JP2007505827A - ワクチン接種の改良 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、改良された核酸ワクチン、アジュバント系、ならびにそのようなワクチンおよびアジュバント系の調製方法に関する。とくに、本発明に係る核酸ワクチンおよびアジュバント系は、GM-CSFをコードするヌクレオチド配列またはその誘導体と、toll様レセプター(TLR)アゴニストまたはその誘導体と、の組合せを含む。
動物において免疫応答を誘導することにより感染から動物を保護しうる抗原を動物系に導入することを含む伝統的なワクチン接種技術は、何年も前から知られている。プラスミドDNAがin vivoで動物細胞に直接トランスフェクトしうるという1990年代初期の観察に続いて、抗原性ペプチドをコードするDNAを動物に直接導入することにより免疫応答を誘導するDNAプラスミドの使用に基づくワクチン接種技術を開発すべく、かなりの研究努力が払われてきた。「DNA免疫化」または「DNAワクチン接種」と呼ばれるそのような技術は、現在、ウイルス性疾患、細菌性疾患、および寄生虫性疾患に対する多種多様な前臨床モデルにおいて防御抗体(体液性)免疫応答および細胞媒介(細胞性)免疫応答を引き起こすために使用されている。癌、アレルギー、および自己免疫疾患に対する治療および保護におけるDNAワクチン接種技術の使用に関連した研究もまた、進行中である。
本発明の一実施形態によれば、
(i) TLRアゴニストまたはTLRアゴニストをコードするヌクレオチド配列と;
(ii) GM-CSFをコードするヌクレオチド配列と;
を含むアジュバント組成物が提供される。ただし、成分(i)および(ii)は、哺乳動物において抗原に対する免疫応答を増強するように機能的に協同して作用する。
で示される精製されたまたは合成されたリピドAでありうる。
OLIGO 2(配列番号18):TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758)
OLIGO 3(配列番号19):ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG
OLIGO 4(配列番号20):TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006)
OLIGO 5(配列番号21):TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668)
代替的なCpGオリゴヌクレオチドは、それほど重要でない欠失または付加を有する上記の配列を含みうる。
1-(2-メチルプロピル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-4-アミン;
1-(2-ヒドロキシ-2-メチルプロピル)-2-メチル-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-4-アミン;
1-(2,ヒドロキシ-2-メチルプロピル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-4-アミン;
1-(2-ヒドロキシ-2-メチルプロピル)-2-エトキシメチル-1-H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-4-アミン;
よりなる群から選択される式VIで示される化合物である。
TLR-1アゴニスト、たとえば、トリ-アシル化リポペプチド(LP);フェノール可溶性モジュリン;Mycobacterium tuberculosis LP;細菌リポタンパク質のアセチル化アミノ末端を模擬するS-(2,3-ビス(パルミトイルオキシ)-(2-RS)-プロピル)-N-パルミトイル-(R)-Cys-(S)-Ser-(S)-Lys(4)-OH三塩酸塩(Pam3Cys)LPおよびBorrelia burgdorfei由来のOspA LP;
TLR-2アゴニスト、たとえば、M tuberculosis、B burgdorferi、T pallidum由来の細菌リポペプチド;Staphylococcus aureusなどの種由来のペプチドグリカン;リポテイコ酸、マンヌロン酸、Neisseriaポーリン、細菌線毛、Yersinaビルレンス因子、CMVビリオン、麻疹ヘマグルチニン、および酵母由来のザイモサン;
TLR-3アゴニスト、たとえば、二本鎖RNA、またはウイルス感染に関連する分子核酸パターンのポリイノシン酸-ポリシチジル酸(PolyIC);
TLR-4アゴニスト、たとえば、グラム陰性細菌由来のリポ多糖(LPS)またはその断片;熱ショックタンパク質(HSP)10、60、65、70、75、または90;サーファクタントプロテインA、ヒアルロナンオリゴ糖、ヘパラン硫酸断片、フィブロネクチン断片、フィブリノーゲンペプチド、およびb-デフェンシン-2、またはモノホスホリルリピドA(MPL)のようなLPSの無毒の誘導体;
TLR-5アゴニスト、たとえば、細菌フラジェリン;
TLR-6アゴニスト、たとえば、ミコバクテリアリポタンパク質、ジ-アシル化LP、およびフェノール可溶性モジュリン;
TLR-7アゴニスト、たとえば、ロキソリビン、N7位およびC8位のグアノシン類似体、もしくはイミダゾキノリン化合物、またはそれらの誘導体(たとえば、イミキモドもしくはレシキモド);
TLR-8アゴニスト、たとえば、抗ウイルス活性を有するイミダゾキノリン分子(たとえばレシキモド);
TLR-9アゴニスト、たとえば、HSP90、または非メチル化CpGヌクレオチド(とくに、CpGモチーフとして知られる配列コンテキスト)を含有するDNA。
(i) TLRアゴニストまたはTLRアゴニストをコードするヌクレオチド;
(ii) GM-CSFをコードするヌクレオチド;および
(iii) 抗原性のペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む免疫原成分;
を哺乳動物に投与することを含む。
(i) TLRアゴニストまたはTLRアゴニストをコードするヌクレオチド;
(ii) GM-CSFをコードするヌクレオチド;および
(iii) 抗原性のペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む免疫原成分;
を含む免疫原性組成物を提供する。
(i) TLRアゴニストまたはTLRアゴニストをコードするヌクレオチド;
(ii) GM-CSFをコードするヌクレオチド;および
(iii) 抗原性のペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む免疫原成分。
(i) TLRアゴニストまたはTLRアゴニストをコードするヌクレオチド;
(ii) GM-CSFをコードするヌクレオチド;および
(iii) 抗原性のペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む免疫原成分。
(i) TLRアゴニストまたはTLRアゴニストをコードするヌクレオチド;
(ii) GM-CSFをコードするヌクレオチド;および
(iii) 抗原性のペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む免疫原成分。
本明細書および添付の特許請求の範囲の全体を通して、文脈上他の解釈が必要とされないかぎり、「comprise(含む)」および「include(含む)」という単語またはそれらの変化形、たとえば、「comprising」、「comprises」、「including」、「includes」などは、包含的に解釈されるものとする。すなわち、これらの用語が使用される場合、特定して列挙されていない整数または要素を包含しうることを意味する。さらに、本明細書中の「comprising(含む)」、「comprise」、および「comprises」という用語は、それぞれ、いかなる場合においても、「consisting of(よりなる)」、「consist of」、および「consists of」という用語で場合により置換え可能であるものとする。
(i) TLRアゴニストまたはTLRアゴニストをコードするヌクレオチド配列と;
(ii) GM-CSFをコードするヌクレオチド配列と;
(iii) 抗原性のペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む免疫原成分と;
の組合せを意味する。ただし、成分(i)および(ii)は、哺乳動物において免疫原成分に対する免疫応答を増強するように機能的に協同して作用する。
R11は、直鎖状もしくは分枝鎖状のアルキル、ヒドロキシアルキル、アシルオキシアルキル、ベンジル、(フェニル)エチル、およびフェニルよりなる群から選択され、ベンジル置換基、(フェニル)エチル置換基、またはフェニル置換基は、1〜約4個の炭素原子のアルキル、1〜約4個の炭素原子のアルコキシ、およびハロゲンよりなる群から独立して選択される1つまたは2つの部分によりベンゼン環が場合により置換されていてもよく、ただし、ベンゼン環が2つの部分により置換される場合、これらの部分は、合計で6個以下の炭素原子を含有するものとし;R21は、水素、1〜約8個の炭素原子のアルキル、ベンジル、(フェニル)エチル、およびフェニルよりなる群から選択され、ベンジル置換基、(フェニル)エチル置換基、またはフェニル置換基は、1〜約4個の炭素原子のアルキル、1〜約4個の炭素原子のアルコキシ、およびハロゲンよりなる群から独立して選択される1つまたは2つの部分によりベンゼン環が場合により置換されていてもよく、ただし、ベンゼン環が2つの部分により置換される場合、これらの部分は、合計で6個以下の炭素原子を含有するものとし;そして各R1は、水素、1〜約4個の炭素原子のアルコキシ、ハロゲン、および1〜約4個の炭素原子のアルキルよりなる群から独立して選択され、かつnは、0〜2の整数であり、ただし、nが2である場合、R11基は、合計で6個以下の炭素原子を含有するものとする〕
R12は、2〜約10個の炭素原子を含有する直鎖状もしくは分枝鎖状のアルケニルおよび2〜約10個の炭素原子を含有する置換型の直鎖状もしくは分枝鎖状のアルケニルよりなる群から選択され、この置換基は、1〜約4個の炭素原子を含有する直鎖状もしくは分枝鎖状のアルキルおよび3〜約6個の炭素原子を含有するシクロアルキル、ならびに1〜約4個の炭素原子を含有する直鎖状もしくは分枝鎖状のアルキルにより置換された3〜約6個の炭素原子を含有するシクロアルキルよりなる群から選択され;R22は、水素、1〜約8個の炭素原子を含有する直鎖状もしくは分枝鎖状のアルキル、ベンジル、(フェニル)エチル、およびフェニルよりなる群から選択され、ベンジル置換基、(フェニル)エチル置換基、またはフェニル置換基は、1〜約4個の炭素原子を含有する直鎖状もしくは分枝鎖状のアルキル、1〜約4個の炭素原子を含有する直鎖状もしくは分枝鎖状のアルコキシ、およびハロゲンよりなる群から独立して選択される1つまたは2つの部分によりベンゼン環が場合により置換されていてもよく、ただし、ベンゼン環が2つのそのような部分により置換される場合、これらの部分は、合計で6個以下の炭素原子を含有するものとし;そして各R2は、1〜約4個の炭素原子を含有する直鎖状もしくは分枝鎖状のアルコキシ、ハロゲン、および1〜約4個の炭素原子を含有する直鎖状もしくは分枝鎖状のアルキルよりなる群から独立して選択され、かつnは、0〜2の整数であり、ただし、nが2である場合、R2基は、合計で6個以下の炭素原子を含有するものとする〕
R23は、水素、1〜約8個の炭素原子の直鎖状もしくは分枝鎖状のアルキル、ベンジル、(フェニル)エチル、およびフェニルよりなる群から選択され、ベンジル置換基、(フェニル)エチル置換基、またはフェニル置換基は、1〜約4個の炭素原子の直鎖状もしくは分枝鎖状のアルキル、1〜約4個の炭素原子の直鎖状もしくは分枝鎖状のアルコキシ、およびハロゲンよりなる群から独立して選択される1つまたは2つの部分によりベンゼン環が場合により置換されていてもよく、ただし、ベンゼン環が2つのそのような部分により置換される場合、これらの部分は、合計で6個以下の炭素原子を含有するものとし;そして各R5は、1〜約4個の炭素原子の直鎖状もしくは分枝鎖状のアルコキシ、ハロゲン、および1〜約4個の炭素原子の30の直鎖状もしくは分枝鎖状のアルキルよりなる群から独立して選択され、かつnは、0〜2の整数であり、ただし、nが2である場合、R3基は、合計で6個以下の炭素原子を含有するものとする〕
R14は、-CHRARB(ここで、RBは、水素または炭素-炭素結合である)であり、ただし、RBが水素である場合、RAは、1〜約4個の炭素原子のアルコキシ、1〜約4個の炭素原子のヒドロキシアルコキシ、2〜約10個の炭素原子の1-アルキニル、テトラヒドロピラニル、アルコキシアルキル(ここで、アルコキシ部分は、1〜約4個の炭素原子を含有し、かつアルキル部分は、1〜約4個の炭素原子を含有する)、2-、3-、もしくは4-ピリジルであるものとし、さらに、RBが炭素-炭素結合である場合、RBおよびRAは、一緒になって、ヒドロキシおよび1〜約4個の炭素原子のヒドロキシアルキルよりなる群から独立して選択される1つ以上の置換基で場合により置換されていてもよいテトラヒドロフラニル基を形成するものとし;R24は、水素、1〜約4個の炭素原子のアルキル、フェニル、および置換フェニル(ここで、置換基は、1〜約4個の炭素原子のアルキル、1〜約4個の炭素原子のアルコキシ、およびハロゲンよりなる群から選択される)よりなる群から選択され;そしてR4は、水素、1〜約4個の炭素原子を含有する直鎖状もしくは分枝鎖状のアルコキシ、ハロゲン、および1〜約4個の炭素原子を含有する直鎖状もしくは分枝鎖状のアルキルよりなる群から選択される〕
R15は、水素;1〜約10個の炭素原子を含有する直鎖状もしくは分枝鎖状のアルキルおよび1〜約10個の炭素原子を含有する置換型の直鎖状もしくは分枝鎖状のアルキル(ここで、置換基は、3〜約6個の炭素原子を含有するシクロアルキル、および1〜約4個の炭素原子を含有する直鎖状もしくは分枝鎖状のアルキルで置換された3〜約6個の炭素原子を含有するシクロアルキルよりなる群から選択される);2〜約10個の炭素原子を含有する直鎖状もしくは分枝鎖状のアルケニルおよび2〜約10個の炭素原子を含有する置換型の直鎖状もしくは分枝鎖状のアルケニル(ここで、置換基は、3〜約6個の炭素原子を含有するシクロアルキル、および1〜約4個の炭素原子を含有する直鎖状もしくは分枝鎖状のアルキルで置換された3〜約6個の炭素原子を含有するシクロアルキルよりなる群から選択される);1〜約6個の炭素原子のヒドロキシアルキル;アルコキシアルキル(ここで、アルコキシ部分は、1〜約4個の炭素原子を含有し、かつアルキル部分は、1〜約6個の炭素原子を含有する);アシルオキシアルキル(ここで、アシルオキシ部分は、2〜約4個の炭素原子のアルカノイルオキシまたはベンゾイルオキシであり、かつアルキル部分は、1〜約6個の炭素原子を含有する);ベンジル;(フェニル)エチル;ならびにフェニル;よりなる群から選択され;ベンジル置換基、(フェニル)エチル置換基、またはフェニル置換基は、1〜約4個の炭素原子のアルキル、1〜約4個の炭素原子のアルコキシ、およびハロゲンよりなる群から独立して選択される1つまたは2つの部分によりベンゼン環が場合により置換されていてもよく、ただし、ベンゼン環が2つの部分により置換される場合、これらの部分は、合計で6個以下の炭素原子を含有するものとし;
R25は、
RXおよびRYは、水素、1〜約4個の炭素原子のアルキル、フェニル、および置換型フェニル(ここで、置換基は、1〜約4個の炭素原子のアルキル、1〜約4個の炭素原子のアルコキシ、およびハロゲンから選ばれる)よりなる群から独立して選択され;Xは、1〜約4個の炭素原子を含有するアルコキシ、アルコキシアルキル(ここで、アルコキシ部分は、1〜約4個の炭素原子を含有し、かつアルキル部分は、1〜約4個の炭素原子を含有する)、1〜約4個の炭素原子のハロアルキル、アルキルアミド(ここで、アルキル基は、1〜約4個の炭素原子を含有する)、アミノ、置換型アミノ(ここで、置換基は、アルキルまたは1〜約4個の炭素原子のヒドロキシアルキルである)、アジド、1〜約4個の炭素原子のアルキルチオよりなる群から選択される}
であり;そしてR5は、水素、1〜約4個の炭素原子を含有する直鎖状もしくは分枝鎖状のアルコキシ、ハロゲン、および1〜約4個の炭素原子を含有する直鎖状もしくは分枝鎖状のアルキルよりなる群から選択される〕
のうちの1つにより定義される化合物、または以上のいずれかの化合物の製薬上許容される塩でありうる。
Rtは、水素、1〜約4個の炭素原子を含有する直鎖状もしくは分枝鎖状のアルコキシ、ハロゲン、および1〜約4個の炭素原子を含有する直鎖状もしくは分枝鎖状のアルキルよりなる群から選択され;
Ruは、2-メチルプロピルまたは2-ヒドロキシ-2-メチルプロピルであり;そして
Rvは、水素、1〜約6個の炭素原子のアルキル、またはアルコキシアルキル(ここで、アルコキシ部分は、1〜約4個の炭素原子を含有し、かつアルキル部分は、1〜約4個の炭素原子を含有する)である〕
により定義される化合物、または適切であれば以上のいずれかの化合物の生理学的に許容される塩でありうる。
1-(2-メチルプロピル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-4-アミン(Rtが水素であり、Ruが2-メチルプロピルであり、かつRvが水素であるときの式VIで示される化合物);
1-(2-ヒドロキシ-2-メチルプロピル)-2-メチル-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-4-アミン(Rtが水素であり、Ruが2-ヒドロキシ-2-メチルプロピルであり、かつRvがメチルであるときの式VIで示される化合物);
1-(2-ヒドロキシ-2-メチルプロピル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-4-アミン(Rtが水素であり、Ruが2-ヒドロキシ-2-メチルプロピルであり、かつRvが水素であるときの式VIで示される化合物);
1-(2-ヒドロキシ-2-メチルプロピル)-2-エトキシメチル-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-4-アミン(Rtが水素であり、Ruが2-ヒドロキシ-2-メチルプロピルであり、かつRvがエトキシメチルであるときの式VIで示される化合物);
またはそれらの生理学的に許容される塩を包含しうる。
本出願に係るワクチン接種方法および組成物は、たとえば、ウイルス性、細菌性、または寄生虫性の感染症、癌、アレルギー、および自己免疫障害のようなさまざまな疾患状態に対して哺乳動物を保護または治療すべく適合化可能である。本発明に係る方法または組成物を用いることにより保護または治療の対象となりうる障害または疾患状態のいくつかの特定例は、以下のとおりである:
ウイルス感染症
A型、B型、C型、D型、およびE型肝炎ウイルス症、HIV症、1型、2型、6型、および7型ヘルペスウイルス症、サイトメガロウイルス症、水痘帯状疱疹、パピローマウイルス症、エプスタインバーウイルス症、インフルエンザウイルス症、パラインフルエンザウイルス症、アデノウイルス症、コクサッキーウイルス症、ピコルナウイルス症、ロタウイルス症、呼吸器合胞体ウイルス症、ポックスウイルス症、ライノウイルス症、風疹ウイルス症、パポバウイルス症、ムンプスウイルス症、麻疹ウイルス症、
細菌感染症
TBおよび癩病を引き起こすミコバクテリア症、肺炎球菌症、好気性グラム陰性バチルス症、マイコプラズマ症、ブドウ球菌感染症、連鎖球菌感染症、サルモネラ症、クラミジア症、
寄生虫症
マラリア症、リーシュマニア症、トリパノソーマ症、トキソプラズマ症、住血吸虫症、フィラリア症、
癌
乳癌、結腸癌、直腸癌、頭頸部癌、腎臓癌、悪性黒色腫、喉頭癌、卵巣癌、子宮頸癌、前立腺癌、
アレルギー
ハウスダストダニ、花粉、および他の環境アレルゲンに起因する鼻炎、
自己免疫疾患
全身性紅斑性狼瘡。
抗原反応を誘導すべく哺乳動物系内で発現される本出願で言及されるヌクレオチド配列は、抗原反応を開始させうる全タンパク質または単により短いペプチド配列をコードしうる。本明細書および添付の特許請求の範囲の全体を通して、「抗原性ペプチド」または「免疫原」という表現は、対象動物内で免疫応答を誘導しうるすべてのペプチド配列またはタンパク質配列を包含するものとする。しかしながら、動物系内で全タンパク質を発現させると天然抗原提示が模擬されて全免疫応答が惹起される可能性が高くなるので、一実施形態では、ヌクレオチド配列は、疾患状態に関連する全タンパク質をコードするであろう。特定の疾患状態に関係する公知の抗原性ペプチドのいくつかの例としては、以下の物質が挙げられるが、これらに限定されるものではない:
ヒト病原体に対して免疫応答を惹起しうる抗原、この抗原または抗原性組成物は、HIV-1由来(たとえば、tat、nef、gp120またはgp160、gp40、p24、gag、env、vif、vpr、vpu、rev)、ヒトヘルペスウイルス由来(たとえば、gH、gL、gM、gB、gC、gK、gE、もしくはgD、またはそれらの誘導体、あるいは前初期タンパク質、たとえば、HSV1またはHSV2に由来するICP27、ICP47、ICP4、ICP36)、サイトメガロウイルス(とくにヒトサイトメガロウイルス)由来(たとえば、gBまたはその誘導体)、エプスタインバーウイルス由来(たとえば、gp350またはその誘導体)、水痘帯状疱疹ウイルス由来(たとえば、gpI、II、III、およびIE63)であるか、または肝炎ウイルス由来、たとえば、B型肝炎ウイルス由来(たとえば、B型肝炎表面抗原もしくは肝炎コア抗原もしくはpol)、C型肝炎ウイルス抗原、およびE型肝炎ウイルス抗原であるか、または他のウイルス性病原体由来、たとえば、パラミクソウイルス由来:呼吸器合胞体ウイルス由来(たとえば、FおよびGタンパク質またはそれらの誘導体)であるか、またはパラインフルエンザウイルス由来、麻疹ウイルス由来、ムンプスウイルス由来、ヒトパピローマウイルス由来(たとえば、HPV6、11、16、18に由来するL1、L2、E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7など)、フラビウイルス(たとえば、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス)由来、またはインフルエンザウイルス細胞由来(たとえば、HA、NP、NA、もしくはMタンパク質、またはそれらの組合せ)の抗原であるか、あるいは細菌性病原体由来、たとえば、N. gonorrheaおよびN. meningitidisを含むNeisseria spp.由来(たとえば、トランスフェリン結合タンパク質、ラクトフェリン結合タンパク質、PilC、付着因子);S. pyogenes由来(たとえば、Mタンパク質もしくはその断片、C5Aプロテアーゼ)、S. agalactiae由来、S. mutans由来;H. ducreyi由来;Moraxella spp.由来、たとえば、Branhamella catarrhalisとしても知られるM catarrhalis由来(たとえば、高分子量および低分子量の付着因子ならびにインベーシン);Bordetella spp.由来、たとえば、B. pertussis由来(たとえば、ペルタクチン、百日咳毒素もしくはその誘導体、繊維状ヘマグルチニン、アデニル酸シクラーゼ、線毛)、B. parapertussis 由来、およびB. bronchiseptica由来;Mycobacterium spp.由来、たとえば、M. tuberculosis由来(たとえば、ESAT6、抗原85A、-B、もしくは-C、MPT44、MPT59、MPT45、HSP10、HSP65、HSP70、HSP75、HSP90、PPD 19kDa[Rv3763]、PPD 38kDa[Rv0934])、M. bovis由来、M. leprae由来、M. avium由来、M. paratuberculosis由来、M. smegmatis由来;Legionella spp.由来、たとえば、L. pneumophila由来;Escherichia spp.由来、たとえば、腸内毒性E. coli由来(たとえば、定着因子、易熱性トキシンもしくはその誘導体、耐熱性トキシンもしくはその誘導体)、腸管出血性E. coli由来、腸病原性E. coli由来(たとえば、志賀毒素様毒素もしくはその誘導体);Vibrio spp.由来、たとえば、V. cholera由来(たとえば、コレラ毒素もしくはその誘導体);Shigella spp.由来、たとえば、S. sonnei由来、S. dysenteriae由来、S. flexnerii由来;Yersinia spp.由来、たとえば、Y. enterocolitica由来(たとえば、Yopタンパク質)、Y. pestis由来、Y. pseudotuberculosis由来;Campylobacter spp.由来、たとえば、C. jejuni由来(たとえば、トキシン、付着因子、およびインベーシン)およびC. coli由来;Salmonella spp.由来、たとえば、S. typhi由来、S. paratyphi由来、S. choleraesuis由来、S. enteritidis由来;Listeria spp.由来、たとえば、L. monocytogenes;Helicobacter spp.由来、たとえば、H. pylori由来(たとえば、ウレアーゼ、カタラーゼ、空胞形成毒素);Pseudomonas spp.由来、たとえば、P. aeruginosa由来;Staphylococcus spp.由来、たとえば、S. aureus由来、S. epidermidis由来;E. faecalis由来、E. faecium由来を含むEnterococcus spp.由来;Clostridium spp.由来、たとえば、C. tetani由来(たとえば、破傷風毒素およびその誘導体)、C. botulinum由来(たとえば、ボツリヌス毒素およびその誘導体)、C. difficile由来(たとえば、クロストリジウム毒素AまたはBならびにそれらの誘導体);Bacillus spp.由来、たとえば、B. anthracis由来(たとえば、ボツリヌス毒素およびその誘導体);Corynebacterium spp.由来、たとえば、C. diphtheriae由来(たとえば、ジフテリア毒素およびその誘導体);Borrelia spp.由来、たとえば、B. burgdorferi由来(たとえば、OspA、OspC、DbpA、DbpB)、B. garinii由来(たとえば、OspA、OspC、DbpA、DbpB)、B. afzelii由来(たとえば、OspA、OspC、DbpA、DbpB)、B. andersonii由来(たとえば、OspA、OspC、DbpA、DbpB)、B. hermsii由来;Ehrlichia spp.由来、たとえば、E. equi由来およびヒト顆粒球性エールリヒア症因子;Rickettsia spp.由来、たとえば、R. rickettsii由来;Chlamydia spp.由来、たとえば、C. trachomatis由来(たとえば、MOMP、ヘパリン結合タンパク質)、C. pneumoniae由来(たとえば、MOMP、ヘパリン結合タンパク質)、C. psittaci由来;Leptospira spp.由来、たとえば、L. interrogans由来;Treponema spp.由来、たとえば、T. pallidum由来(たとえば、微量外膜タンパク質)、T. denticola由来、T. hyodysenteriae由来;の抗原であるか、あるいは寄生虫由来、たとえば、Plasmodium spp.由来、たとえば、P. falciparum由来;Toxoplasma spp.由来、たとえば、T. gondii(たとえば、SAG2、SAG3、Tg34)由来;Entamoeba spp.由来、たとえば、E. histolytica由来;Babesia spp.由来、たとえば、B. microti由来;Trypanosoma spp.由来、たとえば、T. cruzi由来;Giardia spp.由来、たとえば、G. lamblia由来;Leishmania spp.由来、たとえば、L. major由来;Pneumocystis spp.由来、たとえば、P.カリニ(P.carinii)由来;Trichomonas spp.由来、たとえば、T. vaginalis由来;Schisostoma spp.由来、たとえば、S. mansoni由来;であるか、あるいは酵母由来、たとえば、Candida spp.由来、たとえば、C. albicans由来;Cryptococcus spp.由来、たとえば、C. neoformans由来;である。
ヒト(高発現)遺伝子1/24/91(human_high.cod)のコドン使用頻度
アミノ酸 コドン 数 /1000 比率
Gly GGG 905.00 18.76 0.24
Gly GGA 525.00 10.88 0.14
Gly GGT 441.00 9.14 0.12
Gly GGC 1867.00 38.70 0.50
Glu GAG 2420.00 50.16 0.75
Glu GAA 792.00 16.42 0.25
Asp GAT 592.00 12.27 0.25
Asp GAC 1821.00 37.75 0.75
Val GTG 1866.00 38.68 0.64
Val GTA 134.00 2.78 0.05
Val GTT 198.00 4.10 0.07
Val GTC 728.00 15.09 0.25
Ala GCG 652.00 13.51 0.17
Ala GCA 488.00 10.12 0.13
Ala GCT 654.00 13.56 0.17
Ala GCC 2057.00 42.64 0.53
Arg AGG 512.00 10.61 0.18
Arg AGA 298.00 6.18 0.10
Ser AGT 354.00 7.34 0.10
Ser AGC 1171.00 24.27 0.34
Lys AAG 2117.00 43.88 0.82
Lys AAA 471.00 9.76 0.18
Asn AAT 314.00 6.51 0.22
Asn AAC 1120.00 23.22 0.78
Met ATG 1077.00 22.32 1.00
Ile ATA 88.00 1.82 0.05
Ile ATT 315.00 6.53 0.18
Ile ATC 1369.00 28.38 0.77
Thr ACG 405.00 8.40 0.15
Thr ACA 373.00 7.73 0.14
Thr ACT 358.00 7.42 0.14
Thr ACC 1502.00 31.13 0.57
Trp TGG 652.00 13.51 1.00
End TGA 109.00 2.26 0.55
Cys TGT 325.00 6.74 0.32
Cys TGC 706.00 14.63 0.68
End TAG 42.00 0.87 0.21
End TAA 46.00 0.95 0.23
Tyr TAT 360.00 7.46 0.26
Tyr TAC 1042.00 21.60 0.74
Leu TTG 313.00 6.49 0.06
Leu TTA 76.00 1.58 0.02
Phe TTT 336.00 6.96 0.20
Phe TTC 1377.00 28.54 0.80
Ser TCG 325.00 6.74 0.09
Ser TCA 165.00 3.42 0.05
Ser TCT 450.00 9.33 0.13
Ser TCC 958.00 19.86 0.28
Arg CGG 611.00 12.67 0.21
Arg CGA 183.00 3.79 0.06
Arg CGT 210.00 4.35 0.07
Arg CGC 1086.00 22.51 0.37
Gln CAG 2020.00 41.87 0.88
Gln CAA 283.00 5.87 0.12
His CAT 234.00 4.85 0.21
His CAC 870.00 18.03 0.79
Leu CTG 2884.00 59.78 0.58
Leu CTA 166.00 3.44 0.03
Leu CTT 238.00 4.93 0.05
Leu CTC 1276.00 26.45 0.26
Pro CCG 482.00 9.99 0.17
Pro CCA 456.00 9.45 0.16
Pro CCT 568.00 11.77 0.19
Pro CCC 1410.00 29.23 0.48
したがって、免疫原成分をコードするヌクレオチド分子がMUC-1免疫原をコードする本発明の一実施形態では、ヌクレオチド配列は、βアクチンのように高度に発現されるヒト遺伝子の使用頻度に近づけるように改変される。
1) 7 VNTR MUC-1 (すなわち、7個の完全反復配列のみを有する完全MUC-1)
2) 7 VNTR MUC-1 Δss (シグナル配列を欠く以外は1と同じ)
3) 7 VNTR MUC-1 ΔTM ΔCYT (膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを欠く以外は1と同じ)
4) 7 VNTR MUC-1 Δss ΔTM ΔCYT (シグナル配列を欠く以外は3と同じ)
5) 短縮型VNTR MUC-1 (すなわち、完全反復配列を含まない完全MUC-1)
6) 短縮型VNTR MUC-1 Δss (シグナル配列を欠く以外は5と同じ)
7) 短縮型VNTR MUC-1 ΔTM ΔCYT (膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを欠く以外は5と同じ)
8) 短縮型VNTR MUC-1 Δss ΔTM ΔCYT (シグナル配列を欠く以外は7と同じ)
HBV - PreS1、PreS2、および表面envタンパク質(coreおよびpol)
HCV - E1、E2、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5AおよびB
HIV - gp120、gp40、gp160、p24、gag、pol、env、vif、vpr、vpu、tat、rev、nef
パピローマ - E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8、L1、L2
HSV - gL、gH、gM、gB、gC、gK、gE、gD、ICP47、ICP36、ICP4
インフルエンザ - 赤血球凝集素、核タンパク質
TB - ミコバクテリアスーパーオキシドジスムターゼ、85A、85B、MPT44、MPT59、MPT45、HSP10、HSP65、HSP70、HSP90、PPD 19kDa Ag、PPD 38kDa Ag。
-免疫原-C-LytA反復配列1-4-P2エピトープ(C-LytA反復配列5に挿入または置換)-C-LytA反復配列6
-C-LytA反復配列1-4-P2エピトープ(C-LytA反復配列5に挿入または置換)-C-LytA反復配列6-免疫原
-免疫原-C-LytA反復配列2-5-P2エピトープ(C-LytA反復配列6に挿入)
-C-LytA2-5-P2エピトープ(C-LytA反復配列6に挿入)-免疫原
-免疫原 C-LytA反復配列1-5-P2エピトープ-C-LytA反復配列6に挿入
-C-LytA反復配列1-5-P2エピトープ-C-LytA反復配列6に挿入-免疫原
-免疫原-C-LytA反復配列1に挿入されたP2エピトープ-C-LytA反復配列2-5
-C-LytA反復配列1に挿入されたP2エピトープ-C-LytA反復配列2-5-免疫原
-免疫原-C-LytA反復配列1に挿入されたP2エピトープ-C-LytA反復配列2-6
-C-LytA反復配列1に挿入されたP2エピトープ-C-LytA反復配列2-6-免疫原
-免疫原-C-LytA反復配列1-C-LytA反復配列2に挿入されたP2エピトープ-C-LytA反復配列3-6
-C-LytA反復配列1-C-LytA反復配列2に挿入されたP2エピトープ-C-LytA反復配列3-6-免疫原;
ただし、「に挿入」とは、反復配列の任意の位置であってよいことを意味し、たとえば、残基1と2の間または2と3と間などである。
イントロダクション
GM-CSFをコードするヌクレオチド分子およびTLRアゴニストを使用すると抗原性ペプチドに対する細胞性免疫応答が増強されることを実験により実証する。免疫原性に関して有意差が観測された。すなわち、以下の実験からわかるように、GM-CSFをコードするヌクレオチドを含むアジュバントをTLRアゴニストと共に使用すると、抗原に対する免疫応答の速度論的挙動および機能性が改善される。これについては、本明細書中に概説される以下のプロトコルおよび当技術分野で周知のプロトコルにより、さらに実証しうる。
1 発現ベクターの構築: OVAcyt、7VNTRMuc1、HIV RNG、およびGM-CSFプラスミド
OVAcytプラスミドの構築
野生型ニワトリova遺伝子の分泌シグナル(a.a. 20-145)を欠失させることにより、非分泌型ニワトリオバルブミンをコードする遺伝子を構築した。非分泌細胞質型のオバルブミンタンパク質であることを示すべく、この短縮型遺伝子をOVAcytと記す。DNAワクチンベクターp7313中への連結を可能にする制限部位の組み込まれたプライマーを用いるPCRにより、この遺伝子を増幅した(詳細については、WO 02/08435(この先行公開は、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)に記載されている)。
マウスGM-CSFをcDNAライブラリーからクローン化し、発現ベクターpVACss2中にクローン化した。このcDNAクローンを鋳型として使用して、Kozac配列と開始コドンとDNAワクチンベクターp7313(上記WO 02/08435)中へのクローン化を可能にする制限酵素部位とが組み込まれたプライマーを用いるPCRにより、mGM-CSFオープンリーディングフレームを増幅した。図2は、このmGM-CSF発現カセットのコード配列を示している。
Iowa長HCMVプロモーター+エキソン1の下流かつウサギβ-グロビンポリアデニル化シグナルの上流の、不活性化コドン最適化RT、短縮型Nef、およびHIV-1 clade B株HXB2由来のコドン最適化gag遺伝子のp17/p24部分。
7個のVNTRユニットを含有するMUC1発現ベクターの構築
このベクターの構築については、特許出願WO03/100060(その開示内容は、参照により本明細書に組み入れられるものとする)に詳述されている。その配列を図3Aに示す。
二段階法を用いてMUC1のC末端にHepBヘルパーエピトープを挿入した。2種のオリゴFORAおよびREVAをアニーリングすることにより、エピトープをコードする短いDNAリンカーを生成させた。FORプライマー10pmol、REVプライマー10pmol、1×T4 DNAリガーゼ緩衝液、および10U T4ポリヌクレオチドキナーゼを全体積20μlで混合し、37℃で2時間インキュベートし、そして最初に95℃まで2分間加熱してから-0.1℃/sの速度で冷却することによりアニーリングした。4℃に保持した。得られたリンカーをpVACのNheI/XhoI部位に連結させてベクターJNW729(C末端)を生成させた。MUC1発現カセットをベクターJNW656からXbaIカセットで切り出してベクターJNW729のNheI部位にクローン化し、ベクターJNW737(C末端)を生成させた。ベクターはすべて、配列確認された。JNW737の配列は、図3Bに示されており、ヘルパーエピトープ配列は、四角で囲まれている。
最初に短いリンカーをpVAC1に挿入することにより、C末端融合体を生成させた。2種のプライマーPADREFORおよびPADREREVをアニーリングすることによりリンカーを作製して、NheI部位およびXhoI部位を介してpVAC1中にリンカーをクローン化し、ベクターJNW800を生成させた。MUC1カセットをXbaI断片で切り出してXbaI部位にクローン化することにより、JNW656(7×VNTR MUC1)およびJNW758(コドン最適化7×VNTR MUC1、特許出願VB60033参照)に由来する7×VNTR MUC1発現カセットをJNW800に挿入し、以下の2種のベクターを生成させた。
7×VNTR MUC1 C末端PADRE:JNW810
7×VNTR MUC1(コドン最適化) C末端PADRE:JNW812
JNW810およびJNW812に由来するMUC1発現カセットおよびPADREエピトープの配列決定結果を図3Cに示す。
動物
CBAB6.F1は、C57Bl6マウスとCBAマウスとの交雑種であり、使用したMUC1 Tgマウスに対する野生型バックグラウンドである。MUC1 Tgマウスは、Imperial Cancer Research Fundから入手したものであり、ヒトMUC1プロモーターの制御下でヒトMUC1を発現する(Peat et al, 1992)。そのマウスにおけるMUC1発現パターンは、ヒト組織に見られる発現のプロファイルに非常に類似している。Charles Riverから入手したC57/bl6またはBalb/Cをp7313OVAcytおよびp7313RNGに関係する試験に使用した。RIP-OVAloマウスは、GSKの社内で飼育されたものである。
塩化カルシウムおよびスペルミジンを用いて、プラスミドDNAを直径2μmの金ビーズ上に沈澱させた。抗原をコードするプラスミド(p7313OVAcyt、p7313RNG、pVAC7VNTRMuc1、pVAC7VNTRMuc1-PADRE、またはpVAC7VNTRMuc1-HepB)とp7313GMCSFプラスミドとを等量で混合して共沈させることにより、すべてのビーズが2種のプラスミドの混合物でコーティングされて両方のプラスミドが同一の細胞に確実に送達されるようにした。とくに指定がないかぎり、抗原およびGMCSFをいずれも0.5μg/カートリッジで充填した。より低用量の抗原を使用する場合、GMCSF充填量を0.5μgに保持し、p7313emptyプラスミドまたはpVACemptyプラスミドを用いてカートリッジ上の全DNAを1μgになるように調整した。充填ビーズを、たとえば、Eisenbraum, et al. 1993, DNA Cell Biol. 12:791-797; Pertmer et al, 1996 J. Virol. 70:6119-6125に記載されているように、Tefzelチューブ上にコーティングした。Accell遺伝子送達(PCT WO 95/19799;参照により本明細書に組み入れられるものとする)を用いて、微粒子銃衝撃を行った。剃毛後に腹部の各側に1ヶ所ずつ結果の節に詳述される各時間点でプラスミドを2回投与することにより、雌C56Bl/6マウスを免疫化した。各時間点におけるDNAの全用量は、2μgであった。イミキモドを送達する場合、これをクリーム製剤として免疫化の24時間後に免疫化部位上に局所適用した。20μlの5% AldaraTMクリーム(3M)を各免疫化部位に適用した。ミニブタの場合、各回1μgで4回の免疫化を腹部に施した(剃毛後)。
プラスミドの共コーティングと同一の手順を用いて、CpGオリゴヌクレオチドを金ビーズ上に共コーティングした。10:1のオリゴ:プラスミド比でオリゴをDNAと混合した。我々は、プラスミドがオリゴヌクレオチドにより置き換えられないこと明らかにし、オリゴヌクレオチドの10%がビーズ上に沈澱してカートリッジ上で1:1の比を生じると推測する。10:1のオリゴ対プラスミド比で共コーティングすると、1:1の比のときと比較してカートリッジ上へのオリゴの取り込みが多くなる。この試験で使用したODNを表1に列挙する。PTO ODNのCpG1826(刺激性CpG)およびGpC1745(非刺激性オリゴ)ならびにDNA ODNは、MWG-Biotech AGにより合成されたものである。
マウス脾細胞の調製
免疫化の7日後または図に示される時間点で免疫化マウスから脾臓を取得した。ガラススライド間で粉砕することにより脾臓を処理して細胞懸濁液を作製した。塩化アンモニウム処理により赤血球を溶解させ、デブリを除去して脾細胞の微細懸濁液を残した。ELISPOTアッセイに使用するために、RPMI完全培地に4×106/mlの濃度で細胞を再懸濁させた。
OVAアッセイでは、ペプチドSIINFEKL(OVAの優性CD8ペプチド)を50nMの最終濃度でアッセイに使用してCD8応答を測定し、ペプチドTEWTSSNVMEERKIKVを10μMの最終濃度で使用してCD4応答を測定した。ICSアッセイでは、同様にオバルブミンタンパク質を使用して1mg/mlでCD4応答を測定した。p7313RNGペプチドに対する応答を検出すELISPOTでは、CD8ペプチドAMQMLKETIを刺激に使用した。Muc1に対する応答の検出では、CD4ペプチドGGSSLSYTNPAVAATSANLおよびGEKETSATQRSSVPSを10μMで使用し、CD8ペプチドSAPDNRPALを10nmで使用した。マウスにおけるGagおよびRTに対するCD8応答を追跡するために使用した9-merペプチドは、それぞれ、AMQLKETI(Gag CD8)およびYYPDSKDLI(RT CD8)であり、GagおよびRTに対するCD4応答は、それぞれ、IYKRWIILGLNKIVR(Gag CD4)およびQWPLTEEKIKALVEI(RT CD4)を用いて追跡した。ペプチドEREVLEWRFDSRLAF(Nef 218)についても試験した。これらのペプチドを10μMの最終濃度で試験した。ペプチドは、Genemed Synthesis, South San Franciscoから入手したものである。
15μg/ml(PBS中)のラット抗マウスIFNγまたはラット抗マウスIL-2(Pharmingen)でプレートをコーティングした。プレートを+4℃で一晩かけてコーティングした。使用前、プレートをPBSで3回洗浄した。脾細胞を4×105細胞/ウェルでプレートに添加した。各ウェル中の全体積は、200μlであった。ペプチド刺激細胞を含有するプレートを加湿された37℃のインキュベーター中で16時間インキュベートした。
水で1回洗浄(1分間の浸漬を行って細胞を確実に溶解させる)およびPBSで3回洗浄を行うことにより、細胞をプレートから除去した。ビオチンコンジュゲート化ラット抗マウスIFNγまたはIL-2(Phamingen)をPBS中1μg/mlで添加した。プレートを振盪させながら室温で2時間インキュベートした。次に、プレートをPBSで3回洗浄し、その後、ストレプトアビジンアルカリホスファターゼ(Caltag)を1/1000希釈で添加した。PBSで3回洗浄した後、BCICP基質(Biorad)と共に15〜45分間インキュベートすることにより、スポットを出現させた。水を用いて基質を洗浄除去し、そしてプレートを乾燥させた。Asthma Cell Biology unit, GSKのBrian Hayesにより考案された画像解析システムまたはAID Elispotリーダー(Cadama Biomedical, UK)を用いて、スポットを計数した。
試験管1本あたり4×106個の脾細胞のアリコートに分け、そしてスピニングしてペレットにした。上清を除去し、そしてサンプルをボルテックスしてペレットを粉砕した。0.5μgの抗CD28+0.5μgの抗CD49d(Pharmingen)を各管に添加して放置し、室温で10分間インキュベートした。培地単独または適切な濃度でペプチドもしくはタンパク質を有する培地のいずれかを含む1mlの培地を該当する管に添加した。次に、サンプルを熱水浴中に入れて37℃で1時間インキュベートした。10μg/mlのブレフェルジンAを各管に添加して、37℃でインキュベーションをさらに5時間継続させた。次に、プログラム制御式水浴を6℃に戻し、その温度に一晩保持した。
100μlの全血または脾細胞を懸濁状態で各管に添加した。フィコエリトリン(PE)で標識化されたH2-Kb SIINFEKLテトラマー(Immunomics) 5μlを室温で20分間かけて添加した。抗マウスCD8-CyChromeまたはAPCを添加して放置し、さらに10分間インキュベートした。全血を分析する場合、製造業者の指示に従って「全血溶解溶液」(Immunotech)で赤血球を溶解させた。洗浄後、サンプルを緩衝液に再懸濁させ、フローサイトメーターで分析した。1サンプルあたり400,000事象を収集した。
ミニブタの免疫化
腹部下面に4カートリッジを送達することにより、ミニブタを免疫化した。14日後、末梢血単核細胞(BMC)を調製するために、末梢血サンプルを採取した。
ブタ血液をヘパリン中に採取し、PBSで2:1に希釈し、そして50ml Falconチューブ内のHistopaque(Sigma)上に層状化した。チューブを1200gで30分間遠心し、境界面からブタリンパ球を採取した。塩化アンモニウム溶解緩衝液を用いて残留赤血球を溶解させた。細胞を計数し、2×106/mlで完全RPMI培地中に再懸濁させた。
8μg/ml(PBS中)の(精製されたマウス抗ブタIFN□, Biosource ASC4934)でプレートをコーティングした。プレートを+4℃で一晩かけてコーティングした。使用前、プレートをPBSで3回洗浄し、完全RPMI培地で2時間ブロックした。PBMCを2×105細胞/ウェルでプレートに添加した。各ウェル中の全体積は、200μlであった。組換えGag、Nef、またはRTタンパク質(自社内で調製)を5μg/mlの最終濃度で添加した。プレートを加湿された37℃のインキュベーター中で16時間インキュベートした。
水で1回洗浄(1分間の浸漬を行って細胞を確実に溶解させる)およびPBSで3回洗浄を行うことにより、細胞をプレートから除去した。ビオチンコンジュゲート化抗ブタIFNγをPBS中0.5μg/mlで添加した。プレートを振盪させながら室温で2時間インキュベートした。次に、プレートをPBSで3回洗浄し、その後、ストレプトアビジンアルカリホスファターゼ(Caltag)を1/1000希釈で添加した。PBSで3回洗浄した後、BCICP基質(Biorad)と共に15〜45分間インキュベートすることにより、スポットを出現させた。水を用いて基質を洗浄除去し、そしてプレートを乾燥させた。AID Elispotリーダー(Cadama Biomedical, UK)を用いて、スポットを計数した。
イミキモドは免疫応答を増大させる
2×0.5μg p73I-RNG(GW825780X)または対照空ベクターを用いてPMIDによりマウスを免疫化した。該当する場合、20μlの5% AldaraTMクリーム(3M)を免疫化の各領域に擦り込んだ。免疫化の24時間後にAldaraTMクリームを適用した。免疫化後の14日目に脾臓を採取し、GAG balb/c CD8 9merペプチド:AMQMLKETIで刺激した後でIFNγ Elispotにより細胞応答を分析した。結果を図5に示す。データは、免疫化の0時間後または24時間後におけるイミキモドの送達を比較したものであり、免疫化の24時間後の適用が良好なアジュバント作用を有することを示している。
IFNγで処理されたDCにおけるTLR発現のTaqman分析
3体の健常ドナーのPBMCから単球を単離し、IL-4およびGM-CSFと共に7日間培養し、未成熟DCへの分化を誘導した。次に、DCをIFNγで24時間処理した。次に、TLR 1〜9のmRNA発現をTaqmanにより測定した。結果を図6に示す。発表された報告とは対照的に、我々は、低レベルのTLR7が単球由来のDC上で構成的に発現されることを示した。IFNγ処理の後、3体のドナーのいずれにおいてもTLR8の発現およびTLR7の増大されたレベルの発現が見いだされた。TLR2もまた、アップレギュレートされたが、その程度は、より少なかった。in vitroにおける刺激の24時間後のTLR7発現の増大は、免疫化の24時間後のイミキモドの良好な効果を示す図5の結果を説明する。
我々はまた、レシキモドに対するこれらのドナー由来の細胞の応答についても調べた。DCを単離し、前と同じようにGMCSFと共に培養した。次に、DCをIFNγで24時間処理するかまたは未処理の状態で放置し、その後、レシキモドで処理した。産生されたサイトカインのレベルおよび表面マーカー発現のレベルを測定した。結果を図7に示す。IFNγ前処理によりレシキモドに対するDCの応答性が増大されることが判明した。成熟過程が増強されて、細胞表面マーカーの発現、サイトカインの産生、およびDCの機能的能力が増大される結果となった。これらの結果から、TLR7およびTLR8がヒト単球由来のDCにおけるレシキモドに対する応答に関係していることが示唆され、再び、免疫化の24時間後のイミキモドの送達が支持される。
0日目のPMIDによる一次免疫化の後でELISPOTを行うことにより、OVAcytならびにp7313GMCSFおよびイミキモドとの組合せによる免疫化の後における細胞応答を評価した。0.5μgのp7313OVAcytおよび0.5μgのp7313GMCSFまたは空ベクター対照でカートリッジを充填した。したがって、2ショットとしてマウス1匹あたりに与えられた全DNA用量は、2μgであった。アッセイ条件は、次のとおりであった:SIINFEKL(高親和性CD8ペプチド)またはTEWTSSNVMEERKIKV(CD4エピトープを含有する)による刺激。Elispotアッセイの結果を図8に示す。この図は、GMCSFまたはイミキモドのいずれかをp7313 OVAcytと共に送達したときのアジュバント作用を示している。免疫化後の7日目に分析を行った。OVA+GMCSF+イミキモドのグループでは、CD8 IFNγ Elispotのウェルは、計数により識別可能なスポットよりも多くのスポットを含有していることから、GMCSF単独またはイミキモド単独のいずれよりも大幅に増大されていることが示される。p7313OVAcyt単独で免疫化した場合と比べて劇的に改良された他のパラメーターは、CD4細胞の数およびIFNγを分泌するCD4細胞の割合であった。
0日目および28日目にp7313OVAcytでマウスを免疫化した。これを単独で送達するかまたはp7313GMCSFと共送達し、いくつかのグループでは、免疫化の24時間後にイミキモドの適用を行った。初回免疫および追加免疫の免疫化スケジュールでは、p7313OVAcytの用量を0.005μg/カートリッジに低減させた。p7313GMCSFは、存在する場合、0.5μg/カートリッジで送達した。追加免疫後の7日目に脾臓を採取し、オバルブミンCD4およびCD8ペプチドで一晩刺激した後、Elispotにより分析した。24時間でのイミキモドの投与と組み合わせてGMCSFの共送達を行うと、ova単独のときと比較して、CD4細胞およびCD8細胞のいずれによる細胞応答(とくにIFNγ産生)も増強されることが判明した。
pVAC7VNTR Muc1に対する応答に及ぼすGMCSFおよびイミキモド処理の影響を調べる実験を行った。0日目および21日目にマウスをpVAC7VNTR muc1で免疫化した。これを単独で送達するか、p7313GMCSFと共送達するか、またはp7313GMCSFと共送達しかつ免疫化の24時間後にイミキモドを適用した。追加免疫後の7日目に脾臓を採取し、Muc1 CD4ペプチドで一晩刺激した後、Elispotにより分析した。p7313 GMCSFの共投与またはイミキモドの適用はいずれもpVAC 7VNTRMuc1単独で免疫化したときと比較してCD4応答を改良することが判明した。GMCSFの共送達を24時間でのイミキモドの投与と組み合わせると、応答はさらに増強された(図12)。
Powderject研究装置を用いてPMIDにより2カートリッジを送達することにより、雌Balb/c(K2d)マウスを免疫化した。1カートリッジあたり0.5μgおよび0.05μgで、2回用量の抗原を使用した。該当する場合、免疫化の24時間後にイミキモドを適用した。免疫化の7日後に1グループあたり3匹のマウスを屠殺し、脾臓を取り出してELIspotアッセイによる細胞応答分析に供した。GagおよびRTに対するCD8応答を追跡するために使用した9-merペプチドは、それぞれ、AMQLKETI(Gag CD8)およびYYPDSKDLI(RT CD8)であり、GagおよびRTに対するCD4応答は、それぞれ、IYKRWIILGLNKIVR(Gag CD4)およびQWPLTEEKIKALVEI(RT CD4)を用いて追跡した。ペプチドEREVLEWRFDSRLAF(Nef 218)についても試験した。GagおよびRTのCD4およびCD8ペプチドに対する応答は、これらのいずれかを単独で使用したときと比較して、イミキモドと組み合わされたGMCSFの存在下で最大に増強された。これらの結果は、GMCSF/イミキモドの組合せがとくにCD4細胞に強い影響を及ぼすオバルブミンおよびMuc1のデータに一致する。
グラフ上の軸表示に示されるようなOVAcytならびにCpG 1826、CpG1745、およびGMCSFの組合せでコーティングされたカートリッジを用いてPMIDにより、C57/bl6マウスを免疫化した。カートリッジの作製については、材料および方法に記載されている。指定があれば、免疫化の24時間後に局所適用イミキモド(AldaraTM)によるマウスの処置も行った。免疫化の7日後にマウスを屠殺し、脾細胞を分析した。ペプチドSIINFEKLを用いてCD8応答を測定し(10nm)、ペプチドTEWTSSNVMEERIKV(10μm)を用いてCD4応答を測定した(図16)。CpGオリゴ1826とp7313OVAcytとの共コーティングは、SIINFEKLペプチドにより測定されるCD8応答にプラスの影響を及ぼすことが示された。CpG 1745(負の対照のオリゴ)は、非特異的アジュバント作用を有するが、これは1826と比べてかなり減少されたものであった。TLRリガンドCpG 1826とGMCSFとの相乗効果は、イミキモドで見いだされたものに類似していた。
RIP OVAloマウスを使用してGMCSF+イミキモドの組合せによる寛容破綻の可能性を試験した(図20)。RIP OVAloマウスは、膵臓のインスリン産生ベータ細胞上でオバルブミン(OVA)を発現するので、この分子に対して寛容である。この寛容が破綻するとベータ細胞の自己免疫破壊が起こって糖尿病を引き起こす。これは、糖尿および血中グルコースレベルを測定することにより、容易に監視可能である。空ベクターまたはOVAcyt(PMIDを用いる)、±GM-CSF(PMIDを用いる)、および±イミキモドを用いて、RIPova loおよびC57/BL6マウス(wt対照グルーブ)に4回免疫化を行った。免疫化は3週間の間隔で行った。PMIDの24時間後、免疫化部位にイミキモドを局所適用した。最後の免疫化の7日後、脾細胞および血清のサンプルを採取した。TEWTSSNVMEERIKVペプチドで再刺激された脾細胞を用いて、CD4+ T細胞内におけるIFNγおよびIL2の産生を細胞内サイトカイン染色により監視した。SIINFEKLペプチドで再刺激された脾細胞を用いて、CD8+ T細胞内におけるIFNγおよびIL2の産生を細胞内サイトカイン染色により監視した。脾細胞を用いてCD8+ T細胞のH-2 Kb SIINFEKLテトラマー分析を行った。結果は、CD4寛容を破綻させるのにGMCSF+イミキモドが必要であることを示している(図20A)。CD8細胞の場合、GMCSF単独のグループおよびイミキモド単独のグループで応答が存在するが、応答は、GMCSF+イミキモドグループで最大である。このことはまた、CD8応答をテトラマーにより監視した場合にもあてはまる(図20C)。このモデルでの寛容破綻に対する機能試験は、糖尿病の発症である。これは、尿中グルコースレベルにより測定される。この試験を用いると、GMCSFとイミキモドとを組み合わせた免疫化スケジュールは、明らかに優れている(図20E)。この実験は、機能的応答の発生を含む寛容破綻が目標である場合、複数回の追加免疫を含むスケジュールにGMCSFを組み入れることが重要性であることを示している。
腹部下面に4回の投与(すなわち、4カートリッジ)を行うことにより、Gottingenミニブタを免疫化した。各カートリッジは、0.5μgのp7313RNGと0.5μgのp7313emptyまたはp7313GMCSFのいずれかとで構成されていた(図21に対する説明文中に詳述されるとおり)。最初の免疫化の14日後、血液をサンプリングし、PBMCを精製し、抗原特異的IFNγ分泌細胞数をELISPOTにより決定した(図21)。結果は、GMCSF+イミキモドの組合せにより媒介されるアジュバント作用がGMCSF単独またはイミキモド単独のいずれにより媒介されるアジュバント作用よりも大きいことを示している。
Claims (66)
- (i) TLRアゴニストまたはTLRアゴニストをコードするヌクレオチド配列と;
(ii) GM-CSFをコードするヌクレオチド配列と;
を含む、アジュバント組成物。 - 成分(i)をコードするヌクレオチド配列および成分(ii)をコードするヌクレオチド配列が、同一のポリヌクレオチド分子内に含まれるかまたは構成される、請求項1に記載のアジュバント組成物。
- 成分(i)をコードするヌクレオチド配列および成分(ii)をコードするヌクレオチド配列が、異なるヌクレオチド分子内に含まれるかまたは構成されるヌクレオチド配列によりコードされる、請求項1に記載のアジュバント組成物。
- 前記ヌクレオチド配列がDNA配列である、請求項1〜3に記載のアジュバント組成物。
- 前記ヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド分子がDNAプラスミド内にコードされる、いずれかの先行請求項に記載のアジュバント組成物。
- アジュバント成分(i)が、次の分子:β-デフェンシン;HSP60;HSP70;HSP90;フィブロネクチン;およびフラジェリンタンパク質のうちの1つ以上またはTLRアゴニストとして作用しうるその成分をコードするヌクレオチド配列である、いずれかの先行請求項に記載のアジュバント組成物。
- アジュバント成分(i)が、次の物質:
トリ-アシル化リポペプチド(LP);フェノール可溶性モジュリン;Mycobacterium tuberculosis LP;S-(2,3-ビス(パルミトイルオキシ)-(2-RS)-プロピル)-N-パルミトイル-(R)-Cys-(S)-Ser-(S)-Lys(4)-OH三塩酸塩(Pam3Cys) LP;またはOspA LPのようなTLR-1アゴニスト;
M tuberculosis、B burgdorferi、またはT pallidum由来の細菌リポペプチド;Staphylococcus aureusなどの種由来のペプチドグリカン;リポテイコ酸、マンヌロン酸、Neisseriaポーリン、細菌線毛、Yersinaビルレンス因子、CMVビリオン、麻疹ヘマグルチニン、または酵母由来のザイモサンのようなTLR-2アゴニスト、;
二本鎖RNAまたはポリイノシン酸-ポリシチジル酸(Poly IC)のようなTLR-3アゴニスト、;
グラム陰性細菌由来のリポ多糖(LPS);熱ショックタンパク質10、60、65、70、75、または90;サーファクタントプロテインA、ヒアルロナンオリゴ糖、ヘパラン硫酸断片、フィブロネクチン断片、フィブリノーゲンペプチド、b-デフェンシン-2、またはモノホスホリルリピドA(MPL)といったLPSの無毒の誘導体のようなTLR-4アゴニスト、;
細菌フラジェリンのようなTLR-5アゴニスト;
ミコバクテリアリポタンパク質、ジ-アシル化LP、またはフェノール可溶性モジュリンのようなTLR-6アゴニスト、;
ロキソリビン、N7位およびC8位のグアノシン類似体、もしくはイミダゾキノリン化合物、またはそれらの誘導体(たとえば、イミキモドもしくはレシキモド)のようなTLR-7アゴニスト;
抗ウイルス活性を有するイミダゾキノリン分子(たとえばレシキモド)のようなTLR-8アゴニスト;
HSP90、または非メチル化CpGヌクレオチド(とくに、CpGモチーフとして知られる配列コンテキスト)を含有するDNAのようなTLR-9アゴニスト;
のうちの1つ以上またはTLRアゴニストとして作用しうるその成分である、請求項1に記載のアジュバント組成物。 - 前記イミダゾキノリンまたはその誘導体が、本明細書に定義される式I〜VIのいずれか1つにより定義される化合物である、請求項7に記載のアジュバント組成物。
- 前記イミダゾキノリンまたはその誘導体が、本明細書に定義される式VIにより定義される化合物である、請求項7または8に記載のアジュバント組成物。
- 前記イミダゾキノリンまたはその誘導体が、
1-(2-メチルプロピル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-4-アミン;
1-(2-ヒドロキシ-2-メチルプロピル)-2-メチル-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-4-アミン;
1-(2,ヒドロキシ-2-メチルプロピル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-4-アミン;
1-(2-ヒドロキシ-2-メチルプロピル)-2-エトキシメチル-1-H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-4-アミン;
よりなる群から選択される式VIで示される化合物である、請求項7〜9のいずれかに記載のアジュバント組成物。 - 前記イミダゾキノリンまたはその誘導体がイミキモドである、請求項7〜10のいずれかに記載のアジュバント組成物。
- 前記イミダゾキノリンまたはその誘導体がレシキモドである、請求項7〜10のいずれかに記載のアジュバント組成物。
- 成分(i)が、併行投与または逐次投与に供すべく、成分(ii)とは別の組成物として提供される、請求項1または請求項3〜12のいずれかに記載のアジュバント組成物。
- 成分(i)が、局所投与されるイミダゾキノリンである、請求項13に記載のアジュバント組成物。
- 成分(i)が、成分(ii)の12〜26時間後に投与される、請求項14に記載のアジュバント組成物。
- いずれかの先行請求項に記載のアジュバント組成物と、
(iii)抗原性のペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む免疫原成分と、
を含む、1種または複数種の免疫原性組成物。 - 成分(i)が、ヌクレオチド配列によりコードされ、かつ成分(i)、(ii)、および(iii)をコードするヌクレオチド配列が、同一のポリヌクレオチド分子内に含まれるかまたは構成される、請求項16に記載の免疫原性組成物。
- 成分(i)が、ヌクレオチド配列によりコードされ、かつ成分(i)、(ii)、および(iii)をコードするヌクレオチド配列が、併行投与または逐次投与に供すべく、別々のポリヌクレオチド分子内に含まれるかまたは構成される、請求項16に記載の1種または複数種の免疫原性組成物。
- 成分(i)が、ヌクレオチド配列によりコードされ、しかも成分(i)、(ii)、および(iii)のうちのいずれか2つ成分をコードするヌクレオチド配列が、同一のポリヌクレオチド分子内に含まれるかまたは構成され、かつ残りのヌクレオチド配列が、併行投与または逐次投与に供すべく、さらなるポリヌクレオチド分子内にコードされる、請求項16に記載の1種または複数種の免疫原性組成物。
- 成分(ii)および(iii)をコードするヌクレオチド配列が、同一のポリヌクレオチド分子内に含まれるかまたは構成され、かつ成分(i)をコードするヌクレオチド配列が、併行投与または逐次投与に供すべく、さらなるポリヌクレオチド分子内にコードされる、請求項19に記載の1種または複数種の免疫原性組成物。
- 前記ヌクレオチド配列がDNA配列である、請求項16〜19のいずれかに記載の1種または複数種の免疫原性組成物。
- 前記ヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド分子が、DNAプラスミド内にコードされる、請求項21に記載の1種または複数種の免疫原性組成物。
- 前記ヌクレオチド配列が、in vivoで免疫応答を惹起しうるP501Sタンパク質またはその誘導体をコードし、該免疫応答が、P501Sを発現する腫瘍細胞または腫瘍を認識可能である、請求項16〜22のいずれかに記載の1種または複数種の免疫原性組成物。
- 前記ヌクレオチド配列が、in vivoで免疫応答を惹起しうるMUC-1タンパク質またはその誘導体をコードし、該免疫応答が、MUC-1を発現する腫瘍細胞または腫瘍を認識可能である、請求項16〜22のいずれかに記載の1種または複数種の免疫原性組成物。
- 前記MUC-1タンパク質またはその誘導体が、いかなる反復ユニット(完全または不完全)をも有していない、請求項24に記載の1種または複数種の免疫原性組成物。
- 前記MUC-1タンパク質またはその誘導体が、いかなる完全反復ユニットをも有していない、請求項24に記載の1種または複数種の免疫原性組成物。
- 前記MUC-1タンパク質またはその誘導体が、1〜15個の反復ユニットを含有する、請求項24に記載の1種または複数種の免疫原性組成物。
- 前記MUC-1タンパク質またはその誘導体が、7個の完全反復ユニットを含有する、請求項24に記載の1種または複数種の免疫原性組成物。
- 前記MUC-1タンパク質またはその誘導体をコードするヌクレオチド配列がコドン改変されている、請求項24〜28のいずれかに記載の1種または複数種の免疫原性組成物。
- 前記不完全反復領域をコードするヌクレオチド配列が、少なくとも0.6のRSCUを有する、請求項24〜29のいずれかに記載の1種または複数種の免疫原性組成物。
- 前記MUC-1タンパク質またはその誘導体の不完全反復ユニットをコードするヌクレオチド配列が、対応する非反復領域にわたり野生型MUC-1 DNAに対して85%未満の同一性レベルを有する、請求項24〜30のいずれかに記載の1種または複数種の免疫原性組成物。
- 前記MUC-1タンパク質またはその誘導体が、グリコシル化を低減させた突然変異体のような改変反復配列(VNTRユニット)を含有する、請求項24〜31のいずれかに記載の1種または複数種の免疫原性組成物。
- 前記MUC-1タンパク質またはその誘導体が、融合タンパク質であるか、または外来T細胞エピトープにコンジュゲートされている、請求項24〜32のいずれかに記載の1種または複数種の免疫原性組成物。
- 前記MUC-1タンパク質またはその誘導体が、融合タンパク質であるか、あるいはP2もしくはP30またはそれらの断片にコンジュゲートされている、請求項33に記載の1種または複数種の免疫原性組成物。
- 前記外来T細胞エピトープが、前記MUC-1タンパク質またはその誘導体の内部またはいずれかの末端に組み込まれる、請求項33に記載の1種または複数種の免疫原性組成物。
- 請求項16〜35のいずれかに記載の1種または複数種の組成物と、製薬上許容される担体、希釈剤、または賦形剤と、を含む、ワクチン組成物。
- 請求項1〜15のいずれかに記載のアジュバント成分(i)および(ii)を、抗原性のペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む免疫原成分(iii)と、混合することを含む、免疫原性組成物の製造方法。
- アジュバント成分(i)がヌクレオチド配列によりコードされる、請求項37に記載の方法。
- アジュバント成分(ii)をコードするヌクレオチド分子が、免疫原成分(iii)をコードするヌクレオチドと混合され、かつアジュバント成分(i)が、併行投与または逐次投与に供すべく、別の組成物として提供される、請求項37または38に記載の方法。
- アジュバント成分(ii)をコードするヌクレオチド分子が、免疫原成分(iii)をコードするヌクレオチドと共コードされて単一のポリヌクレオチド分子を形成し、かつアジュバント成分(i)が、併行投与または逐次投与に供すべく、別の組成物として提供される、請求項37または38に記載の方法。
- 成分(i)、(ii)、および(iii)をコードするヌクレオチド配列が、併行投与または逐次投与に供すべく、別々のポリヌクレオチド分子内にコードされる、請求項38に記載の方法。
- 成分(i)、(ii)、および(iii)のうちのいずれか2つ成分をコードするヌクレオチド配列が、共コードされて単一のポリヌクレオチド分子を形成し、かつ残りのヌクレオチド配列が、併行投与または逐次投与に供すべく、さらなるポリヌクレオチド配列内にコードされる、請求項38に記載の方法。
- 成分(i)、(ii)、および(iii)をコードするヌクレオチド配列が、共コードされて単一のポリヌクレオチド分子を形成する、請求項38に記載の方法。
- 前記ヌクレオチド配列がDNAである、請求項37〜43のいずれかに記載の方法。
- 前記ヌクレオチド配列がプラスミドDNA内にコードされる、請求項44に記載の方法。
- 成分(ii)および(iii)をコードするヌクレオチド分子が、プラスミド内に組み込まれ、かつアジュバント成分の(i)が、併行投与または逐次投与に供すべく、別の組成物として提供される、請求項37〜40のいずれかに記載の方法。
- 前記成分が、製薬上許容される賦形剤、希釈剤、または担体の内部に組み込まれる、請求項37〜46のいずれかに記載の方法。
- 請求項1〜15のいずれかに記載のアジュバント組成物と;抗原性のペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む免疫原成分(iii)と;1種以上の製薬上許容される賦形剤、希釈剤、または担体と;を含む、1種または複数種の医薬組成物。
- 請求項16〜35のいずれかに記載の1種または複数種の免疫原性組成物と、製薬上許容される賦形剤、希釈剤、または担体と、を含む、1種または複数種の医薬組成物。
- アジュバント成分(ii)と、免疫原成分(iii)と、製薬上許容される賦形剤、希釈剤、または担体と、を含む医薬組成物と;アジュバント成分(i)と、製薬上許容される賦形剤、希釈剤、または担体と、を含むさらなる医薬組成物と;を含むキットであって、アジュバント成分(i)が、TLRアゴニストまたはTLRアゴニストをコードするヌクレオチドを含み;アジュバント成分(ii)が、GM-CSFをコードするヌクレオチドを含み;かつ免疫原成分(iii)が、抗原性のペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む;上記キット。
- 少なくとも1種の担体が金ビーズであり、かつ少なくとも1種の医薬組成物が粒子媒介薬剤送達による送達に適用可能である、請求項48〜50のいずれかに記載の1種または複数種の医薬組成物。
- 成分(ii)および(iii)用の担体が金ビーズであり、かつアジュバント成分(i)が、併行投与または逐次投与に供すべく製剤化されている、請求項51に記載の1種または複数種の医薬組成物。
- 請求項16〜36または請求項48〜52のいずれかに記載の免疫原性組成物、ワクチン組成物、または医薬組成物を、安全かつ有効な量で投与することにより、腫瘍を患っているかまたは患いやすい患者を治療する方法。
- 前記腫瘍が、MUC-1を発現する腫瘍である、請求項53に記載の患者を治療する方法。
- 前記腫瘍が、乳癌;非小細胞肺癌などの肺癌;または前立腺癌、胃癌、および他の消化器癌;である、請求項53または54に記載の患者を治療する方法。
- 抗原に対する哺乳動物の免疫応答を増大させる方法であって、以下の成分:
(i) TLRアゴニストまたはTLRアゴニストをコードするヌクレオチド;
(ii) GM-CSFをコードするヌクレオチド;および
(iii) 抗原性のペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む免疫原成分;
を投与することを含む、上記方法。 - 前記方法が、成分(i)、(ii)、および(iii)のうちのいずれか2つの成分の併行投与と、残りの成分の逐次投与と、を含む、請求項56に記載の免疫応答を増大させる方法。
- 前記方法が、成分(i)、(ii)、および(iii)の逐次投与を含む、請求項56に記載の免疫応答を増大させる方法。
- 併行投与に供される成分が別々の組成物として製剤化される、請求項56または57に記載の抗原に対する哺乳動物の免疫応答を増大させる方法。
- MUC-1を発現する腫瘍の治療または予防に使用するための医薬の製造における、以下の成分:
(i) TLRアゴニストまたはTLRアゴニストをコードするヌクレオチド;
(ii) GM-CSFをコードするヌクレオチド;および
(iii) 抗原性のペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む免疫原成分;
を含む免疫原性組成物。 - 哺乳動物において疾患状態に対する免疫応答を惹起する方法であって、該疾患状態に関連する抗原性ペプチドをコードするヌクレオチド配列を適切なベクターに組み入れて該哺乳動物に投与することと;GM-CSFをコードするヌクレオチド配列を適切なベクターに組み入れて該哺乳動物に追加的に投与することと;該免疫応答を惹起すべく該哺乳動物にイミダゾキノリンまたはその誘導体をさらに投与することと;を含む、上記方法。
- 免疫原に対する哺乳動物の免疫応答を増大させる方法であって、免疫応答を刺激するのに有効な量で該免疫原をコードするヌクレオチド配列およびGM-CSFをコードするヌクレオチド配列を適切なベクターに組み入れて該哺乳動物に投与する工程と;該免疫原をコードするヌクレオチド配列およびGM-CSFをコードするヌクレオチド配列の投与の12〜36時間後の時点で、該免疫応答を増大させるのに有効な量でイミダゾキノリンまたはその誘導体を該哺乳動物にさらに投与する工程と;を含む、上記方法。
- 抗原性のペプチドまたはタンパク質により開始される免疫応答を増強するための医薬の製造におけるイミダゾキノリンまたはその誘導体およびGM-CSFの使用であって、該抗原性のペプチドまたはタンパク質が、該ペプチドをコードするヌクレオチド配列を哺乳動物に投与した結果として発現される、上記使用。
- ヌクレオチド配列によりコードされる抗原に対する免疫応答を増強するための医薬の製造における以下の成分(i)〜(iii):
(i) TLRアゴニストまたはTLRアゴニストをコードするヌクレオチド;
(ii) GM-CSFをコードするヌクレオチド;および
(iii) 抗原性のペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む免疫原成分;
の使用。 - ヌクレオチド配列によりコードされる抗原に対する免疫応答を増強すべく哺乳動物に併行投与または逐次投与するための2種以上の医薬の製造における以下の成分(i)〜(iii):
(i) TLRアゴニストまたはTLRアゴニストをコードするヌクレオチド;
(ii) GM-CSFをコードするヌクレオチド;および
(iii) 抗原性のペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む免疫原成分;
の使用。 - ヌクレオチド配列によりコードされる抗原に対する免疫応答を増強すべく哺乳動物に併行投与または逐次投与するための医薬の製造における以下の成分(i)〜(iii):
(i) TLRアゴニストまたはTLRアゴニストをコードするヌクレオチド;
(ii) GM-CSFをコードするヌクレオチド;および
(iii) 抗原性のペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む免疫原成分;
の使用であって、
各成分が別々の医薬として製剤化される、上記使用。
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