JP6534146B2 - ワクチン用アジュバント、ワクチン、及び免疫誘導方法 - Google Patents
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Description
そこで、本発明者らは、粘膜免疫応答の誘導に必要な機能を樹状細胞に与えることを基準としてアジュバントを選択することにより、全身性免疫応答に加えて粘膜免疫応答をも効率よく誘導できる全く新しい免疫法が開発できるのではないかと考え、検討を行った。
また、Yokota A. et al. Int Immunol. 2009 Apr;21(4):361-377.(非特許文献2)には、腸管樹状細胞は、血中の単核球が腸管粘膜固有層に入り、腸内でGM-CSFとIL-4の影響を受けて分化することによって産生されることが開示されている。
さらに、β-1,3-グルカンと、TLR9アゴニストであるCpGオリゴデオキシヌクレオチドとを組み合わせたアジュバントを使用して抗原と共に投与すると、血中に抗原特異的なIgG抗体が誘導されるとともに、糞便中に抗原特異的なIgA抗体が誘導されることを見出した。この方法では、抗原特異的なIgG抗体産生の誘導は長期間持続したが、IgA抗体産生は一過性に上昇した後、消退した。しかしながら、抗原のみ粘膜面に投与することによって追加免疫を行ったところ、大量の抗原特異的IgA抗体が誘導され、IgA産生も3か月以上持続することを見出した。
〔1〕Dectin−1リガンドと、
TLRアゴニストと
を含むワクチン用アジュバント;
〔2〕
前記Dectin−1リガンドが、Raldh2遺伝子の発現誘導剤である、〔1〕に記載のワクチン用アジュバント。
〔3〕
前記Raldh2遺伝子の発現誘導剤が、顆粒球単球コロニー刺激因子(GM−CSF)又はグルカン類である、〔2〕に記載のワクチン用アジュバント。
〔4〕
さらに、不完全フロイントアジュバントを含む、〔1〕から〔3〕のいずれかに記載のワクチン用アジュバント。
〔5〕
少なくとも1つの抗原と共に投与するための、〔1〕から〔4〕のいずれかに記載のワクチン用アジュバント。
〔6〕
少なくとも1つの抗原と、
〔1〕から〔5〕のいずれかに記載のワクチン用アジュバントとを備えるワクチン。
〔7〕
前記ワクチンは、前記抗原と、前記ワクチン用アジュバントとを含むワクチン組成物である、〔6〕に記載のワクチン。
〔8〕
前記少なくとも1つの抗原は、ウイルス、若しくはその一部、若しくはその成分を不活化若しくは弱毒化したもの、細菌、若しくはその一部、若しくはその成分を不活化又は弱毒化したもの、又はアレルゲンである、〔6〕又は〔7〕に記載のワクチン。
〔9〕
抗原特異的IgA産生を誘導する、〔6〕から〔8〕のいずれかに記載のワクチン。
〔10〕
抗原特異的IgA産生及び抗原特異的IgG産生を誘導する、〔6〕から〔9〕のいずれかに記載のワクチン。
〔11〕
粘膜免疫応答を誘導する、〔6〕から〔10〕のいずれかに記載のワクチン。
〔12〕
前記ワクチンの投与は、ワクチンを経皮投与、皮下投与、皮中投与、及び筋肉内投与からなる群より選択される方法で投与することによって行われる、〔6〕〜〔11〕のいずれかに記載のワクチン。
〔13〕
前記ワクチンの投与後、一定期間経過後に、抗原を投与する追加免疫を少なくとも1回行う免疫誘導方法に用いられる、〔6〕から〔12〕のいずれかに記載のワクチン。
〔14〕
前記追加免疫は、経口投与、経鼻投与、経粘膜投与、経膣投与、経眼投与、及び直腸内投与からなる群より選択される方法で抗原を投与することによって行われる、〔13〕に記載のワクチン。
〔15〕
前記追加免疫は、アジュバントを使用せずに抗原を投与することによって行われる、〔13〕又は〔14〕に記載のワクチン。
〔16〕
少なくとも1つの抗原と、
Dectin−1リガンドと、TLRアゴニストとを含むワクチン用アジュバントとを備えるワクチンを投与する工程
を含む免疫誘導方法。
〔17〕
前記ワクチンを投与する工程は、ワクチンを経皮投与、皮下投与、皮中投与、及び筋肉内投与からなる群より選択される方法で投与することによって行われる、〔16〕に記載の免疫誘導方法。
〔18〕
前記ワクチンを投与する工程後、一定期間経過後に、抗原を投与して追加免疫を行う工程
をさらに含む、〔16〕又は〔17〕に記載の免疫誘導方法。
〔19〕
前記追加免疫を行う工程は、経口投与、経鼻投与、経粘膜投与、経膣投与、経眼投与、及び直腸内投与からなる群より選択される方法で抗原を投与することによって行われる、〔18〕に記載の免疫誘導方法。
〔20〕
前記追加免疫を行う工程は、アジュバントを使用せずに抗原を投与することによって行われる、〔18〕又は〔19〕に記載の免疫誘導方法。
〔21〕
少なくとも1つのウイルス、細菌又はアレルゲンに由来する抗原と、
Dectin−1リガンドと、TLRアゴニストとを含むワクチン用アジュバントと、
を備えるワクチンを投与する工程
を含む、ウイルス感染症、細菌感染症又はアレルギーの予防方法。
また、上記アジュバントを使用して免疫応答の誘導を行うと全身性免疫応答の誘導は長期間持続する一方、粘膜免疫応答の誘導は比較的短期間で消失するが、さらに、抗原のみを粘膜面に投与して追加免疫を行うことにより、粘膜免疫応答の誘導も長期間持続させることができる。追加免疫の際、抗原の投与ルートを適宜選択することにより、腸管や気道など所望の部位に粘膜免疫応答を誘導することも可能である。
本発明に係るワクチン用アジュバントは、Dectin-1リガンドと、TLRアゴニストを含む。
本明細書において用語「ワクチン」は、感染症の予防を目的として用いられる医薬品であり、失活又は弱毒化した抗原を含む。ワクチンは、ヒトなどの動物に投与されると、免疫応答を誘導し、以後、そのワクチンに含まれる抗原による感染症(アレルギー反応を含む)の罹患や重症化を防ぐことができる。以下に、本発明に係るワクチン用アジュバントが、本発明に係る作用効果を奏する理由等を、主として従来技術のワクチン(又はワクチン用アジュバント)の作用効果や動物の生理作用を介して説明する。
TLRアゴニストとしては、例えば、TLR1〜9アゴニストが挙げられる。これらのTLRアゴニストは、例えばヒトとマウスとで、TLR1〜9が相同性を有していることから、共通した作用を示す。
TLR2アゴニストとしては、各種リポペプチド、ペプチドグリカン、熱ショックタンパク質、それらの機能的フラグメント又はアナログ、Pam3Cys-Ser-(Lys)4、MALP-2、FSL-1、Hib-OMPC等が挙げられる。
TLR3アゴニストとしては、二本鎖RNA、ポリイノシンポリシチジン酸(Poly(I:C))等の二本鎖RNAアナログが挙げられる。
TLR4アゴニストとしては、各種リポ多糖、熱ショックタンパク質、フィブリノーゲン、ヘパリン硫酸、ヒアルロン酸、及びこれらの機能的フラグメント又はアナログ、アミノアルキルグルコサミニドホスフェート(AGP)、モノホスホリルリピドA(MPLA)、RC-529等が挙げられる。
TLR5は小腸粘膜固有層のCD11c陽性細胞に特異的に発現し、病原細菌のフラジェリンを認識して免疫応答を誘導することが知られている。TLR5アゴニストとしては、例えばリコンビナントフラジェリン、CBLB502等が挙げられる。
TLR6アゴニストとしては、各種ジアシルリポペプチド、その機能的フラグメント又はアナログ、FSL-1、Pam2Cys等が挙げられる。
TLR7は、ウイルス由来の一本鎖RNAを認識し、自然免疫系を活性化する。TLR7アゴニストとしては、例えば、Imiquimod、その誘導体であるR-848、Loxoribine、Bropirimine、Gardiquimodが挙げられる。Imiquimod、Loxoribine、Gardiquimod、及びR-848はヒトTLR8アゴニストとしても知られる。
TLR9は、生体内では、細菌やウイルス由来のCpGオリゴデオキシヌクレオチド(CpG ODN)を認識し、自然免疫系を活性化する。CpG ODNとは、CpGモチーフが含まれた短い合成オリゴデオキシヌクレオチドをいう。本発明に係るワクチン用アジュバントに用いられるTLR9アゴニストとしても、CpG ODNを用いることができるが、これに限定されない。TLR9アゴニストとなるCpG ODNは、当業者が適宜設計することができ、市販のものを用いることもできる。本発明に用いる場合、CpG ODNはその塩であってもよく、例えばナトリウム塩とすることができる。CpG ODNは、非メチル化CpG ODNとしてもよい。例えば、CpG-ODN 1668、2006、1826、2395等が挙げられる。
本発明に係るワクチンは、本発明に係るワクチン用アジュバントに加えて、少なくとも1つの抗原を備える。ワクチンは、上記ワクチン用アジュバントと、上記抗原とを含むワクチン組成物であってもよいが、ワクチンの保存安定性の観点から、上記ワクチン用アジュバントと上記抗原とが別体であってもよい。
細菌抗原の非限定的な例として、インフルエンザ菌、肺炎球菌、百日咳菌、破傷風菌、ジフテリア菌、結核菌、腸管出血性大腸菌等の大腸菌、コレラ菌、サルモネラ菌、及びメチシリン耐性黄色ブドウ球菌からなる群より選択される少なくとも1つの細菌、又はその一部、又はその成分を、不活化若しくは弱毒化したものが挙げられる。
アレルゲンの非限定的な例として、花粉(スギ花粉、イネ科花粉、キク科花粉等)、真菌、昆虫、食物(大豆、卵、牛乳等)、及び薬剤(ペニシリン等)が挙げられる。
抗原を投与する追加免疫では、アジュバントを使用せずに抗原を投与してもよく、抗原をアジュバントと共に投与してもよい。
例えば、抗原としてインフルエンザウイルスを用いる場合、予め数種の抗原を含むワクチンを投与しておき、毎年インフルエンザが流行する季節に先立って、その年に流行すると予想される抗原で追加免疫を行えば、粘膜免疫によってインフルエンザウイルスの感染自体を抑制することが可能となる。
本発明は、本発明に係るワクチンを投与する工程を含む免疫誘導方法も包含する。また、上記ワクチンを投与する工程後、一定期間経過後に、抗原を投与して追加免疫を少なくとも1回行う工程をさらに含む免疫誘導方法も包含する。
本発明は、少なくとも1つのウイルス又は細菌に由来する抗原と、Dectin−1リガンドと、TLRアゴニストとを含むワクチン用アジュバントと、を備えるワクチンを投与する工程を含む、ウイルス感染症又は細菌感染症の予防方法も包含する。また、上記ワクチンを投与する工程後、一定期間経過後に、抗原を投与して追加免疫を行う工程をさらに含むウイルス又は細菌の感染症の予防方法も包含する。
「予防方法」とは、抗原により引き起こされる感染症又はアレルギー反応を、発現する前に予防する方法を意味する。
本明細書において用語「ワクチン」は、感染症の予防を目的として用いられる医薬品であり、失活又は弱毒化した抗原を含む。ワクチンは、ヒトなどの動物に投与されると、免疫応答を誘導し、以後、そのワクチンに含まれる抗原による感染症の罹患や重症化を防ぐことができる。
「治療方法」とは、抗原により引き起こされる感染症又はアレルギー反応を、発現した後に治療する方法を意味する。
抗原を投与して追加免疫を少なくとも1回行う工程では、抗原を投与してもよく、抗原をアジュバントと共に投与してもよい。
脾臓cDCを、抗原としてオボアルブミン(OVA; 100 μg/ml)と、アジュバントとしてCpG ODN 1668(1 μg/ml)単独、又はCpG ODNとGM-CSF(10 ng/ml)の組み合わせとを用いて、24時間刺激した。
ここで、マウス小腸粘膜固有層細胞を、樹状細胞マーカーのCD11cとマクロファージマーカーのCD11bで分画すると、R1(樹状細胞)(CD11chighCD11blow)、R2(樹状細胞)(CD11chighCD11bhigh)、R3(マクロファージ)(CD11cintCD11bint)、R4(好酸球)(CD11cintCD11bhigh)の4群に分かれる。このR2樹状細胞が特異的にRaldh2を発現し、Th17応答及びIgA産生を誘導する(非特許文献1)。そこで、陽性コントロールとして、R2樹状細胞をOVA(100 μg/ml)及びCpG ODN 1668(1 μg/ml)で刺激した。脾臓cDCを、OVA(100 μg/ml)及びCpG ODN 1668(1 μg/ml)さらにGM-CSF (10 ng/ml)ありなしで刺激した。
刺激後0日目と14日目に、抗原を取り込んだ樹状細胞(それぞれ5×104個)(またはPBS)を、CD57BL/6マウスの腹腔内に注射投与した。21日目から25日目に経口でOVAを1 mg/mouseで毎日投与し、32日目に抗原特異的な血清total IgGと、糞便中IgAをELISAで測定した。
次に、グルカン類としてザイモザン(Zymosan:Saccharomyces cerevisiae由来の酵母細胞壁由来の成分; 25 ng/ml)及びカードラン(Curdlan:Agrobacterium spp., Alcaligenes spp.由来のβ-1,3-グルカン; 25 ng/ml)を用い、これらの物質で脾臓cDCを24時間刺激し、RNAを回収後、Raldh2のmRNAの発現をRT-PCRで測定した。
不完全フロイントアジュバント(IFA)に、抗原としてOVA(500 μg/ml)、アジュバントとしてCpG ODN 1668(5 μg/ml)及び/又はカードラン(5 mg /ml)を加えたIFAエマルジョンを、200 μl/mouseで筋注により投与した。その後、経時的(一週間に一回)に血清と糞便を採取し、抗原(OVA)特異的な血清total IgGと糞便中IgAをELISAで測定した。
次に、3.と同様の実験を、抗原としてCT(1 μg/mouse)を用いて行った。筋注による免疫後、3週間経過時に、抗原特異的な血清total IgGと糞便中IgAをELISAで測定した。
4.の実験の後、マウスに20 μgのCTを経口投与し、下痢の症状を検討した。実験の概要と結果を図5に示す。正常な腸管では、固形の便が見られ、盲腸も小さい。一方、IFAのみ、又はIFAとCTのみ投与した場合には、便が水状となり、盲腸が肥大しているのが観察された。これに対し、IFA、CT、CpG ODN及びカードランを投与したマウスでは、固形の便が見られ、盲腸の肥大も見られなかった。
IFAにOVAと、CpG ODN及び/又はカードランを加えて、又はいずれも加えずに、筋注によりマウスを免疫した後、42日目にOVAを1 mg/mouseで単回経口投与して追加免疫を行い、経口投与した日、及びその1週間後に、抗原特異的な糞便中IgAをELISAで、抗原特異的なIgA産生細胞をELISpotで測定した。
6.と同様の実験を行った後、さらに長期間にわたって、抗原特異的な血清total IgGと糞便中IgAを経時的に測定した。実験の概要と結果を図7に示す。抗原特異的IgG量は追加免疫からその後13週間ほとんど低下せず、13週目に2度目の追加免疫を行うことによりわずかに上昇して当初の値まで回復した。一方、糞便中の抗原特異的IgA量は、徐々に低下して13週目にほとんどゼロとなったが、13週目にOVAを1 mg/mouseで単回経口投与して2度目の追加免疫を行うことにより著しく回復した。
6.と同様の実験を行い、OVA経口投与による追加免疫後、7日目に、マウスから脾臓と腸管粘膜固有層の細胞を摘出して抗原存在下(OVA 100 μg/ml)で培養し、4日後にIFN-γ、IL-4及びIL-17の産生をELISAで測定した。
IFA、IFA+OVA+CpG ODN、IFA+OVA+カードラン、IFA+OVA+CpG ODN+カードランのそれぞれをマウスに筋注投与し、35日後にOVAを1 μg/mouseで経鼻投与して追加免疫を行い、7日後に、抗原特異的な血清total IgGと気管支肺胞洗浄液中IgAをELISAで測定した。
9.の実験において、OVAの経鼻投与から7日後に、マウスから肺粘膜固有層細胞を摘出し、抗原存在下(OVA 100 μg/ml)で培養して、4日後にIFN-γ、IL-4、及びIL-17産生をELISAで測定した。
IFAに、OVAのみ、OVAとCpG ODN、OVAとカードラン、又は、OVAとCpG ODNとカードランを加え、それぞれマウスに筋注投与し(0日目)、35日目にMedroxyprogesteroneをマウス1匹あたり2 mg皮下投与し、42日目にOVAをマウス1匹当たり100 μg膣内投与して、その1週間後に抗原特異的な膣洗浄液中IgAをELISAで測定した。
次に、β-1,3-グルカンを認識する受容体であるDectin-1の樹状細胞における発現を測定した。実験の概要と結果を図12に示す。図中左に示されるとおり、脾臓由来樹状細胞では、Dectin-1の発現は多くないが、CpG ODNで刺激することによりDectin-1の発現が3倍以上上昇することが確認された。Dectin-1はTh17応答を誘導することが知られる。これらのことは、CpG ODNとβ-1,3-グルカンの双方をアジュバントに加えることにより、樹状細胞がβ-1,3-グルカンによる刺激を受けやすくなり、Th17応答が誘導されるという本発明のメカニズムを示す。
IFA、IFA+OVA+R-848(100 μg/mouse)、又はIFA+OVA+R-848+カードランをマウスに筋注して免疫し、28日後にOVAを1 mg/mouseで単回経口投与して追加免疫し、経時的に、抗原特異的な血清total IgGと糞便中IgAをELISAで測定した。R-848は、TLR7/8アゴニストである。
IFAに、抗原としてOVA(500 μg/ml)、アジュバントとしてCpG ODN 1668(5 μg/ml)及び/又はレンチナン(5 mg /ml)を加えたIFAエマルジョンを、200 μl/mouseで筋注により投与した。その後、経時的に血清と糞便を採取し、抗原特異的な血清total IgGと糞便中IgAをELISAで測定した。
IFAにOVAと、CpG ODN及び/又はレンチナンを加えて、又はいずれも加えずに、筋注によりマウスを免疫した後、42日目にOVAを1 mg/mouseで単回経口投与して追加免疫を行い、経口投与した日、及びその1週間後に、抗原特異的な糞便中IgAをELISAで、抗原特異的なIgA産生細胞をELISpotで測定した。
15.と同様の実験を行い、OVA経口投与による追加免疫後、7日目に、マウスから脾臓と腸管粘膜固有層の細胞を摘出して抗原存在下(OVA 100 μg/ml)で培養し、4日後にIFN-γ、IL-4及びIL-17の産生をELISAで測定した。
IFAに、抗原としてOVA(500 μg/ml)、アジュバントとしてCpG ODN 1668(5 μg/ml)及びカードラン(5 mg /ml)を加えたIFAエマルジョンを、200 μl/mouseでDectin-1ヘテロ欠損マウス(Clec7a+/-)とDectin-1ホモ欠損マウス(Clec7a-/-)に筋注により投与した。その3週後に血清と糞便を採取し、抗原特異的な血清total IgGと糞便中IgAをELISAで測定した。
IFAにOVAと、CpG ODN及びカードランを加えて、筋注によりDectin-1ヘテロ欠損マウスとDectin-1ホモ欠損マウスを免疫した後、42日目にOVAを1 mg/mouseで単回経口投与して追加免疫を行い、経口投与した日、及びその1週間後に、抗原特異的な糞便中IgAをELISAで測定した。
18.と同様の実験を行い、OVA経口投与による追加免疫後、7日目に、マウスから脾臓と腸管粘膜固有層の細胞を摘出して抗原存在下(OVA 100 μg/ml)で培養し、4日後にIFN-γ、IL-4及びIL-17の産生をELISAで測定した。
Claims (10)
- 顆粒球単球コロニー刺激因子(GM−CSF)、又はDectin−1に結合することができるグルカン類と、
TLRアゴニストと
を含み、
筋肉内投与される、IgA産生を誘導するためのワクチン用アジュバント。 - 顆粒球単球コロニー刺激因子(GM−CSF)、又はDectin−1に結合することができるグルカン類と、
TLRアゴニストと
を含み、
筋肉内投与される、粘膜免疫応答を誘導するためのワクチン用アジュバント。 - さらに、不完全フロイントアジュバントを含む、請求項1又は2に記載のワクチン用アジュバント。
- 前記Dectin−1に結合することができるグルカン類が、β−1,3−グルカンである、請求項1から3のいずれか1項に記載のワクチン用アジュバント。
- 少なくとも1つの抗原と共に投与するための、請求項1から4のいずれか1項に記載のワクチン用アジュバント。
- 前記少なくとも1つの抗原は、ウイルス、若しくはその一部、若しくはその成分を不活化若しくは弱毒化したもの、細菌、若しくはその一部、若しくはその成分を不活化又は弱毒化したもの、又はアレルゲンである、請求項5に記載のワクチン用アジュバント。
- 抗原特異的IgG産生をさらに誘導するための、請求項1から6のいずれか1項に記載のワクチン用アジュバント。
- 前記ワクチン用アジュバントの投与後、一定期間経過後に、抗原を投与する追加免疫を少なくとも1回行う免疫誘導方法に用いられる、請求項1から7のいずれか1項に記載のワクチン用アジュバント。
- 前記追加免疫は、経口投与、経鼻投与、経粘膜投与、経膣投与、経眼投与、及び直腸内投与からなる群より選択される方法で抗原を投与することによって行われる、請求項8に記載のワクチン用アジュバント。
- 前記追加免疫は、アジュバントを使用せずに抗原を投与することによって行われる、請求項8又は9に記載のワクチン用アジュバント。
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