KR100876263B1 - Ｄｎａ 백신접종에서 면역보강제로서이미다조퀴놀린아민의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 핵산 백신접종과 함께 사용하기 위한 면역보강제로서의 1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 유도체의 용도에 관한 것이다.
Figure R1020037004041
백신, DNA, 면역보강제, 이미다조퀴놀린아민.

Description

ＤＮＡ 백신접종에서 면역보강제로서 이미다조퀴놀린아민의 용도{Use Of Imidazoquinolinamines As Adjuvants In DNA Vaccination}
본 발명은 개선된 DNA 백신접종(vaccination) 및 특히, 백신 조성물(단, 이에 국한되는 것은 아님), 각종 질병에 대해 포유동물에게 백신접종을 하는 방법 및 의약의 제조에 있어서 특정 화합물의 용도에 관한 것이다.
동물에서 면역 반응을 야기하고 그에 따라 감염으로부터 동물을 보호할 수 있는 항원을 동물의 체내로 도입하는 단계를 포함하는 전통적인 백신접종 기술은 다년간에 걸쳐 알려져 왔다. 플라스미드 DNA가 동물 세포를 생체 내에서 직접 감염(transfect)시킬 수 있다는 것을 1990년대 초반에 발견한 후, 항원성 펩티드를 코딩하는 DNA를 동물에 직접 도입시킴으로써, 면역반응을 야기하는 DNA 플라스미드의 사용을 토대로 백신접종 기술을 개발하려는 현저한 연구 노력이 있어 왔다. 현재, "DNA 면역화" 또는 "DNA 백신접종"으로도 불리는 그러한 기술을 사용하여 바이러스, 박테리아 및 기생충 질환에 대한 각종 예비 임상적 모델에서의 보호성 항체(체액성) 및 세포 매개(세포성) 면역 반응을 유발시켜 왔다. 또한, 암, 알레르기 및 자가면역 질환의 치료 및 그로부터의 보호에 있어서 DNA 백신접종 기술의 용도와 관련된 연구가 진행중에 있다.
DNA 백신은 박테리아성 플라스미드 벡터로 보통 구성되는데, 그 속으로 항원성 펩티드 및 폴리아데닐레이션/전사 종결 서열을 코딩하는 중요한 유전자인 강한 프로모터(promoter)가 삽입된다. 상기 중요한 유전자가 코딩하는 면역원 (immunogen)은 완전한(full) 단백질 또는 단순히 항원성 펩티드 서열[병원체, 종양 또는 기타 보호하고자 하는 다른 병원체에 관계됨]일 수 있다. 상기 플라스미드는 예를 들어 E. 콜리에서와 같이 박테리아에서 성장시키고, 이어서 숙주에 투여하기 전에 원하는 투여 경로에 따라 적합한 매질에서 단리 및 제조할 수 있다.
DNA 백신접종과 관련하여 유용한 배경 정보는 도넬리(Donnelly) 등의 문헌[Annual Rev. Immunol. (1997) 15: 617-648]에 기재되어 있고, 동 문헌을 본 명세서에서 전부 참고문헌으로 인용한다.
전통적인 백신접종 기술에 비해 DNA 백신접종은 많은 이점들을 가지고 있다. 먼저, DNA 서열에 의해 코딩되는 단백질이 숙주에서 합성되기 때문에, 단백질의 구조 또는 배열은 질병과 관련된 천연 단백질에 유사할 것으로 예측된다. 또한, DNA 백신접종은 보존된 단백질로부터의 에피토프를 인식하는 세포독성 T 림포사이트 반응을 발생시킴으로써 바이러스의 상이한 균주로부터 보호할 것으로 생각된다. 나아가, 상기 플라스미드는 항원성 단백질이 생성될 수 있는 숙주 세포에 직접 도입되기 때문에 장기간의 면역 반응이 유발될 것이다. 또한, 상기 기술은 단일의 제제에 다양한 면역원들을 조합하여 다수의 질환에 관계된 동시 면역화를 촉진시킬 가능성을 제공한다.
전통적인 백신접종 요법에 비해 DNA 백신접종과 관련된 다수의 이점에도 불 구하고, 동물에 투여되는 플라스미드 DNA에 의해 코딩되는 단백질에 의해 유발된 면역 반응을 증가시키는 역할을 수행할 면역보강제를 개발할 필요성이 있다.
DNA 백신접종은 특히 DNA가 표피에 직접 투여될 때 Th1 반응에서 Th2 반응으로의 부적합한 면역반응 일탈과 종종 관련된다(Fuller and Haynes Hum. Retrovir (1994) 10:1433-41). 핵산 백신으로부터의 원하는 면역 프로파일은 치료하고자 하는 질환에 의존한다는 사실을 인식하고 있다. Th1 반응의 바람직한 자극은 많은 바이러스 질환 및 암에 대한 백신의 효능을 제공할 것으로 생각되며, 반응의 우성 Th2 형은 어떤 자가면역 반응과 관련된 염증 및 알레르기를 억제하는데 효과적일 수 있다. 따라서, 면역 반응을 정량적으로 증가시키거나 반응의 형태를 질환 적응증에 가장 효과적일 수 있는 형태로 전환시키는 방법이 유용할 수 있다.
따라서, 본 발명의 한가지 목적은 DNA 백신접종 절차와 관련하여 사용될 수 있는 면역보강제를 제공하는 것이다. 본 발명의 목적은 또한 그러한 면역보강제에 관련된 개선된 DNA 백신접종법 외에 상기 면역보강제를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 아래 상세한 설명으로부터 자명해질 것이다. 그러나, 현재까지 이들 목적을 충족시키는 것이 어려운 것으로 판명되었는데, 주 원인은 전통적인 백신 기술에 비해 DNA 백신접종과 관련된 역학적(mechanistic) 차이이다. 또한, 적합한 화합물의 확인이 쉽지 않고, 다수의 공지된 면역증강제 (immunopotentiating agent)가 제한적이거나 기껏 각양각색의 성공률으로 DNA 백신접종 기술과 병용하여 시도되어 왔다. 예를 들어, IFN-γ유전자 및 광견병 바이러스 당단백질의 공동 투여는 T 보조세포 반응 및 항체 반응 모두에 억제 효과를 가 졌다(Xiang 및 Ertl).
이러한 배경을 염두에 둘 때, 본 발명자들이 개선된 면역 반응, 특히 DNA 백신접종에서 면역보강제로 사용시 개선된 세포 면역반응을 촉진시키는데 효과적인 면역보강 화합물을 보고하는 것은 매우 놀랄만한 것이다. 이미다조퀴놀린아민 유도체는 IFN-α, IL-6 및 TNF-α을 비롯한 시토킨의 유도인자이다. 예를 들어, 레이터(Reiter) 등의 문헌(J. Leukocyte Biology(1994) 55:234-240) 참조. 이들 화합물 및 그 제조 방법은 PCT 국제특허출원 공개공보 제WO94/17043호에 개시되어 있다. 본 발명자들은 이들 유도체가 DNA 백신접종에서 면역보강제로 효과적으로 사용될 수 있음을 밝혀냈다.
본 발명의 요약
본 발명의 일실시태양에 따르면, (i) 1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 유도체를 포함하는 면역보강 화합물 및 (ii) 질병 상태와 관련된 항원성 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 면역원 성분을 포함하고, 포유동물에 있어서 상기 면역보강 성분이 항원성 펩티드 또는 단백질에 대한 면역 반응을 증강시키는 것인, 백신 조성물을 제공한다.
추가적 측면으로, 본 발명은 항원을 코딩하는 핵산 및 이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 유도체를 순차적으로 또는 동시에 투여하는 것을 포함하는, 항원에 대한 면역반응을 증강시키는 방법을 제공한다.
추가의 실시태양에서, 상기 유도체와 순차 또는 동시 투여되는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 항원에 대한 면역반응의 증강을 위한 의약을 제조함에 있어 이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 유도체의 용도를 제공한다.
추가의 실시태양에서, 본 발명은 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 항원에 대한 면역 반응을 증강시키는, 이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 유도체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 유도체가 본 명세서에서 정의한 화학식 (I) 내지 (VI) 중 하나에 의해 정의된 화합물이다. 더욱 바람직하게는, 화학식 (VI)에 의해 정의된 화합물이다. 특히 바람직하게는, 1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 유도체가 아래 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 화학식 (VI)의 화합물이다.
1-(2-메틸프로필)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민,
1-(2-히드록시-2-메틸프로필)-2-메틸-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민,
1-(2-히드록시-2-메틸프로필)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민,
1-(2-히드록시-2-메틸프로필)-2-에톡시메틸-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민.
다른 실시태양에서, 본 발명은 적합한 벡터 내에서 포유동물에게 질환 관련 항원성 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 투여하고, 부가적으로 상기 포유동물에게 백신 면역보강제로서 면역반응을 증강시키는 1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 유도체를 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 질환에 대한 면역반응을 증가시키는 방법을 제공한다. 추가로, 본 발명은 적합한 벡터 내에서 면역반응을 촉진시키기에 효과적인 양으로 면역원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 투여하는 단 계 및 부가적으로 상기 포유동물에게 백신 면역보강제로서 면역반응을 증강시키기에 효과적인 양으로 1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 유도체를 투여하는 단계를 포함하는, 면역원에 대한 포유동물의 면역 반응을 증가시키는 방법을 제공한다.
추가의 실시태양에서, 본 발명은 포유동물에게 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 투여 결과 발현되는 항원성 단백질 펩티드 또는 단백질에 의해 개시되는 면역반응을 증가시키는 약제를 제조함에 있어, 1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 유도체의 용도를 제공한다.
도면의 간단한 설명
도 1
이미퀴모드는 인플루엔자 바이러스(pVAC1.PR)로부터의 뉴클레오 단백질을 코딩하는 플라스미드를 사용한 백신접종 후의 세포독성 T-세포 반응을 증가시킨다.
도 2
이미퀴모드는 CD4+T 세포의 증가된 증식에 의해 측정되는 바와 같이, 난백 알부민 단백질을 코딩하는 플라스미드를 사용한 백신접종 후 생체내에서의 CD4 세포의 클론성 증식을 증가시킨다.
도 3
이미퀴모드는 증가된 IFN-γ및 IL-4 생성 세포에 의해 측정되는 바와 같이, 난백 알부민 단백질을 코딩하는 플라스미드를 사용한 백신접종 후 생체내 활성화된 CD4 세포의 수를 증가시킨다.
도 4
이미퀴모드는 증가된 IFN-γ및 IL-4 생성 세포에 의해 각각 측정되는 바와 같이, 난백 알부민 단백질을 코딩하는 플라스미드를 사용한 백신접종 후 생체내 Th1 및 Th2 반응을 야기한다.
도 5
이미퀴모드는 HIV 항원 Gag 및 Nef(WRG7077. Gag/Nef)를 코딩하는 플라스미드를 사용한 백신접종 후 세포독성 T-세포 반응을 증가시킨다. WRG7077은 벡터 대조군이다.
도 6
레시퀴모드 1-(2-히드록시-2-메틸프로필)-2-에톡시메틸-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민(이미퀴모드의 유사체)는 증가된 IFN-γ및 IL-4 생성 세포에 의해 측정되는 바와 같이(각각, 6A 및 6B), 난백 알부민 단백질을 코딩하는 플라스미드를 사용한 백신접종 후 생체내 활성화된 CD4 T 세포의 수를 증가시킨다.
도 7
이미퀴모드의 두 유사체, 즉 1-(2-히드록시-2-메틸프로필)-2-메틸-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 및 1-(2, 히드록시-2-메틸프로필)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민은 증가된 IFN-γ및 IL-4 생성 세포에 의해 측정되는 바와 같이(각각, 7A 및 7B), 난백 알부민 단백질을 코딩하는 플라스미드를 사용한 백신접종 후 생체내 활성화된 CD4 T 세포의 수를 증가시킨다.
도 8
이미퀴모드의 국부 투여는 HIV 항원 Gag 및 Nef(WRG7077. Gag/Nef)를 코딩하 는 플라스미드를 사용한 백신접종 후 세포독성 T-세포 반응을 증가시킨다. WRG7077은 벡터 대조군이다.
도 9
이미퀴모드는 난백 알부민을 코딩하는 플라스미드를 사용한 백신접종 후 난백 알부민 발현 EG7.OVA 종양 세포에 의해 면역 테스트된 동물에서 종양의 성장을 지연시킨다.
도 10
이미퀴모드는 난백 알부민을 코딩하는 플라스미드로 예비 면역화된 동물에 이식된 난백 알부민 발현 EG7.OVA 종양 세포의 종양유발성(tumourigenicity)을 감소시킨다.
발명의 상세한 설명
본 명세서 및 청구범위를 통하여, 문맥에 따라 다른 식으로 해석되지 않는 한, "포함한다" 또는 다른 변형들, 예를 들어 "포함하는" 등은 포괄적으로 해석되어야 한다. 즉 이러한 용어들의 사용은 구체적으로 언급되지 않은 완전체(integer) 또는 요소의 포함이 가능하다는 것을 암시한다.
상기 기술된 바와 같이, 본 발명은 면역원성 조성물(예: 백신 조성물) 및 백신 방법에 관한 것이고, 또한 항원 단백질 또는 펩티드인 면역원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포유류 체내에 도입하는 단계(여기서, 상기 단백질 또는 펩티드는 포유류 체내에서 발현되어 항원 단백질 또는 펩티드에 대하여 면역 반응을 야기한다)를 포함하는 백신 방법의 개선에 관한 것이다. 이러한 백신 방법은 공지되어 있으며, 상기 언급된 도넬리(Donnelly) 등의 문헌에 상세히 기술되어 있다.
본원에서 사용된 용어 "백신 조성물"은 면역원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 면역원 성분 및 1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 유도체를 포함하는 면역보강제 성분의 조합을 지칭한다. 상기 조합은 예를 들어 약학적으로 허용가능한 단일 제제 중의 두 성분의 혼합물의 형식 또는 별도의 성분들의 형식, 예를 들어 면역원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 면역원 성분 및 1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 유도체를 포함하는 면역보강제 성분을 포함하며, 여기서 두 성분이 별도로, 순차적으로 또는 동시에 투여되는 키트의 형태이다. 상기 두 성분들의 조합이 실질적으로 동시에 투여되는 것이 바람직하다.
본 명세서 및 청구범위를 통하여 언급된 1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 유도체는 하기 화학식 I-VI로 정의되는 화합물 중 하나 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염인 것이 바람직하다:
Figure 112003009697604-pct00001
상기 식에서,
R11은 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 히드록시알킬, 아실옥시알킬, 벤질, (페닐)에틸 및 페닐로 구성되는 군으로부터 선택되며, 이때 상기 벤질, (페닐)에틸 또는 페 닐 치환기들은 벤젠 고리 상에서 알킬(1 내지 약 4 개의 탄소 원자), 알콕시(1 내지 약 4 개의 탄소 원자) 및 할로겐으로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택된 1 개 또는 2 개의 잔기로 임의적으로 치환되는데, 단 상기 벤젠 고리가 상기 잔기 2 개로 치환된 경우에는 상기 잔기들이 함께 단지 6 개의 탄소 원자를 갖는다;
R21은 수소, 알킬(1 내지 약 8 개의 탄소 원자), 벤질, (페닐)에틸 그리고 페닐로 구성된 군으로부터 선택되며, 이때 상기 벤질, (페닐)에틸 또는 페닐 치환기들은 벤젠 고리 상에서 알킬(1 내지 약 4 개의 탄소 원자), 알콕시(1 내지 약 4 개의 탄소 원자) 및 할로겐으로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택된 1 개 또는 2 개의 잔기로 임의적으로 치환되는데, 단 상기 벤젠 고리가 상기 잔기 2 개로 치환된 경우에는 상기 잔기들이 함께 단지 6 개의 탄소 원자를 갖는다; 그리고,
각 R1은 수소, 알콕시(1 내지 약 4 개의 탄소 원자), 할로겐 및 알킬(1 내지 약 4 개의 탄소 원자)로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택되며, n은 0 내지 2의 정수인데, 단 n이 2인 경우, 상기 R11 기들은 함께 단지 6 개의 탄소 원자를 갖는다;
Figure 112003009697604-pct00002
상기 식에서,
R12는 직쇄 또는 분지쇄 알케닐(2 내지 약 10 개의 탄소 원자) 및 치환된 직쇄 또는 분지쇄 알케닐(2 내지 약 10 개의 탄소 원자)로 구성된 군으로부터 선택되며, 여기서 상기 치환기는 직쇄 또는 분지쇄 알킬(1 내지 약 4 개의 탄소 원자), 시클로알킬(3 내지 약 6 개의 탄소 원자); 직쇄 또는 분지쇄 알킬(1 내지 약 4 개의 탄소 원자)로 치환된 시클로알킬(3 내지 약 6 개의 탄소 원자)로 구성된 군으로부터 선택되며;
R22는 수소, 직쇄 또는 분지쇄 알킬(1 내지 약 8 개의 탄소 원자), 벤질, (페닐)에틸 그리고 페닐로 구성되는 군으로부터 선택되고, 이때 상기 벤질, (페닐)에틸 또는 페닐 치환기는 벤젠 고리 상에서 직쇄 또는 분지쇄 알킬(1 내지 약 4 개의 탄소 원자), 직쇄 또는 분지쇄 알콕시(1 내지 약 4 개의 탄소 원자) 및 할로겐으로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택된 1 개 또는 2 개의 잔기로 임의적으로 치환되는데, 단 상기 벤젠 고리가 상기 잔기 2 개로 치환된 경우에는 상기 잔기들이 함께 단지 6 개의 탄소 원자를 갖는다; 그리고,
각 R2는 직쇄 또는 분지쇄 알콕시(1 내지 약 4 개의 탄소 원자), 할로겐 및 알킬(1 내지 약 4 개의 탄소 원자)로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택되며, n은 0 내지 2의 정수인데, 단 n이 2인 경우, 상기 R2 기들은 함께 단지 6 개의 탄소 원자를 갖는다;
Figure 112003009697604-pct00003
상기 식에서,
R23은 수소, 직쇄 또는 분지쇄 알킬(1 내지 약 8 개의 탄소 원자), 벤질, (페닐)에틸 그리고 페닐로 구성되는 군으로부터 선택되고, 이때 상기 벤질, (페닐)에틸 또는 페닐 치환기는 벤젠 고리 상에서 직쇄 또는 분지쇄 알킬(1 내지 약 4 개의 탄소 원자), 직쇄 또는 분지쇄 알콕시(1 내지 약 4 개의 탄소 원자) 및 할로겐으로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택된 1 개 또는 2 개의 잔기로 임의적으로 치환되는데, 단 상기 벤젠 고리가 상기 잔기 2 개로 치환된 경우에는 상기 잔기들이 함께 단지 6 개의 탄소 원자를 갖는다; 그리고,
각 R3는 직쇄 또는 분지쇄 알콕시(1 내지 약 4 개의 탄소 원자), 할로겐 및 30 직쇄 또는 분지쇄 알킬(1 내지 약 4 개의 탄소 원자)로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택되며, n은 0 내지 2의 정수인데, 단 n이 2인 경우, 상기 R3 기들은 함께 단지 6 개의 탄소 원자를 갖는다;
Figure 112003009697604-pct00004
상기 식에서,
R14는 -CHRARB이고, 여기서 RB는 수소 또는 탄소-탄소 결합인데, 단 RB가 수소인 경우, RA는 알콕시(1 내지 약 4 개의 탄소 원자), 히드록시알콕시(1 내지 약 4 개의 탄소 원자), 1-알키닐(2 내지 약 10 개의 탄소 원자), 테트라히드로피라닐, 알콕시알킬(여기서, 알콕시 잔기는 1 내지 약 4 개의 탄소 원자를 가지며, 알킬 잔기는 1 내지 약 4 개의 탄소 원자를 갖는다), 2-피리딜, 3-피리딜, 또는 4-피리딜이며, 또한 RB가 탄소-탄소 결합인 경우, RB 및 RA는 함께 히드록시 및 히드록시알킬(1 내지 약 4 개의 탄소 원자)로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택되는 1 이상의 치환기들로 임의적으로 치환된 테트라히드로푸라닐 기를 형성하고;
R24는 수소, 알킬(1 내지 약 4 개의 탄소 원자), 페닐, 그리고 치환된 페닐[여기서, 치환기는 알킬(1 내지 약 4 개의 탄소 원자), 알콕시(1 내지 약 4 개의 탄소 원자) 및 할로겐으로 구성되는 군으로부터 선택된다]로 구성되는 군으로부터 선택되며; 그리고
R4는 수소, 직쇄 또는 분지쇄 알콕시(1 내지 약 4 개의 탄소 원자), 할로 겐, 그리고 직쇄 또는 분지쇄 알킬(1 내지 약 4 개의 탄소 원자)로 구성되는 군으로부터 선택된다;
Figure 112003009697604-pct00005
상기 식에서,
R15는 하기로 구성되는 군으로부터 선택된다:
수소; 직쇄 또는 분지쇄 알킬(1 내지 약 10 개의 탄소 원자) 및 치환된 직쇄 또는 분지쇄 알킬(1 내지 약 10 개의 탄소 원자)[여기서 상기 치환기는 시클로알킬(3 내지 약 6 개의 탄소 원자) 및 직쇄 또는 분지쇄 알킬(1 내지 약 4 개의 탄소 원자)로 치환된 시클로알킬(3 내지 약 6 개의 탄소 원자)임];
직쇄 또는 분지쇄 알케닐(2 내지 약 10 개의 탄소 원자) 및 치환된 직쇄 또는 분지쇄 알케닐(2 내지 약 10 개의 탄소 원자)[여기서 상기 치환기는 시클로알킬(3 내지 약 6 개의 탄소 원자) 및 직쇄 또는 분지쇄 알킬(1 내지 약 4 개의 탄소 원자)로 치환된 시클로알킬(3 내지 약 6 개의 탄소 원자)임];
히드록시알킬(1 내지 약 6 개의 탄소 원자); 알콕시알킬(여기서, 알콕시 잔기는 1 내지 약 4 개의 탄소 원자를 가지며, 알킬 잔기는 1 내지 약 6 개의 탄소 원자를 갖는다);
아실옥시알킬[여기서, 상기 아실옥시 잔기는 알카노일옥시(2 내지 약 4 개의 탄소 원자) 또는 벤조일옥시이고, 상기 알킬 잔기는 1 내지 약 6 개의 탄소 원자를 갖는다];
벤질; (페닐)에틸; 그리고 페닐;
이때 상기 벤질, (페닐)에틸 또는 페닐 치환기는 벤젠 고리 상에서 알킬(1 내지 약 4 개의 탄소 원자), 알콕시(1 내지 약 4 개의 탄소 원자) 및 할로겐으로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택된 1 개 또는 2 개의 잔기로 임의적으로 치환되는데, 단 상기 벤젠 고리가 상기 잔기 2 개로 치환된 경우에는 상기 잔기들이 함께 단지 6 개의 탄소 원자를 갖는다;
R25는 하기 기이며
Figure 112003009697604-pct00006
상기 식에서,
Rx 및 Ry는 수소, 알킬(1 내지 약 4 개의 탄소 원자), 페닐, 그리고 치환된 페닐[여기서, 치환기는 알킬(1 내지 약 4 개의 탄소 원자), 알콕시(1 내지 약 4 개의 탄소 원자) 및 할로겐으로 구성되는 군으로부터 선택된다]로 구성되는 군으로부터 선택되며;
X는 알콕시(1 내지 약 4 개의 탄소 원자), 알콕시알킬(여기서, 알콕시 잔기는 1 내지 약 4 개의 탄소 원자를 가지며, 알킬 잔기는 1 내지 약 4 개의 탄소 원자를 갖는다), 할로알킬(1 내지 약 4 개의 탄소 원자), 알킬아미도(알킬기가 1 내지 약 4 개의 탄소 원자를 갖는다), 아미노, 치환된 아미노(치환기는 1 내지 약 4 개의 탄소 원자를 갖는 알킬 또는 히드록시알킬임), 아지도, 알킬티오(1 내지 약 4 개의 탄소 원자)로 구성되는 군으로부터 선택되며; 그리고,
R5는 수소, 직쇄 또는 분지쇄 알콕시(1 내지 약 4 개의 탄소 원자), 할로겐, 그리고 직쇄 또는 분지쇄 알킬(1 내지 약 4 개의 탄소 원자)로 구성되는 군으로부터 선택된다.
선호되는 알킬기는 C1-C4 알킬, 예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필, 2-메틸프로필 그리고 부틸이다. 가장 선호되는 알킬기는 메틸, 에틸 및 2-메틸-프로필이다. 선호되는 알콕시기는 메톡시, 에톡시 그리고 에톡시메틸이다.
상기 화합물 및 그의 제조 방법은 PCT 특허 출원 공보 WO 94/17043에 개시되어 있다.
n이 0, 1 또는 2일 수 있는 경우, n은 0 또는 1인 것이 바람직하다.
상기 치환체 R1-R5는 본 명세서에서 일반적으로 "벤조 치환체"로 지칭한다. 바람직한 벤조 치환체는 수소이다.
상기 치환체 R11-R15는 본 명세서에서 일반적으로 "1-치환체"로 지칭한다. 바람직한 1-치환체는 2-메틸프로필 또는 2-히드록시-2-메틸프로필이다.
상기 치환체 R21-R25는 본 명세서에서 일반적으로 "2-치환체"로 지칭한다. 바람직한 2-치환체는 수소, 탄소수 1 내지 약 6개의 알킬, 알콕시 잔기가 1 내지 약 4개의 탄소 원자를 함유하고 알킬 잔기가 1 내지 약 4개의 탄소 원자를 함유하는 알콕시알킬이다. 가장 바람직한 2-치환체는 수소, 메틸 또는 에톡시메틸이다.
특히 바람직한 것은 1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민이 하기 화학식 VI에 의해 정의되는 화합물, 또는 적절한 경우 그 중 어느 하나의 생리학적으로 허용가능한 염인 경우이다:
Figure 112003009697604-pct00007
상기 식에서,
Rt는 수소, 1 내지 약 4개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄 또는 분지쇄 알콕시, 할로겐, 및 1 내지 약 4개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄 또는 분지쇄 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Ru는 2-메틸프로필 또는 2-히드록시-2-메틸프로필이고;
Rv는 수소, 탄소수 1 내지 약 6개의 알킬, 또는 알콕시 잔기가 1 내지 약 4개의 탄소 원자를 함유하고 알킬 잔기가 1 내지 약 4개의 탄소 원자를 함유하는 알콕시알킬이다.
화학식 VI에서, Rt는 바람직하게는 수소이고, Ru는 바람직하게는 2-메틸프로필 또는 2-히드록시-2-메틸프로필이고, Rv는 바람직하게는 수소, 메틸 또는 에톡시메틸이다.
바람직한 1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민에는,
1-(2-메틸프로필)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 (화학식 VI에서 Rt가 수소이고, Ru가 2-메틸프로필이고, Rv가 수소인 화합물);
1-(2-히드록시-2-메틸프로필)-2-메틸-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 (화학식 VI에서 Rt가 수소이고, Ru가 2-히드록시-2-메틸프로필이고, Rv가 메틸인 화합물);
1-(2-히드록시-2-메틸프로필)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 (화학식 VI에서 Rt가 수소이고, Ru가 2-히드록시-2-메틸프로필이고, Rv가 수소인 화합물);
1-(2-히드록시-2-메틸프로필)-2-에톡시메틸-1-H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 (화학식 VI에서 Rt가 수소이고, Ru가 2-히드록시-2메틸프로필이고, Rv가 에톡시메틸인 화합물); 또는
이들의 생리학적으로 허용가능한 염이 포함된다.
본 발명에 따른 백신접종 방법 및 조성물을 예를 들어 바이러스, 박테리아 또는 기생충 감염, 암, 알레르기 및 자가면역 장애과 같은 다양한 질병 상태에 대한 포유류의 예방 또는 치료에 적합하게 만들 수 있다. 본 발명에 따른 방법 또는 조성물을 이용하여 예방하거나 치료할 수 있는 장애 또는 질병 상태의 구체적인 예들을 일부 들면 다음과 같다:
바이러스 감염
간염 감염 A, B, C, D & E, HIV, 헤르페스 바이러스 1, 2, 6 & 7, 사이토메갈로바이러스, 수두 대상포진, 유두종 바이러스, 엡스타인 바 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 아데노바이러스, 콕사키(coxsakie) 바이러스, 피코르나 바이러스, 로타바이러스, 호흡기 신시티움 바이러스, 수두 바이러스, 코감기 바이러스, 풍진 바이러스, 파포바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 홍역 바이러스.
박테리아 감염
TB 및 나병을 일으키는 미코박테리아, 폐렴구균, 호기성 그람 음성 간상균, 미코플라스마, 포도상구균 감염, 연쇄상구균 감염, 살모넬라균, 클라미디아.
기생충
말라리아, 리슈마니아증, 트리파노소마증, 주혈원충병, 주혈흡충병, 필라리아병
암
유방암, 결장암, 직장암, 머리 및 목 암, 신장암, 악성 흑색종, 후두암, 난소암, 경부암, 전립선암.
알레르기
집 먼지 진드기, 꽃가루 및 다른 환경성 알레르겐으로 인한 비염.
자가면역 질병
전신 홍반성 낭창
바람직하게는, 본 발명의 방법 또는 조성물을 바이러스성 질병인 B형 간염, C형 간염, 인간 유두종 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 또는 단순성 헤르페스 바이러스; 박테리아성 질병인 TB; 유방암, 결장암, 난소암, 경부암, 및 전립선암; 또는 자가면역 질병인 천식, 류머티즘성 관절염 및 알츠하이머 질병을 예방 또는 치료하는 데 사용한다.
이들 구체적인 질병 상태들은 예를 든 것일 뿐이고, 본 발명의 범위에 제한을 두려는 것은 아님을 인식할 것이다.
본 발명에서 참고하는 뉴클레오티드 서열은 포유류 조직 내에서 발현되어 항원 반응을 유발하게 되는데, 전체 단백질을 코딩하거나, 항원 반응을 개시할 수 있는 보다 짧은 펩티드 서열만을 코딩할 수 있다. 본 명세서 및 특허청구범위 전반적으로, "항원 펩티드" 또는 "면역원"이라는 구절은 관련 동물 내에서 면역 반응을 유발할 수 있는 모든 펩티드 또는 단백질 서열을 포함한다. 하지만, 뉴클레오티드 서열이 질병 상태와 관련된 전체 단백질을 코딩하는 것이 가장 바람직한데, 이는 동물 조직 내에서 전체 단백질이 발현되는 것이 천연의 항원 표상을 모방할 가능성이 더 높아 완전한 면역 반응을 일으키기 때문이다. 구체적인 질병 상태와 관련하여 공지된 항원 펩티드 중의 일부 비제한적 예에는 다음이 포함된다:
인간 병원균에 대한 면역 반응을 이끌어낼 수 있는 항원으로서, 항원 또는 항원 조성물이 다음으로부터 유도되는 것: HIV-1, (예를 들면, tat, nef, gp120 또 는 gp160, gp40, p24, gag, env, vif, vpr, vpu, rev), 인간 헤르페스 바이러스, 예를 들면 gH, gL gM gB gC gK gE 또는 gD 또는 이들의 유도체 또는 조기 발현 단백질, 예를 들면 HSV1 또는 HSV2로부터의 ICP27, ICP47, ICP4, ICP36, 사이토메갈로바이러스, 특히 인간 사이토메갈로바이러스, (예를 들면 gB 또는 그의 유도체), 엡스타인 바 바이러스(예를 들면 gp350 또는 그의 유도체), 수두 대상포진 바이러스 (예를 들면 gpI, II, III 및 IE63), 간염 바이러스, 예를 들면 B형 간염 (예를 들면 B형 간염 표면 항원 또는 간염 핵심 항원 또는 pol), C형 간염 바이러스 및 E형 간염 바이러스, 또는 다른 바이러스 병원균, 예를 들면 파라믹소바이러스: 호흡기 신시티움 바이러스(예를 들면 F 및 G 단백질 또는 이들의 유도체), 또는 파라인플루엔자 바이러스, 홍역 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 인간 유두종 바이러스 (예를 들면 HPV6, 11, 16, 18, eg L1, L2, E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7), 플라비바이러스 (예를 들면 황열 바이러스, 뎅기열 바이러스, 진드기 매개 뇌염 바이러스, 일본 뇌염 바이러스) 또는 인플루엔자 바이러스 세포, (예를 들면 HA, NP, NA, 또는 M 단백질, 또는 이들의 조합), 또는 엔. 고노레아(N. gonorrhea) 및 엔. 메닝티디스 (N. meningtidis)를 비롯한 나이세리아(Neisseria) 종과 같은 박테리아성 병원균, (예를 들면, 트란스페린 결합 단백질, 락토페린 결합 단백질, PilC, 아드헤진); 에스. 표진스(S. pyogenes)(예를 들면 M 단백질 또는 그의 단편들, C5A 프로테아제), 에스. 아갈락티에(S. agalactiae), 에스. 뮤탄스(S. mutans); 에이취. 듀크레이(H. ducreyi); 브란하멜라 카타랄리스(Branhamella catarrhalis)로도 알려진 엠. 카타랄리스(M. catarrhalis)를 비롯한 모락셀라(Moraxella) 종(예를 들 면 고분자량 및 저분자량 아드헤진 및 인바진); 비. 페르투시스(B. pertussis)(예를 들면 페르탁틴, 백일해 독소 또는 그의 유도체, 필라멘티어스 헤마글루티닌, 아데닐레이트 사이클레이스, 섬모), 비. 파라페르투시스(B. parapertussis) 및 비. 브론키셉티카 (B. bronchiseptica)를 비롯한 보르데텔라(Bordetella) 종; 엠. 튜버큘로시스(M. tuberculosis)(예를 들면 ESAT6, Antigen 85A, -B 또는 -C, MPT44, MPT59, MPT45, HSP10, HSP65, HSP70, HSP75, HSP90, PPD 19kDa [Rv3763], PPD 38kDa [Rv0934]), 엠. 보비스(M. bovis), 엠. 레프라에(M. leprae), 엠. 아비움(M. avium), 엠. 파라튜버큘로시스(M. paratuberculosis), 엠. 스메그마티스(M. smegmatis)를 비롯한 미코박테리아 종; 엘. 뉴모필라(L. pneumophila)를 비롯한 레지오넬라(Legionella) 종; 장독성 이. 콜리(E. coli)(예를 들면 군체 형성 인자, 열불안정성 독소 또는 그의 유도체, 열안정성 독소 또는 그의 유도체), 장출혈성 이. 콜리, 장병원성 이. 콜리(예를 들면 시가(shiga) 독소 유사 독소 또는 그의 유도체)를 비롯한 에스케리키아(Escherichia) 종; 브이. 콜레라(V. cholera)(예를 들면 콜레라 독소 또는 그의 유도체)를 비롯한 비브리오(Vibrio) 종; 에스. 소니(S. sonnei), 에스. 디센테리아(S. dysenteriae), 에스. 플렉스네리(S. flexnerii)를 비롯한 시겔라 (Shigella) 종; 와이. 엔테로콜리티아(예를 들면 욥(Yop) 단백질), 와이. 페스티스(Y, pestis), 와이. 수도튜버큘로시스(Y. pseudotuberculosis)를 비롯한 예르시니아(Yersinia) 종; 씨. 제주니(C. jejuni)(예를 들면 독소, 아드헤진 및 인바진) 및 씨. 콜리(C. coli)를 비롯한 캄필로박테르(Campylobacter) 종; 에스. 타이피(S. typhi), 에스. 파라타이피(S. paratyphi), 에스. 콜레라수스(S. choleraesuis), 에스. 엔테리티디스(S. enteritidis)를 비롯한 살모넬라 (Salmonella) 종; 엘. 모노사이토진(L. monocytogenes)을 비롯한 리스테리아(Listeria) 종; 에이취. 필로리(H. pylori)(예를 들면 우레아제, 카탈라제, 액포 형성 독소)를 비롯한 헬리코박터(Helicobacter) 종; 피. 에어루기노사(P. aeruginosa)를 비롯한 수도모나스(Pseudomonas) 종; 에스. 아우레우스(S. aureus), 에스. 에피더미디스(S. epidermidis)를 비롯한 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 종; 이. 파에칼리스(E. faecalis), 이. 파에슘(E. faecium)을 비롯한 엔테로코쿠스(Enterococcus) 종; 씨. 테타니(C. tetani)(예를 들면 테타누스 독소 및 그의 유도체), 씨. 디피실(C. difficile)(예를 들면 클로스트리듐 독소 A 또는 B 및 그의 유도체)를 비롯한 클로스트리듐(Clostridium) 종; 비. 안트라시스(B. anthracis)(예를 들면 보툴리눔 독소 및 그의 유도체)를 비롯한 바실루스 (Bacillus) 종; 씨. 디프테리아(C. diphtheriae)(예를 들면 디프테리아 독소 및 그의 유도체)를 비롯한 코리네박테리아(Corynebacterium) 종; 비. 버그도페리(B. burgdorferi)(예를 들면 OspA, OspC, DbpA, DbpB), 비. 가리니(B. garinii)(예를 들면 OspA, OspC, DbpA, DbpB), 비. 아프젤리(B. afzelii)(예를 들면 OspA, OspC, DbpA, DbpB), 비. 안더소니(B. andersonii)(예를 들면 OspA, OspC, DbpA, DbpB), 비. 헤름시(B. hermsii)를 비롯한 보렐리아(Borrelia) 종; 이. 에퀴(E. equi) 및 인간 과립구 에르리히증의 병원체를 비롯한 에르리히아(Ehrlichia) 종; 알. 리켓시(R. rickettsii)를 비롯한 리켓시아(Rickettsia) 종; 씨. 트라코마티스(C. trachomatis)(예를 들면 MOMP, 헤파린 결합 단백질), 씨. 뉴모니아(C. pneumoniae)(예를 들면 MOMP, 헤파린 결합 단백질), 씨. 시타시(C. psittaci)를 비롯한 클라미디아(Chlamydia) 종; 엘. 인터로간스(L. interrogans)를 비롯한 렙토스피라(Leptospira) 종; 티. 팔리둠(예를 들면 희귀 외부 막 단백질), 티. 덴티콜라(T. denticola), 티. 히오디센테리아(T. hyodysenteriae)를 비롯한 트레포네마(Treponema) 종; 티. 곤디(T. gondii)(예를 들면 SAG2, SAG3, Tg34)를 비롯한 톡소플라스마(Toxoplasma) 종; 이. 히스톨리티카(E. histolytica)를 비롯한 엔타모에바(Entamoeba) 종; 비. 미크로티(B. microti)를 비롯한 바베시아(Babesia) 종; 티. 크루지(T. cruzi)를 비롯한 트리파노소마(Trypanosoma) 종; 지. 람블리아(G. lamblia)를 비롯한 기아디아(Giardia) 종; 엘. 메이저(L. major)를 비롯한 레쉬마니아(Leshmania) 종; 피. 카리니(P. carinii)를 비롯한 뉴모시스티스 (Pneumocystis); 티. 바기날리스(T. vaginalis)를 비롯한 트리코모나스 (Trichomonas) 종; 에스. 만소니(S. mansoni)를 비롯한 쉬소스토마(Schisostoma) 종, 또는 씨, 알비칸스(C. albicans)를 비롯한 칸디다(Candida) 종과 같은 효모; 씨. 네오포만스(C. neoformans)를 비롯한 크립토코쿠스(Cryptococcus) 종.
엠. 튜버큘로시스의 다른 바람직한 구체적인 항원은 예를 들면 Rv2557, Rv2558, RPFs: Rv0837c, Rv1884c, Rv2389c, Rv2450, Rv1009, aceA (Rv0467), PstS1, (Rv0932), SodA (Rv3846), Rv2031c 16kDal., Tb Ra12, Tb H9, Tb Ra35, Tb38-1, Erd 14, DPV, MTI, MSL, mTTC2 및 hTCC1(WO 99/51748)가 있다. 엠. 튜버큘로시스의 단백질에는 2종 이상의, 바람직하게는 3종의 엠. 튜버큘로시스의 폴리펩티드가 보다 큰 단백질에 융합된 융합 단백질 및 그의 변종도 포함된다. 바람직 한 변종에는 Ra12-TbH9-Ra35, Erd14-DPV-MTI, DPV-MTI-MSL, Erd14-DPV-MTI-MSL-mTCC2, Erd14-DPV-MTI-MSL, DPV-MTI-MSL- mTCC2, TbH9-DPV-MTI (WO 99/51748)가 포함된다.
클라미디아(Chlamydia)에 가장 바람직한 항원에는 예를 들면 고분자량 단백질(HWMP)(WO 99/17741), ORF3(EP 366 412), 및 추정 멤브레인 단백질(Pmp)이 포함된다. 백신 제제의 다른 클라미디아 항원은 WO 99/28475에 기재된 군으로부터 선택될 수 있다.
바람직한 박테리아 백신은 에스. 뉴모니아(S. pseumoniae)를 비롯한 스트렙토코쿠스 종으로부터 유도된 항원(PsaA, PspA, 스트렙토리신, 콜린 결합 단백질) 및 단백질 항원 뉴모리신(Pneumolysin)(Biochem Biophys Acta, 1989,67,1007; Rubins et al., Microbial Pathogenesis, 25,337-342), 및 그의 돌연변이 해독된 유도체(WO 90/06951; WO 99/03884)를 포함한다. 다른 바람직한 박테리아 백신은 에이취. 인플루엔자 B 타입(예를 들면 PRP 및 그의 콘쥬게이트), 비분류형 에이취. 인플루엔자를 비롯한 헤모필루스(Haemophilus) 종으로부터 유도된 항원, 예를 들면 OMP26, 고분자량 아드헤진, P5, P6, 단백질 D 및 리포단백질 D, 및 핌브린(fimbrin) 및 핌브린 유도된 펩티드(US 5,843,464) 또는 그의 다중 복사 변종 또는 융합 단백질을 포함한다.
본 발명에 사용할 수 있는 항원은 말라리아를 일으키는 기생충으로부터 유도되는 항원을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 플라스모디아 팔시파룸(Plasmodia falciparum)으로부터 유도되는 바람직한 항원에는 RTS, S 및 TRAP가 포함된다. RTS는 B형 간염 표면 항원의 preS2 부분의 4개 아미노산을 통해 B형 간염 바이러스의 표면(S) 항원에 연결된 피. 팔시파룸의 서컴스포로조이트(circumsporozoite, CS) 단백질의 거의 모든 C-말단 부분을 포함하는 하이브리드 단백질이다. 그의 전체 구조는 국제특허출원 PCT/EP92/02591(WO 93/10152로 공고, 영국 특허출원 제9124390.7호에 우선권 주장)에 개시되어 있다. 효모에서 발현되는 경우, RTS는 리포단백질 입자로 생성되고, HBV로부터의 S 항원과 함께 공동 발현되는 경우, RTS,S로 알려진 혼합 입자를 생성한다. TRAP 항원은 국제특허출원 PCT/GB89/00895 (WO 90/01496으로 공고)에 기재되어 있다. 본 발명의 바람직한 실시태양은 항원 제제가 RTS, S 및 TRAP 항원의 조합을 포함하는 말라리아 백신이다. 다단계 말라리아 백신의 성분으로서 후보가 될 수 있는 다른 플라스모듐(Plasmodium) 항원은 피. 팔시파룸, MSP1, AMA1, MSP3, EBA, GLURP, RAP1, RAP2, 세퀘스트린(Sequestrin), PfEMP1, Pf332, LSA1, LSA3, STARP, SALSA, PfEXP1, Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfs16, Pfs48/45, Pfs230 및 이들의 플라스모듐 종 유사체들이다.
본 발명은 항종양 항원의 사용을 의도하고 암의 면역요법 치료에 유용하다. 예를 들면, 전립선암, 유방암, 결장암, 폐암, 췌장암, 신장암 또는 흑색종암의 치료에 사용되는 것과 같은 종양 거부 항원이 있다. 항원의 예에는 MAGE 1, 3 및 MAGE 4 또는 WO 99/40188, PRAME, BAGE, Lage(NY Eos 1으로도 알려짐) SAGE 및 HAGE(WO 99/53061) 또는 GAGE이 포함된다(Robbins and Kawakami, 1996, Current Opinions in Immunology 8, pps 628-636; Van den Eynde et al., International Journal of Clinical & Laboratory Research (1997년 제출); Correale et al. (1997), Journal of the National Cancer Institute 89, p.293). 이들 항원은 흑색종, 폐 암종, 육종 및 방광 암종과 같은 넓은 범위의 종양 유형에서 발현된다.
본 발명에 사용되는 MAGE 항원은 발현 촉진체 또는 면역학적 융합 파트너와의 융합 단백질로 발현될 수 있다. 특히, Mage 단백질은 헤모필루스 인플루엔자 B로부터의 단백질 D에 융합될 수 있다. 특히, 융합 파트너는 단백질 D의 첫번째 1/3을 포함할 수 있다. 그러한 구성은 WO 99/40188에 개시되어 있다. 암 특이적인 에피토프를 함유할 수 있는 융합 단백질의 다른 예에는 bcr/abl 융합 단백질이 포함된다.
바람직한 실시태양에서, 전립선 항원을 사용하고, 예를 들면 전립선 특이적 항원(PSA), PAP, PSCA(PNAS 95(4) 1735-1740 1998), PSMA 또는 프로스타제로 알려진 항원이 있다.
프로스타제는 전립선 특이적 세린 프로테아제(트립신 유사)로서, 아미노산 길이가 254이고, 보존된 세린 프로테아제 촉매 트리아드 H-D-S 및 아미노 말단 프리-프로펩티드 서열을 가지며, 잠재적 분비 기능을 나타낸다(P. Nelson, Lu Gan, C. Ferguson, P. Moss, R. Gelinas, L. Hood & K. Wand, "Molecular cloning and characterisation of prostase, an androgen-regulated serine protease with prostate restricted expression, In Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999) 96,3114-3119). 추정 글리코실화 지점이 기술되었다. 예측된 구조는 다른 알려진 세린 프로테아제와 매우 유사하고, 성숙 폴리펩티드가 단일 영역 안으로 접히는 것을 보여 준다. 성숙 단백질은 아미노산 길이가 224이고, 하나의 A2 에피토프가 천연적으로 프로세싱되는 것으로 나타난다.
프로스타제 뉴클레오티드 서열 및 유래된 폴리펩티드 서열 및 동족체는 퍼군센(Fergusen) 등의 문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999,96, 3114-3119] 및 국제특허출원 WO 98/12302(대응 미국 특허 제5,955,306호), WO 98/20117(대응 미국 특허 제US 5,840,871호 및 제5,786,148호)(전립선 특이적 칼리크레인) 및 WO 00/04149(P703P)에 개시되어 있다.
본 발명은 프로스타제 단백질 및 그의 단편 및 동족체("유도체")에 기초한 프로스타제 단백질 융합을 포함하는 항원을 제공한다. 그러한 유도체는 전립선 종양의 치료에 적합한 치료 백신 제제에 사용하기에 적합하다. 보통, 단편은, 상기 특허 및 특허출원에 개시된 바와 같이, 20 이상, 바람직하게는 50 이상, 더욱 바람직하게는 100 이상의 연속 아미노산을 갖는다.
더욱 바람직한 전립선 항원은 P501S, WO 98/37814의 서열 ID 113으로 알려져 있다. 상기 특허출원에 개시된 바와 같이 20 이상, 바람직하게는 50 이상, 더욱 바람직하게는 100 이상의 연속 아미노산을 포함하는 면역성 단편 및 그의 유전자에 의해 코딩된 부분을 의도한다. 특정 단편은 PS108(WO 98/50567)이다.
다른 전립선 특이적 항원은 WO 98/37418 및 WO/004149로부터 알려져 있다. 또다른 것은 STEAP PNAS 96 14523 14528 7-12 1999 이다.
본 발명의 맥락에서 유용한 항원에 관련된 다른 종양에는 다음이 포함된다: Plu-1 J Biol. Chem 274 (22) 15633-15645,1999, HASH-1, HasH-2, Cripto (Salomon et al Bioessays 199,21 61-70, 미국 특허 5654140) 크립틴(Criptin) 미국 특허 5 981 215. 또한, 암의 치료용 백신에 특히 관련된 항원은 티로시나제 및 서비빈(survivin)도 포함한다.
본 발명은 Muc-1, Muc-2, EpCAM, her 2/ Neu, 마마글로빈(미국 특허 5668267) 또는 WO/00 52165, W099/33869, W099/19479, WO 98/45328에 개시된 것들과 같은 유방암 항원과 조합해서도 유용하다. Her 2 neu 항원은 특히 미국 특허 5,801,005에 개시되어 있다. 바람직하게는 Her 2 neu는 전체 세포외 영역(대략 아미노산 1-645 포함) 또는 그의 단편 및 대략 C 말단 580 아미노산의 전체 세포내 영역 또는 그의 적어도 면역성 부분을 포함한다. 특히, 세포내 부분은 포스포릴화 영역 또는 그의 단편을 포함해야 한다. 그러한 구조는 WO 00/44899에 개시되어 있다. 특히 바람직한 구조는 ECD PD로 알려져 있고 두번째는 ECD □PD로 알려져 있다(WO 00/44899 참조).
본 명세서에서 사용되는 her 2 neu는 래트, 마우스 또는 인간으로부터 유도될 수 있다.
백신은 종양 지지 메커니즘(예를 들면 안지오제너시스, 종양 인베이젼)와 관련된 항원, 예를 들면 tie 2, VEGF를 함유할 수도 있다.
본 발명의 백신은 알레르기, 암 또는 감염성 질병 외에 만성 질병의 예방 또는 치료에도 사용될 수 있다. 그러한 만성 질병은 천식, 아테롬성 동맥경화증, 및 알츠하이머병과 같은 질병들 및 다른 자가면역 질병들이다. 피임약으로 사용되는 백신도 고려할 수 있다.
알츠하이머 신경변성 질병에 잘 걸리는 또는 앓고 있는 환자들의 예방 또는 치료에 관련된 항원은, 특히 N 말단 39-43 아미노산 단편(ABthe 아밀로이드 전구체 단백질 및 더 작은 단편들)이다. 이 항원은 국제특허출원 WO 99/27944(Athena Neurosciences)에 개시되어 있다.
자가면역 질병용 백신 또는 피임용 백신으로 포함될 수 있는 잠재적인 자기 항원에는 시토킨, 호르몬, 성장 인자 또는 세포외 단백질이 포함되며, 더욱 바람직하게는 4-헬리컬 시토킨, 가장 바람직하게는 IL13이다. 시토킨에는 예를 들면 IL1, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL11, IL12, IL13, IL14, IL15, IL16, IL17, IL18, IL20, IL21, TNF, TGF, GMCSF, MCSF 및 OSM이 포함된다. 4-헬리컬 시토킨에는 IL2, IL3, IL4, IL5, IL13, GMCSF 및 MCSF가 포함된다. 호르몬에는 예를 들면 황체형성 호르몬(LH), 난포 자극 호르몬(FSH), 융모막 성선자극 호르몬(CG), VGF, GHrelin, 아구터, 아구터 관련 단백질 및 뉴로펩티드 Y가 포함된다. 성장 인자에는 예를 들면 VEGF가 포함된다.
본 발명의 백신은 만성 질병 및 암과 같은 질병의 면역 치료에 특히 적합할 뿐만 아니라, 잠복기가 긴 감염증의 치료에도 적합하다. 따라서, 본 발명의 백신은 결핵(TB), HIV 감염(예: AIDS) 및 B형 간염 바이러스 감염과 같은 감염성 질병의 면역 치료에 특히 적합하다.
특히 바람직한 실시태양에서, 핵산은 하기 항원 중 1 이상을 코딩한다:
HBV - PreS1 PreS2 및 표면 env 단백질, 코어 및 pol
HIV - gp120 gp40, gp160, p24, gag, pol, env, vif, vpr, vpu, tat, rev, nef
유두종 - E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7, E8, L1, L2
HSV - gL, gH, gM, gB, gC, gK, gE, gD, ICP47, ICP36, ICP4
인플루엔자 - 헤모글루틴(haemaggluttin), 핵단백질
TB - 미코박테리아 수퍼 옥시드 디스뮤타제(Mycobacterial super oxide dismutase), 85A, 85B, MPT44, MPT59, MPT45, HSP10, HSP65, HSP70, HSP90, PPD 19kDa Ag, PPD 38kDa Ag.
뉴클레오티드 서열은 게놈 DNA, 합성 DNA 또는 cNDA를 포함하는 RNA 또는 DNA일 수 있다. 바람직한 뉴클레오티드 서열은 DNA 서열이고 가장 바람직한 것은 cDNA 서열이다. 포유류 세포 내에서 항원 펩티드의 발현을 얻기 위해, 항원 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 적절한 벡터 시스템으로 제시될 필요가 있다. 본 명세서에서 "적절한 벡터"란 항원 펩티드가 포유류 내에서 충분한 양으로 발현되어 면역 반응을 일으킬 수 있게 하는 임의의 벡터를 의미한다.
예를 들면, 선택된 벡터는 항원 펩티드의 발현을 얻을 수 있는 정확한 순서로 정렬된 플라스미드, 프로모터 및 폴리아데닐화/전사 종결 서열을 포함할 수 있다. 이러한 성분들 및 임의적으로 증진제, 제한 효소 지점 및 선택 유전자(예: 내항생 유전자)와 같은 다른 성분들을 포함하는 벡터의 구성은 당업자에게 잘 알려져 있으며 마니아티스(Maniatis) 등의 문헌 ["Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour Press, Vols 1-3, 2nd Edition, 1989]에 상세히 설명되어 있다.
플라스미드가 포유류 숙주 내에서 복제하고 동물의 염색체 DNA 내에서 통합하지 않게 하는 것이 바람직하기 때문에, 진핵 세포에서 기능하는 복제의 원천 없이 플라스미드를 생성하는 것이 바람직할 것이다.
본 발명에 따른 방법 및 조성물은 예를 들어 가축, 실험실 동물, 사육 동물, 사로잡은 야생 동물을 비롯한 모든 포유류, 가장 바람직하게는 인간의 예방 또는 치료 과정과 관련하여 사용할 수 있다.
본 발명자들은 1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 유도체를 DNA 백신접종에 면역보강제로 사용하는 경우 Th1 및 Th2 시토킨 프로필을 증강시킬 수 있다는 것을 입증하였다. 본 명세서에서 면역보강제 또는 면역보강 성분이라는 용어는 상기 유도체 또는 상기 유도체를 포함하는 성분이 면역원에 대한 신체 반응을 바람직한 방향으로 증진시키고(거나) 변형시키는 역할을 한다는 것을 뜻하는 것이다. 따라서, 예를 들면, 면역보강제는 면역 반응을 주로 Th1 반응으로 변환하거나, 두가지 형태의 반응 모두 증가시키는 데 사용할 수 있다. 예를 들면, 면역보강제를 사용하여 주로 Th1 반응에 대한 면역 반응을 변경시키거나, 두 형태의 반응 모두를 증가시킬 수 있다.
면역 반응의 TH1 형의 바람직한 유발인자는 세포 매개 반응이 일어나게 할 수 있다. 고농도의 Th1-형 시토킨은 주어진 항원에 대한 세포 매개 면역 반응의 유도를 촉진하는 경향이 있지만, 고농도의 Th2-형 시토킨은 항원에 대한 체액성 면역 반응의 유도를 촉진하는 경향이 있다.
Th1과 Th2-형 면역 반응의 구분이 절대적이지 않다는 것을 명심하는 것이 중 요하다. 실제로, 한 개체는 주로 Th1 또는 주로 Th2가 존재하는 것으로 기술된 면역 반응을 지지할 것이다. 그러나, 모스만과 코프만(Mosmann and Coffman)에 의한 쥐과의 CD4 +ve T세포 클론에 기술된 것들의 관점에서 시토킨 족들을 고려하는 것이 종종 편리하다(문헌 [Mosmann, T.R. and Coffman, R.L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, p145-173]). 전통적으로, Th1-형 반응들은 T-림프구에 의한 INF-γ 및 IL-2 시토킨의 생성과 관련이 있다. 기타 시토킨들은 IL-12와 같이, T세포에 의해 생성되지 않는다. 대조적으로, Th2-형 반응들은 IL-4, IL-5, IL-6, IL-10의 분비와 관련이 있다.
항원성 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 포함하는 면역원 성분을 다양한 방법으로 투여할 수 있다. 벡터를 적절한 매질, 예를 들면 PBS와 같은 완충된 식염수 용액에 현탁된 벗겨진 형태로(즉, 바이러스 벡터 또는 트랜스펙션 촉진 단백질을 갖는, 리포솜 제제와 관련이 없는 벗겨진 뉴클레오티드 서열로서) 투여한 다음, 근내, 피하, 복강내 또는 정맥내로 투여할 수 있지만, 일부 선행 자료는 근내 또는 피하 주사가 바람직하다고 제시한다(문헌 [Brohm et al Vaccine 16 No. 9/10 pp 949-954 (1998)](그 전문이 참조형식으로 본 명세서에 인용됨)). 추가로, 상기한 경로 외에 경구, 비내(nasal) 또는 폐 경로를 통한 투여를 위하여, 벡터들을 예를 들면, 리포솜으로 캡슐화하거나, 폴리락티드 코-글리콜리드(PLG) 입자(25) 내에 캡슐화할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시태양에 따르면, 바람직하게는 유전자-총 (특히 입자 충격) 투여 기술을 사용한 면역원 성분의 피내 투여도 가능하다. 상기 기술들은 예를 들면 문헌[Haynes et al J. Biotechnology 44: 37-42 (1996)]에 기술된 바와 같이, 금 비드 상에 면역원 성분을 코팅한 다음, 표피 내로 고압 하에 투여하는 것을 포함할 수 있다.
항원성 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터들을 예방 또는 치료적으로 효과적인 양으로 투여한다. 투여되는 양은 일반적으로 입자 매개 전달의 경우 투여량 당 뉴클레오티드 1 피코그램 내지 1 밀리그램, 바람직하게는 1 피코그램 내지 10 마이크로그램이고, 기타 경로의 경우 10 마이크로그램 내지 1 밀리그램이다. 정확한 양은 면역시킬 포유동물의 종 및 체중, 투여 경로, 1H-이마다조-[4,5-c]퀴놀린 유도체의 효능 및 투여량, 치료 또는 보호되는 질병 상태의 성질, 면역 반응을 생성하는 대상자의 면역계의 용량 및 목적하는 단백질 또는 치료 효능의 정도에 따라 상당히 변할 수 있다. 이러한 변수들에 기초하여, 의학 또는 수의학에 종사하는 의사들은 적절한 용량 수준을 용이하게 결정할 수 있을 것이다.
항원성 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 면역원 성분은 약 1일 내지 약 18개월의 간격으로, 예를 들면 1 내지 7회, 바람직하게는 1 내지 4회, 반복하여 투여하거나, 일회성 투여로 투여될 수 있다. 그러나, 강조하면, 이러한 치료 체계는 대상 동물의 크기 및 종, 치료/보호될 질병, 투여되는 뉴클레오티드 서열의 양, 투여 경로, 선택된 1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 유도체의 효능 및 용량, 및 숙련된 수의학 또는 의학 종사자에게 명백한 기타 인자들에 따라 상당히 변할 것이다.
본 명세서에 특정된 면역보강제 성분은 예를 들면, 경구, 비내, 폐, 근내, 피하, 피내, 국소 경로와 같은 다양하고 상이한 투여 경로를 통하여 유사하게 투여할 수 있다. 바람직하게는, 상기 성분은 피내 또는 국소 경로로 투여된다. 이러한 투여는 뉴클레오티드 서열의 투여 약 14일 전 내지 약 14일 후, 바람직하게는 약 1일 전 내지 약 3일 후일 수 있다. 가장 바람직한 것은 면역보강제 성분을 뉴클레오티드 서열의 투여와 실질적으로 동시에 투여하는 경우이다. "실질적으로 동시에"가 의미하는 것은 면역보강제 성분의 투여가 바람직하게는 뉴클레오티드 서열의 투여와 같은 시간이거나, 아니면, 뉴클레오티드 투여의 전후 어느쪽으로든 적어도 수시간 내이다. 가장 바람직한 치료 프로토콜에서는, 면역보강제 성분이 뉴클레오티드 서열과 실질적으로 동시에 투여될 것이다. 자명하게도, 이러한 프로토콜은 상기한 변수들의 유형에 따라, 필요에 따라 변화시킬 수 있다.
강조하면, 상기 변수들에 따라, 유도체의 투여 용량도 변할 것이지만, 예를 들면, kg 당(여기서, "kg 당"은 대상 포유동물의 체중을 지칭함) 약 0.1mg 내지 약 100mg의 범위일 수 있다. 1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 유도체의 투여는 뉴클레오티드 서열의 각 후속 또는 부스터 투여로 반복되는 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는, 투여량은 kg 당 약 1mg 내지 약 50mg일 것이다.
1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 유도체만을 포함하는 면역보강제 성분이 원료 화학물질 상태로 투여되는 것이 가능하지만, 약제 형태로 투여되는 것이 바람직하다. 즉, 면역보강제 성분은 1종 이상의 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체 및 경우에 따라 기타 치료 성분들과 배합된 1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린- 4-아민을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 담체(들)은 제제 내에서 기타 성분들과 병용가능하며 그 수여자에 유해하지 않다는 견지에서 "허용가능한"이어야 한다. 상기 제제의 성질은 목적하는 투여 경로에 따라 당연히 변할 것이며, 제약 분야에 공지된 방법으로 제조할 수 있다. 모든 방법은 1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 유도체를 적절한 담체 또는 담체들과 연관시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제제들은 유도체를 액상 담체 또는 미분된 고상 담체, 또는 둘 다와 균일하고 밀접하게 결합시킨 다음, 필요하다면 제품을 원하는 제형으로 형상화하여 제조한다. 경구 투여에 적합한 본 발명의 제제는 캡슐, 카세제(cachet) 또는 정제(각각 예정된 양의 활성 성분을 함유)와 같은 이산 단위로서; 분말 또는 과립으로서; 수성 액체 또는 비수성 액체 중의 용액 또는 현탁액으로서; 또는 수중유(oil in water) 액상 유제 또는 유중수 유제로서 제공될 수 있다. 활성 성분은 거환(bolus), 지제(electuary) 또는 페이스트 상태로 제공될 수도 있다.
정제는 압축 또는 몰딩에 의해, 임의로 1종 이상의 보조 성분과 함께 제조될 수 있다. 압축된 정제는 분말 또는 과립과 같은 자유 유동 형태인 활성 성분을 경우에 따라 결합제, 윤활제, 불활성 희석제, 계면활성제 또는 분산제와 함께 혼합하여 적합한 기계 중에서 압축하여 제조할 수 있다. 몰딩된 정제는 불활성 액상 희석제로 축축하게 된 분말 화합물의 혼합물을 적합한 기계 중에서 몰딩하여 제조할 수 있다.
정제는 코팅되거나 눈금이 새겨질 수 있고, 활성 성분의 지연 또는 조절 방출을 제공하도록 제형화될 수 있다.
주사, 예를 들면 근내, 복강내 또는 피하 투여 경로를 통한 주사를 위한 제제는 항산화제, 완충액, 제균제, 및 제제가 의도된 수여자의 혈액과 등장성이 되게 하는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성 무균 주사 용액; 및 현탁제 및 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 무균 현탁액을 포함한다. 상기 제제는 단위투여 또는 다중투여 용기, 예를 들면, 밀봉된 앰플 및 바이알로 제공될 수 있으며, 무균 액상 담체, 예를 들면 사용 직전에 주사용수만 첨가하면 되는 동결건조(lyophilised) 조건하에 저장될 수 있다. 즉석 주사 용액 및 현탁액은 전술한 종류의 무균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다. 협측(buccal) 또는 비강을 통한 폐 투여에 적합한 제제는 바람직하게는 직경 0.5 내지 7 미크론을 갖는 활성 성분을 함유하는 입자가 수여자의 기관세지 내로 전달되도록 제공된다. 상기 제제에 대한 변형들(possibilities)은 이들이 흡입 장치에서 사용하기 위한, 적합하게는 예를 들면 겔라틴으로된 투과성(piercable) 캡슐 또는 별법으로는 활성 성분, 적합한 액상 추진제 및 임의로 계면활성제 및(또는) 고상 희석제와 같은 기타 성분들을 함유하는 자가-추진(self-propelling) 제제로서 편의적으로 제공될 수 있는 미세하게 분쇄된 분말의 형태이다. 상기 자가-추진 제제는 당업계에 공지된 것들과 유사하며, 확립된 방법에 의해 제조할 수 있다. 이들은 목적하는 분무 특성을 갖는 수동 또는 자동 기능 밸브를 갖추는 것이 적합하며, 상기 밸브는 작동시 마다 예를 들면 50 내지 100㎕의 고정된 부피를 전달하는 계량 형태인 것이 유리하다.
추가의 변형으로는 면역보강제 성분이 분무기(atomiser) 또는 의료용분무기(nebuliser)(이에 의해 가속화된 기류 또는 초음파 진탕을 이용하여 흡입을 위한 미세 소적 분무를 생성시킴)에서 사용하기 위한 용액의 형태일 수 있다.
비내 투여에 적합한 제제는 일반적으로 폐 투여에 대하여 상기한 것들과 유사한 제품을 포함하지만, 상기 제제가 약 10 내지 약 200 미크론의 범위의 입도를 가져 비강 내 보유가 가능하도록 하는 것이 바람직하다. 이것은 적절하다면 적합한 입도의 분말 사용 또는 적절한 값의 선택에 의해 이룰 수 있다. 기타 적합한 제제는 코 가까이에 고정된 용기로부터 코의 통로를 통한 빠른 흡입에 의한 투여의 경우 약 20 내지 약 500 미크론의 범위의 입자 직경을 갖는 조제(coarse) 분말 및 수성 또는 유성 용액 중의 활성 성분 약 0.2 내지 5 %(w/w)를 포함하는 점비액을 포함한다. 본 발명의 한 실시태양에서는, 항원성 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터가 1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 유도체와 동일 제제 내에 투여되는 것이 가능하다. 따라서, 이 실시태양에서는, 면역원 및 면역보강제 성분이 동일 제형 내에서 발견된다.
바람직한 실시태양에서, 면역보강제 성분은 유전자총 투여에 적합한 형태로 제조되며, 뉴클레오티드 서열의 투여와 실질적으로 동시인 경로를 통하여 투여된다. 이러한 방식에 사용하기에 적합한 제제의 제조를 위하여, 1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 유도체를 동결건조시키고, 예를 들면 유전자총 투여에 적합한 금 비드 상에 부착시키는 것이 필요할 수 있다.
별법적 실시태양에서는, 면역보강제 성분은 고압 기체 추진 수단을 통하여 건조 분말로서 투여될 수 있다. 이것은 뉴클레오티드 서열의 투여와 실질적으로 동시에 일어나는 것이 바람직하다.
함께 제형화되지 않았더라도, 면역보강제 성분을 뉴클레오티드 서열과 동일한 투여 부위 또는 근처에서 투여하는 것이 적절할 수 있다.
약제의 기타 상세한 설명은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennysylvania (1985)](그 전문의 개시 내용이 본 명세서에 참고로 인용됨)에서 발견할 수 있다.
본 발명은 이제 하기 비제한적 실시예를 참고하여 추가로 설명될 것이다.
1. 이미퀴모드는 핵산 백신에 대한 세포독성 T세포 반응의 정도를 증가시킨다.
플라스미드의 구성 및 DNA 제조
사용 플라스미드는 pVAC1(Michelle Young(GlaxoWellcome, UK)으로부터 구입), 포유동물 발현 벡터의 변형, pCI(Promega)에 기초하는데, 여기서 다중 클로닝 자리인 EcoRI 내지 Bst ZI는 5' 말단에 특이 Nhe I, Rsr II 및 Xho I 제한 효소 자리를 가지며, 3' 말단에 특히 Pac I, Asc I 및 Not I 제한 효소 자리를 갖는 EMCV IRES 서열에 의해 치환되었다.
인플루엔자 뉴클레오 단백질 발현 플라스미드인 pVAC1.PR은 pAR501(Dr. D. Kiossis(NIMR, London, UK)로부터 얻음)로부터 인플루엔자 A 바이러스 균주 PR/8/34의 뉴클레오 단백질을 코딩하는 PCR 증폭 cDNA를 발현 벡터 pVAC1에 접합시 켜 만들어졌다.
플라스미드 DNA는 E. 콜리에서 증식되었고, 플라스미드 정제 키트(QIAGEN Ltd, Crawle, UK)를 사용하여 제조되고, 10mM 트리스/EDTA 완충액 중의 약 1mg 플라스미드 DNA/ml에서 -20℃에서 저장하였다.
DNA 면역화를 위한 카트리지의 제조
Accell 유전자 전달 장치를 위한 카트리지의 제조는 전기한 바와 같다(문헌 [Eisenbraun et al DNA and Cell Biology, 1993 Vol 12 No 9 pp 791-797; Pertner et al] 참조). 요약하면, 플라스미드 DNA를 2㎛ 금 입자(DeGussa Corp., South Plainfield, N.J., USA), Tefzel 튜브내로 충전시키고, 이어서 튜브를 카트리지로 사용하기 위해 1.27cm 길이로 절단하고, 사용시 까지 4℃에서 건조 보관하였다. 전형적 백신접종에서, 각 카트리지는 빈 벡터(pVAC1)를 총 0.5㎍ DNA/카트리지를 제공하도록 가하면서 약 0.05㎍ pVAC1.PR로 코팅된 금 0.5mg을 함유하였다.
면역화
이미퀴모드가 핵산 백신접종에 의해 생성된 세포독성 T세포 반응을 증가시킬 수 있는지를 시험하기 위해, pVAC1.PR을 마우스의 피부내로 입자 매개 유전자 전달(0.05㎍/카트리지)에 의해 투여하였다. 플라스미드는 500lb/in2에서 Accell 유전자 전달 장치(McCabe WO95/19799)를 사용하여 두 카트리지로부터 C57BI/6 마우스(Charles River United Kingdom Ltd(Margate, UK)로부터 구입)의 복부의 면도된 표적 부위로 전달되었다. 백신접종 직후, 이미퀴모드(무균수 중의 메틸셀룰로오스 0.3%(w/v) 및 트윈(Tween) 0.1%(v/v)를 포함하는 비히클 중의 현탁액으로서 제조) 를 단독 피하 주사(0.05ml/체중 10g, 투여량 30mg/kg을 제공하도록 제제화)에 의해 면역화 부위에 투여하였다. 플라스미드 및 이미퀴모드 대조군은 각각 빈 벡터(pVAC1) 및 비히클이었다.
세포독성 T세포 반응
세포독성 T세포 반응을 1주일 후에 수거된 비장세포의 CD8+ T세포-제한된 IFN-γELISPOT 분석에 의해 평가하였다. 마우스들을 단두 치사시키고, 비장을 빙냉 PBS 내로 수거하였다. 비장세포를 인산염 완충 식염수(PBS)로 얇게 뜬 다음 적혈구 세포를 용혈시켰다(NH4Cl 155mM, KHCO3 10mM, EDTA 0.1mM로 이루어진 완충액 중에서 1분). PBS 중에서 2회 세척으로 입자상 물질을 제거한 후, 단독 세포 현탁액을, 사전에 포획 IFN-γ항체로 코팅되고 CD8-제한 동족(cognate) 펩티드로 자극된 ELISPOT 플레이트내로 분취하였다. 밤새 배양시킨 후, IFN-γ생성 세포를 항-쥐(murine) IFN-γ-비오틴 표지된 항체(Pharmingen)를 적용한 다음 스트렙타비딘-콘쥬게이션된 알칼리성 포스파타아제에 의해 가시화하고, 상 분석을 통하여 정량화하였다.
이 실험의 결과(도 1)는 pVAC1.PR 및 이미퀴모드의 조합으로 처리된 마우스의 비장의 세포독성 T세포 수가 pVAC1.PR+ 비히클 단독의 경우보다 3배 이상 크다는 것을 보여준다. 대조 플라스미드(pVAC1) + 이미퀴모드 또는 비히클 군 사이에 아무런 차이도 보이지 않았다는 것은 이미퀴모드의 효과가 항원-제한성이라는 것을 나타낸다. 이러한 결과는 이미퀴모드가 핵산 백신접종을 위한 잠재적 면역보강제 라는 것을 명백히 보여준다.
2. 이미퀴모드는 핵산 백신에 대한 CD4+ T세포 반응의 정도를 증가시킨다.
플라스미드, DNA 및 카트리지 제조
닭 난백 알부민 발현 플라스미드인 pVAC1.OVA를 발현 벡터 pVAC1 내로 pUGOVA(Dr. F. Carbone으로부터 얻음)로부터의 닭 난백 알부민을 코딩하는 PCR 증폭 cDNA를 접합시켜 제조하고, 카트리지를 제조하였다(상기 실시예 1에서와 같이 제조).
마우스 및 면역화
수컷 또는 암컷 D0.11.10 형질전환 마우스(6 내지 10주령)를 베리 그린 농장(Bury Green Farm)의 본 발명자들의 특정병원성미생물이 없는 동물 사육 설비에서 사육하였다. 이러한 마우스들이 발현하는 이식 유전자는 MHC-II 분자(I-Ad)에 결합된 닭 난백 알부민 펩티드 잔기(잔기 323-339; OVA 펩티드)에 특성적인 T세포 수용체(TCR)이다. 특성적으로 이 TCR을 인식하는 단클론성 항체인 KJ1-26을 TCR-이식 유전자 T세포의 동정을 위해 사용한다. 다수의 이러한 마우스들의 시험은 큰 비율(40 내지 65%)의 CD4+ T세포가 KJ1-26+이지만, 매우 작은 비율의 CD4_ CD8+ KJ1.26+ T세포도 존재한다는 것을 보여준다(문헌 [Pape, et al Immunological Reviews (1997) 156: 67-78]).
Balb/c 마우스를 영국 마르게이트에 소재한 회사[Charles River United Kingdom Ltd.]로부터 구입하였다.
측정될 면역 파라미터의 민감도를 증가시키는 입양 전이(adoptive transfer) 모델을 사용하여 CD4+ T세포 반응을 검사하였다. 여기서, 난백 알부민 단백질로부터의 펩티드 서열을 특성적으로 인식하는 T세포가 면역화 전의 자연적 야생형 마우스 내로 이식 유전자로부터 입양 전이되었다. 요약하면, 면역화 24시간 전에, D0.11.10 비장세포를 6 내지 8주령의 Balb/c 마우스에게 입양 전이하였다. 비장세포는 상기 실시예 1에서와 같이 제조하였다. 이어서, 세포들을 100㎕의 주사에 의해 측면 꼬리 정맥으로 입양 전이시켰다(즉, 25 x 106 비장세포/마우스).
이어서, 마우스들을 난백 알부민 코팅 플라스미드(pVAC1.OVA; 0.5㎍/카트리지) 및 이미퀴모드(30mg/kg)로, 또는 실시예 1에서와 같이 대조 플라스미드 또는 비히클로 입자 매개 유전자 전이에 의해 면역화하였다.
CD4 T세포 반응
마우스들을 단두 치사시키고, 서혜부 및 대동맥주위 림프절을 수거하고, 적혈구 세포 용혈 단계를 생략한 것을 제외하고는 비장세포의 경우와 마찬가지로 준비하였다(실시예 1에 기술).
CD4+ T세포의 클론성 확장에 이은 면역화를 측정하기 위하여, 동족 난백 알부민 펩티드를 사용한 시험관 재면역화에 수반하는 난백 알부민-특성적 T세포의 증식을 면역화 3일 후에 수거된 림프절 준비물에서 평가하였다. 세포 증식에 의한 삼중수소화 티미딘을 취하여 평가된 증식은 pVAC1.OVA + 비히클과 비교시 pVAC1.OVA + 이미퀴모드의 조합의 경우 두 배 이상 이었다(도 2). 대조 플라스미 드(pVAC1) + 이미퀴모드 또는 비히클 군 사이에 아무런 차이가 보이지 않는 것은 이미퀴모드의 효과가 항원-제한되었다는 것을 가리킨다.
pVAC1.OVA 단독(70% 증가)와 비교시, 면역화 6일 후 수거된 림프절 세포 상 IL-2 ELISPOT(실시예 1)에 의해 평가된 CD4 T세포의 활성화에서의 실질적 증가가 pVAC1.OVA + 이미퀴모드의 조합에 대해 발견되었다(도 3).
이러한 결과들은 생체내 이미퀴모드의 보강 효과가 두 개의(즉, CD8 + 세포독성세포 및 CD4 + 보조세포) T세포 개체수 모두로 확장된다는 것을 보여준다. 이들은 또한 핵산 백신접종을 위한 이미퀴모드의 보강 효과의 잠재성을 확인시켜준다.
3. 이미퀴모드는 핵산 백신에 대한 Th1 및 Th2 반응을 유발한다
CD4 + 아군(subset)들을 입양 전이 모델(상기 실시예 2)을 사용하여 평가하였다. IFN-γ-생성 (Th1) 및 IL-4-생성(Th2) 세포를 ELISPOT(상기 실시예 1)에 의해 분석하였다. 이미퀴모드는 두 개의 시토킨-생성 세포 모두에서 증가를 유도하였지만, IL-4와 비교시 IFN-γ에 대한 증가가 더 실질적이었다(도 4). 어떠한 시토킨 생성 세포도 빈 벡터 면역화 대조군에서 검출되지 않았다. IFN-γ-생성 세포를 향한 편향은 이미퀴모드가 핵산 백신접종을 위한 면역보강제로서 작용할 뿐 아니라, Th1 형태의 반응을 바람직하게 유도한다는 것을 가리킨다(후자는 상기 실시예 1에서 구체화됨).
4. 체액성 면역 반응에 대한 이미퀴모드의 효과
이미퀴모드가 핵산 백신접종에 의해 발생한 체액성 반응을 증가시키는지를 시험하기 위하여, 항원(예; 인플루엔자 바이러스로부터의 뉴클레오 단백질)을 코딩하는 플라스미드를 마우스의 피부로 PMGT에 의해 투여한다. 일차 면역화에 이어 1회 이상의 부스트 면역화를 한다(각 면역화 간격은 적어도 4주임). 각 면역화 전 및(또는) 직후, 이미퀴모드를 면역시킬 부위에 단독 피하 주사에 의해 투여한다. 플라스미드 및 이미퀴모드 대조군들은 각각 빈 벡터(즉, 항원이 없음) 및 비히클이다. 혈액 샘플을 면역화 1 내지 3일 전 및 후 일정 간격으로 꼬리 정맥으로부터 수거한다. 혈청을 분리하고, 후속 항체 분석을 위하여 -20℃에서 저장한다.
체액성 반응은 일차 및 부스트 면역화 후 수거된 혈청 샘플에서 항원-특이적 전체 IgG 항체 수준(예; 인플루엔자 바이러스로부터의 뉴클레오 단백질)에 의해 평가한다. 미소적정판(Nunc Immunoplate F96 maxisorp, Lifet Technologies)을 4℃에서 밤새 배양에 의해 항원 10㎍/ml로 코팅하고, 세척 완충액(5% 트윈 20 및 0.1% 아지드화나트륨을 함유하는 PBS)으로 4회 세척한다. 이어서, 혈청 샘플을 블록킹 완충액에서 연속적으로 희석시키면서 20℃에서 1시간 배양한다. 4회의 추가 세척(상기한 바와 같이)으로 결합되지 않은 항체를 제거하고, 블로킹 완충액 중에서 퍼옥시다아제 콘쥬게이션된 항-마우스 IgG 항체(Southern Biotechnology)를 희석시키면서 판을 1시간 동안 배양한다. 결합된 항체의 양은 4회의 추가 세척(상기한 바와 같이) 후 TMB 기질 용액(T-8540-Sigma)의 첨가에 의해 결정한다. 빛으로부터 보호하면서 20℃에서 30분 후, 1M 황산으로 반응을 정지시키고 흡광도를 450nm에서 판독한다. 역가는 OD 0.2에 도달하는 최고 희석으로서 정의된다. 이미퀴모드 없이 면역화된 것들에 대한 이미퀴모드로 처리된 면역화 마우스에서의 항체 수준의 증가는 체액성 반응에 대한 이미퀴모드의 증강 효과를 나타낸다.
5. 이미퀴모드는 HIV 항원에 대한 면역 반응을 증가시킨다
플라스미드, DNA 및 카트리지 제조
Gag 및 Nef 항원(즉, WRG7077Gag/Nef)을 발현하는 플라스미드는 WRG7077에 기초하여 만들었다. 원 WRG7077 플라스미드는 pUC19(Amersham Pharmacia Biotech UK Ltd(Amersham Place, Little Chalfont, Bucks, HP7 9NA 소재)로부터 구입가능)의 EamI 1051 - PstI 단편을 함유하는 베타-락타마제 유전자를 카나마이신 내성 유전자를 함유하는 pUC4K(Amersham-Pharmacia)의 EcoRI 단편으로 대체한 후, 두 단편들의 T4 DNA 중합 효소를 사용한 평활말단화에 의해 만들었다. 인간 거대세포바이러스 IE1 프로모터/인핸서, 인트론 A를 플라스미드 JW4303(Dr. Harriet Robinson(University of Massachussets)로부터 얻음)로부터 유도하였고, 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 시그널을 혼입시키면서, Xhol - Sal1 단편으로서 pUC19의 Sal1 자리로 삽입하였다. Gag-Nef 접합은 HIV-1 균주 248A(Genbank Acc. No. L15518, a kink gift from G. Thompson), 및 HIV-1 클레이드 B 균주 HXB2(Genbank Acc. No. K03455)를 함유하는 플라스미드 pHXBΔPr(Maschera et al., 1995)p17p24(Gag)로부터 유도된, 첫번째 65 아미노산을 제거하는 유전자의 5' 말단으로부터 결실된 195bp로 절단된 Nef를 PCR 봉합시켜 생성시켰다. 생성 Gag-Nef 접합부는 이어서 NotI-BamHI 단편인 WRG7077로 접합되었다. 플라스미드 DNA 및 카트리지 제조는 실시예 1에서 기술한 바와 같다.
마우스 및 면역화
Balb/c 마우스를 면역화하고, 이미퀴모드를 제조하고 투여하였다(실시예 1에서 기술한 바와 같음). 여기서, 마우스들은 일차 면역화된 후, 42일 후 부스트 면역화되었다. 이미퀴모드(100mg/kg)를 부스트에서만 투여하였다.
세포독성 T세포 반응
IFN-γELISPOT 분석은 부스트 면역화 5일 후 수거된 비장세포를 자극하기 위하여 Gag 및 Nef 항원들에 대한 CD8-제한 동족 펩티드를 사용하여, 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행하였다.
비히클만을 갖는 플라스미드를 받은 군과 비교시, 이미퀴모드를 공동 투여할 경우 세포독성 T세포에서의 실질적 증가가 관찰되었다(Gag 및 Nef에 대하여 각각 10배 및 100배)(도 5). 이러한 발견들은 이미퀴모드의 보강 효과가 항원 특이적이지 않음을 제시하고, 바이러스 항원의 경우의 효능, 특히 HIV에 대한 효능을 예시한다.
6. 이미퀴모드의 유사체들은 핵산 백신에 대한 효과적인 면역보강제이다.
상기 pVAC1.OVA 플라스미드를 사용하여 카트리지를 제조하였고, 면역화 및 T 세포 반응들은 실시예 2에 기술된 바와 같았다. 테스트된 이미퀴모드의 유사체들은 1-(2-히드록시-2-메틸프로필)-2-에톡시메틸-1-H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민(즉, 레시퀴모드), 1-(2-히드록시-2-메틸프로필)-2-메틸-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민 그리고 1-(2-히드록시-2-메틸프로필)-1H-이미다조 [4,5-c]퀴놀린-4-아민이었다.
넓은 범위의 투여량에 걸쳐서 레시퀴모드를 테스트한 바, 1 mg/kg이 확실히 최적이었다. 면역화하고 5일 경과한 후에 수집한 림프절 세포를 분석한 결과 IFN- γ를 생산하는 CD4 T 세포들이 6 배 증가하였으며, IL-4를 생산하는 CD4 T 세포들에 대해서는 단지 중간 정도(modest)의 효과가 있었는데(도 6), 이는 나아가 실시예 3에서 관찰된 Th1 편향 효과를 지지하는 것이다.
30 mg/kg으로 1회 투여한 상태에서 나머지 두 개의 유사체들에 대해서 면역화하고 5일 후에 T 세포들에 대한 효과를 조사하였다. 1-(2-히드록시-2메틸프로필)-2-메틸-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민에 의해서 IFN-γ를 생산하는 CD4 T 세포들 및 IL-4를 생산하는 CD4 T 세포들 모두에서 2 배의 증가가 야기되었다. 유사한 효과가 1-(2-히드록시-2-메틸프로필)-1H-이미다조 [4,5-c]퀴놀린-4-아민(도 7)의 경우에 관찰되었다.
전체적으로, 이 실시예의 결과들은 상기 면역보강제 효과가 이미퀴모드만으로 제한되는 것이 아니라 이 화학물질군의 넓은 범위의 화합물들에까지 확장되는 것을 보여준다.
7. 국부 적용은 핵산 백신과 이미퀴모드를 투여하는 효과적인 경로이다.
WRG7077Gag/Nef 플라스미드를 사용하여 카트리지를 제조하였고, PMID 면역화 및 T 세포 반응은 실시예 5에 기술된 바와 같았다. 여기서, 이미퀴모드를 30 mg/kg의 투여양으로 피하 투여하였다. 면역화 후 즉시 PMID 부분에 국부적으로 5% (w/v) 크림 제제(즉, 알다라: Aldara) 20 ㎕를 적용하여 이미퀴모드를 투여하는 경우에는 추가적인 그룹이 포함되었다. 상기 부스트 면역화 후 6일 및 11일 경과후에 분석하기 위해 지라(spleen)를 회수하였다.
이미퀴모드를 피하 주사를 사용하여 또는 국부적으로 함께 투여한 경우는, 플라스미드와 피하(s.c) 비히클만을 투여받은 그룹에 비하여 세포독성 T 세포들에 있어서 상당한 증가가 관찰되었다(즉, 자극하고 11일 후, 대략 2 배)(도 8). 이러한 발견은 국부적으로 투여된 이미퀴모드가 PMID에 대하여 효과적인 면역보강제라는 것을 보여주며, PMID와 조합된 면역보강제의 조사에 있어서 피하 주사법은 국부 적용에 대한 적절한 대용 경로임을 제안한다.
8. 이미퀴모드는 종양 성장의 예방을 위한 효과적인 면역보강제이다.
상기 pVAC1.OVA 플라스미드를 사용하여 카트리지를 제조하였다(실시예 2에 기술된 바와 같음). 12 마리의 마우스들의 군들을 실시예 5에 기술된 바와 같이 PMID에 의해 면역화시켰는데, 단 0.1 ㎍의 DNA 및 이미퀴모드를 함유하는 카트리지를 30 mg/kg의 투여량으로 피하 투여하였다.
종양 시험(challenge)
상기 부스트 후 2 주 경과 후, 각 마우스의 옆구리(flank)에 피하 바늘 주사에 의해 EG7-OVA 세포들을 이식하고(100,000 세포/마우스), 종양의 성장을 관찰하였다. 상기 EG7-OVA 세포들은 원래 에프. 카본[F. Carbone (Moore, M. W., Carbone, F. R. and Bevan, M. J., Cell, 54,777-785, 1988)]에 의해, 안정적으로 닭 난백알부민을 발현시키기 위하여 마우스 복수(ascites) 림프종(lymphoma) 림프모구(lymphoblast) 세포 라인, EL4를 감염시켜서(transfect) 제조되었다.
촉진할 수 있는(palpable) 종양들이 조기에 나타났고, 마우스 대조군들[즉, 빈(empty) 벡터 ±이미퀴모드]의 경우에 가장 빨리 성장하였다. pVAC1.OVA + 이미퀴모드로 면역화된 마우스의 경우에 종양유발성은 25 %이었다. 반면, 다른 모든 군들의 경우 종양유발성은 40 %를 넘었다(도 10). 이러한 결과들은 이미퀴모드가 PMID의 항종양 효과를 개선시킬 수 있다는 것을 보여주며, 이미퀴모드가 질병의 치료를 위한 핵산과의 효과적인 면역보강제가 될 것이라는 점을 제안한다.

Claims (24)

  1. (i) 하기 화학식 VI의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 면역보강 성분, 및
    (ii) 질병 상태와 관련된 항원성 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 면역원 성분
    을 포함하는 백신 조성물:
    <화학식 VI>
    Figure 112008033054164-pct00027
    상기 식에서,
    Rt는 수소, 직쇄 또는 분지쇄 알콕시(1 내지 4개의 탄소 원자), 할로겐, 및 직쇄 또는 분지쇄 알킬(1 내지 4개의 탄소 원자)로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    Ru는 2-메틸프로필 또는 2-히드록시-2-메틸프로필이고,
    Rv는 수소, 알킬(1 내지 6개의 탄소 원자), 또는 알콕시알킬(알콕시 잔기가 1 내지 4개의 탄소 원자를 함유하고 알킬 잔기가 1 내지 4개의 탄소 원자를 함유)이다.
  2. (i) 하기 화학식 VI의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 면역보강 성분, 및
    (ii) 질병 상태와 관련된 항원성 펩티드 또는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 면역원 성분
    을 포함하는 키트:
    <화학식 VI>
    Figure 112008033054164-pct00028
    상기 식에서,
    Rt는 수소, 직쇄 또는 분지쇄 알콕시(1 내지 4개의 탄소 원자), 할로겐, 및 직쇄 또는 분지쇄 알킬(1 내지 4개의 탄소 원자)로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    Ru는 2-메틸프로필 또는 2-히드록시-2-메틸프로필이고,
    Rv는 수소, 알킬(1 내지 6개의 탄소 원자), 또는 알콕시알킬(알콕시 잔기가 1 내지 4개의 탄소 원자를 함유하고 알킬 잔기가 1 내지 4개의 탄소 원자를 함유)이다.
  3. 제1항에 있어서, 상기 성분들이 순차 또는 동시 투여되기 위한 것인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 성분들이 단일의 약학적으로 허용가능한 제제 중에 존재하는 것인 조성물.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Rt가 수소인 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 Ru가 2-메틸프로필 또는 2-히드록시-2-메틸프로필이고, Rv가 수소, 메틸 또는 에톡시메틸인 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 상기 화합물이 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 조성물:
    1-(2-메틸프로필)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민,
    1-(2-히드록시-2-메틸프로필)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민,
    1-(2-히드록시-2-메틸프로필)-2-메틸-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민, 및
    1-(2-히드록시-2-메틸프로필)-2-에톡시메틸-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민.
  10. 제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 각 성분이 경구, 비강, 국부, 폐, 근육내, 피하 또는 피내 경로를 통해 투여되는 백신 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 면역원 성분이 입자 매개 유전자 전달 기술을 사용하여 투여되는 백신 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 면역보강 성분이 입자 매개 유전자 전달 기술을 사용하여 투여되는 백신 조성물.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 하기 화학식 VI의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 항원성 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포유류에게 투여한 결과로 발현되는 상기 항원성 펩티드에 의해 개시되는 면역 반응을 강화시키기 위한 의약:
    <화학식 VI>
    Figure 112008033054164-pct00029
    상기 식에서,
    Rt는 수소, 직쇄 또는 분지쇄 알콕시(1 내지 4개의 탄소 원자), 할로겐, 및 직쇄 또는 분지쇄 알킬(1 내지 4개의 탄소 원자)로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    Ru는 2-메틸프로필 또는 2-히드록시-2-메틸프로필이고,
    Rv는 수소, 알킬(1 내지 6개의 탄소 원자), 또는 알콕시알킬(알콕시 잔기가 1 내지 4개의 탄소 원자를 함유하고 알킬 잔기가 1 내지 4개의 탄소 원자를 함유)이다.
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 제18항에 있어서, 상기 화학식 VI의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 1 mg/kg 내지 50 mg/kg의 양으로 투여하는 것인 의약.
  22. 항원성 펩티드인 면역원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및
    상기 항원성 펩티드에 의해 개시되는 면역 반응을 강화시키는 하기 화학식 VI의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염
    을 포함하는, DNA 백신접종(vaccination)에서의 사용을 위한 별도, 순차 또는 동시 투여를 위한 성분들의 조합물:
    <화학식 VI>
    Figure 112008033054164-pct00030
    상기 식에서,
    Rt는 수소, 직쇄 또는 분지쇄 알콕시(1 내지 4개의 탄소 원자), 할로겐, 및 직쇄 또는 분지쇄 알킬(1 내지 4개의 탄소 원자)로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    Ru는 2-메틸프로필 또는 2-히드록시-2-메틸프로필이고,
    Rv는 수소, 알킬(1 내지 6개의 탄소 원자), 또는 알콕시알킬(알콕시 잔기가 1 내지 4개의 탄소 원자를 함유하고 알킬 잔기가 1 내지 4개의 탄소 원자를 함유)이다.
  23. 제8항에 있어서, 각 성분이 경구, 비강, 국부, 폐, 근육내, 피하 또는 피내 경로를 통해 투여되는 백신 조성물.
  24. 제9항에 있어서, 각 성분이 경구, 비강, 국부, 폐, 근육내, 피하 또는 피내 경로를 통해 투여되는 백신 조성물.
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