MXPA06002969A

MXPA06002969A - Avances en vacunacion.

Info

Publication number: MXPA06002969A
Application number: MXPA06002969A
Authority: MX
Inventors: Gary Peter Bembridge; Jennifer L Craigen
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 2003-09-15
Filing date: 2004-09-13
Publication date: 2007-03-26
Also published as: MA28323A1; AU2004271726A1; US20080145375A1; RU2370537C2; GB0321615D0; BRPI0414381A; IL174131A0; WO2005025614A2; RU2006106848A; NO20061242L; KR20070029111A; WO2005025614A3; ZA200602156B; CN1878567A; EP1682175A2; IS8363A; NZ545948A; JP2007505827A; SG145767A1; CA2538197A1

Abstract

La presente invencion se refiere a vacunas de acido nucleico mejoradas, sistemas de adyuvante y procesos para la preparacion de dichas vacunas y sistemas de adyuvantes. En particular, las vacunas de acido nucleico y los sistemas de adyuvantes de la presente invencion, comprenden una combinacion de una secuencia de acido nucleico que codifica GM-CSF, o derivados de los mismos, y agonistas del receptor tipo leva (TLR) y derivados de los mismos.

Description

AVANCES EN VACUNACIÓN Campo del Invento La presente invención se refiere a vacunas de ácido nucleico mejoradas, sistemas de adyuvantes y procesos para la preparación de dichos sistemas de vacunas y adyuvantes. En particular, los sistemas de vacuna de adyuvante de ácido nucleico de la presente invención, comprenden una combinación de una secuencia de ácido nucleico que codifica GM-CSF, o derivados del mismo, y agonistas de receptor tipo toll (TLR) o derivados del mismo. Antecedentes del Invento Las técnicas de vacunación tradicionales que comprenden la introducción de un antígeno dentro de un sistema de animal que puede inducir una respuesta inmune en el animal, y proteger por lo tanto al animal contra infección, han sido conocidas por muchos años. Después de la observación al principio de la década de los 1990s de que el ADN de plásmido podría transfectar directamente in vivo células de animales, se han realizado esfuerzos de investigación significativos para desarrollar técnicas de vacunación con base en el uso de plásmidos de ADN para inducir respuestas inmunes, mediante la introducción directa en los animales del ADN, el cual codifica los péptidos antigénicos. Dichas técnicas, las cuales son referidas como "inmunización de ADN" o "vacunación de ADN" se utilizan en la actualidad para generar respuestas inmune de anticuerpos (humoral) y transmitidas por células (celular) protectoras en una amplia variedad de modelos pre-clínicos de enfermedades virales, bacterianas y de parásitos. La investigación también está en relación con el uso de técnicas de vacunación de ADN en el tratamiento y protección contra cáncer, alergias y enfermedades autoinmunes. Las vacunas de ADN normalmente consisten en un vector de plásmido bacteriano en el cual se inserta un promotor fuerte, el gen de interés que codifica un péptido antigénico y una secuencia de terminación de poli-adenilación/de transcripción. El inmunógeno en donde el gen de interés se codifica, puede ser una proteína completa o simplemente una secuencia de péptido antigénico que se relaciona con el patógeno, con el tumor o con otro agente el cual esté proyectado para ser protegido. El plásmido puede crecer en bacterias, tales como por ejemplo £. coli y posteriormente aislarse y prepararse en un medio adecuado, dependiendo de la ruta de administración proyectada, antes de ser administrada al huésped. En la publicación de "Donnelly, J. y Asociados, Annual Rev. Immunol. (1997) 15:617-648; Ertl P. y Thomsen L., Technical issues in construction of nucleic acid vaccines Methods noviembre de 2003; 31 (3):199-206; se proporciona información de antecedente auxiliar en relación a la vacunación de ADN; cuyas descripciones están incluidas en su totalidad a la presente invención como referencia. Existe un número de ventajas de la vacunación de ADN con relación a las técnicas de vacunación tradicionales. Primero, se anticipa que debido a que las proteínas son codificadas por las secuencias de ADN se sintetizan en el huésped, la estructura o conformación de la proteína será similar a la proteína nativa asociada con el estado de enfermedad. También es probable que la vacunación de ADN ofrezca protección contra diferentes cepas de un virus, generando respuestas de linfocito T citotóxicas que reconocen epítopes de las proteínas conservadas. Además, debido a que los plásmidos se introducen directamente en las células huésped, en donde la proteína antigénica puede ser producida, se generará una respuesta inmune de larga duración. La tecnología también ofrece la posibilidad de combinar diversos inmunogénes en una sola preparación para facilitar la inmunización simultánea en relación a un número de estados de enfermedad. A pesar de las numerosas ventajas asociadas con la vacunación de ADN con relación a terapias de vacunación tradicionales, existe el deseo de desarrollar compuestos adyuvantes que se servirán para incrementar la respuesta inmune inducida por la proteína la cual es codificada por el ADN de plásmido administrado a un animal. La vacunación de ADN algunas veces está asociada con una desviación de la respuesta inmune desde una respuesta Th1 hasta una respuesta Th2, especialmente cuando el ADN se administra directamente a la epidermis (Fuller and Haynes, Hum. Retrovir. (1994) 10:1433-41). Se reconoce que el perfil inmune deseado de una vacuna de ácido nucleico, depende de la enfermedad que esté siendo tratada. La estimulación preferencial de una respuesta Th1 es probable que proporcione la eficacia de vacunas para muchas enfermedades virales y cánceres, y un tipo de respuesta Th2 dominante puede ser efectiva para limitar alergia e inflamación asociada con algunas enfermedades autoinmunes. Por consiguiente, pueden ser útiles formas para elevar en forma cuantitativa la respuesta inmune o para cambiar el tipo de respuesta a una que pueda ser más eficaz para la indicación de enfermedad. Las células dendríticas se encuentran en una forma inmadura en los tejidos. En respuesta a la infección del tejido u otro daño de tejido, las células dendríticas migran hacia el tejido dañado, en donde son captadas, se procesan y presentan péptidos del tejido dañado y migran hacia los nodos linfáticos. Los péptidos son presentados por las células dendríticas dentro del contexto de moléculas de complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) de la superficie, junto con moléculas co-estimuladoras. Las células dendríticas que presentan péptidos en las MHC junto con moléculas coestimuladoras, son denominadas células dendríticas "maduras". Las células dendríticas maduras tienen la capacidad de ¡nteractuar con células T, y activar células T que reconocen el péptido presentado para montar una respuesta inmune para eliminar el origen del daño al tejido (por ejemplo, bacteria invasora). El factor de estimulación de colonia del granulocito-macrófago (GM-CSF) es una citocina con la capacidad de inducir diferenciación, proliferación y activación de un rango de células con función inmunológica. El GM-CSF induce la proliferación de células dendríticas a partir de precursores de médula ósea para alcanzar un estado de célula dendrítica inmaduro, es decir, que las células expresan bajos niveles de marcadores de co-estimulación y altos niveles de receptores para la captación de antígenos.

Los receptores tipo Toll (TLRs) son receptores de transmembrana tipo I, conservados en forma evolucionaría entre insectos y humanos. Diez TLRs han estado muy establecidos (TLRs 1-10) (Sabroe y Asociados, Jl 2003 p1630-5). Los elementos de la familia TLR tienen dominios extracelulares e intracelulares similares; sus dominios extracelulares han sido mostrados por tener secuencias de repetición ricas en leucina, y sus dominios intracelulares son similares a la región intracelular del receptor de interleucina-1 (IL-1R). Las células TLR se expresan en forma diferente entre células inmune y otras células (incluyendo células epiteliales vasculares, adipocitos, miocitos cardíacos y células epiteliales intestinales). El dominio intracelular de los TLRs puede interactuar con la proteína adaptadora Myd88, la cual también procede del dominio IL-1R en su región citoplásmica, conduciendo a una activación NF-KB de citocinas; esta trayectoria Myd88 es una forma a través de la cual se efectúa la liberación de citocinas mediante la activación TLR. La principal expresión de los TLRs está en los tipos celulares, tales como células que presentan antígenos (por ejemplo células dendríticas, macrófagos, etc.). La activación de células dendríticas mediante estimulación a través de TLRs, conduce a la maduración de células dendríticas, y la producción de citocinas inflamatorias tales como IL-12. La investigación llevada a cabo ha descubierto que los TLRs reconocen diferentes tipos de agonistas, aunque algunas agonistas son comunes para varios TLRs. Los agonistas TLR son derivados predominantemente de bacterias o viruses, e incluyen moléculas tales como flagelina o lipopolisacáridos bacterianos (LPS).

Los compuestos de imidazoquinolina, imiquimod y resiquimod, son pequeños compuestos anti-virales. El imiquimod ha sido utilizado para el tratamiento local de verrugas genitales originados por virus de papiloma humano; el resiquimod ha sido probado también para usarse en el tratamiento de verrugas genitales. El imiquimod y el resiquimod se consideran como que actúan a través de las trayectorias de señalización TLR-7 ó TLR-8 y en la activación de la trayectoria de activación Myd88. Los inventores de la presente invención han identificado ciertas combinaciones adyuvantes las cuales son efectivas para promover una respuesta inmune mejorada, en particular una respuesta inmune celular mejorada cuando se utilizan como adyuvantes en vacunación de ADN. Sumario del Invento De acuerdo con una modalidad de la presente invención, se proporciona una composición de adyuvante que comprende: (i) un agonista de TLR, una secuencia de nucleótidos que codifica un agonista de TLR; y (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica GM-CSF, en donde los componentes (i) y (¡i), actúan en co-operación funcional para aumentar las respuestas inmunes en un mamífero a un antígeno. Por el término GM-CSF, se entiende toda la molécula de GM-CSF ó cualquier fragmento de la misma con la capacidad de incluir la proliferación de células precursoras de médula ósea para alcanzar un estado de célula dendrítica inmaduro. La secuencia de gen de polinucleótido de ratón GM-CSF, se muestra en la figura 2. La secuencia de ADN para GM-CSF humano se obtuvo de la base de datos Genbank (número de acceso M11220-Ref. Lee, F. y Asociados, PNAS 82(13) 4360-4364 (1985)). En una modalidad, en donde los adyuvantes se utilizan para vacunas humanas, la secuencia GM-CSF es la secuencia humana (ver figura 22). Las secuencias de nucleótidos de la presente invención, por ejemplo la secuencia de nucleótidos que codifica GM-CSF, pueden proporcionarse dentro del contexto de un plásmido que comprende secuencias de control reguladoras. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos puede estar dentro del contexto del vector de vacuna p7313 (los detalles se incluyen en la Publicación WO 02/08435) bajo el control de regulación del promotor temprano inmediato (IE) de citomegalovirus humano (CMV).

Por el término "agonista de TLR", se entiende un componente el cual tiene la capacidad de originar una respuesta de señalización a través de una trayectoria de señalización TLR, ya sea como un ligando directo o indirectamente a través de la generación de un ligando endógeno o exógeno (Sabroe y Asociados, Jl 2003 p1630-5). En una modalidad de la presente invención, el componente (i) es un agonista de TLR con la capacidad de originar una respuesta de señalización a través de TLR-1 (Sabroe y Asociados, Jl 2003 p1630-5). En una modalidad, el agonista de TLR con la capacidad de originar una respuesta de señalización a través de TLR-1 se selecciona de: lipopéptidos tri-acilados (LPs); modulina soluble en fenol; tuberculosis micobacterium LP; S-82,3-bis(palmitoiloxi)-(2-RS)-propil)-N-palm¡toil-(R)-Cys-(S)-Ser-(S)-Lys(4)-OH, triclorhidrato (Pam3Cys) LP que mimetiza el término amino acetilado de una lipoproteína bacteriana y LP OspA de Borrelia burgdorfei. En una modalidad alternativa, el componente (i) es un agonista de TLR con la capacidad de originar una respuesta de señalización a través de TLR-2 (Sabroe y Asociados, Jl 2003 p1630-5). En una modalidad, el agonista de TLR tiene la capacidad de originar una respuesta de señalización a través de TLR-2 es uno o más de un lipopéptido bacteriano procedente de tuberculosis M, B. burgdorferi. T. pallidum; peptidoglicanos de especies que incluyen Staphylococcus aureus; ácidos lipoteicoicos, ácidos manurónicos, porinas Neisseria, fimbrias bacteriana, factores de virulencia Yersinia, viriones CMV, measles hemaglutinina y zymosan procedente de levadura. En una modalidad alternativa, el componente (i) es un agonista de TLR con la capacidad de originar una respuesta de señalización a través de TLR-3 (Sabroe y Asociados, Jl 2003 p1630-5). En una modalidad, el agonista de TLR tiene la capacidad de originar una respuesta de señalización a través de TLR-3 que es un ARN de hebra doble, o ácido poli-inosínico-policitidílico (Poly IC), un patrón de ácido nucleico molecular asociado con una infección viral. En una modalidad alternativa, el componente (i) es un agonista de TLR con la capacidad de originar una respuesta de señalización a través de TLR-44 (Sabroe y Asociados, Jl 2003 p1630-5). En una modalidad, el agonista de TLR tiene la capacidad de originar una respuesta de señalización a través de TLR-4 que es uno o más de un lipopolisacárido (LPS) de una bacteria gram-negativa o fragmentos de la misma; proteína de impacto de calor (HSP) 10, 60, 65, 70, 75, ó 90; proteína A de tensoactivo, oligosacáridos de hialuronano, fragmentos de sulfato de heparano, fragmentos de fibronectina, péptidos de fibrinogén y b-defensin-2. En una modalidad, el agonista de TLR es HSP 60, 70, ó 90. En una modalidad alternativa, el agonista de TLR tiene la capacidad de originar una respuesta de señalización a través de TLR-4 que es un derivado no tóxico de LPS. El lípido de monofosforilo A (MPL) es un derivado no tóxico, producido mediante la eliminación del grupo de carbohidrato del núcleo y el fosfato procedente de la glucosamina con extremo de reducción. MPL ha sido descrito por Ribi y Asociados (1986, Immunology and Immunopharmacology of bacterial endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY, p407-419). MPL, el cual se puede utilizar como agonista de TLR en la presente invención, tiene la siguiente estructura: Una versión destoxificada adicional de MPL, resulta de la eliminación de la cadena de acilo de la posición-3 del esqueleto de disacárido, y se denomina lípido de monofosforilo 3-O-desacilado A (3D-MPL). 3D-MPL es un agonista de TLR que se puede utilizar en la presente invención. Puede ser purificado y preparado a través de los métodos considerados en la Patente GB 2122204B, cuya referencia también describe la preparación del lípido de difosforilo A, y las variantes 3-O-desaciladas del mismo. Una forma de 3D-MPL está en la forma de una emulsión que tiene un pequeño tamaño de partícula menor a 0.2 µm de diámetro, y su método de fabricación se describe en la Publicación WO 94/21292. Las formulaciones acuosas que comprenden el lípido de monofosforilo A y un tensoactivo, han sido descritas en la Publicación WO9843670A2. Se han descrito otros derivados no tóxicos purificados y sintéticos de LPS (Patente Norteamericana No. 6,005,099 y Patente EP 0,729,473 B1; Hilgers y Asociados, 1986, Int. Arch. Allergy. Immunol., 79(4):392-6; Hilgers y Asociados, 1987, Immunology, 60(1):141-6; y Patente EP 0,549,074 B1). Los derivados no tóxicos de LPS, o lipopolisacáridos bacterianos que se puedan utilizar como agonistas TLR en la presente invención, pueden ser purificados y procesados a partir de fuentes bacterianas, o como alternativa pueden ser sintéticos. Por ejemplo, el lípido de monofosforilo purificado A se describe en la Publicación de Ribi y Asociados 1986 (supra), y el lípido de monofosforilo o difosforilo 3-O-desacilado A derivado de Salmonella sp., se describe en la Patente GB 2220211 y en la Patente US 4912094. Otros lipopolisacáridos purificados y sintéticos también han sido descritos (Patente Norteamericana No. 6,005,099 y Patente EP 0,729,473 B1; Hilgers y Asociados, 1986, Int. Arch. Allergy. Immunol., 79(4):392-6; Hilgers y Asociados, 1987, Immunology, 60(1 ): 141 -6; y la Patente EP 0,549,074 B1). Los adyuvantes de lipopolisacáridos bacterianos pueden ser 3D-MPL y los disacáridos de glucosamina ß( 1 -6) que se describe en la Patente US 6,005,099 y en la Patente EP 0,729,473 B1. Por consiguiente, otros derivados de LPS que pueden ser utilizados como agonistas TLR en la presente invención, son los inmunoestimulantes que son similares en estructura a la de LPS ó MPL ó 3D-MPL. En otro aspecto de la presente invención, los derivados de LPS pueden ser un monosacárido acilado, el cual es una subparte de la estructura de MPL anterior. Un agonista de disacárido puede ser un lípido A purificado o sintético de la siguiente fórmula: en donde R2 puede ser H o PO3H2; R3 puede ser una cadena de acilo ó ß-hidroximiristoílo ó un residuo de 3-aciloxiacilo que tiene la fórmula: en donde R* en donde X y Y tienen un valor de desde 0 hasta aproximadamente 20. Un derivado no tóxico aún adicional de LPS, el cual comparte una pequeña homología estructural con LPS y es puramente sintético, es el que se describe en la Publicación WO 00/00462, cuyos contenidos están incorporados en su totalidad a la presente invención como referencia. En una modalidad alternativa, el componente (i) es un agonista de TLR con la capacidad de originar una respuesta de señalización a través de TLR-5 (Sabroe y Asociados, Jl 2003 p1630-5). En una modalidad, el agonista de TLR que tiene la capacidad de originar una respuesta de señalización a través de TLR-5 es flagelina bacteriana. En una modalidad alternativa, el componente (i) es un agonista de TLR con la capacidad de originar una respuesta de señalización a través de TLR-6 (Sabroe y Asociados, Jl 2003 p1630-5). En una modalidad, el agonista de TLR con la capacidad de originar una respuesta de señalización a través de TLR-6 es lipoproteína micobacteriana, LP d¡-acilado y modulina soluble en fenol. En la Publicación WO2003043572 se describen agonistas TLR-6 adicionales. En una modalidad alternativa, el componente (i) es un agonista de TLR con la capacidad de originar una respuesta de señalización a través de (Sabroe y Asociados, Jl 2003 p1630-5). En una modalidad, el agonista de TLR con la capacidad de originar una respuesta de señalización a través de TLR-7 es loxorribina, un análogo de guanosina en las posiciones N7 y C8, o un compuesto de imidazoquinolina o un derivado del mismo. En una modalidad, el agonista de TLR es imiquimod. Los agonistas TLR-7 adicionales se' describen en la Publicación WO02085905. En una modalidad alternativa, el componente (i) es un agonista de TLR con la capacidad de originar una respuesta de señalización a través de TLR-8 (Sabroe y Asociados, Jl 2003 p1630-5). En una modalidad, el agonista de TLR que tiene la capacidad de originar una respuesta de señalización a través de TLR-8 es una molécula de imidazoquinolina con una actividad anti-viral, por ejemplo resiquimod (R848); resiquimod también tiene la capacidad de ser reconocido por TLR-7. Otros agonistas TLR-8 que se pueden utilizar incluyen los que se describen en la Publicación WO2004071459. En una modalidad alternativa, el agonista de TLR es imiquimod. En otra modalidad, el agonista de TLR es resiquimod. En una modalidad alternativa, el componente (i) es un agonista de TLR con la capacidad de originar una respuesta de señalización a través de TLR-9 (Sabroe y Asociados, Jl 2003 p1630-5). En una modalidad, el agonista de TLR con la capacidad de originar una respuesta de señalización a través de TLR-9 es HSP90. Como alternativa, el agonista de TLR con la capacidad de originar una respuesta de señalización a través de TLR-9 es un ADN que contiene nucleótidos CpG no metilados, en particular contextos de secuencia conocidos como motivos CpG. Los oligonucleótidos que contienen CpG inducen una respuesta predominantemente Th1. Dichos oligonucleótidos son bien conocidos y se describen por ejemplo en las Publicaciones WO 96/02555, WO 99/33488, y en las Patentes Norteamericanas Nos. 6,008,200 y 5,856,462. En una modalidad, los nucleótidos CpG son oligonucleótidos CpG. En una modalidad, el nucleótido CpG es una composición de oligonucleótido que tiene una región de oligonucleótido ¡nmunoestimulador que contiene al menos un motivo de di-nucleótido no metilado CG. Con frecuencia la secuencia inmunoestimuladora es: Purina, Purina, C, G, pirimidina, pirimidina; en donde el motivo CG de dinucleótido no está metilado. En una modalidad, los nucleótidos CpG contienen dos o más motivos CpG de dinucleótidos separados por al menos tres, o al menos seis o más nucleótidos. Los nucleótidos CpG de la presente invención normalmente son desoxinucleótidos. En una modalidad, el enlace de internucleótido en el oligonucleótido es fosforoditioato. En una modalidad adicional el enlace de internucleótido en el oligonucleótido es un enlace de fosforotioato, aunque el fosfodiéster y otros enlaces de internucleótido están dentro del alcance de la presente invención, incluyendo oligonucleótidos con ligaduras de ¡nternucleótido mezcladas. Los métodos para producir oligonucleótidos de fosforotioato o fosforoditioato se describen en la Patente Norteamericana No. US5,666,153, Patente Norteamericana No. US5,278,302, y Publicación WO95/26204. Los ejemplos de nucleótidos CpG tienen las siguientes secuencias. Las secuencias pueden contener ligaduras de ¡nternucleótido modificadas por fosforotioato. OLIGO 1 (SEQ ID NO:17): TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826) OLIGO 2 (SEQ ID NO:18): TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758) OLIGO 3 (SEQ ID NO:19): ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG OLIGO 4 (SEQ ID NO:20): TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006) OLIGO 5 (SEQ ID NO:21): TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668) Los oligonucleótidos CpG alternativos pueden • comprender las secuencias anteriores ya que tienen eliminaciones o adiciones sin consecuencias en las mismas. Los nucleótidos CpG utilizados en la presente invención, pueden ser sintetizados a través de cualquier método conocido en la técnica (por ejemplo, Patente EP 468520). En forma conveniente, dichos nucleótidos CpG pueden ser sintetizados utilizando un sintetizador automático. Los nucleótidos CpG utilizados en la presente invención son normalmente desoxinucleótidos. En una modalidad, el enlace de internucleótido en el oligonucleótido es un fosforoditioato. En una modalidad adicional el enlace de internucleótido en el oligonucleótido es un enlace de fosforotioato, aunque los fosfodiésteres están dentro del alcance de la presente invención. Se contemplan oligonucleótidos que comprenden diferentes ligaduras de internucleótido, por ejemplo, fosforotioato-fosfodiésteres mezclados. Se pueden utilizar otros enlaces de internucleótido que estabilizan el oligonucleótido. En una modalidad alternativa, el componente (i) es un agonista de TLR con la capacidad de originar una respuesta de señalización a través de TLR-10. Como alternativa, el agonista de TLR tiene la capacidad de originar una respuesta de señalización a través de cualquier combinación de dos o más de los TLRs anteriores. Los agonistas TLR particulares que se pueden utilizar en la presente invención, incluyen agonistas de TLRs 2, 4, 7, u 8. En una modalidad alternativa adicional, las combinaciones de más de un agonista de TLR pueden ser utilizadas. En una modalidad de la presente invención, se utiliza un agonista de TLR-4 y un agonista de TLR-7. En una modalidad de la presente invención, el componente (i) no tiene la capacidad de originar una respuesta de señalización a través de TLR-9. La presente invención no se limita a los agonistas-TLR descritos en la presente invención; también se pueden utilizar en la misma otros ligantes naturales o agonistas TLR sintéticos. En una modalidad de la presente invención, el agonista de TLR tiene la capacidad de originar una respuesta de señalización a través de TLR-7. En una modalidad de la presente invención, el agonista de TLR es un compuesto de imidazoquinolina o derivado del mismo. En una modalidad adicional, la ¡midazoquinolina o derivado del mismo es un compuesto definido por cualesquiera de las fórmulas de la I a la VI, tal como se define en la presente invención. En una modalidad adicional, la imidazoquinolina o derivado del mismo es un compuesto definido a través de la fórmula VI. En una modalidad, la ¡midazoquinolina o derivado del mismo es un compuesto de la fórmula VI seleccionado porque consiste en: 1-(2-metilprop¡l)-1H-imidázo[4,5-c]quinol¡n-4-am¡na: 1-(2-hidroxi-2-metilpropil)-2-metil-1H-¡midazo[4,5-c]quinolin-4-amina; 1-(2-hidroxi-2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina; 1-(2-hidroxi-2-metilpropil)-2-etoximetil-1-H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina. En una modalidad adicional, la imidazoquinolina o derivado del mismo es imiquimod o resiquimod. La imidazoquinolina o derivado del mismo puede ser imiquimod. En una modalidad de la presente invención, cuando la imidazoquinolina o derivado del mismo es imiquimod, el imiquimod se proporciona de una formulación en crema para administración tópica. Un ejemplo de una formulación en crema de imiquimod que se puede utilizar es crema AldaraMR al 5% (3M). En una modalidad alternativa de la presente invención, cuando la imidazoquinolina o derivado del mismo es resiquimod, el resiquimod se proporciona en una formulación para administración oral o administración intradérmica. En una modalidad de la presente invención, los componentes (¡i) y (iii) son secuencias de polinucleótidos que se administran en forma concomitante, y el componente (i) es una imidazoquinolina, por ejemplo imiquimod, el cual se administra en forma tópica, por ejemplo en una formulación en crema, entre 12 y 36 horas después de la administración de los componentes (ii) y (iii), por ejemplo en o aproximadamente 24 horas después de la administración de los componentes (ii) y (iii).

En una modalidad de la presente invención, las secuencias de nucleótidos que codifican los componentes (i), (ii), ó (iii) de la presente invención son ADN. En una modalidad adicional, la secuencia de nucleótidos o moléculas de polinucleótidos se codifica dentro del ADN de plásmido. En una modalidad de la composición adyuvante de la presente invención, las secuencias de nucleótidos que codifican el componente (i) y el componente (ii) se codifican en conjunto dentro de un plásmido.

En una modalidad, el componente de adyuvante (i) es una secuencia de nucleótidos que codifica uno o más de los siguientes, o que codifican un componente de los siguientes que tienen la capacidad de actuar como un agonista de TLR: ß-defensina; HSP60; HSP70; HSP90, u otro HSP de peso molecular inferior con la capacidad de actuar como un agonista de TLR; fibronectina; y proteína de flagelina. En una modalidad alternativa, el agonista de TLR del componente (i) es uno o más de los siguientes, o un componente de los siguientes, con la capacidad de actuar como un agonista de TLR: un agonista de TLR-1 tal como: lipopéptidos tri-acilados (LPs); modulina soluble-fenol; tuberculosis Micobacterium LP; S-(2,3-bis(palmitoiloxi)-(2-RS)-propil)-N-palmitoil-(R)-Cys-(S)-Ser-(S)-Lys(4)-OH, LP de triclorhidrato (Pam3Cys) el cual mimetiza el término amino acetilado de la lipoproteína bacteriana y LP OspA de Borrelia burgdorfei; un agonista TLR-2 tal como: lipopéptido bacteriano de tuberculosis M, B burgdorferi. T. pallidum; peptidoglicanos de las especies que incluyen Staphylococcus aureus; ácidos lipoteicoicos, ácido manurónicos, porinas Neisseria, fimbria bacteriana, factores de virulencia Yersina, viriones CMV, sarampión de hemaglutinina y zymosan de levadura; un agonista TLR-3 tal como: ARN de hebra doble, o ácido poli-inosínico-policitidílico (Poly IC), un patrón de ácido nucleico molecular asociado con infección viral; un agonista TLR-4 tal como: un lipopolisacárido (LPS) de bacteria gram-negativa o fragmentos del mismo; proteína de impacto de calor (HSP) 10, 60, 65, 70, 75 ó 90; proteína de tensoactivo A, oligosacáridos de hialuronan, fragmentos de sulfato de heparano, fragmentos de fibronectina, péptidos de fibrinogén y b-defensin-2, ó un derivado no tóxico de LPS tal como lípido de monofosforilo A (MPL); un agonista de TLR-5 tal como: flagelina bacteriana; un agonista TLR-6 tal como: lipoproteína micobacteriana, LP di-acilado y modulina soluble en fenol; un agonista TLR-7 tal como: loxorribina, un análogo de guanosina en las posiciones N7 y C8, o un compuesto de imidazoquinolina, o un derivado del mismo tai-como imiquimod o resiquimod; un agonista de TLR-8, tal como: una molécula de imidazoquinolina con una actividad anti-viral, tal como resíquimod; un agonista TLR-9 tal como: HSP90 ó ADN que contiene nucleótidos CpG no metilados, en particular contextos de secuencia conocidos como motivos CpG, para administración concomitante o en secuencias con el componente (ii). En una modalidad, el componente (i) es uno de los agonistas TLR anteriores. La presente invención proporciona además una. composición inmunógenoica o composiciones que comprenden componentes adyuvantes (i) y (¡i) tal como se describe en la presente invención, y (iii) un componente de inmunógeno que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido o proteína antigénica. En una modalidad de la presente invención, el componente (i) se codifica a través de una secuencia de nucleótidos, y las secuencias de nucleótidos que codifican los componentes (i), (ii), y (iii) están comprendidas o consisten en una, o las mismas, moléculas de polinucleótidos. En una modalidad adicional de la presente invención, el componente (i) es codificado por una secuencia de nucleótidos, y las secuencias de nucleótidos que codifican los componentes (i), (¡i), (iii) están comprendidos o consisten en moléculas de polinucleótido separadas para administración concomitante o en secuencias. Como alternativa, las secuencias de nucleótidos que codifican cualesquiera de los dos componentes (i), (ii) y (iii) pueden comprender o consistir en una, o las mismas, moléculas de polinucleótidos y la secuencia de nucleótidos restantes pueden ser modificadas dentro de una molécula de polinucleótido adicional, para administración concomitante o en secuencias. Las secuencias de nucleótidos que codifican los componentes (ii) y (iii) pueden estar comprendidas o pueden consistir en una, o las mismas moléculas de polinucleótidos, y el componente de codificación de secuencia de nucleótidos (i) puede estar codificado dentro de una molécula de polinucleótido adicional, para administración concomitante o en secuencias. En una modalidad de la presente invención en donde los componentes (i), (¡i), y/o (iii) están comprendidos o consisten en moléculas de polinucleótidos separadas, las moléculas de polinucleótidos pueden estar presentes cada una en plásmidos separados para la administración concomitante o en secuencias. En una modalidad, se puede utilizar administración concomitante. En una modalidad de la presente invención, la secuencia de nucleótidos que codifica el componente (i) y la secuencia de nucleótidos que codifica el componente (¡i) están comprendidas o consisten en una o las mismas moléculas de polinucleótidos. En una modalidad alternativa, la secuencia de nucleótidos que codifica el componente (i) y la secuencia de nucleótidos que codifica el componente (ii) se codifican mediante secuencias de nucleótidos que están comprendidas de o que consisten en diferentes moléculas de nucleótidos, para administración concomitante o en secuencias. Por administración concomitante, se entiende la administración substancialmente simultánea; esto es, los componentes se administran al mismo tiempo, o si no, con al menos 5 minutos de diferencia entre uno y otro. Como alternativa, los componentes se administran al uno, dos, tres, cuatro, cinco, o diez minutos con diferencia del otro. En un protocolo de tratamiento, los componentes de adyuvante (i) y (ii) se administran en forma substancialmente simultánea a la administración de la secuencia de nucleótidos que codifica el inmunógeno (iii). Obviamente, este protocolo se puede variar según sea necesario. En una modalidad de la presente invención, el componente (i) es una imidazoquinolina o derivado del mismo, y se proporciona una composición por separado de los componentes (ii) y (iii) para administración concomitante o en secuencias. En una modalidad, el compuesto de imidazoquinolina o derivado del mismo se administra en secuencias, esto es después de la administración de los componentes (ii) y (iii) en una composición por separado. En una modalidad adicional, el compuesto de imidazoquinolina o derivado del mismo, se proporciona 2, 4, 6, 8, 12, ó 24 horas después de la administración de los componentes (ii) y (iii). En una modalidad, el compuesto de ¡midazoquinolina o derivado del mismo se proporciona en, o aproximadamente las 24 horas después de la administración de los componentes (ii) y (¡ii). En una modalidad adicional, en donde el compuesto de imidazoquinolina o derivado del mismo es para administración tópica, en una formulación en crema, la crema se aplica 24 horas después de la administración de los componentes (ii) y (¡ii). En una modalidad alternativa de la presente invención, en donde el compuesto de imidazoquinolina, o derivado del mismo se proporciona en una formulación soluble para administración, por ejemplo, pero no se limita a administración subcutánea, el compuesto de ¡midazoquinolina o derivado del mismo se puede administrar entre 6 y 24 horas después de la administración de los componentes (ii) y (iii) o se puede administrar el siguiente día hábil después de la administración de los componentes (¡i) y (iii). Los componentes (ii) y (iii) pueden empacarse en una cuenta de oro y administrarse dentro de la piel del paciente utilizando administración de fármaco transmitida por partícula, por ejemplo utilizando una "pistola de genes" tal como se describió por ejemplo en la Patente EP0500799. En una modalidad adicional de la presente invención, también se proporcionan secuencias de nucleótidos que codifican interferón-gamma (IFNy). El IFNy puede proporcionarse en una secuencia de nucleótidos por separado a cualesquiera de los componentes (i), (ii), ó (iii). En una modalidad de la presente invención, en la cual el componente (i) es una secuencia de nucleótidos que codifica un agonista TLR, el IFNy puede ser codificado en conjunto dentro de una secuencia de nucleótidos que codifica uno o más de los componentes (i), (ii), ó (iii). Cualesquiera de los componentes restantes pueden ser codificados dentro de las secuencias de nucleótidos separadas, o pueden ser codificadas en conjunto dentro de una sola secuencia de nucleótidos adicional. En una modalidad, el IFNy se codifica dentro de una secuencia de nucleótidos que codifican los componentes (ii) y (iii), o los componentes (ii) y (iii) y el IFNy se codifican dentro de las mismas o moléculas de plásmido separadas, y el componente (i) se proporciona en una composición por separado para la administración concomitante o en secuencias. Por ejemplo los componentes (ii) y (iii) y el IFN? se codifican dentro de las moléculas de plásmidos separados. En una modalidad, el componente (i) puede ser una molécula de imidazoquinolina o derivado del mismo, por ejemplo imiquimod. En una modalidad adicional de la presente invención, también se proporcionan secuencias de nucleótidos que codifican el ligando CD40 (CD40L). El CD40L también se puede proporcionar en una secuencia de nucleótido separada a cualesquiera de los componentes (i), (ii), ó (iii). En una modalidad de la presente invención en donde el componente (i) es una secuencia de nucleótidos que codifica un agonista TLR, se puede codificar en conjunto un CD40L dentro de una secuencia de nucleótidos que codifican uno o más de los componentes (i), (ii), ó (iii). Cualesquiera de los componentes restantes se pueden codificar dentro de secuencias de nucleótidos separadas, o pueden ser codificadas en conjunto dentro de una sola secuencia de nucleótidos adicional. En una modalidad, el CD40L se codifica dentro de una secuencia de nucleótidos que codifica los componentes (ii) y (iii) o los componentes (ii) y (iii) y el CD40L se codifican dentro de las mismas moléculas de plásmido o unas separadas, y el componente (i) se proporciona en una composición por separado para administración concomitante o en secuencias. Por ejemplo los componentes (ii) y (iii) y el CD40L se codifican dentro de moléculas de plásmido separadas. En una modalidad, el componente (i), puede ser una molécula de imidazoquinolina, o un derivado del mismo, por ejemplo imiquimod. Todas las secuencias de nucleótidos referidas en la presente invención pueden ser secuencias de ARN ó ADN. Además, todas las secuencias de nucleótidos pueden estar comprendidas o consistir en ADN de plásmido. En una modalidad en donde los componentes (¡i) y (¡ii) se proporcionan para administración concomitante, se pueden administrar a la misma célula plásmidos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican los componentes (ii) y (iii), o a células circunvecinas. En una modalidad, cuando los plásmidos se suministran a células circunvecinas, la expresión origina la liberación de componentes en el mismo microambiente. En una modalidad, el componente (i) se proporciona en una composición separada para administración concomitante o en secuencias. En una modalidad adicional la administración es concomitante. En una modalidad alternativa, el componente (i) se proporciona en una composición separada para la administración 12 horas ó 24 horas después de la administración de los componentes (¡i) y (iii). La administración del componente (i) puede ser en el mismo sitio que la administración de los componentes (ii) y (iii). Por el término mismo sitio, se entiende que el componente (i) puede ser administrado dentro de los 15 cm del sitio de administración, dentro de 5 cm, dentro de 1 cm, o puede ser en el sitio de inyección de los componentes (ii) y (iii). En una modalidad alternativa de la presente invención, se pueden administrar uno o más componentes en diferentes sitios de inyección. En una modalidad, los componentes se administran todos en sitios en donde todos drenan en el mismo nodo o nodos linfáticos. En una modalidad de la presente invención, la secuencia de nucleótidos que codifica (iii) codifica una proteína MUC-1 o derivado de la misma que tiene la capacidad de elevar una respuesta inmune in vivo, teniendo la capacidad la respuesta inmune de reconocer una célula de tumor o un tumor que expresa MUC-1. En una modalidad adicional de la presente invención, la secuencia de nucleótidos que codifica (iii), codifica una proteína P501S derivado que tiene la capacidad de elevar una respuesta inmune in vivo, teniendo la capacidad la respuesta inmune de reconocer una célula de tumor o tumor que expresa P501S. La presente invención prueba además una composición de vacuna que comprende una composición o composiciones inmunógenoicas de acuerdo con la presente invención, y vehículo(s), diluyente(s) o excipiente(s) farmacéuticamente aceptables. La presente invención proporciona además un proceso para la fabricación de una composición inmunógenoica que comprende mezclar los componentes adyuvantes (i) y (¡i) de la presente invención con un componente de inmunógeno (iii) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido o proteína antigénica. En una modalidad del proceso comprende mezclar la molécula de nucleótidos que codifica el componente adyuvante (ii) con el nucleótido que codifica el componente de inmunógeno (iii), y proporcionar el componente adyuvante (i) o una secuencia de nucleótidos que codifica el componente adyuvante (i) en una composición por separado para administración concomitante o en secuencias. Como alternativa, el proceso que comprende codificar en conjunto la molécula de nucleótidos que codifica el componente adyuvante (¡i) con el nucleótido que codifica el componente de inmunógeno (iii) para formar una sola molécula de polinucleótidos, y proporcionar el componente adyuvante (i) o una secuencia de nucleótidos que codifica el componente adyuvante (i) en una composición separada para la administración concomitante o en secuencias. En una modalidad alternativa, se proporciona un proceso en el cual las secuencias de nucleótidos que codifican los componentes (i), (ii), y (iii) están codificadas dentro de moléculas de polinucleótidos separadas para la administración concomitante o en secuencias. En una modalidad aún adicional, se proporciona un proceso en el cual las secuencias de nucleótidos que codifican cualesquiera de los dos componentes (i), (¡i), y (iii), se codifican en conjunto para formar una sola molécula de polinucleótido, y la secuencia de nucleótido restante se codifica dentro de una secuencia de polinucleótidos adicional para administración concomitante o en secuencias. Como alternativa las secuencias de nucleótidos que codifican los componentes (i), (ii), y (iii) se codifican en conjunto para formar una sola molécula de polinucleótidos. En una modalidad, la secuencia de nucleótidos que se utiliza en el proceso es ADN, y la secuencia de nucleótidos que se puede utilizar en el proceso se codifica dentro del ADN de plásmido. En una modalidad alternativa, se proporciona un proceso en el cual las moléculas de nucleótidos que codifican los componentes (ii) y (¡ii) están incorporadas dentro de un plásmido, y el componente 'adyuvante (i) se proporciona en una composición por separado para la administración concomitante o en secuencias. En una modalidad adicional, el proceso proporciona además incorporar los componentes dentro de excipientes, diluyentes o vehículos farmacéuticamente aceptables. La presente invención proporciona además una composición o composiciones farmacéuticas que comprenden componentes adyuvantes (i) y (ii) de acuerdo con la presente invención; un componente de inmunógeno (iii) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido o proteína antigénica; y uno o más excipientes, diluyentes o vehículos farmacéuticamente aceptables. Como alternativa, la presente invención proporciona una composición o composiciones farmacéuticas que comprenden una composición o composiciones inmunógenoicas tal como se describe en la presente invención, y excipientes diluyentes o vehículos farmacéuticamente aceptables. La presente invención proporciona además un equipo que comprende una composición farmacéutica que comprende el componente de adyuvante (ii); el componente de inmunógeno (iii) y un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable; y una composición farmacéutica adicional que comprende un componente adyuvante, y un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable, en el cual: el componente adyuvante (i) comprende un agonista TLR o un nucleótido que codifica un agonista TLR; el componente adyuvante (ii) comprende un nucleótido que codifica FM-CSF; y el componente de inmunógeno (iii) comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido o proteína antigénica. En una modalidad, al menos un vehículo es una cuenta de oro y al menos una composición farmacéutica está adaptada para ser suministrada mediante administración de fármaco transmitida por partículas. En una modalidad adicional el vehículo de los componentes (¡i) y (iii) es una cuenta de oro y el componente adyuvante (i) se formula para administración concomitante o en secuencias. En un aspecto de la presente invención, se proporciona un método que comprende empacar las secuencias de nucleótidos que codifican uno o más de los componentes (ii) y (iii) en cuentas de oro. En una modalidad de la presente invención, los componentes se empacan en poblaciones separadas de cuentas de oro las cuales posteriormente se combinan antes de la administración. En una modalidad alternativa, los componentes se empacan en la misma población de las cuentas de oro. En una modalidad adicional, los componentes (i) se empacan en cuentas de oro, y el componente (i) se proporciona en una composición separada para la administración concomitante o en secuencias. La presente invención proporciona además un método para tratar un paciente que padece de, o que es susceptible a un tumor, a través de la administración de una cantidad segura y efectiva de una composición de vacuna o una composición farmacéutica inmunógenoica tal como se describe en la presente invención. En una modalidad del tumor que será tratado es un tumor que expresa MUC-1 ó P501S. El tumor que será tratado puede ser carcinoma de seno; carcinoma de pulmón, incluyendo carcinoma de pulmón de célula no pequeña; o carcinomas de próstata, gástricos o gastrointestinales. La presente invención proporciona además un método para incrementar una respuesta inmune en el mamífero a un antígeno, en donde el método comprende la administración al mamífero de los siguientes componentes: (i) un agonista TLR, o un nucleótido que codifica un agonista TLR; (ii) un nucleótido que codifica GM-CSF; (iii) un componente de inmunógeno que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido o proteína antigénica. En una modalidad, el método comprende la administración concomitante de cualesquiera de los dos componentes (i), (¡i), y (iii), y la administración en secuencias del componente restante. Como alternativa, el método comprende la administración en secuencias de los componentes (i), (ii), y (¡ii). En una modalidad adicional, los componentes para administración concomitante se formulan en composiciones separadas. En un método de la presente invención, los componentes (i¡), y (iii), se administran en forma concomitante, y el componente (i) se proporciona en una composición separada para administración concomitante o en secuencias. En una modalidad, el componente (i) es una imidazoquinolina o derivado del mismo. El componente (i) puede ser imiquimod, y puede ser proporcionado en la forma de la crema AldaraMR (3M) para administración tópica en, o cerca del sitio de administración de los componentes (ii) y (iii).

La presente invención proporciona además una composición inmunógenoica que comprende los siguientes componentes, en la fabricación de un medicamento para utilizarse en el tratamiento o profilaxis de tumores que expresan MUC-1 ó P501S: (i) un agonista TLR, o un nucleótido que codifica un agonista TLR; (¡i) un nucleótido que codifica GM-CSF; y (iii) un componente de inmunógeno que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido o proteína antigénica MUC-1 ó P501. La presente invención proporciona además un método para elevar una respuesta inmune en un mamífero contra un estado de enfermedad, en donde el método comprende administrar al mamífero dentro de un vector adecuado, una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido antigénico asociado con el estado de enfermedad; administrar además al mamífero dentro de un vector adecuado, una secuencia de nucleótidos que codifica GM-CSF; y administrar además al mamífero una imidazoquinolina o derivado del mismo para elevar la respuesta inmune. La presente invención proporciona además un método para incrementar la respuesta inmune de un mamífero a un inmunógeno, en donde el método comprende el paso de administrar al mamífero dentro de un vector adecuado, una secuencia de nucleótidos que codifica el inmunógeno en una cantidad efectiva para estimular una respuesta inmune y una secuencia de nucleótidos que codifica GM-CSF; y administrar además al mamífero una imidazoquinolina o derivado del mismo en una cantidad efectiva para incrementar la respuesta inmune. La presente invención proporciona además un método de administración de cualesquiera de las composiciones tal como aquí se describen. La presente invención proporciona además el uso de una imidazoquinolina o derivado del mismo y GM-CSF en la fabricación de un medicamento para aumentar las respuestas inmune iniciadas por un péptido o proteína antigénica, siendo expresado el péptido o proteína antigénica como resultado de la administración a un mamífero de una secuencia de nucleótidos que codifica el péptido. La presente invención proporciona además el uso de los siguientes componentes del (i) al (iii) en la fabricación de un medicamento para aumentar la respuesta inmune a un antígeno codificado por una secuencia de nucleótidos: (i) un agonista TLR o un nucleótido que codifica un agonista TLR; (ii) un nucleótido que codifica GM-CSF; y (iii) un componente de inmunógeno que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido o proteína antigénica. La presente invención proporciona además el uso de los siguientes componentes del (i) al (iii) en la fabricación de dos o más medicamentos para administración concomitante o en secuencias a un mamífero para el aumento de una respuesta inmune a un antígeno codificado por una secuencia de nucleótidos: (i) un agonista TLR o un nucleótido que codifica un agonista TLR; (¡i) un nucleótido que codifica GM-CSF; y (iii) un componente de inmunógeno que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido o proteína antigénica. La presente invención proporciona además el uso de los siguientes componentes del (i) al (iii) en la fabricación de medicamentos para la administración concomitante o en secuencias a un mamífero para el aumento de una respuesta inmune a un antígeno codificado por una secuencia de nucleótidos, en donde cada componente se formula en un medicamento separado: (i) un agonista TLR o un nucleótido que codifica un agonista TLR; (ii) un nucleótido que codifica GM-CSF; y (iii) un componente de inmunógeno que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido o proteína antigénica. La composición o composiciones adyuvantes aquí descritas pueden utilizarse en la etapa de "principal" y/o "refuerzo", en una estrategia de "únicamente principal" o un método de "principal-refuerzo". El método de "principal-refuerzo" utilizado puede comprender dos vacunas de ácido nucleico, o puede comprender dos distintas preparaciones de vacuna (un ácido nucleico, una proteína). Un ejemplo del método de "principal-refuerzo" se describe en la Publicación de Barnett y Asociados, Vaccine 15:869-873 (1997), en donde se preparan dos preparaciones de vacuna distintas (un ADN, una proteína) y se administran por separado, en diferentes momentos, y en un orden específico. En una modalidad, las composiciones como se describen anteriormente se utilizan en la etapa de "principal" de una estrategia de vacunación. Descripción Detallada del Invento A lo largo de la presente especificación y de las reivindicaciones adjuntas, a menos que el contexto lo requiera de otra forma, las palabras "comprende" e "incluye" o las variaciones tales como "que comprende", "comprendiendo", "incluyendo", "que incluye", etc., serán construidas en forma exclusiva, esto es, el uso de estas palabras implicará la posible inclusión de entidades completas o elementos no mencionados en forma específica. Además, los términos "que comprende", "comprende" y "comprendiendo" de la presente invención, pretenden ser opcionalmente sustituibles por los términos "que consisten en", "consiste en" y "consistente en", respectivamente y en cada caso. Además, a lo largo de la presente invención y en las reivindicaciones adjuntas, excepto en relación con los datos experimentales, los ejemplos y las figuras, el término "GM-CSF" es substituido opcionalmente por el término "IFNy" y viceversa en cada caso. En una modalidad de la presente invención, cuando el componente (ii) es una secuencia de nucleótido que codifica IFNy, el componente (i) puede se un agonista de TLR de TLR-2, 4, 7 u 8. Tal como se describió anteriormente, la presente invención se refiere a composiciones inmunógenoicas, composiciones de vacuna, métodos de vacunación y a mejoras de métodos de vacunación que comprenden la introducción en un mamífero de una secuencia de nucleótidos que codifica un inmunógeno el cual es una proteína o péptido antigénico, de modo que la proteína o péptido estarán expresados dentro del cuerpo del mamífero para inducir de esta forma una respuesta inmune dentro del mamífero contra la proteína o péptido antigénico. Dichos métodos de vacunación son bien conocidos y se describen completamente en la publicación de Donnelly y asociados y Erti y asociados tal como se refirió anteriormente. Tal como se utilizó anteriormente, el término-composición inmunógenoica se refiere a una combinación de (i) un agonista TLR, una secuencia de nucleótidos que codifica un agonista TLR; (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica GM- CSF; y (iii) un componente de inmunógeno que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido de proteína antigénica. en donde los componentes (i) y (ii) actúan en cooperación funcional para aumentar las respuestas inmune en un mamífero al componente de inmunógeno (iii). La combinación, está por ejemplo, en la forma de una mezcla en adiciones de los tres componentes en una sola formulación farmacéuticamente aceptable o en la forma de componentes separados, individuales, por ejemplo en la forma de un equipo que comprende componentes adyuvantes (ii) y (iii) y el componente de inmunógeno (iii), en donde los tres componentes son para la administración separada, en secuencias o simultánea. En una modalidad, la administración de los tres componentes es concomitante. En una modalidad, adicional de la presente invención, los componentes (ii) y (iii) se administran en forma concomitante, y el componente (i) se administra por separado, antes de la administración de los componentes (ii) y (iii). En una modalidad adicional de la presente invención, los componentes (ii) y (iii) se administran en forma concomitante, y el componente (i) se administra por separado, después de la administración de los componentes (ii) y (iii). La ¡midazoquinolina o derivado del mismo tal como se refiere a lo largo de la presente especificación y las reivindicaciones, puede ser un compuesto definido por cualesquiera de las Fórmulas I-VI que se encuentran más adelante: en donde R11 es seleccionado del grupo que consiste en alquilo, hidroxialquilo, aciloxialquilo, bencilo, (fenil)etilo y fenilo, de cadena recta o ramificada, siendo el bencilo, (fenil)etilo o sustituyente de fenilo opcionalmente sustituidos en el anillo de benceno por una o dos porciones seleccionadas independientemente del grupo que consiste en alquilo de uno hasta cuatro átomos de carbono, alcoxi de uno hasta cuatro átomos de carbono y halógeno, siempre que el anillo de benceno sea sustituido por dos de las porciones, entonces las porciones juntas contienen no más de 6 átomos de carbono; R2? es seleccionado del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo de uno a ocho átomos de carbono, bencilo, (fenilo)etilo y fenilo, siendo el sustituyente de bencilo, (fenil )eti lo o fenilo opcionalmente sustituido en el anillo de benceno por una o dos porciones seleccionadas independientemente del grupo que consiste en alquilo de uno hasta cuatro átomos de carbono, alcoxi de uno hasta cuatro átomos de carbono y halógeno, siempre que el anillo de benceno sea sustituido por dos de las porciones, entonces las porciones juntas contienen no más de 6 átomos de carbono; y cada R1 es independientemente seleccionado del grupo que consiste en hidrógeno, alcoxi de uno a cuatro átomos de carbono, halógeno y alquilo de uno a cuatro átomos de carbono, y n es un entero de 0 a 2, siempre que n sea 2, entonces los grupos R-n juntos contienen no más de 6 átomos de carbono; en donde R-?2 es seleccionado del grupo que consiste en alquenilo de cadena recta o ramificada que contiene de 2 a 10 átomos de carbono y alquenilo de cadena recto o ramificada sustituido que contiene de 2 hasta 10 átomos de carbono, en donde el sustituyente es seleccionado del grupo que consiste en alquilo de cadena recta o ramificada que contiene de 1 a 4 átomos de carbono, y cicloalquilo que contiene de 3 hasta aproximadamente 6 átomos de carbono; y cicloalquilo que contiene de 3 hasta aproximadamente 6 átomos de carbono sustituido por el alquilo de cadena recta o ramificada que contiene de 1 hasta aproximadamente 4 átomos de carbono; y R22 es seleccionado del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo de cadena recta o ramificada que contiene de uno hasta aproximadamente ocho átomos de carbono, bencilo (fenil)etilo y fenilo, siendo el sustituyente de bencilo (fenil)etilo o fenilo opcionalmente sustituido en el anillo de benceno por uno o dos porciones seleccionadas independientemente del grupo que consiste en alquilo de cadena recta o ramificada que contiene de uno hasta aproximadamente cuatro átomos de carbono, alcoxi de cadena recta que contiene de uno hasta aproximadamente cuatro átomos de carbono, y halógeno, siempre y cuando el anillo de benceno sea sustituido por dos de dichas porciones, entonces las porciones juntas contiene no más de seis átomos de carbono; y cada R2 es seleccionada independientemente del grupo que consiste en alcoxi de" cadena recta o ramificada que contiene de uno hasta aproximadamente cuatro átomos de carbono, halógeno, y alquilo de cadena recta o ramificada que contiene de uno hasta aproximadamente cuatro átomos de carbono, y n es un entero de cero a 2, siempre y cuando n sea 2, entonces los grupos R2 juntos contienen uno o más de 6 átomos de carbono; (III) en donde R23 es seleccionado del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo de cadena recta o ramificada que contiene de uno hasta aproximadamente ocho átomos de carbono, bencilo, (fenil)etilo y fenilo, siendo el sustituyente de bencilo, (fenil)etilo o fenilo opcionalmente sustituido en el anillo de benceno por una o dos porciones seleccionadas independientemente del grupo que consiste en alquilo de cadena recta o ramificada de uno hasta aproximadamente cuatro átomos de carbono, alcoxi de cadena recta o ramificada de uno hasta aproximadamente cuatro átomos de carbono y halógeno siempre y cuando el anillo de benceno sea sustituido por dos de dichas porciones, entonces las porciones juntas no contienen más de 6 átomos de carbono; y cada R5 es seleccionada independientemente del grupo que consiste en alcoxi de cadena recta o ramificada de uno hasta aproximadamente cuatro átomos de carbono, halógeno y 30 alquilos de cadena recta o ramificada desde uno hasta aproximadamente cuatro átomos de carbono, y n es un entero de cero a 2, siempre y cuando n sea 2, entonces los grupos R3 juntos no contienen más de 6 átomos de carbono; R14 es -CHRARB ßn donde RB es hidrógeno o un enlace de carbono-carbono, siempre y cuando RB sea hidrógeno, RA sea alcoxi de uno hasta aproximadamente cuatro átomos de carbono, hidroxialcoxi de uno hasta aproximadamente cuatro átomos de carbono, 1 -alq u ini lo de dos hasta aproximadamente diez átomos de carbono, tetrahidropiranilo, alcoxialquilo en donde la porción alcoxi contiene de uno hasta aproximadamente cuatro átomos de carbono y la porción de alquilo contiene de uno hasta cuatro átomos de carbono, 2-, 3-, ó 4-piridilo, y siempre y cuando RB sea un enlace de carbono a carbono, RB y RA juntos forman un grupo tetrahidrofuranilo opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en hidroxi e hidroxialquilo de uno hasta aproximadamente cuatro átomos de carbono; R24 es seleccionado del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo de uno hasta aproximadamente cuatro átomos de carbono, fenilo y fenilo sustituido en donde el sustituyente es seleccionado del grupo que consiste en alquilo de uno hasta aproximadamente cuatro átomos de carbono, alcoxi de uno hasta aproximadamente cuatro átomos de carbono, y halógeno; y R4 es seleccionado del grupo que consiste en hidrógeno, alcoxi de cadena recta o ramificada que contiene de uno hasta aproximadamente cuatro átomos de carbono, halógeno y alquilo de cadena recta o ramificada que contiene de uno hasta aproximadamente cuatro átomos de carbono; (V) en donde R-15 es seleccionado del grupo que consiste en: hidrógeno; alquilo de cadena recta o ramificada que contiene de uno hasta aproximadamente diez átomos de carbono y alquilo de cadena recta o ramificada sustituido que contiene de uno hasta aproximadamente diez átomos de carbono, en donde el sustituyente es seleccionado del grupo que consiste en cicloalquilo que contiene de tres hasta aproximadamente seis átomos de carbono y cicloalquilo que contiene de tres hasta aproximadamente seis átomos de carbono sustituidos por alquilo de cadena recta o ramificada que contiene de uno hasta aproximadamente cuatro átomos de carbono; alquenilo de cadena recta o ramificada que contiene de dos hasta aproximadamente diez átomos de carbono y alquenilo de cadena recta o ramificada que contiene de dos hasta aproximadamente diez átomos de carbono, en donde el sustituyente es seleccionado del grupo que consiste en cicloalquilo que contiene de tres hasta aproximadamente seis átomos de carbono y cicloalquilo que contiene de tres hasta aproximadamente seis átomos de carbono sustituido por alquilo de cadena recta o ramificada que contiene de uno hasta aproximadamente cuatro átomos de carbono; hidroxialquilo de uno hasta aproximadamente seis átomos de carbono; alcoxialquilo en donde la porción de alcoxi contiene de uno hasta aproximadamente seis átomos de carbono; aciloxialquilo en donde la porción de aciloxi es alcanoiloxi de dos hasta aproximadamente cuatro átomos de carbono o benzoiloxi, y la porción alquilo contiene de uno hasta aproximadamente seis átomos de carbono; bencilo; (fenil)etilo; y fenilo; siendo el sustituyente bencilo, (fenil)etilo o fenilo opcionalmente sustituido en el anillo de benceno por una de las porciones seleccionadas independientemente del grupo que consiste en alquilo de uno hasta aproximadamente cuatro átomos de carbono, alcoxi de uno hasta aproximadamente cuatro átomos de carbono, y halógeno, siempre y cuando el anillo de benceno sea sustituido por dos las porciones, entonces las porciones juntas contienen no más de seis átomos de carbono; R25 es en donde Rx y R? son seleccionadas independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo de uno hasta aproximadamente cuatro átomos de carbono, fenilo y fenilo sustituido, en donde el sustituyente es seleccionado del grupo que consiste en alquilo de uno hasta aproximadamente cuatro átomos de carbono, alcoxi de uno hasta aproximadamente cuatro átomos de carbono, y halógeno; X es seleccionado del grupo que consiste en alcoxi que contiene de uno hasta aproximadamente cuatro átomos de carbono, alcoxialquilo en donde la porción de alcoxi contiene de uno hasta aproximadamente cuatro átomos de carbono y en donde la porción alquilo contiene de uno hasta aproximadamente cuatro átomos de carbono, haloalquilo de uno hasta aproximadamente cuatro átomos de carbono, alquilamido en donde el grupo alquilo contiene de uno hasta aproximadamente cuatro átomos de carbono, amino, amino sustituido en donde el sustituyente es alquilo o hidroxialquilo de uno hasta aproximadamente cuatro átomos de carbono, azido, alquiltio de uno a hasta aproximadamente cuatro átomos de carbono; y R5 es seleccionado del grupo que consiste en hidrógeno, alcoxi de cadena recta o ramificada que contiene de uno hasta aproximadamente cuatro átomos de carbono, halógeno, y alquilo de cadena recta o ramificada que contiene de uno hasta aproximadamente cuatro átomos de carbono; o una sal farmacéuticamente aceptable o cualesquiera de los anteriores. Los grupos alquilo pueden ser C -C4 alquilo, por ejemplo, metilo, etilo, propilo, 2-metilpropilo y butilo. Los grupos alquilo pueden ser metilo, etilo y 2metil-propilo. Los grupos alcoxi pueden ser metoxi, etoxi y etoximetilo.

Los compuestos mencionados anteriormente y los métodos para su preparación se describen en la Publicación de Solicitud de Patente PCT NÚMERO WO 94/17043. En ejemplos en donde n puede ser cero, uno o dos, n puede ser cero o uno. Los sustituyentes R1-R5 anteriores, son designados generalmente como "sustituyentes benzo" en la presente invención. El sustituyente benzo puede ser hidrógeno. Los sustituyentes R-M-R15 anteriores son designados generalmente "sustituyentes-1" en la presente invención. El sustituyente-1 puede ser 2-metilpropilo o 2-hidroxi-2-metilpropilo. Los sustituyentes R2?,-R25 anteriores, son designados generalmente como "sustituyentes-2" en la presente invención. Los sustituyentes-2 pueden ser hidrógeno, alquilo de uno hasta aproximadamente seis átomos de carbono, alcoxialquilo en donde la porción alcoxi contiene de uno hasta aproximadamente cuatro átomos de carbono y la porción alquilo contiene de uno hasta aproximadamente cuatro átomos de carbono. Los sustituyentes-2 pueden ser hidrógeno, metilo o etoximetilo. La 1 H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina puede ser un compuesto definido por la fórmula VI que se encuentra a continuación: en donde Rt es seleccionado del grupo que consiste en hidrógeno, alcoxi de cadena recta o ramificada que contiene de uno hasta aproximadamente cuatro átomos de carbono, halógeno, y alquilo de cadena recta o ramificada que contiene de uno hasta aproximadamente cuatro átomos de carbono; Ru es 2-metilpropilo o 2-hidroxi-2-metilpropilo; y Rv es hidrógeno, alquilo de uno hasta aproximadamente seis átomos de carbono, o alcoxialquilo en donde la porción alcoxi contiene de uno hasta aproximadamente cuatro átomos de carbono y la porción alquilo contiene de uno hasta aproximadamente cuatro átomos de carbono; o sales fisiológicamente aceptables de cualesquiera de los anteriores, cuando sea adecuado. En la fórmula VI, Rt puede ser hidrógeno, Ru puede ser 2-metilpropilo o 2-hidroxi-2-metilpropilo, y Rv puede ser hidrógeno, metilo o etoximetilo. Las 1 H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-aminas pueden incluir lo siguiente: 1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina (un compuesto de la fórmula VI en donde R es hidrógeno, Ru es 2-metilpropilo y Rv es hidrógeno); 1-(2-hidroxi-2-metilpropil)-2-metil-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina (un compuesto de la fórmula VI en donde Rt es hidrógeno, Ru es 2-hidroxi-2-metilpropilo, y Rv es metilo; 1-(2-hidroxi-2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina (un compuesto de la fórmula VI en donde Rt es hidrógeno, Ru es 2-hidroxi-2-metilpropilo, y Rv es hidrógeno) 1-(2-hidroxi-2-metilpropil)-2-etoximetil-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina (un compuesto de la fórmula VI en donde Rt es hidrógeno, Ru es 2-hidroxi-2-metilpropilo, y Rv es etoximetilo); o sales fisiológicamente aceptables de los mismos. Estados de Enfermedad Es posible para los métodos de vacunación y composiciones de acuerdo con la presente solicitud, que sean adaptados para protección o tratamiento de mamíferos contra una variedad de estados de enfermedad, tales como, por ejemplo, infecciones virales, bacterianas o de parásitos, cáncer, alergia y padecimientos autoinmunes. Algunos ejemplos específicos de padecimientos o estados de enfermedad contra los cuales se puede dar protección o que pueden ser tratados utilizando los métodos o composiciones de la presente invención, son como tal como los que se indican a continuación: Infecciones Virales. Víruses de hepatitis A, B, C, D & E, VIH, víruses de herpes 1, 2, 6 & 7, -citomegalovirus, varicela zoster, virus del papiloma, virus de Epstein Barr, víruses de influenza, víruses de para-influenza, adenovíruses, víruses "coxsa ie", víruses picorna, rotavíruses, víruses sincitiales respiratorios, víruses de aves de corral, rinovíruses, virus de rubéola, papovirus, virus de parotiditis, víruses de sarampión. Infecciones Bacterianas Micobacterias que originan TB y lepra, pneumococcus, bacilos gran negativos aeróbicos, micoplasma, infecciones estafilococales, infecciones estreptococales, salmonela, clamidiae. Parasíticas. Malaria, leishmaniasis, tripanosomiasis, toxoplasmosis, esquistosomiasis, filariasis. Cáncer. Cáncer de seno, cáncer de colón, cáncer rectal, cáncer de cabeza y cuellos, cáncer renal, melanoma maligno, cáncer de laringe, cáncer de ovario, cáncer cervical, cáncer de próstata. Alergias. Rinitis por acáridos de polvo doméstico, polen y otros alergénicos ambientales. Enfermedad Autoinmune. Lupus eritematoso sistémico. En una modalidad, los métodos o composiciones de la presente invención, se utilizan para proteger contra o tratar los padecimientos virales de Hepatitis B, Hepatitis C, virus del papiloma Humano, virus de inmunodeficiencia Humano, o virus de Herpes simple; la enfermedad bacterial TB; cánceres de seno, colón, ovario, cuellos de útero y próstata; o las enfermedades autoinmunes de asma, artritis reumatoide y Alzheimer. Se reconocerá que estos estados de enfermedad . específicos han sido referidos a manera de ejemplo únicamente y no están proyectados para limitar el alcance de la presente invención. Antígeno o Inmunógeno. Las secuencias de nucleótido del componente (iii) referido en la presente solicitud, que codifica en el antígeno o inmunógeno que será expresado dentro de un sistema de mamífero, con el objeto de inducir una respuesta antigénica, pueden codificar una proteína completa, o meramente una secuencia de péptidos más corta, la cual tiene la capacidad de iniciar una respuesta antigénica. A Ice largo de la presente especificación y las reivindicaciones adjuntas, la frase "péptido antigénico" o "inmunógeno" pretende comprender todas las secuencias de péptidos o proteínas que tienen la capacidad de inducir una respuesta inmune dentro del animal respectivo. Sin embargo, en una modalidad, la secuencia de nucleótidos codificará una proteína completa la cual está asociada con el estado de enfermedad, como la expresión de las proteínas completas dentro del sistema animal que más probablemente mimetizan la presentación de antígenos naturales, y por lo tanto generan una respuesta inmune completa. Algunos ejemplos sin limitación de péptidos antigénicos conocidos en relación con los estados de enfermedad específicos incluyen los siguientes: Antígenos que tienen la capacidad de provocar una respuesta inmune contra patógenos humanos en donde el antígeno o composición antigénica se deriva de VIH-1, (ti como tat, nef, gp120 o gp160, pg40, p24, gag, env, vif, vpr, vpu, rev), víruses de herpes humano, tal como gH, gL gM gB gC gK gE ó gD o derivados de los mismos o proteína Temprana Inmediata tal como ICP27, 1CP47, IC P 4, ICP36 procedente de HSV1 ó HSV2, citomegalovíruses, especialmente Humano, (tal como gB o derivados de los mismos), virus de Epstein Barr (tal como gp350 o derivados de los mismos), virus de Varicella Zoster (tal como gpl, II, III, e IE63), o virus de hepatitis tales como virus de hepatitis B (por ejemplo antígeno se superficie de Hepatitis B o antígeno de núcleo de hepatitis o pol), antígeno de virus de hepatitis C o antígeno de hepatitis E, o de otros patógenos virales tales como paramixovíruses: virus Sincitial Respiratorio (tal como proteínas F y G o derivados de las mismas), o antígenos de virus de parainfluenza, virus de viruela, virus de parotiditis, víruses de papiloma humano (por ejemplo, HPV6, 11, 16, 18, eg L1, L2, E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7), favivíruses (por ejemplo, Virus de Fiebre Amarilla, Virus de Dengue, virus de encefalitis de transmisión por garrapatas, Virus de Encefalitis Japonés) o células de virus de Influenza, tal como HA, NP, NA, ó proteínas M, o combinaciones de los mismos), o antígenos derivados de patógenos bacterianos tales como Neisseria spp, incluyendo N. Gonorrea y N. Meningitidis, por ejemplo de enlace de transferina, proteínas de enlace de lactoferrina, PiLC, adhesinas); S. Pyrogenes (por ejemplo proteínas M o fragmentos de los mismos, proteasa C5A, S. Agalactiae, S. Mutans; H. Ducreyi; Moraxella spp, incluyendo M catarrhalis, también conocidos como Branhamella catarrhalis (por ejemplo adhesinas o invasinas de peso molecular alto y bajo); Bordetella spp, Incluyendo B. pertussis (por ejemplo, pertactina, toxina de pertussis o derivados de la misma, hemaglutinina filamentosa, ciclasa de adenilato, fimbrias), B. parapertussis y B. bronchiseptica; Mycobacterium spp., incluyendo M. tuberculosis (por ejemplo, ESAT6, Antigen 85a, -B ó -C, MPT 44, MPT59, MPT45, HSP10, HSP65, HSP70, HSP 75, HSP90, PPD, 19kDa [Rv3763], PPD 38kDa [Rv0934], M. bovis, M. leprae, M. avium, M. paratuberculosis, M. smegmatis; Legionella spp, incluyendo L. Pneumophila; Escherichia spp, incluyendo E. coli enterotóxico (por ejemplo, factores de colonización, toxina labile con calor o derivados del mismo, toxina o derivados estables con calor del mismo), E. coli enterohemorrágico, E. coli enteropatogénico (por ejemplo toxina tipo toxina shiga o derivados del mismo); Vibrio spp, incluyendo V. cholera (por ejemplo toxina de cólera o derivados de los mismos); Shigella spp, incluyendo S. Sonnei, S. Dysenteriae, S.

Flexnerii; Yersinia .spp, in cluyendo Y. enterocolitica (por . ejemplo una proteína Yop), Y. pestis, Y. pseudotuberculosis; Campylobacter spp, incluyendo C. jejuni (por ejemplo toxinas, adhesinas e invasinas) y C. coli; Salmonella spp, incluyendo S. Typhi, S. Paratyphi, S.

Choleraesuis, S. Enteritidis; Listeria spp., incluyendo L.

Monocitogenes; Helicobacter spp, incluyendo H. Pylori (por ejemplo toxina de vaculación de ureasa, catalasa); Pseudomonas spp, incluyendo P. Aeruginosa; ' Staphylococcus spp., incluyendo S. Aureus, S. Epidermidis; Enterococcus spp, incluyendo E.. faecalis, E. faecium; Clostridium spp., incluyendo C. tetani (por ejemplo toxina de tetanus y derivados de la misma), C. botulinum (por ejemplo toxina de botulinio y derivados de la misma), C. difficile (por ejemplo toxinas de clostridium A ó B y derivados de los mismos); Bacillus spp., incluyendo B. anthracis (por ejemplo toxina de botulinio y derivados de la misma); Corynebacterium spp., incluyendo C. diphtheriae (por ejemplo toxina de difteria y derivados de la misma); Borrelia spp., incluyendo B. burgdorferi (por ejemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB), ß. garinii (por ejemplo, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. afzelii (por ejemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. andersonii (por ejemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB); B hermxii; Ehriichia spp., incluyendo E. equi y el agente de Ehrlichiosis Granulocítico Humano; Rickettsia spp, incluyendo R. Rickettsii; Chlamydia spp., incluyendo C. trachomatis (por ejemplo MOMP, proteínas de enlace de heparina), C. pneumoniae (por ejemplo MOMP, proteínas de enlace de heparina), C. psittaci; Leptospira spp., incluyendo L. Interrogans; Treponema spp., incluyendo T. Pallidum (por ejemplo proteínas de membrana externa raras), T. Dent icol a, T. Hyodysenteriae; o derivados de parásitos tales como Plasmodium spp., incluyendo P. falciparum; Toxoplasma spp., incluyendo T. Gondii (por ejemplo SAG2, SAG3, Tg34); Entamoeba spp., incluyendo E. histolítica; Babesia spp., incluyendo B. microti; Tripanosoma spp., incluyendo T. Cruzi; Giardia spp., incluyendo G. lamblia; leishmania spp., incluyendo L. Major; Pneumocystis spp., incluyendo P. carinii; Tricomonas spp., incluyendo T. Vaginalis; Schisostoma spp., incluyendo S. Mansoni oderivados de levaduras tales como Candida spp., incluyendo C. albicans; Cryptococcus spp., incluyendo C. neoformans. Otros antígenos específicos para tuberculosis M. incluyen por ejemplo Rv2557, Rv2558, RPFs; Rv0837c, Rv1884c, Rv2389c, Rv2450, Rv1009, aceA (Rv0467), PstS1, (Rv0932), SodA (Rv3846), Rv2031c 16kDal., Tb Ra12, Tb H9, Tb Ra35, Tb38-1, Erd 14, DPV, MTI, MSL, mTTC2, y hTCC1 (WO 99/51748). Las proteínas para tuberculosis M. también incluyen proteínas de fusión y variantes de las mismas en donde al menos dos o tres polipéptidos de tuberculosis M. se fusionan en una proteína más grande. Las fusiones incluyen Ral 2-TbH9-Ra35, Erd 14-DPV-MTI , DPV-MTI-MSL, Erd 14-DPV-MTI-MSL-Mtcc2, Erd 14-DPV-MTI- MSL, DPV-MTI-MSL-mTCC2, TbH9-DPV-MTI (WO 99/51748).

En una modalidad, los antígenos para Chlamydia incluyen por ejemplo la Proteína de Alto Peso Molecular (HWMP) WO 99/17741), ORF3 (EP 366 412), y proteínas de membrana putativa (Pmps). Otros antígenos de Chlamydia de la formulación de vacuna pueden ser seleccionados del grupo que se describe en la publicación WO 99/28475. En una modalidad, las ' vacunas bacterianas comprenden antígenos derivados de Streptococcus spp, incluyendo S. Pneumoniae (PsaA, PspA, estreptolisina, proteínas de enlace de colina) y el antígeno de proteína Pneumolysina (Biochem Biophys Acta, 1989, 67, 1007; Rubins y asociados., Microbial Patogénesis, 25, 337-342), y derivados destoxificados mutantes del mismo (WO 90/06951; WO 99/03884). Otras vacunas bacterianas comprenden antígenos derivados de Haemophilus spp., incluyendo H. Influenzae tipo B (por ejemplo PRP y conjugados de los mismos), non typeable H. Influenzae, por ejemplo OMP26, adhesinas de alto peso molecular, P5, P6, proteína D y lipoproteína D, y fimbrina y péptidos derivados de fimbrina (US 5,843,464) o variantes de copias múltiples o proteínas de fusión de los mismos. Los antígenos que pueden ser utilizados en la presente invención, pueden comprender además antígenos derivados de parásitos que originan Malaria. Por ejemplo, los antígenos de Plasmodia falciparum incluyen RTS.S y TRAP. RTS es una proteína híbrida que comprende sustancialmente toda la parte de terminal-C de la proteína circumsporozoita (CS) de P. falciparum enlazada a través de cuatro aminoácidos de la porción preS2 del antígeno de superficie de Hepatitis B a la superficie del antígeno (S) del virus de hepatitis B. Su estructura total se describe en la Solicitud de Patente Internacional No. PCT/EP92/02591 , publicada con el número WO 93/10152 que reclama prioridad de la Solicitud de Patente UK No. 9124390.7. Cuando se expresa en RTS de levadura, se produce como una partícula de lipoproteína, y cuando se expresa en conjunto con el antígeno S de HBV se produce una partícula mezclada conocida como RTS.S. Los antígenos TRAP se describen en la Solicitud de Patente Internacional No. PCT/GB89/00895, publicada con el número WO 90/01496. Una modalidad de la presente invención es una vacuna de Malaria en donde la preparación antigénica comprende una preparación de los antígenos RTS, S y TRAP. Otros antígenos de plasmodia que son igualmente candidatos para ser componentes de una vacuna de Malaria de tapa múltiple son P. faciparum MSP1, AMA1, MSP3, EBA, GLURP, RAP1, RAP2, Sequestrin, PfEMPI, Pf332, LSA1, LSA3, STARP, SALSA, PfEXPI, Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfs16, Pfs48/45, Pfs230 y sus análogos en Plasmodium spp. La presente invención contempla el uso de un antígeno antitumor y será útil para el tratamiento inmuterapeútico de cánceres. Por ejemplo, los antígenos de rechazo de tumor tales como los de cánceres de próstata, seno, colorectales, pulmón, pancreáticos, renales o de melanoma. Los antígenos de ejemplo incluyen MAGE 1, 3 y MAGE 4 u otos antígenos MAGE tales como los que se describen en la Publicación WO99/40188, PRMAE, BAGE, lage (también conocidos como NY Eos 1) SAGE y HAGE (WO 99/53061) ó GAGE (Robbins y Kawakami, 1996, Current Opinions Immunology 8, p 628-636; Van den Eynde y asociados., International Journal of Clinical & Laboratory Research (presentada en 1997); Corréale y asociados (1997), Journal of the National Cáncer Institute 89, p293. De hecho estos antígenos se expresan en un amplio rango de tipos de tumor, tales como melanoma, carcinoma de pulmón, sarcoma y carcinoma de vejiga. Los antígenos MAGE para utilizarse en la presente invención, pueden ser expresados como una proteína de fusión con un aumentador de expresión o una parte de fusión inmunológica. En particular, la proteína Mage puede fusionarse a la proteína procedente de influenza Heamophilus B. En particular, la parte de fusión puede comprender la primera de 1/3 de la Proteína D. Dichas construcciones se describen en la Publicación WO99/40188. Otros ejemplos de proteína de fusión pueden contener epítopes específicos de cáncer que incluyen proteínas de fusión bcr/abl. En una modalidad, se utilizan antígenos de próstata, tales como, antígeno específico de próstata (PSA), PAP, PSCA (PNAS 95(4) 1735-1740 1998), PSMA o antígeno conocido como Prostasa. La prostasa es una proteasa de serina específica de próstata (tipo tripsina), con 254 aminoácidos de longitud, con una triada catalítica de proteasa de serina conservada H-D-S y una secuencia de pre-propéptido de terminal-amino, que indica una función de segregación (P. Nelson, Lu Gan, C. Ferguson, P. Moss, R. Gelinas, L. Hood & K. Wnad, ""Molecular cloning and characterisation of prostasa, an androgen-regulated serina proteasa with prostate restricted expresión, In Proc. Nati. Acad. Sci EUA (1999) 96, 3114-3119). Ya se ha descrito un sitio de glucosilación putativa. La estructura anticipada es muy similar a otras proteasas de serina conocidas, que muestran los dobleces de polipéptido maduro en un solo dominio. La proteína madura tiene 224 aminoácidos de longitud, con un epítope A2 mostrado como procesado en forma natural. La secuencia de nucleótidos de prostasa y la secuencia de polipéptido deducida y homólogos se describen en la publicación de Ferguson, y asociados (Proc. Nati. Acad. Sci EUA 1999, 96, 3114-3119) y en las Solicitudes de Patente Internacional No. WO 98/12302 (y también la Patente otorgada correspondiente No. 5,955,306), WO 98/20117 (y también las Patentes otorgadas Nos. 5,840,871 y 5,786,148) (kallikreina específica de próstata) y WO 00/04149 (P703P). La presente invención proporciona antígenos que comprenden fusiones de proteína de prostasa con base en la proteína de prostasa y fragmentos y homólogos del mismo ("derivados"). Dichos derivados son adecuados para utilizarse en formulaciones de vacunas terapéuticas, las cuales son adecuadas para el tratamiento de tumores de * próstata. Normalmente, el fragmento contendrá al menos 20, 50 ó 100 aminoácidos contiguos, tal como se describe en las solicitudes de patente y en las patentes referenciadas anteriormente. Un antígeno de próstata adicional es conocido como P501S ID de secuencia no. 113 de la Publicación WO98/37814, incorporada a la presente invención como referencia. P501S es una proteína de membrana que interactúa con un receptor de superficie celular. Se anticipa que será un tipo de membrana de plasma tipo Illa con de 9 a 11 regiones de transmembrana que abarcan toda la longitud de la proteína. P501S comparte algunas homologías con proteína de enlace de sacarosa de espinaca (Riesmeier JW, Willmitzer L, Frommer WB, 1992, EMBO J 11, 4705-13). Los fragmentos de cADN P501S de traslape parcial y contiguos y los polipéptidos codificados de esta manera, también han sido descritos (WO 98/50567), más particularmente un fragmento de terminal-C de 255 aminoácidos de longitud. Un polipéptido de 231 aminoácidos de longitud, que se describe en la publicación WO 99/67384, se reporta como que comprende un dominio de transmembrana potencial, dos sitios de fosforilación de cinasa de caseína potencial II, un sitio de fosforilación de cinasa de proteína potencial C y una secuencia de adhesión de células potencial. P501S y las construcciones del mismo también se describen en la Patente Norteamericana No. 6,329,505 también incorporada a la presente invención como referencia. Los fragmentos y porciones inmunógenoicas codificadas por el gen del mismo comprende al menos 20, 50 ó 100 aminoácidos contiguos tal como se describe en la solicitud de patente referenciada anteriormente y también se contemplan. Un fragmento particular es PS108 (WO 98/50567, incorporada a la presente invención como referencia). Se conocen otros antígenos específicos de próstata a partir de las publicaciones WO98/37418 y WO/004149. Otro es STEAP PNAS 96 14523 14528 7-12 1999. Otros antígenos asociados con tumor útiles dentro del contexto de la presente invención incluyen: Plu-1 J Biol.. Chem 274 (22) 15633-15645, 1999, HASH-1, HasH-2, Cripto (Salomón y asociados al Bioessays 199, 21 61 -70, Patente No. 5654140) Patente Norteamericana No. 5,981,215 de Criptin. Además, los antígenos particularmente relevantes para vacunas en la terapia de cáncer también comprenden tirosinasa y survivina. La presente invención también es útil en combinación con antígenos de cáncer de seno, tales como Muc-1, Muc-2, EpCAM, her 2/Neu, mammaglobina (Patente Norteamericana No. 5,668,267) o los que se describen en las publicaciones WO00/52165, WO99/33869, WO99/19479, WO98/45328. La mucina de célula epitelial MUC-1 (también conocida como episialina o mucina epitelial polimórfica, PEM), es una glucoproteína de peso molecular alto que se expresa en muchas células epiteliales, las cuales han sido descritas en WO01/46228 y WO03/100060. En una modalidad, el componente (iii) codificó una proteína MUC-1 o derivado el cual está desprovisto de cualesquiera unidades de repetición (perfectas o imperfectas). En una modalidad adicional, la proteína MUC-1 o derivado esta desprovisto únicamente de las unidades de repetición perfectas. Aún en una modalidad adicional, la proteína MUC-1 o derivado contiene entre uno y 15 unidades de repetición; 7 unidades de repetición perfectas.

En una modalidad de la presente invención, el derivado MUC-1 puede ser modificado por codón del Muc-1 tipo natural. En particular, la región de repetición no perfecta puede tener un RSCU (Uso de Codón Sinónimo Relativo) de al menos 0.6, o al menos 0.65. La secuencia de nucleótidos que codifica a las unidades de repetición no perfectas de la proteína MUC-1 o derivado del mismo pueden tener un nivel de identidad con respecto a ADN MUC-1 tipo natural, con respecto a las regiones sin repetición correspondientes de menos del 85% o menos del 80%. El código de ADN tiene 4 letras (A, T, C y G) y se usan estas para deletrear "codones" de tres de letras que representan los aminoácidos de las proteínas que codifican en genes de un organismo. La secuencia lineal de codones a lo largo de la molécula de ADN se traduce en la secuencia lineal de los aminoácidos en la proteína (s) codificada por dichos genes. El código es altamente degenerativo, con 61 codones que codifican los 20 aminoácidos naturales y 3 codones que representan las señales de "detención". Por lo tanto, la mayor parte de los aminoácidos son codificados por más de un codón - de hecho varios son codificados por cuatro o más diferentes codones. Cuando está disponible más de un codón para codificar un aminoácido determinado, se ha observado que los patrones de uso del codón de los organismos son altamente no aleatorios. Las diferentes especies muestran diferentes inclinaciones en su selección de codón y además, la utilización de los codones puede ser marcadamente diferente en una sola especie entre genes que se expresan en niveles altos y bajos. Esta inclinación es diferente en células de víruses, plantas, bacterias y mamíferos, y algunas especies muestran una inclinación más fuerte lejos de una selección de codón aleatoria que otras. Por ejemplo, los humanos y otros mamíferos son desestabilizados en forma menos fuerte que ciertas bacterias o víruses. Por estas razones, existe una probabilidad significativa de que un gen de mamífero expresado en E. coli o un gen viral expresado en células de mamíferos, tenga una distribución inadecuada de codones para expresión eficiente. Se considera que la presencia en una secuencia de ADN heteróloga de agrupaciones de codones los cuales se observan raramente en el huésped en cuya expresión van a ocurrir, es predictiva de bajos niveles de expresión heteróloga en dicho huésped. En consecuencia, los codones preferidos por un procariótico particular (por ejemplo E. Coli o levaduras) o huésped eucariótico puede ser modificado para codificar la misma proteína MUC-1, pero difieren de una secuencia tipo natural. El proceso de modificación de codón puede incluir cualquier secuencia, generada ya sea en forma manual a mediante software de computadora en donde algunos o todos de los codones de la secuencia nativa de MUC-1 son modificados. Se han publicado varios métodos (Nakamura y asociados., Nucleic Acids Research 1996, 24:214-215; WO98/34640). Un método es el método Syngene, una modificación del método Calcgene (R. S. Hale y G Thompson (Protein Expresión and Purification Vol. 12 p. 185-188 (1998)). Este proceso de modificación de codón de MUC1 puede tener algunos o todos de los siguientes beneficios: 1) mejorar la expresión del producto de gen reemplazando los codones utilizados en forma rara o no frecuente con codones utilizados en forma más frecuente, 2) para eliminar o incluir sitios de enzima de restricción para facilitar la clonación de corrientes descendente y 3) para reducir el potencial de recombinación homologa entre la secuencia de inserto en el vector de ADN y las secuencia genómicas y 4) mejorar las respuesta inmunes en humanos. Las secuencias de MUC1 tienen en forma conveniente un potencial de recombinación reducida, pero expresan al menos el mismo nivel que las secuencias tipo natural. Debido a la naturaleza los algoritmos utilizados por el programa SynGene para generar una secuencia modificada por codón, es posible generar un número extremadamente grande de diferentes secuencias modificada por codón las cuales llevarán a cabo una función similar. En síntesis, los codones son asignados utilizando un método estadístico para producir un gen sintético que tiene una frecuencia de codón más cercana a la que se encuentra naturalmente en los genes humanos expresados en forma superior tal como ß-Actina. En una modalidad del inmunógeno de los polinucleótidos que codifican el inmunógeno para utilizarse en la presente invención, en donde el inmunógeno es MUC-1, el patrón de uso del codón se altera al típico de MUC-1 para representar en forma más cercana la estabilización del codón del gen humano altamente expresado objetivo. El "coeficiente de uso del codón" es una medida de en que forma tan cercana se asemeja el patrón de una secuencia de polinucleótidos determinada al de una especie objetivo. Las frecuencias del codón pueden ser derivadas de las fuentes de literatura de los genes altamente expresados de muchas especies (ver la publicación de Nakamura y asociados., Nucleic Acids Research 1996, 24:214-215). Las frecuencias de codón de cada uno de los 61 codones (expresados como el número de surgimientos por cada 1000 codones de la clase de genes seleccionados), son normalizados para cada uno de los veinte aminoácidos naturales, de modo que el valor del codón utilizado en forma más frecuente de cada aminoácido, se ajusta a uno, y las frecuencias de los codones menos comunes son escaladas para estar entre cero y 1. Por lo tanto cada uno de los 61 codones se le asigna un valor de uno o menos para los genes altamente expresados de las especies objetivo. Con el objeto de calcular un coeficiente de uso del codón para un polinucleótido específico, en forma relativa a los genes altamente expresados de dicha especie, el valor escalado de cada codón del polinucleótido específico es anotado y el promedio geométrico de todos estos valores es tomado (dividiendo la suma de los registros naturales de estos valores entre el número total de codones y tomar el anti-registro). El coeficiente tendrá un valor entre cero y uno y entre más alto es el coeficiente mas codones en el polinucleótido son codones utilizados en forma frecuente. Si una secuencia de polinucleótido tiene un coeficiente de uso de codón 1, todos los codones son codones "más frecuentes" para genes altamente expresados de las especies objetivo. En un ejemplo de un inmunógeno para utilizarse en la presente invención, el patrón de uso del codón del polinucleótido puede excluir codones que representan <10% de los codones utilizados por un aminoácido en particular. Un valor de uso de codón sinónimo o relativo (RSCU) es el número observado de codones divididos entre el número esperado, si todos los codones de dicho aminoácido fueron utilizados en forma igualmente frecuente. Un polinucleótido de la presente invención puede excluir codones con un valor RSCU menor a 0.2 en genes altamente expresados del organismo objetivo. Un polinucleótido de la presente invención, tendrá generalmente un coeficiente de uso de codón para genes humanos altamente expresados mayores a 0.6, mayores a 0.65, o mayores a 0.7. Las tablas de uso del codón para humanos también se pueden encontrar en el Genbank. En comparación, un gen de beta actina altamente expresado tiene un RSCU de 0.747. A continuación se presenta la tabla de uso de codón para homo sapiens: Uso de codón para genes humanos (altamente expresados) 1/24/91 (human_high.cod) Aminoácido Codón Número /1000 Fracción Gly GGG 905.00 18.76 0.24 Gly GGA 525.00 10.88 0.14 Gly GGT 441.00 9.14 0.12 Gly GGC 1867.00 38.70 0.50 Glu GAG 2420.00 50.16 0.75 Glu GAA 792.00 16.42 0.25 Asp GAT 592.00 12.27 0.25 Asp GAC 1821.00 37.75 0.75 Val GTG 1866.00 38.68 0.64 Val GTA 134.00 2.78 0.05 Val GTT 198.00 4.10 0.07 Val GTC 728.00 15.09 0.25 Ala GCG 652.00 13.51 0.17 Ala GCA 488.00 10.12 0.13 Ala GCT 654.00 13.56 0.17 Ala GCC 2057.00 42.64 0.53 Arg AGG 512.00 10.61 0.18 Arg - AGA 298.00 6.18 0.10 Ser AGT 354.00 7.34 0.10 Ser AGC 1171.00 24.27 0.34 Lys AAG 2117.00 43.88 0.82 Lys AAA 471.00 9.76 0.18 Asn AAT 314.00 6.51 0.22 Asp AAC 1120.00 23.22 0.78 Met ATG 1077.00 22.32 1.00 lie ATA 88.00 1.82 0.05 He ATT 315.00 6.53 0.18 lie ATC 1369.00 28.38 0.77 Thr ACG 405.00 8.40 0.15 Thr ACÁ 373.00 7.73 0.14 Thr ACT 358.00 7.42 0.14 Thr ACC 1502.00 31.13 0.57 Trp TGG 652.00 13.51 . 1.00 End TGA 109.00 2.26 0.55 Cys TGT 325.00 6.74 0.32 Cys TGC 706.00 14.63 0.68 End TAG 42.00 0.87 0.21 End TAA 46.00 0.95 0.23 Tyr TAT 360.00 7.46 0.26 Tyr TAC 1042.00 21.60 0.74 Leu TTG 313.00 6.49 0.06 Leu TTA 76.00 1.58 0.02 Phe TTT 336.00 6.96 0.20 Phe TTC 1377.00 28.54 0.80 Ser TCG 325.00 6.74 0.09 Ser TCA 165.00 3.42 0.05 Ser TCT 450.00 9.33 0.13 Ser TCC 958.00 19.86 0.28 Arg CGG 611.00 12.67 0.21 Arg CGA 183.00 3.79 0.06 Arg CGT 210.00 4.35 0.07 Arg CGC 1086.00 22.51 0.37 Gln CAG 2020.00 41.87 0.88 Gln CAÁ 283.00 5.87 0.12 His CAT 234.00 4.85 0.21 His CAC 870.00 18.03 0.79 Leu CTG 2884.00 59.78 0.58 Leu CTA 166.00 3.44 0.03 Leu CTT 238.00 4.93 0.05 Leu CTC 1276.00 26.45 0.26 Pro CCG 482.00 9.99 0.17 Pro CCA 456.00 9.45 0.16 Pro CCT 568.00 11.77 0.19 Pro CCC 1410.00 29.23 0.48 Por consiguiente en una modalidad de la presente invención en donde la molécula de nucleótido que codifica el componente de inmunógeno codifica un inmunógeno MUC-1, las secuencias de nucleótidos se modifican para semejarse en forma más cercana al uso de un gen humano altamente expresado, tal como ß actina. Cualesquiera unidades sin VNTR de un componente de inmunógeno MUC-1 que se puede utilizar, puede ser modificada por codón. Las unidades VNTR cuando se encuentran, pueden o no ser modificadas. En una modalidad, la secuencia de modificada por codón es menor al 50% idéntica a la unidad sin VNTR de Muc-1. Cuando se comparan secuencias de polinucleótidos, se dice que dos secuencias serán "idénticas" y las secuencias de nucleótidos en las dos secuencias es la misma cuando se alinean para una correspondencia máxima, tal como se describe más adelante. Las comparaciones entre dos secuencias se llevan a cabo normalmente comparando las secuencias mediante una ventana de comparación para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. Una "ventana de comparación" tal como se refiere en la presente invención, se refiere a un segmento de al menos aproximadamente 20 posiciones contiguas, normalmente de 30 hasta aproximadamente 75, 40 hasta aproximadamente 50, en donde una secuencia puede ser comparada con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que las dos secuencias son alineadas en forma óptima. Por lo tanto, para un inmunógeno que se utilizará en la presente invención, la región sin repetición de la región modificada por codón y la región sin repetición de la alineación óptima de secuencias para comparación, puede llevarse a cabo a través de algoritmos de identidad local de Smith and Waterman (1981) Add. APL. Math 2:482, mediante el algoritmo de identidad de Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol.. 48:443, a través de la búsqueda de métodos de similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc. Nati. Sci. EUA 85: 2444, mediante implementaciones computárizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, y TFASTA en el Paquete de Software de Genetics de Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wl), o mediante inspección. Los ejemplos de algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, los cuales se describen en la publicación de Altschul y asociados (1977) Nucí. Acids Res. 25:3389-3402 y Altschul y asociados (1990) J. Mol. Biol.. 215-403-410, respectivamente. Se pueden utilizar BLAST y BLAST 2.0, por ejemplo con los parámetros aquí descritos, para determinar el porcentaje de identidad de secuencia de los polinucleótidos de la presente invención. El Software para llevar a cabo los análisis, está disponible públicamente a través del Centro Nacional de Biotecnología. Dichas construcciones tienen la capacidad de elevar tanto una respuesta celular como de anticuerpos que reconocen las células de tumor que expresan MUC-1. La inclusión de una composición adyuvante de acuerdo con la presente invención puede mejorar las cinéticas y funcionalidad de la respuesta inmune para MUC.1. Las construcciones también pueden contener una repetición alterada (unidades VNTR) tal como mutantes de glucosilación reducidos tal como se describe en la publicación WO01/46228. Las construcciones MUC-1 adicionales que pueden ser utilizadas incluyen las siguientes, tal como se describe en la publicación WO 03/100060, junto con variantes aquí descritas: 1) 7 VNTR MUC-1 (es decir Muc-1 total únicamente con 7 repeticiones perfectas) 2) 7 VNTR MUC-1 ss (Como 1, aunque también desprovista de secuencia de señal) 3) 7 VNTR MUC-1 ?ATM ?CYT (Como 1, aunque desprovisto de dominio de transmembrana y citoplásmicos) 4) 7 VNTR MUC-1 ?ss ?CYT (Como 3, también desprovisto de secuencia de señal) 5) MUC-1-Truncado (es decir MUC-1 total sin repeticiones perfectas) 6) MUC-1-Truncado ?ss (Como 5, también desprovisto de secuencia de señal) 7) MUC-1-Truncado ?ATM ?CYT (Como 5, aunque desprovisto de dominio de transmembrana y citoplásmicos). 8) MUC-1-Truncado ?ss ?ATM ?CYT (Como 7, aunque desprovisto de secuencia de señal. En una modalidad, se mutan una o más de las unidades VNTR imperfectas para reducir el potencial de glucosilación, alterando un sitio de glucosilación. La mutación puede ser un reemplazo, o puede ser una inserción o eliminación. Normalmente al menos una treonina o serina esta sustituida con valina, isoleucina, alanina, asparagina, fenilalanina o triptofan. En una modalidad adicional, el ácido nucleico MUC-1 destruido está abastecido con un sitio de restricción en la unión de la secuencia líder y el dominio extracelular. Normalmente, este sitio de restricción es un sitio Nhe1.

Los antígenos Her 2 neu se describen ínter, alia, en la Patente Norteamericana No. 5,801,005. El Her 2 neu puede comprender todo el dominio extracelular (comprendiendo aproximadamente aminoácidos del 1 al 645) o fragmentos, del mismo y al menos una porción inmunógenoica de, o todo el dominio ¡ntracelular aproximadamente de la terminal-C de 580 aminoácidos. En particular, la parte intracelular debe comprender el dominio de fosforilación o fragmentos del mismo. Dichas construcciones se describen en WO00/44899. Una construcción se conoce como ECD PD, una segunda construcción se conoce como ECD ?PD. (Ver WO/00/44899.) El her 2 neu tal como se utiliza en la presente invención se puede derivar de rata, ratón o humano. La vacuna también puede contener antígenos asociados con mecanismos de soporte de tumor (por ejemplo angiogenesis, invasión de tumor) por ejemplo tie 2, VEGF. Las vacunas de la presente invención también pueden ser utilizadas para profilaxis o terapia de padecimientos crónicos además de alergia, cáncer o enfermedades infecciosas. Dichos padecimientos crónicos son enfermedades tales como asma, aterosclerosis, y Alzheimer y otros padecimientos autoinmunes. Las vacunas para utilizarse como anticonceptivos, también pueden ser consideradas. Los antígenos relevantes para profilaxis y la terapia de pacientes susceptibles a, o que padecen de, enfermedad neurodegenerativa de Alzheimer, son en particular, el fragmento de los aminoácidos 39 a 43 de terminal N (proteína precursora amiloide Abthe y fragmentos más pequeños. Este antígeno se describe en la Publicación de Patente Internacional No. WO 99/27944 - (Athena Neurosciences). Los autoantígenos potenciales que pueden incluirse como vacunas para padecimientos autoinmunes o como vacunas anticonceptivas incluyen: citocinas, hormonas, factores de crecimiento o proteínas extracelulares, o una citosina de 4 hélices, por ejemplo IL13. Las citocinas incluyen, por ejemplo, IL1, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL11, IL12, IL13, IL14, IL15, IL16, IL17, IL18, IL20, IL21, TNF, TGF, GMCSF, MCSF y OSM. Las citocinas de 4 hélices incluyen IL2, IL3, IL4, IL5, IL13, GMCSF y MCSF. Las hormonas incluyen, por ejemplo, hormona de luteinización (LH), hormona de estimulación de folículos (FSH), gonadotropina coriónica (CG), VGF, GHrelin, agouti, proteína relacionado con agutí y neuropéptido Y. Los factores de crecimiento incluyen por ejemplo, VEGF. Las vacunas de la presente invención están particularmente adecuadas para el tratamiento inmunoterapeútico de enfermedades, tales como condiciones y cánceres crónicos, aunque también para la terapia de infecciones persistentes. Por consiguiente las vacunas de la presente invención son particularmente adecuadas para la inmunoterapia de enfermedades infecciosas, tales como Tuberculosis (TB), infecciones VIH tales como SIDA e infecciones de virus de Hepatitis B (HepB). En una modalidad, el ácido nucleico codifica uno o más de los siguientes antígenos: HBV-PreS1 PreS2 y proteínas de Superficie, núcleo y pol HCV-E1, E2, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A y B HIV-gp120 pg40, gp160, p24, gag, pol, env, vif, vpr, vpu, tat, rev, nef Papiloma - E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7, E8, L1, L2 HSV - gL, gH, gM, gB, gC, gK, gE, gD, ICP47, ICP36, ICP4 Influenza - hemaglutinina, nucleoproteína TB - dismutasa super óxido Micobacteriana, 85A, 85B, MPT44, MPT59, MPT45, HSP10, HSP65, HSP70, HSP90, PPD 19kDa Ag, PPD 38kDa Ag. Se considera que la presente invención será particularmente efectiva para detener la tolerancia contra auto-antígenos, por ejemplo los antígenos de cáncer P501S ó MUC-1. Dichos antígenos pueden utilizarse en la presente invención. En una modalidad, adicional de la presente invención, las construcciones de inmunógeno de la presente invención, incluyen una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos un epítope de célula-T heterólogo. Estos epítopes de célula T pueden ser incorporados dentro o ya sea en cualquier extremo del inmunógeno. Los epítopes de célula T pueden ser epítopes auxiliares T. Los epítopes de célula T incluyen epítopes de célula T PADRE®, derivados de proteínas y toxinas bacterianas, tales como toxinas de Tétanos y Difteria. Por ejemplo, los epítopes P2 y P30 de la toxina de Tétanos pueden ser utilizados. Dichos epítopes pueden ser parte de una secuencia más larga. Los epítopes pueden ser incorporados dentro de las moléculas de ácido nucleico o en el extremo 3' ó 5' de la secuencia de acuerdo con la presente invención. Se pueden contemplar otras partes de fusión tales como las derivadas del antígeno del núcleo de Hepatitis B o tuberculosis. En una modalidad, una parte de fusión derivada de tuberculosis Micobacterium, RA12, una subsecuencia (aminoácidos 192 a 323) de MTB32A (Skeiky y. asociados Infection and Immunity (1999) 67:3998-4007). Una modalidad de la presente invención, el inmunógeno es cualesquiera de las construcciones MUC-1 aquí definidas, fusionadas al epítope de célula T promiscuo PADRE. Aún otras partes de fusión inmunológicas incluyen por ejemplo, proteína D de influenza Hemofílica B (WO91/18926) o una porción (normalmente la parte de terminal-C) de LytA derivado de streptococcus pneumoniae (ClytA; Biotechnology 10: 795-798, 1992), la cual puede ser fusionada a otra parte tal como P2. ClytA-P2-ClytA (CPC), tal como se describe en la publicación WO03/104272. La publicación WO99/40188 describe ínter alia proteínas de fusión que comprenden antígenos MAGE con colas His y una parte C-LytA en el término-N de la molécula; secuencias de ácido nucleico que codifican dichas proteínas de fusión pueden comprender el componente (iii) de la presente invención. Las construcciones de inmunógeno adicionales que pueden ser codificadas por un nucleótido que comprende el componente (iii) de la presente invención, pueden incluir por consiguiente: -inmunógeno-repeticiones C-LytA 1-4-epítope P2 (insertado en o reemplazando C-LytA de repetición5)-C-LytA de repetición 6. -C-LytA repetición 1-4 epítope -P2 (insertado en o reemplazando C-LytA de repeticiónd) - C-LytA de repeticiónß-inmunógeno. -inmunógeno-repeticiones C-LytA2-5-epítope P2 (insertado en C-LytA de repeticiónß) -C-LytA2-5 epítope -P2 (insertado en C-LytA de repetición6)-inmunógeno. -Inmunógeno C-LytA repeticiones 1-5-epítope P2 -insertado en C-LytA de repeticiónd -C-LytA repeticiones 1-5-epítope P2 -insertado en C-LytA de repeticiónd-inmunógeno -Inmunógeno epítope P2 -insertado en C-LytA de repeticiónl -C-LytA de repetición2-5 -epítope P2 -insertado en C-LytA de repeticiónl -C-LytA de repetición2-5-inmunógeno -inmunógeno epítope P2 -insertado en C-LytA de repetición1-C-LytA de repetición2-6 -epítope P2 -insertado en C-LytA de repeticiónl -C-LytA de repetición2-6-inmunógeno -inmunógeno C-LytA de repeticiónl -epítope -P2 insertado en C-LytA de repetición2-C-LytA de repetición3-6 -C-LytA de repeticiónl -epítope -P2 insertado en C-LytA de repetición2-C-LytA de repetición3-6-inmunógeno; en donde el término "insertado en" significa en cualquier lugar en la repetición, entre el residuo 1 y 2, o entre 2 y 3, etc. El epítope auxiliar T promiscuo puede ser insertado dentro de una región de repetición, por ejemplo, C-LytA repeticiones 2-5 - C-LytA repetición 6a-epítope P2 - C-LytA repetición 6b, en donde el epítope P2 se inserta dentro de la sexta repetición (ver figura 20 de la Publicación WO03/104272). En otras modalidades, el extremo de terminal-C de CPL1 (C-CPL1) puede utilizarse como una alternativa para C-LytA. Como alternativa, el epítope P2 en las construcciones anteriores puede ser reemplazado por otros epítopes T promiscuos, por ejemplo P30. Los inmunógenos particularmente ilustrativos comprenden una secuencia de al menos 10 aminoácidos contiguos, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180 aminoácidos de una proteína asociada con tumor o una proteína específica de tejido fusionada a la parte de fusión. De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, los vectores de expresión que se proporcionan comprenden y tienen la capacidad de dirigir la expresión de cada secuencia de polinucleótidos de la presente invención. El vector puede ser adecuado para conducir la expresión del ADN heterólogo en células de insecto o mamífero bacterianas, particularmente células de humano. También se proporciona el uso de una vacuna o composición inmunogénica de acuerdo con la presente invención, o de un vector de acuerdo con la presente invención, para el tratamiento o profilaxis de tumor o metástasis que expresan MUC-1 ó P501S. La presente invención también proporciona métodos para tratar o prevenir un tumor que expresa MUC-1 ó P501S, cualesquiera síntomas o enfermedades asociadas con el mismo, incluyendo metástasis, en donde los métodos comprenden la administración de una cantidad efectiva de la vacuna o composición inmunógenoica de acuerdo con la presente invención. La presente invención no se limita a vacunas que comprenden ácido nucleico que codifica MUC-1. La secuencia de nucleótidos puede ser ARN ó ADN incluyendo ADN genómico, ADN sintético ó cADN. En una modalidad, la secuencia de nucleótidos es una secuencia de ADN, o una secuencia de cADN. Con el objeto de obtener la expresión del péptido antigónico dentro de células de mamífero, es necesario que la secuencia de nucleótidos codifique el péptido antigénico que será presentado en un sistema de vector adecuado. Por el término "vector adecuado" tal como se utiliza en la presente invención, se entiende cualquier vector que permita que el péptido antigénico sea expresado dentro de un mamífero en cantidades suficientes para evocar una respuesta inmune. Por ejemplo, el vector seleccionado puede comprender un plásmido, promotor o secuencia de terminación de poliadenilación/transcripción ajustada en el orden correcto para obtener la expresión de los péptidos antigénicos. La construcción de vectores que incluyen estos componentes y opcionalmente otros, tales como aumentadores, sitios de enzimas de restricción y genes de selección, tales como genes de resistencia a antibióticos, es bien conocida por los expertos en la técnica y se explica con detalle en la Publicación de Maniatis y Asociados, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour Press, Volúmenes 1-3, 2a Edición, 1989. Para prevenir los plásmidos que se replican dentro del huésped de mamífero e integrarse entro del ADN cromosomal del animal, el plásmido puede ser producido sin un origen de réplica que es funcional en células eucarióticas. Los métodos y composiciones de acuerdo con la presente invención, se pueden utilizar en relación con procedimientos profilácticos o de tratamiento de todos los mamíferos, incluyendo por ejemplo, animales domésticos, animales de laboratorio, animales de granja, animales salvajes en cautiverio o en una modalidad, humanos. Tal como se describió anteriormente, la presente invención incluye el uso de vectores de expresión que codifican los componentes adyuvantes (i) y/o (¡i), o componentes de antígenos o de inmunógeno (iii) de la presente invención. Dichos vectores de expresión se construyen en forma rutinaria en la técnica de la biología molecular, y pueden, por ejemplo, comprender el uso de ADN de plásmido e iniciadores, promotores, aumentadores y otros elementos adecuados, tales como por ejemplo señales de poliadenilación las cuales pueden ser necesarias, y que están colocadas en la orientación correcta, con el objeto de permitir la expresión de proteínas. Otros vectores adecuados pueden ser apreciados por los expertos en la técnica. A manera de un ejemplo adicional a este respecto, nos referimos a la Publicación de Sambrook y Asociados, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2a Edición, CSH Laboratory Press (1989). Un polinucleótido, o para utilizarse en la presente invención en un vector, puede ser enlazado en forma operable a una secuencia de control que tiene la capacidad de proporcionar la expresión de la secuencia de codificación a través de la célula huésped, por ejemplo, el vector es un vector de expresión. El término "enlazado en forma operable" se refiere a una yuxtaposición en donde los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar en su forma proyectada. Una secuencia reguladora, tal como un promotor "enlazado en forma operable" a una secuencia de codificación, se coloca de tal forma que la expresión de la secuencia de codificación sea lograda bajo condiciones compatibles con la secuencia de regulación. Los vectores pueden ser, por ejemplo, plásmidos, cromosomas artificiales (por ejemplo, BAC, PAC, YAC), virus o vectores de fago abastecidos con un origen de réplica, opcionalmente un promotor para la expresión del polinucleótido y opcionalmente un regulador del promotor. Los vectores pueden contener uno o más genes marcadores seleccionables, por ejemplo un gen de resistencia a ampicilina o canamicina en el caso de un plásmido bacteriano, o un gen con resistencia a un vector fúngico. Los vectores pueden ser utilizados in vitro, por ejemplo para la producción de ADN ó ARN o utilizar para transfectar o transformar una célula huésped, por ejemplo, una célula de huésped de mamífero, por ejemplo, para la producción de proteína codificada por el vector. Los vectores pueden ser adaptados también para ser utilizados in vivo, por ejemplo en un método de vacunación de ADN ó de terapia genética. Los promotores y otras señales de regulación de expresión pueden ser seleccionados para ser compatibles con la célula huésped para la cual se diseña la expresión. Por ejemplo, los promotores de mamífero incluyen el promotor de metalotioneína, el cual puede ser inducido en respuesta a metales pesados tales como cadmio, y el promotor de ß-actina. Los promotores virales tales como promotor de antígeno T grande SV40, promotor temprano inmediato (IE) de citomegalovirus humano (CMV) promotor de virus de sarcoma rous LTR, promotor de adenovirus o promotor de HPV, particularmente la región reguladora de corriente ascendente HPV (URR), también pueden ser utilizados. Todos estos promotores se describen y están disponibles fácilmente en la técnica. Un elemento promotor es el promotor temprano inmediato CMV desprovisto de intrón A, aunque el exón 1 (WO02/36792). Por consiguiente se proporciona un vector que comprende un polinucleótido de la presente invención bajo el control del promotor temprano IE HCMV. Los ejemplos de vectores virales adecuados incluyen vectores virales de herpes simplex, vectores de vacuna ó alfa-virus o retroviruses, incluyendo lentiviruses, adenoviruses y viruses adeno-asociados. Las técnicas de transferencia genética que utilizan estos viruses, son conocidos por los expertos en la técnica. Los vectores de retrovirus, se pueden utilizar por ejemplo para integrar en forma estable el polinucleótido de la presente invención en el genoma huésped, aunque dicha recombinación no es la preferida. Los vectores de adenovirus con defectos en la réplica a través de contraste, permanecen episomales y por consiguiente permiten la expresión temporal. Los vectores con la capacidad de conducir la expresión en células de insectos (por ejemplo vectores baculovirus) en células humanas o en bacterias, pueden emplearse con el objeto de producir cantidades de la proteína VIH codificada por los polinucleótidos de la presente invención, por ejemplo para utilizarse como vacunas de subunidad o ¡nmunoensayos. Los polinucleótidos de la presente invención, tienen utilidad particular en vacunas virales, como intentos previos para generar construcciones de vacunas de longitud total que han tenido éxito. En una modalidad de la presente invención, los vectores virales que se pueden utilizar comprenden una secuencia de ácido nucleico adenoviral seleccionada de C1, Pan 5, Pan 6, Pan 7 C68 (Pan 9), SV1, SV25, y SV 39, tal como se describe en la Solicitud PCT Publicada WO 03/046124, cuya totalidad está incorporada a la presente invención como referencia. Los vectores bacterianos, tales como Salmonella o Listeria atenuada pueden ser utilizados en forma alternativa. Los polinucleótidos de acuerdo con la presente invención tienen utilidad en la producción mediante la expresión de las proteínas codificadas, cuya expresión puede tener lugar in vitro, in vivo ó ex vivo. Los nucleótidos pueden estar involucrados, por consiguiente, en síntesis de proteína recombinante, por ejemplo para incrementar las producciones, o de hecho pueden tener uso como agentes terapéuticos por su propio derecho, utilizados en técnicas de vacunación de ADN. Cuando los polinucleótidos de la presente invención se utilizan en la producción de las proteínas codificadas in vitro o ex vivo, las células, por ejemplo en cultivo celular, serán modificadas para incluir el polinucleótido que será expresado. Dichas células incluyen líneas celulares de mamífero temporales o estables. Los ejemplos particulares de células que pueden ser modificadas mediante inserción de vectores que codifican un polipéptido de acuerdo con la presente invención, incluyen células HEK293T, CHO HeLa, 293 y COS de mamífero. La línea celular seleccionada puede ser una que no sea únicamente estable, sino que también permita la glucosilación madura y la expresión de superficie celular de un polipéptido. La expresión se puede lograr en oocitos transformados. Un polipéptido puede ser expresado a partir de un polinucleótido de la presente invención, en células de un animal no humano transgénico, tal como un ratón. Un animal no humano transgénico que expresa un polipéptido de un polinucleótido de la presente invención, está incluido dentro del alcance de la misma. La presente invención proporciona además un método de vacunación de un sujeto mamífero, en donde el método comprende administrar al mismo una cantidad efectiva de dicha vacuna o composición de vacuna. Los vectores de expresión para utilizarse en vacunas de ADN, composiciones de vacuna inmunoterapéuticos pueden ser vectores de plásmido. El componente de ¡nmunógeno que comprende un vector que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica un péptido antigénico, se puede administrar en una variedad de formas. Es posible que el vector sea administrado en una forma desprotegida (esto es en la forma de una secuencia de nucleótidos desprotegida que no está en asociación con formulaciones liposomales, con vectores virales o proteínas de facilitación de transfección) suspendido en el medio adecuado, por ejemplo una solución salina regulada tal como PBS, y posteriormente se inyecta en forma intramuscular, subcutánea, ¡ntraperitoneal o intravenosa, aunque alguna información anterior sugiere que se puede utilizar inyección intramuscular o subcutánea (Brohm y Asociados, Vaccine 1_6_ No. 9/10, páginas 949-954 (1998), cuya descripción está incluida en totalidad a la presente invención como referencia). Además es posible que los vectores sean encapsulados, por ejemplo, a través de liposomas o dentro de partículas de co-glucólido poliláctico (PLG) (25) para la administración a través de rutas orales, nasales o pulmonares, además de las rutas detalladas anteriormente.

También es posible, de acuerdo con una modalidad de la presente invención, la administración intradérmica del componente de ¡nmunógeno, por ejemplo a través del uso de técnicas de administración de pistola genética (particularmente bombardeo de partículas). Dichas técnicas pueden comprender el recubrimiento del componente de inmunógeno sobre las cuentas de oro, las cuales posteriormente se administran bajo alta presión dentro de la epidermis, tal como por ejemplo tal como se describe en la Publicación de Haynes y Asociados, J. Biotechnology 44:37-42 (1996). En un ejemplo ilustrativo, se puede lograr una aceleración de partículas conducida por gas con aparatos tales como los fabricados por Powderject Pharmaceuticals PLC (Oxford, UK) and Powerject Vaccines Inc. (Madison, Wl), algunos ejemplos de los cuales se describen en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,846,796; 6,010,478; 5,865,796; 5,584,807; y en la Patente EP No. 0500 799/ Este método ofrece un método de suministro libre de agujas en donde una formulación en polvo seco de partículas microscópicas, tal como polinucleótido, son aceleradas a alta velocidad dentro de un chorro de gas helio generado a través de un aparato manual, impulsando las partículas dentro de un tejido objetivo de interés, normalmente la piel. Las partículas pueden ser cuentas de oro de 0.4-4.0 µm, ó 0.6-2.0 µm de diámetro y el conjugado de ADN recubierto en estas, y posteriormente guardado en un cartucho o cinta para la colocación en la "pistola genética". En una modalidad relacionada, pueden ser útiles otros aparatos y métodos para la inyección sin agujas conducida por gas de composiciones de la presente invención e incluyen las proporcionadas por Bioject, Inc. (Portland, OR), en donde algunos de sus ejemplos se describen en las Patentes Norteamericanas Nos. 4,790,824; 5,064,413; 5,312,335; 5,383,851; 5,399,163; 5,520,639, y 5,993,412. La vacuna de ácido nucleico también puede ser suministrada a través de medios de microagujas, los cuales pueden ser recubiertos con una composición de la presente invención o suministrados a través de la microaguja procedente de un depósito. Los vectores que comprenden las secuencias de nucleótidos que codifican los péptidos antigénicos, se administran en una cantidad tal que será profiláctica o terapéuticamente efectiva. La cantidad que será administrada, en general está dentro del rango de 1 picogramo a 1 miligramo, o un picogramo a 10 microgramos para administración transmitida por partículas, y de 10 microgramos 1 miligramo para otras rutas de nucleótido por dosis. La cantidad exacta puede variar considerablemente dependiendo de las especies y pesos del mamífero que esté siendo inmunizado, la ruta de administración, la potencia y dosis de los componentes adyuvantes, la naturaleza del estado de enfermedad que esté siendo tratado o protegido en contra, la capacidad del sistema inmune del sujeto para producir una respuesta inmune y el grado de protección o eficacia terapéutica deseada. Con base en estas variables, un especialista médico o veterinario tendrá la capacidad de determinar fácilmente el nivel de dosis adecuado. Es posible que el componente de inmunógeno (iii) que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el péptido antigónico, y los componentes adyuvantes (i) y (ii) sean administrados sobre bases de una vez, o sean administrados en forma repetida, por ejemplo, entre 1 y 7 veces, o entre 1 y 4 veces, en intervalos de aproximadamente 4 semanas y aproximadamente 18 meses. Sin embargo, una vez más este régimen de tratamiento será variado en forma significativa dependiendo del tamaño del paciente, la enfermedad que esté siendo tratada o de la que se esté protegiendo, la cantidad de secuencia de nucleótidos administrada, la ruta de administración y otros factores que pueden ser apreciados por el especialista médico. El paciente puede recibir uno o más de otros fármacos anticáncer, como parte de su régimen de tratamiento general. Una vez más, dependiendo del tipo de variables descritas anteriormente, la dosis de administración del agonista TLR también variará, aunque, por ejemplo, puede fluctuar entre aproximadamente 0.1 mg por kg hasta aproximadamente 100 mg por kg, en donde el término "por kg" se refiere al peso corporal del mamífero correspondiente. Esta administración del derivado de amina agonista TLR puede repetirse con cada administración subsecuente o de refuerzo de la secuencia de nucleótidos. La dosis de administración puede ser de entre aproximadamente 0.5 mg por kg hasta aproximadamente 5 mg por kg, o de aproximadamente 1 mg/kg ó 1 mg/mg. Cuando el agonista TLR es resiquimod o ¡miquimod, la dosis puede ser de 1 mg/kg. Cuando el agonista TLR es imiquimod, se puede utilizar la crema AldaraMR (5% imiquimod; 3M) y aplicarse tópicamente en, o cerca del sitio de administración. En una modalidad de la presente' invención, se puede utilizar un paquete de 12.5 mg (3M) de AldaraMR al 5%, como alternativa se puede utilizar más de un paquete de crema AldaraMR. En una modalidad adicional de la presente invención, se puede utilizar una fracción de un paquete: por ejemplo aproximadamente el 20%, 25%, 33% ó 50% de un paquete puede utilizarse en, o cerca de cada sitio. Aunque es posible que el componente adyuvante del agonista TLR comprenda una molécula de imidazoquinolina o derivado de la misma para ser administrada en el estado químico sin procesar, la administración puede ser en la forma de una formulación farmacéutica. Esto es, el componente adyuvante del agonista TLR puede comprender la molécula de imidazoquinolina o derivado de la misma combinada con uno o más vehículos farmacéutica o veterinariamente aceptables, y opcionalmente, otros ingredientes terapéuticos. El vehículo(s) puede ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con otros ingredientes dentro de la formulación, y no perjudicial para el receptor del mismo. La naturaleza de las formulaciones variará naturalmente de acuerdo con la ruta de administración proyectada, y puede ser preparada a través de métodos bien conocidos en la técnica farmacéutica. Todos los métodos para preparar las formulaciones incluyen el paso de poner en asociación una molécula de imidazoquinolina o derivado de la misma con un vehículo o vehículos adecuados. Los vehículos incluyen una formulación en crema o como alternativa, PBS o agua. En general las formulaciones se preparan poniendo en asociación uniforme y profunda el derivado con los vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente divididos, o ambos, y posteriormente si es necesario formar el producto en la formulación deseada. Las formulaciones de la presente invención adecuadas para administración oral, pueden presentarse en la forma de unidades independientes tales como cápsulas, cápsulas o tabletas que contienen cada una, una cantidad predeterminada del ingrediente activo; en la forma de un polvo o granulos; como una solución o una suspensión en un líquido acuoso o un líquido no acuoso; o en la forma de una emulsión líquida de aceite en agua o una emulsión de agua en aceite. El ingrediente activo también debe ser preparado como un bolo, mezclado con sustancia azucarada o pasta. Una tableta puede ser elaborada mediante compresión o moldeo, opcionalmente con uno o más ingredientes accesorios. Las tabletas comprimidas pueden ser preparadas comprimiendo en una máquina adecuada el ingrediente activo en la forma de flujo libre tal como un polvo o granulos, opcionalmente mezclados con un enlazador, lubricante, diluyente inerte, superficie activa o agente de dispersión. Las tabletas moldeadas pueden ser elaboradas moldeando en una máquina adecuada una mezcla del compuesto pulverizado humedecido con un diluyente líquido inerte. Las tabletas pueden ser recubiertas opcionalmente o clasificadas, y pueden ser formuladas para proporcionar la liberación lenta o controlada del ingrediente activo. Las formulaciones para inyección, por ejemplo, a través de rutas de administración intramusculares, intraperitoneales o subcutáneas incluyen soluciones de inyección estéril acuosas y no acuosas, que pueden contener antioxidantes, reguladores, bacteriostatos y soluciones derretidas que hacen isotónica la formulación con la sangre del receptor proyectado; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas las cuales pueden incluir agentes de suspensión y agentes de engrosamiento. Las formulaciones pueden presentarse en contenedores de dosis por unidad o de dosis múltiples, por ejemplo, ampolletas y frascos sellados, pueden ser almacenadas en una condición secada por congelación (liofilizada) que requiere únicamente la adición del vehículo líquido estéril, por ejemplo, agua para inyecciones, inmediatamente antes de utilizarse. Las soluciones y suspensiones de inyección extemporánea, se pueden preparar a partir de polvos, granulos y tabletas estériles del tipo previamente descrito. Las formulaciones adecuadas para administración pulmonar a través de la cavidad bucal o nasal, se presentan de modo que las partículas que contienen el ingrediente activo, en • forma deseable que tienen un diámetro dentro del rango de 0.5 a 7 mieras, se suministran en el árbol bronquial del receptor. Las posibilidades de que dichas formulaciones estén en la forma de polvos finamente molidos que pueden ser presentados de manera conveniente ya sea en una cápsula perforable, por ejemplo convenientemente de gelatina, para utilizarse en un aparato de inhalación, como alternativa, una formulación de alta propulsión que comprende ingrediente activo, un propulsor líquido adecuado y opcionalmente, otros ingredientes tales como tensoactivo y/o diluyente sólido. Las formulaciones de autopropulsión pueden ser empleadas cuando el ingrediente activo se disperse en la forma de gotas de una solución o suspensión. Dichas formulaciones de autopropulsión son análogas por los expertos en la técnica, y pueden ser preparadas mediante procedimientos establecidos. Se abastecen en forma adecuada ya sea con una válvula que opera en forma manual o que funciona en forma automática que tiene las características de rocío deseadas; en forma , conveniente la válvula es de un tipo de suministro medido de un volumen fijo, por ejemplo de 50 a 100 µl, al momento de cada operación de la misma. En una posibilidad adicional, el componente de adyuvante puede estar en la forma de una solución para utilizarse en un atomizador o nebulizador, en tanto que se emplea una corriente de aire acelerado o agitación ultrasónica para producir una neblina de gotas finas para inhalación. Las formulaciones adecuadas para administración ¡ntranasal, incluyen generalmente presentaciones similares a las descritas anteriormente para administración pulmonar, aunque dichas formulaciones pueden tener un diámetro de partícula dentro del rango de aproximadamente 10 hasta aproximadamente 200 mieras, para permitir la retención dentro de la cavidad nasal. Esto se puede lograr, según sea adecuado, a través del uso de un polvo de un tamaño de partícula adecuado, o la elección de una válvula adecuada. Otras formulaciones adecuadas incluyen polvos gruesos que tienen un diámetro de partícula dentro del rango desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 500 mieras, para administración mediante inhalación rápida a través del pasaje nasal desde un contenedor que se mantiene cerrado hacia la nariz, y gotas nasales que comprenden desde aproximadamente 0.2 hasta el 5% p/p del ingrediente activo en soluciones acuosas o de aceite. En una modalidad de la presente invención, es posible que el vector que comprenda la secuencia de nucleótidos que codifica el péptido antigénico sea administrada dentro de la misma formulación que el derivado de 1 H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina. Por lo tanto en esta modalidad, el componente de inmunógenoico y el componente adyuvante se encuentran dentro de la misma formulación. En una modalidad el componente adyuvante (ii) y el componente de inmunógeno (iii) se preparan en formas adecuadas para administración con pistola genética, y se administran a través de la ruta concomitante para la administración de la secuencia de nucleótidos que codifica el inmunógeno. Para la preparación de formulaciones adecuadas para utilizarse en esta forma, puede ser necesario que el componente adyuvante (ii) y el componente de inmunógeno (iii) sean liofilizados y adheridos, por ejemplo, a cuentas de oro que son adecuadas para administración con pistola genética. En esta modalidad, el componente adyuvante (i) puede administrarse en secuencias, en una composición separada. En una modalidad alternativa, el componente adyuvante (i) ó (ii), o ambos, se pueden administrar en la forma de un polvo seco, a través de propulsión de gas de alta presión. Al menos un componente adyuvante puede ser concomitante para la administración de la secuencia de nucleótidos que codifica el inmunógeno; el componente adyuvante (ii) puede ser administrado en forma concomitante a la administración del componente del inmunógeno. Incluso si no se formulan juntos, puede ser adecuado que los componentes adyuvantes (i) y (ii) sean administrados en el mismo sitio, o aproximadamente en el mismo sitio de administración que la secuencia de nucleótidos. Se pueden encontrar otros detalles de preparaciones farmacéuticas en la Publicación Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1985), cuya descripción está incluida en su totalidad a la presente invención como referencia. Los componentes adyuvantes aquí especificados pueden ser administrados en forma similar a través de una variedad de diferentes rutas de administración, tales como por ejemplo, a través de rutas orales, nasales, pulmonares, intramusculares, subcutáneas, intradérmicas o tópicas. Los componentes pueden ser administrados a través de rutas ¡ntradérmicas, subcutáneas o tópicas. La administración del adyuvante puede tener lugar entre aproximadamente 14 días antes y aproximadamente 14 días después de la administración de la secuencia de nucleótidos, o entre aproximadamente 1 día antes y aproximadamente 3 días después de la administración de la secuencia de nucleótidos. La secuencia de nucleótidos que codifica GM-CSF puede ser administrada en forma concomitante con la administración de la secuencia de nucleótidos que codifica el inmunógeno, y el componente el cual es un agonista TLR proporcionado en secuencias. El componente el cual es un agonista TLR puede proporcionarse aproximadamente o exactamente en los días 7, 6, 5, 4, 3, 2, ó 1 ó aproximadamente o exactamente a las 24, 22, 20, 18, 16, 14, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, ó una hora antes del componente de antígenos. El componente que es un agonista TLR puede ser administrado aproximadamente o exactamente en los días 7, 6, 5, 4, 3, 2, ó 1 días o aproximadamente o exactamente a las 24, 22, 20, 18, 16, 14, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, o una hora después del componente de antígenos. El componente el cual es un agonista TLR puede ser administrado la las 24 horas, o aproximadamente 24 horas después de los componentes restantes. Una ventaja de proporcionar el componente del agonista TLR después de la administración de los componentes (¡i) y (iii) es que la administración de los componentes (ii) y (iii) puede conducir a la inducción de IFNy en el lugar de administración; esto puede conducir a la activación de los TLRs, de modo que la activación de TLRs 7 y/o 8, conduce a una respuesta incrementada al agonista TLR. En una modalidad de la presente invención, los componentes (¡i) y (iii) están en una formulación adecuada para administración simultánea a través de la administración de pistola genética, y el componente adyuvante (i) se proporciona en una formulación en crema por separado para administración tópica en secuencias. Las técnicas adecuadas para introducir el polinucleótido desprotegido o vector en un paciente, también incluye una aplicación tópica con un vehículo adecuado. El ácido nucleico puede ser administrado en forma tópica a la piel, a las superficies de mucosas por ejemplo mediante administración intranasal, oral, intravaginal o ¡ntra-rectal. El polinucleótido o vector desprotegido puede presentarse junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina regulada por fosfato (PBS). La captación de ADN puede facilitarse en forma adicional a través del uso de agentes de facilitación tales como bupicaína, ya sea por separado o incluida en la formulación de ADN. Otros métodos para administrar el ácido nucleico directamente al receptor, incluyen ultrasonido, estimulación eléctrica, electroporación y microsembrado, los cuales se describen en la Patente 5,697,901. La captación de construcciones de ácido nucleico puede mejorarse a través de diversas técnicas de transfección conocidas, por ejemplo las que incluyen el uso de agentes de transfección. Los ejemplos de estos agentes incluyen agentes catiónicos, por ejemplo, fosfato de calcio y DEAE-Dextran y lipofectantes, por ejemplo lipofectan y transfectan. La dosis del ácido nucleico que será administrada puede alterarse. Una secuencia de ácido nucleico de la presente invención también puede ser administrada por medio de células transformadas. Dichas células incluyen células recolectadas de un sujeto. El polinucleótido o vector desprotegido de la presente invención puede ser introducido en las células in vitro, y las células transformadas posteriormente pueden ser regresadas al sujeto. El polinucleótido de la presente invención puede integrarse en ácido nucleico ya presente en una célula a través de eventos de recombinación homologa. Si se desea, la célula transformada puede crecerse in vitro, y una o más de las células resultantes se pueden utilizar en la presente invención. Las células pueden ser proporcionadas en un sitio adecuado en un paciente a través de técnicas quirúrgicas y microquirúrgicas conocidas (por ejemplo injerto, microinyección, etc.). Los inventores de la presente invención han demostrado que la combinación del agonista TLR con GM-CSF, cuando se utiliza como adyuvantes en vacunación de ADN, tiene la capacidad de incrementar las respuestas inmunológicas transmitidas por la célula, en particular después de una inyección primera. El término adyuvante o componente adyuvante tal como se utiliza en la presente invención, pretende dar a entender que los derivados o el componente que comprenden los derivados, actúan para aumentar y/o alterar la respuesta del cuerpo a un inmunógeno en un modo deseado. Por ejemplo, un adyuvante se puede utilizar para cambiar una respuesta inmune a una respuesta predominantemente Th1, o para incrementar ambos tipos de respuestas. Un inductor de un tipo Th1 de respuesta inmune, permite que se genere una respuesta transmitida por la célula. Los altos niveles de citosinas tipo Th1 tienden a favorecer la inducción de las respuestas inmune transmitidas por célula al antígeno determinado, mientras que los altos niveles de citocina Th2, tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes humorales al antígeno. Es importante recordar que la distinción de la respuesta inmune tipo Th1 y Th2 no es absoluta. En realidad, un individuo soportará una respuesta inmune la cual se describe como siendo predominantemente Th1 ó predominantemente Th2. Sin embargo, con frecuencia es conveniente considerar las familias de citocinas en términos que se describen en los clones de célula T CD4 +ve de múrido por Mosmann y Coffman (Mosmann, T. R. and Coffmann, R. L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Anual Review of Immunology, 7, p145-173). Tradicionalmente, las respuestas tipo Th1 están asociadas con la producción de IFN-? y citocinas IL-2 a través de linfocitos-T. Otras citocinas con frecuencia están asociadas directamente con la inducción de respuestas inmune tipo Th1 que no son producidas por células-T, tal como IL-2. En contraste, las respuestas tipo Th2 están asociadas con la segregación de 11-4, IL-5, IL-6, IL-10. La presente invención será descrita en forma adicional, con referencia a los siguientes ejemplos sin limitación: Ejemplos Introducción Los experimentos demuestran el uso de una molécula de nucleótidos que codifica GM-CSF y un agonista TLR para aumentar la respuesta inmune celular a un péptido antigénico. Las diferencias significativas en la inmunógenoicidad han sido observadas; el uso de un adyuvante que comprende un nucleótido que codifica GMCSF, junto con un agonista TLR, puede mejorar las cinéticas y funcionalidad de una respuesta humana a un antígeno, tal como se puede observar a partir de los siguientes experimentos y en donde lo cual puede ser demostrado en forma adicional a través de los siguientes protocolos aquí señalados o protocolos bien conocidos en la técnica. Materiales y Métodos 1. Construcción de vectores de expresión: plásmido de OVAcyt, 7VNTRMuc1, HIV RNG y GM-CSF. Construcción de plásmido OVAcyt. Un gen que codifica una forma no segregada de ovalbúmina de pollo se construyó eliminando la señal de secreción (a. a. 20-145) del gen de ovario de pollo tipo natural. El gen truncado se denomina OVAcyt, lo cual significa que es una forma citoplásmica no segregada de la proteína de ovalbúmina. Este gen fue amplificado mediante PCR utilizando cebadores que incorporan sitios de restricción para permitir la ligadura en el vector de vacuna de ADN p7313 (los detalles se incluyen en la Publicación WO 02/08435, cuya totalidad está incorporada a la presente invención como referencia). La figura 1, muestra la secuencia de la cinta de expresión que contiene el gen OVaCyt. Los sitios de enzimas de restricción de Notl y BamH1 están subrayados, los codones de inicio y detención están con letras negritas y la secuencia Kozak está en letras cursivas. Construcción de plásmido GMCSF. Se clonó GM-CSF de ratón a partir de una biblioteca de cADN y se clonó en el pVACss2 del vector de expresión. Se utilizó el clon de cADN como una plantilla para amplificar la estructura de lectura abierta de mGM-CSF mediante PCR, utilizando cebadores que incorporan una secuencia Kozac, el codón de inicio y los sitios de enzima de restricción para permitir la clonación en el vector de. vacuna de ADN p7313 (WO 02/08435 tal como se indicó anteriormente). La figura 2 muestra la secuencia de codificación para esta cinta de expresión mGM-CSF.

En la figura 2, los sitios de enzima de restricción de Nhe1 y Asc1 se muestran subrayados, los codones de inicio y detención se muestran con letras negritas y la secuencia Kozak se muestra con letras cursivas. Construcción de plásmido RNG. El RT optimizado por codón inactivado, la parte Nef y p17/p24 truncada del gen gag optimizado por el codón a partir de la corriente descendente HXB2 de la cepa del grupo de organismos B de VIH-1 de un promotor de HCMV de longitud inferior + exon 1, y la corriente ascendente de una señal de poli-adenilación de ß-globina de conejo. El orden de los genes dentro de la construcción se logró mediante amplificación PCR del RT-trNef y los genes p17p24 de p73i-Tgrn. Se llevó a cabo el hilvanado PCR de los dos fragmentos de ADN y se purificó el gel del producto 3 kb y se cortó Notl/BamHI antes de la ligadura con p7313ie digerido por Notl/BamHI. La secuencia se muestra en la figura 4. Generación de construcciones MUC-1. Construcción de un vector de expresión MUC1 que contiene siete unidades VNTR. La construcción de este vector se detallada en la Solicitud de Patente No. WO 03/100060, cuya descripción está incorporada a la presente invención como referencia, y su secuencia se muestra en la figura 3a.

Construcción de una cinta de expresión MUC1 con un epítope auxiliar HepB insertado en el término-C de MUC1. Se utiliza un proceso de dos pasos para insertar el epítope auxiliar HepB en el término C de MUC-1. Un enlazador de ADN corto que codifica el epítope, fue generado mediante endurecimiento de dos oligos, FORA y REVA. Se mezcló cebador FOR 10 pmol, cebador REV 10 pmol, regulador de ligasa de ADN 1X T4 y cinasa de polinucleótido 10U T4 en un volumen total de 10 µl, se incubó durante 2 horas a una temperatura de 37°C y se endureció mediante calentamiento primero a una temperatura de 95°C durante 2 minutos y posteriormente enfriando en un rango de 0.1°C/s. Se mantuvo a una temperatura de 4°C. Los enlazadores resultantes se ligaron en el sitio Nhel/Xhol de pVAC, generando vectores JNW729 (terminal-C). La cinta de expresión MUC1 fue extirpada del vector JNW656 en una cinta Xbal y se clonó en los sitios Nhel de los vectores JNW729, generando vectores JNW737 (terminal-C). Todos los vectores fueron verificados en su secuencia. La secuencia de JNW737 se muestra en la figura 3B, en donde la secuencia del epítope auxiliar está encerrada en un cuatro. Construcción de una cinta de expresión MUC1 con un epítope auxiliar PADRE insertado en el término-C de MUC-1.

Se generó una fusión de terminal-C insertando primero un enlazador corto en pVAC1. El enlazador fue creado endurecimiento los dos cebadores PADREFOR y PADREREV, y clonando el enlazador en pVAC1 a través de los sitios Nhel y Xhol, generando el vector JNW800. En JNW800, se insertó la cinta de expresión 7x VNTR MUC procedente de JNW656 (7x VNTR MUC1) y JNW758 (codón optimizado 7x VNTR MUC, ver Solicitud de Patente No. VB60033) extirpando la cinta MUC1 en el fragmento Xbal y clonando en el sitio Xbal, generando los siguientes dos vectores. 7x VNTR MUC1 terminal-C PADRE: JNW810. 7x VNTR MUC1 (codón optimizado) terminal-C PADRE: JNW812. La secuenciación de la cinta de expresión MUC1 y el epítope JNW810 y JNW812 se muestra en la figura 13. 2. Elaboración de construcciones-materiales. Animales CBAB6.F1 es un cruce de ratón C57BI6 y ratón CBA y son el antecedente de tipo natural del ratón Tg MUC1 utilizado. Los ratones Tg MUC1 se obtuvieron del Imperial Cáncer Research Fund y expresan MUC1 de humano bajo el control del promotor MUC de humano (Peat y Asociados, 1992). El patrón de expresión MUC1 en dichos ratones, es muy similar al perfil de la expresión observada en tejidos humanos. C57/bl6 ó Balb/C obtenido de Charles River fueron utilizados para estudios que comprenden p7313OVAcyt y p7313RNG. Se mantuvieron en alojamiento en GSK, ratones RIP-OVAIo. 2.1. Coadministración de dos plásmidos: p7313 OVAcyt (plásmido que codifica el antígeno) p7313RNG (plásmido que codifica el antígeno), o pVAC 7VNTR Muc1 (plásmido que codifica el antígeno), y plásmidos p7313 GMCSF (que codifica GM-CSF). Se precipitó el ADN de plásmido en cuentas de oro con diámetro de 2 µg utilizando cloruro de calcio y espermidina. Se mezclaron cantidades iguales de plásmidos que codifican el antígeno (p7313OVAcyt, p7313RNG, pVAC7VNTRMud , pVAC7VNTRMud-PADRE ó pVAC7VNTRMuc1 -HepB) y plásmidos p7313GMCSF y se co-precipitaron de modo que todas las cuentas fueron recubiertas con una mezcla de los dos plásmidos, asegurando la administración de ambos plásmidos a la misma célula. A menos que se indique lo contrario, tanto el antígeno como GMCSF fueron cargados en 0.5 µg/cartucho. Cuando se utilizaron dosis inferiores de antígeno, la carga GMCSF permaneció en 0.5 µg y el ADN total en el cartucho se ajustó a 1 µg utilizando plásmidos p7313 vacíos o pVAC vacíos. Las cuentas cargadas fueron recubiertas sobre tubería Tefzel tal como se describe, por ejemplo, en la Publicación de Eisenbraum y Asociados, 1993. DNA Cell Biol. 12:791-797; Pertmer y Asociados, 1996 J. Virol. 70:6119-6125). Se llevó a cabo bombardeo de partículas utilizando la administración de genes Accell (PCT WO 95/19799; incorporada a la presente invención como referencia). Se inmunizaron ratones C56BI/6 hembra con dos administraciones de plásmido en cada punto del tiempo tal como se detalla en la sección de resultados, uno en cada lado del abdomen después de rasurarse. La dosis total de ADN en cada punto del tiempo fue de 2 µg. Cuando se administró imiquimod, éste se suministró en forma tópica en una formulación en crema sobre el ciclo de inmunización, 24 horas después de la inmunización. Se aplicaron 20 µl de crema AldaraMR al 5% (3M) en cada sitio de inmunización. En el caso de minicerdos, se administraron en el abdomen (después de rasurarse) 4 inmunizaciones de 1 µg cada una. Recubrimiento en conjunto de oligonucleótidos CpG. Los oligonucleótidos CpG fueron recubiertos en conjunto sobre cuentas doradas utilizando la misma metodología que el recubrimiento en conjunto de plásmidos. Los oligos fueron mezclados con el ADN en una proporción de 10:1, oligo:plásmido. Hemos demostrado que el plásmido no es desplazado por los oligonucleótidos y se estima que el 10% del oligonucleótido es precipitado sobre las cuentas, dando como resultado una proporción de 1:1 en los cartuchos. El recubrimiento en conjunto con una proporción de 10:1 de oligo a plásmido, da como resultado una mayor incorporación del oligo en los cartuchos en comparación con una proporción de 1:1. Los ODNs utilizados en este estudio se describen en la tabla 1. Se sintetizaron PTO ODNs CpG1826 (CpG de estimulación) y GpC1745 (oligo no estimulador) y DNA ODNs mediante MWG-Biotech AG. Tabla 1. Lista de oligonucleótidos utilizados en este estudio.

Los residuos PTO (fosforotioato) están en letras cursivas; los motivos CpG/GpC se muestran con letras negritas. 2.2. Ensayos ELISPOT para respuestas de células T. Preparación de esplenocitos de ratón. Los bazos fueron obtenidos de ratones inmunizados 7 días después de la inmunización o en el punto de tiempo indicado en las figuras. Los bazos fueron procesados mediante molido entre correderas de vidrio para producir una suspensión de células. Se Usaron los glóbulos rojos mediante tratamiento con cloruro de amonio y se eliminaron los residuos para dejar una suspensión fina de esplenocitos. Las células se suspendieron nuevamente a una concentración de 4x106/ml en un medio completo RMPI para utilizarse en ensayos ELISPOT. Péptidos utilizados para estudios de múrido. Para ensayos OVA, el péptido SIINFEKL, un péptido CD8 dominante de OVA, se utilizó en ensayos a una concentración final de 50 nM para medir respuestas CD8 y el péptido TEWTSSNVMEERKIKV se utilizó en una concentración final de 10 µM para medir respuestas CD4. Para ensayos ICS, se utilizó también proteína de ovalbúmina para medir las respuestas CD4 en 1 mg/ml. Para ELISPOT, para detectar las respuestas al péptido P7313RNG, se utilizó el péptido CD8 AMQMLKETI para estimulación. Para detectar respuestas a Muc1, los péptidos CD4 GGSSLSYTNPAVAATSANL y GEKETSATQRSSVPS fueron utilizados en 10 µM y se utilizó el péptido CD8 SAPDNRPAL en 10 nM. Los péptidos 9-mer utilizados para seguir las respuestas CD8 a Gag y RT en ratones fueron AMQLKETI (Gag CD8) y YYPDSKDLI (RT CD8), respectivamente, y las respuestas CD4 a Gag y RT fueron seguidas utilizando IYKRWMLGLNKIVR (Gag CD4) y QWPLTEEKIKALVEI (RT CD4) respectivamente. También se probó el péptido EREVLEWRFDSRLAF (Nef 218). Estos péptidos fueron probados a una concentración final de 10 µM. Los péptidos fueron obtenidos de Genemed Synthesis, South San Francisco. Ensayo ELISPOT de IFNg e IL-2 de ratón. Se recubrieron placas con 15 µg/ml (en PBS) de IFNy de rata anti-ratón ó IL-2 de rata anti-ratón (Pharmingen). Las placas se recubrieron durante la noche a una temperatura de +4°C. Antes de utilizar las placas, fueron lavadas tres veces con PBS. Se agregaron esplenocitos a las placas en 4x105 células/depósito. El volumen total en cada depósito fue de 200 µl. Las placas que contienen las células estimuladas por péptido fueron incubadas durante 16 horas en un incubador humidificado a una temperatura de 37°C. Desarrollo de placas de ensayo ELISPOT. Las células fueron eliminadas de las placas lavando una vez con agua (con un enjuague de 1 minuto para asegurar la lisis de las células) y tres veces con PBS. El IFN? ó IL-2 de rata anti-ratón conjugado por biotina (Pharmingen), fue agregado a 1 µg/ml en PBS. Las placas fueron incubadas con agitación durante 2 horas a temperatura ambiente. Posteriormente las placas fueron lavadas tres veces con PBS antes de la adición de fosfatasa alcalina de Streptavidin (Caltag) a una dilución de 1/1000. Después tres lavados en PBS, los manchados fueron revelados mediante incubación con substrato BCICP (Biorad) durante de 15 a 45 minutos. El substrato fue lavado utilizando agua y las placas se dejaron secar. Los manchados se eliminaron utilizando un sistema de análisis de imagen de Brian Hayes, Unidad de Asthma Cell Biology, GSK o el lector AID Elispot (Cadama Biomedical, UK). 2.3. Citometría de flujo para detectar producción IFNy e IL-2 de células T de múrido en respuesta a estimulación con péptidos o proteína. Se alicuotaron 4 x 106 de esplenocitos por tubo de prueba, y se giraron para peletizar. El sobrenadante se eliminó y las muestras fueron vortizadas para el rompimiento del pellet. Se agregaron 0.5 µg de anti-CD28 + 0.5 µg de anti-CD49d (Pharmingen) a cada tubo, y se dejó incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se agregaron 1 ml de medio a tubos adecuados, que contenían ya sea medio solo, o medio con péptido o proteína en la concentración adecuada. Posteriormente las muestras se incubaron durante 1 hora a una temperatura de 37°C en un baño de agua caliente. Se agregaron 10 µg/ml de Brefeldin A, a cada tubo y la incubación a una temperatura de 37°C continuó durante 5 horas adicionales. Posteriormente el baño de agua programado regresó a una temperatura de 6°C, y se mantuvo a dicha temperatura durante la noche. Las muestras fueron teñidas posteriormente con CD4-PerCP anti-ratón (Pharmingen) y con CD8 APC anti-ratón. En los ejemplos p7313 RNG, se utilizaron el citocromo CD4 y biotina CD8 y las muestras fueron lavadas, y teñidas con streptavidin-ECD. Las muestras fueron lavadas y se agregaron 100 µl de Fixative del equipo "Intraprep Permeabilization Reagent" (Immunotech) durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después del lavado, se agregó a cada muestra 100 µl del reactivo de permeabilidad del equipo Intraprep con anti-IFN?-PE + anti-IL-2-FITC (Immunotech). Las muestras fueron incubadas a temperatura ambiente durante 15 minutos y fueron lavadas. Las muestras se suspendieron nuevamente en 0.5 ml de regulador y se analizaron en el citómetro de flujo. Se recolectó un total de 500,000 células por muestra y subsecuentemente se reunieron las células CD4 y CD8 para determinar las poblaciones de células que segregan IFNy y/o IL-2 en respuesta al estímulo. 2.4. Tinción y análisis del tetrámero. 100 µl de sangre completa o esplenocitos en suspensión se agregó a cada tubo. 5 µl del tetrámero H2-Kb SIINFEKL (Immunomics) etiquetado con Phycoeritherin (PE) se agregó durante 20 minutos a temperatura ambiente. Se agregó CD8-CyChrome ó APC anti-ratón y se dejó incubar durante 10 minutos adicionales. Si se analizaba la sangre completa, los glóbulos rojos fueron Usados con "solución de lisado de sangre completa" (Immunotech) siguiendo las instrucciones de los fabricantes. Después de lavar las muestras se resuspendieron en regulador y se analizaron en el citómetro de flujo. Se recolectaron 400,000 eventos por muestra. 3. Datos de minicerdos. Inmunización de minicerdos. Se inmunizaron minicerdos mediante la administración de cuatro cartuchos en el abdomen ventral. Catorce días después, se recolectaron muestras de sangre periférica para la preparación de células mononucleares de sangre periférica (BMC). Purificación de PBMC de porcino. Se recolectó sangre de porcino en heparina, se diluyó 2:1 en PBS y se hizo capa sobre Histopague (Sigma) en 50 ml de tubos Falcon. Los tubos fueron centrifugados a 1,200 g durante 30 minutos y los linfocitos de porcino fueron recolectados de la ¡nterfase. Se Usaron glóbulos rojos residuales utilizando regulador de lisis de cloruro de amonio. Las células fueron contadas y resuspendidas en medio RPMI completo a 2 x 106/ml. Ensayo ELISPOT IFNg de porcino. Las placas fueron recubiertas con 8 µg/ml (en PBS) IFNy anti-cerdo de ratón purificado, Biosource ASC4934). Las placas fueron recubiertas durante la noche a +4°C. Antes de utilizarse las placas fueron lavadas tres veces con PBS y bloqueadas durante 2 horas con medio RPMI completo. Se agregaron PBMC a las placas a 2x105 células/depósito. El volumen total en cada depósito fue de 200 µl. Se agregó proteína Gag, Nef, ó proteína RT recombinante (preparada en forma local) a una concentración final de 5 µg/ml. Se incubaron placas durante 16 horas en un incubador humidificado a una temperatura de 37°C. Desarrollo de placas de ensayo ELISPOT. Las células fueron eliminadas de las placas lavando una vez con agua (con un lavado de 1 minuto para asegurar la lisis de las células) y tres veces con PBS. Se agregó IFNy anti-porcino conjugado por biotina en 0.5 µg/ml en PBS. Las placas fueron incubadas con agitación durante 2 horas a temperatura ambiente. Posteriormente las placas fueron lavadas tres veces con PBS antes de la adición de fosfatasa alcalina de estreptavidin (Caltag) a una dilución de 1/1000. Después de tres lavados en PBS, los manchados fueron revelados mediante incubación con substrato BCICP (Biorad) durante de 15 a 45 minutos. El substrato fue lavado utilizando agua y las placas se dejaron secar. Los manchados se enumeraron utilizando el lector AID Elispot (Cadama Biomedical, UK). 3. Resultados Imiquimod incrementa la respuesta inmune. Los ratones fueron inmunizados con PMID con 2x0.5 µg p731-RNG (GW825780X) o el vector vacío de control. Cuando es relevante, se frotó 20 µl de crema AldaraMR al 5% (3M) en cada área de inmunización. La crema AldaraMR fue aplicada 24 horas después de la inmunización. Los bazos fueron recolectados 14 días después de la inmunización y las respuestas celulares fueron analizadas mediante Elispot IFN? después de la estimulación con péptido GAG balb/c CD8: AMQMLKETI. Los resultados se muestran en la figura 5. Los datos comparan la administración de imiquimod de 0 horas ó 24 horas después de la inmunización y muestra que la aplicación 24 horas después de la inmunización tiene un buen efecto adyuvante. Datos in vitro para demostrar activación de TLRs en respuesta a estímulos inflamatorios. Análisis Taqman de expresión TLR en DC tratado con IFNy.

Se aislaron monocitos de PBMC de 3 donantes saludables se cultivaron con IL-4 y GM-CSF durante 7 días para inducir la diferenciación para DC inmaduro.

Posteriormente los DC fueron tratados con IFNy durante 24 horas. Posteriormente se midió la expresión de mARN de TLR 1-9 mediante Taqman. Los resultados se muestran en la figura 6. En contraste con los reportes publicados hemos demostrado que los bajos niveles de TLR7 se expresan en forma constitutiva en DC derivado de monocitos. Después del tratamiento IFNy, la expresión de TLR8 y los niveles incrementados de expresión de TLR7 se encontraron en los tres donantes. TLR2 también fue activado pero a un menor grado. El incremento en la expresión TLR7 24 horas después de la estimulación in vitro, proporciona una explicación de los resultados en la figura 5, que muestran el buen efecto de imiquimod a las 24 horas posteriores a la inmunización. IFN? incrementa la respuesta de De a resiquimod. También investigamos las respuestas de las células de estos donantes a resiquimod. Se aislaron DC y se cultivaron con GMCSF tal como se indicó anteriormente. Los DC fueron tratados posteriormente con IFNy durante 24 horas, o se dejaron sin tratar, antes del tratamiento con resiquimod. Los niveles de citocina producida y la expresión de marcador en la superficie fueron medidos. Los resultados se muestran en la figura 7. Se descubrió que el tratamiento previo con IFN? incrementó la respuesta de estos DC a resiquimod. Se aumentó el proceso de maduración, dando como resultado incrementos en la expresión de marcadores de superficie celular, producción de citocina y capacidad funcional de los DC. Estos resultados indican que TLR7 y TLR8 están involucrados en la respuesta a resiquimod en DC derivados de monocito humano, soportando nuevamente la administración de imiquimod 24 horas después de la inmunización.

La co-administración de GMCSF y la aplicación de imiquimod, aumenta las respuestas celulares a p7313VAcyt después de inmunización primaria. Se evaluaron las respuestas celulares después de la inmunización con OVAcyt y las combinaciones con p7313GMCSF e imiquimod, mediante ELISPOT después de una inmunización primaria mediante PMID en el día 0. Se cargaron cartuchos con 0.5 µg p7313VAcyt y 0.5 µg p7313GMCSF o control de vector vacío. La dosis de ADN total por ratón produjo 2 disparos que fueron de 2 µg. Las condiciones de ensayo fueron: estimulación con SIINFEKL, un péptido CD8 de alta afinidad, o TEWTSSNVMEERKIKV, que contiene un epítope CD4. Los resultados de los ensayos Elispot se muestran en la figura 8, que muestra los efectos adyuvantes cuando se suministran ya sea GMCSF ó imiquimod con p7313 OVAcyt. Los análisis se llevaron a cabo el día 7 posterior a la inmunización. En el grupo de OVA + GMCSF + imiquimod, los depósitos en el Elispot CD8 IFN? contenían más manchados de los que pudieron distinguirse para conteo, lo que representa un gran ¡ncremento ya sea de GMCSF o imiquimod solos. El otro parámetro que fue mejorado en forma significativa en comparación con inmunización con p7313OVAcyt solo, fue el número de células CD4 y la proporción de células CD4 que segregan IFN?.

En experimentos adicionales siguiendo el mismo programa de inmunización, se evaluaron las respuestas celulares después de la inmunización con OVAcyt y las combinaciones con p7313GMCSF e imiquimod mediante citometría de flujo, ya que esto tiene la capacidad de medir un mayor rango de respuestas. Los ensayos se llevaron a cabo en esplenocitos a los días 7, 14, y 21 posteriores a la inmunización. Las condiciones de ensayo fueron la estimulación con péptido SIINFEKL, un péptido CD8 de alta afinidad o proteína de ovalbúmina que estimula células tanto CD4 como CD8. Los ensayos que se llevaron a cabo fueron tinción con citocina intracelular para frecuencia de células CD4 y CD8 que segregan IFN? e IL-2, y tinción con tetrámero SIINFEKL Kb para determinar la frecuencia total de células CD8 que responden. La figura 9 muestra las respuestas medidas mediante tinción con tetrámero en los días 7, 14, y 21 posteriores a la inmunización primaria. De acuerdo con el experimento anterior, se descubrió que la combinación de GMCSF e imiquimod indujo a una mayor frecuencia de células CD8 específicas de SIINFEKL, que cualesquiera de estos solos. La figura 10 muestra la proporción de células CD4 y CD8 que segregan IFN? y/o IL-2. De acuerdo con los resultados Elispot, la combinación de GMCSF e ¡miquimod indujo las respuestas más potentes. Este fue el caso para la secreción de citocinas a partir de células tanto CD8 como CD4. En particular, se aumentó en gran medida el número de células CD4 que segregan tanto IFNy como IL-2. Aplicación de ¡miquimod en la presencia o ausencia de co-administración GMCSF, aumenta las respuestas celulares a p7313VAcyt después de inmunización de primera vez o refuerzo. Los ratones fueron inmunizados los días 0 y 28 con p7313OVAcyt. Esto se administró solo o se administró en conjunto con p7313GMCSF, con algunos grupos habiéndoseles administrado aplicación de imiquimod a las 24 horas posterior a la inmunización. Para programas de inmunización con una inmunización de primera vez y de refuerzo, la dosis de p7313OVAcyt fue reducida a 0.05 µg/cartucho. Cuando estuvo presente p7313GMCSF fue suministrado a 0.5 µg/cartucho. Los bazos fueron recolectados al día 7 después del refuerzo y analizados mediante Elispot seguido de la estimulación durante la noche con péptido CD4 y CD8 de ovalbúmina. Se encontró que la co-administración de GMCSF combinado con la administración de imiquimod a las 24 horas, aumentó las respuestas celulares y en particular la producción de IFN? a través de células CD4 y CD8 comparados con Ova solo. Efecto de GMCSF e imiquimod en respuestas celulares a Mud.

Se llevaron a cabo experimentos para determinar el efecto de GMCSF e imiquimod en respuestas a pVAC7VNTR Mud. Los ratones fueron inmunizados los días 0 y 21 con pVAC7VNTR mud. Esto se administró solo, se administró en conjunto con p7313GMCSF ó con p7313GMCSF y aplicación de imiquimod a las 24 horas posteriores a la inmunización. Los bazos fueron recolectados al día 7 después del refuerzo y analizados mediante Elispot seguido de estimulación durante la noche con péptido CD4 Mud. Se descubrió que la administración en conjunto ya sea de p7313 GMCSF o aplicación de imiquimod mejoró las respuestas CD4 en comparación con inmunización pVAC7VNTRMuc1 sola. La co-administración de GMCSF combinada con la administración de imiquimod a las 24 horas, mejoró las respuestas en forma adicional (figura 12).

Se llevaron a cabo experimentos adicionales para investigar el efecto de GMCSF e imiquimod en respuestas Mud. Para experimentos de rompimiento de tolerancia, se utilizaron ratones Muc Sacll los cuales son transgénicos para Muc1 de humano. Estos ratones son generados en el antecedente CBA/C57/bl6, de modo que los ratones con este antecedente fueron utilizados como controles. Los ratones CBA/C57/bl6 F1 o los ratones Sacll fueron inmunizados con pVac vacío, pVac7VNTRMuc ó PVAC7VNTR-PADRE administrado en conjunto ya sea con o sin co-administración GMCSF. Los grupos GMCSF tuvieron aplicación de imiquimod 24 horas más tarde. Los ratones fueron inmunizados los días 0, día 28, día 42, y recogidos el día 49. La secreción de IFNg e IL-2 de las células CD4, se midió mediante Elispot de IFNg e IL-2 seguido de estimulación con péptidos CD4 Mud GGSSLSYTNPAVAATSANL (298) y GEKETSATQRSSVPS (192) ó péptido PADRE AKFVAAWTLKAAA. También se midió la secreción de IFNg e IL-2 utilizando ICS, utilizando la misma estimulación. Las respuestas en los grupos de ratones tipo natural que recibieron p7313 GMCSF e imiquimod, tuvo las respuestas CD4 más altas. Esto fue real para respuestas al péptido padre o péptido Mucl. Los ratones Sacll inmunizados con 7VNTRMuc1 + GMCSF/imiquimod tuvieron respuestas CD4 Mud al péptido GGSSLSYTNPAVAATSANL (298), de modo que la tolerancia se rompió en estos ratones. Los ratones Salí inmunizados con pVac7VNTR PADRE + imiquimod GMCSF tuvieron una mayor respuesta a PADRE (24% de células CD4), pero no hubo rompimiento de tolerancia Mucl. Esto puede ser debido a la inmunodominación de la respuesta PADRE sobre la respuesta Muc1 (figura 13). En un experimento adicional utilizando un protocolo idéntico (figura 14), los ratones Sacll fueron inmunizados con pVac vacío, pVac7VNTRMuc1 , PVAC7VNTR-PADRE ó PVAC7VNTR HepB administrado en conjunto ya sea con o sin co-administración GMCSF. En este experimento, las respuestas CD4 a HepB y PADRE fueron aumentadas en la presencia de GMCSF e imiquimod y la tolerancia CD4 al péptido CD4 Mud 298 fue rota a través de la construcción 7VNTR y la construcción 7VNTRHepB. GMCSF e imiquimod aumenta respuestas a antígenos VIH codificados por plásmido p7313RNG. Se inmunizaron ratones Balb/c hembra (K2d) administrando dos cartuchos mediante PMID utilizando un aparato de investigación Powderject. Se utilizaron dos dosis de antígeno, 0.5 y 0.05 µg por cartucho. Cuando fue adecuado, las 24 horas posteriores a la inmunización, se aplicó imiquimod. Se recogieron 3 ratones por grupo a los 7 días después de la inmunización y los bazos fueron eliminados para análisis de respuestas celulares mediante ensayo Elispot. Los péptidos 9-mer utilizados para seguir las respuestas CD8 a Gag y RT, fueron AMQLKETI (Gag CD8), respectivamente, y las respuestas CD4 a Gag y RT fueron seguidas utilizando IYKRWIILGLNKIVR (Gag CD4) y QWPLTEEKIKALVEl (RT CD4), respectivamente. También se probó el péptido EREVLEWRFDSRLAF (Nef 218). Las respuestas a Gag y RT de los péptidos CD4 y CD8, fueron aumentadas hasta el mayor punto en la presencia de GMCSF combinado con imiquimod, en comparación cualesquiera de estos solos.

Estos resultados están de acuerdo con los datos de ovalbúmina y Muc1, en donde la combinación de GMCSF/imiquimod tiene un fuerte efecto en células CD4 específicamente. Los oligonucleótidos GMCSF y CpG aumentan las respuestas a p7313OVA después de inmunización primaria. Los ratones C57/bl6 fueron inmunizados mediante PMID utilizando cartuchos recubiertos con OVAcyt y combinaciones de CpG 1826, CpG1745, y GMCSF tal como se muestra en las etiquetas de eje en la gráfica. La generación de los cartuchos se describe en la sección de Materiales y Métodos. Cuando se indicó, los ratones fueron tratados con ¡miquimod tópico (AldaraMR) 24 horas posterior a la inmunización. Todos los ratones fueron recogidos 7 días después de la inmunización y se analizaron los esplenocitos. Se utilizó el péptido SIINFEKL para medir respuestas CD8 (10 nM) y el péptido TEWTSSNVMEERIKV (10 µm) fue utilizado para medir respuestas CD4 (figura 16). El recubrimiento en conjunto de CpG oligo 1826 con p7313OVAcyt, demostró tener un efecto positivo en respuestas CD8 tal como se mide a través del péptido SIINFEKL. CpG 1745, el oligo de control negativo tuvo un efecto adyuvante no específico, aunque este fue altamente reducido en comparación con 1826. La sinergia del ligando TLR y CpG 1826 con GMCSF fue similar al que se encontró con imiquimod. GMCSF e ¡miquimod aumentan respuestas citotóxicas a p7313OVA después de inmunización primaria. Los ratones C57/bl6 fueron inmunizados ya sea con OVAcyt o OVAcyt+GMCSF a través de PMID. A las 24 horas posteriores a la inmunización, imiquimod se aplicó en el sitio de inmunización. A los 7 días de la inmunización primaria los esplenocitos de los tres ratones en cada grupo, fueron reunidos y se midió la citotoxicidad a través de ensayos de citotoxicidad in vitro, tal como se describió en la sección de Materiales y Métodos. Los ensayos se llevaron a cabo tanto directamente ex vivo como después de una expansión de 7 días. En ambas condiciones, se encontró la mayor citotoxicidad en el grupo GMCSF + imiquimod que muestra que el incremento en números de células T que responden es funcionalmente relevante (figura 17). El efecto de GMCSF e imiquimod en respuestas citotóxicas a p7313OVA, después de inmunización primaria también fue medido a través de ensayos de citotoxicidad in vivo (figura 18). Los ratones C57/bl6 fueron inmunizados ya sea con OVAcyt a través de OVAcyt + GMCSF a través de PMID. A las 24 horas posteriores a la inmunización, se aplicó ¡miquimod en el sitio de inmunización. A los días 7, 14, 21, y 42 posteriores a la inmunización, los ratones fueron inyectados i.v. con esplenocitos etiquetados con CSFE que consisten en péptido SIINFEKL pulsado y no pulsado en números iguales. Después de 2 horas se analizó la sangre mediante citometría de flujo y la proporción de las células pulsadas y no pulsadas restantes, fue calculada para producir un valor numérico de citotoxicidad. Aunque imiquimod solo y GMCSF/imiquimod proporcionaron un claro beneficio con respecto a OVA solo, no hubo una diferencia clara entre estos grupos cuando se utilizaron tres ratones por grupo. Por esta razón se establecieron experimentos adicionales en los cuales se compararon 6 ó 7 ratones por grupo. En este experimento, se encontró una clara diferencia en el porcentaje de lisis específica entre los grupos, en donde todos los ratones en el grupo GMCSF + imiquimod mostraron una mayor lisis específica que aquéllos en los que imiquimod era el único grupo (figura 19b). Rompimiento de tolerancia en ratones RIP OVA o con GMCSF + imiquimod Se utilizaron ratones RIP OVAlo para probar el potencial de rompimiento de tolerancia de la combinación GMCSF + imiquimod (figura 20). Los ratones RIP OVAlo expresan ovalbúmina (OVA) en las células beta que producen insulina del páncreas y por consiguiente son tolerantes a esta molécula. La interrupción de esta tolerancia dio como resultado la destrucción autoinmune de las células beta, lo que conduce a la diabetes que puede ser fácilmente monitoreada a través de la medición del nivel de glicosuria y de glucosa en la sangre. Los ratones RIPova y C57/BL6 (grupo de control de peso) recibieron cuatro inmunizaciones con vector vacío u OVAcyt (utilizando PMID), +_ GM-CSF (utilizando PMID), y +_ imiquimod. Se administraron inmunizaciones en intervalos de tres semanas. El ¡miquimod se aplicó en forma tópica en el sitio de inmunización 24 horas posteriores a PMID. Siete días después de la última inmunización, se tomaron muestras de esplenocitos y suero. Se monitoreó la producción de IFN? e IL-2 en células T CD4+ a través de tinción de citocina intracelular en esplenocitos estimulados nuevamente con el péptido TEWTSSNVMEERIKV. Se monitoreó la producción IFN? e IL2 en células T CD8+ a través de tinción de citocina intracelular en esplenocitos estimulados nuevamente con el péptido SIINFEKL. Se llevó a cabo el análisis de tetrámero Kb SIINFEKL de células T CD8+ en esplenocitos. Los resultados muestran que se requiere el rompimiento de tolerancia CD4 de GMCSF + imiquimod (figura 20A). En el caso de las células CD8, existen respuestas en los grupos de GMCSF solo e imiquimod solo, pero las respuestas son mayores en el grupo de GMCSF + imiquimod. Este también es el caso cuando las respuestas CD8 son monitoreadas mediante tetrámero (figura 20C). La prueba funcional de rompimiento de tolerancia en este modelo, es el desarrollo de diabetes. Esto se mide a través de niveles de glucosa en la orina. Utilizando esta prueba, el programa de inmunización combinando GMCSF e imiquimod es claramente superior (figura 20E). Este experimento mostró la importancia de la inclusión de GMCSF en programas que comprenden refuerzos múltiples, cuando el objeto es romper la tolerancia incluyen la generación de respuestas funcionales. GM-CSF e imiquimod mejora las respuestas primarias a p7313RNG (GW825780X) en minicerdos. Se inmunizaron minicerdos Gottingen con 4 administraciones (es decir, 4 cartuchos) en abdomen ventral. Cada cartucho estuvo compuesto de 0.5µ p7313RNG y 0.5 µg ya sea de p7313vacío ó p7313GMCSF (tal como se detalla en la leyenda de la figura 21). Catorce días después de la inmunización inicial, se muestreó la sangre, se purificaron PBMC y se determinaron los números de células que segregan IFNy específico de antígenos mediante ELISPOT (figura 21). Los resultados muestran que existe un efecto adyuvante transmitido por la combinación de GMCSF + imiquimod, el cual es mayor que el que es transmitido ya sea por GMCSF ó por imiquimod solos. Los inventores de la presente invención han determinado que la ventaja de un adyuvante que comprende el nucleótido que codifica GM-CSF, junto con un agonista TLR, es que el sistema de adyuvante de la presente invención conduce a una activación y maduración total de las células dendríticas. Esto a su vez, conduce a una respuesta inmune muy mejorada contra un antígeno codificado por una secuencia de nucleótidos. Esta mejoría puede medirse a través de los números de células específicas y actividad citotóxica. Además, se reduce en gran parte el riesgo de tolerancia del sistema inmune a un antígeno o que propicie una anergia. Además, el sistema de adyuvante tiene la capacidad de superar la tolerancia a auto-antígenos codificados por secuencias de nucleótidos, cuando se administran como una serie de inmunizaciones.

Claims

R E I V I N D I C A C I O N E S 1. Una composición adyuvante que comprende: (i) un agonista TLR, o un secuencia de nucleótidos que codifica un agonista TLR; y (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica GM¬
CSF. 2. La composición adyuvante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la secuencia de nucleótidos que codifica el componente (i) y la secuencia de nucleótidos que codifica el componente (ii), están comprendidas o consisten en la misma molécula de polinucleótidos.
3. La composición adyuvante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la secuencia de nucleótidos que codifica el componente (i) y la secuencia de nucleótidos que codifica el componente (ii), están codificadas por secuencias de nucleótidos que están comprendidas o consisten en diferentes moléculas de nucleótidos.
4. La composición adyuvante de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque la secuencia de nucleótidos es una secuencia de ADN.
5. La composición adyuvante de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la secuencia de nucleótidos o la molécula de polinucleótido está codificada dentro de un plásmido de ADN.
6. La composición adyuvante de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el componente adyuvante (i) es una secuencia de nucleótidos que codifica una o más de las siguientes moléculas, o un componente del mismo, con la capacidad de actuar como un agonista TLR: ß-defensina; HSP60; HSP70; HSP90; fibronectina; y proteína de flagelina.
7. La composición adyuvante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el componente adyuvante (i) es uno o más de los siguientes, o un componente del mismo, con la capacidad de actuar como un agonista TLR: un agonista TLR-1 tal como: lipopéptidos tri-acilados (LPs); modulina soluble en fenol; tuberculosis Mycobacterium LP; S-(2,3-bis(palmitoiloxi)-(2-RS)-propil)-N-palmitoil-(R)-Cys-(S)-Ser-(S)-Lys(4)-OH; LP de triclorhidrato (Pam3Cys); ó LP OspA; un agonista TLR-2 tal como: un lipopéptido bacteriano de tuberculosis M, B. burgdorferi o T pallidum; peptidoglicanos de especies que incluyen Staphylococcus aureus; ácidos lipoteicoicos, ácidos manurónicos, porinas Neisseria, fimbrias bacteriana, factores de virulencia Yersina, viriones CMV, hemaglutinina de paperas o zymosan de levadura; un agonista TLR-3, tal como: ARN de hebra doble, o ácido poli-inosínico-policitidílico (Poly IC); un agonista TLR-4 tal como: un lipopolisacárido (LPS) de una bacteria gram-negativa; proteína de impacto por calor 10, 60, 65, 70, 75, ó 90; proteína A de tensoactivo, oligosacáridos de hialuronan, fragmentos de sulfato de heparan, fragmentos de fibronectina, péptidos de fibrinogén, b-defensina-2 o un derivado no tóxico de LPS tal como lípido A de monofosforilo (MPL); un agonista TLR-5 tal como: flagelina bacteriana; un agonista TLR-6 tal como: lipoproteína micobacteriana, LP di-acilado o modulina soluble en fenol; un agonista TLR-7 tal como: loxorribina, un análogo de guanosina en las posiciones N7 y C8, o un compuesto de imidazoquinolina o derivado del mismo tal como imiquimod o resiquimod; un agonista TLR-8 tal como: una molécula de ¡midazoquinolina con una actividad antiviral tal como resiquimod; un agonista TLR-9 tal como: HSP90 ó ADN que contiene nucleótidos CpG no metilados, en contextos de secuencias particulares conocidos como motivos CpG.
8. La composición adyuvante de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque la imidazoquinolina o derivado de la misma es un compuesto definido por cualesquiera de las fórmulas I a VI, tal como se define en la presente especificación.
9. La composición adyuvante de conformidad con la reivindicación 7 u 8, caracterizada porque la imidazoquinolina o derivado de la misma es un compuesto definido por la fórmula VI, tal como se define en la presente especificación.
10. La composición adyuvante de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 7 a 9 en la imidazoquinolina o derivado de la misma, caracterizada porque es un compuesto de la fórmula VI seleccionado del grupo que consiste en: 1-(2-met¡lpropil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-am¡na; 1-(2-hidroxi-2-metilpropil)-2-metil-1H-imidazo[4,5-cjquinolin-4-amina; 1-(2-hidroxi-2-met¡lprop¡l)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina; 1-(2-hidroxi-2-metilpropil)-2-etoximetil-1-H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina.
11. La composición adyuvante de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 7 a 10, caracterizada porque la imidazoquinolina o derivado de la misma es imiquimod.
12. La composición adyuvante de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 7 a 10, caracterizada porque la imidazoquinolina o derivado de la misma es resiquimod.
13. La composición adyuvante de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1, ó 3 a 12, caracterizada porque el componente (i) está proporcionando una composición separada a la del componente (ii) para administración concomitante o en secuencias.
14. Una composición adyuvante de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque el componente (i) es una imidazoquinolina administrada en forma tópica.
15. Una composición adyuvante de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque el componente (i) es administrado entre 12 y 26 horas después del componente (ii).
16. Una composición o composiciones inmunogénicas que comprenden una composición adyuvante de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones anteriores, y (iii) un componente de inmunógeno que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido o proteína antigénica.
17. Una composición inmunógenica de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque el componente (i) está codificado por una secuencia de nucleótidos, y en donde las secuencias de nucleótidos que codifican los componentes (i), (ii), y (Mi) están comprendidas o consisten en la misma molécula de polinucleótidos.
18. Una composición o composiciones inmunogénicas de conformidad con la reivindicación 16, caracterizadas porque el componente (i) está codificado por una secuencia de nucleótidos, en donde las secuencias de nucleótidos que codifican los componentes (i), (ii), y (iii) están comprendidas o consisten en moléculas de polinucleótidos separadas, para administración concomitante o en secuencias.
19. Una composición o composiciones inmunogénicas de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque el componente (i) está codificado por una secuencia de nucleótidos, y en donde las secuencias de nucleótidos que codifican cualesquiera de los componentes (i), (¡i), y (iii) están comprendidas o consisten en la misma molécula de polinucleótidos, y la secuencia de nucleótidos restante está codificada dentro de una molécula de polinucleótido adicional, para administración concomitante o en secuencias.
20. Una composición o composiciones inmunogénicas de conformidad con la reivindicación 19, caracterizadas porque las secuencias de nucleótidos que codifican los componentes (ii) y (iii), están comprendidas o consisten en la misma molécula de polinucleótidos, y la secuencia de nucleótidos que codifica el componente (i) está codificada dentro de una molécula de polinucleótidos adicional, para administración concomitante o en secuencias.
21. Una composición o composiciones inmunogénicas de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 16 a 19, caracterizadas porque la secuencia de nucleótidos es una secuencia de ADN.
22. Una composición o composiciones ¡nmunogénicas de conformidad con la reivindicación 21, caracterizadas porque la secuencia de nucleótidos o molécula de polinucleótidos está codificada dentro de un plásmido de ADN.
23. Una composición o composiciones inmunogénicas de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 16 a 22, caracterizada porque la secuencia de nucleótidos codifica una proteína P501S o derivado que tiene la capacidad de elevar in vivo una respuesta inmune, teniendo la respuesta inmune la capacidad de reconocer una célula de tumor o tumor que expresa P501S.
24. Una composición o composiciones inmunogénicas de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 16 a 22, caracterizada porque la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína MUC-1 o derivado que tiene la capacidad de elevar in vivo una respuesta inmune, teniendo la respuesta inmune la capacidad de reconocer una célula de tumor o tumor que expresa MUC-1.
25. Una composición o composiciones inmunogénicas de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque la proteína MUC-1 ó derivado está desprovista de cualesquiera unidades de repetición (perfectas o imperfectas).
26. Una composición o composiciones inmunogénicas de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque la proteína MUC-1 ó derivado, está desprovista de cualesquiera unidades de repetición perfectas.
27. Una composición o composiciones inmunogénicas de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque la proteína MUC-1 ó derivado, contienen entre 1 y 15 unidades de repetición
28. Una composición o composiciones ¡nmunogénicas de conformidad con la reivindicación 24, caracterizadas porque la proteína MUC-1 ó derivado contiene 7 unidades de repetición perfectas.
29. Una composición o composiciones inmunogénicas de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 24 a 28, caracterizada porque la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína MUC-1 ó derivado, está modificada con codón.
30. Una composición o composiciones inmunogénicas de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 24 a 29, caracterizada porque la secuencia de nucleótidos que codifica la región de repetición no perfecta tiene un RSCU de al menos 0.6.
31. Una composición o composiciones inmunogénicas de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 24 a 30, caracterizada porque la secuencia de nucleótidos que codifica las unidades de repetición no perfectas de la proteína MUC-1 ó derivado tiene un nivel de identidad con respecto al ADN MUC-1 tipo natural sobre las regiones sin repetición correspondientes de al menos el 85%.
32. Una composición o composiciones inmunogénicas de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 24 a 31, caracterizada porque la proteína MUC-1 ó derivado contiene repeticiones alteradas (unidades VNTR), tal como mutantes de glucosilación reducida.
33. Una composición o composiciones inmunogénicas de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 24 a 32, caracterizadas porque la proteína MUC-1 ó derivado es una proteína de fusión o está conjugada con epítopes de célula-T externos.
34. Una composición o composiciones inmunogénicas de conformidad con la reivindicación 33, caracterizadas porque la proteína MUC-1 ó derivado es una proteína de fusión o está conjugada con P2 ó P30, o fragmentos de los mismos.
35. Una composición o composiciones inmunogénicas de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque los epítopes de célula-T externos están incorporadas dentro, o en cualquier extremo de la proteína MUC-1 ó derivado.
36. Una composición de vacuna que comprende una composición o composiciones de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 16 a 35, y un vehículo(s), diluyente(s), ó excipiente(s) farmacéuticamente aceptables.
37. Un proceso para la fabricación de una composición inmunogénica que comprende mezclar los componentes adyuvantes (i) y (¡i) de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 15 con un componente de inmunógeno (iii) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido o proteína antigénica.
38. Un proceso de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque el componente adyuvante (i) está codificado por una secuencia de nucleótidos.
39. Un proceso de conformidad con las reivindicaciones 37 ó 38, caracterizada porque la molécula de nucleótidos que codifica el componente adyuvante (ii) está mezclada con nucleótidos que codifican el componente de inmunógeno (iii), y el componente adyuvante (i) está proporcionado en una composición separada para administración concomitante o en secuencias.
40. Un proceso de conformidad con la reivindicación 37 ó 38, caracterizado porque la molécula de nucleótidos que codifica el componente adyuvante (ii) está codificado en conjunto con el nucleótido que codifica el componente de inmunógeno (iii) para formar una sola molécula de polinucleótidos, y el componente adyuvante (i) está proporcionado en una composición separada para administración concomitante o en secuencias.
41. Un proceso de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque las secuencias de nucleótidos que codifican los componentes (i), (ii), y (¡ii) están codificadas dentro de moléculas de polinucleótidos separados para administración concomitante o en secuencias.
42. Un proceso de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque las secuencias de nucleótidos que codifican cualesquiera de los dos componentes (i), (ii), y (iii) están codificadas en conjunto para formar una sola molécula de polinucleótidos, y la secuencia de nucleótidos restante está codificada dentro de una secuencia de polinucleótidos adicional para administración concomitante o en secuencias.
43. Un proceso de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque las secuencias de nucleótido que codifican los componentes (i), (ii), y (iii) están codificadas en conjunto para formar una sola molécula de polinucleótidos.
44. Un proceso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 37 a 43, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos es ADN.
45. Un proceso de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos está codificada dentro del ADN de plásmido.
46. Un proceso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 37 a 40, caracterizado porque las moléculas de de nucleótidos que codifican los componentes (ii) y (iii) están incorporadas dentro de un plásmido, y el componente adyuvante (i) está proporcionando una composición separada para administración concomitante o en secuencias.
47. Un proceso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 37 a 46, caracterizado porque los componentes están incorporados dentro de excipientes, diluyentes o vehículos farmacéuticamente aceptables.
48. Una composición o composiciones farmacéuticas que comprenden una composición adyuvante de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 15; un componente de inmunógeno (iii) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido o proteína antigénica; y uno o más excipientes, diluyentes o vehículos farmacéuticamente aceptables.
49. Una composición o composiciones farmacéuticas que comprenden una composición o composiciones inmunogénicas de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 16 a 35, y excipientes, diluyentes o vehículos farmacéuticamente aceptables.
50. Un equipo que comprende una composición farmacéutica que comprende un componente adyuvante (ii); un componente de inmunógeno (iii), y un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable; y una composición farmacéutica adicional que comprende el componente adyuvante (i), y un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable, en el cual: el componente adyuvante (i) comprende un agonista TLR, o un nucleótido que codifica un agonista TLR; el componente adyuvante (ii) comprende un nucleótido que codifica GMCSF; y el componente de inmunógeno (iii) comprende una-secuencia de nucleótidos que codifica un péptido o proteína antigénica.
51. Una composición o composiciones farmacéuticas de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 48 a 50, caracterizada porque al menos un vehículo es una cuenta de oro y al menos una composición farmacéutica se puede adaptar para ser suministrada a través de administración de fármacos transmitida por partículas.
52. Una composición o composiciones farmacéuticas de conformidad con la reivindicación 51, caracterizada porque el vehículo de los componentes (ii) y (iii), es una cuenta de oro y el componente adyuvante (i) está formulado para administración concomitante o en secuencias.
53. Un método para tratar a un paciente que padece de o que es susceptible a un tumor, a través de la administración de una cantidad segura y efectiva de una composición ¡nmunogénica, de vacuna o farmacéutica de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 16 a 36 ó 48 a 52.
54. Un método para tratar a un paciente de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque el tumor es un tumor que expresa MUC-1.
55. Un método para tratar a un paciente de conformidad con la reivindicación 53 ó 54, caracterizado porque el tumor es carcinoma de seno; carcinoma de pulmón, incluyendo carcinoma de pulmón de célula no pequeña; o carcinomas de próstata, gástricos u otros carcinomas gastrointestinales.
56. Un método para incrementar una respuesta inmune de un mamífero a un antígeno, en donde el método comprende administrar los siguientes componentes: (i) un agonista TLR, o un nucleótido que codifica un agonista TLR; (ii) un nucleótido que codifica GM-CSF; y (¡ii) un componente de inmunógeno que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido o proteína antigénica.
57. Un método para incrementar una respuesta inmune de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado porque el método comprende la administración concomitante de cualesquiera de dos de los componentes (i), (ii), y (iii) y la administración en secuencias del componente restante.
58. Un método para incrementar una respuesta inmune de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado porque el método comprende la administración en secuencias de los componentes (i), (ii), y (¡ii).
59. Un método para incrementar una respuesta inmune de un mamífero a un antígeno de conformidad con las reivindicaciones 56 ó 57, caracterizado porque los componentes para administración concomitante se formulan en composiciones separadas.
60. Una composición inmunógenoica que comprende, los siguientes componentes, en la fabricación de un medicamento para utilizarse en el tratamiento o profilaxis de tumores que expresan MUC-1: (i) un agonista TLR, o un nucleótido que codifica un agonista TLR; (ii) un nucleótido que codifica GM-CSF; y (iii) un componente de inmunógeno que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido o proteína antigénica.
61. Un método para elevar una respuesta inmune en un mamífero contra un estado de enfermedad, en donde el método comprende administrar al mamífero dentro de un vector adecuado, una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido antigénico asociado con el estado de enfermedad; administrar en forma adicional al mamífero dentro de un vector adecuado, una secuencia de nucleótidos que codifica GM-CSF; y administrar en forma adicional al mamífero una imidazoquinolina o derivado de la misma para elevar la respuesta inmune.
62. Un método para incrementar la respuesta inmune de un mamífero a un inmunógeno, en donde el método comprende el paso de administrar al mamífero dentro de un vector adecuado, una secuencia de nucleótidos que codifica el inmunógeno en una cantidad efectiva para estimular una respuesta inmune y una secuencia de nucleótidos que codifica GM-CSF; y administrar en forma adicional al mamífero una imidazoquinolina o derivado de la misma en una cantidad efectiva para incrementar la respuesta inmune en un punto del tiempo de entre 12 y 36 horas después de la administración de la secuencia de nucleótidos que codifica el inmunógeno y una secuencia de nucleótidos que codifica GM-CSF.
63. El uso de una imidazoquinolina o derivado de la misma y GM-CSF en la fabricación de un medicamento para aumentar respuestas inmune iniciadas por un péptido o proteína antigénica, siendo expresado el péptido o proteína antigénica como resultado de la administración a un mamífero de una secuencia de nucleótidos que codifica el péptido.
64. El uso de los siguientes componentes (i), (¡i), y (iii) en la fabricación de un medicamento para aumentar una respuesta inmune a un antígeno codificado por una secuencia de nucleótidos: (i) un agonista TLR, o un nucleótido que codifica un agonista TLR; (ii) un nucleótido que codifica GM-CSF; y (iii) un componente de inmunógeno que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido o proteína antigénica.
65. El uso de los siguientes componentes (i) a (iii) en la fabricación de dos o más medicamentos para administración concomitante o en secuencias a un mamífero para el aumento de una respuesta inmune a un antígeno codificado por una secuencia de nucleótidos: (i) un agonista TLR, o un nucleótido que codifica un agonista TLR; (ii) un nucleótido que codifica GM-CSF; y (iii) un componente de inmunógeno que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido o proteína antigénica.
66. El uso de los siguientes componentes (i) a (iii) en la fabricación de medicamentos para la administración concomitante o en secuencias a un mamífero para aumentar una respuesta inmune a un antígeno codificado por una secuencia de nucleótidos, en donde cada componente se formula en un medicamento separado: (i) un agonista TLR, o un nucleótido que codifica un agonista TLR; (ii) un nucleótido que codifica GM-CSF; y (¡ii) un componente de inmunógeno que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido o proteína antigénica. R E S U M E N La presente invención se refiere a vacunas de ácido nucleico mejoradas, sistemas de adyuvante y procesos para la preparación de dichas vacunas y sistemas de adyuvantes. En particular, las vacunas de ácido nucleico y los sistemas de adyuvantes de la presente invención, comprenden una combinación de una secuencia de ácido nucleico que codifica GM-CSF, o derivados de los mismos, y agonistas del receptor tipo leva (TLR) y derivados de los mismos.