JP2010502176A - 合成遺伝子 - Google Patents
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Abstract
本発明は、合成遺伝子、該合成遺伝子を設計するための方法、及び遺伝子治療や改良されたDNAワクチン接種におけるその使用に関する。新規合成遺伝子と方法は、遺伝子の全体的コドン使用頻度を変化させることなく、同じタンパク質をコードする天然遺伝子に対して相同性が低下するように、コドンシャフルされる。特に本発明はコドンシャフルされたGM-CSF核酸配列を含む、疾患の治療または予防のための改良されたポリヌクレオチドと方法とに関する。本発明の核酸ワクチンは、コドンシャフルされたGM-CSFをコードするヌクレオチド配列と、免疫応答を誘導されることが望まれる抗原をコードするヌクレオチドと、Toll様受容体(TLR)アゴニストとの組合せを含み得る。
Description
本発明は、合成遺伝子、該合成遺伝子を設計するための方法、及び遺伝子治療や改良されたDNAワクチン接種におけるその使用に関する。新規合成遺伝子と方法は、遺伝子の全体的コドン使用頻度を変化させることなく、同じタンパク質をコードする天然遺伝子に対して相同性(homology)が低下するように、コドンシャフルされる。特に本発明はコドンシャフルされたGM-CSF核酸配列を含む、疾患の治療または予防のための改良されたポリヌクレオチドと方法とに関する。本発明の核酸ワクチンは、コドンシャフルされたGM-CSFをコードするヌクレオチド配列と、免疫応答を誘導されることが望まれる抗原をコードするヌクレオチドと、Toll様受容体(Toll-like receptor:TLR)アゴニストとの組合せを含み得る。
本発明は、DNAポリヌクレオチドが宿主の細胞に投与される医療の分野である。遺伝子治療及びDNAワクチン接種の場合、治療効果(遺伝子治療の場合は機能的生成物を得るための導入されたDNAの発現、又はワクチンの場合は免疫応答を引き起こすために生成物を発現させること)を得るために、タンパク質をコードする遺伝子が患者の宿主細胞中に導入される。いずれの場合もタンパク質をコードするDNAは、宿主細胞のゲノム中にすでに存在する遺伝子と高度の相同性を有し得る。導入されたDNAと宿主細胞遺伝子との高度の相同性が、相同的組換えを引き起こし、このため導入されたDNAが宿主細胞ゲノム中に取り込まれるという安全性の問題を引き起こす心配が当該分野にある。従ってヒト細胞への投与のためのDNAワクチンの成分としてヒトタンパク質をコードする野生型DNA配列の使用は、宿主ゲノム中にプラスミドDNAが相同的組換えされるリスクが非常に小さい。
導入されたDNAが宿主ゲノムに組み込まれ得、発癌性又は染色体の不安定化の確率を上昇させる心配があるため、米国食品医薬品局(US Food and Drug Administration)は、この問題についての懸念に取り組むために、医薬品業界に対して製品の認可申請には、投与されたプラスミドのin vivoの生体分布と組み込み可能性を評価する実験が必要であるとする指針の草案を発布した["Considerations for plasmid DNA vaccines for infectious disease indications February, 2005, (CBER)"]。
DNAコードは4つの文字(A、T、C、G)を持ち、これらを使用して、生物の遺伝子中でタンパク質がコードしているアミノ酸を示す3文字の「コドン」を判読する。DNA分子に沿ったコドンの線状配列は、これらの遺伝子によりコードされるタンパク質中のアミノ酸の線状配列に翻訳される。このコードは縮重性が高く、61個のコドンが20個の天然のアミノ酸をコードし、3個のコドンは「停止」シグナルを示す。すなわちほとんどのアミノ酸は、2個以上のコドンによりコードされ、実際いくつかのものは4個又はそれ以上の異なるコドンによりコードされる。
あるアミノ酸をコードするコドンが2個以上ある場合、生物のコドン使用頻度パターンは非ランダム性が高いことが観察されている。異なる種はそのコドン選択における偏りが異なり、さらに、1つの種で高レベルに発現される遺伝子と低レベルに発現される遺伝子とではコドンの使用が顕著に異なる。この偏りは、ウイルス、植物、細菌、及び哺乳動物細胞で異なり、ある種では別の種より、ランダムコドン選択からは離れた強い偏りを示す。例えばヒトと他の哺乳動物は、ある細菌又はウイルスとあまり大きく偏っていない。
遺伝子中で使用されるコドンを変化させることにより、天然遺伝子または野生型遺伝子と同じタンパク質をコードする合成遺伝子が設計できることは公知である。これらの設計法は、哺乳動物の遺伝子であまり使用されないコドンを、哺乳動物遺伝子中のアミノ酸についてより頻繁に使用されるコドンで置換することを含む。この方法(コドン最適化と呼ばれる)は、野生型配列でトランスフェクトされる場合のレベルと比較して、コドン最適化した遺伝子でトランスフェクトした場合に、宿主細胞により産生されるタンパク質の総レベルを高くすることを目的として使用される。いくつかの方法が公表されている(Nakamura et al., Nucleic Acids Research 1996, 24:214-215; WO98/34640; WO97/11086)。
遺伝子がコドン最適化されているかどうかは、コドン使用係数の上昇により測定することができる。「コドン使用係数」は、あるポリヌクレオチド配列のコドンパターンが標的種のコドンパターンとどの程度似ているかの尺度である。コドン頻度は、多くの種の高発現遺伝子についての文献から得ることができる(Nakamura et al., Nucleic Acids Research 1996, 24:214-215)。61個のコドンのそれぞれのコドン頻度(選択された群の遺伝子の1000のコドン当たりの発生数として表される)は、20個の天然のアミノ酸のそれぞれについて標準化され、従って各アミノ酸について最も高頻度に使用されるコドンの値を1に設定し、あまり一般的ではないコドンについての頻度がゼロと1の間にあるように調整される。従って61個のコドンのそれぞれは、標的種の高度に発現される遺伝子について1又はそれ以下の値が割り当てられる。その種の高度に発現される遺伝子に対する特定のポリヌクレオチドのコドン使用係数を計算するために、特定のポリヌクレオチドの各コドンについて調整された値が注目され、これらのすべての値の幾何平均が取られる(これらの値の自然対数の合計をコドンの総数で割って、真数を取る)。この係数は0〜1の値を有し、この係数が大きいほど、ポリヌクレオチドのより多くのコドンがより頻繁に使用されるコドンである。1に近いコドン使用係数を有するポリヌクレオチド配列は、低いコドン使用係数(例えば0.2)の配列より、哺乳動物細胞中でより高頻度に発現されると考えられる。
ホモサピエンスについてのコドン使用表を以下に示す:
動物で免疫応答を誘導できる抗原を動物系に導入し、こうして動物を感染から防御することを含む伝統的なワクチン接種法は、何年も前から知られている。プラスミドDNAが動物細胞をin vivoで直接トランスフェクトできることが1990年代初期に観察された後、抗原性ペプチドをコードするDNAを動物に直接導入することにより、免疫応答を誘導するためのDNAプラスミドの使用に基づくワクチン接種法を開発するための多くの研究がなされている。「DNA免疫化」又は「DNAワクチン接種」と呼ばれるかかる方法は現在、ウイルス、細菌、及び寄生虫疾患について多種類の前臨床モデルで防御抗体(体液性)免疫応答及び細胞介在(細胞性)免疫応答を誘発するために使用されている。
動物で免疫応答を誘導できる抗原を動物系に導入し、こうして動物を感染から防御することを含む伝統的なワクチン接種法は、何年も前から知られている。プラスミドDNAが動物細胞をin vivoで直接トランスフェクトできることが1990年代初期に観察された後、抗原性ペプチドをコードするDNAを動物に直接導入することにより、免疫応答を誘導するためのDNAプラスミドの使用に基づくワクチン接種法を開発するための多くの研究がなされている。「DNA免疫化」又は「DNAワクチン接種」と呼ばれるかかる方法は現在、ウイルス、細菌、及び寄生虫疾患について多種類の前臨床モデルで防御抗体(体液性)免疫応答及び細胞介在(細胞性)免疫応答を誘発するために使用されている。
DNAワクチンは通常、強いプロモーターが挿入された細菌プラスミドベクターと、免疫応答を誘導することが望まれる抗原性ペプチドをコードする目的の遺伝子と、ポリアデニル化/転写停止配列とからなる。あるいはDNAワクチンは、細胞中の目的の遺伝子の発現を行うためのベクター(例えばウイルスベクター)を含んでよい。目的の遺伝子がコードする免疫原は、病原体、腫瘍、もしくは防御することが目的の他の物質に関する完全タンパク質でも又は単に抗原性ペプチド配列でもよい。プラスミドは細菌(例えば大腸菌(E. coli))中で増殖させることができ、次に単離され、目的の投与経路に応じて適切な媒体中で調製され、次に宿主に投与される。
DNAワクチン接種に関する有用な背景情報は、Donnelly, J et al Annual Rev. Immunol. (1997) 15:617-648; Ertl P. and Thomsen L., Technical issues in construction of nucleic acid vaccines Methods. 2003 Nov;31(3):199-206(これらの開示内容は参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる)に記載されている。
従来のワクチン接種治療と比較してDNAワクチン接種法の多くの成功にもかかわらず、動物に投与されるプラスミドDNAによりコードされるタンパク質によって誘導される免疫応答を上昇させるように作用するアジュバント化合物を開発したいという要求がある。
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)は、免疫学的機能を有する一連の細胞の分化、増殖、及び活性化を誘導することができるサイトカインである。GM-CSFは、骨髄前駆体からの樹状細胞の増殖を誘導して未成熟樹状細胞状態(すなわち細胞は、低レベルの同時刺激マーカーと抗原取り込みのための高レベルの受容体とを発現する)に到達させる。
ワクチンへのGM-CSFの使用は当該分野で公知であり(US5,679,356)、さらにGM-CSFの配列は、より高度に発現されたタンパク質を得るためにコドン最適化がされている(WO04/004742)。従ってこの最適化されたヌクレオチド配列は、哺乳動物遺伝子中での発現のためにより大きいコドン使用係数を有する。本発明は、構成性ヒトGM-CSF遺伝子との相同性が低下したヒトGM-CSFをコードする合成遺伝子を提供し、従って遺伝子治療又はDNAワクチン接種でヒト細胞中に合成遺伝子が挿入された時、合成遺伝子がヒトゲノムと組換えを引き起こすリスクを低下させる。
Toll様受容体(TLR)はI型膜貫通受容体であり、昆虫とヒトとで進化的に保存されている。これまで10個のTLRが確立されている(TLR1〜10)(Sabroe et al., JI 2003, P.1630-5)。TLRファミリーのメンバーは、同様の細胞外及び細胞内ドメインを有する;これらの細胞外ドメインはロイシンリッチな繰り返し配列を有し、その細胞内ドメインはインターロイキン-1受容体(IL-1R)の細胞内領域に似ていることが証明されている。TLR細胞は、免疫細胞や他の細胞(血管上皮細胞、脂肪細胞、心筋細胞、及び小腸上皮細胞を含む)中で示差的に発現される。TLRの細胞内ドメインは、アダプタータンパク質Myd88と相互作用することができ、これはまた細胞質領域中にIL-1Rドメインを有し、サイトカインのNF-KB活性化が起きる;このMyd88経路は、TLR活性化によりサイトカイン放出が起きる1つの経路である。TLRの主要な発現は、抗原提示細胞のようなタイプの細胞(例えば、樹状細胞、マクロファージなど)中である。
TLRを介する刺激による樹状細胞の活性化は、樹状細胞を成熟させ、IL-12のような炎症性サイトカインを産生させる。これまでに行われた研究で、TLRは異なるタイプのアゴニストを認識するが、一部のアゴニストはいくつかのTLRに共通であることがわかっている。TLRアゴニストは主に細菌又はウイルスから得られ、フラジェリン又は細菌リポ多糖(LPS)のような分子がある。
イミダゾキノリン化合物であるイミキモド(imiquimod)とレシキモド(resiquimod)は小さい抗ウイルス化合物である。イミキモドはヒトパピローマウイルスにより引き起こされる陰部疣贅の局所的治療に使用されている;レシキモドもまた陰部疣贅治療での使用が試験されている。イミキモドとレシキモドは、TLR-7及び/又はTLR-8シグナル伝達経路とMyd88活性化経路の活性化を介して作用すると考えられている。
宿主細胞(宿主細胞のゲノムが、DNA組成物と同じタンパク質をコードする遺伝子を含む)への投与用であって、宿主細胞のゲノム中に組成物が相同的組換えされるリスクが低い新規DNA組成物を提供すべきニーズが当該分野に存在する。
Considerations for plasmid DNA vaccines for infectious disease indications February, 2005, (CBER)
Nakamura et al., Nucleic Acids Research 1996, 24:214-215
Donnelly, J et al Annual Rev. Immunol. (1997) 15:617-648
Ertl P. and Thomsen L., Technical issues in construction of nucleic acid vaccines Methods. 2003 Nov;31(3):199-206
Sabroe et al., JI 2003, P.1630-5
本発明は、哺乳動物のゲノム中に存在する遺伝子と比較して相同性が大きく低下している、新規の非天然遺伝子と、該合成遺伝子を設計する方法とを提供する。ヒトの遺伝子治療又はDNAワクチン接種の場合、新規合成遺伝子は、同じタンパク質をコードする哺乳動物ゲノム中に存在する遺伝子と比較して、相同性が大きく低下している。
一般に本発明の方法は、当該分野の他のコドン修飾法を使用して得られるものより低い相同性を有する非天然遺伝子の作製を可能にする。
本発明の一実施形態において、タンパク質をコードする非天然遺伝子が、同じタンパク質をコードする野生型cDNA配列又はコード配列と80%未満の相同性を有するDNA配列を含んでなる、タンパク質をコードする非天然DNA配列であって、非天然遺伝子のコドン使用係数が野生型cDNA配列のコドン使用係数以下であることを特徴とするcDNA配列が提供される。
本発明のすべての態様内で「非天然配列」は、本発明の目的のために設計されていて、全体として哺乳動物のゲノム内には存在しない人工的配列である。
ある実施形態において非天然DNA配列はヒトタンパク質をコードする。
別の実施形態において非天然DNA配列はヒトGM-CSFをコードする。
本発明において非天然DNA配列は、トランスフェクトされた宿主細胞により発現される時、生物活性があるタンパク質をコードする。生物活性は、a)そのタンパク質が、宿主細胞のゲノム中の野生型遺伝子により産生されたかのようなタンパク質の活性を有すること、又はb)宿主細胞のゲノム中で野生型遺伝子により産生されるタンパク質に特異的な免疫応答を刺激することができるという意味で活性があることである。
非天然配列が生物活性のある又は成熟型のタンパク質をコードし、一方宿主細胞のゲノム中に存在する野生型遺伝子が不活性化タンパク質をコードして、これが翻訳後事象で活性化されることは、理解されるであろう。宿主細胞の遺伝子がコード領域と非コード領域(それぞれエクソンとイントロン)を含み、一方遺伝子発現中に産生されるmRNAが、遺伝子のコード領域に対する相補的RNA配列のみを含有してもよいことも、当業者は理解するであろう。従ってmRNAから産生又は推定され得る相補的DNA(すなわちcDNA)配列は、宿主細胞遺伝子のコード領域に対応する。
ある実施形態において本発明の非天然配列は、成熟型のタンパク質をコードするか、又は不活性な前プロセシング型のタンパク質をコードする。本発明の非天然配列は、同じタンパク質についての宿主細胞の遺伝子中に現れ得るイントロンを含有せず、従って非天然配列の相同性の程度は、宿主細胞のコード部分、又は非天然配列と同じタンパク質をコードするcDNA配列に対応する野生型遺伝子に対して、計算すべきであることを当業者は理解するであろう。
本発明のある実施形態において、タンパク質をコードする非天然遺伝子であって、同じ野生型タンパク質をコードするcDNA配列と80%未満の相同性を有するDNA配列を含む非天然遺伝子が提供され、ここで非天然遺伝子のコドン使用係数は野生型遺伝子のものと同じであることを特徴とする。
ある実施形態において、該非天然遺伝子によって、その発現を可能にする形態でトランスフェクトされた宿主細胞によるタンパク質の産生レベルは、野生型遺伝子でトランスフェクトされた場合に宿主細胞により産生されるタンパク質のレベル以下である。
ある実施形態において非天然遺伝子は、ヒトゲノム中に存在する遺伝子によりコードされる成熟型のポリペプチドと同一であるポリペプチドをコードする。
ある実施形態において非天然遺伝子は、ヒトゲノム中に存在する遺伝子によりコードされる前駆体型のポリペプチドと同一であるポリペプチドをコードする。前駆体とは、シグナル配列又はプロ配列を含むポリペプチド配列を意味する。
ある実施形態において非天然遺伝子は、コドンシャフルされた顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)をコードする。
本発明のすべての態様内でGM-CSFは、骨髄前駆細胞の増殖を誘導して未成熟樹状細胞状態に到達させることができる、シグナル配列又はその任意の断片を有する成熟型又は前駆体型のGM-CSFの完全分子を意味する。ヒトGM-CSFの野生型DNA配列はジーンバンク(GenBank)データベース中に存在する(受け入れ番号M11220、文献、Lee, F. et al. PNAS 82 (13) 4360-4364 (1985))。
ある実施形態において非天然GM-CSF遺伝子の配列は、配列番号1(図7)の配列である。
ある実施形態において非天然遺伝子は、非天然遺伝子と制御配列とを含む発現カセット中に含まれる。
本発明の別の実施形態において非天然遺伝子を含有する発現カセットは、プラスミド中に含まれる。
本発明のヌクレオチド配列(例えばGM-CSFをコードするヌクレオチド配列)は、制御配列を含むプラスミド内で提供され得る。例えばヌクレオチド配列は、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)主要前初期(IE)プロモーターの制御下のワクチンベクターp7313(詳細はWO02/08435に記載されている)内にあり得る。
本発明はまた、本発明の非天然遺伝子を含む発現ベクターを提供する。かかる発現ベクターは分子生物学の分野で日常的に構築され、例えばタンパク質発現を可能にするために、プラスミドDNA及び適切な開始要素、プロモーター、エンハンサー、及び他の要素(例えば、必要な場合があり、正しい配向で配置されるポリアデニル化シグナル)の使用を含んでよい。他の適切なベクターは当業者に明らかであろう。この点で追加の例としては、Sambrook et al. Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd Edition, CSH Laboratory Press (1989)を参照されたい。
本発明で使用される非天然ポリヌクレオチドを含むベクターは、宿主細胞によるコード配列の発現を提供することができる制御配列に機能できる形で結合してもよい(すなわちベクターは発現ベクターである)。用語「機能できる形で結合した」は、記載の成分が目的の方法で機能することを可能にする関係にある、並びを意味する。コード配列に「機能できる形で結合した」制御配列(例えばプロモーター)は、制御配列と適合する条件下でコード配列の発現が行われるように配置される。
ベクターは例えば、複製開始点、適宜の、ポリヌクレオチドの発現のためのプロモーター、及び適宜の、プロモーターの制御要素を有する、プラスミド、人工染色体(例えば、BAC、PAC、YAC)、ウイルスベクター又はファージベクターでもよい。ベクターは1つ又はそれ以上の選択マーカー遺伝子、例えば細菌プラスミドの場合アンピシリン又はカナマイシン耐性遺伝子、又は菌類ベクターの耐性遺伝子を含んでよい。ベクターはin vitroで、例えばDNA又はRNAの産生のために使用されるか、又はベクターにコードされるタンパク質の産生のために宿主細胞(例えば哺乳動物宿主細胞)をトランスフェクト又は形質転換するために使用される。ベクターはまた、in vivoで例えばDNAワクチン接種又は遺伝子治療での使用に適合するように改変される。
プロモーター及び他の発現制御シグナルは、発現が好ましい宿主細胞と適合するように選択され得る。例えば哺乳動物プロモーターには、メタロチオネインプロモーター(これはカドミウムのような重金属に応答して誘導することができる)やp-アクチンプロモーターがある。ウイルスプロモーター、例えばSV40ラージT抗原プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)前初期早期(IE)プロモーター、ラウス肉腫ウイルスLTRプロモーター、アデノウイルスプロモーター、又はHPVプロモーター(特にHPV上流制御領域(URR))が使用され得る。これらのプロモーターはすべて充分記載されており、当該分野で容易に利用できる。
1つのプロモーター要素は、イントロンAが欠如しているがエクソン1を含むCMV前初期早期プロモーターである(WO02/36792)。従って、HCMV IE早期プロモーターの制御下で本発明のポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。
適当なウイルスベクターの例には、単純ヘルペスウイルスベクター、ワクシニア又はアルファウイルスベクター、及びレトロウイルス(レンチウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルスを含む)がある。これらのウイルスを使用する遺伝子輸送法は、当業者に公知である。例えばレトロウイルスベクターは、本発明のポリヌクレオチドを宿主ゲノムに安定に組み込むために使用され得るが、かかる組換えは好ましくはない。
これに対して複製欠陥アデノウイルスベクターはエピソームのまま存在し、従って一過性発現を可能にする。例えばサブユニットワクチンとして又はイムノアッセイで使用するための、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるHIVタンパク質の量を産生するために、昆虫細胞(例えばバキュロウイルスベクター)、ヒト細胞、又は細菌で発現を指令できるベクターが使用され得る。完全長ワクシニア構築体を作製する以前の試みは成功していないため、本発明のポリヌクレオチドはウイルスワクチンで特に有用である。
本発明のある実施形態において、PCT出願WO03/046124(これは参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる)に記載のようなC1、Pan5、Pan6、Pan7、C68(Pan9)、SV1、SV25、及びSV39から選択されるアデノウイルス核酸配列を含むウイルスベクターが選択され得る。
あるいは細菌ベクター[例えば弱毒化サルモネラ(Salmonella)又はリステリア(Listeria)]が使用され得る。
本発明のある実施形態において、
a)免疫原成分
b)アジュバント成分
(ここでa)もしくはb)又は両方はコドンシャフルされた遺伝子でもよい)を含むワクチン組成物が提供される。
a)免疫原成分
b)アジュバント成分
(ここでa)もしくはb)又は両方はコドンシャフルされた遺伝子でもよい)を含むワクチン組成物が提供される。
非天然遺伝子配列がヒトワクチンで使用される実施形態において、野生型ヒトGM-CSF配列は配列番号4で示される(図10を参照)。本発明はさらに、抗原性ペプチドもしくはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有するプラスミドと、コドンシャフルされたGM-CSFをコードするポリヌクレオチド配列を含有するプラスミドとを含むワクチン組成物を提供する。本発明はさらに、かかるワクチンもしくはワクチン組成物の有効量を哺乳動物被験体に投与することを含んでなる、哺乳動物被験体をワクチン接種する方法を提供する。DNAワクチン、ワクチン組成物、及び免疫治療薬で使用される発現ベクターは、プラスミドベクターでもよい。
本発明の別の実施形態においてポリヌクレオチドは、免疫応答を誘導することが望まれるタンパク質をコードし得、こうしてポリヌクレオチドは、HCV、HIV、HPV、又は腫瘍関連抗原から選択される抗原をコードする。
抗原性応答を誘導するために哺乳動物系で発現される抗原又は免疫原をコードする本出願において参照される免疫原成分のヌクレオチド配列は、全タンパク質をコードするか、又は単に抗原性応答を開始できる短いペプチド配列をコードしてもよい。本明細書と特許請求の範囲を通して「抗原性ペプチド」又は「免疫原」という用語は、関係する動物内で免疫応答を誘導することができるすべてのペプチドまたはタンパク質配列を包含する。しかしある実施形態において、動物系内の完全なタンパク質の発現は自然の抗原提示を模倣し易く、従って完全な免疫応答を誘発し易いため、ヌクレオチド配列は疾患状態に関連する完全なタンパク質をコードするであろう。具体的な疾患状態に関連する公知の抗原性ペプチドのいくつかの非限定例には以下がある:
ある実施形態において本発明で使用される抗原は、ヒトの病原体(例えばウイルス、細菌、又は寄生虫抗原)に対して免疫応答を誘発することができる。
ある実施形態において本発明で使用される抗原は、ヒトの病原体(例えばウイルス、細菌、又は寄生虫抗原)に対して免疫応答を誘発することができる。
本出願のワクチン接種法と組成物は、種々の疾患状態(例えば、ウイルス、細菌、もしくは寄生虫感染症、癌、アレルギー、及び自己免疫疾患)に対して哺乳動物を防御もしくは治療するように改変することができる。本発明の方法又は組成物を使用して防御又は治療できる疾患又は疾患状態の、いくつかの具体例は以下の通りである:ウイルス感染症、肝炎ウイルスA、B、C、D、及びE、HIV、ヘルペスウイルス1、2、6、及び7、サイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、パピローマウイルス、エプスタインバーウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、ピコルナウイルス、ロタウイルス、呼吸器多核体ウイルス、ポックスウイルス、ライノウイルス、風疹ウイルス、パポウイルス、おたふくかぜウイルス、麻疹ウイルス。
細菌感染症、TBとライ病を引き起こすマイコバクテリア(Mycobacteria)、肺炎球菌、好気性グラム陰性菌、マイコプラズマ(mycoplasma)、ブドウ球菌感染症、連鎖球菌感染症、サルモネラ菌、クラミジア。
寄生虫マラリア、リーシュマニア症、トリパノソーマ症、トキソプラズマ症、住血吸虫症、 フィラリア症、癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、頭と首の癌、腎臓癌、悪性黒色腫、喉頭癌、卵巣癌、子宮頚癌、前立腺癌。
ハウスダストダニ、花粉、及び他の環境アレルギー源によるアレルギー性鼻炎、自己免疫疾患である全身性エリテマトーデス。ある実施形態において本発明の方法又は組成物は、ウイルス疾患であるB型肝炎、C型肝炎、ヒトパピローマウイルス、ヒト免疫不全症ウイルス、又は単純ヘルペスウイルス;細菌疾患であるTB;乳房、結腸、卵巣、子宮頚部、及び前立腺の癌;又は喘息、リウマチ様関節炎、及びアルツハイマー病の自己免疫疾患に対して防御するために又はこれらを治療するために使用される。これらの具体的な疾患状態は単に例示目的であり、決して本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。
本発明のさらなる実施形態においてヌクレオチド配列によりコードされるコドンシャフルされたGM-CSF、及び免疫原成分をコードするヌクレオチド配列は、同時又は連続投与のために別のポリヌクレオチド分子内に含まれる。免疫原とコドンシャフルされたGM-CSF成分が別のポリヌクレオチド分子内に含まれる本発明のある実施形態において、ポリヌクレオチド分子はそれぞれ、同時又は連続送達のために別のプラスミド内に存在してもよい。ある実施形態において同時送達が使用され得る。
同時投与とは、実質的に同時の投与を意味する;すなわち成分は同時に投与されるか、又は同時でない場合でも、互いに少なくとも数分以内に投与される。あるいは成分は互いに1、2、3、4、5、又は10分以内に投与される。ある治療プロトコールにおいてアジュバント成分は、免疫原及びコドンシャフルされたGM-CSFをコードするヌクレオチド配列の投与に対して実質的に同時に投与される。明らかに、このプロトコールは必要に応じて変化してもよい。本発明のある実施形態においてアジュバント成分はイミダゾキノリン又はその誘導体であり、同時又は連続投与のために免疫原成分とコドンシャフルされたGM-CSFとは別の組成物中で提供される。ある実施形態においてイミダゾキノリン化合物又はその誘導体は連続的に投与され、すなわち免疫原成分とコドンシャフルされたGM-CSFを別の組成物中で投与した後に投与される。さらなる実施形態においてイミダゾキノリン化合物又はその誘導体は、免疫原成分とコドンシャフルされたGM-CSFの投与の、2、4、6、8、12、又は24時間後に投与される。ある実施形態においてイミダゾキノリン化合物又はその誘導体は、免疫原成分とコドンシャフルされたGM-CSFの投与の24時間後又はほぼ24時間後に投与される。イミダゾキノリン化合物又はその誘導体が局所的投与用のクリーム剤中にあるさらなる実施形態において、クリーム剤は免疫原成分とコドンシャフルされたGM-CSFの投与の24時間後に塗布される。
イミダゾキノリン化合物又はその誘導体が、特に限定されないが皮下投与用の可溶性製剤で投与される本発明の別の実施形態において、イミダゾキノリン化合物又はその誘導体は、免疫原成分とコドンシャフルされたGM-CSF投与の6〜24時間後に投与されるか、又は免疫原成分とコドンシャフルされたGM-CSF投与の次の作業日に投与され得る。免疫原成分とコドンシャフルされたGM-CSFは金ビーズ上にパッケージングして、粒子介在薬剤送達を使用して例えばEP0500799に記載の「遺伝子銃」を使用して、患者の皮膚に投与してもよい。
あるいは本発明は、本明細書に記載の免疫原組成物と薬剤学的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体とを含む医薬組成物又は組成物を提供する。
本発明はさらに、本発明のアジュバント成分と、抗原性ペプチドもしくはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む免疫原成分と、1つ又はそれ以上の薬剤学的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体とを含む医薬組成物又は組成物を提供する。
本発明のさらなる実施形態において、本発明のコドンシャフルされたポリヌクレオチドを哺乳動物に投与することを含んでなる哺乳動物の免疫応答を誘導する方法はさらに、TLRアゴニストの投与を含む。
「TLRアゴニスト」とは、TLRシグナル伝達経路を介して、直接のリガンドとして又は間接的に内因性もしくは外因性リガンドの生成を介して、シグナル伝達応答を引き起こすことができる成分を意味する(Sabroe et al, JI 2003 P1630-5)。
本発明のある実施形態において、TLRアゴニストはTLR-7を介してシグナル伝達応答を引き起こすことができる。本発明のある実施形態においてTLRアゴニストはイミダゾキノリン化合物又はその誘導体である。さらなる実施形態においてイミダゾキノリン又はその誘導体は、本明細書で定義される式I〜VIのいずれかにより定義される化合物である。さらなる実施形態においてイミダゾキノリン又はその誘導体は式VIにより定義される化合物である。ある実施形態においてイミダゾキノリン又はその誘導体は、1-(2-メチルプロピル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-4-アミン;1-(2-ヒドロキシ-2-メチルプロピル)-2-メチル-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-4-アミン;1-(2-ヒドロキシ-2-メチルプロピル)-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-4-アミン;1-(2-ヒドロキシ-2-メチルプロピル)-2-エトキシメチル-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-4-アミンよりなる群から選択される式VIの化合物である。さらなる実施形態においてイミダゾキノリン又はその誘導体は、イミキモド又はレシキモドである。イミダゾキノリン又はその誘導体はイミキモドでもよい。
本発明はさらに、免疫原成分とコドンシャフルされたGM-CSF成分と、薬剤学的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体とを含む医薬組成物;及びさらに、TLRアゴニスト、又はTLRアゴニストをコードするヌクレオチド、及び「担体」を含む医薬組成物、を含んでなるキットを提供する。ある実施形態において少なくとも1つの担体は金ビーズであり、少なくとも1つの医薬組成物は、粒子介在薬剤送達による送達が容易である。
本発明はさらに、疾患状態に関連する抗原性ペプチドをコードするヌクレオチド配列を適切なベクター内で哺乳動物に投与すること;コドンシャフルされたGM-CSFをコードするヌクレオチド配列を、適切なベクター内で哺乳動物にさらに投与すること;及び、免疫応答を誘導するためにイミダゾキノリン又はその誘導体を哺乳動物にさらに投与することを含む、疾患状態に対する哺乳動物の免疫応答を誘導する方法を提供する。
本発明はさらに、免疫応答を刺激するのに有効な量の免疫原をコードするヌクレオチド配列とコドンシャフルされたGM-CSFをコードするヌクレオチド配列とを、適切なベクター内で哺乳動物に投与する工程と;免疫応答を上昇させるのに有効な量のイミダゾキノリン又はその誘導体を哺乳動物にさらに投与する工程とを含む、免疫原に対する哺乳動物の免疫応答を上昇させる方法を提供する。
本発明のある実施形態において、野生型遺伝子のcDNA配列とDNAレベルで80%未満の相同性を有する合成遺伝子(合成遺伝子と野生型cDNA遺伝子は同じポリペプチドをコードする)を作製する方法であって、
a)野生型cDNA配列中の各アミノ酸のコドンを同定し;及び
b)アミノ酸残基が少なくとも2つの位置で野生型cDNA配列によりコードされる場合、野生型cDNA配列中にこれが存在するコドンの第1の位置から、野生型cDNA配列中に存在しない第2の位置に、少なくとも80%のコドンを転位させる、ことを含んでなる前記方法が提供される。
a)野生型cDNA配列中の各アミノ酸のコドンを同定し;及び
b)アミノ酸残基が少なくとも2つの位置で野生型cDNA配列によりコードされる場合、野生型cDNA配列中にこれが存在するコドンの第1の位置から、野生型cDNA配列中に存在しない第2の位置に、少なくとも80%のコドンを転位させる、ことを含んでなる前記方法が提供される。
この実施形態において、少なくとも90%のコドンは転位されている。
本発明のある実施形態において、野生型遺伝子のcDNA配列とDNAレベルで80%未満の相同性を有する合成遺伝子(合成遺伝子と野生型cDNA遺伝子は同じポリペプチドをコードする)を作製する方法であって、
a)野生型cDNA配列中の各アミノ酸のコドンを同定し;及び
b)各コドンが野生型cDNA配列と同じ比率で合成遺伝子中に存在するように、コドンを転位させる、ことを含んでなる前記方法が提供され、
ここで、細胞により産生されるタンパク質のレベルは、野生型cDNA配列でトランスフェクトした場合の細胞のレベル以下である。
a)野生型cDNA配列中の各アミノ酸のコドンを同定し;及び
b)各コドンが野生型cDNA配列と同じ比率で合成遺伝子中に存在するように、コドンを転位させる、ことを含んでなる前記方法が提供され、
ここで、細胞により産生されるタンパク質のレベルは、野生型cDNA配列でトランスフェクトした場合の細胞のレベル以下である。
本発明のある実施形態において、野生型遺伝子のcDNA配列とDNAレベルで80%未満の相同性を有する合成遺伝子(合成遺伝子と野生型遺伝子は同じポリペプチドをコードする)を作製する方法であって、
a)野生型cDNA配列中の各アミノ酸のコドンを同定し;及び
b)野生型cDNA配列中のコドンの第1の位置から野生型cDNA配列中に存在しない第2の位置に、充分な数のコドンを転位させる、ことを含んでなる前記方法が提供され、
ここで、合成遺伝子のコドン使用係数は野生型cDNA配列のコドン使用係数以下である。
a)野生型cDNA配列中の各アミノ酸のコドンを同定し;及び
b)野生型cDNA配列中のコドンの第1の位置から野生型cDNA配列中に存在しない第2の位置に、充分な数のコドンを転位させる、ことを含んでなる前記方法が提供され、
ここで、合成遺伝子のコドン使用係数は野生型cDNA配列のコドン使用係数以下である。
本発明のある実施形態において、本発明の免疫原組成物、ワクチン組成物、又は医薬組成物の安全かつ有効な量の投与を含んでなる、患者を治療する方法が提供される。
本発明のある実施形態において、抗原性ペプチド又はタンパク質により開始される免疫応答を増強するための医薬の製造における本発明のプラスミドとイミダゾキノリン又はその誘導体の使用が提供され、ここで抗原性ペプチド又はタンパク質は、ペプチドをコードするヌクレオチド配列の哺乳動物への投与の結果として発現される。
本発明はさらに、ヌクレオチド配列によりコードされる抗原に対する免疫応答の増強のための医薬の製造における、免疫原成分及びコドンシャフルされたGM-CSF成分の使用を提供する。
本明細書において免疫原組成物という用語は、GM-CSFをコードするヌクレオチド配列と;抗原性ペプチド又はタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む免疫原成分(ここでこの成分は機能的に共同して作用して、免疫原成分に対する哺乳動物の免疫応答を増強するように作用する)との組合せを意味する。
免疫原成分が、抗原性ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクターを含む場合、これは種々の方法で投与することができる。ベクターは裸の形態(すなわちリポソーム製剤、ウイルスベクター、又はトランスフェクション促進タンパク質に結合していない裸のヌクレオチド配列)で、適切な媒体(例えばPBSのような緩衝化食塩水)に懸濁し、次に筋肉内、皮下、腹腔内、又は静脈内注射することができるが、いくつかの先行データは筋肉内又は皮下注射が使用できることを示唆する(Brohm et al Vaccine 16 No. 9/10 pp. 949-954 (1998)、この開示内容は参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる)。さらにベクターは、前記経路以外に経口、鼻内、又は肺経路で投与するために、例えばリポソームもしくはポリラクチド−コ−グリコリド(PLG)粒子(25)内に封入することができる。
また本発明のある実施形態において、例えば遺伝子銃(特に粒子衝撃)投与法を使用して、免疫原成分を皮内投与することができる。かかる方法は金ビーズに免疫原成分をコーティングして、次にこれを例えばHaynes et al J. Biotechnology 44:37-43 (1996)に記載のように高圧下で表皮に投与することを含む。
ある例において、Powderject Pharmaceuticals PLC (Oxford, UK) 及び Powderject Vaccines Inc. (Madison, WI)製のような装置(そのいくつかの例は、US Patent No. 5,846,796;6,010,478;5,865,796;5,584,807;及びEP Patent No.0500799に記載されている)を用いて、ガス駆動式粒子加速を行うことができる。
このアプローチは針を使用しない送達アプローチを与え、ここで微細粒子の乾燥粉末調製物(例えばポリヌクレオチド)を携帯型装置で発生したヘリウムガスジェット内で高速に加速して、粒子を目的の標的組織(典型的には皮膚)に噴射させる。粒子は直径0.4〜4.0μm又は0.6〜2.0μmの金ビーズでよく、DNAコンジュゲートがその上に被覆され、次に「遺伝子銃」に入れるためにカートリッジもしくはカセットに入れられる。
関連する実施形態において、本発明の組成物のガス駆動式粒子加速注入に有用な他の装置や方法には、Bioject, Inc. (Portland, OR)に提供されるものがある(このいくつかの例は、US Patent No. 4,790,824;5,064,413;5,312,335;5,383,851;5,399,163;5,520,639、及び5,993,412に記載されている)。
核酸ワクチンはまた微細針(これは本発明の組成物で被覆されてもよい)により送達されるか、又は微細針によりリザーバーから送達される。抗原性ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクターは、予防的または治療的に有効な量で投与される。投与すべき量は一般に、投与当たりのヌクレオチドは1ピコグラム〜1ミリグラム、又は粒子介在送達について1ピコグラム〜10マイクログラム、及び他の経路について10マイクログラム〜1ミリグラムである。正確な量は、免疫される哺乳動物の種と体重、投与経路、アジュバント成分の力価と用量、治療又はそれに対して防御される疾患状態の性質、免疫応答を生成する被験体の免疫系の能力、所望の防御もしくは治療効果の程度に依存して大きく変動し得る。これらの変化量に基づき、医師又は獣医師は適切な用量レベルを容易に決定することができるであろう。
抗原性ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む免疫原成分及びアジュバント成分は、1回だけ、又は例えば1〜7回、又は1〜4回、約4週間〜約18ヶ月間の間隔で繰り返し投与することができる。しかし再度この治療法は、患者の大きさ、治療/防御される疾患、投与されるヌクレオチド配列の量、投与経路、及び当業者の医師に明らかな他の因子により大きく変動するであろう。患者は、全体的治療法の一環として1つ又はそれ以上の他の抗癌剤を投与されてもよい。
再度、前記の変化量の種類によりTLRアゴニストの投与量も変化するが、例えば約0.1mg/kg〜約100mg/kgでもよく、ここで「/kg」は問題の哺乳動物の体重を意味する。TLRアゴニストアミン誘導体の投与は、ヌクレオチド配列の各以後の又は追加免疫投与で繰り返してもよい。投与量は約0.5mg/kg〜約5mg/kg、又は約1mg/kg又は1mg/kgであり得る。TLRアゴニストがレシキモド又はイミキモドである場合、用量はmg/kgであり得る。TLRアゴニストがイミキモドである場合、Aldaraクリーム(5%イミキモド;3M)が使用され得、投与部位又はその近くに局所塗布される。本発明のある実施形態において1つの12.5mgパケット(3M)の5% Aldaraクリームが使用されるか、又は2つ以上のAldaraクリームが使用され得る。本発明のさらなる実施形態においてパケットの一部も使用され得る;例えばパケットの20%、25%、33%、又は50%もしくはほぼこれらの値が、各部位又はその近くに使用され得る。
イミダゾキノリン分子又はその誘導体を含むTLRアゴニストアジュバント成分は原料のままの化学物質状態で投与することができるが、医薬製剤の形で投与してもよい。すなわちTLRアゴニストアジュバント成分は、イミダゾキノリン分子又はその誘導体を1つ又はそれ以上の医薬的又は獣医学的に許容し得る担体、及び随時他の治療成分と組合せて含有してもよい。担体は、製剤内の他の成分と適合し、その受容者にとって有害ではないという意味で「許容し得る」ものでなければならない。製剤の性質は、目的の投与経路に従って当然変化し、医薬分野で公知の方法により調製され得る。製剤を調製するためのすべての方法は、イミダゾキノリン分子又はその誘導体を適切な担体と組合せる工程を含む。担体には、クリーム調製物、又はその代わりのものとしてPBSもしくは水がある。一般に調製物は、誘導体を液体担体もしくは微粉化固体担体、又はこれらの両方と均一かつ直接一緒にすることにより、次に必要であれば、生成物を所望の製剤に成形することにより、調製される。経口投与に適した本発明の製剤は、それぞれが所定量の活性成分を含有するカプセル剤、カシェ剤、又は錠剤のような別個の単位として;粉末又は顆粒として;水性液体又は非水性液体中の溶液又は懸濁物として;又は水中油液体エマルジョン又は油中水エマルジョンとして、提供され得る。
アジュバントの投与は、ヌクレオチド配列投与の約14日前〜約14日後、又はヌクレオチド配列投与の約1日前〜約3日後に行われる。GM-CSFをコードするヌクレオチド配列は、免疫原をコードするヌクレオチド配列及び連続的に提供されるTLRアゴニストである成分と同時に投与してもよい。TLRアゴニストである成分は、抗原成分のほぼもしくは正確に7、6、5、4、3、2、もしくは1日前、又はほぼもしくは正確に24、22、20、18、16、14、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2、もしくは1時間前に投与され得る。TLRアゴニストである成分は、抗原成分のほぼもしくは正確に7、6、5、4、3、2、もしくは1日後、又はほぼもしくは正確に24、22、20、18、16、14、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2、もしくは1時間後に投与され得る。
TLRアゴニストである成分は、残りの成分の正確にもしくはほぼ24時間後に投与され得る。免疫原とコドンシャフルされたGM-CSF成分の投与後にTLRアゴニスト成分を投与する利点は、これらの成分の送達により、送達の局所においてIFNyが誘導され得ることであり;これはTLRのアップレギュレーション(例えばTLR7及び/又は8のアップレギュレーション)を引き起こして、TLRアゴニストの応答性を向上させ得る。
本発明のある実施形態において免疫原とコドンシャフルされたGM-CSF成分は、遺伝子銃送達による同時投与に適した製剤中にあり、アジュバント成分は連続的局所投与のために別のクリーム製剤で提供される。
裸のポリヌクレオチド又はベクターを患者に導入する適当な方法はまた、適切なビヒクルを用いる局所塗布を含む。核酸は、例えば鼻内、経口、膣内、又は直腸内投与により皮膚又は粘膜表面に局所投与され得る。裸のポリヌクレオチド又はベクターは、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)のような医薬的に許容し得る賦形剤とともに存在してもよい。DNA取り込みは、ブピバカインのような促進剤をDNA製剤と、別に又は一緒にして使用することによりさらに促進され得る。受容者に核酸を直接投与する他の方法には、超音波、電気刺激、電気穿孔、及び微量接種(これはUS5,697,901に記載されている)がある。
核酸構築体の取り込みは、いくつかの公知のトランスフェクション法(例えば、トランスフェクション剤の使用を含むもの)により増強され得る。これらの物質の例には、陽イオン物質、例えばリン酸カルシウム及びDEAEデキストラン、リポフェクタント、例えばリポフェクタム及びトランスフェクタムがある。投与される核酸の用量は変えることができる。
本発明の核酸はまた、形質転換細胞を用いて投与してもよい。かかる細胞には被験体から採取される細胞がある。本発明の裸のポリヌクレオチド又はベクターはin vitroでかかる細胞中に導入でき、形質転換細胞を後で被験体に戻すことができる。本発明のポリヌクレオチドは、細胞中にすでに存在する核酸に相同的組換えにより組み込んでもよい。形質転換細胞は所望であればin vitroで増殖させ、1つ又はそれ以上の得られる細胞を本発明で使用してもよい。細胞は患者の適切な部位に、公知の外科的又は顕微外科的方法(例えば、移植、微量注入など)により与えることができる。本発明者は、TLRアゴニストとGM-CSFとの組合せはDNAワクチン接種においてアジュバントとして使用すると、特に初期注入後に、細胞性免疫応答を上昇させることができることを証明した。本明細書において用語「アジュバント」又は「アジュバント成分」は、誘導体又は誘導体を含む成分が、所望の方法で免疫原に対する体の応答を増強及び/又は改変するように作用することを示す。従って、例えばアジュバントは、免疫応答を主にTh1応答にシフトさせるか、又は両方のタイプの応答を上昇させるのに使用され得る。
本明細書と特許請求の範囲を通して特に明記しない場合は、「含む(comprise)」及び「含む(include)」又はこれらの変化形である「含んでなる(comprising)」、「含む(comprises)」、「含む(inlcuding)」、「含む(includes)」などは、包括的に理解すべきであり、すなわちこれらの用語の使用は、明記されていない整数又は要素を含む可能性がある。さらに本明細書の「含んでなる(comprising)」、「含む(comprise)」、及び「含む(comprises)」は、すべての場合に、「からなる(consisting of)」、「からなる(consist of)」、及び「からなる(consists of)」により適宜置換可能である。
本発明を以下の非限定例を参照してさらに詳細に説明する。
(実施例)
コドンシャフルされたヒトGM-CSFをコードする遺伝子の設計
ヒトGM-CSF DNA配列をその成分コドンに分解し、これらを対応するアミノ酸によりプールした。例えば遺伝子はコドンGCA(×2)、GCC(×5)、及びGCT(×2)で示される9つのアラニン残基を含有する。同じアミノ酸配列に翻訳されるが元の野生型配列との相同性が低下している新しいDNA配列を作製するために、これらのコドンを用手的に異なる順序で再度割り当てた。野生型遺伝子配列中の対応するコドンと比較してできるだけ異なるコドンが使用されるように、プールからコドンを割り当てた。コドンの最初の再割り当てが完了したら、野生型配列と整列比較を行い、必要な場合は、A)20塩基対を超える同一のストレッチ鎖が無いことを確実にするために、B)翻訳の効率を低下させるかもしれないまれなコドンのかたまりが発生していないことを確実にするために、個々のコドンの交換を用手的に行った。
ヒトGM-CSF DNA配列をその成分コドンに分解し、これらを対応するアミノ酸によりプールした。例えば遺伝子はコドンGCA(×2)、GCC(×5)、及びGCT(×2)で示される9つのアラニン残基を含有する。同じアミノ酸配列に翻訳されるが元の野生型配列との相同性が低下している新しいDNA配列を作製するために、これらのコドンを用手的に異なる順序で再度割り当てた。野生型遺伝子配列中の対応するコドンと比較してできるだけ異なるコドンが使用されるように、プールからコドンを割り当てた。コドンの最初の再割り当てが完了したら、野生型配列と整列比較を行い、必要な場合は、A)20塩基対を超える同一のストレッチ鎖が無いことを確実にするために、B)翻訳の効率を低下させるかもしれないまれなコドンのかたまりが発生していないことを確実にするために、個々のコドンの交換を用手的に行った。
この方法により、野生型配列のような全体的コドン使用を維持するが野生型ヒトGM-CSF DNA配列とはわずかに76.8%の相同性を有するGM-CSFのコドンシャフルされた配列が得られ、こうして相同的組換えとヒト宿主細胞への組み込みの確率が低下している。
pMNB003とPMNB004からのヒトGM-CSFの発現
コドンシャフルされたGM-CSFプラスミドと野生型GM-CSFプラスミドからのGM-CSFの発現を確認するために、コドンシャフルGM-CSFプラスミドと野生型ヒトGM-CSFプラスミドのそれぞれについて多くのDNAバッチを作製し、HEK293細胞を一過性にトランスフェクトするのに使用した。48時間後上清を採取し、ヒトGM-CSF ELISAを行って2つの構築体の発現を比較した。ヒトGM-CSF ELISAは、一致した抗体対、ヒトGM-CSF標準物質、及び酵素コンジュゲートのキットとしてR & D Systemsから供給された(カタログ番号DY215)。図1は、キット中の標準物質成分を使用したELISAについての標準曲線を示す。
コドンシャフルされたGM-CSFプラスミドと野生型GM-CSFプラスミドからのGM-CSFの発現を確認するために、コドンシャフルGM-CSFプラスミドと野生型ヒトGM-CSFプラスミドのそれぞれについて多くのDNAバッチを作製し、HEK293細胞を一過性にトランスフェクトするのに使用した。48時間後上清を採取し、ヒトGM-CSF ELISAを行って2つの構築体の発現を比較した。ヒトGM-CSF ELISAは、一致した抗体対、ヒトGM-CSF標準物質、及び酵素コンジュゲートのキットとしてR & D Systemsから供給された(カタログ番号DY215)。図1は、キット中の標準物質成分を使用したELISAについての標準曲線を示す。
予備実験では、野生型GM-CSFプラスミドとコドンシャフルされたGM-CSFプラスミドとでトランスフェクトしたHEK細胞の上清中のGM-CSFの濃度を評価した。GM-CSFの発現はELISAにより評価し、図1の標準曲線を使用して濃度に変換した。図2に示した結果は、野生型GM-CSFプラスミドとコドンシャフルされたGM-CSFプラスミドからの発現が同等であることを示す。
一連の3つの独立した実験で、野生型GM-CSFプラスミド及びコドンシャフルされたGM-CSFプラスミドからの発現レベルのより詳細な研究を行った。各実験において、野生型プラスミドとコドンシャフルされたプラスミドの両方について2つの別のバッチのプラスミドを使用した。HEK細胞へのトランスフェクションを四重測定で行った(各プラスミドについて合計で8個のデータ点が得られる)。GM-CSFの平均発現レベルを図3に示す。実験3Aは、コドンシャフルされたプラスミドからの発現に小さな低下があった(p=0.0455)が、繰り返し実験(3Bと3C)では野生型GM-CSFとコドンシャフルされたGM-CSFの発現は同等(それぞれp=0.6744とp=0.7734)であり、図2に示した予備データに一致することを示した。
発現データの要約
発現データは、コドンシャフルされたGM-CSFからの発現が野生型GM-CSFの発現に匹敵することを示す。
発現データは、コドンシャフルされたGM-CSFからの発現が野生型GM-CSFの発現に匹敵することを示す。
生物活性アッセイ
ヒト赤芽球腫細胞株TF-1は、hGM-CSFに応答して増殖することができる。野生型ヒトGM-CSFとコドンシャフルされたヒトGM-CSFのHEK293細胞への一過性トランスフェクション後に上清を採取し、TF-1バイオアッセイでその活性について試験した。細胞上清の希釈物をTF-1細胞に加え、72時間後その増殖を測定した。
ヒト赤芽球腫細胞株TF-1は、hGM-CSFに応答して増殖することができる。野生型ヒトGM-CSFとコドンシャフルされたヒトGM-CSFのHEK293細胞への一過性トランスフェクション後に上清を採取し、TF-1バイオアッセイでその活性について試験した。細胞上清の希釈物をTF-1細胞に加え、72時間後その増殖を測定した。
図4と図5は、上清中のGM-CSFの濃度(定量的ELISAにより測定した)に対して標準化したTF-1増殖アッセイで、野生型(wta、wtc)GM-CSFプラスミドとコドンシャフルされた(csa、csb)GM-CSFプラスミドの比較を示す。結果は、野生型構築体とコドンシャフルされた構築体から発現されるGM-CSFが生物活性があり、同等の活性を有することを確認している。
生物活性データの要約
野生型DNA配列と76.9%の同一性であるが野生型遺伝子産物と同じアミノ酸配列を転写するコドンシャフルされたヒトGM-CSF遺伝子が構築された。コドンシャフルされたGM-CSF遺伝子を含有する発現ベクター(pMNB003)は、同じ発現ベクター(pMNB004)中に挿入された野生型GM-CSF遺伝子と同等レベルの発現を与える。さらにコドンシャフルされたGM-CSFプラスミドと野生型GM-CSFプラスミドとから発現されたヒトGM-CSFは細胞ベースのバイオアッセイで同等レベルの活性を示す。
野生型DNA配列と76.9%の同一性であるが野生型遺伝子産物と同じアミノ酸配列を転写するコドンシャフルされたヒトGM-CSF遺伝子が構築された。コドンシャフルされたGM-CSF遺伝子を含有する発現ベクター(pMNB003)は、同じ発現ベクター(pMNB004)中に挿入された野生型GM-CSF遺伝子と同等レベルの発現を与える。さらにコドンシャフルされたGM-CSFプラスミドと野生型GM-CSFプラスミドとから発現されたヒトGM-CSFは細胞ベースのバイオアッセイで同等レベルの活性を示す。
GM-CSFと抗原プラスミドの同時コーティング
抗原をコードするプラスミドとGM-CSFプラスミドをPMED送達を介して同じ細胞に送達するために、同時コーティングアプローチを開発した。これは、抗原とGM-CSFとの比を最適化して最大の免疫原性を与えるという利点を有する。このアプローチはまた、各プラスミドでコーティングされたビーズを混合する方法と比較して、開発のために標準化することがはるかに簡単である。さらにこれは、同じプラスミド上にコードされた抗原とGM-CSFを有する二重プロモーター構築体が、すべての計画で有用なGM-CSFについて一般的な安全性パッケージを開発することを可能にするという利点を有する。
抗原をコードするプラスミドとGM-CSFプラスミドをPMED送達を介して同じ細胞に送達するために、同時コーティングアプローチを開発した。これは、抗原とGM-CSFとの比を最適化して最大の免疫原性を与えるという利点を有する。このアプローチはまた、各プラスミドでコーティングされたビーズを混合する方法と比較して、開発のために標準化することがはるかに簡単である。さらにこれは、同じプラスミド上にコードされた抗原とGM-CSFを有する二重プロモーター構築体が、すべての計画で有用なGM-CSFについて一般的な安全性パッケージを開発することを可能にするという利点を有する。
GM-CSF発現が抗原の発現に影響を与えず、逆も真であることを証明することが重要であった。
図6は、p7313ieOvaとp7313ieマウスGM-CSFの同時トランスフェクションが抗原(オバルブミン(ovalbumin))の発現を変化させなかったことを示す。
Claims (19)
- タンパク質をコードする非天然遺伝子が、同じタンパク質をコードする野生型cDNA配列と80%未満の相同性を有するDNA配列を含む、非天然遺伝子であって、非天然遺伝子のコドン使用係数が野生型cDNA配列のコドン使用係数以下であることを特徴とする、前記遺伝子。
- 非天然遺伝子のコドン使用係数が野生型遺伝子のcDNA配列と同じであることを特徴とする、請求項1に記載の非天然遺伝子。
- 非天然遺伝子によって、その発現を可能にする形態で、トランスフェクトされた宿主細胞によるタンパク質の産生レベルが、野生型遺伝子でトランスフェクトされた場合の、宿主細胞により産生されるタンパク質のレベル以下であることを特徴とする、請求項2に記載の遺伝子。
- 非天然遺伝子が、ヒトゲノム中に存在する遺伝子によりコードされる成熟型のポリペプチドと同一であるポリペプチドをコードすることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の非天然遺伝子。
- 遺伝子が、コドンシャフルされた顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)をコードすることを特徴とする、請求項4に記載の非天然遺伝子。
- 配列が配列番号1の配列であることを特徴とする、請求項5に記載の非天然遺伝子。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載の非天然遺伝子を含む発現カセット。
- 請求項7に記載の発現カセットを含むプラスミド。
- (a)請求項8に記載のプラスミドベクターと、(b)免疫応答を誘導することが望まれるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとを含む、ワクチン組成物。
- 免疫応答を誘導することが望まれるタンパク質が、HCV、HIV、HPV、又は腫瘍関連抗原から選択されることを特徴とする、請求項9に記載のワクチン組成物。
- 請求項8に記載のワクチンを哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物の免疫応答を誘導する方法。
- TLRアゴニストの投与をさらに含む、請求項10に記載の方法。
- 野生型遺伝子のcDNA配列とDNAレベルで80%未満の相同性を有する合成遺伝子を作製する方法であって、合成遺伝子と野生型cDNA遺伝子が同じポリペプチドをコードし、該方法が、
a)野生型cDNA配列中の各アミノ酸のコドンを同定すること;及び
b)任意のアミノ酸残基が少なくとも2つの位置で野生型cDNA配列によりコードされる場合に、野生型cDNA配列中に存在するコドンの第1の位置から、野生型cDNA配列中に存在しない第2の位置に、少なくとも80%のコドンを移動させること
を含む、前記方法。 - 少なくとも90%のコドンが転位されている、請求項12に記載の合成遺伝子を作製する方法。
- 野生型遺伝子のcDNA配列とDNAレベルで80%未満の相同性を有する合成遺伝子を作製する方法であって、合成遺伝子と野生型遺伝子が同じポリペプチドをコードし、該方法が、
a)野生型cDNA配列中の各アミノ酸のコドンを同定すること;及び
b)各コドンが野生型cDNA配列と同じ比率で合成遺伝子中に存在するように、コドンを再配置させること
を含み、
ここで、細胞により産生されるタンパク質のレベルが、野生型cDNA配列でトランスフェクトした場合の該細胞のレベル以下であることを特徴とする、前記方法。 - 野生型遺伝子のcDNA配列とDNAレベルで80%未満の相同性を有する合成遺伝子を作製する方法であって、合成遺伝子と野生型遺伝子が同じポリペプチドをコードし、該方法が、
a)野生型cDNA配列中の各アミノ酸のコドンを同定すること;及び
b)野生型cDNA配列中の第1の位置から野生型cDNA配列中に存在しない第2の位置に、充分な数のコドンを移動させること
を含み、
ここで、合成遺伝子のコドン使用係数が野生型cDNA配列のコドン使用係数以下であることを特徴とする、前記方法。 - 請求項8又は9に記載の免疫原組成物、ワクチン組成物、又は医薬組成物の安全かつ有効量の投与を含む、患者を治療する方法。
- 疾患状態に関連する抗原性ペプチドをコードするヌクレオチド配列を、適切なベクター内で哺乳動物に投与すること;GM-CSFをコードするヌクレオチド配列を、適切なベクター内で哺乳動物にさらに投与すること;及び、免疫応答を誘導するためにイミダゾキノリン又はその誘導体を、哺乳動物にさらに投与することを含む、疾患状態に対する哺乳動物の免疫応答を誘導する方法。
- 抗原性ペプチド又はタンパク質により開始される免疫応答を増強するための医薬の製造における、請求項7に記載のプラスミドとイミダゾキノリン又はその誘導体の使用であって、抗原性ペプチド又はタンパク質が、ペプチドをコードするヌクレオチド配列の哺乳動物への投与の結果として発現されることを特徴とする、前記使用。
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