) 절단된-MUC-1 △TM △CYT (As 5, 그러나 막전위 및 세포질 도메인을 결여함)

8) 절단된-MUC-1 △ss △TM △CYT (As 7, 그러나 또한 시그날 서열을 결여함)

하나의 양태에서, 하나 이상의 불완전한 VNTR 단위를 돌연변이시켜 글리코실화 부위를 변경시킴으로써 글리코실화를 위한 전위를 감소시킨다. 돌연변이는 치환일 수 있거나, 삽입 또는 결실일 수 있다. 통상적으로, 하나 이상의 트레오닌 또는 세린을 발린, 이소류신, 알라닌, 아스파라긴, 페닐알라닌 또는 트립토판으로 치환시킨다.

추가의 양태에서, 제거한 MUC-1 핵산은 리더 서열 및 세포외 도메인의 연결부에서 제한 부위를 제공한다. 통상적으로 이러한 제한 부위는 Nhe1 부위이다.

Her 2 neu 항원은 특히 미국 특허 5,801,005에 기술되어 있다. Her 2 neu는 전체 세포외 도메인(대략 1 내지 645번 아미노산 포함) 또는 이의 단편, 및 적어도 이의 면역원 부위 또는 C 말단 580개 아미노산의 전체 세포내 도메인을 포함할 수 있다. 특히, 세포내 부위는 포스포릴화 도메인 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 이러한 작제물은 WO00/44899에 기술되어 있다. 하나의 작제물은 ECD PD로 공지되어 있으며, 두번째 작제물은 ECD △PD로 공지되어 있다(참조: WO/00/44899).

본원에 사용된 것으로서 her 2 neu는 랫트, 마우스 또는 사람으로부터 기원할 수 있다.

백신은 또한 종양-지지 메카니즘(예: 신생물형성, 종양 침입)과 연관된 항원, 예를 들면, tie 2, VEGF를 함유할 수 있다.

본 발명의 백신은 또한 알레르기, 암 또는 감염성 질병외에 만성 질환의 예방 또는 치료요법에 사용할 수 있다. 이러한 만성 질환은 천식, 죽상경화증 및 알츠하이머병 및 기타 자가면역 질환과 같은 질병이다. 피임제로서 사용하기 위한 백신이 또한 고려될 수 있다.

알츠하이머 신경변성 질병으로 고생하거나 이에 걸릴 가능성이 높은 환자의 예방 및 치료와 관련된 항원은 특히 N 말단 39 내지 43 아미노산 단편(AB), 아밀로이드 전구체 단백질 및 보다 작은 단편이다. 당해 항원은 국제 특허원 WO 99/27944(Athena Neurosciences)에 기술되어 있다.

자가면역 질환용 백신으로서 또는 피임용 백신으로서 포함될 수 있는 강력한 자가-항원은 시토카인, 호르몬, 성장 인자 또는 세포외 단백질, 또는 4-나선형 시토카인, 예를 들면 IL13을 포함한다. 시토카인은 예를 들면, IL1, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL11, IL12, IL13, IL14, IL15, IL16, IL17, IL18, IL20, IL21, TNF, TGF, GMCSF, MCSF 및 OSM을 포함한다. 4-나선형 시토카인 은 IL2, IL3, IL4, IL5, IL13, GMCSF 및 MCSF를 포함한다. 호르몬은 예를 들면, 황체화 호르몬(LH), 소포 자극 호르몬(FSH), 융모생식샘자극호르몬(CG), VGF, GHrelin, 아고우티(agouti), 아고우티 관련 단백질 및 뉴로펩티드 Y를 포함한다. 성장 인자는 예를 들면, VEGF를 포함한다.

본 발명의 백신은 특히 만성 상태 및 암과 같은 질병의 면역치료적 치료뿐만 아니라, 지속 감염의 치료용으로 특히 적합하다. 따라서, 본 발명의 백신은 결핵(TB), AIDS와 같은 HIV 및 B형 간염(HepB) 바이러스 감염과 같은 감염성 질병의 면역치료요법에 특히 적합하다.

하나의 양태에서, 핵산은 하나 이상의 다음 항원을 암호화한다:

HBV-PreS1 PreS2 및 표면 env 단백질, 코어 및 pol

HCV-E1, E2, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A 및 B

HIV-gp120 gp40, gp160, p24, gag, pol, env, vif, vpr, vpu, tat, rev, nef

유두종-E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7, E8, L1, L2

HSV-gL, gH, gM, gB, gC, gK, gE, gD, ICP47, ICP36, ICP4

인플루엔자-해마글루틴, 핵단백질

TB-마이코박테리아 슈퍼 옥사이드 디스뮤타제, 85A, 85B, MPT44, MPT59, MPT45, HSP10, HSP65, HSP70, HSP90, PPD 19kDa Ag, PPD 38kDa Ag.

본 발명은 자가-항원, 예를 들면, 암 항원 P501S, 또는 MUC-1에 대한 파괴 내성에서 특히 효과적이다. 이러한 자가-항원은 본 발명에서 사용될 수 있다.

본 발명의 추가의 양태에서, 본 발명의 면역원 작제물은 하나 이상의 이종 T-세포 에피토프를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 이러한 T 세포 에피토프는 면역원내 또는 말단에 혼입될 수 있다. T 세포 에피토프는 T 헬퍼 에피토프일 수 있다. T 세포 에피토프는 PADRE^®, 세균 단백질로부터 기원한 T-세포 에피토프 및 테타누스 및 디프테리아 독소와 같은 독소를 포함한다. 예를 들어, 테타누스 독소로부터의 P2 및 P30 에피토프가 사용될 수 있다. 이러한 에피토프는 보다 긴 서열의 일부일 수 있다. 당해 에피토프는 본 발명에 따른 서열의 3' 또는 5' 말단에서 또는 핵산 분자내에 혼입될 수 있다.

B형 간염 코어 항원, 또는 결핵으로부터 기원한 것과 같은 다른 융합 파트너도 고려할 수 있다. 하나의 양태에서, 융합 파트너는 마이코박테리움 투베르쿨로시스, RA12, MTA32A의 아-서열(아미노산 192 내지 323번)으로부터 기원한다[참조: Skeiky et al Infection and Immunity (1999) 67: 3998-4007].

본 발명의 양태에서, 면역원은 난잡한 T 세포 에피토프 PADRE에 융합된, 본원에 정의된 바와 같은 MUC-1 작제물중 어느 하나이다.

다른 면역학적 융합 파트너는 예를 들면, WO03/104272에 기술되어 있는 바와 같이, P2와 같은 다른 파트너, 즉, ClytA-P2-CLytA(CPC)에 융합될 수 있는 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(참조: CLytA; Biotechnology 10: 795-798, 1992)로부터 기원한 LytA의 일부(통상적으로 C-말단 부위) 또는 해모필루스 인플루엔자 B(참조: WO91/18926)으로부터의 단백질 D를 포함한다. WO99/40188은 특히 분자의 N-말단에서 His 테일 및 C-LytA 부위를 지닌 MAGE 항원을 포함하는 융합 단백질을 기술하고 있으며; 이러한 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 본 발명의 성분 (iii)을 포함할 수 있다.

따라서, 본 발명의 성분 (iii)을 포함하는 누클레오티드에 의해 암호화될 수 있는 추가의 면역원 작제물은 다음을 포함한다:

-면역원-C-LytA 반복단위1-4-P2 에피토프(삽입되거나 C-LytA 반복단위5를 대체)-C-LytA 반복단위6

- C-LytA 반복단위1-4-P2 에피토프(삽입되거나 또는 C-LytA 반복단위5를 대체)-C-LytA 반복단위6-면역원

-면역원-C-LytA 반복단위2-5-P2 에피토프(C-LytA 반복단위6내로 삽입됨)

- C-LytA2-5-P2 에피토프(C-LytA 반복단위6내로 삽입됨)-면역원

-면역원-C-LytA 반복단위6에 삽입된 C-LytA 반복단위1-5-P2 에피토프-

-C-LytA 반복단위 6-면역원내에 삽입된 C-LytA 반복단위 1-5-P2 에피토프-면역원

-면역원-C-LytA 반복단위1-C-LytA 반복단위 2-5내로 삽입된 P2 에피토프

-C-LytA 반복단위1-C-LytA반복단위2-5-내로 삽입된 P2 에피토프-면역원

-면역원-C-LytA 반복단위1-C-LytA 반복단위2-6내로 삽입된 P2 에피토프

C-LytA 반복단위1-C-LytA 반복단위2-6-내로 삽입된 P2 에피토프-면역원

-면역원-C-LytA 반복단위2-C-LytA 반복단위3-6내로 삽입된 C-LytA 반복단위1-P2 에피토프

C-LytA 반복단위2-C-LytA 반복단위3-6내로 삽입된 C-LytA 반복단위1-P2 에피 토프-면역원;

여기서, "내로 삽입된"은 예를 들면, 잔기 1 및 2사이 또는 2 및 3 사이 등에 반복단위내로의 어떠한 위치를 의미한다.

뒤섞인 T 헬퍼 에피토프는 예를 들면, C- LytA 반복단위 2-5 _-C-LytA 반복단위 6a-P2 에피토프 - C-LytA 반복단위 6b(여기서, P2 에피토프는 6번째 반복단위내에 삽입된다. 참조: W003/104272의 도 20)내에 삽입될 수 있다.

다른 양태에서, CPL1 (C-CPL1)의 C-말단을 C-LytA에 대한 대체물로서 사용할 수 있다.

달리는, 상기 작제물에서 P2 에피토프를 다른 무차별의 T 에피토프, 예를 들면, P30으로 치환시킬 수 있다.

특히 예시적인 면역원은 융합 파트너와 관련된 종양 또는 이에 융합된 조직 특이적 단백질의 10개 이상의 근접한 아미노산, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180 아미노산의 서열을 포함한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라서, 본 발명의 각각의 폴리누클레오티드 서열의 발현을 지시할 수 있고 이들을 포함하는 발현 벡터가 제공된다. 당해 벡터는 세균, 곤충 또는 포유동물 세포, 특히 사람 세포에서 이종 DNA의 발현을 구동하는데 적합할 수 있다.

또한, MUC-1 또는 P501S 발현 종양 또는 전이의 치료 또는 예방시 본 발명에 따른 백신 또는 면역원성 조성물, 또는 본 발명에 따른 벡터의 용도가 제공된다.

본 발명은 또한 유효량의 본 발명에 따른 백신 또는 면역원성 조성물을 투여 함으로 포함하여, MUC-1 또는 P501S 발현 종양, 전이를 포함한 이와 관련된 어떠한 증상 또는 질병을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.

본 발명은 MUC-1을 암호화하는 핵산을 포함하는 백신에 한정되지 않는다.

누클레오티드 서열은 게놈성 DNA, 합성 DNA 또는 cDNA를 포함하는 RNA 또는 DNA일 수 있다. 하나의 양태에서, 누클레오티드 서열은 DNA 서열 또는 cDNA 서열이다. 포유동물 세포내에서 항원성 펩티드를 발현시키기 위하여, 항원성 펩티드를 암호화하는 누클레오티드 서열이 적절한 벡터 시스템내에 존재하도록 하는 것이 필수적이다. 본원에 사용된 것으로서, "적절한 벡터"는, 항원성 펩티드가 면역 반응을 유발시키기에 충분한 양으로 포유동물내에서 발현되도록 할 특정의 벡터를 의미한다.

예를 들어, 선택된 벡터는 항원성 펩티드를 발현시키기 위하여 바르게 정렬된 플라스미드, 프로모터 및 폴리아데닐화/전사 말단 서열을 포함할 수 있다. 이들 성분 및 인핸서, 제한 효소 부위 및 항생제 내성 유전자와 같은 선별 유전자와 같은 임의의 기타 성분들을 포함하는 벡터의 작제는 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지되어 있으며, 문헌[참조: Maniatis et al "Molecular Cloning : A Laboratory Manual", Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour Press, Vols 1-3, 2^nd Edition, 1989]에 상세히 설명되어 있다.

플라스미드가 포유동물 숙주내에서 복제하고 동물의 염색체 DNA내에서 통합되는 것을 방지하기 위하여, 플라스미드를 진핵 세포내에서 작용성인 복제 오리진 없이 생성시킬 수 있다.

본 발명에 따른 방법 및 조성물은 예를 들면, 애완동물, 시험실 동물, 농장 동물, 사육 야생 동물 또는 하나의 양태에서, 사람을 포함하는 모든 포유동물의 예방 또는 치료 과정과 관련하여 사용할 수 있다.

상기 논의한 바와 같이, 본 발명은 본 발명의 애쥬번트 성분 (i) 및/또는 (ii), 항원 또는 면역원 성분 (iii)을 암호화하는 발현 벡터의 용도를 포함한다. 이러한 발현 벡터는 분자 생물학 분야에서 일반적으로 작제되며 예를 들면, 플라스미드 DNA 및 적절한 개시인자, 프로모터, 인핸서 및 단백질을 발현시키기 위하여 필수적일 수 있거나 정확한 배위로 위치하는 기타 성분, 예를 들면, 폴리아데닐화 시그날의 용도를 포함한다. 기타 적합한 벡터는 당해 분야의 숙련가에게 명백하다. 이와 관련하여 추가의 예로써, 본 출원인은 문헌[참조: Sambrook et al. Molecular Cloning : a Laboratory Manual. 2^nd Edition. CSH Laboratory Press. (1989)]을 참조한다.

벡터내에서 본 발명에서 사용하기위해 폴리누클레오티드는 숙주 세포에 의해 암호화 서열을 발현시킬 수 있는 조절 서열에 작동적으로 연결될 수 있는데, 즉, 벡터는 발현 벡터이다. 용어 "작동적으로 연결된"은, 기술된 성분이 이들의 의도된 방식으로 작용하도록 하는 관계에 있는 근접부위를 말한다. 암호화 서열에 "작동적으로 연결된" 프로모터와 같은 조절 서열은, 암호화 서열의 발현이 조절 서열과 혼용성인 조건하에서 달성되도록 하는 방식으로 위치한다.

벡터는 예를 들면, 플라스미드, 인공 염색체(예: BAC, PAC, YAC), 바이러스 또는 복제 오리진, 임의로 폴리누클레오티드 발현용 프로모터 및 임의로 프로모터의 조절인자와 함께 제공된 바이러스 또는 파아지 벡터일 수 있다. 당해 벡터는 하나 이상의 선택성 마커 유전자, 예를 들면, 세균 플라스미드의 경우에 암피실린 또는 가나마이신 내성 유전자 또는 진균 벡터용 내성 유전자를 함유할 수 있다. 벡터는 예를 들면 DNA 또는 RNA를 생산하기 위해 시험관내에서 사용할 수 있거나, 숙주 세포, 예를 들면, 포유 동물 숙주 세포를 형질감염 또는 형질전환시키기 위해, 예를 들면, 벡터에 의해 암호화된 단백질을 생산하기 위해 사용할 수 있다. 벡터는 또한 예를 들면, DNA 백신접종 또는 유전자 치료요법의 방법에서 생체내에서 사용하도록 조절할 수 있다.

프로모터 및 기타 발현 조절 시그날을 발현이 설계된 숙주 세포와 혼용성이도록 선택할 수 있다. 예를 들어, 포유동물 프로모터는 카드늄과 같은 중금속에 대한 반응시 유도될 수 있는 메탈로티오네인 프로모터 및 β-액틴 프로모터를 포함한다. SV40 거대 T 항원 프로모터, 사람 사이토메갈로바이러스(CMV) 이미디에이트 얼리(IE) 프로모터, 로우스 육종 바이러스 LRT 프로모터, 아데노바이러스 프로모터 또는 HPV 프로모터와 같은 바이러스 프로모터, 특히 HPV 상부 조절 영역(URR)이 또한 사용될 수 있다. 이들 프로모터 모두는 당해 분야에 잘 기술되어 있으며 용이하게 이용가능하다.

하나의 프로모터 성분은 인트론 A가 결여되어 있으나 엑손 1을 포함하는 CMV 이미디에이트 얼리 프로모터이다(WO02/36792). 따라서, HCMV IE 얼리 프로모터의 조절하에 본 발명의 폴리누클레오티드를 포함하는 벡터가 제공된다.

적합한 바이러스 벡터의 예는 렌티바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스를 포함하는 레트로바이러스, 백시니아 또는 알파-바이러스 벡터 및 단순 헤르페스 바이러스 벡터를 포함한다. 이러한 바이러스를 사용하는 유전자 전달 기술은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 예를 들어 레트로바이러스 벡터를 사용하여 본 발명의 폴리누클레오티드를 숙주 게놈내로 안정하게 통합시킬 수 있으나, 이러한 재조합은 바람직하지 않다. 대조에 의한 복제-결여 아데노바이러스 벡터는 에피솜(episome)한 상태로 잔존하므로 일시적으로 발현되도록 한다. 곤충 세포(예를 들면, 바큘로바이러스 벡터), 사람 세포 또는 세균 세포내에서 발현을 구동할 수 있는 벡터를 사용하여 본 발명의 폴리누클레오티드에 의해 암호화된 HIV 단백질의 양을 생산하는데, 예를 들면, 아단위 백신 또는 면역검정으로서 사용하기 위해 사용할 수 있다. 본 발명의 폴리누클레오티드는 완전한 길이의 백시니아 작제물을 생성하기 위한 앞서의 시도가 성공적이지 않았으므로 바이러스 백신에서 특정 용도를 지닌다.

본 발명의 하나의 양태에서, 본원에 전체 내용이 참조로 인용된 공개된 PCT 출원 WO03/046124에 기술된 바와 같이 C1, Pan 5, Pan 6, Pan 7 C68 (Pan 9), SV1, SV25 및 SV 39로부터 선택된 아데노바이러스 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터를 사용할 수 있다.

약화된 살모넬라 또는 리스테리아와 같은 세균 벡터를 대안적으로 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 폴리누클레오티드는 암호화된 단백질의 발현에 의한 생산시 용도를 지니며, 이러한 발현은 시험관내, 생체내 또는 생체외에서 일어날 수 있다. 따라서, 누클레오티드는 예를 들면 수율을 증가시키기 위해 재조합 단백질 합성시 포함될 수 있거나, 또는 DNA 백신접종 기술에서 이용된 이들 자체의 치료제로서의 용도를 발견할 수 있다. 본 발명의 폴리누클레오티드가 시험관내 또는 생체외 세포, 예를 들면 세포 배양물에서 암호화된 단백질의 생산시 사용되는 경우, 발현될 폴리누클레오티드를 포함시키기 위해 개질시킬 것이다. 이러한 세포는 일시적, 또는 안정한 포유동물 세포주를 포함한다. 본 발명에 따른 폴리펩티드를 암호화하는 벡터를 삽입시킴으로써 개질시킬 수 있는 세포의 특정 예는 포유동물 HEK293T, CHO, HeLa, 293 및 COS 세포를 포함한다. 선택된 세포주는 안정할 뿐 아니라 성숙한 글리코실화 및 폴리펩티드의 세포 표면 발현을 허용하는 것일 수 있다. 발현은 형질전환된 난모세포내에서 달성된다. 폴리펩티드는 본 발명의 폴리누클레오티드로부터 마우스와 같은 유전자삽입 비-사람 동물의 세포내에서 발현될 수 있다. 본 발명의 폴리누클레오티드로부터 폴리펩티드를 발현하는 유전자삽입(transgenic) 비-사람 동물이 본 발명의 영역내에 포함된다.

본 발명은 또한 유효량의 이러한 백신 또는 백신 조성물을 투여함을 포함하여 포유동물 대상을 백신접종하는 방법을 제공한다. DNA 백신, 백신 조성물 및 면역치료요법에서 사용하기 위한 발현 벡터는 플라스미드 벡터일 수 있다.

항원성 펩티드를 암호화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 포함하는 면역원 성분은 각종 방법으로 투여할 수 있다. 비록 일부의 선행 데이타가, 근육내 또는 피하 주사가 사용될 수 있음을 제안하고 있다 하더라도[참조: Brohm et al Vaccine 16 No. 9/10 pp 949-954 (1998), 본원에 이의 전문이 참조로 인용됨],적절한 배지, 예를 들면 PBS와 같은 완충 염수 용액에 현탁시킨 원래의 형태(즉, 리포솜 제형, 바이러스 벡터 또는 형질감염 촉진 단백질과 연합되지 않은 원래의 누클레오티드 서열)로 벡터를 투여한 후 근육내, 피하, 복강내 또는 정맥내 투여하는 것이 가능하다. 또한, 위에서 상세히 기술한 경로외에 경구, 비강 또는 폐 경로를 통해 투여하기 위해, 벡터를 예를 들면, 폴리락타이드 코-글리콜라이드(PLG) 입자(25) 또는 리포좀에 의해 봉입시키는 것이 가능하다.

본 발명의 하나의 양태에 따라서, 예를 들면, 유전자-총(특히 입자 충격) 투여 기술의 사용을 통해 면역원 성분을 경피 투여하는 것도 가능하다. 이러한 기술은 면역원 성분을 금 비드상에 피복시킨 후 예를 들면 문헌[참조: Haynes et al J. Biotechnology 44: 37-42 (1996)]에 기술되어 있는 바와 같이 고압하에 내피내로 투여하는 것을 포함할 수 있다.

하나의 예시적인 실시예에서, 가스-구동된 입자 가속화는 업자[Powderject Pharmaceuticals PLC (Oxford, UK) 및 Powderject Vaccines Inc. (Madison, WI), 이의 일부 예는 미국 특허 5,846,796; 6,010,478; 5,865,796; 5,584,807; 및 EP 특허 0500 799에 기술되어 있다]에 의해 제조된 것과 같은 장치를 사용하여 달성할 수 있다. 이러한 시도는, 폴리누클레오티드와 같은 현미경적 입자의 무수 분말 제형을 손으로 작동하는 장치로 생성된 헬륨 가스 분사내에서 고속으로 가속화시키고 당해 입자를 목적한 표적 조직, 통상적으로 피부에 추진시킨다. 입자는, 직경이 0.4 내지 4.0㎛, 또는 0.6 내지 2.0㎛인 금 비드일 수 있으며 DNA 컨쥬게이트는 이 들에 피복된 후 "유전자 총"내로 두도록 카트리지 또는 카세트내에 싸여진다.

관련 양태에서, 본 발명의 조성물의 가스-구동된 침이없는 주입에 유용할 수 있는 기타 장치 및 방법은 이의 일부 예가 미국 특허 4,790,824; 5,064,413; 5,312,335; 5,383,851; 5,399,163; 5,520,639 및 5,993,412에 기술된 업자[Bioject, Inc. (Portland, OR)]에 의해 제공된 것들을 포함한다.

핵산 백신은 또한 저장기로부터 미세 침을 통해 전달되거나 본 발명의 조성물로 피복될 수 있는 미세 침의 수단으로 전달될 수 있다.

항원성 펩티드를 암호화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 벡터는 예방학적 또는 치료학적으로 효과적일 양으로 투여된다. 투여될 양은 일반적으로 입자-매개된 전달의 경우 용량당 1mg 또는 1pg 내지 10㎍의 범위, 및 누클레오티드의 기타 경로의 경우 용량당 10㎍ 내지 10mg의 범위일 수 있다. 정확한 양은 면역화시킬 포유동물의 종 및 체중, 투여경로, 애쥬번트 성분의 효능 및 투여량, 보호되거나 치료되는 질병 상태의 특성, 면역 반응 및 바람직한 보호 또는 치료 효능도를 생산하기 위한 대상체의 면역 시스템의 능력에 따라 현저히 변할 수 있다. 이러한 변수를 기초로 하여, 의학 또는 축산 종사자들은 적절한 투여량 수준을 용이하게 결정할 수 있다.

항원성 펩티드를 암호화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 면역원 성분 (iii), 애쥬번트 성분 (i) 및 (ii)는 1회 기준으로 또는 반복적으로, 예를 들면 1 내지 7회, 또는 1 내지 4회 약 4주 내지 약 18개월의 가격으로 투여할 수 있다. 다시한번, 그러나, 이러한 치료 섭생은 환자의 체격, 치료/보호하는 질병, 투여된 누클레오티드 서열의 양, 투여 경로 및 숙련된 의학 종사자에게 명백한 기타 인자에 따라 현저히 변할 것이다. 환자는 자체의 전체 치료 섭생의 일부로서 하나 이상의 다른 항암제 약물을 투여받을 수 있다.

다시 한번, 상기 나열한 유형의 변수에 따라, TLR 효능제의 투여 용량은 또한 변할 수 있을 뿐 아니라, 예를 들면, kg당 약 0.1mg 내지 kg당 약 100mg의 범위일 수 있으며, 여기서, "kg당"은 관련 포유동물의 체중을 말한다. TLR 효능제 아민 유도체의 투여는 누클레오티드 서열의 각각의 후속적인 또는 부스터 투여로 반복할 수 있다. 투여량은 약 0.5mg/kg 내지 약 5mg/kg, 또는 약 1mg/kg 또는 1mg/kg일 수 있다. TLR 효능제가 레지퀴모드 또는 이미퀴모드인 경우, 용량은 1mg/kg일 수 있다. TLR 효능제가 이미퀴모드인 경우, Aldara^TM 크림(5% 이미퀴모드; 3M)를 사용할 수 있으며 투여 부위에 또는 근처에 국소 적용한다. 본 발명의 하나의 양태에서, 1회의 12.5mg 패킷(3M)의 5% Aldara^TM 크림이 사용될 수 있으며, 교호적으로 1개 이상의 패킷의 Aldara^TM 크림이 사용될 수 있다. 본 발명의 추가의 양태에서, 패킷의 분획이 사용될 수 있는데, 예를 들면, 20%, 25%, 33% 또는 50%의 또는 근처의 패킷이 각각의 부위에서 또는 부위 근처에서 사용될 수 있다.

TLR 효능제 애쥬번트 성분이 천연 화학 상태로 투여될 이미다조퀴놀린 분자 또는 이의 유도체를 포함하는 것이 가능하나, 약제학적 제형의 형태로 투여할 수 있다. 즉, TLR 효능제 애쥬번트 성분은 이미다조퀴놀린 분자 또는 하나 이상의 약제학적으로 또는 수의학적으로 허용되는 담체, 및 임의로 다른 치료학적 성분과 조 합된 이미다조퀴놀린 분자 또는 이의 유도체를 포함할 수 있다. 담체는 제형내 다른 성분들과 혼화성인 측면에서 "허용가능"하여야 하며, 이의 수용체에 유해하지 않아야 한다. 제형의 특성은 의도된 투여 경로에 따라 자연적으로 변할 것이며, 약제 분야에 잘 공지된 방법으로 제조할 수 있다. 제형의 모든 제조 방법은 이미다조퀴놀린 분자 또는 이의 유도체와 적절한 담체 또는 담체들을 연합시키는 단계를 포함한다. 담체는 크림 제형, 또는 달리는 PBS 또는 물을 포함한다. 일반적으로, 제형은 유도체를 액체 담체 또는 미분된 고체 담체, 또는 이들 둘다와 유도체를 균일하게 및 친밀하게 연합시킨 후, 경우에 따라 생성물을 바람직한 제형으로 성형시켜 제조한다. 경구 투여에 적합한 본 발명의 제형은 각각 예정된 양의 활성 성분을 함유하는 캅셀제, 사쉐제 또는 정제와 같은 별개의 단위로서; 산제 또는 과립제로서; 수성 액체 또는 비수성 액체중 액제 또는 현탁제로서; 또는 수중유 액체 유액 또는 유중수 유액으로서 존재할 수 있다. 활성 성분은 또한 거환제, 연질약 또는 페이스트로서 존재할 수 있다.

정제는 임의로 하나 이상의 보조 성분과 함께 압착 또는 성형시켜 제조할 수 있다. 압착된 정제는 적합한 기계속에서 임의로 결합제, 윤활제, 불활성 희석제, 윤활성 표면 활성 또는 분산제와 혼합된 산제 또는 과립제와 같은 자유 유동 형태로서의 활성 성분을 압착시켜 제조할 수 있다. 성형시킨 정제는 적합한 기계속에서 불활성 액체 희석제로 습윤시킨 분말 화합물의 혼합물을 성형시켜 제조할 수 있다.

정제는 임의로 피복되거나 줄을 그을 수 있으며 활성 성분의 느린 또는 조절 된 방출을 제공하도록 제형화시킬 수 있다.

예를 들면, 근육내, 복강내 또는 피하 투여 경로를 통한 주사 제형은 항산화제, 완충제, 살세균제 및 제형이 의도된 수용체의 혈액과 등장성이 되도록 하는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 주사액; 및 현탁제 및 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 현탁액을 포함한다. 제형은 단일-투여량 또는 다-투여량 용기, 예를 들면, 밀봉된 앰플 및 바이알내에 존재할 수 있으며, 멸균 액체 담체, 예를 들면 주사용수를 사용 직전에 첨가하는데 요구되는 냉동-건조(동결건조) 조건하에서 저장할 수 있다. 임시처방 주사제 및 현탁제는 앞서 기술한 종류의 멸균 산제, 과립제 및 정제로부터 제조할 수 있다. 볼 또는 비강을 통한 폐 투여용으로 적합한 제형은, 바람직하게는 직경이 0.5 내지 7 마이크론의 범위인 활성 성분을 함유하는 입자가 수용체의 기관지내로 전달될 수 있도록 존재한다. 이러한 제형에 대한 가능성은, 이들이 흡입 장치내에서 사용하기 위해 예를 들면, 젤라틴의 삼키기 쉬운 캅셀제로서, 또는 달리는 활성 성분, 적합한 액체 추진제 및 임의로 표면활성제 및/또는 고체 희석제와 같은 다른 성분을 포함하는 자가-추진 제형으로서 편리하게 존재할 수 있는 미분된 산제 형태인 것이다. 자가-추진 제형은 또한, 활성 성분이 용액 또는 현탁액의 소적의 형태로 분산되는 경우에 사용할 수 있다. 이러한 자가-추진 제형은 당해 분야의 숙련가에게 유사하며 확립된 과정으로 제조할 수 있다. 이들은 수동으로 조작가능하거나 바람직한 분무 특성을 갖는 자동 작용 밸브를 적합하게 제공하며; 유리하게는 당해 밸브는 이의 각각의 작동시 고정된 용량, 예를 들면 50 내지 100μL를 전달하는 계량된 유형이다.

추가의 가능성에 있어서, 애쥬번트 성분은 분사기(atomiser) 또는 분무기(nebuliser)에서 사용하기 위한 용액의 형태일 수 있으며, 이에 의해 가속화된 공기스트림 또는 초음파 교반을 사용하여 흡입용의 미분 소적 미스트(mist)를 생성할 수 있다.

비강 투여용으로 적합한 제형은 일반적으로 폐 투여용으로 위에서 기술된 것과 유사한 설명을 포함하나, 이러한 제형은 비강내 보유할 수 있도록 약 10 내지 약 200 마이크론의 범위의 입자 직경을 지닐 수 있다. 이는, 적절하게는 적합한 입자 크기의 분말을 사용하거나 적절한 밸브를 선택함으로써 달성할 수 있다. 다른 적합한 제형은 코로 근접한 용기로부터 비강 통로를 통한 신속한 흡입에 의한 투여를 위해 입자 직경이 약 20 내지 약 500 마이크론인 조악한 분말, 및 수성 또는 유성 용액중 활성 성분 약 0.2 내지 5%w/w을 포함하는 비강 소적을 포함한다. 본 발명의 하나의 양태에서, 벡터가 1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 유도체와 같이 동일한 제형내에서 투여될 항원성 펩티드를 암호화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 것도 가능하다. 따라서, 당해 양태에서, 면역원 및 애쥬번트 성분은 동일한 제형내에서 발견된다.

하나의 양태에서 애쥬번트 성분 (ii) 및 면역원 성분 (iii)을 유전자-총 투여에 적합한 형으로 제조하고, 면역원을 암호화하는 누클레오티드 서열의 투여와 동시에 이러한 경로로 투여한다. 이러한 방식으로 사용하기에 적합한 제형을 제조하기 위해, 애쥬번트 성분 (ii) 및 면역원 성분 (iii)을 동결건조시키고 예를 들면, 유전자-총 투여에 적합한 금 비드상에 부착시키는 것이 필수적일 수 있다. 당 해 양태에서, 애쥬번트 성분 (i)은 별개의 조성물로 연속 투여할 수 있다.

대안적 양태에서, 애쥬번트 성분 (i) 또는 (ii), 또는 이들 둘다는 고압 가스 추진제를 통해 무수 분말로 투여될 수 있다. 하나 이상의 애쥬번트 성분은 면역원을 암호화하는 누클레오티드 서열의 투여와 동시에 수행할 수 있으며, 애쥬번트 성분 (ii)은 면역원 성분의 투여와 동시에 투여할 수 있다.

함께 제형화하지 않은 경우, 애쥬번트 성분 (i) 및 (ii)를 누클레오티드 서열과 동일한 투여 부위에 또는 투여 부위 근처에 투여하는 것이 적절할 수 있다.

약제학적 제제의 다른 세부사항은 이의 전문이 참조로 인용된 문헌[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennysylvania (1985)]에서 찾을 수 있다.

본원에 정의된 애쥬번트 성분은 예를 들면, 경구, 비강, 폐, 근육내, 피하, 경피 또는 국소 경로와 같은 각종의 상이한 투여 경로를 통해 유사하게 투여할 수 있다. 당해 성분들은 경피, 피하 또는 국소 경로를 통해 투여할 수 있다.

애쥬번트의 투여는 누클레오티드의 투여 전 약 14일째 내지 투여 후 약 14일 째에, 또는 누클레오티드 서열의 투여전 약 1일째 내지 투여 후 약 3일째에 수행할 수 있다. GM-CSF를 암호화하는 누클레오티드 서열은 면역원, 및 연속적으로 제공된 TLR 효능제인 성분의 투여와 동시에 투여할 수 있다. TLR 효능제인 성분은 항원 성분의 투여 전 정확히 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1일째, 또는 거의 또는 정확히 24, 22, 20, 18, 16, 14, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1시간째에 제공될 수 있다. TLR 효능제인 성분은 항원 성분 투여 후 거의 또는 정확히 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1일째, 또는 거의 또는 정확히 24, 22, 20, 18, 16, 14, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1시간째에 제공될 수 있다.

TLR 효능제인 성분은 나머지 성분들 투여 후 24시간 또는 약 24시간째에 제공될 수 있다. 성분 (ii) 및 (iii)의 투여 후 TLR 효능제 성분을 제공하는 것의 잇점은, 성분 (ii) 및 (iii)의 전달이 전달의 부위에서 IFNγ를 유도할 수 있기 때문이며; 이는 TLR 7 및/또는 8과 같은 TLR을 상향 조절하여 TLR 효능제에 대한 반응성을 증가시킬 수 있기 때문이다.

본 발명의 하나의 양태에서, 성분 (ii) 및 (iii)은 유전자 총 전달에 의한 동시 투여에 적합한 제형으로 존재하며, 애쥬번트 성분 (i)은 연속적인 국소 투여용의 별개 크림 제형으로 제공된다.

환자에게 원래의 폴리누클레오티드 또는 벡터를 도입시키기에 적합한 기술은 적절한 비히클을 사용한 국소 적용을 포함한다. 핵산은 피부에 국소 투여될 수 있거나 예를 들면, 비강, 경구, 질내 또는 직장내 투여로 점막 표면에 투여도리 수 있다. 원래의 폴리누클레오티드 또는 벡터는 포스페이트 완충 염수(PBS)와 같은 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 존재할 수 있다. DNA 흡수는 부피바카인과 같은 촉진제를 사용함으로써 별개로 또는 DNA 제형중에 포함시켜 촉진시킬 수 있다. 수용체에 핵산을 직접 투여하는 다른 방법은 미국 특허 5,697,901에 기술된 바와 같은 초음파, 전기 자극, 전기천공(electroporation) 및 미세살포(microseeding)를 포함한다.

핵산 작제물의 흡수는 예를 들면 형질감염제의 사용을 포함하는, 몇가지 공 지된 형질감염 기술에 의해 증진시킬 수 있다. 이러한 제제의 예는 양이온성 제제, 예를 들면, 칼슘 포스페이트 및 DEAE-덱스트란 및 예를 들면, 리포펙탐 및 트랜스펙탐과 같은 리포펙탐을 포함한다. 투여될 핵산의 투여량은 변경시킬 수 있다.

본 발명의 핵산 서열은 또한 형질전환된 세포의 수단으로 투여할 수 있다. 이러한 세포는 대상체로부터 수거된 세포를 포함한다. 본 발명의 원래의 폴리누클레오티드 또는 벡터는 이러한 세포로 시험관내에서 도입될 수 있으며 형질전환된 세포는 후에 대상체로 도입될 수 있다. 본 발명의 폴리누클레오티드는 동종 재조합 현상에 의해 세포내에서 이미 존재하는 핵산내로 통합될 수 있다. 경우에 따라, 형질전환된 세포는 시험관내에서 성장하고 하나 이상의 수득된 세포는 본 발명에서 사용될 수 있다. 세포는 공지된 외과 또는 미세수술 기술(예: 이식, 미세-주사 등)에 의해 환자의 적절한 부위에 제공될 수 있다.

본 발명자는, GM-CSF와 TLR 효능제의 조합이, DNA 백신접종에서 애쥬번트로 사용되는 경우, 특히 초회 주사(prime injection)후에 세포-매개된 면역학적 반응을 증가시킬 수 있음을 입증하였다. 본원에 사용된 것으로서 용어 애쥬번트 또는 애쥬번트 성분은, 유도체 또는 유도체를 포함하는 성분이 바람직한 양식으로 면역원에 대한 체 반응을 증진시키고/시키거나 개질시키도록 작용하는 것으로 의도된다. 따라서, 예를 들면, 애쥬번트를 사용하여 주로 Th1 반응에 대한 면역 반응을 이동(shift)시키거나, 또는 반응의 유형 둘다를 증가시킬 수 있다.

면역 반응의 TH1 유형의 유도인자는, 세포 매개된 반응이 생성되도록 할 수 있다. 높은 수준의 Th1-유형 시토카인은 제공된 항원에 대한 세포 매개된 면역 반응의 유도를 허용하는 경향이 있는 반면, 높은 수준의 Th2-유형 시토카인은 항원에 대한 체액성 면역 반응의 유도를 허용하는 경향이 있다.

Th1 및 Th2-유형 면역 반응의 구별이 절대적이지 않은 것을 기억하는 것이 중요하다. 실제로 개개인은 주로 Th1 또는 주로 Th2인 것으로 기술된 면역 반응을 지지할 것이다. 그러나, 모스만(Momann) 및 코프만(Coffman)에 의한 쥐 CD4 + ve T 세포 클론에서 기술된 것[참조: Mosmann, T. R. and Coffman, R. L. (1989) TH1 and TH2 cells : different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, p145-173]의 측면에서 시토카인 과를 고려하는 것이 유리하다. 전통적으로, Th1-유형 반응은 T-림프구에 의한 IFN-γ 및 IL-2 시토카인의 생산과 관련된다. 흔히 Th1-형 면역 반응의 유도와 직접적으로 관련된 다른 시토카인은 IL-12와 같은 T-세포에 의해 생산되지 않는다. 대조적으로, Th2-유형 반응은 I1-4, IL-5, IL-6 및 IL-10의 분비와 관련된다.

이제 본 발명을 하기 비-제한적인 실시예를 참조로 하여 추가로 기술할 것이다.

도입

본 실시예는, GM-CSF를 암호화하는 누클레오티드 분자 및 TLR 효능제의 항원성 펩티드에 대한 세포 면역 반응을 증가시키는데 있어서의 용도를 입증한다. 면역원성에 있어서의 현저한 차이가 관측되었으며; GM-CSF를 암호화하는 누클레오티 드와 TLR 효능제를 포함하는 애쥬번트의 사용은 하기 실시예에서 관측될 수 있는 바와 같이, 항원에 대한 면역 반응의 역학 및 기능성을 증진시킬 수 있으며, 이는 또한 본원에 요약한 하기 프로토콜 및 당해 분야에 잘 공지된 프로토콜에 의해 입증될 수 있다.

재료 및 방법

1. 발현 벡터: OVAcyt, 7VNTRMuc1, HIV RNG 및 GM-CSF 플라스미드의 작제

OVAcyt 플라스미드의 작제

닭 오브알부민의 분비되지 않은 형태를 암호화하는 유전자를 야생형 닭 ova 유전자의 분비 시그날(아미노산 20 내지 145번)을 결실시켜 작제하였다. 당해 절단된(truncated) 유전자는, 당해 유전자가 오브알부민 단백질의 분비되지 않은 세포질 형태인 것을 구별하기 위해 OVAcyt로 명명한다. 당해 유전자를 제한 부위를 도입시키는 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭시켜 DNA 백신 벡터 p7313내로 연결되도록 한다(세부사항은 WO 02/08435에 포함되어 있으며 이의 전체 내용은 본원에 참조로 인용된다).

도 1은 OvaCyt 유전자를 함유하는 발현 카세트의 서열을 나타낸다. Not1 및 BamH1에 대한 제한 효소 부위는 밑줄그어져 있으며, 개시 및 정지 코돈은 굵은 활자체로, 코작 서열(Kozak sequence)은 이탤릭체로 나타낸다.

GMCSF 플라스미드의 작제

마우스 GM-CSF를 cDNA 라이브러리로부터 클로닝하여 발현 벡터 pVACss2내로 클로닝하였다. 당해 cDNA 클론을 주형으로 사용하여 프라이머 혼입 코작 서열, 개 시 코돈 및 제한 효소 부위를 사용하는 PCR에 의해 mGM-CSF 개방 판독 프레임을 증폭시킴으로써 DNA 백신 벡터 p7313내로 클로닝되도록 하였다(참조: 상기 WO 02/08435). 도 2는 이러한 mGM-CSF 발현 카세트에 대한 암호화 서열을 나타낸다.

도 2에서, Nhe1 및 Asc1에 대한 제한 효소 부위는 밑줄그어져 있으며, 개시 및 정지 코돈은 굵은 활자체로, 코작 서열은 이탤릭체로 나타낸다.

RNG 플라스미드의 작제

불활성화된 코돈 최적화된 RT, 로와(lowa) 길이 HCMV 프로모터 + 엑손1의 HIV-1 클레이드(clade) B 균주 HXB2 하부로부터의 코돈 최적화된 gag 유전자의 절단된 Nef 및 p17/p24 부위, 및 토끼 β-글로빈 폴리-아데닐화 시그날의 상부.

작제물내 유전자의 순서는 p73i-Tgrn으로부터의 RT-trNef 및 p17p24 유전자의 PCR 증폭으로 달성하였다. 2개의 DNA 단편의 PCT 스티칭(stitching)을 수행하고 3kb 생성물을 겔 정제하고 Notl/BamHl을 Notl/BamHl 분해된 p7313ie와의 연결전에 절단하였다. 당해 서열을 표 4에 나타낸다.

MUC-1 작제물의 생성

7개의 VNTR 단위를 함유하는 MUC1 발현 벡터의 작제

당해 벡터의 작제는 국제 특허원 W003/100060에 기술되어 있으며, 이의 전문은 본원에 참조로 인용되어 있고, 이의 서열은 도 3a에 나타낸다.

MUC1의 C-말단에서 삽입된 HepB 헬퍼 에피토프를 사용한 MUC1 발현 카세트의 작제

2단계 과정을 사용하여 MUC1의 C-말단에 HepB 헬퍼 에피토프를 삽입하였다. 에피토프를 암호화하는 짧은 DNA 링커를 2개의 올리고 FORA 및 REVA를 어닐링시켜 생성시켰다. FOR 프라이머 10pmol, REV 프라이머 10pmol, 1X T4 DNA 리가제 완충제 및 10U T4 폴리누클레오티드 키나제를 총 20㎕의 용적으로 혼합하고 37℃에서 2시간 항온처리하고 우선 95℃에서 2분동안 가열한 후 -0.1℃/초 의 속도로 냉각시켜 어닐링하였다. 4℃에서 유지하였다. 수득되는 링커를 벡터 JNW729(C-말단)을 생성하는 pVAC의 NheI/XhoI 부위내로 연결시켰다. MUC1 발현 카세트를 Xbal 카세트상에서 벡터 JNW656으로부터 절단하여 벡터 JNW729의 NheI 부위내로 클로닝함으로써 벡터 JNW729(C-말단)를 생성하였다. 모든 벡터를 서열 검증하였다. JNW737의 서열은 도 3b에 나타내며, 여기서, 헬퍼 에피토프 서열은 박스로 처리하였다.

MUC1의 C-말단에 삽입된 RADRE 헬퍼 에피토프를 사용한 MUC1 발현 카세트의 작제

C-말단 융합을 우선 짧은 링커를 pVAC1내로 삽입시킴으로써 생성시켰다. 링커는 2개의 프라이머 PADREFOR 및 PADREREV를 어닐링하고 Nhel 및 Xhol 부위를 통해 pVAC1내로 링커를 클로닝함으로써 벡터 JNW800을 생성시켰다. JNW800내로, JNW656 (7x VNTR MUC1) 및 JNW758(코돈 최적화된 7x VNTR MUC1, 특허원 VB60033 참조)으로부터의 7x VNTR MUC1 발현 카세트를 XbaI 단편상에서 MUC1 카세트를 절단하고 Xbal 부위내로 클로닝함으로써 삽입하여 다음 2개의 벡터를 생성시켰다.

7x VNTR MUC1 C-말단 PADRE: JNW810

7x VNTR MUC1 (코돈 최적화됨) C-말단 PADRE: JNW812

JNW810 및 JNW812로부터의 MUC1 발현 카세트 및 PADRE 에피토프의 서열분석 은 도 3c에 나타낸다.

2. 작제물-물질의 시험

동물

CBAB6.F1은 C57BI6 마우스와 CBA 마우스의 교배이며 이들은 사용된 MUC1 Tg 마우스에 대한 야생형 유전자 배경이다. MUC1 Tg 마우스를 업자(Imperial Cancer Research Fund)로부터 입수하고 이들은 사람 MUC1 프로모터의 조절하에 사람 MUC1을 발현시킨다(참조: Peat et al, 1992). 이러한 마우스상에서 MUC1 발현 패턴은 사람 조직에서 관측된 발현 프로파일과 매우 유사하다. 챨스 리버(Charles River)로부터 입수한 C57/bl6 또는 Balb/C를 p73130VAcyt 및 p7313RNG를 포함하는 연구에서 사용하였다. RIP-OVAlo 마우스를 우리내 GSK에서 교배하였다.

2.1 2개의 플라스미드: p7313 OVAcyt (항원을 암호화하는 플라스미드) p7313RNG (항원을 암호화하는 플라스미드), 또는 pVAC 7VNTR Muc1 (항원을 암호화하는 플라스미드) 및 p7313 GMCSF 플라스미드 (GM-CSF를 암호화하는 플라스미드)의 동시-전달

플라스미드 DNA를 염화칼슘 및 스페르미딘을 사용하여 2㎛ 직경의 금 비드상에 침전시켰다. 항원을 암호화하는 플라스미드(p73130VAcyt, p7313RNG, pVAC7VNTRMuc1, pVAC7VNTRMuc1-PADRE 또는 pVAC7VNTRMuc1-HepB) 및 p7313GMCSF 플라스미드의 등량을 혼합하고 동시-침전시켜 모든 비드가 동일한 세포에 대해 플라스미드 둘다의 전달을 보증하는 2개 플라스미드의 혼합물로 피복시켰다. 달리 언급하지 않을 경우, 항원 및 GMCSF 둘다는 0.5㎍/카트리지상에 로딩하였다. 보다 적을 용량의 항원을 사용하는 경우 GMSCF 로딩은 0.5㎍이 남고 카트리지상의 총 DNA는 p7313empty 또는 pVACempty 플라스미드를 사용하여 1㎍으로 조절하였다. 로딩된 비드를 예를 들면, 문헌[참조: Eisenbraum, et al. 1993. DNA Cell Biol. 12: 791-797; Pertmer et al, 1996 J. Virol. 70: 6119-6125]에 기술된 바와 같이 Tefzel 튜빙상에 피복시켰다. 입자 충격을 악셀 유전자 전달(Accell gene delivery)(참조: 본원에 참조로 인용된 PCT WO 95/19799)을 사용하여 수행하였다. 암컷 C56BI/6 마우스를 결과 단락에서 상세히 나타낸 바와 같이 각각의 시점에서 플라스미드를 면도후 복부의 각각의 측면상에 1회씩, 2회 투여하여 면역화시켰다. 각각의 시점에서 총 용량의 DNA는 2㎍이었다. 이미퀴모드를 전달하는 경우, 이는 면역화 부위위에 크림 제형으로 국소적으로 면역화 후 24시간째에 적용하였다. 20㎕의 5% Aldara^TM 크림(3M)을 각각의 면역화 부위에 적용하였다. 미니피그의 경우에 각각 1㎍의 4회 면역화를 복부상에 면도후 제공하였다.

GpG 올리고누클레오티드의 동시-피복

CpG 올리고누클레오티드를 플라스미드의 동시-피복으로서 동일한 방법을 사용하여 금 비드상에 동시-피복시켰다. 올리고를 10:1의 올리고:플라스미드의 비로 DNA와 혼합하였다. 본 출원인은, 당해 플라스미드가 올리고누클레오티드에 의해 대체되지 않으며 10%의 올리고누클레오티드가 비드상에 침전되어 카트리지상에서 1:1의 비로 수득됨을 나타낸다. 10:1 비의 올리고 대 플라스미드를 사용한 동시-피복으로 1:1 비와 비교하여 카트리지상에서 올리고의 보다 높은 혼입이 달성된다. 당해 연구에 사용된 ODN은 표 1에 나타낸다. PTO ODNs CpG1826 (자극성 CpG) 및 GpC1745 (비 자극성 올리고) 및 DNA ODN를 MWG-Biotech AG로 합성하였다.

표 1. 당해 연구에 사용된 올리고누클레오티드의 목록

PTO (포스포로티오에이트) 잔기는 이탤릭체이며; CpG/GpC 모티프는 굵은 활자체로 나타낸다;

2.2 T 세포 반응에 대한 엘리스팟(ELISPOT) 검정

마우스 비장 세포의 제조

비장을 면역화후 7일째 또는 도면에 나타낸 시점에서 면역화된 마우스로부터 입수하였다. 비장을 유리 슬라이드사이에 활주시켜 가공하여 세포 현탁액을 제조하였다. 적혈구 세포를 염화암모늄 처리로 분해하고 세포 파편을 제거하고 비장세포의 미세한 현탁액을 남겼다. 세포를 엘리스팟 검정에서 사용하기 위해 RPMI 완전 배지상에서 4x10⁶/ml의 농도로 재현탁시켰다.

쥐 연구에 사용된 펩티드

OVA 검정 펩티드 SIINFEKL을 위해, OVA의 우세한 CD8 펩티드를 50nM의 최종 농도에서 검정에 사용하여 CD8 반응을 측정하고 펩티드 TEWTSSNVMEERKIKV를 10μM의 최종 농도로 사용하여 CD4 반응을 측정하였다. ICS 검정을 위해 오브알부민 단백질을 또한 사용하여 1mg/ml에서 CD4 반응을 측정하였다. p7313RNG 펩티드에 대 한 반응을 검출하기 위한 엘리스팟의 경우 CD8 펩티드 AMQMLKETI를 자극에 사용하였다. Muc1에 대한 반응을 검출하기 위해, CD4 펩티드 GGSSLSYTNPAVAATSANL 및 GEKETSATQRSSVPS를 10μM에서 사용하고 CD8 펩티드 SAPDNRPAL을 10nM에서 사용하였다. 마우스에서 Gag 및 RT에 대한 CD8 반응을 수반하기 위해 사용된 9-mer 펩티드는 각각 AMQLKETI (Gag CD8) 및 YYPDSKDLI (RT CD8)이며, Gag 및 RT에 대한 CD4 반응을 각각 IYKRWIILGLNKIVR (Gag CD4) 및 QWPLTEEKIKALVEI (RT CD4)를 사용하여 유발시켰다. 펩티드 EREVLEWRFDSRLAF (Nef 218)를 또한 시험하였다. 당해 펩티드를 10μM의 최종 농도에서 시험하였다. 펩티드는 업자(Genemed Synthesis, South San Francisco)로부터 입수하였다.

마우스 IFNg 및 IL-2 엘리스팟 검정

플레이트를 15㎍/ml (PBS 중) 랫트 항 마우스 IFNγ 또는 랫트 항 마우스 IL-2 (Pharmingen)으로 피복시켰다. 플레이트를 +4℃에서 밤새 피복시켰다. 사용전에 플레이트를 PBS로 3회 세척하였다. 비장을 플레이트에 4x10⁵ 세포/웰로 가하였다. 각각의 웰에서 총 용적은 200㎕이었다. 펩티드 자극시킨 세포를 함유하는 플레이트를 습윤처리된 37℃ 항온처리기내에서 16시간 동안 항온처리하였다.

엘리스팟 검정 플레이트의 개발

세포를 물로 1회(1분 침지시켜 세포의 분해를 보증) 세척하고 PBS로 3회 세척하여 플레이트로부터 제거하였다. 바이오틴 컨쥬게이션된 랫트 항 마우스 IFNγ 또는 IL-2 (Phamingen)을 PBS중 1㎍/ml에서 가하였다. 플레이트를 실온에서 2시간 동안 진탕시켜 항온처리하였다. 이후에 플레이트를 1/1000 희석의 스트렙트아비딘 알칼린 포스파타제(Caltage)의 첨가전에 3회 세척하였다. PBS중에서 3회 세척한 후 스팟을 BCICP 기질(Biorad)과 함께 15 내지 45분 동안 항온처리함으로써 나타내었다. 기질을 물로 세척하고 플레이트를 건조시켰다. 스팟을 상 분석 시스템[Brian Hayes에 의해 고안, Asthma Cell Biology unit, GSK] 또는 AID 엘리스팟 판독기(Cadama Biomedical, UK)을 사용하여 확인하였다.

2.3 펩티드 또는 단백질 자극에 대한 반응시 쥐 T 세포로부터 IFNγ 및 IL-2 생산을 검출하기 위한 유동 세포분석기

4 x10⁶ 비장 세포를 시험 튜브에 분취하고 회전시켜 펠렛화하였다. 상층액을 제거하고 샘플을 와동시켜 펠렛을 파괴하였다. 0.5㎍의 항-CD28 + 0.5㎍의 항-CD49d(Pharmingen)를 각각의 튜브에 가하고 실온에서 10분 동안 항온처리하였다. 1ml의 배지를 배지 단독, 또는 펩티드 또는 단백질과 배지를 적절한 농도로 함유하는 적절한 튜브에 가하였다. 이후에 샘플을 1시간 동안 37℃에서 가열된 수욕속에서 항온처리하였다. 10㎍/ml의 브레펠딘 A를 각각의 튜브에 가하고 37℃에서 항온처리를 5시간 동안 지속시켰다. 프로그램화된 수욕을 6℃로 하고, 이 온도를 밤새 유지시켰다.

이후에 샘플을 항-마우스 CD4-PerCP(Pharmingen) 및 항-마우스 CD8 APC로 염색하였다. p7313 RNG 실시예에서 CD4 사이크롬 및 CD8 바이오틴을 사용하고 샘플을 세척하고 스트렙트아비딘-ECD로 염색하였다. 샘플을 세척하고 lOO㎕의 고정액 을 실온에서 15분 동안 '인트라프렙 퍼미어빌라이제이션 시약(Intraprep Permeabilization Reagent)" 키트(Immunotech)로부터 가하였다. 세척후, 100㎕의 인트라프렙 키트(Intraprep kit)로부터의 퍼미어빌라이제이션 시약을 각각의 샘플에 항-IFNγ-PE + 항-IL-2-FITC(Immunotech)와 함께 가하였다. 샘플을 실온에서 15분 동안 항온처리하고 세척하였다. 샘플을 0.5ml 완충액속에 재현탁시키고 유동 세포분석기상에서 분석하였다.

총 500,000 세포를 샘플당 수집하고 후속적으로 CD4 및 CD8 세포를 사용하여 자극에 대한 반응시 IFNγ 및/또는 IL-2를 분비하는 세포 집단을 측정하였다.

2.4 사합체 염색 및 분석

현탁액중 100㎕의 전혈 또는 비장세포를 각각의 튜브에 가하였다. 5㎕의 피코에리테린(PE)으로 표지시킨 H2-kb SIINFEKL 사합체(Immunomics)를 실온에서 20분 동안 가하였다. 항-마우스 CD8-사이크롬 또는 APC를 가하고 추가로 10분 동안 항온처리하였다. 전혈을 분석하는 경우, 적혈구 세포를 제조업자의 지시에 따라서 "전혈 분해 용액"(Immunotech)으로 분해하였다. 세척후 샘플을 완충액속에 재현탁시키고 유동 세포계수기상에서 분석하였다. 400,000 현상을 샘플당 수집하였다.

3. 미니피그 데이타

미니피그의 면역화

미니피그를 배쪽 복부내로 4개 카트리지를 전달하여 면역화하였다. 14일 후에 말초 혈액 샘플을 말초 혈액 단핵 세포(BMC)를 제조하기 위해 수집하였다.

돼지 PBMC의 정제

돼지 혈액을 헤파린내로 수집하고, PBS속에서 2:1로 희석시키고 50ml의 팔콘 튜브(Falcon tube)속에서 히스토플라크(Histopaque)(Sigma)위에 층화하였다. 당해 튜브를 1200g에서 30분 동안 원심분리하고 돼지 림프구를 계면으로부터 수거하였다. 잔류 적혈구 세포를 염화암모늄 분해 완충액을 사용하여 분해하였다. 세포를 계수하고 완전한 RPMI 배지에서 2 x 10⁶/ml로 재현탁시켰다.

돼지 IFNg 엘리스팟 검정

플레이트를 8㎍/ml (PBS중)(정제된 마우스-돼지 IFNγ, Biosource ASC4934)로 피복하였다. 플레이트를 +4℃에서 밤새 피복하였다. 사용전에 플레이트를 PBS로 3회 세척하고 완전 RPMI 배지를 사용하여 2시간 동안 차단시켰다. PBMC를 플레이트에 2x10⁵ 세포/웰로 가하였다. 각각의 웰중 총 용적은 200㎕였다. 재조합 Gag, Nef 또는 RT 단백질(우리에서 제조)를 5㎍/ml의 최종 농도에서 가하였다. 플레이트를 습윤된 37℃ 항온처리기속에서 16시간 동안 항온처리하였다.

엘리스팟 검정 플레이트의 개발

세포를 물로 1회(1분 침지시켜 세포의 분해 보증) 및 PBS로 3회 세척하여 플레이트로부터 제거하였다. 바이오틴 컨쥬게이션된 항-돼지 IFNγ를 PBS중 0.5㎍/ml에서 가하였다. 플레이트를 실온에서 2시간 동안 진탕시켜 항온처리하였다. 이후에 플레이트를 스트렙트아비딘 알칼릴 포스파타제(Caltag)을 1/1000 희석으로 가하기전에 PBS로 3회 세척하였다. PBS속에서 3회 세척한 후 BCICP 기질(Biorad)과 함께 15 내지 45분 동안 항온처리하여 스팟을 나타내었다. 기질을 물을 사용하 여 세척제거하고 플레이트를 건조시켰다. 스팟을 AID 엘리스팟 판독기(Cadama Biomedical, UK)를 사용하여 확인하였다.

3. 결과

면역반응을 증가시키는 이미퀴모드

마우스를 2xO.5㎍ p731-RNG (GW825780X) 또는 대조군 empty 벡터를 사용하는 PMID에 의해 면역화하였다. 관련하여, 20㎕의 5% Aldara^TM 크림(3M)을 각각의 멱역화 영역내로 문질렀다. Aldara^TM 크림을 면역화후 24시간 적용하였다. 비장을 면역화후 14일째에 수거하고 세포 반응을 IFNyγ 엘리스팟에 이어서 GAG balb/c CD8 9mer 펩티드: AMQMLKETI를 사용한 자극으로 분석하였다. 당해 결과는 도 5에 나타낸다. 이 데이타를 면역화한 후 0시간 또는 24시간째에 이미퀴모드의 전달과 비교하며 면역화후 24시간째 적용이 우수한 애쥬번트 효과를 지님을 나타낸다.

염증 자극에 대한 반응시 TLR의 상향조절을 입증하기 위한 시험관내 데이타

IFNγ 처리된 DC상에서 TLR 발현의 태크만 분석(Taqman analysis)

단핵구를 3마리의 건강한 공여체의 PBMC로 분리하고 DC를 성숙시키기 위한 분화를 유도하기 위해 7일 동안 IL-4 및 GM-CSF와 함께 항온처리하였다. 이후에 DC를 IFNγ로 24시간 동안 처리하였다. TLR 1 내지 9의 mRNA 발현을 태크만으로 측정하였다. 당해 결과를 도 6에 나타낸다. 공개된 보고와는 대조적으로, 본 출원인은, 낮은 수준의 TLR7이 단핵구 기원한 DC상에서 구성적으로 발현됨을 나타내었다. IFNγ 처리에 이어서, TLR8의 발현 및 증가된 수준의 TLR7의 발현이 모든 3 개의 공여체에서 발견되었다. TLR2 또한 상향조절되었으나 정도가 보다 약하였다. 시험관내에서 자극후 24시간 째에 TLR7 발현에 있어서의 증가는 면역화후 24시간째에 이미퀴모드의 우수한 효과를 나타내는 도 5의 결과에 대한 설명을 제공한다.

레지퀴모드에 대한 Dc의 반응성을 증가시키는 IFNγ

본 출원인은, 레지퀴모드에 대한 이들 공여체로부터의 세포의 반응을 시험하였다. DC를 분리하고 앞서와 같이 GMCSF와 함께 항온처리하였다. 이후에 DC를 레지퀴모드로 처리하기 전, INFγ로 24시간 동안 처리하거나 처리하지 않고 두었다. 생성된 시토카인의 수준 및 표면 마커 발현을 측정하였다. 당해 결과를 도 7에 나타낸다. IFNγ 예비-처리는 레지퀴모드에 대한 이들 DC의 반응성을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 성숙 과정은 증강되었으며, 세포 표면 마커, 시토카인 생산 및 DC의 기능적 능력에 있어서의 증가를 초래하였다. 이러한 결과는, TLR7 및 TLR8이 DC 기원한 사람 단핵구에서 레지퀴모드에 대한 반응에 관련되어 있으며 면역화후 24시간째에 이미퀴모드의 전달을 지지한다.

초기 면역화후 p7313GMCSF에 대한 세포 반응을 증진시키는 GMCSF 동시-전달 및 이미퀴모드 적용

OVAcyt 및 p7313GMCSF와 이미퀴모드의 조합물을 사용한 면역화후 세포 반응을 엘리스팟에 이은 0일째 PMID에 의한 초기 면역화로 평가하였다. 카트리지를 0.5㎍ p7313OVAcyt 및 0.5㎍ p7313GMCSF 또는 empty 벡터 대조군을 사용하여 로딩하였다. 2회 발사로 제공된 마우스당 총 DNA 용량은 2㎍이었다. 검정 조건은 다음과 같다: SIINFEKL, 고 친화 CD8 펩티드 또는 CD4 에피토프를 함유하는 TEWTSSNVMEERKIKV를 사용한 자극. 엘리스팟 검정의 결과를 도 8에 나타내며, 당해 도는 GMCSF 또는 이미퀴모드가 p7313OVAcyt로 희석되는 경우 애쥬번트 효과를 나타낸다. 분석을 면역화후 7일째에 수행하였다. OVA+GMCSF+이미퀴모드 그룹에서, 계수를 위해 구별할 수 있는 것보다 많은 스팟을 함유한 CD8 IFNγ 엘리스팟은 GMCSF 또는 이미퀴모드 단독으로부터 큰 증가를 나타낸다. p73130VAcyt 단독을 사용한 면역화와 비교하여 현저히 증가된 기타 매개변수는 CD4 세포의 수 및 IFNγ를 분비하는 CD4 세포의 비율이었다.

동일한 면역화 스케쥴을 수반하는 추가의 시험에서, OVAcyt 및 p7313GMCSF 및 이미퀴모드와의 조합물을 사용한 면역화후 세포 반응을, 보다 큰 범위의 반응을 측정하는 능력을 지니는 유동 세포분석기로 평가하였다. 검정을 면역화후 7, 14 및 21일째에 비장세포에서 수행하였다. 검정 조건은 SIINFEKL 펩티드, 고 친화성 CD8 펩티드 또는 CD4 및 CD8 세포 둘다를 자극시키는 오브 알부민 단백질로 자극시켰다. 수행한 검정은 IFNγ 및 IL-2를 분비하는 CD4 및 CD8 세포, 및 반응하는 CD8 세포의 총 발생을 측정하기 위한 SIINFEKL Kb 사합체 염색의 발생에 대한 세포내 시토카인 염색이다. 도 9는, 초기 면역화후 7, 14 및 21일째에 사합체 염색에 의해 측정된 반응을 나타낸다. 앞서의 시험과 일치하여, GMCSF 및 이미퀴모드의 조합은 이들 단독보다 SIINFEKL 특이적인 CD8 세포의 발생을 유도함이 밝혀졌다. 도 10은, IFNγ 및/또는 IL-2를 분비하는 CD4 및 CD8 세포의 비를 나타낸다. 엘리스팟 결과와 일치하여 GMCSF 및 이미퀴모드의 조합물은 가장 강력한 반응을 유도하였다. 이는 CD8 세포 및 CD4 세포 둘다로부터의 시토카인 분비에 대한 경우이다. 특히, INFγ 및 IL-2를 분비하는 CD4 세포의 수가 일반적으로 증가하였다.

초기 및 부스트 면역화에 이은 p73130VAcyt에 대한 세포 반응을 증진시키는 GMCSF 동시-전달의 존재 또는 부재하에서의 이미퀴모드 적용

마우스를 p73130VAcyt로 0일째 및 28일째에 면역화시켰다. 이들을 단독으로 또는 p7313GMCSF와 동시-전달하며, 일부 그룹은 면역화후 24시간째에 이미퀴모드를 적용시킨다. 초기 및 부스트를 사용한 면역화 스케쥴을 위해, p73130VAcyt의 용량을 0.005㎍/카트리지로 감소시켰다. p7313GMCSF는 존재하는 경우 0.5㎍/카트리지에서 전달하였다. 비장을 부스트후 7일째에 수거하고 엘리스팟에 이어 오브알부민 CD4 및 CD8 펩티드를 사용하여 밤새 자극시켜 분석하였다. 24시간째에 이미퀴모드의 투여와 함께 GMCSF의 동시-전달은 세포 반응 및 특히 Ova 단독과 비교하여 CD4 및 CD8 세포 둘다에 의한 IFNγ 생산을 증진시켰다.

Muc1에 대한 세포 반응시 GMCSF 및 이미퀴모드의 효과

시험을 수행하여 pVAC7VNTR Muc1에 대한 반응시 GMCSF 및 이미퀴모드 처리의 효과를 측정하였다. 마우스를 pVAC7VNTR muc1으로 0일 및 21일째에 면역화하였다. 이를 단독으로 전달하거나, p7313GMCSF와 함께 동시-전달하거나, 또는 p7313GMCSF 및 이미퀴모드 적용과 함께 면역화후 24시간째에 전달하였다. 비장을 부스트 7일째에 수거하고 엘리스팟에 이어 Muc1 CD4 펩티드를 사용한 밤새 자극으로 분석하였다. pVAC 7VNTRMuc1 단독을 사용한 면역화와 비교하여 p7313 GMCSF 또는 이미퀴모드의 적용의 동시-투여가 CD4 반응을 증진시키는 것으로 밝혀졌다. 24시간째에 이미퀴모드의 투여와 결합된 GMCSF의 동시-전달은 또한 반응을 증진시켰다(도 12).

추가의 시험을 수행하여 Muc1 반응시 GMCSF 및 이미퀴모드의 효과를 시험하였다. 내성 파괴 시험을 위해, 사람 Muc1에 대해 유전자삽입된 Muc1 Sacll 마우스를 사용하였다. 이들 마우스는 CBA/C57/bl6 배경으로 생성되므로, 이러한 유전자 배경을 지닌 마우스를 대조군으로 사용하였다. CBA/C57/bl6 F1 마우스 또는 SacII 마우스를 GMCSF 동시-전달과 함께 또는 이의 전달없이 동시-전달된 pVac empty, pVac7VNTRMuc1 또는 PVAC7VNTR-PADRE 로 면역화시켰다. GMCSF 그룹은 24시간 후 이미퀴모드를 적용하였다. 마우스를 0일째, 28일째, 42일째에 면역화하고 49일째에 선택하였다. CD4 세포로부터 IFNg 및 IL-2 분비를 IFNg 및 IL-2 엘리스팟에 이어 Muc1 CD4 펩티드 GGSSLSYTNPAVAATSANL (298) 및 GEKETSATQRSSVPS (192) 또는 PADRE 펩티드 AKFVAAWTLKAAA로 자극시켜 측정하였다. IFNg 및 IL-2 분비를 또한 동일한 자극을 사용하여 ICS로 측정하였다. p7313 GMCSF 및 이미퀴모드를 투여받은 야생형 마우스의 그룹에서의 반응이 최고 높은 CD4 반응을 지녔다. 이는 PADRE 펩티드 또는 Muc1 펩티드에 대한 반응의 경우 사실이다. 7VNTRMuc1 + GMCSF/이미퀴모드로 면역화시킨 SacII 마우스는 펩티드 GGSSLSYTNPAVAATSANL (298)에 대해 Muc1 CD4 반응을 지니므로 내성이 당해 마우스에서는 파괴되었다. pVac7VNTR PADRE + GMCSF 이미퀴모드로 면역화시킨 SacII 마우스는 PADRE에 대해 높은 반응을 나타내나(24%의 CD4 세포) Muc1에 대해 내성은 파괴되지 않았다. 이는 Muc1 반응에 걸쳐 PADRE 반응의 면역우세성에 기인할 수 있다(도 13). 동일한 프로토콜을 사용하는 추가의 시험에서(도 14), SacII 마우스를 GMCSF의 동시-전달 또는 전달없이 동시-전달시킨 pVac empty, pVac7VNTRMuc1, PVAC7VNTR-PADRE 또는 PVAC7VNTR HepB로 면역화시켰다. 당해 시험에서 HepB 및 PADRE에 대한 CD4 반응은 GMCSF 및 이미퀴모드의 존재하에서 증진되었으며 Muc1 CD4 펩티드 298에 대한 CD4 내성은 7VNTR 작제물 및 7VNTRHepB 작제물에 의해 차단되었다.

p7313RNG 플라스미드에 의해 암호화된 HIV 항원에 대한 반응을 증진시키는 GMCSF 및 이미퀴모드

암컷 Balb/c (K2^d) 마우스를 파워제트 연구 장치(Powderject research device)를 사용하여 PMID로 2개 카트리지를 전달함으로써 면역화시켰다. 2개 용량의 항원을 카트리지당 0.5 및 0.05㎍으로 사용하였다. 경우에 따라 면역화후 24시간 째에, 이미퀴모드를 적용시켰다. 그룹당 3개의 마우스를 면역화후 7일째에 선택하고 엘리스팟 검정에 의한 세포 반응을 분석하기 위해 비장을 제거하였다. Gag및 RT에 대한 CD8 반응을 수행하기 위해 사용된 9-mer 펩티드는 각각 AMQLKETI (Gag CD8) 및 YYPDSKDLI (RT CD8)이며, Gag 및 RT에 대한 CD4 반응은 IYKRWIILGLNKIVR (Gag CD4) 및 QWPLTEEKIKALVEI (RT CD4)를 각각 사용하여 수행하였다. 펩티드 EREVLEWRFDSRLAF (Nef 218)를 또한 시험하였다. Gag 및 RT CD4 및 CD8 펩티드에 대한 반응은 이들 단독과 비교하여 이미퀴모드와 결합된 GMCSF의 존재하에 매우 큰 정도로 증진되었다. 이들 결과는 오브알부민 및 Muc1 데이타와 일치하며, 여기서, GMCSF/이미퀴모드 조합은 CD4 세포 특이성에 있어서 강한 효과를 지닌다.

초기 면역화후 p73130VA에 대한 반응을 증진시키는 GMCSF 및 CpG 올리고누클 레오티드

C57/bl6 마우스를 그래프의 축 표지에 나타낸 바와 같이 OVAcyt 및 CpG 1826, CpG1745, 및 GMCSF의 조합으로 피복시킨 카트리지를 사용하여 PMID로 면역화시켰다. 카트리지의 생성은 물질 및 방법란에 기술되어 있다. 나타낸 바와 같이 마우스를 또한 면역화후 24시간 째에 국소 이미퀴모드(Aldara^TM)로 처리하였다. 마우스를 면역화후 7일째에 선택하고 비장세포를 분석하였다. 펩티드 SIINFEKL을 사용하여 CD8 반응(10nM)을 측정하고 펩티드 TEWTSSNVMEERIKV(10㎛)을 사용하여 CD4 반응을 측정하였다(도 16). p73130VAcyt를 사용한 CpG 올리고 1826의 동시-피복은 SIINFEKL 펩티드에 의해 측정한 바와 같이 CD8 반응시 양성 효과를 지니는 것으로 밝혀졌다. CpG 1745, 음성 대조군 올리고는 비특이적인 애쥬번트 효과를 지니나 이는 1826과 비교하여 현저히 감소되어 있다. GMCSF를 사용한 TLR 리간드 CpG 1826의 공동작용은 이미퀴모드를 사용하여 발견된 것과 유사하였다.

초기 면역화후 p73130VA에 대한 세포독성 반응을 증진시키는 GMCSF 및 이미퀴모드

C57/bl6 마우스를 PMID에 의해 OVAcyt 또는 OVAcyt+GMCSF로 면역화시켰다. 면역화후 24시간째에 이미퀴모드를 면역화부위에 적용시켰다. 초기 면역화후 7일째에 각각의 그룹에서 3마리의 마우스로부터의 비장 세포를 수거하고 세포독성을 물질 및 방법란에서 기술한 바와 같이 시험관내 세포독성 검정으로 측정하였다. 검정을 생체외에서 직접 및 이후 7일 확장 둘다로 수행하였다. 둘다의 조건에서 최대 세포독성은 GMCSF+이미퀴모드 그룹에서 발견되었으며, 이는, 반응하는 T 세포의 수에 있어서의 증가가 기능적으로 관련성이 있음을 나타낸다(도 17). 초기 면역화후 p73130VA에 대한 세포독성 반응시 GMCSF 및 이미퀴모드의 효과를 또한 생체내 세포독성 검정으로 측정하였다(도 18). C57/bl6 마우스를 OVAcyt 또는 OVAcyt+GMCSF를 사용하여 PMID에 의해 면역화시켰다. 면역화후 24시간 째에 이미퀴모드를 면역화부위에 적용시켰다. 면역화후 7, 14, 21 및 42일째에 마우스에게 동량의 엄버(umber)속에서 펄스하거나 펄스하지 않은 SIINFEKL 펩티드로 이루어진 SCFE 표지된 비장세포를 사용하여 정맥내 주사하였다. 2시간 후 혈액을 유동 세포기로 분석하고 잔류하는 펄스되지 않은 세포에 대한 펄스된 세포의 비를 계산하여 세포독성의 수치를 제공하였다. 비록 이미퀴모드 단독 및 GMCSF/이미퀴모드가 OVA 단독에 걸쳐 명백한 잇점을 제공한다고 해도, 그룹당 3마리의 마우스를 사용하는 이들 그룹 간의 명백한 차이는 없다. 이러한 이유로 그룹당 6 또는 7마리의 마우스를 비교하는 추가의 시험을 설정하였다. 당해 시험에서, 특이적 분해율에서 명백한 차이가 그룹간에 발견되었으며 이미퀴모드 단독 그룹에서보다 GMCSF+이미퀴모드 그룹에서의 마우스 모두가 보다 높은 특이적인 분해를 나타내었다(도 19b).

GM-CSF + 이미퀴모드를 사용하는 RIP OVAlo 마우스에서 내성 파괴

RIP OVAlo 마우스를 사용하여 GMCSF+이미퀴모드 조합물의 내성 차단에 대한 효능을 시험하였다(도 20). RIP OVAlo 마우스는 췌장의 인슐린 생산 베타 세포에서 오브알부민(OVA)을 발현하므로 당해 분자에 대해 내성이다. 당해 내성의 파괴는 당뇨 및 혈당 수준을 측정함으로써 용이하게 모니터할 수 있는 당뇨병을 이끄는 베타 세포의 자가면역 파괴를 초래한다. RiPova lo 및 C57/BL6 마우스(대조군 그룹 중량)를 empty 벡터 또는 OVAcyt(PMID 사용), ±GM-CSF(PMID 사용), 및 ±이미퀴모드를 사용하여 4회 면역화시켰다. 면역화는 3주 간격에서 제공하였다. 이미퀴모드를 PMID후 24시간째에 면역화부위에 국소 적용하였다. 최종 면역화 후 7일째에 비장세포 및 혈청 샘플을 취하였다. CD4+T 세포에서 IFNγ 및 IL2 생산을 TEWTSSNVMEERIKV 펩티드로 재자극시킨 비장세포상에서 세포내 시토카인 염색으로 모니터하였다. CD8⁺ T 세포에서 IFNγ 및 IL2 생산을 SIINFEKL 펩티드로 재자극시킨 비장세포상에서 세포내 시토카인 염색으로 모니터하였다. CD8⁺ T세포의 H-2Kb SIINFEKL 사합체 분석을 비장세포상에서 수행하였다. 당해 결과는, CD4 내성 GMCSF+이미퀴모드를 차단시키는 것이 요구됨을 나타낸다(도 20A). CD8 세포의 경우에, GMCSF 단독 및 이미퀴모드 그룹 단독에서 반응이 존재하나 당해 반응은 GMCSF+이미퀴모드 그룹에서 더욱 높다. 이는 또한, CD8 반응이 사합체로 모니터되는 경우이다(도 20C). 당해 모델에서 내성 파괴에 대한 작용 시험은 당뇨병의 진행이다. 이는 뇨당 수준으로 측정한다. 당해 시험을 사용하여, GMCSF 및 이미퀴모드를 결합시키는 면역화 스케쥴은 명백히 우수하다(도 20E). 당해 시험은, 다수 부스트를 포함하는 스케쥴에서 GMCSF의 혼입의 중요성을 나타내며, 여기서의 목적은 작용적 반응의 생성을 유도하는 내성 파괴이다.

미니피그에서 p7313RNG(GW825780X)에 대한 초기 반응을 증진시키는 GM-CSF 및 이미퀴모드

고팅겐(Gottingen) 미니피그를 배쪽 복부상에 4회 투여(즉, 4개 카트리지)하여 면역화시켰다. 각각의 카트리지는 0.5㎍의 p7313RNG 및 0.5㎍의 p7313empty 또는 p7313GMCSF(도 21에 대한 설명에서 상세히 기술함)로 구성되었다. 초기 면역화후 14일째에, 혈액을 샘플화하고, PBMC를 정제하고 항원-특이적 IFNγ를 분비하는 세포 수를 엘리스팟으로 측정하였다(도 21). 이들 결과는, GMCSF 또는 이미퀴모드 단독에 의해 매개된 것보다 높은 GMCSF+이미퀴모드 조합에 의해 매개된 애쥬번트 효과가 존재함을 나타낸다.

본 발명자는, GM-CSF를 암호화하는 누클레오티드와 함께 TLR 효능제를 포함하는 애쥬번트의 장점이, 본 발명의 애쥬번트 시스템이 가지 세포의 성숙 및 완전한 활성화를 이끈다는 것이라는 것을 측정하였다. 이는 결국 누클레오티드 서열에 의해 암호화된 항원에 대한 더욱 증진된 초기 면역 반응을 이끈다. 이러한 개선은 다수의 특이 세포 및 세포독성 활성으로 측정할 수 있다. 또한, 항원에 대한 면역 시스템, 또는 알레르기 유발을 견딜 위험성은 현저히 감소된다. 또한, 애쥬번트 시스템은 일련의 면역화로서 투여되는 경우 누클레오티드 서열에 의해 암호화된 자가-항원에 대한 내성을 극복할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Glaxo Group Ltd Gary Bembridge Jennifer Craigen <120> Improvements in Vaccination <130> VB60454 <160> 29 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 1 tccatgagct tcctgagtc 19 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Gallus gallus <400> 2 Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu 1 5 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Gallus gallus <400> 3 Thr Glu Trp Thr Ser Ser Asn Val Met Glu Glu Arg Lys Ile Lys Val 1 5 10 15 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HIV virus <400> 4 Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile 1 5 <210> 5 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapiens <400> 5 Gly Gly Ser Ser Leu Ser Tyr Thr Asn Pro Ala Val Ala Ala Thr Ser 1 5 10 15 Ala Asn Leu <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapiens <400> 6 Gly Glu Lys Glu Thr Ser Ala Thr Gln Arg Ser Ser Val Pro Ser 1 5 10 15 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapiens <400> 7 Ser Ala Pro Asp Asn Arg Pro Ala Leu 1 5 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HIV virus <400> 8 Ala Met Gln Leu Lys Glu Thr Ile 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HIV virus <400> 9 Tyr Tyr Pro Asp Ser Lys Asp Leu Ile 1 5 <210> 10 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HIV virus <400> 10 Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys Ile Val Arg 1 5 10 15 <210> 11 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HIV virus <400> 11 Gln Trp Pro Leu Thr Glu Glu Lys Ile Lys Ala Leu Val Glu Ile 1 5 10 15 <210> 12 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HIV virus <400> 12 Glu Arg Glu Val Leu Glu Trp Arg Phe Asp Ser Arg Leu Ala Phe 1 5 10 15 <210> 13 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial PADRE epitope <400> 13 Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala 1 5 10 <210> 14 <211> 798 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gallus gallus <400> 14 gcggccgcca tgggctccat cggtgcagca agcatggaat tttgttttga tgtattcaag 60 gagctcatca attcctgggt agaaagtcag acaaatggaa ttatcagaaa tgtccttcag 120 ccaagctccg tggattctca aactgcaatg gttctggtta atgccattgt cttcaaagga 180 ctgtgggaga aaacatttaa ggatgaagac acacaagcaa tgcctttcag agtgactgag 240 caagaaagca aacctgtgca gatgatgtac cagattggtt tatttagagt ggcatcaatg 300 gcttctgaga aaatgaagat cctggagctt ccatttgcca gtgggacaat gagcatgttg 360 gtgctgttgc ctgatgaagt ctcaggcctt gagcagcttg agagtataat caactttgaa 420 aaactgactg aatggaccag ttctaatgtt atggaagaga ggaagatcaa agtgtactta 480 cctcgcatga agatggagga aaaatacaac ctcacatctg tcttaatggc tatgggcatt 540 actgacgtgt ttagctcttc agccaatctg tctggcatct cctcagcaga gagcctgaag 600 atatctcaag ctgtccatgc agcacatgca gaaatcaatg aagcaggcag agaggtggta 660 gggtcagcag aggctggagt ggatgctgca agcgtctctg aagaatttag ggctgaccat 720 ccattcctct tctgtatcaa gcacatcgca accaacgccg ttctcttctt tggcagatgt 780 gtttcccctt aaggatcc 798 <210> 15 <211> 449 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mus <400> 15 gctagcgcca caaccatgtg gctgcagaat ttacttttcc tgggcattgt ggtctacagc 60 ctctcagcac ccacccgctc acccatcact gtcacccggc cttggaagca tgtagaggcc 120 atcaaagaag ccctgaacct cctggatgac atgcctgtca cattgaatga agaggtagaa 180 gtcgtctcta acgagttctc cttcaagaag ctaacatgtg tgcagacccg cctgaagata 240 ttcgagcagg gtctacgggg caatttcacc aaactcaagg gcgccttgaa catgacagcc 300 agctactacc agacatactg ccccccaact ccggaaacgg actgtgaaac acaagttacc 360 acctatgcgg atttcataga cagccttaaa acctttctga ctgatatccc ctttgaatgc 420 aaaaaaccag tccaaaaatg aggcgcgcc 449 <210> 16 <211> 1818 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapiens <400> 16 gctagcgcca ccatgtctag aacaccgggc acccagtctc ctttcttcct gctgctgctc 60 ctcacagtgc ttacagttgt tacaggttct ggtcatgcaa gctctacccc aggtggagaa 120 aaggagactt cggctaccca gagaagttca gtgcccagct ctactgagaa gaatgctgtg 180 agtatgacca gcagcgtact ctccagccac agccccggtt caggctcctc caccactcag 240 ggacaggatg tcactctggc cccggccacg gaaccagctt caggttcagc tgccacctgg 300 ggacaggatg tcacctcggt cccagtcacc aggccagccc tgggctccac caccccgcca 360 gcccacgatg tcacctcagc cccggacaac aagccagccc cgggctccac cgccccccca 420 gcccacggtg tcacctcggc cccggacacc aggccggccc cgggctccac cgccccccca 480 gcccacggtg tcacctcggc cccggacacc aggccggccc cgggctccac cgccccccca 540 gcccacggtg tcacctcggc cccggacacc aggccggccc cgggctccac cgccccccca 600 gcccacggtg tcacctcggc cccggacacc aggcccgccc cgggctccac cgccccccca 660 gcccacggtg tcacctcggc cccggacacc aggcccgccc cgggctccac cgcgcccgca 720 gcccacggtg tcacctcggc cccggacacc aggccggccc cgggctccac cgccccccaa 780 gcccacggtg tcacctcggc cccggacacc aggccggccc cgggctccac cgccccccca 840 gcccatggtg tcacctcggc cccggacaac aggcccgcct tgggctccac cgcccctcca 900 gtccacaatg tcacctcggc ctcaggctct gcatcaggct cagcttctac tctggtgcac 960 aacggcacct ctgccagggc taccacaacc ccagccagca agagcactcc attctcaatt 1020 cccagccacc actctgatac tcctaccacc cttgccagcc atagcaccaa gactgatgcc 1080 agtagcactc accatagcac ggtacctcct ctcacctcct ccaatcacag cacttctccc 1140 cagttgtcta ctggggtctc tttctttttc ctgtcttttc acatttcaaa cctccagttt 1200 aattcctctc tggaagatcc cagcaccgac tactaccaag agctgcagag agacatttct 1260 gaaatgtttt tgcagattta taaacaaggg ggttttctgg gcctctccaa tattaagttc 1320 aggccaggat ctgtggtggt acaattgact ctggccttcc gagaaggtac catcaatgtc 1380 cacgacgtgg agacacagtt caatcagtat aaaacggaag cagcctctcg atataacctg 1440 acgatctcag acgtcagcgt gagtgatgtg ccatttcctt tctctgccca gtctggggct 1500 ggggtgccag gctggggcat cgcgctgctg gtgctggtct gtgttctggt tgcgctggcc 1560 attgtctatc tcattgcctt ggctgtctgt cagtgccgcc gaaagaacta cgggcagctg 1620 gacatctttc cagcccggga tacctaccat cctatgagcg agtaccccac ctaccacacc 1680 catgggcgct atgtgccccc tagcagtacc gatcgtagcc cctatgagaa ggtttctgca 1740 ggtaatggtg gcagcagcct ctcttacaca aacccagcag tggcagccac ttctgccaac 1800 ttgtctagat agctcgag 1818 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial oligonucleotide <400> 17 tccatgacgt tcctgacgtt 20 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial oligonucleotide <400> 18 tctcccagcg tgcgccat 18 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial oligonucleotide <400> 19 accgatgacg tcgccggtga cggcaccacg 30 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial oligonucleotide <400> 20 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial oligonucleotide <400> 21 tccatgacgt tcctgatgct 20 <210> 22 <211> 598 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapiens <400> 22 Met Ser Arg Thr Pro Gly Thr Gln Ser Pro Phe Phe Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Thr Val Leu Thr Val Val Thr Gly Ser Gly His Ala Ser Ser Thr Pro 20 25 30 Gly Gly Glu Lys Glu Thr Ser Ala Thr Gln Arg Ser Ser Val Pro Ser 35 40 45 Ser Thr Glu Lys Asn Ala Val Ser Met Thr Ser Ser Val Leu Ser Ser 50 55 60 His Ser Pro Gly Ser Gly Ser Ser Thr Thr Gln Gly Gln Asp Val Thr 65 70 75 80 Leu Ala Pro Ala Thr Glu Pro Ala Ser Gly Ser Ala Ala Thr Trp Gly 85 90 95 Gln Asp Val Thr Ser Val Pro Val Thr Arg Pro Ala Leu Gly Ser Thr 100 105 110 Thr Pro Pro Ala His Asp Val Thr Ser Ala Pro Asp Asn Lys Pro Ala 115 120 125 Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp 130 135 140 Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr 145 150 155 160 Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala 165 170 175 His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr 180 185 190 Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala 195 200 205 Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp 210 215 220 Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Ala Ala His Gly Val Thr 225 230 235 240 Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Gln Ala 245 250 255 His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr 260 265 270 Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Asn Arg Pro Ala 275 280 285 Leu Gly Ser Thr Ala Pro Pro Val His Asn Val Thr Ser Ala Ser Gly 290 295 300 Ser Ala Ser Gly Ser Ala Ser Thr Leu Val His Asn Gly Thr Ser Ala 305 310 315 320 Arg Ala Thr Thr Thr Pro Ala Ser Lys Ser Thr Pro Phe Ser Ile Pro 325 330 335 Ser His His Ser Asp Thr Pro Thr Thr Leu Ala Ser His Ser Thr Lys 340 345 350 Thr Asp Ala Ser Ser Thr His His Ser Thr Val Pro Pro Leu Thr Ser 355 360 365 Ser Asn His Ser Thr Ser Pro Gln Leu Ser Thr Gly Val Ser Phe Phe 370 375 380 Phe Leu Ser Phe His Ile Ser Asn Leu Gln Phe Asn Ser Ser Leu Glu 385 390 395 400 Asp Pro Ser Thr Asp Tyr Tyr Gln Glu Leu Gln Arg Asp Ile Ser Glu 405 410 415 Met Phe Leu Gln Ile Tyr Lys Gln Gly Gly Phe Leu Gly Leu Ser Asn 420 425 430 Ile Lys Phe Arg Pro Gly Ser Val Val Val Gln Leu Thr Leu Ala Phe 435 440 445 Arg Glu Gly Thr Ile Asn Val His Asp Val Glu Thr Gln Phe Asn Gln 450 455 460 Tyr Lys Thr Glu Ala Ala Ser Arg Tyr Asn Leu Thr Ile Ser Asp Val 465 470 475 480 Ser Val Ser Asp Val Pro Phe Pro Phe Ser Ala Gln Ser Gly Ala Gly 485 490 495 Val Pro Gly Trp Gly Ile Ala Leu Leu Val Leu Val Cys Val Leu Val 500 505 510 Ala Leu Ala Ile Val Tyr Leu Ile Ala Leu Ala Val Cys Gln Cys Arg 515 520 525 Arg Lys Asn Tyr Gly Gln Leu Asp Ile Phe Pro Ala Arg Asp Thr Tyr 530 535 540 His Pro Met Ser Glu Tyr Pro Thr Tyr His Thr His Gly Arg Tyr Val 545 550 555 560 Pro Pro Ser Ser Thr Asp Arg Ser Pro Tyr Glu Lys Val Ser Ala Gly 565 570 575 Asn Gly Gly Ser Ser Leu Ser Tyr Thr Asn Pro Ala Val Ala Ala Thr 580 585 590 Ser Ala Asn Leu Ser Arg 595 <210> 23 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hepatitis B virus <400> 23 Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu 1 5 10 <210> 24 <211> 1878 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapiens <400> 24 gctagagcca ccatggctag aacaccgggc acccagtctc ctttcttcct gctgctgctc 60 ctcacagtgc ttacagttgt tacaggttct ggtcatgcaa gctctacccc aggtggagaa 120 aaggagactt cggctaccca gagaagttca gtgcccagct ctactgagaa gaatgctgtg 180 agtatgacca gcagcgtact ctccagccac agccccggtt caggctcctc caccactcag 240 ggacaggatg tcactctggc cccggccacg gaaccagctt caggttcagc tgccacctgg 300 ggacaggatg tcacctcggt cccagtcacc aggccagccc tgggctccac caccccgcca 360 gcccacgatg tcacctcagc cccggacaac aagccagccc cgggctccac cgccccccca 420 gcccacggtg tcacctcggc cccggacacc aggccggccc cgggctccac cgccccccca 480 gcccacggtg tcacctcggc cccggacacc aggccggccc cgggctccac cgccccccca 540 gcccacggtg tcacctcggc cccggacacc aggccggccc cgggctccac cgccccccca 600 gcccacggtg tcacctcggc cccggacacc aggcccgccc cgggctccac cgccccccca 660 gcccacggtg tcacctcggc cccggacacc aggcccgccc cgggctccac cgcgcccgca 720 gcccacggtg tcacctcggc cccggacacc aggccggccc cgggctccac cgccccccaa 780 gcccacggtg tcacctcggc cccggacacc aggccggccc cgggctccac cgccccccca 840 gcccatggtg tcacctcggc cccggacaac aggcccgcct tgggctccac cgcccctcca 900 gtccacaatg tcacctcggc ctcaggctct gcatcaggct cagcttctac tctggtgcac 960 aacggcacct ctgccagggc taccacaacc ccagccagca agagcactcc attctcaatt 1020 cccagccacc actctgatac tcctaccacc cttgccagcc atagcaccaa gactgatgcc 1080 agtagcactc accatagcac ggtacctcct ctcacctcct ccaatcacag cacttctccc 1140 cagttgtcta ctggggtctc tttctttttc ctgtcttttc acatttcaaa cctccagttt 1200 aattcctctc tggaagatcc cagcaccgac tactaccaag agctgcagag agacatttct 1260 gaaatgtttt tgcagattta taaacaaggg ggttttctgg gcctctccaa tattaagttc 1320 aggccaggat ctgtggtggt acaattgact ctggccttcc gagaaggtac catcaatgtc 1380 cacgacgtgg agacacagtt caatcagtat aaaacggaag cagcctctcg atataacctg 1440 acgatctcag acgtcagcgt gagtgatgtg ccatttcctt tctctgccca gtctggggct 1500 ggggtgccag gctggggcat cgcgctgctg gtgctggtct gtgttctggt tgcgctggcc 1560 attgtctatc tcattgcctt ggctgtctgt cagtgccgcc gaaagaacta cgggcagctg 1620 gacatctttc cagcccggga tacctaccat cctatgagcg agtaccccac ctaccacacc 1680 catgggcgct atgtgccccc tagcagtacc gatcgtagcc cctatgagaa ggtttctgca 1740 ggtaatggtg gcagcagcct ctcttacaca aacccagcag tggcagccac ttctgccaac 1800 ttgtctagct ggattcgcac tcctccagcc tatagaccac caaatgcccc tatcttatca 1860 acacttccgt gactcgag 1878 <210> 25 <211> 1857 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapiens <400> 25 gctagcgcca ccatgtctag aacccctggc acccagtccc ccttctttct cctgctgctg 60 ctcaccgtgc tgaccgtcgt gaccggcagt gggcatgcgt cctcgacgcc cggcggcgag 120 aaggagacca gtgctaccca gcgcagctct gtgccttcca gcacggagaa gaacgctgtg 180 agtatgactt cctccgtgct gtcctcccat agccccggct cgggcagctc caccacccag 240 gggcaggacg tgacactggc tcccgcaacc gagcccgcct ctggctctgc cgccacctgg 300 ggccaggacg tgacatccgt gcccgtgacc cgccccgccc tgggcagcac caccccccct 360 gctcatgacg tcacctcagc cccggacaac aagccagccc cgggctccac cgccccccca 420 gcccacggtg tcacctcggc cccggacacc aggccggccc cgggctccac cgccccccca 480 gcccacggtg tcacctcggc cccggacacc aggccggccc cgggctccac cgccccccca 540 gcccacggtg tcacctcggc cccggacacc aggccggccc cgggctccac cgccccccca 600 gcccacggtg tcacctcggc cccggacacc aggcccgccc cgggctccac cgccccccca 660 gcccacggtg tcacctcggc cccggacacc aggcccgccc cgggctccac cgcgcccgca 720 gcccacggtg tcacctcggc cccggacacc aggccggccc cgggctccac cgccccccaa 780 gcccacggtg tcacctcggc cccggacacc aggccggccc cgggctccac cgccccccca 840 gcccatggtg tcacctcggc cccggacaac aggcccgcct tgggctccac cgcccctcca 900 gtccacaatg tcacctcggc ctcaggctct gcatcaggct cagcctccac actggtgcat 960 aacggaacct ccgcgcgcgc caccaccacc ccagcgagca agagcacccc cttctctatc 1020 ccctcccatc atagcgacac acccaccacg ctggccagcc atagcaccaa aaccgacgcc 1080 tctagcaccc accactccac ggtgcccccc ctgacctcca gcaaccattc tacctccccc 1140 cagctgtcca cgggggtgag ctttttcttc ctgtccttcc atatcagcaa cctccagttc 1200 aattcctctc tggaggaccc cagcaccgac tactaccaag agttgcagcg ggacatctcc 1260 gagatgttcc tgcagatcta caaacagggc ggcttcctgg gattgagcaa catcaagttc 1320 cgccccgggt ccgtggtggt gcagctcacc ctggccttca gggagggcac catcaacgtg 1380 catgacgtcg agacccagtt caatcagtat aagaccgagg ccgcctcccg gtacaacctg 1440 acgatcagcg acgtgtctgt gtccgacgtg cccttcccct tctccgcaca gtccggcgcc 1500 ggcgtgcctg gctggggcat cgccctgctc gtgttggtgt gcgtgctcgt ggccctcgcc 1560 atcgtgtacc tgatcgccct ggccgtctgt cagtgcagga gaaagaacta tgggcagttg 1620 gatatcttcc ccgccaggga cacctaccac cccatgtccg agtaccccac ctaccacacc 1680 cacggccgct atgtccctcc ctcctcgacc gaccgctccc cttacgagaa ggtgagcgcc 1740 ggcaacggag gcagctccct gtcctacacc aaccctgccg tggccgccac aagcgccaac 1800 ctgtctagag ccaagttcgt ggctgcctgg accctgaagg ctgccgcttg actcgag 1857 <210> 26 <211> 1857 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapiens <400> 26 gctagcgcca ccatgtctag aacaccgggc acccagtctc ctttcttcct gctgctgctc 60 ctcacagtgc ttacagttgt tacaggttct ggtcatgcaa gctctacccc aggtggagaa 120 aaggagactt cggctaccca gagaagttca gtgcccagct ctactgagaa gaatgctgtg 180 agtatgacca gcagcgtact ctccagccac agccccggtt caggctcctc caccactcag 240 ggacaggatg tcactctggc cccggccacg gaaccagctt caggttcagc tgccacctgg 300 ggacaggatg tcacctcggt cccagtcacc aggccagccc tgggctccac caccccgcca 360 gcccacgatg tcacctcagc cccggacaac aagccagccc cgggctccac cgccccccca 420 gcccacggtg tcacctcggc cccggacacc aggccggccc cgggctccac cgccccccca 480 gcccacggtg tcacctcggc cccggacacc aggccggccc cgggctccac cgccccccca 540 gcccacggtg tcacctcggc cccggacacc aggccggccc cgggctccac cgccccccca 600 gcccacggtg tcacctcggc cccggacacc aggcccgccc cgggctccac cgccccccca 660 gcccacggtg tcacctcggc cccggacacc aggcccgccc cgggctccac cgcgcccgca 720 gcccacggtg tcacctcggc cccggacacc aggccggccc cgggctccac cgccccccaa 780 gcccacggtg tcacctcggc cccggacacc aggccggccc cgggctccac cgccccccca 840 gcccatggtg tcacctcggc cccggacaac aggcccgcct tgggctccac cgcccctcca 900 gtccacaatg tcacctcggc ctcaggctct gcatcaggct cagcttctac tctggtgcac 960 aacggcacct ctgccagggc taccacaacc ccagccagca agagcactcc attctcaatt 1020 cccagccacc actctgatac tcctaccacc cttgccagcc atagcaccaa gactgatgcc 1080 agtagcactc accatagcac ggtacctcct ctcacctcct ccaatcacag cacttctccc 1140 cagttgtcta ctggggtctc tttctttttc ctgtcttttc acatttcaaa cctccagttt 1200 aattcctctc tggaagatcc cagcaccgac tactaccaag agctgcagag agacatttct 1260 gaaatgtttt tgcagattta taaacaaggg ggttttctgg gcctctccaa tattaagttc 1320 aggccaggat ctgtggtggt acaattgact ctggccttcc gagaaggtac catcaatgtc 1380 cacgacgtgg agacacagtt caatcagtat aaaacggaag cagcctctcg atataacctg 1440 acgatctcag acgtcagcgt gagtgatgtg ccatttcctt tctctgccca gtctggggct 1500 ggggtgccag gctggggcat cgcgctgctg gtgctggtct gtgttctggt tgcgctggcc 1560 attgtctatc tcattgcctt ggctgtctgt cagtgccgcc gaaagaacta cgggcagctg 1620 gacatctttc cagcccggga tacctaccat cctatgagcg agtaccccac ctaccacacc 1680 catgggcgct atgtgccccc tagcagtacc gatcgtagcc cctatgagaa ggtttctgca 1740 ggtaatggtg gcagcagcct ctcttacaca aacccagcag tggcagccac ttctgccaac 1800 ttgtctagag ccaagttcgt ggctgcctgg accctgaagg ctgccgcttg actcgag 1857 <210> 27 <211> 3204 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HIV virus <400> 27 atgggcccca tcagtcccat cgagaccgtg ccggtgaagc tgaaacccgg gatggacggc 60 cccaaggtca agcagtggcc actcaccgag gagaagatca aggccctggt ggagatctgc 120 accgagatgg agaaagaggg caagatcagc aagatcgggc cggagaaccc atacaacacc 180 cccgtgtttg ccatcaagaa gaaggacagc accaagtggc gcaagctggt ggatttccgg 240 gagctgaata agcggaccca ggatttctgg gaggtccagc tgggcatccc ccatccggcc 300 ggcctgaaga agaagaagag cgtgaccgtg ctggacgtgg gcgacgctta cttcagcgtc 360 cctctggacg aggactttag aaagtacacc gcctttacca tcccatctat caacaacgag 420 acccctggca tcagatatca gtacaacgtc ctcccccagg gctggaaggg ctctcccgcc 480 attttccaga gctccatgac caagatcctg gagccgtttc ggaagcagaa ccccgatatc 540 gtcatctacc agtacatgga cgacctgtac gtgggctctg acctggaaat cgggcagcat 600 cgcacgaaga ttgaggagct gaggcagcat ctgctgagat ggggcctgac cactccggac 660 aagaagcatc agaaggagcc gccattcctg aagatgggct acgagctcca tcccgacaag 720 tggaccgtgc agcctatcgt cctccccgag aaggacagct ggaccgtgaa cgacatccag 780 aagctggtgg gcaagctcaa ctgggctagc cagatctatc ccgggatcaa ggtgcgccag 840 ctctgcaagc tgctgcgcgg caccaaggcc ctgaccgagg tgattcccct cacggaggaa 900 gccgagctcg agctggctga gaaccgggag atcctgaagg agcccgtgca cggcgtgtac 960 tatgacccct ccaaggacct gatcgccgaa atccagaagc agggccaggg gcagtggaca 1020 taccagattt accaggagcc tttcaagaac ctcaagaccg gcaagtacgc ccgcatgagg 1080 ggcgcccaca ccaacgatgt caagcagctg accgaggccg tccagaagat cacgaccgag 1140 tccatcgtga tctgggggaa gacacccaag ttcaagctgc ctatccagaa ggagacctgg 1200 gagacgtggt ggaccgaata ttggcaggcc acctggattc ccgagtggga gttcgtgaat 1260 acacctcctc tggtgaagct gtggtaccag ctcgagaagg agcccatcgt gggcgcggag 1320 acattctacg tggacggcgc ggccaaccgc gaaacaaagc tcgggaaggc cgggtacgtc 1380 accaaccggg gccgccagaa ggtcgtcacc ctgaccgaca ccaccaacca gaagacggag 1440 ctgcaggcca tctatctcgc tctccaggac tccggcctgg aggtgaacat cgtgacggac 1500 agccagtacg cgctgggcat tattcaggcc cagccggacc agtccgagag cgaactggtg 1560 aaccagatta tcgagcagct gatcaagaaa gagaaggtct acctcgcctg ggtcccggcc 1620 cataagggca ttggcggcaa cgagcaggtc gacaagctgg tgagtgcggg gattagaaag 1680 gtgctgatgg tgggttttcc agtcacacct caggtacctt taagaccaat gacttacaag 1740 gcagctgtag atcttagcca ctttttaaaa gaaaaggggg gactggaagg gctaattcac 1800 tcccaaagaa gacaagatat ccttgatctg tggatctacc acacacaagg ctacttccct 1860 gattggcaga actacacacc agggccaggg gtcagatatc cactgacctt tggatggtgc 1920 tacaagctag taccagttga gccagataag gtagaagagg ccaataaagg agagaacacc 1980 agcttgttac accctgtgag cctgcatggg atggatgacc cggagagaga agtgttagag 2040 tggaggtttg acagccgcct agcatttcat cacgtggccc gagagctgca tccggagtac 2100 ttcaagaact gctgaatggg tgcccgagct tcggtactgt ctggtggaga gctggacaga 2160 tgggagaaaa ttaggctgcg cccgggaggc aaaaagaaat acaagctcaa gcatatcgtg 2220 tgggcctcga gggagcttga acggtttgcc gtgaacccag gcctgctgga aacatctgag 2280 ggatgtcgcc agatcctggg gcaattgcag ccatccctcc agaccgggag tgaagagctg 2340 aggtccttgt ataacacagt ggctaccctc tactgcgtac accagaggat cgagattaag 2400 gataccaagg aggccttgga caaaattgag gaggagcaaa acaagagcaa gaagaaggcc 2460 cagcaggcag ctgctgacac tgggcatagc aaccaggtat cacagaacta tcctattgtc 2520 caaaacattc agggccagat ggttcatcag gccatcagcc cccggacgct caatgcctgg 2580 gtgaaggttg tcgaagagaa ggccttttct cctgaggtta tccccatgtt ctccgctttg 2640 agtgaggggg ccactcctca ggacctcaat acaatgctta ataccgtggg cggccatcag 2700 gccgccatgc aaatgttgaa ggagactatc aacgaggagg cagccgagtg ggacagagtg 2760 catcccgtcc acgctggccc aatcgcgccc ggacagatgc gggagcctcg cggctctgac 2820 attgccggca ccacctctac actgcaagag caaatcggat ggatgaccaa caatcctccc 2880 atcccagttg gagaaatcta taaacggtgg atcatcctgg gcctgaacaa gatcgtgcgc 2940 atgtactctc cgacatccat ccttgacatt agacagggac ccaaagagcc ttttagggat 3000 tacgtcgacc ggttttataa gaccctgcga gcagagcagg cctctcagga ggtcaaaaac 3060 tggatgacgg agacactcct ggtacagaac gctaaccccg actgcaaaac aatcttgaag 3120 gcactaggcc cggctgccac cctggaagag atgatgaccg cctgtcaggg agtaggcgga 3180 cccggacaca aagccagagt gttg 3204 <210> 28 <211> 435 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapiens <400> 28 atgtggctgc agagcctgct gctcttgggc actgtggcct gcagcatctc tgcacccgcc 60 cgctcgccca gccccagcac gcagccctgg gagcatgtga atgccatcca ggaggcccgg 120 cgtctcctga acctgagtag agacactgct gctgagatga atgaaacagt agaagtcatc 180 tcagaaatgt ttgacctcca ggagccgacc tgcctacaga cccgcctgga gctgtacaag 240 cagggcctgc ggggcagcct caccaagctc aagggcccct tgaccatgat ggccagccac 300 tacaagcagc actgccctcc aaccccggaa acttcctgtg caacccagat tatcaccttt 360 gaaagtttca aagagaacct gaaggacttt ctgcttgtca tcccctttga ctgctgggag 420 ccagtccagg agtga 435 <210> 29 <211> 144 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo Sapiens <400> 29 Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile 1 5 10 15 Ser Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln Pro Trp Glu His 20 25 30 Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp 35 40 45 Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu Val Ile Ser Glu Met Phe 50 55 60 Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys 65 70 75 80 Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met 85 90 95 Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser 100 105 110 Cys Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys 115 120 125 Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln Glu 130 135 140

Claims (66)

1. (i) TLR 효능제, TLR 효능제를 암호화하는 누클레오티드 서열; 및

   (ii) GM-CSF를 암호화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 애쥬번트 조성물.
2. 제1항에 있어서, 구성성분 (i)을 암호화하는 누클레오티드 서열 및 구성성분 (ii)를 암호화하는 누클레오티드 서열이 동일한 누클레오티드 분자내에 포함되거나 구성됨을 특징으로 하는 애쥬번트 조성물.
3. 제1항에 있어서, 구성성분 (i)을 암호화하는 누클레오티드 서열 및 구성성분 (ii)를 암호화하는 누클레오티드 서열이 상이한 누클레오티드 분자내에 포함되거나 구성되는 누클레오티드 서열에 의해 암호화됨을 특징으로 하는 애쥬번트 조성물.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 누클레오티드 서열이 DNA 서열임을 특징으로 하는 애쥬번트 조성물.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 누클레오티드 서열 또는 폴리누클레오티드 분자가 DNA 플라스미드내에 암호화됨을 특징으로 하는 애쥬번트 조성물.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 애쥬번트 성분 (i)이 TLR 효능제로서 작용할 수 있는 β-데펜신; HSP60; HSP70; HSP90; 피브로넥틴; 및 플라겔린 단백질 분자 중 하나 이상, 또는 이의 성분을 암호화하는 누클레오티드 서열임을 특징으로 하는 애쥬번트 조성물.
7. 제1항에 있어서, 애쥬번트 성분 (i)이 TLR 효능제로서 작용할 수 있는 하나 이상의 하기 효능제, 또는 이의 성분임을 특징으로 하는 애쥬번트 조성물:

   트리-아실화된 지질펩티드(LP); 페놀-가용성 모듈린; 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) LP; S-(2,3-비스(팔미토일옥시)-(2-RS)-프로필)-N-팔미토일-(R)-Cys-(S)-Ser-(S)-Lys(4)-OH, 트리하이드로클로라이드(Pam₃Cys)LP; 또는 OspA LP와 같은 TLR-1 효능제;

   엠. 투베르쿨로시스(M. tuberculosis), 비. 부르그도르페리(B. burgdorferi) 또는 티. 팔리둠(T. pallidum)으로부터의 세균 지질펩티드; 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)를 포함하는 종으로부터의 펩티도글리칸; 지질타이코산, 만누론산, 나이세리아 포린, 세균 핌브리아에(bacterial fimbriae), 예르시나 발병력 인자(Yersina virulence factor), CMV 비리온, 풍진 혈구응집소 및 효모로부터의 지모산과 같은 TLR-2 효능제;

   이중 가닥 RNA, 또는 폴리이노신성-폴리사이티딜산(Poly IC)와 같은 TLR-3 효능제;

   그람-음성 세균으로부터의 지질다당류(LPS); 열 쇽 단백질(HSP) 10, 60, 65, 70, 75 또는 90; 표면활성 단백질 A, 하이알루로난 올리고사카라이드, 헤파란 설페이트 단편, 피브로넥틴 단편, 피브리노겐 펩티드 및 b-데펜신-2, 또는 모노포스포릴 지질 A(MPL)과 같은 LPS의 비-독성 유도체와 같은 TLR-4 효능제;

   세균 플라겔린과 같은 TLR-5 효능제;

   마이코박테리아 지질단백질, 디-아실화된 LP, 또는 페놀-가용성 모듈린과 같은 TLR-6 효능제;

   록소리빈, N7 또는 N8 위치에서 구아노신 유사체, 또는 이미다조퀴놀린 화합물, 또는 이미퀴모드 또는 레지퀴모드와 같은 이의 유도체와 같은 TLR-7 효능제;

   레지퀴모드와 같은 항-바이러스 활성을 지닌 이미다조퀴놀린 분자와 같은 TLR-8 효능제;

   메틸화되지 않은 CpG 누클레오티드, 특히 CpG 모티프로서 공지된 특정 서열 성분을 함유하는 HSP90 또는 DNA와 같은 TLR-9 효능제.
8. 제7항에 있어서, 이미다조퀴놀린 또는 이의 유도체가 본 명세서에서 정의된 바와 같은 화학식 I 내지 VI 중 어느 하나로 정의된 화합물임을 특징으로 하는 애쥬번트 조성물.
9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 이미다조퀴놀린 또는 이의 유도체가 본 명세서에서 정의한 바와 같은 화학식 VI으로 정의된 화합물임을 특징으로 하는 애쥬번트 조성물.
10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 이미다조퀴놀린 또는 이의 유도체가 1-(2-메틸프로필)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민;

    1-(2-하이드록시-2-메틸프로필)-2-메틸-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민;

    1-(2-하이드록시-2-메틸프로필)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민;

    1-(2-하이드록시-2-메틸프로필)-2-에톡시메틸-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 화학식 VI의 화합물임을 특징으로 하는 애쥬번트 조성물.
11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 이미다조퀴놀린 또는 이의 유도체가 이미퀴모드임을 특징으로 하는 애쥬번트 조성물.
12. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 이미다조퀴놀린 또는 이의 유도체가 레지퀴모드임을 특징으로 하는 애쥬번트 조성물.
13. 제1항, 또는 제3항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 구성성분 (i)이 동시 또는 연속 투여를 위해 구성성분 (ii)로부터 별개의 조성물로 제공됨을 특징으로 하는 애쥬번트 조성물.
14. 제13항에 있어서, 구성성분 (i)이 국소 투여된 이미다조퀴놀린임을 특징으로 하는 애쥬번트 조성물.
15. 제14항에 있어서, 구성성분 (i)이 구성성분 (ii)의 투여 후 12 내지 26시간 사이에 투여됨을 특징으로 하는 애쥬번트 조성물.
16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 애쥬번트 조성물, 및 (iii) 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 면역원 성분을 포함하는 면역원성 조성물(들).
17. 제16항에 있어서, 구성성분 (i)이 누클레오티드 서열에 의해 암호화되고, 구성성분 (i), (ii) 및 (iii)을 암호화하는 누클레오티드 서열이 동일한 폴리누클레오티드 분자내에 포함되거나 구성됨을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
18. 제16항에 있어서, 구성성분 (i)이 누클레오티드 서열에 의해 암호화되고, 구성성분 (i), (ii) 및 (iii)을 암호화하는 누클레오티드 서열이 동시 또는 연속 투여를 위해 별개의 폴리누클레오티드 분자내에 포함되거나 구성됨을 특징으로 하는 면역원성 조성물(들).
19. 제16항에 있어서, 구성성분 (i)이 누클레오티드 서열에 의해 암호화되고, 동 시 또는 연속 투여를 위해, 구성성분 (i), (ii) 및 (iii) 중 임의의 2개를 암호화하는 누클레오티드 서열이 동일한 폴리누클레오티드 분자내에 포함되거나 구성되고, 나머지 누클레오티드 서열이 추가의 폴리누클레오티드 분자내에 암호화됨을 특징으로 하는 면역원성 조성물(들).
20. 제19항에 있어서, 동시 또는 연속 투여를 위해, 구성성분 (ii) 및 (iii)을 암호화하는 누클레오티드 서열이 동일한 폴리누클레오티드 서열내에 포함되거나 구성되고, 구성성분 (i)을 암호화하는 누클레오티드 서열이 추가의 폴리누클레오티드 분자내에 암호화됨을 특징으로 하는 면역원성 조성물(들).
21. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 누클레오티드 서열이 DNA 서열임을 특징으로 하는 면역원성 조성물(들).
22. 제21항에 있어서, 누클레오티드 서열 또는 폴리누클레오티드 분자가 DNA 플라스미드내에 암호화됨을 특징으로 하는 면역원성 조성물(들).
23. 제16항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 누클레오티드 서열이 P501S 발현 종양 세포 또는 종양을 인지할 수 있는 생체내 면역 반응을 일으킬 수 있는 P501S 단백질 또는 유도체를 암호화함을 특징으로 하는 면역원성 조성물(들).
24. 제16항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 누클레오티드 서열이 MUC-1 발현 종양 세포 또는 종양을 인지할 수 있는 생체내 면역 반응을 일으킬 수 있는 MUC-1 단백질 또는 유도체를 암호화함을 특징으로 하는 면역원 조성물(들).
25. 제24항에 있어서, MUC-1 단백질 또는 유도체가 임의의 반복 단위(완전하거나 완전하지 않은)를 지니지 않음을 특징으로 하는 면역원성 조성물(들).
26. 제24항에 있어서, MUC-1 단백질 또는 유도체가 임의의 완전한 반복 단위를 지니지 않음을 특징으로 하는 면역원성 조성물(들).
27. 제24항에 있어서, MUC-1 단백질 또는 유도체가 1개 내지 15개의 반복 단위를 함유함을 특징으로 하는 면역원성 조성물(들).
28. 제24항에 있어서, MUC-1 단백질 또는 유도체가 7개의 완전한 반복 단위를 함유함을 특징으로 하는 면역원성 조성물(들).
29. 제24항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, MUC-1 단백질 또는 유도체를 암호화하는 누클레오티드 서열이 코돈-개질됨을 특징으로 하는 면역원성 조성물(들).
30. 제24항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 완전하지 않은 반복 영역을 암호화하는 누클레오티드 서열이 0.6 이상의 RSCU를 지님을 특징으로 하는 면역원성 조성물(들).
31. 제24항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, MUC-1 단백질 또는 유도체의 완전하지 않은 반복 단위를 암호화하는 누클레오티드 서열이 상응하는 반복하지 않는 영역에 걸쳐 야생형 MUC-1 DNA와 관련하여 85% 미만의 동일성 레벨을 지님을 특징으로 하는 면역원성 조성물(들).
32. 제24항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, MUC-1 단백질 또는 유도체가 환원된 글리코실화 돌연변이와 같은 변경된 반복단위(VNTR 단위)를 함유함을 특징으로 하는 면역원성 조성물(들).
33. 제24항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, MUC-1 단백질 또는 유도체가 융합 단백질이거나, 외부 T-세포 에피토프에 컨쥬게이션됨을 특징으로 하는 면역원성 조성물(들).
34. 제33항에 있어서, MUC-1 단백질 또는 유도체가 융합 단백질이거나, P2 또는 P30, 또는 이의 단편에 컨쥬게이션됨을 특징으로 하는 면역원성 조성물(들).
35. 제33항에 있어서, 외부 T-세포 에피토프가 MUC-1 단백질 또는 유도체의 말단내에 또는 말단에서 혼입됨을 특징으로 하는 면역원성 조성물(들).
36. 제16항 내지 제35항 중 어느 한 항에 따른 조성물(들), 및 약제학적으로 허용되는 담체(들), 희석제(들) 또는 부형제(들)를 포함하는 백신 조성물.
37. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 애쥬번트 성분 (i) 및 (ii)를 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 면역원 성분 (iii)과 혼합하는 것을 포함하여, 면역원성 조성물을 제조하는 방법.
38. 제37항에 있어서, 애쥬번트 성분 (i)이 누클레오티드 서열에 의해 암호화됨을 특징으로 하는 방법.
39. 제37항 또는 제38항에 있어서, 애쥬번트 성분 (ii)를 암호화하는 누클레오티드 분자가 면역원 성분 (iii)을 암호화하는 누클레오티드와 혼합되고 애쥬번트 성분 (i)이 동시 또는 연속 투여를 위해 별개의 조성물로 제공됨을 특징으로 하는 방법.
40. 제37항 또는 제38항에 있어서, 애쥬번트 성분 (ii)를 암호화하는 누클레오티드 분자가 면역원 성분 (iii)을 암호화하는 누클레오티드와 동시-암호화되어 단일 의 폴리누클레오티드 분자를 형성하고, 애쥬번트 성분 (i)이 동시 또는 연속 투여를 위해 별개의 조성물로 제공됨을 특징으로 하는 방법.
41. 제38항에 있어서, 구성성분 (i), (ii) 및 (iii)을 암호화하는 누클레오티드 분자가 동시 또는 연속 투여를 위해 별개의 폴리누클레오티드 분자내에 암호화됨을 특징으로 하는 방법.
42. 제38항에 있어서, 구성성분 (i), (ii) 및 (iii) 중 임의의 2개를 암호화하는 누클레오티드 서열이 동시-암호화되어 단일의 폴리누클레오티드 분자를 형성하고 나머지 누클레오티드 서열이 동시 또는 연속 투여를 위해 추가의 누클레오티드 서열내에서 암호화됨을 특징으로 하는 방법.
43. 제38항에 있어서, 구성성분 (i), (ii) 및 (iii)을 암호화하는 누클레오티드 서열이 동시-암호화되어 단일의 폴리누클레오티드 분자를 형성함을 특징으로 하는 방법.
44. 제37항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 누클레오티드 서열이 DNA임을 특징으로 하는 방법.
45. 제44항에 있어서, 누클레오티드 서열이 플라스미드 DNA내에 암호화됨을 특징 으로 하는 방법.
46. 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 구성성분 (ii) 및 (iii)을 암호화하는 누클레오티드 분자가 플라스미드내에 혼입되고, 애쥬번트 성분 (i)이 동시 또는 연속 투여를 위해 별개의 조성물로 제공됨을 특징으로 하는 방법.
47. 제37항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 구성성분들이 약제학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체내에 혼입됨을 특징으로 하는 방법.
48. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 애쥬번트 조성물; 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 면역원 성분 (iii); 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체를 포함하는 약제학적 조성물(들).
49. 제16항 내지 제35항 중 어느 한 항에 따른 면역원성 조성물(들), 및 약제학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체를 포함하는 약제학적 조성물(들).
50. 애쥬번트 성분 (ii); 면역원 성분 (iii), 및 약제학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체를 포함하는 약제학적 조성물; 및 애쥬번트 성분 (i), 및 약제학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체를 포함하는 추가의 약제학적 조성물을 포함는 키트로서, 애쥬번트 성분 (i)은 TLR 효능제, 또는 TLR 효능제를 암호화하는 누클레오티드를 포함하고; 애쥬번트 성분 (ii)는 GM-CSF를 암호화하는 누클레오티드를 포함하며; 면역원 성분 (iii)은 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 키트.
51. 제48항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 담체가 금 비드이고 하나 이상의 약제학적 조성물이 입자 매개된 약물 전달에 의해 전달되도록 조절될 수 있음을 특징으로 하는 약제학적 조성물(들).
52. 제51항에 있어서, 구성성분 (ii) 및 (iii)용 담체가 금 비드이고 애쥬번트 성분 (i)이 동시 또는 연속 투여를 위해 제형화됨을 특징으로 하는 약제학적 조성물(들).
53. 제16항 내지 제36항 또는 제48항 내지 제52항 중 어느 한 항에 따른 안전하고 유효한 양의 면역원성 백신 또는 약제학적 조성물을 투여함에 의해 종양이 있거나 종양이 생길 위험이 있는 환자를 치료하는 방법.
54. 제53항에 있어서, 종양이 MUC-1 발현 종양임을 특징으로 하는 환자의 치료방법.
55. 제53항 또는 제54항에 있어서, 종양이 유방 종양; 비-소세포 폐 종양을 포함하는 폐 종양; 또는 전립선, 위 및 기타 위장 종양임을 특징으로 하는 환자의 치료방법.
56. (i) TLR 효능제, 또는 TLR 효능제를 암호화하는 누클레오티드;

    (ii) GM-CSF를 암호화하는 누클레오티드; 및

    (iii) 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 면역원 성분을 투여하는 것을 포함하여, 항원에 대한 포유동물의 면역 반응을 증가시키는 방법.
57. 제 56항에 있어서, 구성성분 (i), (ii) 및 (iii) 중 임의의 2개를 동시 투여하고, 나머지 구성성분을 연속 투여하는 것을 포함함을 특징으로 하는 면역 반응을 증가시키는 방법.
58. 제56항에 있어서, 구성성분 (i), (ii) 및 (iii)을 연속 투여하는 것을 포함함을 특징으로 하는 면역 반응을 증가시키는 방법.
59. 제56항 또는 제57항에 있어서, 동시 투여용 구성성분들이 별개의 조성물로 제형화됨을 특징으로 하는 항원에 대한 포유동물의 면역 반응을 증가시키는 방법.
60. MUC-1 발현 종양의 치료 또는 예방에 사용되는 약제를 제조하기 위한

    (i) TLR 효능제, 또는 TLR 효능제를 암호화하는 누클레오티드;

    (ii) GM-CSF를 암호화하는 누클레오티드; 및

    (iii) 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 면역원 성분을 포함하는 면역원성 조성물.
61. 질병 상태와 연관된 항원성 펩티드를 암호화하는 누클레오티드 서열을 적절한 벡터내에서 포유동물에게 투여하고; GM-CSF를 암호화하는 누클레오티드 서열을 적절한 벡터내에서 포유동물에게 추가로 투여하며; 이미다조퀴놀린 또는 이의 유도체를 포유동물에게 추가로 투여하여 면역 반응을 일으키는 것을 포함하여, 포유동물에서 질병 상태에 대한 면역 반응을 일으키는 방법.
62. 면역 반응을 자극하기에 효과적인 양의 면역원을 암호화하는 누클레오티드 서열 및 GM-CSF를 암호화하는 누클레오티드 서열을 적절한 벡터내에서 포유동물에게 투여하는 단계; 및 면역원을 암호화하는 누클레오티드 서열 및 GM-CSF를 암호화하는 누클레오티드 서열을 투여한 지 12 내지 36시간 후의 시점에 면역 반응을 증가시키기에 효과적인 양의 이미다조퀴놀린 또는 이의 유도체를 포유동물에게 추가로 투여하는 단계를 포함하여, 면역원에 대한 포유동물의 면역 반응을 증가시키는 방법.
63. 펩티드를 암호화하는 누클레오티드 서열을 포유동물에게 투여한 결과로서 발현되는 항원성 펩티드 또는 단백질에 의해 개시된 면역 반응을 증진시키는 약제를 제조하기 위한 이미다조퀴놀린 또는 이의 유도체 및 GM-CSF의 용도.
64. 누클레오티드 서열에 의해 암호화된 항원에 대한 면역 반응을 증진시키는 약제를 제조하기 위한

    (i) TLR 효능제 또는 TLR 효능제를 암호화하는 누클레오티드;

    (ii) GM-CSF를 암호화하는 누클레오티드; 및

    (iii) 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 면역원 성분의 용도.
65. 누클레오티드 서열에 의해 암호화된 항원에 대한 면역 반응을 증진시키기 위해 포유동물에게 동시 또는 연속 투여되는 둘 이상의 약제를 제조하기 위한

    (i) TLR 효능제 또는 TLR 효능제를 암호화하는 누클레오티드;

    (ii) GM-CSF를 암호화하는 누클레오티드; 및

    (iii) 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 면역원 성분의 용도.
66. 누클레오티드 서열에 의해 암호화된 항원에 대한 면역 반응을 증진시키기 위해 포유동물에게 동시 또는 연속 투여되는 약제를 제조하기 위한

    (i) TLR 효능제 또는 TLR 효능제를 암호화하는 누클레오티드;

    (ii) GM-CSF를 암호화하는 누클레오티드; 및

    (iii) 항원성 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 면역원 성분의 용도로서, 각각의 성분은 별개의 약제로 제형화되는 용도.

Images