TWI287453B

TWI287453B - Use of immidazoquinolinamines as adjuvants in DNA vaccination

Info

Publication number: TWI287453B
Application number: TW090123505A
Authority: TW
Inventors: Lindy Louise Thomsen; John Philip Tite; Peter Topley
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 2000-09-20
Filing date: 2001-09-20
Publication date: 2007-10-01
Also published as: EP1318835A1; MXPA03002453A; US20110002953A1; HUP0301180A2; NZ524792A; AR035586A1; IL154947A0; AU8790801A; ATE401097T1; CA2422863A1; EP1318835B1; BR0113982A; PL360895A1; DE60134866D1; AU2001287908B2; HUP0301180A3; KR100876263B1; MY138978A; CN1473051A; US20070248614A1

Description

1287453 A7 _B7__ 五、發明説明（！）發明領域本發明係有關DNA接種之改良且特定言之（但不限於）係關於疫苗組合物，接種哺乳類動物以對抗疾病狀態之方法，及有關特定化合物於藥劑製造上之用途。發明背景多年來已知傳統接種技術涉及將可在動物誘發免疫反應之抗原導入動物體内，並藉此保護該動物對抗感染。繼1990 年代早期觀察到質體DNA可在活體内直接轉染動物細胞後，已有有意義之研究投入發展以利用DNA質體誘發免疫反應為基礎之接種技術，此係藉由將編碼抗原性胜肽之DNA 直接導入動物體内。這類稱為“DNA免疫”或“DNA接種’’之技術現已經利用於極多種病毒性，細菌性及寄生蟲性疾病之前-臨床模型誘出保護性抗體（體液性）及細胞中介（細胞性）免疫反應與對抗癌症，過敏及自體免疫疾病之治療及保護之DNA接種技術上之用途有關之研究亦在進行中。 DNA疫苗通常由插入強啟動子，編碼抗原性胜肽之感興趣之基因及聚腺（苷）酸化作用/轉錄終止序列之細菌質體載體所組成。該感興趣之基因編碼之抗原可為與病原，腫瘤或其他作用劑有關之完整蛋白質或僅為一抗原性胜肽序列，希望其引起保護性抵抗。可將該質體於細菌中培養，例如大腸桿菌且然後將其分離出且在對宿主投藥前於適當的媒介中製備，此取決於所欲之投藥途徑。與DNA接種有關之有用背景資料係經提供於“多内里 (Donnelly)，J等人 Annual Rev. Immunol (1997) 15 : 617-648” -4- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 裝訂

線 1287453 A7 B7 五、發明説明（2 ) ，其所揭示之内容全文以參考文獻併入此處。相對於傳統接種技術，DNA接種有許多優點。首先，吾人預料因為該DNA序列所編碼之蛋白質在宿主内合成，故該蛋白質之結構或構形會相似於與疾病狀態有關之天賦蛋白質。DNA接種亦可提供保護作用對抗不同品系之病毒，此係藉由產生辨識來自保守蛋白質之抗原決定部位之細胞毒性T 淋巴細胞反應。進一步地，因為將質體直接導入可產生抗原性蛋白質之宿主細胞，所以會謗出财久性免疫反應。該技術亦提供組合多種抗原於單一製備物中之可能性，以幫助同時進行與許多疾病狀態有關之接種。雖然與傳統接種療法相較，DNA接種有多種好處，然而仍有需要發展能增加由投用至動物之質體DNA所編碼之蛋白質所謗發之免疫反應之佐劑化合物。有時DNA接種與由Thl不當偏移至Th2反應之免疫反應有關，特別是當將DNA直接投用至表皮時（富勒（Fuller)及黑尼斯（Haynes) Hum. Retrovir. (1994) 10 : 1433-41)。應知所需之核酸疫苗之免疫表現形式取決於鎖定之疾病。Thl反應之優先刺激作用似乎是提供許多病毒性疾病及癌症之疫苗功效。而以Th2類型為優勢之反應對於限制與某些自體免疫疾病有關之過敏及發炎是有效的。據此，定量提升免疫反應或轉換反應類型成對該疾病病徵最有效之方式係有用的。據此，本發明的一個目的係提供可與DNA接種方法同時利用之佐劑化合物。本發明之目的亦係為提供包括該所考量佐劑之組合物並涉及這類佐劑之改良DNA接種之方法。 -5- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）裝訂

線 1287453 A7 B7 五、發明説明（3 ) 由如下之詳細說明可顯而易見本發明之其他目的。然而至今，經證實難以符合這些目的，主要是由於與傳統疫苗技術相較下與DNA接種有關之機制差異性。並且，合適化合物之確認並非直截了當的，許多已知之賦予免疫力之作用劑已嘗試與DNA接種技術並用，但僅獲致有限的，或頂多是不純然的成功。例如，共投用IFN- r及狂犬病病毒糖蛋白質之基因對丁輔助細胞反應及抗體反應都有抑制作用（Xiang與Ertl) 〇將此背景銘記於心後，請特別注意本案申請人報導了能有效促進改良之免疫反應之佐劑化合物，特定言之，當在 DNA接種中用做佐劑時改良細胞性免疫反應。咪（唑）(産啉）(胺）衍生物係細胞素，包括IFN-α，1L-6及TNF-α，之謗發劑（參看如，瑞塔（Reiter)等人白血球細胞生物學期刊（1994) 55 : 234-240)。這些化合物及其製備方法已經揭示於PCT專利申請公告號WO 94/17043。本案申請人已顯示這些衍生物可有效地用於DNA接種當做佐劑。發明概要根據本發明之一具體實施例，其提供一種疫苗組合物，包含⑴一包含1H-咪唑并[4, 5- c]喹啉-4-胺-衍生物之佐劑組份及（ii) 一包含編碼與疾病狀態有關之抗原性胜肽或蛋白質之核苷酸序列之抗原組份，該佐劑組份在哺乳類動物促進其對該抗原性胜肽或蛋白質之免疫反應。另一方面，本發明提供一種增加對抗原之免疫反應之方法，該方法包含不論是相繼地或同時地投用編碼該抗原之 -6- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 1287453 A7 _ B7 五、發明説明（4 ) 核酸及咪峻并[4,5-c]雙啉_4_胺衍生物。在另-具體實施财，本發明提供咪峻并[4,5·。]些琳j 胺衍生物在製造用以促進對經以一核苷酸序列編碼之抗原產生免疫反應之藥劑上的用途，該核苷酸序列與該衍生物係相繼或同時投用。在另一具體實施例中，本發明進一步提供一種醫藥組合物，其包含一種咪唑并[4,5_c]膣啉胺衍生物以促進對核酸序列編碼之抗原產生之免疫反應。較佳地，该1H-咪唑并[4,5-c]膣啉-4-胺-衍生物係由此處足我之化學式I- VI所定義之化合物。更佳地，其係以化學式 vi定義之化合物。特別較佳者係當1H-咪唑并[4,5_c]膣啉· 4-胺衍生物為選自由如下化合物所組成之群之化學式％化合物時： 1-(2-甲基丙基）-1H-咪唑并[4,5-c]膣琳-4-胺； 1-(2-羥基-2-甲基丙基）-2-甲基-1H-咪唑并[4, 5-c]膣啉-4-胺 9 1-(2,經基-2-甲基丙基）-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺； 1-(2-羥基-2-甲基丙基）-2·乙氧甲基-卜H-咪唑并[4, 5-c]膣琳-4-胺在本發明之另一具體實施·例中提供在哺乳類動物提升對抗疾病狀態之免疫反應之方法，包含投予該哺乳類動物含有編碼與該疾病狀態有關之抗原性胜肽之核苷酸序列之適當載體；並額外投予1H-咪唑并[4, 5-c]喹琳-4-胺衍生物當做疫苗佐劑以提升該免疫反應。本發明進一步提供增加哺本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1287453 A7 _B7_____ 五、發明説明（5 ) 乳類動物對抗原產生免疫反應之方法，包含將有效刺激免疫反應量之含編碼該抗原之核苷酸序列之適當載體投予該哺乳類之步騾；並額外投用有效增加該免疫反應量之1H-咪唑并[4,5-c]膣啉-4-胺衍生物當做疫苗佐劑。較佳地在該方法中，該1H-咪唑并[4, 5-c]堕啉-4-胺衍生物係化學式VI化合物。在另一具體實施例中，本發明提供1H-咪唑并[4, 5-c]璧啉-4-胺衍生物於製造促進肇始於抗原性胜肽或蛋白質之免疫反應之藥劑上的用途，該胜肽/蛋白質之表現係將編碼該胜肽之核苷酸序列投用至哺乳類動物之結果。圖式簡單說明圖1· 米科莫（imiquimod)增加繼接種編碼來自流行性感冒病毒核蛋白之質體（pVAC 1 · PR)後之細胞毒性T-細胞反應。pVAC 1 係控制載體。圖2· 米科莫（imiquimod)增加繼接種編碼卵清蛋白蛋白質之質體後CD4 T細胞在活體内之選殖擴張，此係以增加之CD4+T 細胞增生測量。圖3. 米科莫（imiquimod)增加繼接種編碼卵清蛋白蛋白質之質體後在活體内之活化CD4 T細胞數目，此係以產生IFN- τ及 IL- 4之細胞之增加測量。圖4. -8- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 裝訂

1287453 A7 _B7_______ 五、發明説明（6 ) 米科莫（imiquimod)同時謗發繼接種編碼卵清蛋白蛋白質之質體後在活體内之Thl及Th2反應，此係分別以產生IFN- r 及產生IL-4之細胞之增加測量。圖5. 米科莫（imiquimod)增加繼接種編碼HIV抗原Gag及Nef之質體（WRG7077. Gag/Nef)後之細胞毒性T-細胞反應。WRG7077 係控制載體。圖6. 米科莫（imiquimod)的一個類似物，雷西科莫（Resiquimod) (1-(2-羥基-2-甲基丙基）·2-乙氧甲基-1-H-咪唑并[4,5-c]膣啉-4-胺），增加繼接種編碼卵清蛋白蛋白質之質體後在活體内之活化CD4 T細胞數目，此係以產生IFN- r及產生IL-4之細胞之增加測量（分別示於6A及6B)。圖7. 米科莫（imiquimod)的兩個類似物’ 1 - (2-經基-2-甲基丙基）-2-甲基-1H-咪唑并[4,5-c]膣啉胺及1-(2,羥基-2-甲基丙基）-1H-咪唑并[4, 5- c]喹啉-4-胺，增加繼接種編碼卵清蛋白蛋白質之質體後在活體内之活化CD4 T細胞數目，此係以產生IFN- r及產生IL- 4之細胞之增加測量（分別示於7A及7B) 〇圖8· 局部施用米科莫（imiquimod)增加繼接種編碼HIV抗原Gag 及Nef之質體（WRG7077· Gag/Nef)後之細胞毒性T-細胞反應。 WRG7077係控制載體。 -9 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1287453 A7 B7 五、發明説明（7 ) 圖9· 米科莫（imiquimod)延遲經以表現卵清蛋白之EG7. OVA腫瘤細胞攻毒之動物於以編碼卵清蛋白之質體免疫後之腫瘤生長。圖10· 米科莫（imiquimod)降低經以編碼卵清蛋白之質體預免疫並植入表現卵清蛋白之EG7. OVA腫瘤細胞之動物之腫瘤發生率。發明之詳細說明整篇本案說明書及其附屬之申請專利範圍，除非上下文之需要否則，單字“包含”及“包括”或其變化如“包含進行式”，“包含現在式”，“包括進行式”，“包括現在式”，等等，係要經總括分析的，即，使用這些字是暗示尚可能包括未經詳述之完整事物或元件。如上所述，本發明係有關抗原組合物如疫苗組合物，接種方法，且係有關接種方法之改良，其涉及編碼抗原性蛋白質或胜肽抗原之核（苷）酸序列導入哺乳類動物體内，以使該蛋白質或胜肽在哺乳類動物體内表現以藉此在該哺乳類動物體内誘發免疫反應對抗該抗原性蛋白質或胜肽。這類接種方法係為吾人所熟知的且如上引用之内容係經多内里 (Donnelly)等人完整說明。此處所用辭彙疫苗組合物意指一包含編碼抗原之核苷酸序列抗原組份，與一包含1H-咪唑并[4, 5-c]壁啉-4-胺衍生物之佐劑組份之組合物。該組合物係，例如，以該兩種組份 -10- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1287453 A7

此口物於以早-醫藥上可接受痛配物中之形式或以分開之各別組份之形式，例如以套組形式，包含—包含編碼抗原之核苷魬序列之柷原組份，及一包含1H_咪唑并[4,5_C]喹琳4胺之佐劑組份，其中該兩種組份係用以分帛，相繼或同時投C。幸义佳地，該兩種組份之投藥係實質上同時地。整篇本案說明書及其申請專利範圍中所指之1]9[_咪唑并 [4, 5- c]喹啉-4-胺衍生物較佳地係由如下化學式VI中之一所定義之化合物： (I)

其中

Rl 1係選自由如下基團所組成之群··直或支鏈之燒基，經基烷基，醯氧基烷基，苄基，（苯基）乙基及苯基，該苄基，（苯基）乙基或苯基取代基係視情況地於苯環上以獨立地選自由如下基團所組成之群之一或二部份取代··一至約四個碳原子之烷基，一至約四個碳原子之烷氧基及自素，其限制條件為若該苯環係經以兩個該部份取代，則該兩部份總共含有不多於6個碳原子；R21係選自由如下基團所組成之群：氫，一至約八個碳原子之烷基，苄基，（苯基）乙基及苯基，該苄基，（苯基）乙基或苯基取代基係視情況地經於苯環上以獨立地選自由如下基圏所組成之群之一或二部份取代：一至約 -11 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1287453 A7 B7

五、發明説明四個碳原子之烷基，一至約四個碳原子之烷氧基及函素，其限制條件為當該苯環係經以兩個該部份取代，則該兩個部份總共含有不多於6個碳原子；且每個心係獨立地選自由如下基團所組成之群：氫，一至約四個碳原子之烷氧基，_素及一至約四個碳原子之烷基，且η係自〇至2之整數，其限制條件為若η為2，則該Rn基團總共含有不多於6個碳原子； NH.

R22 r2

其中

Ri2係選自由如下基團所組成之群：直鏈或支鏈且含有2至約 10個碳原子之婦基及經取代之直鏈或支鏈且含有2至約10個碳原子之烯基，其中該取代基係選自由如下基團所組成之群··直鏈或支鏈且含有1至約4個碳原子之烷基及含有3至約6 個碳原子之環烷基；及含有3至約6個碳原子且經直鏈或支鏈之含有1至約4個碳原子之烷基取代之環烷基；且r22係選自由如下基團所組成之群：氫，直鏈或支鏈且含有一至約八個碳原子之烷基，苄基，（苯基）乙基及苯基，該苄基，（苯基）乙基或苯基取代基係視情況地經於苯環上以獨立地選自由如下基團所組成之群之一或二部份取代：直鏈或支鏈且含有一至約四個碳原子之烷基，直鏈或支鏈且含有一至約四 -12- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1287453 A7 B7 五、發明説明（1〇 ) 個碳原子之烷氧基，及函素，其限制條件為當該苯環係經兩個该部份取代時，則該兩個部份總共含有不多於6個碳原子，且每個R2係獨立地選自由如下基團所組成之群：直鏈或支鏈且含有一至約四個碳原子之烷氧基，自素，及直鏈或支鏈且含有一至約四個碳原子之烷基，且自零至2之整數，其限制條件為若n為2，則該&基團總共含有不多於6個碳原子

其中尺23係選自由如下基團所組成之群：氫，直鏈或支鏈之一至約八個碳原子之烷基，苄基，（苯基）乙基及苯基，該苄基（苯基）乙基或苯基取代基係視情況地經於苯環上以獨立地選自由如下基團所組成之群之一或二部份取代··直鏈或支鏈之至、’々四個碳原子之虎基，·直鏈或支鏈之一至約四個碳原子足烷氧基，及鹵素，其限制條件為當該苯環係經以兩個該部伤取代時，則該兩個部份總共含有不多於6個碳原子；且每個Κ係獨立地選自由如下基團所組成之群：直鏈或支鏈之一至約四個碳原子之烷氧基，鹵素，及30直鏈或支鏈之一 -13- 1287453 A7

至約四個碳原子之烷基，且n係自突件為若η為2,則該R3基圈總共;至2(整數，其限制條 ° $不多於6個碳原子；

r4 (IV) 其中 r14係-chrarb且其中Μ'氫或—碳·碳鍵，其限制條件為當 Rb為氫則RA為-至約四個碳原子之烷氧基，一至約四個：原子之羥基烷氧基，二至約十個碳原子七-炔基，四氫哌：基’燒氧基燒基且其中該燒氧基部份含有—至約四個碳原子且該烷基部份含有一至約四個碳原子，2_，3·，或仁吡啶基，且其進一步限制條件為當rb為一碳·碳鍵則以及、一起形成一四氫呋喃基且視情況地經以獨立地選自由如下基團所組成之群之一或多個取代基取代：羥基及一至約四^碳原子之技基坑基；R24係選自由如下基團所組成之群：氯，一至約四個碳原子之烷基，苯基，及經取代之苯基且其中該取代基係選自由如下基團所組成之群··一至約四個碳原子之燒基’ 一至約四個碳原子之燒氧基，及鹵素；且R4係選自由如下基團所組成之群：氫，直鏈或支鏈且含有一至約四個 -14- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1287453 A7 B7 五、發明説明（12 碳原子之烷氧基，鹵素，及直鏈或支鏈且含有一至約四個碳原子之烷基；

(V) 其中 R!5係選自由如下基團所組成之群··氫；直鏈或支鏈且含有至十個碳原子之燒基及經取代之直鏈或支鏈且含有一至約十個碳原子之烷基，其中該取代基係選自由如下基團所組成之群：含有三至約六個碳原子之環烷基及含有三至約穴個碳原子且經以直鏈或支鏈之含有一至約四個碳原子之燒基取代之環烷基；直鏈或支鏈且含有二至約十個碳原子之晞基及經取代之直鏈或支鏈且含有二至約十個碳原子之晞基’其中該取代基係選自由如下基團所組成之群：含有三至約六個碳原子之環烷基及含有三至約六個碳原子且經以直鏈或支鏈之含有一至約四.個碳原子之烷基取代之環烷基 :一至約六個碳原子之羥基烷基；烷氧基烷基且其中該烷氧基部份含有一至約四個碳原子且該烷基部份含有一至約六個碳原子；醯氧基烷基且其中該醯氧基部份係二至約四個碳原子之燒醯氧基或卞酿基氧（]3enZ〇yl〇Xy)，且該燒基部份 -15 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1287453 A7 ____B7 五、發明説明（13 ) 含有一至約六個碳原子；节基；（苯基）乙基；及苯基；該苄基’（苯基）乙基或苯基取代基係視情況地經於苯環上以獨立地選自由如下基團所組成之群之一或二部份取代：一至約四個碳原子之烷基，一至約四個碳原子之烷氧基，及自素，其限制條件為當該苯環係經以兩個該部份取代，則該兩個邵份總共含有不多於六個碳原子；反25係

X /

其中

Rx及RY係獨立地選自由如下基團所組成之群：氫，一至約四個碳原子之烷基，苯基，及經取代之苯基且其中該取代基係選自由如下基團所組成之群··一至約四個碳原子之烷基，一至約四個碳原子之烷氧基，及鹵素；X係選自由如下基團所組成之群：含有一至約四個碳原子之烷氧基，烷氧基烷基且其中該烷氧基部份含有一至約四個碳原子且該烷基部份含有一至約四個碳原子，一至約四個碳原子之鹵烷基，烷基醯胺基且其中該烷基含有一至約四個碳原子，胺基，經取代之胺基且其中該取代基係燒基或一至約四個碳原子之羥基燒基’登氮基，一至約四個碳原子之烷基硫；且化係選自由如下基團所組成之群··氫，直鏈或支鏈且含有一至約四個石炭原子之故氧基，鹵素，及直鏈或支鏈且含有一至約四個碳原子之坑基，或任何以上化合物在醫藥上可接受之鹽類。 -16 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇x297公釐) 1287453 A7 B7 五、發明説明（14 較佳的烷基係CrC4烷基，例如甲基，乙基，丙基，孓甲基丙基及丁基。最佳的烷基係甲基，乙基及2甲基_丙基。較佳的烷氧基係甲氧基，乙氧基及乙氧甲基。上述化合物及其製備方法係經揭示於？(：1[專利申請公告號 W0 94/17043 〇舉例來說η可為零’一’或二，η較佳地係零或一。上述取代基RrR5於此處一般經命名為“苯并取代基，，。較佳之苯并取代基係氫。上述取代基RlrRls於此處一般經命名為“卜取代基，，。較佳之1-取代基係2-甲基丙基或2-羥基-2_甲基丙基。上述取代基Ra-R25於此處一般經命名為“2-取代基，，。較佳之2-取代基係氫，一至約六個碳原子之烷基，烷氧基烷基且其中該燒氧基部份含有一至約四個碳原子且該烷基部份含有一至約四個碳原子。最佳地該2-取代基係氫，甲基，或乙氧甲基。特別較佳的是當該1H-咪唑并[4,5-c]膣啉-4-胺係以如下化學式VI所定義之化合物時：

NIM

(VI) 其中 17- 本紙張尺度適巧國冢標準(CNS) A4規格(210X297公爱） 1287453 A7 B7 15 五、發明説明（

Rt係選自由如下基團所組成之群··氫，直鏈或支鏈且含有一至約四個碳原子之燒氧基，鹵素，及直鏈或支鏈且含有一至約四個碳原子之烷基；

Ru係2-甲基丙基或2-羥基-2-甲基丙基；且

Rv係氫，一至約六個碳原子之烷基，或烷氧基烷基且其中該垸氧基部份含有一至約四個碳原子且該烷基部份含有一至約四個碳原子；或任何以上化合物在生理學上可接受之適當鹽類。在化學式VI中，Rt較佳地係氫，心較佳地係2-甲基丙基或 2-經基-2·甲基丙基，且Rv較佳地係氫，甲基或乙氧甲基。較佳的1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺包括如下化合物： 1-(2-曱基丙基）· 1H-咪峻并[4,5-c]喹啉-4-胺（一化學式vi化合物且其中Rt係氫，！^係2-甲基丙基且Rv係氫）； 1-(2·羥基-2-甲基丙基）-2-甲基-1H-咪唑并[4,5-c]膣啉-4-胺 (一化學式VI化合物且其中Rt係氫，Ru係2-羥基-2-甲基丙基，且Rv#、甲基；卜（2-禮基·2-甲基丙基）_ 1H-咪唑并[4, 5-c]喹啉-4-胺（一化學式VI化合物且其中Rt係氫，心係2-羥基_2_甲基丙基，且1係氫） 1-(2-羥基-2-甲基丙基）-2-乙氧甲基-1-H-咪唑并[4, 5-c]堕啉-4-胺（一化學式VI化合物且其中Rt係氫，Ru係2-經基-2-曱基丙基且Rv係乙氧甲基）；或其生理學上可接受之鹽類。可改進根據本案申請書之接種方法及組合物用於保護或 -18- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1287453 A7 B7 五、發明説明（16 ) 治療哺乳類動物對抗各種疾病狀態如，例如，病毒，細菌或寄生蟲之感染，癌症，過敏及自體免疫病症。如下係可藉由利用根據本發明之方法或組合物保護性抵抗或治療之某些特定病症或疾病狀態實例：病毒感染八，6，（：，0&丑型肝炎病毒，肌乂，泡疹病毒1，2,6& 7，-巨細胞病毒，水痘帶狀泡療病毒，乳頭狀瘤病毒，埃柏坦-巴爾病毒，流行性感冒病毒，副流行性感冒病毒，腺病毒，克沙奇病毒，微小核糖核酸病毒，輪狀病毒，呼吸道融合細胞之病毒，痘病毒，鼻病毒，風珍病毒，papo病毒，流行性腮腺炎病毒，痲疹病毒。細菌感染引起TB及痲瘋之分枝菌，肺炎球菌，好氣性格蘭氏陰性芽孢桿菌，黴漿菌，葡萄球菌感染，鏈球菌感染，沙門氏菌，披衣菌。寄生蟲感染瘧疾，萊什曼病（leishmaniasis)，錐蟲病，毒漿體原蟲病，血吸蟲病’絲蟲病’ 癌症乳癌，大腸癌，直腸癌，.頭及頸部癌症，腎癌，惡性的黑色素瘤，喉癌，卵巢癌，頸癌，前列腺癌。過敏因居家塵蟎，花粉及環境其他過敏原引起之鼻炎自體免疫疾病 -19- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1287453 A7 B7 五、發明説明（17 ) 系統性紅斑性狼瘡較佳地，本發明之方法或組合物係經用以保護性抵抗或治療病毒性病症B型肝炎，C型肝炎，人類乳頭狀瘤病毒，人類免疫不全病毒，或單純泡疹病毒；細菌性疾病TB ;乳房，大腸，卵巢，頸部，及前列腺之癌症；或氣喘，類風濕性關節炎及阿茲海默氏症之自體免疫疾病。應知這些指出之特定疾病狀態係僅當作實例，而非希望限制本發明之範圍。本案申請書中所指出，欲在哺乳類動物系統内表現以誘發抗原性反應之核苷酸序列，可編碼一整個蛋白質，或僅編碼一能肇始抗原性反應之較短胜肽序列。整篇本案申請書及其所附屬之申請專利範圍中，詞彙“抗原性胜肽”或“抗原”係希望包含所有能在所考量之動物體内謗發免疫反應之胜肽或蛋白質序列。然而最好，該核苷酸序列編碼與該疾病狀態有關之完整蛋白質，因為完整的蛋白質在動物系統内之表現似乎更能模擬天然的抗原呈現，並藉此唤起完整的免疫反應。已知與特定疾病狀態有關之抗原性胜肽之某些非限制性實例包括如下··能夠誘出免疫反應對抗人類病原之抗原，且該抗原或抗原性組合物係衍生自HIV-1，（如tat， nef，gpl20或 gpl60，gp40，p24，gag，env，vif，vpr，vpu， rev)，人類泡療病毒，如gH，gL gM gB gC gK gE或gD或其衍生物或直接早期蛋白質如ICP27，ICP 47，IC P4，ICP36 from HSV1或HSV2，巨細胞病毒，特別是人類，（如gB或其衍生物），埃柏坦-巴爾病毒（如gp350或其衍生物），水痘帶狀 -20- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1287453 A7 B7 五、發明説明（18 ) 泡疹病毒（如gpl，II，III及IE63)，或衍生自肝炎病毒如B型肝炎病毒（例如B型肝炎表面抗原或肝炎核心抗原或p〇l) , c型肝炎病毒抗原及E型肝炎病毒抗原，或衍生自其他病毒性病原，如副黏液病毒：呼吸道融合細胞病毒（如F及G蛋白質或其衍生物），或衍生自抗原來自副流行性感冒病毒，痲疹病毒，流行性腮腺炎病毒，人類乳頭狀瘤病毒之抗原（例如 HPV6，1卜 16，18，eg L 卜 L2，E卜 E2，E3，E4，E5，E6 ，E7)，黃熱病病毒（如，黃熱病毒，登革熱病毒，出身於壁蟲之腦炎病母’日本腦炎病毒）或流行性感ft病毒細胞（如 HA，NP , NA，或Μ蛋白質，或其混合物），或該抗原衍生自細菌性病原如奈瑟氏球菌屬，包括淋病奈瑟菌淋病奈瑟菌及腦膜炎球菌（如，運鐵蛋白結合蛋白質，乳醯肝褐質結合蛋白，Pile，附著素（adhesins));釀膿鏈球菌（例如Μ蛋白質或其片段，C5A蛋白酶），無乳鏈球菌，突變鏈球菌；杜克雷氏嗜血桿菌（Η. ducreyi);莫拉克氏菌屬，包括黏膜炎莫拉克氏菌，亦為已知之黏膜炎布蘭漢氏球菌（Branhamella catarrhalis)(例如高及低分子量附著素及入侵素（invasin));波德氏菌屬，包括百日咳波德氏桿菌（例如pertactin，百日咳毒素或其衍生物，絲狀血凝素，腺嘌呤核苷酸環化酶，纖毛），副百日咳波德氏桿菌及支血管敗血性波德氏桿菌；分枝桿菌屬，包括結核桿菌（例如ESAT6，抗原85A，-B或-C，MPT 44，MPT59，MPT45，HSP10，HSP65，HSP70，HSP 75，HSP90 ，PPD 19kDa [Rv3763]，PPD 38kDa [Rv0934])，牛結核桿菌，痲瘋桿菌，禽結核桿菌，副結核桿菌，包皮垢桿菌；軍團菌屬 -21 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 1287453 A7 B7 五、發明説明（19 ) ’包括親肺軍團菌；大腸桿菌屬，包括腸毒性大腸桿菌（例如移生因子，熱不安定之毒素或其衍生物，熱安定性毒素或其衍生物），腸出血性大腸桿菌，致腸病性大腸桿菌（例如似志賀毒素之毒素或其衍生物）；弧菌屬，包括霍亂弧菌（例如霍亂毒素或其衍生物）；志賀桿菌屬，包括宋内氏志賀桿菌 ’痢疾桿菌’副痢疾桿菌；耶爾森氏菌屬，包括小腸結腸炎耶爾森氏菌（例如Y〇p蛋白質），鼠疫耶爾森氏菌，假結核耶爾森氏菌；彎曲桿菌屬，包括空腸彎曲桿菌（例如毒素，附著素及入侵素）及大腸桿菌；沙門氏菌屬，包括傷寒桿菌，副傷寒桿菌，豬霍亂桿菌，腸炎桿菌；李斯特氏菌屬，包括單核細胞增多性李斯特氏菌；螺桿菌屬，包括幽門螺桿菌（例如尿素酶，過氧化氫酶，空泡毒素）；假單孢菌屬，包括綠膿桿菌；葡萄球菌屬，包括金黃色葡萄球菌，白色表皮葡萄球菌；腸球菌屬，包括糞鏈球菌，E. faecium ;梭菌屬，包括破傷風桿菌（例如破傷風毒素及其衍生物），臘腸毒梭菌 (例如臘腸毒素及其衍生物），困難梭菌（例如梭菌毒素A或B 及其衍生物）；桿菌屬，包括氣腫疽桿菌（例如臘腸毒素及其衍生物）；棒狀桿菌屬，包括白喉桿菌（例如白喉毒素及其衍生物）；疏螺旋體屬，包括伯格朵夫氏羅螺旋體（B. burgdorferi)(例如 OspA，OspC，DbpA，DbpB)，加利尼氏螺旋體（Β· garinii)(例如 OspA，OspC，DbpA，DbpB)，阿茲里氏螺旋體（Β· afzelii)(例如 OspA，OspC，DbpA，DbpB)，安德森氏螺旋體（B. andersonii)(例如 OspA，OspC，DbpA，DbpB)，西北美洲回歸熱螺旋體；埃里希氏體（Ehrlichia)屬，包括伊克埃 -22- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1287453 A7 B7 五、發明說明（2〇 ) 里希氏體（E· equi)及人類顆粒性白血球埃里希氏症之作用劑 ;立克次體屬，包括洛磯山熱立克次體；披衣菌屬，包括砂眼披衣菌（例如MOMP，肝素結合蛋白），肺炎披衣菌（例如 MOMP，肝素結合蛋白），鸚鵡熱披衣菌；細螺旋體屬，包括腎臟螺旋體；螺旋體屬，包括梅毒螺旋體（例如罕見外膜蛋白）’齒螺旋體(T· denticola)，舌骨痛]疾螺旋體(T. hyodysenteriae); 或衍生自寄生蟲如瘧原蟲屬，包括夏秋瘧原蟲；毒漿原蟲屬，包括嚆齒動物漿原蟲（例如SAG2，SAG3，Tg34);阿米巴屬，包括溶組織阿米巴；巴貝斯蟲屬，包括細微巴貝斯蟲；錐蟲屬，包括克魯氏錐蟲（T. cruzi);紀亞德氏鞭毛蟲屬 (Giardia spp.)，包括腸梨形蟲；李士曼蟲屬（Leshmania spp.) ，包括主要李士曼蟲；肺囊蟲屬，包括卡瑞尼氏肺囊蟲；滴蟲屬，包括陰道滴蟲；血吸蟲屬，包括曼森氏血吸蟲，或衍生自酵母菌如念珠菌屬，包括白色念珠菌；隱球菌屬，包括新形隱球菌。其他較佳之結核桿菌特異性抗原係例如Rv2557，Rv2558， RPFs : Rv0837c，Rvl884c，Rv2389c，Rv2450，Rvl009，aceA (Rv0467)，PstSl，（Rv0932)，SodA (Rv3846)，Rv2031c 16kDal. ，Tb Ral2，Tb H9，Tb Ra35，Tb38-1，Erd 14，DPV，MTI， MSL，mTTC2及hTCCl (WO 99/51748)。用於結核桿菌之蛋白質亦包括融合的蛋白質及其變異體其中至少兩個，較佳地三個結核桿菌多肽經融合至較大之蛋白質中。較佳的融合之蛋白質包括Ral2·TbH9-Ra35，EΓdl4-DPV-MTI，DPV-MTI-MSL，Erdl4-DPV-MTI-MSL-mTCC2，Erdl4-DPV-MTI-MSL， -23- _ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐） 1287453 A7 B7 五、發明説明（21 ) DPV-MTI-MSL-mTCC2，TbH9-DPV-MTI(W0 99/51748)。最佳的披衣菌抗原包括例如高分子量蛋白質（HWMP)(WO 99/17741)，0RF3 (EP 366 412)，及推定的膜蛋白質（Pmps)。疫苗調配物之其他披衣菌抗原可選自說明於W0 99/28475中之群。較佳的細菌性疫苗包含之抗原衍生自鏈球菌屬，包括肺炎雙球菌（PsaA，PspA，鏈球菌溶血素，膽鹼結合蛋白）及蛋白質抗原肺炎球菌自溶酶(Biochem Biophys Acta，1989，67, 1007 ;魯賓斯（Rubins)等人，微生物致病原因，25, 337-342) ，及其突變體去毒衍生物（WO 90/06951 ; WO 99/03884)。其他較佳之細菌性疫苗包括衍生自嗜血桿菌屬之抗原，包括B 型流行性感冒嗜血桿菌（例如PRP及其共軛物），無法驗明類型之流行性感冒嗜血桿菌，例如OMP26，高分子量附著素， P5，P6 ’蛋白質D及脂蛋白D，及毛蛋白及自毛蛋白衍生之胜肽（US 5, 843,464)或多複本變異體或其融合蛋白質。可用於本發明之抗原進一步包含衍生自引起瘧疾之寄生蟲之抗原。例如，來自鐮狀瘧原蟲之較佳抗原包括RTS，S 及TRAPeRTS係融合蛋白質，包含將鐮狀瘧原蟲之周生殖芽孢（CS)蛋白質之實質上所有C-端部分經由B型肝炎表面抗原之preS2部分之四個胺基酸連接至B型肝炎病毒之表面（S)抗原。其完整結構係經揭示於國際專利申請案號PCT/EP92/02591 ，公告編號為WO 93/ 10152，主張優先權來自英國專利申請案號9124390.7。當表現於酵母菌時，RTS係以脂蛋白質顆粒產生’且當其與來自HBV之S抗原共表現時，其產生已知為 -24- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1287453 A7 B7 五、發明説明（22 ) RTS，S之混合顆粒。TRAP抗原係經說明於國際專利申請案號PCT/GB89/00895，公告編號為W0 90/01496。本發明之一較佳具體實施例係一瘧疾疫苗，其中該抗原性製備物包含 RTS，S及TRAP抗原之組合物。其他可能之候選之多重階段瘧疾疫苗組份之瘧原蟲抗原係鐮狀瘧原蟲MSP1，AMA1， MSP3，EBA，GLURP，RAP1，RAP2，隱蔽素（Sequestrin)，PfEMPl ，Pf332，LSA1，LSA3，STARP，SALSA，PfEXPl，Pfs25，Pfs28， PFS27/25，Pfsl6，Pfs48/45，Pfs230及其在瘧原蟲屬之類似物。本發明涵蓋抗-腫瘤抗原之用途且對於以免疫療法治療癌症有用。例如，腫瘤排斥抗原如用於前列腺，乳房，結腸直腸，肺，胰臟，腎或黑色素瘤癌症。抗原範例包括MAGE 1 。3及MAGE4或其他MAGE抗原係揭示於如WO99/40188， PRAME，BAGE，Lage(亦已知為NY Eos 1) SAGE及HAGE (WO 99/53061)或 GAGE(羅賓斯（Robbins)與卡娃卡米（Kawakami)， 1996，當今免疫學觀念8，628-636頁；凡登恩迪（Van den Eynde)等人，臨床&實驗室研究國際期刊（已投稿1997);克瑞爾（Coireale)等人（1997)，國立癌症研究所期刊89，293頁。的確這些抗原係經表現於極廣泛圍之腫瘤類型如黑色素瘤，肺癌，肉瘤及膀胱癌。用於本發明之MAGE抗原可為伴隨增強劑或免疫學之融合夥伴之表現而表現之融合蛋白質。特定言之，Mage蛋白質可經融合至來自流行性感冒嗜血桿菌B之蛋白質D。特定言之，該融合夥伴可包括蛋白質D的前1/3。這類構建係經揭示於WO99/40188。其他可含有癌症特異性抗原決定部位之融 -25 · 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1287453 A7 B7 五、發明説明（23 ) 合之蛋白質實例包括bcr/abl融合之蛋白質。在一較佳的具體實施例中利用前列腺抗原，如前列腺特異性抗原（PSA)，PAP，PSCA (PNAS 95(4) 1735-1740 1998)，PSMA 或已知為前列腺酶(prostase)之抗原。前列腺酶(prostase)係一前列腺-特異性絲胺酸蛋白酶（似騰蛋白酶的），254個胺基酸長，含有一保守絲胺酸蛋白酶催化三合物H-D-S及一胺基-端前-原胜肽序列，指示出潛在之分泌性功能（P·尼爾森（Nelson)，盧剛（Lu Gan)，C.佛格森 (Ferguson)，Ρ·莫斯（Moss)，R.吉林納（Gelinas)，L.霍德（Hood) & Κ·汪德（Wand)，“前列腺酶（prostase)之分子選殖及特性描述，一種經雄性素調節之絲胺酸蛋白酶，且具有前列腺限制表現作用，於Proc· Natl. Acad· Sci. USA (1999) 96, 3114-3 119)。一推定的糖基化作用位點頃經說明。該預測結構極相似於其他已知之絲胺酸蛋白酶，顯示該成熟多肽摺疊成一單獨之結構區。該成熟蛋白質係224個胺基酸長，具有一個顯示經自然作用之A2抗原決定部位。前列腺酶（prostase)核苷酸序列及推演之多肽序列及同質物係經揭示於佛格森（Ferguson)，等人（Proc·Natl·Acad·Sci· USA 1999, 96, 3114-3119)及於國際專利申請案號W0 98/12302 (且亦經揭示於與相對應且經頒布之專利US 5,955,306)，WO 98/20117(且亦經揭示於與相對應且經頒布之專利US 5,840,871及US 5,786，148)(前列腺-特異性激（肽）釋放酶）及WO 00/04149 (P703P) 〇本發明提供之抗原包含以前列腺酶（prostase)蛋白質及片 -26· 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1287453 A7 B7 五、發明説明（24 ) 段及其同質物（“衍生物”）為基礎之前列腺酶（prostase)蛋白質融合物。這類衍生物係適用於適於治療前列腺腫瘤之治療疫苗調配物。如於以上參考之專利及專利申請書中所揭示，該片段典型地含有至少20個，較佳地50個，更佳地100個鄰接的胺基酸。另一較佳的前列腺抗原係已知為P501S，W098/37814中之序列ID編號113。本發明涵蓋抗原片段及由其基因編碼之部分，如於以上參考之專利申請書中所揭示包含至少20個，較佳地50個，更佳地1〇〇個鄰接的胺基酸。一特定之片段係 PS108 (W0 98/50567)。其他前列腺特異性抗原係由W098/37418，及WO/004149 得知。另一為 STEAP PNAS 96 14523 14528 7- 12 1999。對於本發明有用之其他與其他腫瘤有關之抗原包括：Ρΐυ-ΐ J Biol. Chem 274 (22) 15633-15645， 1999， HASH-1， HasH-2，Cripto(索羅門（Salomon)等人，生物分析法 199，21 61· 70，美國專利5654140) Criptin美國專利5 981 215。此外，對於治療癌症之疫苗特別適切之抗原亦包含酪胺酸酶及生存素 (survivin) ° 本發明也對結合如下乳癌抗原有用：Muc-1，Muc-2， EpCAM，her 2/Neu，乳房球蛋白（美國專利5668267)或揭示於 WO/00 52165，W099/33869，W099/19479，WO 98/45328 者。Her 2 neu抗原係經揭示，尤其是，於美國專利5, 801，005 。較佳地該Her 2 neu包含整個胞外結構區（包含大約是胺基酸1-645)或其片段及至少胞内結構區大約C端580個胺基酸之 -27- ^紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公爱^ 1287453 A7 B7 五、發明説明（25 ) 抗原部分或全部。特定言之，該胞内部分應包含磷酸化作用結構區或其片段。這類構建係經揭示於WOOO/44899。一特別較佳之構建係已知為ECD PD第二個係已知為ECD 〇PD。 (參看 WO/00/44899。）此處所利用之her 2 neu可衍生自大鼠，小鼠或人類。該疫苗亦可含有與腫瘤-支持機制相關之抗原（如，血管生成作用，腫瘤入侵）例如tie 2, VEGF。本發明之疫苗亦可用以預防或治療除了過敏，癌症或感染性疾病以外之慢性病症。這類慢性病症係疾病如氣喘，動脈粥狀硬化，及阿茲海莫氏症及其他自體免疫病症。亦可考慮用做避孕疫苗。對於預防及治療易發生或正罹患阿茲海莫神經退化疾病之患者適切之抗原係，特定言之，N端39-43胺基酸之片段 (Amhe澱粉樣蛋白前驅物蛋白質及較小之片段。此抗原係經揭示於國際專利申請案號WO 99/27944-(雅典納神經科學）。可包括於本發明中當做自體免疫病症疫苗或當做避孕疫苗之潛在自體抗原包括：細胞素，荷爾蒙，生長因子或胞外蛋白質，更佳地4-螺旋狀細胞素，最佳地IL13。細胞素包括，例如，IL1，IL2，IL3，IL4，IL5，IL6，IL7，IL8，IL9， IL10，IL11，IL12，IL13，IL14，IL15，IL16，IL17，IL18， IL20，IL21，TNF，TGF，GMCSF，MCSF及OSM 〇 4-螺旋狀細胞素包括IL2，IL3，IL4，IL5，IL13，GMCSF及MCSF。荷爾蒙包括，例如，黃體化荷爾蒙（LH)，卵泡刺激荷爾蒙（FSH) ，絨毛膜促性腺激素（CG)，VGF，GHrelin，agouti，agouti相 -28- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1287453 A7 B7 五、發明説明（26 ) 關之蛋白質及神經胜肽Y。生長因子包括，例如，VEGF。本發明之疫苗對於以免疫療法治療疾病特別合適’如慢性疾病狀態及癌症，而且也適合治療持績存在之感染。據此，本發明之疫苗係特別適用於感染性疾病之免疫療法’如肺結核（TB)，HIV感染如AIDS及B型肝炎（HepB)病毒感染。在本發明之一較佳的具體實施例中，該核酸編碼一或多種如下抗原：- HBV— PreSl PreS2及表面env蛋白質，核心及pol HIV — gpl20 gp40，gpl60，p24，gag，pol，env，vif，vpr ’ vpu ’ tat， rev j nef 乳頭狀瘤一 E卜 E2，E3，E4，E5，E6，E7，E8，U，L2 HSV- gL，gH，gM，gB，gC，gK，gE，gD，ICP47，ICP36，ICP4 流行性感冒一血凝素，核蛋白 TB —分枝桿菌超氧歧化酶，85A，85B，MPT44，MPT59，MPT45 ，HSP10，HSP65，HSP70，HSP90，PPD 19kDa Ag，PPD38kDaAg。該核苷酸序列可為RNA或DNA，包括基因組DNA，合成之 DNA或cDNA，較佳地該核苷酸序列係一 DNA序列且最佳地為cDNA序列。為了在哺乳類動物細胞内表現該抗原性胜肽，有必要將該編碼抗原性胜肽之核苷酸序列呈現於適當的載體系統中。此處以“適當的載體，，指稱能使該抗原性胜肽以足夠量表現於哺乳類動物體内以唤起免疫反應之任何載體。例如’所選擇之載體可包含質體，啟動子及聚腺苷酸化作用/轉錄終止序列以正確順序安排以表現該抗原性胜肽。包 -29- 本紙張尺度適用中國國家榡準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）

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1287453 A7 B7 五、發明説明（27 ) 括這些組份且視情況包括其他組份，如增強劑，限制酵素位點及選擇基因，如抵抗抗生素之基因，之載體構建係為熟習此項技藝者所熟之且經詳細說明於馬聶堤斯（Maniatis)等人 “分子選殖：實驗室手冊”，冷泉港實驗室，冷泉港出版社，卷1-3第2版，1989年。因為最好能防止質體在哺乳類動物宿主體内複製及累積於該動物染色體DNA内，故該質體之製造較佳地不會引起在真核細胞中之功能性複製。可利用根據本發明之方法及組合物於所有哺乳類動物之預防或治療方法，包括，例如，家畜，實驗室動物，農場動物，監禁之野生動物及，最佳地，人類。本案發明人已說明當利用1H-咪唑并[4,5-c]塵琳-4-胺衍生物為DNA接種之佐劑時能夠同時促進Thl及Th2細胞素表現形式。此處所用辭彙佐劑或佐劑組份係希望表達··該衍生物或包含該衍生物之組份之作用係以必要之方式促進及/或改變身體對抗原之反應。故，例如，可利用佐劑將免疫反應轉換至以Thl為優勢之反應，或同時增加兩種類型之反應。 TH1類型免疫反應之優先誘發物使得能產生經細胞中介之反應。高量之Thl-類型細胞素傾向利於謗發對於特定抗原之經細胞中介之免疫反應，·而高量之Th2-類型細胞素傾向利於謗發對於抗原之體液免疫反應。請務必記得Thl與Th2-類型免疫反應之區別並非決對的。實際上吾人支持以Thl為優勢或以Th2為優勢來說明免疫反應。然而，往往可方便地以莫斯曼（Mosmann)與寇夫曼 -30- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1287453 A7 B7 五、發明説明（28 ) (Coffman)以鼠科CD4+ve T細胞株描述細胞素家族所用的詞彙考量（莫斯曼（Mosmann)，T.R.與寇夫曼（Coffman)，R.L. (1989) TH1及TH2細胞：不同型態之淋巴素分泌導致不同之功能特性。免疫學年度評論，7，145- 173頁）。傳統上，Thl-類型反應與T-淋巴細胞產生INF- τ及IL-2細胞素有關。其他直接與誘發Thl-類型免疫反應有關之細胞素往往非由T_細胞產生，如IL-12。相反地，Th2-類型反應係與IL-4，IL-5， IL-6，IL-10之分泌有關。可以各種方式投用包含一包含編碼抗原性胜肽之核苷酸序列之載體的抗原組份。該載體之投用可以裸露形式（即以裸露之核苷酸序列而不與微脂粒調配物，病毒載體或促轉染蛋白質相關連）經懸浮於適當的媒介中，例如經緩衝之生理食鹽水如PBS，然後經由肌肉内，經由皮下，經由腹腔内或經由靜脈内注射，雖然某些稍早之數據建議肌肉内或皮下注射係較佳的（布羅姆（Brohm)等人，疫苗M No. 9/10 pp 949-954 (1998)，其所揭示之内容全文以參考文獻併入此處）。另外可包囊該載體，以，例如，微脂粒或於聚交酯共-苷醇酯（glycolide)(PLG)顆粒中（25)用於除了以上詳述之途徑以外之經由口腔，鼻腔或肺之投藥途徑。根據本發明之一較佳的具體實施例，亦有可能經由皮内投用該抗原組份，較佳地經由利用基因槍（特定言之，顆粒衝擊）投藥技術。這類技術涉及將抗原組份塗覆於金珠上然後在高壓下將其投用至表皮，例如，於黑尼斯（Haynes)等人，生物技術期刊M:37-42 (1996)中所述。 -31 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 1287453 A7 ______B7 五、發明説明（29 ) 包含編碼抗原性胜肽之核苷酸序列之載體之投用係以預防或治療有效量。投藥量，一般範圍在一微微克至丨毫克，較佳地以每劑1微微克至1〇微克核苷酸用於經顆粒中介之遞送，且以每劑10微克至1毫克核苷酸用於其他途徑。確實之量會變化，主要取決於所欲免疫之哺乳類動物之品種及重量，投藥途徑，該1H-咪唑并-[4, 5-C]膣啉衍生物之效力及劑量，所要治療或保護性抵抗之疾病狀態性質，投藥對象免疫系統產生免疫反應之能力及所欲達到之保護程度或治療功效。依據這些變數，醫學或獸醫學執業者會易於決定適當的劑量。该包含編碼抗原性胜肽之核脊酸序列之抗原組份之投用可以一次用盡為基礎或以重複投藥為基礎，例如，介於1與7 次之間，較佳地介於1與4次之間，以間隔介於約1天與約18 個月之間。再次地，然而，此療法會有顯著變化取決於所考里之動物之大小及種類’所欲治療/保護性抵抗之疾病，所投用之核苷酸序列量，投藥途徑，所選擇之1H_咪唑并[4, 5-c]喹啉-4-胺衍生物之效力及劑量及其他凡熟習此項技藝之獸醫學或醫學執業者顯而易見之因素。此處指定之佐劑組份相似地可經由各式各樣不同之投藥途徑投用，例如，經由口腔·，鼻腔，肺，肌肉内，皮下，皮内或局部途徑。較佳地，該組份之投用係經由皮内或局部途徑。此投藥之進行可介於投用核苷酸序列前約14天與後約14 天之間，較佳地介於投用核苷酸序列之前約1天與之後約3 天之間。最佳的是當該佐劑組份之投用與核苔酸序列之投 -32- ^張;適用巾s s家標準(CNS) A4規格(21QX297公爱)" "" 1287453 A7 B7 五、發明説明（30 ) 用實質上同時。此處以“實質上同時，，說明該佐劑組份之投用較佳地係·與核苷酸序列之投用同時，或若非如此，至少係在投用核苷酸序列前後數小時内。在最佳之治療計畫中，佐劑組份之投用與核苷酸序列之投用實質上同時。顯而易見地，若有必要可根據如上所述之變數類型變化此計畫。再次地，依據這類變數，該衍生物之投用劑量也會有變化，但是，例如，範圍可介於約每公斤〇1毫克至約每公斤1〇〇耄克之間，其中“每公斤，，意指所考量之哺乳類動物之體重。此1H-咪唑并[4,5-c]喹啉胺衍生物較佳地隨每次後來的核苷酸序列或核苷酸序列追加劑投藥而投用。最佳地投藥劑量介於約每公斤1毫克至約每公斤5〇毫克之間。雖然孩佐劑組份可以只包含1H•咪唑并[4,5·^膣啉•胺衍生，以未加工之化學狀態投藥，但最好以醫藥調配物形式投藥。即，茲佐劑組份較佳地包含該1H_咪唑并[4,5_c]璧琳-4-胺與-或多種醫藥上或獸醫學上可接受之載劑組合，且視情況地其他治療成分組合。該一或多種載劑就其與該，配物中其他成分相容性而言必須為“可接受的,，，且血堂

’月豆’IU从局听需之調配物。口 e之步驟。一般而言，該調配物之切地結合該衍生物與液態載劑或經卜，且然後，若有需要，將該產品具。適用於經口投藥之本發明調配物 -33 - 1287453 A7

之活二早位如膠囊，扁囊劑或錠劑’且每個含有預定量之4粉末或雌；4在水性液體或非水性液體中卞：二:净液；或為油在水中之乳液或水在油中之乳液。 μ/性成分吓可呈大丸藥，糖漿或糊狀物。 =丨之製作可藉由壓縮或鐸造，視情況地含有一或多種成分。壓縮之鍵劑之製備可藉由以一合適之機器壓縮動形式，如粉末或雌，之該活性成分，且視情況地^ #J * >r^'f #ι . , #J , 散劑混合。鑄造之錠劑之製作可藉由以合適的機器鑄造經以惰性硬態稀釋劑濕化之粉碎化合物之混合物。，歧劑可視情況地經塗覆或劃痕且可經調製以提供緩慢或控制釋放之活性成分。、用於經由，例如，肌肉内，腹腔内，或皮下投藥途徑注射之調配物包括水性及非水性無菌注射溶液，其可含有抗氧化劑，緩衝溶液，抑菌劑及使該調配物與所希望之接受投藥者血液等張之溶質；及水性及非水性無菌懸浮液，其可包括懸浮劑及增稠劑。可將該調配物放在單位劑量或多重-容器中，例如，密封之安瓶及小玻璃瓶中，且可㈣存於冷 ;東乾燥條件下，在即將使用前僅需添加無菌液態載劑，例如，於注射前加水。即時的注射溶液及懸浮液之製備可自前述種類之無菌粉末，顆粒及錠劑。適用於經由口頰或鼻腔由肺部投藥之調配物最好直徑範圍在〇.5至7微米，以使含有該活性成分之顆粒遞送至接受投藥者之支氣管分支枝=以這類調配物經細微粉碎之粉末形式且可方便地將其放在可 -34-

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1287453 A7 B7 五、發明説明（33 ) 在本發明之一較佳具體實施例中，該佐劑組份之製備係以適用於基因槍投藥之形式，且其投藥係經由與核苷酸序列之投藥實質上同時之途徑。為製備適於以此方式利用之調配物，有需要將1H-咪唑并[4, 5-c]膣啉-4-胺衍生物經冷滚乾燥並黏附至，例如，金珠上以使其適於以基因槍投藥。在另一具體實施例中，該佐劑組份可以乾燥粉末投用，經由高壓氣體之推進力。此與核苷酸序列之投用最好實質上同時。即使未經調製在一起，也宜將該佐劑組份投用於相同或大約相同於投用核普酸序列之部位。醫藥製劑之其他詳細内容可參閱雷明頓氏（Remington1 s)醫藥科學，麥克（Mack)出版公司，伊士頓（Easton)，賓州（1985) ，其所揭示之内容全文以參考文獻併入此處。現以如下非限制性實例進一步說明本發明：實例 1 .米科莫（Imiquimod)增加細胞毒性T細胞對核酸疫苗反應之規模。質體構建及DNA製備所利用之質體係以pVACl為基礎，得自麥克楊（Michelle Young)，格拉克梭威爾康（GlaxoWellcome)，英國，一修飾之哺乳類動物表現載體，pCl，（普羅美佳（Promega))，其中多重選殖位點，由EcoRI至Bst ZI，經以5’側與獨特的Nhe I，Rsr II及Xho 1相接且以為3’側與獨特的Pac I，Asc I及Not I限制酵素位點相接之EMCV IRES序列取代。 -36- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）裝訂

k 1287453 A7 _ B7 五、發明説明（34 ) 流行性感冒核蛋白表現質體，pVACl.PR，之構建係藉由將來自pAR501之編碼A型流行性感冒病毒品系PR/8/34核蛋白之經PCR放大cDNA，（獲贈自D·凱歐西斯（Kiossis)博士， NIMR，倫敦，英國），接合至表現載體pVACl中。質體DNA經於大腸桿菌中繁衍，並利用質體純化套組 (QIAGEN股份有限公司，科羅利（Crawley)，英國）製備，並在 10 mM三羥甲基氮基甲烷/EDTA緩衝溶液中以濃度大約1毫克質體DNA/毫升貯存於-20°C。用於DNA免疫之彈射劑之製備用於Accell基因轉移裝置之彈射劑之製備係如過去所述 (伊森布朗（Eisenbraun)等人，DNA與細胞生物學，1993年，卷12，>1〇9，791-797頁；泊特語（？611；1^1")等人）。簡言之，將質體DNA塗覆於2 /zm金顆粒上（迪固撒（DeGussa)公司，南普蘭菲爾德（Plainfield)，紐澤西州，美國）並裝填至Tefzei管材，接著將其切割成1.27公分長以供做彈射劑並在利用前將其貯存於乾燥之4°C環境下。在典型之接種中，每個彈射劑含有0·5毫克以〜0.05微克pVACl.PR塗覆之金與加入之空載體 (pVACl)提供總計0.5微克DNA/彈射劑。免疫為測試是否米科莫（imiquimod)可增加核酸接種所造成之細胞毒性T細胞反應，以經顆粒中介之基因轉移法（〇微克 /彈射劑）將pVACl.PR投用至小鼠皮膚内。由兩個彈射劑利用Accell基因轉移裝置以500磅/英吋2將質體遞送至C57BI/6 小鼠（購自查爾斯河（Charles River)英國股份有限公司，馬蓋 •37- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1287453 A7 _B7 五、發明説明Ί~ 特（Margate)，英國）腹部皮膚剃毛之標的部位（麥卡比（McCabe) WO 95/19799)。繼接種後立即將米科莫（imiquim〇d)(在媒劑中製備成懸浮液，其中包含0.3%(w/v)甲基纖維素及0 1%(v/v) Tween於無菌水中）以單一皮下注射（〇〇5毫升/1〇公克體重，其經調配以提供劑量30毫克/公斤）投用於該免疫部位。質體控制組及米科莫（imiquimod)控制組分別為空載體（pVAC1)及媒劑。細胞毒性T細胞反應細胞毒性T細胞反應之評估係藉由對一週後收集之脾細胞進行CD8+ T細胞-限制性IFN· r ELISPO分析。以頸部脫臼法殺死小鼠並收集脾臟置入冰冷PBS中。將脾細胞釋出至經磷酸鹽緩衝之生理食鹽水（PBS)中繼而溶解紅血球細胞（在由 155 mM ΝΗ4α，10 mM KHC03，0.1 mM EDTA組成之緩衝溶液中1分鐘）。以PBS清洗兩次以除去微粒物質後將該單細胞懸浮液等份分裝至先前經以捕捉IFN- r抗體塗覆之ELISPOT 盤中並以CD8-限制性母系胜肽刺激。於培養過夜後，產生 IFN- r之細胞之呈現係藉由施加經抗-鼠科IFN- r -生物素標誌之抗體（法敏基（Pharmingen))繼而施加與streptavidin-結合之鹼性磷酸酶並利用影象分析定量。此實驗之結果（圖1)顯示在以pVAC 1 .PR及米科莫（imiquimod) 組合物處理之小鼠脾臟中之細胞毒性T細胞數目係3倍大於單獨以PVAC1.PR+媒劑理者。在控制質體（PVAC1)+米科莫 (imiquimod)或媒劑組間未見到差異指示出米科莫（imiquimod) 之作用係抗原限制性。這些結果清楚顯示米科莫（imiqUim〇d) -38- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1287453 A7 B7 五、發明説明（36 ) 係核酸接種之強力佐劑。 2 .米科莫（imiquimod)增加CD4+ T細胞對核酸疫苗之反應規 Μ 質體，DNA及彈射劑製備難卵清蛋白表現質體，pVACl. OVA，之構建係藉由將來自pUGOVA之編碼難卵清蛋白之經PCR放大的cDNA(由F.卡幫（Carbone)博士贈送）接合至表現載體pVAC 1中並製備彈射劑（如於以上實例1中所述）。小鼠及免疫雄性或雌性DO. 11. 10導入外來基因的小鼠（6-10週齡）係在我們貝瑞葛林（Bury Green)農場之無特異性病原之動物繁殖設備繁殖。這些小鼠表現之導入基因係對與MHC-II分子（ΙΑ’結合之難卵清蛋白胜肽殘基（殘基 323- 339 ; OVA 胜肽）有特異性之T細胞受體（TCR)。利用特異性辨識此TCR之單選殖抗體，KJ1-26，以確認TCR-導入外來基因T細胞。對許多這些小鼠之測試顯示大多數（40-65%) CD4+ T細胞係KJ1-26+，雖然亦存在極小族群之CD4· CD8+ KJ1.26+ T細胞（沛普 (Pape)，等人免疫學評論（1997) 156:67-78)。

Balb/c小鼠係購自查爾斯河（Charles River)英國股份有限公司（馬蓋特，英國）。 CD4+ T細胞反應之測試係利用收養轉移模型，其促進所要測量之免疫參數之敏感性。在此，於免疫前將特異地辨識來自卵清蛋白蛋白質之胜肽序列的T細胞由導入外來基因的小鼠收養轉移至野生型小鼠。簡言之，免疫前24小時， -39- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐）裝訂

1287453 A7 _B7 五、發明説明（37 ) DO· 11.10脾細胞係經收養轉移至6-8週齡之Balb/c小鼠體内。脾細胞之製備係如以上實例1中所述。然後以注射1 〇〇微升 (即，25 X 106個脾細胞/小鼠）將細胞收養轉移至外側尾靜脈 0 接著藉由經顆粒中介之基因轉移法以編碼卵清蛋白之質骨豆（pVACl.OVA ’ 0.5微克/彈射劑）及米科莫（imiqUim〇d)(3〇毫克/公斤）’或以控制質體或媒劑免疫小鼠，如於實例1中所述。 CD4T細胞反應以頸部脫臼殺死小鼠並收集腹股溝及主動脈周圍淋巴結並如且製備脾細胞般製備淋巴結細胞（說明於實例1中），除了略去分解紅血球細胞之步驟外。為測量繼免疫後CD4+ T細胞之選殖擴張，於免疫3天後收集淋巴結製備物並評估卵清蛋白-特異性T細胞繼在體外以母系卵清蛋白胜肽再激發後之增生作用。以增生細胞攝入之經氣標諸之胸腺喊咬評估之增生，在以pVAC 1 · OVA +米科莫（imiquimod)組合物免疫組比以pVACl.OVA +媒劑免疫組多兩倍以上（圖2)。制質體（pVACl) +米科莫（imiquhnod)或媒劑組間未見差異指示出米科莫（imiquimoci)之作用係抗原限制性。 CD4 T細胞活化作用，係以il-2 ELISPOT(如上實例1)對於在免疫後6天收集之淋巴結細胞（圖3)進行評估，且發現以 pVACl.OVA +米科莫（imiquimod)組合物免疫組與單獨以 pVAC 1 · OvA免疫組相較有實質上之增加（增加7〇%)。 -40- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1287453 A7 __ B7 五、發明説明（38 ) 這些結果顯示在活體中米科莫（imiquimod)之佐劑作用同時延伸至兩種（即，CD8+細胞毒性及CD4+輔助型）T細胞族群。他們亦證實米科莫（imiquimod)於核酸接種之佐劑效力。 3 莫（Imiquimod)同時諸發對核酸疫苗之Thl及Th2反應。利用收養轉移模型評估Th CD4+亞群（如上實例2)。產生 IFN_ r -之細胞（Thl)及產生IL-4-之細胞（Th2)係以ELISPOT(如上貫例1)分析。米科莫（imiquimod)同時誘發這兩種產生細胞素之細胞之增加，雖然對IFN- r之增加實質上比IL-4多（圖4) 。在以空載體免疫之控制組未偵測到產生細胞素之細胞。偏向產生IFN· 7 -之細胞的結果指出米科莫（imiquimod)不僅作用為核苷酸接種之佐劑而且其優先誘發Thl類型之反應，後者係經以如上實例1證實。 4· 科蔞對體浚性免疫反應之影響為測試是否米科莫（imiquimod)增加核酸接種造成之體液性反應’以PMGT將編碼抗原之質體（如，來自流行性感冒病毒之核蛋白）投藥至小鼠皮膚中。初級免疫後繼而以一或多次追加免疫，且每次免疫間至少隔4週。在每次免疫前及/或每次免疫後立即在該免疫位點以單一皮下注射投用米科莫 (imiquimod)。質體及米科莫（imiqUim〇d)控制組分別為空載體 (即，不含抗原）及媒劑。自尾靜脈收集血液樣品且於免疫前 1至3天’及免疫後定期收集。分離血清並貯存於·2〇χ：以供後續之抗體分析。體液性反應之評估係藉由測量抗原-特異性之整個IgG抗體（如’來自流行性感冒病毒之核蛋白）在初級及追加免疫後 -41 - 本紙張尺度適用中國國家榡準(CNS) A4規格(21〇x 297公釐） 1287453 A7 B7 五、發明説明（39 ) 收集之血清樣品中之含量。以10微克/毫升之抗原塗覆微滴定盤（囊克（Nunc)免疫盤F96麥克西索普（maxisorp)，賴菲特 (Lifet)科技），在4°C保溫過夜並以清洗緩衝溶液（含有5% Tween 20及0.1%疊氮化鈉之PBS)清洗4次。繼而與經連續稀釋於阻斷緩衝溶液中之血清樣品於20°C下培養1小時。再清洗4次（如上）以除去未結合之抗體後，將微滴定盤與經阻斷緩衝溶液稀釋之與過氧化酶結合之抗-小鼠IgG抗體（南方生物科技）培養1小時。於再清洗4次之後測定結合之抗體量（如上）繼而添加TMB受質溶液（T· 8540-西格馬（Sigma))。於20°C 下避光30分鐘後，以1M硫酸終止反應並讀取於波長450 nm 之吸光值。滴定價係定義為OD達0· 2時之最高稀釋度。在經免疫且以米科莫（imiquimod)處理之小鼠抗體增加量超過經免疫但未以米科莫（imiquimod)處理者，指示出米科莫（imiquimod) 對體液性反應之促進作用。 5 .米科莫（Imiquimod)促進對HIV抗原之免疫反應質體，DNA及彈射劑製備表現Gag及Nef抗原之質體（即WRG7077Gag/Nef)之構建係以WRG7077為基礎。原始WRG7077質體之構建係藉由以含有抗康黴素基因之pUC4K(愛馬夏（Amersham)-法瑪西亞 (Pharmacia))之 EcoRI 片段置換含有 pUC19之 Eamll051-Pstl 片段之貝塔-lactamase基因（購自Amersham Pharmacia生物科技英國股份有限公司，愛馬夏普雷斯（Amersham Place)，小丘芳特（Chalfont)，布克斯（Bucks)，HP7 9NA)，此係繼利用T4 DNA聚合酶使該二片段變鈍之後。人類巨細胞病毒IE1啟動 -42- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1287453 A7 B7 五、發明説明（40 ) 子/增強劑，内子A，係衍生自得自麻州大學之哈里特魯賓森（Harriet Robinson)博士之質體JW4303，並將其插入pUC 19之 SaLl位點是為Xhol-SaLl片段，其併入牛生長荷爾蒙聚腺苷酸化作用信號。Gag-Nef融合物之生成係藉由PCR針缝衍生自HIV-1品系248A(基因庫Acc. No· L15518，由G·湯普森 (Thompson)好意相贈）且具有自基因之5’末端刪除195bp除去前65個胺基酸之經截短之Nef，與來自質體pHXBAPr (Gag)(馬歇拉（Maschera)等人，1995)且含有 HIV-1 clade B 品系HXB2(基因庫Acc· No· K03455)之ρ17ρ24。接著將所生成之Gag-Nef融合（物）接合至WRG7077中是為Notl- BamHI片段。質體DNA及cartridge之製備係如於實例1中所述。小鼠及免疫

Balb/c小鼠之免疫，及米科莫（imiquimod)之製備與投藥係如於實例1中所述。在此小鼠接獲初級免疫繼而於42天後追加免疫。米科莫（imiquimod)(100毫克/公斤）僅於追加時投藥〇細胞毒性之T細胞反應 IFN-r ELISPOT分析之進行係如上所述（實例1)，利用Gag 及Nef抗原之CD8-限制性母系胜肽刺激於追加免疫後5天收集之脾細胞。結果觀察到細胞毒性T細胞在共投用米科莫（imiquimod)組與單獨接受質體與媒劑組相較有實質上之增加（對於Gag及Nef 分別為10倍及100倍）（圖5)。這些發現建議米科莫（imiquimod) 之佐劑作用並非抗原特異性且以病毒性抗原為範例功效， -43- 紙系尺度適用中國ΐ家標準(CNS) A4規格(210X297公Θ 1287453 A7 B7 五、發明説明（41 ) 最特定言之以HIV。 6 .米科莫（imiquimod)之類似物係核酸（疫苗）接種之有效佐劑。利用pVACl.OVA質體製備彈射劑，免疫及T細胞反應系係如於實例2所述。所試驗之米科莫（imiquimod)類似物係1-(2-羥基-2-甲基丙基）-2-乙氧甲基-1-H-咪唑并[4,5-c]堕啉-4-胺（即雷西科莫（resiquimod))，1 - (2-經基-2-甲基丙基）-2-甲基-1Η-_σ坐并[4,5-c]璧琳-4-胺及1-(2,¾基-2-甲基丙基）_ 1H-咪唑并[4,5-c]膣啉-4-胺。對廣大範圍劑量之雷西科莫（Resiquimod)試驗發現1毫克/ 公斤為最適劑量。在此對免疫後5天之淋巴結細胞之分析顯示產生IFN- r之CD4 T細胞增加六倍，而對產生IL-4之CD4 T 細胞只有適度的影響（圖6)，進一步支持在實例3中觀察到之偏好Thl之作用。免疫後5天觀察另外兩個類似物以30毫克/公斤之單一劑量給藥對T細胞之影響。1·(2-羥基-2-甲基丙基）-2-曱基-1H-咪唑并[4,5-c]膣啉-4-胺同時誘發產生IFN- r及產生IL-4之 CD4 T細胞增加兩倍。於1-(2,羥基-2-甲基丙基）-1Η-咪唑并 [4, 5-c]喹啉-4-胺亦觀察到相似之作用（圖7)。整體而言，此實例中之這些結果顯示該佐劑作用不單獨限於米科莫(imiquimod)，而是延伸至此化學分類中更廣範圍之化合物。 7 ·局部施用係投用米科莫（imiquimod)與核酸接種之有效途徑。利用WRG7077Gag/Nef質體製備彈射劑，PMID免疫及T細 -44- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1287453 A7 B7 五、發明説明（42 ) 胞反應係如實例5中所述。在此，米科莫（imiquimod)係經由皮下以劑量3 0毫克/公斤投藥。本實驗包括額外的一組，其中米科莫（imiquimod)之投藥係藉由在緊接著免疫後將20微升之5%(w/v)乳膏調配物（即Aldara)局部施用於PMID部位。於追加免疫後6及11天收集脾臟用於分析。細胞毒性T細胞於共投用米科莫（imiquimod)組，不論以皮下注射或局部施用，與單獨接獲質體與經由皮下之媒劑組相較，觀察到實質上之增加（即，追加後11天大約增力π 2 倍）（圖8)。這些發現顯示局部施用米科莫（imiquimod)對於 PMID係有效之佐劑且在佐劑結合PMID之觀察中建議皮下、、主射係局部施用之適切替代途徑。 8 ·米科莫（Imiquimod)係預防腫瘤生長之有敛佑癌,丨。 OVA質體（如於實例2中所迷）彈射劑之製備係利用pVACl. 。如於實例5中所述以PMID免疫每組12隻小鼠，除了彈射哨含有0· 1微克DNA且米科莫（imiquimod)係由皮下以劑量3〇 * 克/公斤投藥外。腫瘤攻毒於追加兩週後，藉由以針皮下注射每隻小鼠腰窩以植入 EG7-OVA細胞（1〇〇, 〇〇〇個細胞/小鼠）並監測腫瘤生長。兮、 E.G7· OVA細胞最初係由F·卡f (Carbone)產生（慕爾（M〇〇re), Μ· W·，卡幫（Carbone)，F· R·與貝文 Bevan)，Μ· J·,細胞，54 ，777-785，1988)此係藉由轉染小鼠腹水淋巴瘤淋巴母細跑細胞株，EL4，以安定表現雞卵清蛋白。以pVAC 1 · OVA+米科莫（imiquimod)免疫之小鼠與單姨以 45- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 1287453 A7 B7 五、發明説明（43 ) pVACl.OVA免疫之小鼠相較可觸摸到之腫瘤之出現最遲（圖 9)。控制組小鼠（即以空載體土米科莫（imiquimod)免疫之小鼠）之可觸摸到之腫瘤出現較早且生長速度最快。以 pVAC 1 · OVA +米科莫（imiquimod)免疫之小鼠之腫瘤發生率為25%。相反地，所有其他組之腫瘤發生率大於40%(圖10) 。這些結果顯示米科莫（imiquimod)可改良PMID之抗腫瘤作用，且建議米科莫（imiquimod)會是以核酸治療疾病之有效佐劑0 -46 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）

Claims

A8 B8

12874^090123505號專利申請案中文申請專利範圍替換本(96年5月）S 申請專利範園 1 · 一種疫苗組合物，其包含 ⑴佐劑組份，該佐劑組份包含1H_咪唑并[4,5_c]喳啉·心胺衍生物，其中該衍生物係選自由下列所組成之群_ 1·(2-甲基丙基）·1Η-咪唑并[4,5-c]喹啉-心胺 1-(2-羥基-2·曱基丙基唑并[4,5_^奎琳·心胺 4-胺 1令羥基：甲基丙基）_2_乙氧甲基-此咪唑并[4,5义] 喳啉-4·胺；及 ' (ii)抗原組份，該抗原組份包含編碼與疾病狀態相關之抗原性胜肽或蛋白質之核芬酸序列。、 2 · —種套組，其包含 ⑴佐劑組份，該佐劑組份包含1H_咪唑并[4, c] p奎啉_心胺衍生物，其中該衍生物係選自由下列所組成之群 1-(2-曱基丙基）-lH-咪唑并[4,5-c]喳啉_4_胺 1-(2-羥基-2-甲基丙基)_1H_咪唑并[4,5_c]峻啉_4_胺 1-(2-經基-2-甲基丙基）_2_甲基-iH-咪唑并奎啉_ 4-胺 1-(2-羥基-2-甲基丙基>入乙氧甲基_1H_咪唑并[4,5-c] 喹啉-4-胺；及 (11)抗原組份，該抗原組份包含編碼與疾病狀態相關之抗原性胜肽或蛋白質之核嘗酸序列。 3 ·根據申請專利範圍第2項之套組，其中該等組份係實質上同時投藥。 73971-960510.doc 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公爱) 1287453 、申請專利範園 4·，據中請專利㈣p項之組合物’其中該等組份係於早一醫藥上可接受的調配物中。 5·根據申請專利範圍第1項之疫苗組合物，其中每個組份係為適用於經由口，鼻，局部，肺，肌肉内，皮下或皮内等任一途徑投藥之形式。、據申喷專利範圍第5項之疫苗組合物，其中該抗原組 =係為適用於利用經顆粒媒介之基因轉移技術投藥之形 7·根據申請專利範圍第6項之疫苗組合物，其中該佐劑組份係為適用於利用經顆粒媒介之基因轉移技術投藥之形式。 8· y種1H_咪唑并[4,5_c]喹啉胺衍生物之用途，其係用、製U用於促進免疫反應之醫藥品，其中該醫藥品包含編碼抗原性胜肽之核芬酸序列，·且其中該咪唑并 [4,5-c]喹啉_4_胺衍生物係選自由下列所組成之群 1- (2-甲基丙基）_丨Η·咪唑并[4, c]喹啉_ 4•胺 1-(2-羥基-2-甲基丙基咪唾并[4,5·+奎琳心胺 W2-經基-2-甲基丙基>2-甲基]坐并[4,5斗奎琳」 4-胺 1-(2-羥基4甲基丙基）_2_乙氧甲基_ m•咪唑并[4, 5^] p奎琳-4-胺。 9.根據申請專利範圍第8項之用途，其中該ih_咪唑并 [4,5-c]喳啉-4_胺衍生物之投藥劑量係介於約1毫克/公斤至50毫克/公斤之間。 -2- 73971-960510.doc 本紙張尺度適用中國國家標準(CMS) A4規格(210X297公董） 1287453 六、申請專利範園 10· —種用於DNA接種以分別、順序或同時投予組份之組合，其包括編碼抗原性胜肽抗原之核甞酸序列，及促進該抗原性胜肽引發之免疫反應之1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺衍生物，其中該衍生物係選自由下列所組成之群 1-(2•甲基丙基)_1H•咪唑并[4,5_c]喹啉_4_胺 1-(2-羥基-2-甲基丙基）_1H-咪唑并[4,5-c]喹啉_4•胺 1-(2-羥基-2-甲基丙基）_2·甲基-1H_咪唑并[4,5<^奎啉_ 4-胺 1-(2-羥基-2-甲基丙基乙氧甲基·咪唑并[4,5_ c]峻琳-4-胺。 11 ·根據申，專利範圍第2項之套組，其中每個組份係為適用於經由口 ’鼻，局部，肺，肌肉内，皮下或皮内等任一途徑投藥之形式。 12. 根據中請專利範圍第u項之疫苗套組，其中該抗原組份係為適用於利用經顆粒媒介之基因轉移技術投藥之形式。 13. 根據中請專利範圍第u項之疫苗套合，其巾該佐劑組份係為適用於利用經顆粒媒介之基因轉移技術投藥之形式。/、 3- 73971-960510.doc 公釐）本紙張尺度適財a η家鱗(CNS) Α4規格(2ι〇χ撕