ES2309086T3 - Uso de imidazoquinolinaminas como adyuvantes en vacunacion por adn. - Google Patents
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Abstract
Una vacuna que comprende (i) un componente inmunogénico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido antigénico o una proteína asociada con un estado de enfermedad, y (ii) un componente adyuvante para aumentar una respuesta inmune al péptido antigénico, o proteína, codificado por la secuencia de nucleótidos, en la que el componente adyuvante comprende un derivado de 1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina, y en la que el componente adyuvante se administra entre aproximadamente 1 día antes y aproximadamente 3 días después de la administración del componente inmunogénico.
Description
Uso de imidazoquinolinaminas como adyuvantes en
vacunación por ADN.
La presente invención se refiere a mejoras en la
vacunación por ADN y en particular, pero no exclusivamente, a
composiciones de vacuna, a procedimientos de vacunación de un
mamífero frente a estados de enfermedad, y al uso de determinados
compuestos en la fabricación de medicamentos.
Las técnicas de vacunación tradicionales que
implican la introducción en un sistema animal de un antígeno que
puede inducir una respuesta inmune en el animal y, por tanto,
proteger al animal frente a la infección, se conocen hace muchos
años. Después de la observación, al principio de los años 1990, de
que plásmidos de ADN se podían transfectar en células animales
in vivo, se han realizado importantes esfuerzos en
investigación para desarrollar técnicas de vacunación basadas en el
uso de plásmidos de ADN para inducir respuestas inmunes, mediante
la introducción directa en animales de ADN que codifica péptidos
antigénicos. Estas técnicas, que se denominan "inmunización por
ADN" o "vacunación por ADN", se están usado ahora para
generar respuestas inmunes de anticuerpos protectores (humoral) y
mediada por células (celular) en una amplia variedad de modelos
pre-clínicos de enfermedades bacterianas y
parasíticas. La investigación se lleva a cabo también referida al
uso de técnicas de vacunación por ADN en el tratamiento y
protección frente al cáncer, alergias y enfermedades
autoinmunes.
Las vacunas de ADN, generalmente, están
constituidas por un vector de plásmido bacteriano en el que se
inserta un promotor fuerte, el gen de interés que codifica un
péptido antigénico y una secuencia de terminación
trascripcional/poliadenilación. El inmonógeno que es codificado por
el gen de interés podría ser una proteína completa o, simplemente,
una secuencia de un péptido antigénico relacionado con el patógeno,
tumor u otro agente frente al que se pretende proteger. El plásmido
se puede crecer en bacterias, tal como por ejemplo E. coli, y
posteriormente aislarse y prepa-
rarse en un medio apropiado, dependiendo de la vía de administración pretendida, antes de administrarse al huésped.
rarse en un medio apropiado, dependiendo de la vía de administración pretendida, antes de administrarse al huésped.
La información básica necesaria referente a la
vacunación por ADN se proporciona en ``Donnelly, J. et al.,
Annual Rev. Immunol. 15: 617-648 (1997), la
revelación de la cual se incluye en esta memoria descriptiva en su
totalidad mediante referencia.
Existen distintas ventajas de la vacunación por
ADN respecto a las técnicas de vacunación tradicionales. En primer
lugar, se predice que debido a que las proteínas codificadas por la
secuencia de ADN se sintetizan en el huésped, la estructura o
conformación de la proteína será similar a la de la proteína nativa
asociada con el estado de enfermedad. También es probable que la
vacunación por ADN confiera protección frente a cepas diferentes de
un virus mediante la generación de una respuesta de linfocitos T
citotóxicos que reconocen epítopos de proteínas conservadas.
Además, debido a que los plásmidos se introducen directamente en las
células huésped, en las que se puede producir la proteína
antigénica, se generará una respuesta inmune de larga duración. La
tecnología ofrece también la posibilidad de combinar distintos
inmunógenos en una única preparación para facilitar la inmunización
simultánea frente a distintos estados de enfermedad.
A pesar de las numerosas ventajas asociadas con
la vacunación por ADN respecto a las terapias de vacunación
tradicionales, existe, sin embargo, un deseo de desarrollar
compuestos adyuvantes que sirvan para aumentar la respuesta inmune
inducida por la proteína codificada por el plásmido de ADN
administrado a un animal.
La vacunación por ADN se asocia algunas veces a
una desviación inapropiada de la respuesta inmune de un respuesta
Th1 a Th2, especialmente cuando el ADN se administra directamente en
la epidermis (Fuller and Haynes, Hum. Retrovir. 10:
1433-41 (1994)). Se ha reconocido que el perfil
inmune deseado, a partir de una vacuna de ácido nucleico, depende
de la enfermedad a la que va dirigido. La estimulación preferente de
una respuesta Th1 proporciona, probablemente, eficacia a vacunas
frente a muchas enfermedades virales y cánceres, y un tipo de
respuesta Th2 dominante podría ser efectivo para limitar la alergia
y la inflamación asociada con algunas enfermedades autoinmunes. De
acuerdo con esto, podrían ser útiles las vías para aumentar
cuantitativamente la respuesta inmune o para desviar el tipo de
respuesta hacia aquel que sea más eficaz para los síntomas de la
enfermedad.
De acuerdo con esto, un objetivo de la presente
invención es proporcionar composiciones adyuvantes que se puedan
usar junto con procedimientos de vacunación por ADN. También es un
objetivo preferido proporcionar composiciones que incluyan los
adyuvantes de interés, así como los procedimientos para mejorar la
vacunación por ADN que impliquen tales adyuvantes. Otros objetivos
de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente
descripción detallada de los mismos. Hasta la fecha, sin embargo, se
ha probado que es difícil reunir estos objetivos, debido
principalmente a las diferencias en los mecanismos asociados con la
vacunación por ADN, en comparación con las técnicas de vacuna
tradicionales. También, la identificación de los compuestos
adecuados no es directa, habiéndose ensayado distintos agentes
conocidos, que potencian la respuesta inmune, en combinación con
las técnicas de vacunación por ADN, con un éxito limitado o, en el
mejor de los casos, mixto. Por ejemplo, la
co-administración de los genes de
IFN-\gamma y de la glicoproteína del virus de la
rabia tiene un efecto inhibidor tanto de la respuesta de células T
de ayuda como de la respuesta de anticuerpos (Xiang y Ertl).
En el resumen (36^{th} JCAAC, H121), Harrison
et al. muestran que una vacuna de ADN frente al VHS y el
derivado de imidazoquinolina S28463 tienen un efecto terapéutico
aditivo cuando se administran con 7 días de diferencia.
Con estos antecedentes en mente, es muy
sorprendente apreciar que los presentes inventores describen
componentes adyuvantes que son efectivos para promover una
respuesta inmune mejorada, en particular una respuesta inmune
celular mejorada, cuando se usan como adyuvantes en la vacunación
por ADN. Los derivados de imidazoquinolinamina son inductores de
citocinas, que incluyen IFN-\alpha,
IL-6 y TNF-\alpha (véase, por
ejemplo, Reiter et al., J. Leukocyte Biology 55:
234-240 (1994)). Estos compuestos y los
procedimientos para su preparación se han revelado en la
publicación de la solicitud de patente PCT número WO 94/17043. Los
presentes inventores han mostrado que estos derivados se podrían
usar de forma efectiva como adyuvantes en vacunación por ADN.
Según una forma de realización de la presente
invención, se proporciona una vacuna que comprende (i) un componente
adyuvante que comprende un derivado de
1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina
y (ii) un componente inmunogénico que comprende una secuencia de
nucleótidos que codifica un péptido antigénico o una proteína
asociada con un estado de enfermedad, en la que el componente
adyuvante aumenta la respuesta inmune a un péptido antigénico o
proteína en un mamífero y en la que el componente adyuvante se
administra entre aproximadamente 1 día antes y aproximadamente 3
días después de la administración del componente inmunogénico.
En una forma de realización adicional se
proporciona el uso de un derivado de
imidazo[4,5-c]quinolin-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina
en la fabricación de un medicamento para aumentar la respuesta
inmune iniciada por un péptido antigénico, en el tratamiento de un
mamífero en un estado de enfermedad seleccionado entre una infección
viral, bacteriana o parasítica, cáncer, alergia o un trastorno
autoinmune, expresándose dicho péptido como resultado de la
administración a un mamífero de una secuencia de nucleótidos que
codifica dicho péptido y en el que el derivado de
1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina
se administra entre aproximadamente 1 día antes y aproximadamente 3
días después de la administración de la secuencia de nucleótidos
que codifica dicho péptido.
Preferentemente, el derivado de
1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina
es un compuesto definido por una de las fórmula
I-VI definidas en esta memoria descriptiva. Más
preferentemente, es un compuesto definido por la fórmula VI. Es
particularmente preferido cuando el derivado de
1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina
es un compuesto de fórmula VI seleccionado entre el grupo
constituido por
1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina;
1-(2-hidroxi-2-metilpropil)-2-metil-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina;
1-(2-hidroxi-2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina;
1-(2-hidroxi-2-metilpropil)-2-etoximetil-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina.
Imiquimod aumenta la respuesta de células T
citotóxicas después de la vacunación con un plásmido que codifica
la nucleoproteína del virus de la gripe (pVAC1.PR). El vector
control es pVAC1.
Imiquimod aumenta la expansión clonal de las
células T CD4 in vivo después de la vacunación con un
plásmido que codifica la proteína ovoalbúmina, medida por la
proliferación aumentada de células T CD4+.
Imiquimod aumenta el número de células T CD4
activadas in vivo después de la vacunación con un plásmido
que codifica la proteína ovoalbúmina, medido por el aumento de
células productoras de IFN-\gamma e
IL-4.
Imiquimod induce tanto respuestas Th1 como Th2
in vivo después de la vacunación con un plásmido que codifica
la proteína ovoalbúmina, medidas por el aumento de células
productoras de IFN-\gamma e IL-4,
respectivamente.
Imiquimod aumenta la respuesta de células T
citotóxicas después de la vacunación con un plásmido que codifica
los antígenos de VIH, Gag y Nef (WRG7077. Gag/Nef). El vector
control es WRG7077.
Resiquimod
(1-(2-hidroxi-2-metilpropil)-2-etoximetil-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina,
un análogo de imiquimod, aumenta el número de células T CD4
activadas in vivo después de la vacunación con un plásmido
que codifica la proteína ovoalbúmina, medido por el aumento de
células productoras de IFN-\gamma e
IL-4 (6A y 6B, respectivamente).
Dos análogos de imiquimod,
1-(2-hidroxi-2-metilpropil)-2-metil-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina
y
1-(2-hidroxi-2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina,
aumentan el número de células T CD4 activadas in vivo
después de la vacunación con un plásmido que codifica la proteína
ovoalbúmina, medido por el aumento de células productoras de
IFN-\gamma e IL-4 (7A y 7B,
respectivamente).
La aplicación tópica de imiquimod aumenta la
respuesta de células T citotóxicas después de la vacunación con un
plásmido que codifica los antígenos de VIH, Gag y Nef (WRG7077.
Gag/Nef). El vector control es WRG7077.
Imiquimod retrasa el crecimiento de tumores en
animales tratados con células tumorales EG7.OVA, que expresan
ovoalbúmina, después de la inmunización con el plásmido que codifica
ovoalbúmina.
Imiquimod reduce la tumorigenicidad de las
células tumorales EG7.OVA, que expresan ovoalbúmina, implantadas en
animales preinmunizados con el plásmido que codifica
ovoalbúmina.
A lo largo de esta memoria descriptiva y en las
reivindicaciones acompañantes, a menos que el contexto requiera
otra cosa, las palabras "comprende" e "incluye" o
variaciones tales como "que comprende" o "que incluye",
etc., se deben interpretar de forma inclusiva, esto es, el uso de
estas palabras implicará la posible inclusión de números enteros o
de elementos no detallados específicamente.
Como se describió anteriormente, la presente
invención se refiere a composiciones inmunogénicas tales como
composiciones de vacuna, a procedimientos de vacunación y a la
mejora de los procedimientos de vacunación que implican la
introducción en un mamífero de una secuencia de nucleótidos que
codifica un inmunógeno que es una proteína o un péptido antigénico,
de forma que la proteína o el péptido se expresarán en el organismo
del mamífero para inducir por ello una respuesta inmune en el
mamífero frente a una proteína o péptido antigénico. Tales
procedimientos de vacunación son muy conocidos y están descritos
completamente en Donnelly et al., como se hizo referencia
anteriormente.
Como se usa en esta memoria descriptiva, el
término composición de vacuna se refiere a una combinación de un
componente inmunogénico que comprende una secuencia de nucleótidos
que codifica un inmunógeno y un componente adyuvante que comprende
un derivado de
1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina.
La combinación es, por ejemplo, en forma de una mezcla de dos
componentes en una única formulación farmacéuticamente aceptable o
en forma de componentes individuales separados, por ejemplo, en
forma de un kit que comprende un componente inmunogénico que
comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un inmunógeno y
un componente adyuvante que comprende
1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina,
en el que los dos componentes son para la administración simultánea,
secuencial o separada. Preferentemente, la administración de los
dos componentes es sustancialmente simultánea.
El derivado de
1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina,
como se indica a lo largo de esta memoria descriptiva y en las
reivindicaciones, es preferentemente un compuesto definido por una
de las Fórmulas I-VI, a continuación:
en la
que
R_{11} se selecciona entre el grupo
constituido por un alquilo de cadena lineal o ramificada,
hidroxialquilo, aciloxialquilo, bencilo, (fenil)etilo y
fenilo, estando dichos sustituyentes bencilo, (fenil)etilo o
fenilo sustituidos opcionalmente en el anillo de benceno por uno o
dos restos seleccionados independientemente entre el grupo
constituido por alquilo de uno a aproximadamente cuatro átomos de
carbono, alcoxi de uno a aproximadamente cuatro átomos de carbono y
halógeno, con la condición de que si dicho anillo de benceno se
sustituye por dos de dichos restos, dichos restos juntos no
contengan más de 6 átomos de carbono; R_{21} se selecciona entre
el grupo constituido por hidrógeno, alquilo de uno a aproximadamente
ocho átomos de carbono, bencilo, (fenil)etilo, y fenilo,
estando el sustituyente bencilo, (fenil)etilo o fenilo
sustituido opcionalmente en el anillo de benceno por uno o dos
restos seleccionados independientemente entre el grupo constituido
por alquilo de uno a aproximadamente cuatro átomos de carbono,
alcoxi de uno a aproximadamente cuatro átomos de carbono y halógeno,
con la condición de que cuando el anillo de benceno esté sustituido
por dos de dichos restos, los restos juntos no contengan más de 6
átomos de carbono; y cada R_{1} se selecciona independientemente
entre el grupo constituido por hidrógeno, alcoxi de uno a
aproximadamente cuatro átomos de carbono, halógeno y alquilo de uno
a aproximadamente cuatro átomos de carbono, y n es un número entero
de 0 a 2, con la condición de que si n es 2, entonces dichos grupos
R_{11} juntos no contengan más de 6 átomos de carbono;
en la
que
R_{12} se selecciona entre el grupo
constituido por un alquenilo de cadena lineal o ramificada, que
contiene de 2 a aproximadamente 10 átomos de carbono, y un
alquenilo sustituido de cadena lineal o ramificada, que contiene de
2 a aproximadamente 10 átomos de carbono, en el que el sustituyente
se selecciona entre el grupo constituido por un alquilo de cadena
lineal o ramificada, que contiene de 1 a aproximadamente 4 átomos de
carbono y cicloalquilo que contiene de 3 a aproximadamente 6 átomos
de carbono; y un cicloalquilo que contiene de 3 a aproximadamente 6
átomos de carbono, sustituido por un alquilo de cadena lineal o
ramificada, que contiene de 1 a aproximadamente 4 átomos de
carbono; y R_{22} se selecciona entre el grupo constituido por
hidrógeno, alquilo de cadena lineal o ramificada que contiene de
uno a aproximadamente ocho átomos de carbono, bencilo,
(fenil)etilo, y fenilo, estando el sustituyente bencilo,
(fenil)etilo o fenilo opcionalmente sustituido en el anillo
de benceno por uno o dos restos seleccionados independientemente
entre el grupo constituido por alquilo de cadena lineal o
ramificada que contiene de uno a aproximadamente cuatro átomos de
carbono, alcoxi de cadena lineal o ramificada que contiene de uno a
aproximadamente cuatro átomos de carbono, y halógeno, con la
condición de que cuando el anillo de benceno esté sustituido por dos
de dichos restos, los restos juntos no contengan más de 6 átomos de
carbono; y cada R_{2} se selecciona independientemente entre el
grupo constituido por alcoxi de cadena lineal o ramificada que
contiene de uno a aproximadamente cuatro átomos de carbono, halógeno
y alquilo de cadena lineal o ramificada que contiene de uno a
aproximadamente cuatro átomos de carbono, y n es un número entero
de 0 a 2, con la condición de que si n es 2, dichos grupos R_{2}
juntos no contengan más de 6 átomos de carbono;
en la
que
R_{23} se selecciona entre el grupo
constituido por hidrógeno, alquilo de cadena lineal o ramificada de
uno a aproximadamente ocho átomos de carbono, bencilo,
(fenil)etilo, y fenilo, estando el sustituyente bencilo,
(fenil)etilo o fenilo opcionalmente sustituido en el anillo
de benceno por uno o dos restos seleccionados independientemente
entre el grupo constituido por alquilo de cadena lineal o ramificada
de uno a aproximadamente cuatro átomos de carbono, alcoxi de cadena
lineal o ramificada de uno a aproximadamente cuatro átomos de
carbono, y halógeno, con la condición de que cuando el anillo de
benceno esté sustituido por dos de estos restos, los restos juntos
no contengan más de 6 átomos de carbono; y cada R_{5} se
selecciona independientemente entre el grupo constituido por alcoxi
de cadena lineal o ramificada de uno a aproximadamente cuatro átomos
de carbono, halógeno y 30 alquilos de cadena lineal o ramificada de
uno a aproximadamente cuatro átomos de carbono, y n es un número
entero de 0 a 2, con la condición de que si n es 2, dichos grupos
R_{3} juntos no contengan más de 6 átomos de carbono;
en la
que
R_{14} es -CHR_{A}R_{B}, en el que R_{B}
es hidrógeno o un enlace carbono-carbono, con la
condición de que cuando R_{B} es hidrógeno, R_{A} sea alcoxi de
uno a aproximadamente cuatro átomos de carbono, hidroxialcoxi de
uno a aproximadamente cuatro átomos de carbono,
1-alquinilo de dos a aproximadamente diez átomos de
carbono, tetrahidropiranilo, alcoxialquilo en el que el resto alcoxi
contiene de uno a aproximadamente cuatro átomos de carbono y el
resto alquilo contiene de uno a aproximadamente cuatro átomos de
carbono, 2-, 3- ó 4-piridilo, y con la condición
adicional de que cuando R_{B} es un enlace
carbono-carbono, R_{B} y R_{A} juntos formen un
grupo tetrahidrofuranilo, sustituido opcionalmente con uno o más
sustituyentes, seleccionados independientemente entre el grupo
constituido por hidroxi e hidroxialquilo de uno a aproximadamente
cuatro átomos de carbono, R_{24} se selecciona entre el grupo
constituido por hidrógeno, alquilo de uno a aproximadamente cuatro
átomos de carbono, fenilo y fenilo sustituido, en el que el
sustituyente se selecciona entre el grupo constituido por alquilo
de uno a aproximadamente cuatro átomos de carbono, alcoxi de uno a
aproximadamente cuatro átomos de carbono, y halógeno; y R_{4} se
selecciona entre el grupo constituido por hidrógeno, alcoxi de
cadena lineal o ramificada que contiene de uno a aproximadamente
cuatro átomos de carbono, halógeno y alquilo de cadena lineal o
ramificada que contiene de uno a aproximadamente cuatro átomos de
carbono;
en la
que
R_{15} se selecciona entre el grupo
constituido por: hidrógeno; alquilo de cadena lineal o ramificada,
que contiene de uno a aproximadamente diez átomos de carbono, y
alquilo sustituido de cadena lineal o ramificada, que contiene de
uno a aproximadamente diez átomos de carbono, en el que el
sustituyente se selecciona entre el grupo constituido por
cicloalquilo que contiene de tres a aproximadamente seis átomos de
carbono y cicloalquilo que contiene de tres a aproximadamente seis
átomos de carbono, sustituido por un alquilo de cadena lineal o
ramificada, que contiene de uno a aproximadamente cuatro átomos de
carbono; alquenilo de cadena lineal o ramificada que contiene de
dos a aproximadamente diez átomos de carbono y alquenilo sustituido
de cadena lineal o ramificada, que contiene de dos a
aproximadamente diez átomos de carbono, en el que el sustituyente se
selecciona entre el grupo constituido por cicloalquilo que contiene
de tres a aproximadamente seis átomos de carbono y cicloalquilo que
contiene de tres a aproximadamente seis átomos de carbono,
sustituido por un alquilo de cadena lineal o ramificada que
contiene de uno a aproximadamente cuatro átomos de carbono;
hidroxialquilo de uno a aproximadamente seis átomos de carbono;
alcoxialquilo en el que el resto alcoxi contiene de uno a
aproximadamente cuatro átomos de carbono y el resto alquilo contiene
de uno a aproximadamente seis átomos de carbono; aciloxialquilo en
el que el resto aciloxi es un alcanoiloxi de dos a aproximadamente
cuatro átomos de carbono o benzoiloxi, y el resto alquilo contiene
de uno a aproximadamente seis átomos de carbono; bencilo;
(fenil)etilo; y fenilo; estando el sustituyente bencilo,
(fenil)etilo o fenilo opcionalmente sustituido en el anillo
de benceno por uno o dos restos seleccionados independientemente
entre el grupo constituido por alquilo de uno a aproximadamente
cuatro átomos de carbono, alcoxi de uno a aproximadamente cuatro
átomos de carbono, y halógeno, con la condición de que cuando dicho
anillo de benceno esté sustituido por dos de dichos restos, los
restos juntos no contengan más de 6 átomos de carbono;
y R_{25} es
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en el
que
R_{X} y R_{Y} se seleccionan
independientemente entre el grupo constituido por hidrógeno, alquilo
de uno a aproximadamente cuatro átomos de carbono, fenilo, y fenilo
sustituido, en el que el sustituyente se elige entre el grupo
constituido por alquilo de uno a aproximadamente cuatro átomos de
carbono, alcoxi de uno a aproximadamente cuatro átomos de carbono y
halógeno; X se selecciona entre el grupo constituido por alcoxi que
contiene de uno a aproximadamente cuatro átomos de carbono,
alcoxialquilo en el que el resto alcoxi contiene de uno a
aproximadamente cuatro átomos de carbono y el resto alquilo contiene
de uno a aproximadamente cuatro átomos de carbono, haloalquilo de
uno a aproximadamente cuatro átomos de carbono, alquilamido en el
que el grupo alquilo contiene de uno a aproximadamente cuatro
átomos de carbono, amino, amino sustituido en el que el
sustituyente es alquilo o hidroxialquilo de uno a aproximadamente
cuatro átomos de carbono, azido, alquiltio de uno a aproximadamente
cuatro átomos de carbono; y R_{5} se selecciona entre el grupo
constituido por hidrogeno, alcoxi de cadena lineal o ramificada,
que contiene de uno a aproximadamente cuatro átomos de carbono,
halógeno, y alquilo de cadena lineal o ramificada que contienen de
uno a aproximadamente cuatro átomos de carbono; o una sal
farmacéuticamente aceptable de cualquiera de los mencionados
anteriormente.
Los grupos alquilo preferidos son alquilo
C_{1}-C_{4}, por ejemplo metilo, etilo, propilo,
2-metilpropilo y butilo. Los grupos alquilo más
preferidos son metilo, etilo y
2-metil-propilo. Los grupos alcoxi
preferidos son metoxi, etoxi y etoximetilo.
Los compuestos enumerados anteriormente y los
procedimientos para su preparación se revelan en la publicación de
la solicitud de patente PCT número WO 94/17043.
En los ejemplos en los que n puede ser cero, uno
o dos, n es preferentemente cero o uno.
Los sustituyentes
R_{1}-R_{5} anteriores se designan generalmente
"sustituyentes benzo" en esta memoria descriptiva. El
sustituyente benzo preferido es hidrógeno.
Los sustituyente
R_{11}-R_{15} anteriores se designan
generalmente como "sustituyentes en 1" en esta memoria
descriptiva. El sustituyente en 1 preferido es
2-metilpropilo o
2-hidroxi-2-metilpropilo.
Los sustituyentes
R_{21}-R_{25} anteriores se designan
generalmente como "sustituyentes en 2" en esta memoria
descriptiva. Los sustituyentes en 2 preferidos son hidrógeno,
alquilo de uno a aproximadamente seis átomos de carbono,
alcoxialquilo en el que el resto alcoxi contiene de uno a
aproximadamente cuatro átomos de carbono y el resto alquilo
contiene de uno a aproximadamente cuatro átomos de carbono. Lo más
preferido es que el sustituyente en 2 sea hidrógeno, metilo o
etoximetilo.
\newpage
Se prefiere particularmente cuando el
1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina
es un compuesto definido por la fórmula VI, a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que
R_{t} se selecciona entre el grupo constituido
por hidrógeno, alcoxi de cadena lineal o ramificada, que contiene
de uno a aproximadamente cuatro átomos de carbono, halógeno y
alquilo de cadena lineal o ramificada, que contiene de uno a
aproximadamente cuatro átomos de carbono;
R_{u} es 2-metilpropilo o
2-hidroxi-2-metilpropilo;
y
R_{v} es hidrógeno, alquilo de uno a
aproximadamente seis átomos de carbono o alcoxialquilo, en el que el
resto alcoxi contiene de uno a aproximadamente cuatro átomos de
carbono y el resto alquilo contiene de uno a aproximadamente cuatro
átomos de carbono; o las sales fisiológicamente aceptables de
cualquiera de los anteriores, cuando sea apropiado.
En la fórmula VI, R_{t} es preferentemente
hidrógeno, R_{u} es preferentemente 2-metilpropilo
o
2-hidroxi-2-metilpropilo
y R_{v} es preferentemente hidrógeno, metilo o etoximetilo.
Las
1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-aminas
preferidas incluyen las siguientes:
1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina
(un compuesto de fórmula VI en el que R_{t} es hidrógeno, R_{u}
es 2-metilpropilo y R_{v} es hidrógeno);
1-(2-hidroxi-2-metilpropil)-2-metil-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina
(un compuesto de fórmula VI en el que R_{t} es hidrógeno, R_{u}
es
2-hidroxi-2-metilpropilo
y R_{v} es metilo);
1-(2-hidroxi-2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina
(un compuesto de fórmula VI en el que R_{t} es hidrógeno, R_{u}
es
2-hidroxi-2-metilpropilo
y R_{v} es hidrógeno);
1-(2-hidroxi-2-metilpropil)-2-etoximetil-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina
(un compuesto de fórmula VI en el que R_{t} es hidrógeno, R_{u}
es
2-hidroxi-2-metilpropilo
y R_{v} es etoximetil).
o las sales de los mismos
fisiológicamente
aceptables.
\vskip1.000000\baselineskip
Es posible adaptar los procedimientos de
vacunación y las composiciones según la presente solicitud para la
protección o el tratamiento de mamíferos frente a distintos estados
de enfermedad tales como, por ejemplo, infecciones virales,
bacterianas o parasíticas, cáncer, alergias y trastornos
autoinmunes. Algunos ejemplos específicos de trastornos o estados
de enfermedad frente a los que se puede proteger o que se pueden
tratar utilizando los procedimientos o composiciones según la
presente invención, son los siguientes:
- \quad
- Infecciones virales
- \quad
- Virus de la hepatitis A, B, C, D y E, VIH, virus del herpes 1, 2, 6 y 7, citomegalovirus, varicella zoster, virus del papiloma, virus de Epstein Barr, virus de la gripe, virus de para-influenza, adenovirus, virus coxackie, picornavirus, rotavirus, virus respiratorio sincitial, poxvirus, rinovirus, virus de la rubéola, papovirus, virus de paperas y virus del sarampión.
- \quad
- Infecciones bacterianas
- \quad
- Micobacterias que provocan TB y lepra,
- \quad
- pneumococci, bacilos gram negativos aerobios, micoplasmas, infecciones por staphylococcus, infecciones por sptreptococcus, salmonella, chlamydiae.
- \quad
- Parásitos
- \quad
- Malaria, leishmaniasis, tripanosomiasis, toxoplasmosis, esquistosomiasis, filariasis.
- \quad
- Cáncer
- \quad
- Cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de recto, cáncer de cabeza y cuello, cáncer renal, melanoma maligno, cáncer de laringe, cáncer de ovario, cáncer cervical y cáncer de próstata.
- \quad
- Alergias
- \quad
- Rinitis debido a los ácaros del polvo casero, polen y otros alergenos ambientales
- \quad
- Enfermedades autoinmunes
- \quad
- Lupus eritematoso sistémico.
Preferentemente, los procedimientos o
composiciones de la presente invención se usan para proteger frente
a, o para tratar, los trastornos virales de Hepatitis B, Hepatitis
C, virus del papiloma humano, virus de inmunodeficiencia humano o
virus del herpes simple; la enfermedad bacteriana TB; los cánceres
de mama, colon, ovario, cervix y próstata; o las enfermedades
autoinmunes de asma, artritis reumatoide y enfermedad de
Alzheimer.
Se debe reconocer que se ha hecho referencia a
estos estados de enfermedad específicos a modo de ejemplo únicamente
y no se pretende con ellos limitar el alcance de la presente
invención.
Con el fin de que las secuencias de nucleótidos
a las que se hace referencia en esta solicitud, que son para
expresión en un sistema de mamíferos, induzcan una respuesta
antigénica, podrían codificar una proteína entera, o simplemente
una secuencia de un péptido, más corta, que sea capaz de iniciar una
respuesta antigénica. A lo largo de esta memoria descriptiva y en
las reivindicaciones acompañantes, con los términos "péptido
antigénico" o ``inmunógeno se pretende abarcar a todas las
secuencias de péptidos o proteínas que son capaces de inducir una
respuesta inmune en el animal de interés. Más preferiblemente, sin
embargo, la secuencia de nucleótidos codificará una proteína
completa que se asocie con el estado de enfermedad, debido a que la
expresión de proteínas completas en el sistema animal es más
probable que mimetice la presentación de antígeno natural y, por
tanto, que evoque una respuesta inmune completa. Algunos ejemplos
no limitantes de péptidos antigénicos conocidos, relacionados con
estados de enfermedad específicos, incluyen los siguientes:
antígenos que son capaces de generar una respuesta inmune frente a
un patógeno humano, derivándose este antígeno o composición
antigénica de VIH-1 (tal como tat, nef, gp120 o
pgp160, gp40, p24, gag, env, vif, vpr, vpu, rev), del virus del
herpes simple, tales como gH, gL, gM, gB, gC, gK, gE o gD o
derivados de los mismos o de la proteína temprana inmediata tales
como ICP27, ICP 47, ICP 4, ICP 36 de VHS1 o VHS2, del
citomegalovirus, especialmente del humano (tal como gB o derivados
del mismo), del virus de Epstein Barr (tal como gp350 o derivados
del mismo), del virus de varicella zoster (tales como gpI, II, III
y IE63) o del virus de la hepatitis tal como el virus de la
hepatitis B (por ejemplo, el antígeno de superficie de la Hepatitis
B o los antígenos core o pol de la hepatitis), del antígeno del
virus de la hepatitis C y del antígeno del virus de la hepatitis E,
o a partir de otros patógenos virales, tales como paramixovirus:
virus respiratorio sincitial (tal como las proteínas F y G o
derivados de las mismas), o antígenos del virus de parainfluenza,
virus del sarampión, virus de paperas, virus del papiloma humano
(por ejemplo HPV6, 11, 16, 18, por ejemplo, L1, L2, E1, E2, E3, E4,
E5, E6, E7), flavivirus (por ejemplo, el virus de la fiebre
amarilla, el virus del dengue, el virus de la encefalitis
transmitida por garrapatas, virus de la encefalitis japonesa) o las
células infectadas con el virus de la gripe, tales como proteínas
HA, NP, NA, o M o combinaciones de las mismas), o antígenos
derivados de patógenos bacterianos tales como Neisseria
spp., que incluyen N. gonorrhea y N. meningitidis
(por ejemplo, proteínas de unión a transferrina, proteínas de unión
a lactoferrina, PilC, adhesinas); S. pyogenes (por ejemplo
las proteínas M o fragmentos de las mismas, proteasa C5A, S.
agalaciae, S. mutans; H. ducreyi; Moraxella spp., que incluye
M. catarrhalis, conocida también como Branhamella
catarrhalis (por ejemplo, adhesinas e invasinas de alto y bajo
peso molecular); Bordetella spp., que incluye B.
pertussis (por ejemplo pertactina, toxina pertussis o derivados
de la misma, hemaglutinina filamentosa, adenilato ciclasa,
fimbriae), B. parapertussis y B. bronchiseptica;
Mycobacterium spp., que incluye M. tuberculosis (por
ejemplo ESAT6, Antígeno 85A, -B o -C, MPT44, MPT59, MPT45, HSP10,
HSP65, HSP70, HSP75, HSP90, PPD 19 KDa [Rv3763], PPD 38 kDa
[Rv0934], M. bovis, M. leprae, M. avium, M. paratuberculosis, M.
smegmatis; Legionella spp., que incluye L. pneumophila;
Escherichia spp., que incluye E. coli enterotóxica (por
ejemplo factores de colonización, toxina lábil al calor o derivados
de la misma, tóxina estable a calor o derivados de la misma), E.
coli enterohemorrágica, E. coli enteropatógena (por
ejemplo la toxina similar a la toxina Shiga o derivados de la
misma); Vibrio spp., que incluye V. cholera (por
ejemplo la toxina colérica o derivados de la misma); Shigella
spp., que incluye S. sonnei, S. dysenteriae, S. flexnerii;
Yersinia spp., que incluye Y. enterocolitica (por
ejemplo una proteína Yop), Y. pestis, Y. pseudotuberculosis;
Campylobacter spp., que incluye C. jejuni (por ejemplo
las toxinas, adhesinas e invasinas) y C. coli; Salmonella spp.,
que incluye S. typhi, S. paratyphi, S. choleraesuis, S.
enteritidis; Listeria spp., que incluyen L. monocytogenes;
Helicobacter spp., que incluye H. pylori (por ejemplo
ureasa, catalasa, toxina de vacuolación); Pseudomanas spp.,
que incluye P. aeruginosa; Staphylococcus spp., que incluye
S. aureus, S. epidermidis; Enterococcus spp., que incluye
E. faecalis, E. faecium; Clostridium spp., que incluye C.
tetani (por ejemplo toxina tetánica y derivados de la misma),
C. botulinum (por ejemplo toxina botulínica y derivados de la
misma), C. difficile (por ejemplo toxinas de clostridium A y
B y derivados de la misma); Bacillus spp., que incluye B.
anthracis (por ejemplo toxina botulínica y derivados de la
misma); Corynebacterium spp., que incluye C.
diphtheriae (por ejemplo toxina diftérica y derivados de la
misma); Borrelia spp., que incluye B. burgdorferi
(por ejemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. garinii (por ejemplo
OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. afzelii (por ejemplo OspA, OspC,
DbpA, DbpB), B. andersonii (por ejemplo OspA, OspC, DbpA,
DbpB), B. hermsii; Ehrlichia spp., que incluye E. equi
y el agente de la Ehrlichiosis Granulocítica Humana; Rickettsia
spp., que incluye R. rickettsii; Chamydia spp., que
incluye C. trachomatis (por ejemplo MOMP, proteínas de unión
a heparina), C. pheumoniae (por ejemplo MOMP, proteínas de
unión a heparina), C. psittaci; Leptospira spp., que incluye
L. interrogans; Treponema spp., que incluye T.
pallidum (por ejemplo, proteínas raras de la membrana externa),
T. denticola, T. hyodysenteriae; o derivados de parásitos
tales como Plasmodium spp., que incluye P. falciparum;
Toxoplasma spp., que incluye T. gondii (por ejemplo,
SAG2, SAG3, Tg34); Entamoeba spp., que incluye E.
histolytica; Babesia spp., que incluye B. microti;
Trypanosoma spp., que incluye T. cruzi; Giardia
spp., que incluye G. lamblia; Leshmania spp., que
incluye L. major; Pneumocystis spp., que incluye P.
carinni; Trichomonas spp., que incluye T. vaginalis;
Schisostoma spp., que incluye S. mansoni, o derivados de
levaduras tales como Candida spp., que incluye C.
albicans; Cryptococcus spp., que incluye C.
neoformans.
Otos antígenos específicos preferidos para M.
tuberculosis son, por ejemplo, Rv2557, Rv2558, RPF: Rv0837c,
Rv1884c, Rv2389c, Rv2450, Rv1009, aceA /Rv0467), PstS1, (Rv0932),
SodA (Rv3846), Rv2031c 16kDal., Tb Ra12, Tb H9, Tb Ra35,
Tb38-1, Erd 14, DPV, MTI, MSL, mTTC2 y hTCC1
(documento WO 99/51748). Las proteínas para M. tuberculosis
incluyen también proteínas de fusión y variantes de las mismas, en
las que, al menos dos, preferentemente tres, polipéptidos de M.
tuberculosis se fusionan en una proteína mayor. Las fusiones
preferidas incluyen Ra12-TbH9-Ra35,
Erd14-DPV-MTI,
DPV-MTI-MSL,
Erd14-DPV-MTI-MSL-mTCC2,
Erd 14-DPV-MTI-MSL,
DPV-MTI-MSL-mTCC2,
TbH9-DPV-MTI (documento WO
99/51748).
Los antígenos más preferidos de Chlamydia
incluyen, por ejemplo, la proteína de alto peso molecular (HWMP)
(documento WO 99/17747), ORF3 (documento EP 366 412), y las posibles
proteínas de membrana (PMP). Otros antígenos de Chlamydia de
la formulación de la vacuna se pueden seleccionar entre el grupo
descrito en el documento WO 99/28475.
Las vacunas bacterianas preferidas comprenden
antígenos derivados de Streptococcus spp., que incluye S.
pneumoniae (PsaA, PspA, estreptolisina, proteínas de unión a
colina) y antígeno proteico pneumolisina (Biochem. Biophys. Acta,
1989, 67, 1007; Rubins et al., Microbial Pathogenesis 25:
337-342) y los derivados mutantes destoxificados
del mismo (documentos WO 90/06951 y WO 99/03884). Otras vacunas
bacterianas preferidas comprenden antígenos derivados de
Haemophilus spp., que incluye H. influenzae de tipo B
(por ejemplo, PRP y conjugados de la misma), H. influenza no
tipificable, por ejemplo OMP26, adhesinas de alto peso molecular,
P5, P6, proteína D y lipoproteína D, y fimbrina y los péptidos
derivados de fimbrina (documento US 5.843.464) o variantes de
copias múltiples o proteínas de fusión de la misma.
Los antígenos que se podrían usar en la presente
invención podrían comprender, adicionalmente, antígenos derivados
de parásitos que provocan malaria. Por ejemplo, los antígenos
preferidos de Plasmodia falciparum incluyen RTS,S y TRAP.
RTS es una proteína híbrida que comprende, sustancialmente, toda la
porción C-terminal de la proteína del
circumsporozoito (CS) de P. falciparum unida, mediante cuatro
aminoácidos de la porción preS2 del antígeno de superficie del
virus de la Hepatitis B, al antígeno de superficie (S) del virus de
la hepatitis B. Su estructura completa se revela en la solicitud de
patente internacional nº PCT/EP92/02591, publicada bajo el número
WO 93/10152, prioridad reivindicada de la solicitud de patente del
R.U. nº 9124390.7. Cuando se expresa en levaduras, RTS se produce
como una partícula de liproteína y cuando se
co-expresa con el antígeno S del VHB, produce una
partícula mixta conocida como antígenos RTS,S. Los antígenos TRAP se
describieron en la solicitud de patente internacional nº
PCT/GB89/00895, publicada como WO 90/01496. Una forma de realización
preferida de la presente invención es una vacuna frente a la
malaria en la que la preparación antigénica comprende una
combinación de los antígenos RTS,S y TRAP. Otros antígenos de
plasmodia que son probables candidatos para ser componentes
de una vacuna frente a las múltiples etapas de la malaria son MSP1,
AMA1, MSP3, EBA, GLURP, RAP1, RAP2, secuestrina, PfEMP1, Pf332,
LSA1, LSA3, STARP, SALSA, PfEXP1, Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfs16,
Pfs48/45, Pfs230 de P. falciparum y sus análogos en
Plasmodium spp.
La invención contempla el uso de un antígeno
antitumoral y sería útil para el tratamiento inmunoterapéutico de
cánceres. Por ejemplo, antígenos para el rechazo de tumores tales
como los de los cánceres de próstata, mama, colorectal, pulmón,
pancreático, renal o melanoma. Ejemplos de estos antígenos incluyen
MAGE 1, 3 y MAGE 4 u otros antígenos MAGE tales como los revelados
en el documento WO 99/40188, PRAME, BAGE, Lage (conocido también
como NY Eos 1), SAGE y HAGE (documento WO 99/53061) o GAGE (Robins
and Kawakami, 1996, Current Opinions in Immunology 8, páginas
628-636; Van den Eynde et al., International
Journal of Clinical & Laboratory Research (enviado para su
publicación en 1997); Correale et al. (1997), Journal of the
National Cancer Institute 89, página 293. Verdaderamente, estos
antígenos se expresan en una amplia gama de tipos de tumores tales
como melanoma, carcinoma de pulmón, sarcoma y carcinoma de vejiga
urinaria.
Los antígenos MAGE para su uso en la presente
invención se podrían expresar como una proteína de fusión con un
potenciador de la expresión o una molécula inmunológica asociada en
la fusión. En particular, la proteína Mage se podría fusionar con
la Proteína D de Haemophilus influenzae B. En particular, la
molécula asociada en la fusión podría comprender el primer tercio
de la Proteína D. Estas construcciones se revelan en el documento
WO 99/40188. Otros ejemplos de proteínas de fusión que podrían
contener epítopos específicos de cáncer incluyen las proteínas de
fusión bcr/abl.
En una forma de realización preferida, se
utilizan antígenos de próstata, tal como el antígeno específico de
próstata (PSA), PAP, PSCA (PNAS 95(4)
1735-1740 1998), PSMA o el antígeno conocido como
prostasa.
La prostasa es una
serin-proteasa específica de próstata (similar a
tripsina), de 254 aminoácidos de longitud, con una triada
catalítica H-D-S de
serin-proteasas conservada y una secuencia
pre-propéptido amino-terminal, lo
que indica una función secretoria potencial (P. Nelson, Lu Gan, C.
Ferguson, P. Moss, R. Gelinas, L. Hood y K. Wand, "Molecular
cloning and characterisation of prostase, an
androgen-regulated serine protease with prostate
restricted expressión", en Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:
3114-3119 (1999)). Se ha descrito un posible sitio
de glicosilación. La estructura predicha es muy similar a la de
otras serin-proteasas conocidas y muestra que el
polipéptido maduro se pliega en un único dominio. La proteína madura
tiene una longitud de 224 aminoácidos y tiene un epítopo A2 que se
ha mostrado que se procesa de forma natural.
La secuencia de nucleótidos de la prostasa y la
secuencia polipéptidica deducida y sus homólogos se revelan en
Ferguson et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:
3114-3119, 1999) y en las solicitudes de patente
internacionales nº WO 98/12302 (y también en la patente otorgada
correspondiente US 5.955.306), WO 98/20117 (y también en las
patentes otorgadas correspondientes US 5.840.871 y US 5.786.148)
(kalicreina específica de próstata) y WO 00/04149 (P703P).
La presente invención proporciona antígenos que
comprenden proteínas de fusión de prostasa basadas en la proteína
prostasa y en fragmentos y homólogos de la misma ("derivados").
Estos derivados son adecuados para su uso en formulaciones de
vacunas terapéuticas que son adecuadas para el tratamiento de
tumores de próstata. Normalmente, el fragmento contendrá al menos
20, preferentemente 50, más preferentemente 100, aminoácidos
contiguos como se reveló en las patentes y solicitudes de patentes
a las que se ha hecho referencia anteriormente.
Un antígeno de próstata adicional preferido se
conoce como P501S, secuencia ID nº 113 del documento WO 98/37814.
Los fragmentos y porciones inmunogénicos codificados por el gen del
mismo comprende al menos 20, preferentemente 50, más
preferentemente 100, aminoácidos contiguos como se reveló en las
patentes y solicitudes de patentes a las que se ha hecho referencia
anteriormente. Un fragmento particular es PS108 (documento WO
98/50567).
Otros antígenos específicos de próstata se
conocen por los documentos WO 98/37418 y WO 00/4149. Otro es STEAP
(PNAs 96: 14523-14528, 7-12,
1999).
Otros antígenos asociados a tumores útiles en el
contexto de la presente invención incluyen: Plu-1
(J. Biol. Chem. 274 (22): 15633-15645, 1999),
HASH-1, HasH-2, Cripto (Salomon
et al., Bioessays 21: 61-70, 1999, patente
de EE.UU. 56654140), Criptina (patente de EE.UU. 5.981.215.
Adicionalmente, los antígenos particularmente relevantes para
vacunas en la terapia del cáncer comprenden también a la tirosinasa
y a la survivina.
La presente invención es útil también en
combinación con antígenos de cáncer de mama tales como
Muc-1, Muc-2, EpCAM, her 2/Neu,
mamaglobina (patente de EE.UU. 5668267) o los revelados en los
documentos WO 00/52165, WO 99/33869, WO 99/19479, WO 98/45328. Los
antígenos Her-2 neu se revelaron, entre otros, en la
patente de EE.UU. 5.801.005. Preferentemente Her 2 neu comprende el
domino extracelular completo (que comprende aproximadamente los
aminoácidos 1-645) o fragmentos del mismo y, al
menos, una porción inmunogénica, o el dominio intracelular
completo, de aproximadamente los 580 aminoácidos
C-terminales. En particular, la porción intracelular
debería comprender el dominio de fosforilación o fragmentos del
mismo. Estas construcciones se revelan en el documento WO 00/44899.
Una construcción particularmente preferida se conoce como ECD PD,
una segunda se conoce como ECD \BoxPD (Veáse el documento WO
00/44899).
El antígeno her 2 neu, como se utiliza en esta
memoria descriptiva, se pueden derivar de rata, ratón o humano.
La vacuna podría contener también antígenos
asociados como los mecanismos de soporte de tumores (por ejemplo,
angiogénesis, invasión tumoral) por ejemplo tie 2, VEGF.
Las vacunas de la presente invención se podrían
usar también para la profilaxis o la terapia de trastornos
crónicos, además de alergia, cáncer o enfermedades infecciosas.
Estos trastornos crónicos son enfermedades tales como asma,
aterosclerosis y enfermedad de Alzheimer, y otros trastornos
autoinmunes. Se podrían considerar también las vacunas para su uso
como contraceptivos.
Los antígenos relevantes para la profilaxis y la
terapia de pacientes susceptibles de sufrir, o que sufren, la
enfermedad neurodegenerativa de Alzheimer son, en particular, el
fragmento de los 39-43 aminoácidos
N-terminales de la proteína precursora amiloide
(AB) o fragmentos más pequeños de la misma. Este antígeno se revela
en la solicitud de patente internacional nº WO 99/27944 (Athena
Neurosciences).
\newpage
Los antígenos propios potenciales que se podrían
incluir como vacunas para trastornos autoinmunes o como vacuna
contraceptiva incluyen: citocinas, hormonas, factores de crecimiento
o proteínas extracelulares, más preferentemente una citocina que
contiene 4 hélices alfa en su estructura, más preferentemente IL13.
Las citocinas incluyen, por ejemplo, IL1, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6,
IL7, IL8, IL9, IL10, IL11, IL12, IL13, IL14, IL15, IL16, IL17,
IL18, IL20, IL21, TNF, TGF, GMCSF, MCSF y OSM. Las citocinas que
contienen 4 hélices alfa en su estructura incluyen IL2, IL3, IL4,
IL5, IL13; GMCSF y MCSF. Entre las hormonas se incluyen, por
ejemplo, hormona luteinizante (LH), hormona estimuladora del
folículo (FSH), gonadotropina coriónica (CG), VGF, ghrelina, agouti,
proteína relacionada con agouti y neuropéptido Y. Los factores de
crecimiento incluyen, por ejemplo, VEGF.
Las vacunas de la presente invención son
particularmente adecuadas para el tratamiento inmunoterapéutico de
enfermedades, tales como las afecciones crónicas y los cánceres,
pero también para la terapia de infecciones persistentes. De
acuerdo con esto, las vacunas de la presente invención son
particularmente adecuadas para la inmunoterapia de enfermedades
infecciosas tales como tuberculosis (TB), infecciones por VIH tales
como SIDA e infecciones por el virus de la Hepatitis B (HepB).
En una forma de realización particularmente
preferida, el ácido nucleico codifica uno o más de los antígenos
siguientes:
- \quad
- VHB- PreS1, PreS2 y las proteínas env de superficie, core y pol.
- \quad
- VIH- gp120, gp40, gp160, p24, gag, pol, env, vif, vpr, vpu, tat, rev, nef.
- \quad
- Papiloma - E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7, E8, L1, L2.
- \quad
- VHS - gL, gH, gM, gB, gC, gK, gE, gD, ICP47, ICP36, ICP4.
- \quad
- Gripe - Hemaglutinina, nucleoproteína.
- \quad
- TB - superóxido dismutasa micobacteriana, 85A, 85B, MPT44, MPT59, MPT45, HSP10, HSP65, HSP70, HSP90, Antígeno PPD de 19 kDa, antígeno PPD de 38 kDa.
La secuencia de nucleótidos podría ser de ARN o
de ADN e incluye ADN genómico, ADN sintético o ADNc.
Preferentemente, la secuencia de nucleótidos es una secuencia de
ADN y, más preferentemente, una secuencia de ADNc. Con el fin de
obtener expresión del péptido antigénico en células de mamífero, es
necesario que la secuencia de nucleótidos que codifica el péptido
antigénico esté en un sistema vector apropiado. Por "vector
apropiado", como se utiliza en esta memoria descriptiva, se
entiende cualquier vector que permita que el péptido antigénico se
exprese en un mamífero en una cantidad suficiente para generar una
respuesta inmune.
Por ejemplo, el vector seleccionado podría
comprender un plásmido, promotor y secuencia de terminación
transcripcional/poliadenilación dispuesta en el orden correcto para
obtener expresión de los péptidos antigénicos. La construcción de
vectores que incluyan estos componentes y, opcionalmente, otros
componentes tales como potenciadores, sitios específicos de enzimas
de restricción y genes de selección, tales como genes de resistencia
a antibióticos, es muy conocida por los expertos en la técnica y se
explica en detalle en Maniatis et al. "Molecular Cloning: A
Laboratory Manual", Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring
Harbour Press, Vol. 1-3, 2ª edición, 1989.
Como se prefiere, para evitar la replicación de
los plásmidos en el huésped mamífero y la integración en el ADN
cromosómico del animal, el plásmido se generará preferiblemente sin
un origen de replicación que sea funcional en células
eucariotas.
Los procedimientos y las composiciones según la
presente invención se pueden usar para procedimientos profilácticos
o de tratamiento de todos los animales que incluyen, por ejemplo,
animales domésticos, animales de laboratorio, animales de granja,
animales salvajes en cautividad y, más preferentemente, a seres
humanos.
Los presentes inventores han demostrado que los
derivados de las
1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-aminas,
cuando se usan como adyuvantes en la vacunación por ADN, son
capaces de aumentar los perfiles de citocinas Th1 y Th2. Con el
término adyuvante o componente adyuvante, como se usa en esta
memoria descriptiva, se pretende indicar que los derivados o
componentes que comprenden a los derivados actúan para aumentar y/o
alterar la respuesta del organismo a un inmunógeno en una forma
deseada. Así, por ejemplo, un adyuvante se podría utilizar para
desviar una respuesta inmune hacia una respuesta predominantemente
Th1, o para aumentar ambos tipos de respuesta.
Un inductor preferente de una respuesta inmune
de tipo TH1 capacita la generación de una respuesta mediada por
células. Los niveles altos de citocinas de tipo Th1 tienden a
favorecer la inducción de respuestas inmunes mediadas por células
para un antígeno determinado, mientras que altos niveles de
citocinas de tipo Th2 tiende a favorecer la inducción de respuestas
inmunes humorales frente al antígeno.
Es importante recordar que la distinción de
respuestas inmunes de tipos Th1 y Th2 no es absoluta. En realizad,
un individuo generará una respuesta inmune que se describe como que
es predominantemente Th1 o predominantemente Th2. Sin embargo, a
menudo es conveniente considerar a las familias de citocinas en
términos de lo descrito en clones de células T CD4+ ve de ratón por
Mosmann y Coffman (Mosmann, T.R. and Coffman, R.L. (1989) TH1 and
TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to
different functional properties. Annual Review of Immunology 7, p
145-173). Tradicionalmente, las respuestas de tipo
Th1 se asocian con la producción de las citocinas
IFN-\gamma e IL-2 por los
linfocitos T. Otras citocinas, a menudo directamente asociadas con
la inducción de respuestas inmunes de tipo Th1, no son producidas
por las células T, tales como IL-12. En contraste
con esto, las respuestas de tipo Th2 se asocian con la secreción de
IL-4, IL-5, IL-6,
IL-10.
El componente inmunogénico que comprende un
vector que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica un
péptido antigénico, se puede administrar de distintas formas. Es
posible que el vector se administre en una forma desnuda (esto es,
como una secuencia desnuda de nucleótidos sin estar asociado con
formulaciones liposomales, con vectores virales o proteínas
facilitadoras de la transfección) resuspendida en un medio
apropiado, por ejemplo una disolución salina tamponada tal como PBS
y, posteriormente, inyectada de forma intramuscular, subcutánea,
intraperitoneal o intravenosa, aunque algunos datos anteriores
sugiere que es preferible la inyección intramuscular o subcutánea
(Brohm et al., Vaccine 16, no. 9/10 pp
949-954 (1998), la revelación de la cual se incluye
en esta memoria descriptiva en su totalidad por referencia).
Adicionalmente, es posible que los vectores se encapsulen mediante,
por ejemplo, liposomas o en el interior de partículas de polilactida
co-glicolida (PLG) (25) para la administración
mediante las vías oral, nasal o pulmonar, además de por las vías
detalladas anteriormente.
También es posible, según una forma de
realización de la invención preferida, la administración
intradérmica del componente inmunogénico, preferentemente mediante
el uso de técnicas de administración mediante una pistola de genes
(particularmente bombardeo de partículas). Tales técnicas podrían
implicar el revestimiento de esferas de oro con el componente
inmunogénico que, posteriormente, se administran en la epidermis
bajo alta presión, tal como se describe, por ejemplo, en Haynes
et al., J. Biotechnology 44: 37-42
(1996).
Los vectores que comprenden las secuencias de
nucleótidos que codifican péptidos antigénicos se administran en
una cantidad que sea efectiva profiláctica o terapéuticamente. La
cantidad que se administra, está generalmente en el intervalo de un
picogramo a 1 miligramo, preferentemente 1 picogramo a 10
microgramos por administración mediada por partículas, y de 10
microgramos a 1 miligramo para otras vías de nucleótido por dosis.
La cantidad exacta podría variar considerablemente dependiendo de
la especie y del peso del mamífero que se está inmunizado, de la
vía de administración, de la potencia y de la dosis del derivado de
1H-imidazo[4,5-c]quinolina,
de la naturaleza del estado de enfermedad que se está tratando o
contra el que se está protegiendo, de la capacidad del sistema
inmune del individuo para producir una respuesta inmune y del grado
de protección o de eficacia terapéutica deseado. Basándose en estas
variables, un profesional médico o veterinario será capaz de
determinar fácilmente el nivel de dosificación apropiado.
Es posible la administración del componente
inmunogénico, que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica
el péptido antigénico, en un régimen de una vez o la administración
de forma repetida, por ejemplo, entre 1 y 7 veces, preferentemente
entre 1 y 4 veces, a intervalos entre aproximadamente 1 día y
aproximadamente 18 meses. Una vez más, sin embargo, este régimen de
tratamiento variará significativamente dependiendo del tamaño y de
la especie animal implicada, de la enfermedad que se está tratando o
contra la que se está protegiendo, de la cantidad de secuencia de
nucleótidos administrada, de la vía de administración, de la
potencia y de la dosis de los derivados de
1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina
seleccionados y de otros factores que serán evidentes para el
profesional veterinario o médico.
El componente adyuvante especificado en esta
memoria descriptiva se puede administrar de forma similar mediante
distintas vías de administración, tales como por ejemplo, mediante
las vías oral, nasal, pulmonar, intramuscular, subcutánea,
intradérmica o tópica. Preferentemente, el componente se administra
mediante las vías intradérmica o tópica. Esta administración podría
tener lugar entre aproximadamente 14 días antes y aproximadamente 14
después de la administración de la secuencia de nucleótidos,
preferentemente entre aproximadamente 1 día antes y aproximadamente
3 días después de la administración de la secuencia de nucleótidos.
Lo más preferido es cuando el componente adyuvante se administra de
forma sustancialmente simultánea a la administración de la
secuencia de nucleótidos. Por "de forma sustancialmente
simultánea" se quiere indicar que la administración del
componente adyuvante es preferentemente al mismo tiempo que la
administración de la secuencia de nucleótidos, o si no, al menos en
el intervalo de una pocas horas antes y después de la administración
de la secuencia de nucleótidos. En el protocolo de tratamiento más
preferido, el componente adyuvante se administrará de forma
sustancialmente simultánea a la administración de la secuencia de
nucleótidos. Obviamente, este protocolo puede variar según sea
necesario, de acuerdo con el tipo de variables a las que se ha hecho
referencia anteriormente.
De nuevo otra vez, dependiendo de estas
variables variará también la dosis de administración del derivado,
pero podría, por ejemplo, oscilar entre aproximadamente 0,1 mg por
kg y aproximadamente 100 mg por kg, refiriéndose "por kg" al
peso corporal del mamífero implicado. Esta administración del
derivado de
1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-aminas
se podría repetir, preferentemente, con cada administración
posterior, o de refuerzo, de la secuencia de nucleótidos. Lo más
preferible, es que la dosis de administración esté entre
aproximadamente 1 mg por kg y aproximadamente 50 mg por kg.
Aunque es posible que el componente adyuvante
comprenda únicamente el derivado de
1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina
para su administración en el estado químico bruto, es preferible
que la administración sea en forma de una formulación farmacéutica.
Esto es, el componente adyuvante comprenderá, preferentemente, la
1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina
combinada con uno o más vehículos farmacéutica o veterinariamente
aceptables y, opcionalmente, con otros ingredientes terapéuticos.
El vehículo, o vehículos, deben ser "aceptable" en el sentido
de que sea compatible con otros ingredientes dentro de la
formulación, y no perjudicial para el receptor de la misma. La
naturaleza de las formulaciones variará, naturalmente, según la vía
de administración pretendida, y éstas se podrían preparar por
procedimientos muy conocidos en la técnica farmacéutica. Todos los
procedimientos incluyen la etapa de poner en asociación al derivado
de
1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina
con un vehículo, o vehículos, apropiado. En general, las
formulaciones se preparan poniendo en asociación uniforme e
íntimamente al derivado con vehículos líquidos o con vehículos
sólidos finamente divididos, o con ambos, y posteriormente, si es
necesario, conformar el producto en la formulación deseada. Las
formulaciones de la presente invención, adecuadas para la
administración oral, se podrían presentar como unidades discretas
tales como cápsulas, sellos o comprimidos, que contienen cada uno
de ellos una cantidad predeterminada del ingrediente activo; como un
polvo o gránulos; como una disolución o una suspensión en un
líquido acuoso o no acuoso; o como una emulsión líquida de aceite en
agua o de agua en aceite. El ingrediente activo se podría presentar
también como un bolo, electuario o pasta.
Un comprimido se podría fabricar por compresión
o moldeo, opcionalmente con uno o más ingredientes accesorios. Los
comprimidos se podrían preparar comprimiendo el ingrediente activo
en una máquina adecuada en una forma de libre movimiento tal como
un polvo o gránulos, mezclado opcionalmente con un agente
aglutinante, lubricante, diluyente inerte, lubricador, tensioactivo
o de dispersión. Los comprimidos moldeados se podrían generar
moldeando una mezcla del compuesto en polvo humedecido con un
diluyente líquido inerte en una máquina adecuada.
Los comprimidos se podrían recubrir o marcar
opcionalmente y se podrían formular de forma que proporcionasen una
liberación lenta o controlada del ingrediente activo.
Las formulaciones para inyección mediante las
vías de administración, por ejemplo intramuscular, intraperitoneal
o subcutánea, incluyen disoluciones para inyección estériles acuosas
y no-acuosas que podrían contener antioxidantes,
tampones, bacterioestáticos y solutos que harían que la formulación
fuera isotónica con la sangre del receptor pretendido; y
suspensiones estériles acuosas y no acuosas que podrían incluir
agentes de resuspensión y agentes espesantes. Las formulaciones se
podrían presentar en recipientes de dosis unitaria o de múltiples
dosis, por ejemplo ampollas y viales sellados, y se podrían
almacenar en condiciones de congelación-secado
(liofilizadas) que sólo requieren la adición de un vehículo líquido
estéril, por ejemplo agua para inyecciones, inmediatamente antes
del uso. Las disoluciones y suspensiones para inyección
extemporáneas se podrían preparan a partir de polvos, gránulos y
comprimidos estériles del tipo previamente descrito. Las
formulaciones adecuadas para la administración pulmonar vía la
cavidad bucal o nasal se presentan de forma que las partículas que
contienen el ingrediente activo, que tienen deseablemente un
diámetro en el intervalo de 0,5 a 7 micrómetros, se administren en
el árbol bronquial del receptor. Son posibilidades para
formulaciones de este tipo que estén en forma de polvos finamente
divididos, que se podrían presentar de forma conveniente en una
cápsula que se pueda perforar, adecuadamente por ejemplo de
gelatina, para su uso en un dispositivo de inhalación, o
alternativamente, como una formulación autopropulsada que comprende
el ingrediente activo, un propelente líquido adecuado y,
opcionalmente, otros ingredientes tales como un tensioactivo y/o un
diluyente sólido. Se podrían emplear también formulaciones
autopropulsadas en las que el ingrediente activo se distribuye en
forma de gotitas de una disolución o suspensión. Estas
formulaciones autopropulsadas son análogas a las conocidas en la
técnica y se podrían preparar por procedimientos establecidos. Se
podrían administrar, de forma adecuada, con una válvula, operable de
forma manual o que funcione de forma automática, que tenga las
características deseadas de pulverización; de forma ventajosa, la
válvula es de un tipo medidor que administre un volumen fijo, por
ejemplo de 50 a 100 \mul, tras cada accionamiento del mismo.
En una posibilidad adicional, el componente
adyuvante podría estar en forma de una disolución para uso en un
atomizador o un nebulizador en el que se emplea una corriente de
aire acelerada o agitación ultrasónica para producir un suministro
de una niebla de gotitas para inhalación.
Las formulaciones adecuadas para la
administración intranasal incluyen, generalmente, presentaciones
similares a las descritas anteriormente para la administración
pulmonar, aunque se prefiere que estas formulaciones tengan un
diámetro de partícula en el intervalo de aproximadamente 10 a
aproximadamente 200 micrómetros, para permitir la retención en la
cavidad nasal. Esto se podría lograr mediante el uso, según sea
apropiado, de un polvo de un tamaño de partícula adecuado, o la
elección de una válvula apropiada. Otras formulaciones adecuadas
incluyen polvos gruesos, que tiene un tamaño de partícula en el
intervalo de aproximadamente 20 a aproximadamente 500 micrómetros,
para la administración por inhalación rápida a través del pasaje
nasal a partir de un recipiente mantenido cerca de la nariz, y
gotas nasales que comprenden aproximadamente del 0,2 al 5% peso/peso
del ingrediente activo en disoluciones acuosas o aceitosas. En una
forma de realización de la invención, es posible que el vector, que
comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el péptido
antigénico, se administre en la misma formulación que el derivado
de
1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina.
Por lo tanto en esta forma de realización, el
componente inmunogénico y el adyuvante se encuentran en la misma
formulación.
En una forma de realización preferida, el
componente adyuvante se prepara en una forma adecuada para la
administración con una pistola de genes, y se administra mediante
esta ruta de forma sustancialmente simultánea a la administración
de la secuencia de nucleótidos. Para la preparación de formulaciones
adecuadas para el uso de esta forma, podría ser necesario que el
derivado de
1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina
este liofilizado y adherido sobre, por ejemplo, esferas de oro que
son adecuadas para la administración por pistola de genes.
En una forma de realización alternativa, el
componente adyuvante se podría administrar como un polvo seco
mediante propulsión de gas a alta presión. Esto sería,
preferentemente, de forma sustancialmente simultánea a la
administración de la secuencia de nucleótidos.
Incluso si no se formulan juntos, sería
apropiado que el componente adyuvante se administrara en el mismo
sitio de administración que la secuencia de nucleótidos, o en uno
aproximado.
Otros detalles de las preparaciones
farmacéuticas se pueden encontrar en "Remington's Pharmaceutical
Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1985)",
cuya revelación se incluye en esta memoria descriptiva por medio de
referencia.
La presente invención se describirá
adicionalmente ahora en referencia a los siguientes ejemplos no
limitantes:
Los plasmidos usados se basan en el vector
pVAC1, obtenido de Michelle Young, GlaxoWellcome, RU, una
modificación del vector de expresión en mamíferos, pCI (Promega),
en el que la región con múltiples sitios para clonaje, entre los
sitios EcoRI y Bst ZI, se ha reemplazado por la secuencia IRES de
EMCV flanqueada en el extremo 5' por sitios únicos para las enzimas
de restricción Nhe I, Rsr II y Xho I y en el 3' por sitios únicos
Pac I, Asc I y Not I.
Se construyó un plásmido de expresión de la
nucleoproteína del virus de la gripe, pVAC1.PR, por ligamiento de
un ADNc amplificado por PCR, que codifica la nucleoproteína del
virus de la gripe A de la cepa PR/8/34, a partir de pAR501 (donado
por el Dr. D. Kiossis, NIMR, Londres, R.U.), en el vector de
expresión pVAC1.
El plásmido de ADN se propagó en E. coli
y se preparó usando kits de purificación de plásmidos (Quiagen Ltd,
Crawley, R.U.) y se almacenó a -20ºC, a una concentración de
aproximadamente 1 mg de ADN de plásmido/ml en tampón 10 mM
Tris/EDTA.
La preparación de los cartuchos para el
dispositivo de transferencia de genes Accell se realizó como se
describió previamente (Eisenbraun et al., DNA and Cell
Biology, 1993, vol 12, nº 9, pp. 791-797; Pertner
et al.). Brevemente, se recubrieron partículas de oro de 2
\mum (DeGussa Corp., South Plainfield, N.J. EE.UU.) con el ADN
del plásmido y se cargaron en un tubo Tefzel, que posteriormente se
cortó en fragmentos de 1,27 cm de longitud para su utilización como
cartuchos y se almacenaron desecados a 4ºC hasta su uso. En una
vacunación típica, cada cartucho contenía 0,5 mg de oro recubierto
con 0,05 \mug de pVAC1.PR, añadiéndose el vector vacío (pVAC1)
para proporcionar un total de 0,5 \mug ADN/cartucho.
Para examinar si imiquimod podría aumentar la
respuesta de células T citotóxicas generadas mediante la vacunación
por un ácido nucleico, pVAC1.PR se administró mediante transferencia
de genes mediada por partículas (0,05 \mug/cartucho) en la piel
de ratones. El plásmido se administró en un sitio diana afeitado de
la piel abdominal de ratones C57Bl/6 (adquiridos de Charles River
United Kingdom Ltd, Margate, R.U.) mediante dos cartuchos, usando
un dispositivo de transferencia de genes Accell a 225 kg/2,5
cm^{2} (500 lb/in2) (McCabe, documento WO 95/19799).
Inmediatamente después de la vacunación, se administró imiquimod
(preparado como una suspensión en un vehículo que comprendía 0,3%
(p/v) de metilcelulosa y 0,1% (v/v) de Tween en agua estéril)
mediante una única inyección subcutánea (0,05 ml/10 g de peso
corporal, formulada para proporcionar una dosis de 30 mg/kg) en el
sitio de inmunización. Los controles de plásmido y de imiquimod
fueron el vector vacío (pVAC1) y el vehículo, respectivamente.
La respuesta de células T citotóxicas se
determinó mediante un ensayo ELISPOT de IFN-\gamma
restringido a células T CD8+ de esplenocitos obtenidos una semana
más tarde. Los ratones se sacrificaron por dislocación cervical y
los bazos se recogieron en PBS enfriado en hielo. Los esplenocitos
se disgregaron en disolución salina tamponada con fosfato (PBS)
seguido por lisis de los hematíes (1 min en tampón constituido por
155 mM NH_{4}Cl, 10 mM KHCO_{3}, 0,1 mM EDTA). Después de dos
lavados en PBS para eliminar el material en partículas, se hicieron
alícuotas de la suspensión de células aisladas en placas ELISPOT
previamente recubiertas con un anticuerpo para capturar
IFN-\gamma y se estimularon con un péptido
reconocido por células T CD8+. Después de cultivo durante toda la
noche, las células productoras de IFN-\gamma se
visualizaron por la aplicación de un anticuerpo
anti-IFN-\gamma de ratón marcado
con biotina (Pharmingen) seguido por fosfatasa alcalina conjugada
con estreptavidina y se cuantificó usando un análisis de imagen.
\newpage
Los resultados de este experimento (Figura 1)
muestran que el número de células T citotóxicas en los bazos de los
ratones tratados con la combinación de pVAC1.PR e imiquimod fue 3
veces superior que con pVAC1.PR más vehículo únicamente. No se
observó diferencia entre los grupos con plásmido control (pVAC1) más
imiquimod o con vehículo, lo que indicó que el efecto de imiquimod
se restringía al antígeno. Estos resultados muestran claramente que
imiquimod es un potente adyuvante para la vacunación por un ácido
nucleico.
\vskip1.000000\baselineskip
Se construyó un plásmido de expresión de
ovoalbúmina de pollo, pVAC1.OVA, por ligamiento de un ADNc
amplificado por PCR, que codificaba ovoalbúmina de pollo, a partir
de pUGOVA (donado por el Dr. F. Carbone), en el vector de expresión
pVAC1, y se prepararon cartuchos (como se describió en el ejemplo 1
anterior).
Ratones transgénicos D0.11.10 machos y hembras
(6-10 semanas de edad) se cruzaron en las
instalaciones específicas de apareamiento animal libres de
patógenos de los inventores en Bury Green Farm. El transgen que
expresan estos ratones es el receptor de la célula T (TCR)
específico de un péptido de ovoalbúmina de pollo (residuos
323-339; péptido OVA) unido a la molécula
MHC-II (I-A^{d}). El anticuerpo
monoclonal KJ1-26, que reconoce específicamente
este TCR, se utilizó para la identificación de las células T que
expresan el TCR transgénico. El examen de numerosos ratones de este
tipo mostró que una gran proporción (40-65%) de las
células T CD4+ eran KJ1-26+, aunque también estaba
presente una proporción muy pequeña de células T CD4^{-} CD8^{+}
KJ1.26+ (Pape et al., Immunological Reviews (1997) 156:
67-78).
Los ratones Balb/c se adquirieron de Charles
River Unitd Kingdom Ltd. (Margale, R.U.).
Las respuestas de células T CD4+ se examinaron
utilizando un modelo de transferencia adoptiva, que aumenta la
sensibilidad de los parámetros inmunes que se quieren medir. Aquí,
las células T que reconocen específicamente la secuencia del
péptido de la proteína ovoalbúmina, se transfirieron adoptivamente,
a partir de un transgénico, a ratones no inmunizados de tipo
salvaje, antes de la inmunización. Brevemente, 24 horas antes de la
inmunización, los esplenocitos D0.11.10 se transfirieron
adoptivamente a ratones Balb/c de 6-8 semanas de
edad. Los esplenocitos se prepararon como en el ejemplo 1 anterior.
Posteriormente, las células se transfirieron adoptivamente en la
vena lateral de la cola mediante inyección de 100 \mul (esto es,
25 x 10^{6} esplenocitos/ratón).
Los ratones se inmunizaron posteriormente
mediante transferencia de genes mediada por partículas con un
plásmido que codifica ovoalbúmina (pVAC1.OVA; 0,5 \mug/cartucho)
e imiquimod (30 mg/kg), o con los controles de plásmido o vehículo,
como en el ejemplo 1.
Los ratones se sacrificaron por dislocación
cervical y los nódulos linfáticos inguinales y periaórticos se
extrajeron y se prepararon como los esplenocitos (descrito en el
ejemplo 1), excepto que se omitió la etapa de lisis de
hematíes.
Para medir la expansión clonal de las células T
CD4+ después de la inmunización, se analizó la proliferación de
células T específicas de ovoalbúmina después de una nueva
estimulación in vitro con el péptido de ovoalbúmina
reconocido por ellas en preparaciones de nódulos linfáticos
extraídos 3 días después de la inmunización. La proliferación,
determinada mediante la incorporación de timidina tritiada por las
células en proliferación, fue dos veces superior con la combinación
de pVAC1.OVA más imiquimod, en comparación con pVAC1.OVA más
vehículo (Figura 2). No se observó diferencia entre los grupos de
plásmido control (pVAC1) más imiquimod o de vehículo, lo que indica
que el efecto de imiquimod se restringía al antígeno.
Se encontró un aumento sustancial en la
activación de células T CD4, determinada mediante un ELISPOT de
IL-2 (ejemplo 1 anterior), en células de nódulos
linfáticos extraídos 6 días después de la inmunización (Figura 3)
por la combinación de pVAC1.OVA más imiquimod, en comparación con
pVAC1.OVA solo (aumento del 70%).
Estos resultados muestran que el efecto
adyuvante de imiquimod in vivo se extiende a las dos
poblaciones de células T (esto es, citotóxica CD8+ y de ayuda
CD4+). También confirman la potencia del efecto adyuvante de
imiquimod en la vacunación por un ácido nucleico.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinaron las poblaciones CD4+ usando el
modelo de transferencia adoptiva (ejemplo 2 anterior). Las células
productoras de IFN-\gamma (Th1) y productoras de
IL-4 (Th2) se analizaron mediante ELISPOT (ejemplo
1 anterior). Imiquimod induce un aumento en los dos tipos de células
productoras de citocinas, aunque el aumento fue más sustancial para
las células productoras de IFN-\gamma, en
comparación con las productoras de IL-4 (Figura 4).
No se detectaron células productoras de citocinas en los controles
inmunizados con el vector vacío. El sesgo hacia las células
productoras de IFN-\gamma indica que imiquimod no
sólo actúa como un adyuvante para la vacunación por un ácido
nucleico sino que induce de forma preferente un tipo Th1 de
respuesta, siendo esto sustanciado por el ejemplo 1 anterior.
\vskip1.000000\baselineskip
Para examinar si imiquimod aumenta la respuesta
humoral generada por la vacunación por un ácido nucleico, se
administró un plásmido que codifica un antígeno (por ejemplo,
nucleoproteína del virus de la gripe) mediante PMGT en la piel del
ratón. Una inmunización primaria se siguió de una o más
inmunizaciones de refuerzo con, al menos 4 semanas entre cada
inmunización. Antes y/o inmediatamente después de cada inmunización,
se administró imiquimod mediante una única inyección subcutánea en
el sitio de inmunización. Los controles de plásmido e imiquimod son
el vector vacío (esto es, sin antígeno) y el vehículo,
respectivamente. Se extrajeron muestras de sangre de la vena de la
cola de 1 a 3 días antes de la inmunización, y a intervalos después
de ella. El suero se separó y se almacenó a -20ºC para un análisis
de anticuerpos posterior.
La respuesta humoral se determinó midiendo los
niveles de anticuerpo IgG totales específicos del antígeno (por
ejemplo, nucleoproteína del virus de la gripe) en las muestras de
suero recogidas después de la inmunización primaria y de las de
refuerzo. Placas de ensayo (Nunc Immunoplate F96 maxisorp, Life
Technologies) se recubrieron con 10 \mug/ml de antígeno mediante
incubación durante toda la noche a 4ºC y su lavado 4 veces con
tampón de lavado (PBS que contenía 5% de Tween 20 y 0,1% de azida
sódica). Esto se siguió con una incubación de 1 hora a 20ºC con las
muestras de suero diluidas de forma seriada en tampón de bloqueo.
Después de 4 lavados adicionales (como antes) para eliminar el
anticuerpo no unido, las placas se incubaron durante 1 hora con un
anticuerpo anti-IgG de ratón conjugado con
peroxidasa (Southern Biotechnology) diluido en tampón de bloqueo).
La cantidad de anticuerpo unido se determinó después de 4 lavados
adicionales (como antes) seguidos por la adición de la disolución
sustrato TMB (T-8540-Sigma). Después
de 30 minutos a 20ºC protegida de la luz, la reacción se paró con 1
M ácido sulfúrico y la absorbancia se leyó a 450 nm. Los títulos se
definieron como la dilución mayor para alcanzar una OD de 0,2. Un
aumento en los niveles de anticuerpo en los ratones inmunizados
tratados con imiquimod sobre los inmunizados sin imiquimod indicó un
efecto de aumento de la respuesta humoral por imiquimod.
\vskip1.000000\baselineskip
Se construyó un plásmido que expresaba los
antígenos Gag y Nef (esto es, WRG7077Gag/Nef) basado en
WRG7077. El plásmido WRG7077 original se construyó reemplazando el gen de la beta-lactamasa, que contenía el fragmento Eam1105I-PstI de pUC19 (disponible en Amersham Pharmacia Biotech UK Ltd., Amersham Place, Little Chalfont, Bucks, HP7 9NA), con un fragmento EcoRI de pUC4K (Amersham-Pharmacia) que contenía el gen de resistencia a kanamicina, haciendo romos a continuación los dos fragmentos usando la ADN polimerasa de T4. El promotor/potenciador IE1 del citomegalovirus humano, intrón A, se derivó del plásmido JW4303, obtenido del Dr. Harriet Robinson, University of Massachussets, y se insertó en el sitio Sal 1 de pUC19 como un fragmento XhoI-SalI, incorporando la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovino. La fusión Gag-Nef se generó mediante PCR uniendo un gen Nef truncado, con una deleción de 195 pb en el extremo 5' del gen que elimina los 65 primeros aminoácidos, derivado de la cepa de VIH-1 248A (nº de acceso a Genbank L15518, una amable donación de G. Thompson), y p17p24 (Gag) a partir del plásmido pHXB\DeltaPr (Maschera et al., 1995) que contenía el genotipo de VIH-1 de la cepa B HXB2 (nº de acceso a Genbank K03455). La fusión Gag-Nef resultante se ligó posteriormente en WRG7077 como un fragmento NotI-BamHI. La preparación del ADN del plásmido y del cartucho fue como se describió en el ejemplo 1.
WRG7077. El plásmido WRG7077 original se construyó reemplazando el gen de la beta-lactamasa, que contenía el fragmento Eam1105I-PstI de pUC19 (disponible en Amersham Pharmacia Biotech UK Ltd., Amersham Place, Little Chalfont, Bucks, HP7 9NA), con un fragmento EcoRI de pUC4K (Amersham-Pharmacia) que contenía el gen de resistencia a kanamicina, haciendo romos a continuación los dos fragmentos usando la ADN polimerasa de T4. El promotor/potenciador IE1 del citomegalovirus humano, intrón A, se derivó del plásmido JW4303, obtenido del Dr. Harriet Robinson, University of Massachussets, y se insertó en el sitio Sal 1 de pUC19 como un fragmento XhoI-SalI, incorporando la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovino. La fusión Gag-Nef se generó mediante PCR uniendo un gen Nef truncado, con una deleción de 195 pb en el extremo 5' del gen que elimina los 65 primeros aminoácidos, derivado de la cepa de VIH-1 248A (nº de acceso a Genbank L15518, una amable donación de G. Thompson), y p17p24 (Gag) a partir del plásmido pHXB\DeltaPr (Maschera et al., 1995) que contenía el genotipo de VIH-1 de la cepa B HXB2 (nº de acceso a Genbank K03455). La fusión Gag-Nef resultante se ligó posteriormente en WRG7077 como un fragmento NotI-BamHI. La preparación del ADN del plásmido y del cartucho fue como se describió en el ejemplo 1.
Se inmunizaron ratones Balb/c y se preparó y
administró imiquimod como se describió en el ejemplo 1. Aquí, los
ratones recibieron una inmunización primaria seguida por una
inmunización de refuerzo 42 días después. Se administró imiquimod
(100 mg/kg) sólo en la inmunización de refuerzo.
Los ensayos ELISPOT de
IFN-\gamma se realizaron como se describió
(ejemplo 1) usando péptidos de los antígenos Gag y Nef, reconocidos
por células T CD8+, para estimular a los esplenocitos extraídos 5
días después de la inmunización de refuerzo.
Se observó un aumento sustancial de las células
T citotóxicas cuando se co-administró imiquimod, en
comparación con el grupo que recibió el plásmido con el vehículo
únicamente (10 veces y 100 veces para Gag y Nef, respectivamente)
(Figura 5). Estos descubrimientos sugieren que el efecto adyuvante
de imiquimod no es específico del antígeno y ejemplifica la
eficacia con antígenos virales, más específicamente para VIH.
\vskip1.000000\baselineskip
Los cartuchos se prepararon usando el plásmido
pVAC1.OVA y las inmunizaciones y las respuestas de células T fueron
como se describió en el ejemplo 2. Los análogos de imiquimod
analizados fueron
1-(2-hidroxi-2-metilpropil)-2-etoximetil-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina
(esto es, resiquimod),
1-(2-hidroxi-2-metilpropil)-2-metil-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina
y
1-(2-hidroxi-2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina.
Resiquimod se analizó a lo largo de un amplio intervalo de dosis,
siendo 1 mg/kg la óptima aparentemente. Aquí, el análisis de las
células de nódulos linfáticos extraídos 5 días después de las
inmunizaciones mostró un incremento de seis veces de las células T
CD4 que producían IFN-\gamma, con sólo un efecto
modesto sobre las células T CD4 que producían IL-4
(Figura 6), apoyando adicionalmente el efecto sesgado hacia Th1
observado en el ejemplo 3.
El efecto sobre las células T, 5 días después de
la inmunización, se investigó para los otros dos análogos
suministrados a una única dosis de 30 mg/kg. El análogo
1-(2-hidroxi-2-metilpropil)-2-metil-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina
indujo un aumento de dos veces en las células T CD4, tanto en las
productoras de IFN-\gamma como en las productoras
de IL-4. Se observó un efecto similar para el
análogo
1-(2-hidroxi-2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina
(Figura 7).
De forma global, los resultados en este ejemplo
muestran que los efectos adyuvantes no están restringidos sólo a
imiquimod, sino que se extienden a una gama más amplia de compuestos
dentro de esta clase química.
\vskip1.000000\baselineskip
Los cartuchos se prepararon usando el plásmido
WRG7077 Gag/Nef y las inmunizaciones PMID y las respuestas de
células T fueron como se describió en el ejemplo 5. Aquí, se
administró imiquimod de forma subcutánea a una dosis de 30 mg/kg.
Se incluyó un grupo adicional en el que se administró imiquimod por
aplicación de 20 \mul de una formulación en crema del 5% (p/v)
(esto es, Aldara) aplicada de forma tópica en el sitio de PMID
inmediatamente después de la inmunización. Los bazos se extrajeron
para análisis de 6 a 11 días después de la inmunización de
refuerzo.
Se observó un aumento sustancial de las células
T citotóxicas cuando se co-administró imiquimod,
bien como una inyección subcutánea o bien de forma tópica, en
comparación con el grupo que recibió el plásmido con el vehículo
sólo subcutáneamente (esto es, aproximadamente de 2 a 11 días
después de la inmunización de refuerzo) (Figura 8). Estos
descubrimientos muestran que imiquimod, aplicado de forma tópica, es
un adyuvante efectivo para PMID y sugieren que la inyección
subcutánea es una vía alternativa relevante para la aplicación
tópica en investigaciones de adyuvantes combinados con PMID.
\vskip1.000000\baselineskip
Los cartuchos se prepararon usando el plásmido
pVAC1.OVA (como se describió en el ejemplo 2). Se inmunizaron
grupos de 12 ratones mediante PMID como se describió en el ejemplo
5, excepto que los cartuchos contenían 0,1 \mug de ADN y se
administró imiquimod subcutáneamente a una dosis de 30 mg/kg.
Dos semanas después de la inmunización de
refuerzo, las células EG7-OVA se implantaron por
inyección subcutánea con una aguja en el flanco de cada ratón
(100.000 células/ratón) y se monitorizó el crecimiento del tumor.
Las células E.G7-OVA fueron generadas originalmente
por F. Carbone (Moore, M.W., Carbone, F.R. and Bevan, M.J., Cell
54: 777-785, 1988) transfectando la línea celular
linfoblastoide de ascitis de linfoma de ratón, EL4, para que
expresara de forma estable ovoalbúmina de pollo.
La aparición de tumores palpables se retraso más
en los ratones inmunizados con pVAC1.OVA más imiquimod, en
comparación con pVAC1.OVA únicamente (Figura 9). Aparecieron tumores
palpables más temprano y crecieron más rápidamente en los grupos de
ratones control (esto es, inmunizados con el vector vacío \pm
imiquimod). La tumorigenicidad fue del 25% para los ratones
inmunizados con pVAC1.OVA más imiquimod. En contraste con esto, la
tumorigenicidad fue mayor del 40% para los demás grupos (Figura 10).
Estos resultados muestran que imiquimod puede mejorar el efecto
antitumoral de PMID y sugiere que imiquimod será un adyuvante
efectivo con un ácido nucleico para el tratamiento de una
enfermedad.
Claims (18)
1. Una vacuna que comprende (i) un componente
inmunogénico que comprende una secuencia de nucleótidos que
codifica un péptido antigénico o una proteína asociada con un estado
de enfermedad, y (ii) un componente adyuvante para aumentar una
respuesta inmune al péptido antigénico, o proteína, codificado por
la secuencia de nucleótidos, en la que el componente adyuvante
comprende un derivado de
1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina,
y en la que el componente adyuvante se administra entre
aproximadamente 1 día antes y aproximadamente 3 días después de la
administración del componente inmunogénico.
2. Una vacuna según la reivindicación 1, en la
que los componentes se incluyen en una única formulación
farmacéuticamente aceptable.
3. Una vacuna según las reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en la que el derivado de
1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina
es un compuesto definido por una de las Fórmulas
I-VI:
en la
que
R_{11} se selecciona entre el grupo
constituido por un alquilo de cadena lineal o ramificada,
hidroxialquilo, aciloxialquilo, bencilo, (fenil)etilo y
fenilo, estando dichos sustituyentes bencilo, (fenil)etilo o
fenilo sustituidos opcionalmente en el anillo de benceno por uno o
dos restos seleccionados independientemente entre el grupo
constituido por alquilo de uno a aproximadamente cuatro átomos de
carbono, alcoxi de uno a aproximadamente cuatro átomos de carbono y
halógeno, con la condición de que si dicho anillo de benceno se
sustituye por dos de dichos restos, dichos restos juntos no
contengan más de 6 átomos de carbono; R_{21} se selecciona entre
el grupo constituido por hidrógeno, alquilo de uno a aproximadamente
ocho átomos de carbono, bencilo, (fenil)etilo, y fenilo,
estando el sustituyente bencilo, (fenil)etilo o fenilo
sustituido opcionalmente en el anillo de benceno por uno o dos
restos seleccionados independientemente entre el grupo constituido
por alquilo de uno a aproximadamente cuatro átomos de carbono,
alcoxi de uno a aproximadamente cuatro átomos de carbono y halógeno,
con la condición de que cuando el anillo de benceno esté sustituido
por dos de dichos restos, los restos juntos no contengan más de 6
átomos de carbono; y cada R_{1} se selecciona independientemente
entre el grupo constituido por hidrógeno, alcoxi de uno a
aproximadamente cuatro átomos de carbono, halógeno y alquilo de uno
a aproximadamente cuatro átomos de carbono, y n es un número entero
de 0 a 2, con la condición de que si n es 2, entonces dichos grupos
R_{11} juntos no contengan más de 6 átomos de carbono;
en la
que
R_{12} se selecciona entre el grupo
constituido por un alquenilo de cadena lineal o ramificada, que
contiene de 2 a aproximadamente 10 átomos de carbono, y un
alquenilo sustituido de cadena lineal o ramificada, que contiene de
2 a aproximadamente 10 átomos de carbono, en el que el sustituyente
se selecciona entre el grupo constituido por un alquilo de cadena
lineal o ramificada, que contiene de 1 a aproximadamente 4 átomos de
carbono y cicloalquilo que contiene de 3 a aproximadamente 6 átomos
de carbono; y un cicloalquilo que contiene de 3 a aproximadamente 6
átomos de carbono, sustituido por un alquilo de cadena lineal o
ramificada, que contiene de 1 a aproximadamente 4 átomos de
carbono; y R_{22} se selecciona entre el grupo constituido por
hidrógeno, alquilo de cadena lineal o ramificada que contiene de
uno a aproximadamente ocho átomos de carbono, bencilo,
(fenil)etilo y fenilo, estando el sustituyente bencilo,
(fenil)etilo o fenilo opcionalmente sustituido en el anillo
de benceno por uno o dos restos seleccionados independientemente
entre el grupo constituido por alquilo de cadena lineal o
ramificada que contiene de uno a aproximadamente cuatro átomos de
carbono, alcoxi de cadena lineal o ramificada que contiene de uno a
aproximadamente cuatro átomos de carbono, y halógeno, con la
condición de que cuando el anillo de benceno esté sustituido por dos
de dichos restos, los restos juntos no contengan más de 6 átomos de
carbono; y cada R_{2} se selecciona independientemente entre el
grupo constituido por alcoxi de cadena lineal o ramificada que
contiene de uno a aproximadamente cuatro átomos de carbono, halógeno
y alquilo de cadena lineal o ramificada que contiene de uno a
aproximadamente cuatro átomos de carbono, y n es un número entero
de 0 a 2, con la condición de que si n es 2, dichos grupos R_{2}
juntos no contengan más de 6 átomos de carbono;
en la
que
R_{23} se selecciona entre el grupo
constituido por hidrógeno, alquilo de cadena lineal o ramificada de
uno a aproximadamente ocho átomos de carbono, bencilo,
(fenil)etilo, y fenilo, estando el sustituyente bencilo,
(fenil)etilo o fenilo opcionalmente sustituido en el anillo
de benceno por uno o dos restos seleccionados independientemente
entre el grupo constituido por alquilo de cadena lineal o ramificada
de uno a aproximadamente cuatro átomos de carbono, alcoxi de cadena
lineal o ramificada de uno a aproximadamente cuatro átomos de
carbono, y halógeno, con la condición de que cuando el anillo de
benceno esté sustituido por dos de estos restos, los restos juntos
no contengan más de 6 átomos de carbono; y cada R_{5} se
selecciona independientemente entre el grupo constituido por alcoxi
de cadena lineal o ramificada de uno a aproximadamente cuatro átomos
de carbono, halógeno y 30 alquilos de cadena lineal o ramificada de
uno a aproximadamente cuatro átomos de carbono, y n es un número
entero de 0 a 2, con la condición de que si n es 2, dichos grupos
R_{3} juntos no contengan más de 6 átomos de carbono;
en la
que
R_{14} es -CHR_{A}R_{B}, en el que R_{B}
es hidrógeno o un enlace carbono-carbono, con la
condición de que cuando R_{B} es hidrógeno, R_{A} sea alcoxi de
uno a aproximadamente cuatro átomos de carbono, hidroxialcoxi de
uno a aproximadamente cuatro átomos de carbono,
1-alquinilo de dos a aproximadamente diez átomos de
carbono, tetrahidropiranilo, alcoxialquilo en el que el resto alcoxi
contiene de uno a aproximadamente cuatro átomos de carbono y el
resto alquilo contiene de uno a aproximadamente cuatro átomos de
carbono, 2-, 3- ó 4-piridilo, y con la condición
adicional de que cuando R_{B} es un enlace
carbono-carbono, R_{B} y R_{A} juntos formen un
grupo tetrahidrofuranilo, sustituido opcionalmente con uno o más
sustituyentes, seleccionados independientemente entre el grupo
constituido por hidroxi e hidroxialquilo de uno a aproximadamente
cuatro átomos de carbono, R_{24} se selecciona entre el grupo
constituido por hidrógeno, alquilo de uno a aproximadamente cuatro
átomos de carbono, fenilo y fenilo sustituido, en el que el
sustituyente se selecciona entre el grupo constituido por alquilo
de uno a aproximadamente cuatro átomos de carbono, alcoxi de uno a
aproximadamente cuatro átomos de carbono, y halógeno; y R_{4} se
selecciona entre el grupo constituido por hidrógeno, alcoxi de
cadena lineal o ramificada que contiene de uno a aproximadamente
cuatro átomos de carbono, halógeno y alquilo de cadena lineal o
ramificada que contiene de uno a aproximadamente cuatro átomos de
carbono;
en la
que
R_{15} se selecciona entre el grupo
constituido por: hidrógeno; alquilo de cadena lineal o ramificada,
que contiene de uno a aproximadamente diez átomos de carbono, y
alquilo sustituido de cadena lineal o ramificada, que contiene de
uno a aproximadamente diez átomos de carbono, en el que el
sustituyente se selecciona entre el grupo constituido por
cicloalquilo que contiene de tres a aproximadamente seis átomos de
carbono y cicloalquilo que contiene de tres a aproximadamente seis
átomos de carbono, sustituido por un alquilo de cadena lineal o
ramificada, que contiene de uno a aproximadamente cuatro átomos de
carbono; alquenilo de cadena lineal o ramificada que contiene de
dos a aproximadamente diez átomos de carbono y alquenilo sustituido
de cadena lineal o ramificada, que contiene de dos a
aproximadamente diez átomos de carbono, en el que el sustituyente se
selecciona entre el grupo constituido por cicloalquilo que contiene
de tres a aproximadamente seis átomos de carbono y cicloalquilo que
contiene de tres a aproximadamente seis átomos de carbono,
sustituido por un alquilo de cadena lineal o ramificada que
contiene de uno a aproximadamente cuatro átomos de carbono;
hidroxialquilo de uno a aproximadamente seis átomos de carbono;
alcoxialquilo en el que el resto alcoxi contiene de uno a
aproximadamente cuatro átomos de carbono y el resto alquilo contiene
de uno a aproximadamente seis átomos de carbono; aciloxialquilo en
el que el resto aciloxi es un alcanoiloxi de dos a aproximadamente
cuatro átomos de carbono o benzoiloxi, y el resto alquilo contiene
de uno a aproximadamente seis átomos de carbono; bencilo;
(fenil)etilo; y fenilo; estando el sustituyente bencilo,
(fenil)etilo o fenilo opcionalmente sustituido en el anillo
de benceno por uno o dos restos seleccionados independientemente
entre el grupo constituido por alquilo de uno a aproximadamente
cuatro átomos de carbono, alcoxi de uno a aproximadamente cuatro
átomos de carbono, y halógeno, con la condición de que cuando dicho
anillo de benceno esté sustituido por dos de dichos restos, los
restos juntos no contengan más de 6 átomos de carbono;
y R_{25} es
en el
que
R_{X} y R_{Y} se seleccionan
independientemente entre el grupo constituido por hidrógeno, alquilo
de uno a aproximadamente cuatro átomos de carbono, fenilo, y fenilo
sustituido, en el que el sustituyente se elige entre el grupo
constituido por alquilo de uno a aproximadamente cuatro átomos de
carbono, alcoxi de uno a aproximadamente cuatro átomos de carbono y
halógeno; X se selecciona entre el grupo constituido por alcoxi que
contiene de uno a aproximadamente cuatro átomos de carbono,
alcoxialquilo en el que el resto alcoxi contiene de uno a
aproximadamente cuatro átomos de carbono y el resto alquilo contiene
de uno a aproximadamente cuatro átomos de carbono, haloalquilo de
uno a aproximadamente cuatro átomos de carbono, alquilamido en el
que el grupo alquilo contiene de uno a aproximadamente cuatro
átomos de carbono, amino, amino sustituido en el que el
sustituyente es alquilo o hidroxialquilo de uno a aproximadamente
cuatro átomos de carbono, azido, alquiltio de uno a aproximadamente
cuatro átomos de carbono; y R_{5} se selecciona entre el grupo
constituido por hidrogeno, alcoxi de cadena lineal o ramificada,
que contiene de uno a aproximadamente cuatro átomos de carbono,
halógeno, y alquilo de cadena lineal o ramificada que contienen de
uno a aproximadamente cuatro átomos de carbono;
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que
R_{t} se selecciona entre el grupo constituido
por hidrógeno, alcoxi de cadena lineal o ramificada, que contiene
de uno a aproximadamente cuatro átomos de carbono, halógeno y
alquilo de cadena lineal o ramificada, que contiene de uno a
aproximadamente cuatro átomos de carbono;
R_{u} es 2-metilpropilo o
2-hidroxi-2-metilpropilo;
y
R_{v} es hidrógeno, alquilo de uno a
aproximadamente seis átomos de carbono o alcoxialquilo, en el que el
resto alcoxi contiene de uno a aproximadamente cuatro átomos de
carbono y el resto alquilo contiene de uno a aproximadamente cuatro
átomos de carbono;
o una sal fisiológicamente
aceptable de cualquiera de los
anteriores.
4. Una vacuna según la reivindicación 3, en la
que el derivado de
1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina
es un compuesto de fórmula VI.
5. Una vacuna según la reivindicación 4, en la
que R_{t} es hidrógeno.
6. Una vacuna según la reivindicación 5, en la
que R_{u} es 2-metilpropilo o
2-hidroxi-2-metilpropilo
y R_{v} es hidrógeno, metilo o etoximetilo.
7. Una vacuna según la reivindicación 6, en la
que el compuesto se selecciona entre el grupo constituido por
1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina;
1-(2-hidroxi-2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina;
1-(2-hidroxi-2-metilpropil)-2-metil-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina;
1-(2-hidroxi-2-metilpropil)-2-etoximetil-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina.
8. Una vacuna según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en las que cada componente está en una
forma adecuada para la administración mediante cualquiera de las
vías oral, nasal, tópica, pulmonar, intramuscular, subcutánea o
intradérmica.
9. Una vacuna según la reivindicación 8, en la
que el componente inmunogénico está en una forma adecuada para la
administración usando una técnica de transferencia de genes mediada
por partículas.
10. Una vacuna según la reivindicación 9, en la
que el componente adyuvante está en una forma adecuada para la
administración usando una técnica de transferencia de genes mediada
por partículas.
11. El uso de un derivado de
1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina
en la fabricación de un medicamento para aumentar la respuesta
inmune iniciada por un péptido antigénico en el tratamiento de un
mamífero en un estado de enfermedad seleccionado entre una
infección viral, bacteriana o parasítica, cáncer, alergia o un
trastorno autoinmune, expresándose dicho péptido como resultado de
la administración a un mamífero de una secuencia de nucleótidos que
codifica dicho péptido y en el que el derivado de
1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina
se administra entre aproximadamente 1 día antes y aproximadamente 3
días después de la administración de la secuencia de nucleótidos
que codifica dicho péptido.
12. El uso según la reivindicación 11, en el que
el derivado de
1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina
es como se definió en la reivindicación 3.
13. El uso según la reivindicación 12, en el que
el derivado de
1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina
es como se definió en la reivindicación 4.
14. El uso según una cualquiera de la
reivindicaciones 11 a 13, en el que el derivado de
1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina
se administra a una dosis entre aproximadamente 1 mg/kg y 50
mg/kg.
15. El uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 14, en el que la secuencia de nucleótidos que
codifica dicho péptido se administra mediante una técnica de
transferencia de genes mediada por partículas y el derivado de
1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina
se administra de forma tópica en el sitio de administración de la
secuencia de nucleótidos.
16. Un derivado de
1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina
para su uso como un adyuvante para aumentar una respuesta inmune
iniciada por un péptido antigénico, expresándose dicho péptido como
resultado de la administración a un mamífero de una secuencia de
nucleótidos que codifica dicho péptido, administrándose el derivado
de
1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina
entre aproximadamente 1 día antes y aproximadamente 3 días después
de la administración de la secuencia de nucleótidos que codifica
dicho péptido.
17. Un derivado de
1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina
según la reivindicación 16, definiéndose el derivado de
1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina
como en la reivindicación 3.
18. Un derivado de
1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina
según la reivindicación 17, definiéndose el derivado de
1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina
como en la reivindicación 4.
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