CN105031646A - 抗肿瘤疫苗佐剂、其制备方法和编码核酸以及抗肿瘤疫苗组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及由鞭毛蛋白与热休克蛋白gp96制备的融合蛋白Flagp96疫苗佐剂。本发明的疫苗佐剂具有如下的特性：①Flagp96能与Toll-like受体结，活化抗原提呈细胞；②启动特异性CD8⁺和CD4⁺T细胞免疫应答；③具有分子伴侣功能，能与细胞内大量多肽非共价结合，包括细胞中的肿瘤抗原、病毒抗原或胞内细菌抗原。另外，本申请还涉及编码融合蛋白Flagp96的核酸以及融合蛋白Flagp96的制备方法。此外，本发明还提供疫苗组合物，其包括上述佐剂，还包括细胞中的肿瘤抗原、病毒抗原或细菌抗原。

Description

抗肿瘤疫苗佐剂、其制备方法和编码核酸以及抗肿瘤疫苗组合物

技术领域

本发明涉及一种疫苗佐剂，尤其涉及由鞭毛蛋白与热休克蛋白gp96制备的融合蛋白Flagp96疫苗佐剂。另外，本申请还涉及编码融合蛋白Flagp96的核酸以及含有该融合蛋白Flagp96的疫苗组合物。

背景技术

恶性肿瘤是严重威胁人类的健康的多发病和常见病。手术、化疗和放疗是治疗恶性肿瘤的三大传统疗法。肿瘤的免疫治疗近年来发展迅速，提高肿瘤的免疫原性，制备高效的肿瘤疫苗已成为免疫治疗的热点。最有效的疫苗必须既能激活CD4⁺T细胞又能激活CD8⁺T细胞，因此基于树突状细胞的免疫治疗和肿瘤疫苗具有极大的开发及临床应用价值。

树突状细胞(dendriticcells，DCs)是体内功能最强的专职抗原提呈细胞(antigenpresentingcell，APC)，可以通过HLA限制的方式向处女T细胞呈递抗原，能够高水平表达MHC-I、MHC-II类分子，可以分泌免疫刺激因子，表达黏附和共刺激分子，从而诱发CD4⁺Th细胞的有效初始化和产生强效的抗肿瘤CTLs，制备DC疫苗的策略旨在诱导抗原特异性免疫应答和形成免疫记忆。目前，将自体/异体肿瘤细胞或肿瘤抗原与树突状细胞融合，虽可增强其免疫原性，提高CD8⁺T细胞的杀瘤活性，但杀伤效应有限，操作复杂，成本高昂，且肿瘤特异性抗原筛选困难，难于大规模临床应用。

而佐剂是一种非特异性的免疫增强剂，将体液免疫转变为细胞免疫，改变免疫球蛋白的种类和亚类，消除免疫耐受性从而增强免疫反应。理想的佐剂应该有以下特征：能促进体液和细胞介导的免疫，也能作用于弱免疫性抗原，而且不引起有害的副作用，能以不同途径免疫，也能用于不同抗原，能在免疫抑制个体中发挥作用，应用于食用动物不应留有毒素残留，能有效影响免疫反应质量，并且性能稳定、便宜而且容易产生。

树突状细胞作为体内功能最强的专职抗原提呈细胞，是连接抗原与免疫应答细胞以激发有效抗肿瘤免疫应答反应的桥梁。基于活化树突状细胞的肿瘤疫苗，通常以自身肿瘤细胞和同种异体DC融合，产生的融合细胞表达肿瘤抗原并具DC的共刺激能力；或以肿瘤相关抗原、肿瘤细胞溶解物负载DC疫苗，可在不同癌症的治疗中产生肿瘤特异性CD8⁺T细胞免疫应答。但其临床应用中发现许多肿瘤缺乏明确的特异性抗原肽，且单一抗原肽负载DC增加了诱导多样化肿瘤免疫耐受的危险性，这使得肿瘤成分负载DC的免疫治疗缺乏有效靶点。

鞭毛蛋白，是构成细菌的鞭毛纤维的粒状蛋白质，具有较强的抗原性，可以通过自身激发先天性免疫系统产生应答，发挥较强的免疫佐剂作用。我们已经确定Toll-like受体(TLR)功能特性，先天性免疫系统精确熟练的检测入侵的病原微生物。通过TLR识别微生物组分启动信号转导途径，从而触发基因的表达。这些基因产物控制先天免疫反应和进一步指导抗原特异性获得性免疫的发展。

TLR5是鞭毛蛋白受体的一部分，主要表达于肺和肠上皮细胞、单核/巨噬细胞，小肠的固有层未成熟树突状细胞，是鞭毛蛋白的受体。在体内，鞭毛蛋白能够增强抗原特异性CD4⁺T细胞扩增和记忆的发展，与TLR-5相互作用，诱导产生了促炎症反应和激活宿主的树突状细胞。此外，鞭毛蛋白能诱导大量促炎性介质，如TNF-α、IL-1、IL-6、MIP-3α和iNOS，可参与细菌相关病理的发展。类似于内毒素，鞭毛蛋白是全身性炎症反应的有效介质。

热休克蛋白(HSP)gp96是一种高度保守和呈单态性的蛋白质。gp96可与DC表面的受体(如CD91、CD40、Toll-like受体和清道夫受体等)相互作用，通过CD14PTLR2和CD14PTLR4介导的信号转导途径诱导DC成熟并增强其功能，促进CD8⁺和CD4⁺T细胞细胞增殖和分泌细胞因子。能与细胞内大量多肽非共价结合而不受细胞单倍型和MHC分子的影响，包括细胞中的肿瘤抗原、病毒抗原或胞内细菌抗原。gp96-肽复合物也可在体外形成，并具有与体内相似的免疫活性。gp96-肽复合物通过gp96的特异性受体CD91介导的内吞被抗原提呈细胞摄取，然后通过内源性途径将其结合的抗原肽提呈给MHCI类和II类分子，从而启动特异性T细胞CD8⁺和CD4⁺T细胞免疫应答。

综上所述，开发简便、高效、多功能的免疫佐剂迫在眉睫，然而，现有技术中没有将鞭毛蛋白与热休克蛋白融合gp96从而作为免疫佐剂的研究。

发明内容

本发明的申请人通过深入研究发现，通过使鞭毛蛋白与热休克蛋白gp96融合得到的融合蛋白Flagp96能够使鞭毛蛋白和热休克蛋白gp96能够使两者的功能产生协同效应，达到增强特异抗原性，同时能有效活化抗原递呈细胞并增强其抗原递呈能力，刺激特化树突状细胞、CD8⁺T淋巴细胞和自然杀伤(NK)细胞等，功能性激活所必需的其他免疫信号。从而极大地增强机体天然免疫反应的能力，形成免疫消除肿瘤，达到癌症免疫治疗的目标。

根据本发明的一方面，提供一种可作为免疫佐剂的融合蛋白，其为鞭毛蛋白flagelin的氨基酸序列A和热休克蛋白gp96的氨基酸序列B的融合蛋白。

在优选的实施方案中，本发明的融合蛋白中鞭毛蛋白flagelin来源于鼠伤寒沙门氏菌菌株LT2。在另外优选的实施方案中，本发明的融合蛋白中热休克蛋白gp96来源于人类。

优选地，本发明的融合蛋白的序列为SEQIDNO：2所示的序列。

根据本发明的另一方面，提供一种核酸，其编码本发明所述的融合蛋白。优选地，所述序列具有SEQIDNO：1所示的序列。

根据本发明的其它方面，提供制备融合蛋白的方法，其中包括使本发明所述的核酸在细胞表达系统或非细胞表达系统中进行翻译的过程。可选地，所述制备融合蛋白的方法包括通过化学合成方式来合成肽的过程。

此外，本发明还提供本发明中所述的融合蛋白作为佐剂在制备用于治疗肿瘤的疫苗中的用途。此外，本发明还提供本发明所述的核酸在制备用于治疗肿瘤的基团疫苗中的用途。

根据本发明的其它方面，提供一种疫苗组合物，其包括本发明所述的融合蛋白和肿瘤抗原。优选地，所述肿瘤抗原选自细胞抗原、病毒抗原和细菌抗原。

优选地，抗肿瘤疫苗组合物通过包括以下步骤的方法制备：

(1)将肿瘤细胞经过2-10次反复冻融，释放出抗原，增加暴露抗原的数量，表位得到增加，从而增强抗原的免疫原性；

(2)引入白喉毒素，作为载体，有效地递送抗原到MHC类分子上；

(3)加入T辅助表位mHSP70407-426，其来自结核杆菌，能诱导Th1的极化反应，同时刺激Th1极化因子的表位；

(4)将所述多种抗原、白喉毒素和T辅助表位mHSP70407-426用戊二醛偶联；

(5)引入所述抗肿瘤疫苗佐剂。

其中，肿瘤细胞优选地选自由HCC1599ATCCCRL-2331、HCC1937ATCCCRL-2336、HCC1143ATCCCRL-2321和MDA-MB-468ATCCHTB-132组成的组的至少之一。

本发明的融合蛋白不仅能够增强抗原递呈，还能够刺激特化免疫细胞，如树突状细胞、CD8⁺T淋巴细胞和自然杀伤(NK)细胞等功能性激活所必需的其他免疫信号。从而制服癌症抑制机体天然免疫反应的能力，恢复或形成免疫消除肿瘤，达到癌症免疫治疗的目标。这一免疫治疗有潜力单独使用或与传统的癌症治疗联合使用，形成和建立免疫保护，对抗癌症和转移灶。

通过解释本发明的以下优选实施方案，本发明的其他目的和优点将变得清楚。

附图说明

图1细胞免疫过程的说明图。

图2真核表达载体pFastBac-Flagp96示意图。

图3真核表达载体pFastBac-Flagp96的电泳图，其中M表示DNAmarker；1，2表示阳性质粒条带。

图4融合蛋白的SDS-PAGE纯化过程中SDS-PAGE条带变化的电泳图。注：1为marker；2为纯化前细胞裂解液蛋白条带；3为亲和层析柱层析后蛋白条带；4为第一次洗脱后蛋白条带；5为第二次洗脱后的目的蛋白条带；6为第三次洗脱后目的蛋白条带。

图5融合蛋白的Westernblotting免疫印迹图。利用Westernblotting验证目的蛋白Flagp96的电泳图；目的蛋白含有HSPgp96，因此选择anti-gp96单克隆抗体进行目的蛋白的验证。1为marker，2为目的蛋白Flagp96。

具体实施方式

除本发明另作说明外，否则本申请中所使用的名词、术语、短语具有本领域内通常的含义。另外，除本发明另有规定外，否则本申请中所使用的试剂、仪器等均为本领域内的常规试剂或仪器，并且它们可在市场上自由获得。

本文所述的术语“抗肿瘤疫苗佐剂”，也称作“疫苗佐剂”，是指能够非特异性的增强免疫的物质，优选多肽物质，其能够将体液免疫转变为细胞免疫，改变免疫球蛋白的种类和亚类，消除免疫耐受性从而增强免疫反应。其特征在于：能促进体液和细胞介导的免疫，也能作用于弱免疫性抗原，而且不引起有害的副作用，能以不同途径免疫，也能用于不同抗原，能在免疫抑制个体中发挥作用。

本文所使用的术语“融合蛋白”是指通过DNA重组技术得到的两个以上基因重组后的表达产物，或者通过其他生物学和化学方法将两个以上的氨基酸序列融合而得到的蛋白。

上述两个以上的基因可为相同基因或不同基因，本发明中优选为不同基因，更优选为来源于不同生物物种的基因，例如，两个以上的基因可为来源于微生物与高等生物的基因。

此外，本文所述的“氨基酸序列”是指两个以上的氨基酸通过共价键结合的化合物。其中氨基酸可为天然氨基酸或氨基酸衍生物，或者人工修改的氨基酸。

本文所述的融合蛋白可通过本领域内已知的任何手段来获得，例如通过DNA重组技术，用不同基因融合而成的基因在生物表达系统中表达而产生。另外，也可通过化学合成法合成不同的氨基酸序列，最后通过连接不同氨基酸序列而成，或者通过化学合成法延长氨基酸链而成。

本文所述的“鞭毛蛋白flagelin”可来源于沙门氏菌属细菌。它包括在免疫学上可以激发先天性免疫系统应答，引起炎症反应，产生特异性抗体的全长鞭毛蛋白，具有一个以上的氨基酸置换的鞭毛蛋白，或它们的功能片段，或功能片段的组合。可选地，鞭毛蛋白flagelin具有氨基酸序列A。可选地，氨基酸序列A与沙门氏菌属细菌鼠伤寒沙门氏菌菌株LT2的鞭毛蛋白具有80％以上，例如90％以上、95％以上或99％以上同源性的序列。从有效融合并发挥抗原特异性的角度，本发明中优选使用鞭毛蛋白的保守区，例如，鞭毛蛋白的C端片段或鞭毛蛋白的N端片段，例如，定位于N-末端79-117的氨基酸残基，或者定位于C-末端408-439的氨基酸残基的片段。从增强鞭毛蛋白抗原特异性的角度，最优选使用鞭毛蛋白的C端片段和N端片段的组合。

另外，本申请中所述的鞭毛蛋白N端片段和C端片段可以通过肽键直接连接，从防止影响N端片段和C端片段各自功能的角度，优选N端片段和C端片段通过间隔序列连接。关于间隔序列可为一个以上的氨基酸序列，优选地，为2-5个氨基酸序列。

本文所使用的术语“热休克蛋白gp96”具有氨基酸序列B，其可为动物来源，优选哺乳动物，特别是人类来源。与鞭毛蛋白相类似，热休克蛋白gp96可为全长序列或者其功能性片段。可选地，氨基酸序列B为与上述热休克蛋白gp96具有80％、90％、95％、甚至99％以上同一性的序列或片段。从有效融合的观点，优选地，本文所述的氨基酸序列B为对应于人源热休克蛋白gp96全长序列的片段。特别地，本文所使用的“热休克蛋白gp96”优选不具有内质网滞留信号肽。

本文所使用的术语“鞭毛蛋白flagelin”和“热休克蛋白gp96”之间可通过肽键直接连接，也可通过序列C连接。其中所述的序列C可为任意长度的氨基酸序列，只要该序列不影响鞭毛蛋白flagelin和热休克蛋白gp96各自的功能即可。优选地，序列C为1个氨基酸，更优选地，序列C为2-5个氨基酸。

关于本文中所使用的“鞭毛蛋白flagelin”和“热休克蛋白gp96”的排列方式没有特别限定，只要能够发挥两种蛋白各自的性能即可。优选地，从氨基酸N端到C端为鞭毛蛋白flagelin-热休克蛋白gp96或热休克蛋白gp96-鞭毛蛋白flagelin。其中在鞭毛蛋白flagelin为片段的情况下，例如在鞭毛蛋白flagelin为N端片段和C端片段组合的情况下，还可优选为鞭毛蛋白flagelin的N端片段-热休克蛋白gp96-鞭毛蛋白flagelin的C端片段，本发明的申请人发现这种排列方式与其它排列方式相比能够提供意想不到的协同效果。

在以N端鞭毛蛋白-C端鞭毛蛋白-全长Gp96的顺序的情况下，本发明的肿瘤疫苗佐剂的序列优选如下所示。

MAQVINTNSLSLLTQNNLNKSQSALGTAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANRFTANIKG60

LTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSIQAEITQRL120

NEIDRVSGQTQFNGVKVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLKQINSQTLGLDTLNVQGGGG180

SGGGGSGGGGSATTTENPLQKIDAALAQVDTLRSDLGAVQNRFNSAITNLGNTVNNLTSA240

RSRIEDSDYATEVSNMSRAQILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSLLRGGGGSGGGGSGGGGS300

DDEVDVDGTVEEDLGKSREGSRTDDEVVQREEEAIQLDGLNASQIRELREKSEKFAFQAE360

VNRMMKLIINSLYKNKEIFLRELISNASDALDKIRLISLTDENALSGNEELTVKIKCDKE420

KNLLHVTDTGVGMTREELVKNLGTIAKSGTSEFLNKMTEAQEDGQSTSELIGQFGVGFYS480

AFLVADKVIVTSKHNNDTQHIWESDSNEFSVIADPRGNTLGRGTTITLVLKEEASDYLEL540

DTIKNLVKKYSQFINFPIYVWSSKTETVEEPMEEEEAAKEEKEESDDEAAVEEEEEEKKP600

KTKKVEKTVWDWELMNDIKPIWQRPSKEVEEDEYKAFYKSFSKESDDPMAYIHFTAEGEV660

TFKSILFVPTSAPRGLFDEYGSKKSDYIKLYVRRVFITDDFHDMMPKYLNFVKGVVDSDD720

LPLNVSRETLQQHKLLKVIRKKLVRKTLDMIKKIADDKYNDTFWKEFGTNIKLGVIEDHS780

NRTRLAKLLRFQSSHHPTDITSLDQYVERMKEKQDKIYFMAGSSRKEAESSPFVERLLKK840

GYEVIYLTEPVDEYCIQALPEFDGKRFQNVAKEGVKFDESEKTKESREAVEKEFEPLLNW900

MKDKALKDKIEKAVVSQRLTESPCALVASQYGWSGNMERIMKAQAYQTGKDISTNYYASQ960

KKTFEINPRHPLIRDMLRRIKEDEDDKTVLDLAVVLFETATLRSGYLLPDTKAYGDRIER1020

MLRLSLNIDPDAKVEEEPEEEPEETAEDTTEDTEQDEDEEMDVGTDEEEETAKESTAEKD1080

ELHHHHHH1088

下文中，详细描述本发明的优选实施方案。需要说明的是，以下内容仅仅用于说明本发明内容，并不能理解为是对本发明的限定。

实施例

实施例1真核表达质粒pFastBacTM-Flagp96的构建

将目的FlagellinN端和C端蛋白序列(N-末端79-117位氨基酸残基对应的碱基序列；C-末端408-439位氨基酸残基对应的碱基序列)，通过基因合成方式合成基因序列(Flagellin_N-FL-Flagellin_C-FL)，DNA序列按照昆虫表达体系进行优化。其中FL为柔性连接子(flexiblelinker)，其序列为：GGGGSGGGGSGGGGS。

利用正向引物：5’-TACCGTGTTCAGTAATTATGTTTG-3’和反向引物：5’-TGTCGACTTTTTCTCTTAAACATT-3’从细胞MDA-MB-231(来自美国ATCC)的cDNA中扩增HSPgp96。通过overlap-PCR将Flagellin_N-FL-Flagellin_C-FL-Gp96-6His连接在一起。产物经琼脂糖凝胶电泳回收纯化后连入pGEM-TeasyT载体(美国Promega)，连接产物转化大肠杆菌XL-1Blue(请注明生产商家或来源)，PCR筛选阳性克隆。

使用BamHI/XhoI酶切构建好的pGEM-TeasyT质粒，释放目的片段，电泳，回收纯化后，分别连接至XhoI、BamHI酶切的pFastBac载体(LifeInvitrogen^TM)中，连接产物转化大肠杆菌XL-1Blue，PCR筛选阳性克隆，测序验证序列正确，获得pFastBac-Flagp96质粒。参见琼脂糖凝胶电泳图2。

带有正确目的基因的pFastBac质粒转入大肠杆菌DH5a-Bac菌株中，通过转化得到Baculovirus病毒Bacmid。提取Bacmid并PCR验证转化正确(其中PCR引物及扩增条件如下所述)。

上游引物：5’-CGGAATTCAATGGCTTTTCCGCCGCGGCGAC-3’，

下游引物：5’-CGGGATCCTTAAGTTTCTGAGTTTCCTTCACCA-3’。

扩增条件为：94℃(5min)→94℃(30s)，58℃(30s)，72℃(180s)，扩增30个循环→72℃(7min)。

实施例2pFastBac-Flagp96在Sf9昆虫细胞中的表达

使用病毒Bacmid转染Sf9昆虫细胞(美国ATCC)，制备Baculovirusstock。

转染sf9细胞的操作步骤如下：

1.在六孔板中接种9×10⁵个细胞/2ml/孔。其中培养基Grace’s培养基中含有青霉素50U/ml，链霉素50ug/ml，10％FBS。

2.27℃培养1h，使细胞贴壁。

3.在这期间制备Bacmid-Flagp96与CellfectinReagent复合物

a.用100ul不完全Grace’s培养基(不含双抗、FBS)稀释1ugBacmid-Flagp96(约5ul)

b.在使用前将CellfectinReagent倒置5-10次，使其充分混匀，取6ulCellfectinReagent用100ul不完全Grace’s培养基(不含双抗、FBS)稀释。

c.将上述两种稀释液合并(总体积约210ul)，轻轻混匀，室温孵育15-45min。

4.在制备Bacmid-Flagp96与CellfectinReagent复合物期间，将六孔板中的培养基吸掉，用2ml不完全Grace’s培养基(不含双抗、FBS)洗涤一次，去掉培养基。

5.在含有210ul的复合物的管内加入800ul的不完全Grace’s培养基(不含双抗、FBS)，轻轻混匀，加到每个孔中。

6.将六孔板内的细胞孵育5h，27℃

7.去掉复合物混合液，然后在每个孔中加2ml完全培养基(Grace’s培养基含双抗、10％FBS)

8.在37℃湿度培养箱中孵育72h或者直到细胞出现病毒感染迹象。

9.将感染的细胞反复冻融，使细胞裂解。

实施例3真核细胞表达蛋白的纯化

用Ni-Sepharose^TM6FastFlow柱料纯化上述处理后的细胞裂解液：先将裂解液经过0.45μm微孔滤膜滤器过滤后，在裂解液中加入咪唑(5mM)/NaCl(500mM)，再与柱料结合，流速控制在0.5ml/分钟，再用平衡缓冲液(5mmol/LPB，500mmol/LNaCl，5mmol/L咪唑)平衡柱料，洗去未结合的杂蛋白。

用溶液(20mmol/LPB，300mmol/LNaCl，50mmol/L咪唑)冲洗柱料，洗脱液(20mmol/LPB，300mmol/LNaCl，200mmol/L咪唑)分次洗脱结合蛋白，收集洗脱液。将获取的真核表达蛋白，置于4℃用pH7.4PBS大体积超滤，超滤三次，每次45分钟。然后用PBS在4℃将蛋白浓缩至0.5ml。

经SDS-PAGE电泳、免疫印迹鉴定超滤浓缩后的蛋白。结果如图4和5所示。

实施例4Flagp96融合蛋白的体外功能检测

(1)与Toll-like受体结合的试验。

由于flagellin与其配体TLR5结合，将激活下游NF-κB、MEKK-p38MAPK等信号通路，我们将Flagp96在DC中共培养，在不同时间点收获细胞，提取蛋白，westernblot方法检测MAPK及其磷酸化。

结果表明，这些Flagp96能够激活DC中的MAPK及其磷酸化。

(2)Flagp96融合蛋白启动特异性CD8⁺和CD4⁺的T细胞免疫应答的试验

进一步，申请人验证了Flagp96对小鼠体内肿瘤相关抗原特异性CD8⁺T细胞反应的影响。具体步骤如下：

幼稚PmelCD8⁺T细胞(2×10⁶)通过尾静脉注射给C57BL/6小鼠(每组5只)，24小时后，用1×10⁶负载gp96、Flagp96与黑色素瘤抗原肽gp10025-33复合物、OVA的DC及负载gp10025-33的Flagellin-DC尾静脉注射免疫小鼠，不同的时间点，收集脾、回流淋巴结，流式分析检测Pmel特异CD8⁺T细胞的增殖；在高尔基体阻断剂存在的情况下，gp10025-33肽刺激4小时后，细胞内染色分析CD8⁺T细胞的IL-2、IFN-γ分泌。

Claims (14)

1.一种抗肿瘤疫苗佐剂，其为鞭毛蛋白flagelin的氨基酸序列A和热休克蛋白gp96的氨基酸序列B的融合蛋白Flagp96，其中所述抗肿瘤疫苗佐剂具有如下性质：

(1)与Toll-like受体结合，活化抗原提呈细胞，

(2)启动特异性CD8⁺和CD4⁺T细胞免疫应答，和

(3)具有分子伴侣功能，能与细胞内的多肽非共价结合。

2.根据权利要求1所述的抗肿瘤疫苗佐剂，其中所述鞭毛蛋白flagelin来源于鼠伤寒沙门氏菌菌株LT2。

3.根据权利要求1或2所述的抗肿瘤疫苗佐剂，其中所述热休克蛋白gp96来源于人类。

4.根据权利要求1或2所述的抗肿瘤疫苗佐剂，其序列为SEQIDNO：2所示的序列。

5.一种核酸，其编码根据权利要求1-4任一项所述的抗肿瘤疫苗佐剂。

6.根据权利要求5所述的核酸，其为SEQIDNO：1所示的序列。

7.一种制备根据权利要求1-4任一项所述的抗肿瘤疫苗佐剂的方法，其中包括使根据权利要求5或6所述的核酸在细胞表达系统或非细胞表达系统中进行翻译的过程。

8.一种制备根据权利要求1-4任一项所述的抗肿瘤疫苗佐剂的方法，其中包括通过化学合成方式来合成肽的过程。

9.根据权利要求1-4任一项所述的抗肿瘤疫苗佐剂在制备抗肿瘤疫苗中的用途。

10.根据权利要求5或6所述的核酸在制备抗肿瘤基因疫苗中的用途。

11.一种抗肿瘤疫苗组合物，其包括权利要求1-4任一项所述的抗肿瘤疫苗佐剂和肿瘤抗原。

12.根据权利要求11所述的抗肿瘤疫苗组合物，其通过包括以下步骤的方法制备：

(1)将肿瘤细胞经过2-10次反复冻融，释放出抗原，增加暴露抗原的数量，使表位得到增加，从而增强抗原的免疫原性；

(2)引入白喉毒素，作为载体，有效地递送抗原到MHC类分子上；

(3)加入T辅助表位mHSP70407-426，其来自结核杆菌，能诱导Th1的极化反应，同时刺激Th1极化因子的表位；

(4)将所述多种抗原、白喉毒素和T辅助表位mHSP70407-426用戊二醛偶联；

(5)引入所述抗肿瘤疫苗佐剂。

13.根据权利要求12所述的抗肿瘤疫苗组合物，其中所述肿瘤细胞为选自由HCC1599ATCCCRL-2331、HCC1937ATCCCRL-2336、HCC1143ATCCCRL-2321和MDA-MB-468ATCCHTB-132组成的组的至少之一。

14.根据权利要求11所述的抗肿瘤疫苗组合物，其中所述肿瘤抗原为病毒抗原和/或细菌抗原。