ES2893584T3 - Adyuvante para vacunas, vacuna y procedimiento de inducción de inmunidad - Google Patents

Abstract

Vacuna para uso en la prevención de una infección, el tratamiento de una infección o la prevención de una reacción alérgica en un sujeto induciendo una respuesta inmunitaria de la mucosa, en la que la vacuna se administra mediante inyección intramuscular y comprende: al menos un antígeno y un adyuvante para vacuna que comprende: (i) un ligando de dectina-1 y (ii) un agonista de TLR.

Description

DESCRIPCIÓN

Adyuvante para vacunas, vacuna y procedimiento de inducción de inmunidad

Campo técnico

[0001] La presente invención se refiere a una vacuna para uso en la prevención de una infección, el tratamiento de una infección o la prevención de una reacción alérgica en un sujeto induciendo una respuesta inmunitaria de la mucosa, donde la vacuna se administra mediante inyección intramuscular y comprende:

al menos un antígeno, y

un adyuvante para vacuna que comprende: un ligando de dectina-1;

y un agonista de TLR.

[0002] También se describe en esta memoria un adyuvante para vacuna que puede inducir eficazmente la producción de IgA específica del antígeno en la membrana mucosa y una vacuna que incluye el mismo.

Antecedentes de la técnica

[0003] Hasta la fecha, se han desarrollado muchas vacunas para infecciones víricas y bacterianas. Sin embargo, la mayoría de ellas inducen respuestas inmunitarias sistémicas que conducen a la producción de anticuerpos de IgG mediante la inducción de una respuesta de Th1 o Th2. Tales vacunas contribuyen en gran medida a la prevención del agravamiento después de la infección, pero no pueden impedir el establecimiento de la propia infección. Como las vías de entrada de muchos patógenos son tejidos y órganos cubiertos por la membrana mucosa, tales como los ojos, la cavidad nasal, la cavidad oral, la faringe, las vías respiratorias, los órganos digestivos y el aparato genitourinario, es necesario mejorar la respuesta inmunitaria en la membrana mucosa e impedir la entrada para impedir el establecimiento de la propia infección. Por lo tanto, hay una demanda de vacunas que puedan inducir tanto la respuesta inmunitaria de la mucosa, representada por el anticuerpo de IgA, como la respuesta inmunitaria sistémica, representada por el anticuerpo de IgG.

[0004] Como forma de inducir eficazmente tanto la respuesta inmunitaria de la mucosa como la respuesta inmunitaria sistémica a través de la superficie de la membrana mucosa, se ha estudiado el uso de diversos adyuvantes para mejorar la respuesta inmunitaria. Por ejemplo, se han propuesto combinaciones de antígenos inactivados de patógenos, adyuvantes que contienen ARN bicatenario y compuesto a base de glucano como vacunas para administración en la mucosa (Bibliografía de patentes 1). Asimismo, se ha propuesto el uso de un cultivo de un microorganismo de Aureobasidium sp. como adyuvante inmunológico para la administración intranasal (Bibliografía de patentes 2). El cultivo de este microorganismo contiene p-1,3-1,6-glucano y también se ha propuesto combinar el cultivo y Poli(I:C) en la Bibliografía de patentes 2.

Lista de referencias

[0005]

Bibliografía de patentes 1: patente japonesa abierta a la inspección pública n.° 2009-242367

Bibliografía de patentes 2: la patente japonesa de n.° de publicación 5242855 US 2014/199379 describe composiciones que tienen medios para dirigirse al menos a un antígeno en las células dendríticas. El documento US 2014/314804 describe composiciones que incluyen beta-glucanos y procedimientos de uso. Los documentos WO 2015/041318 y EP3048170 describen un complejo que contiene un oligonucleótido que tiene actividad inmunopotenciadora y el uso del mismo. El documento US 2014/234377 describe una composición de vacuna para administración en la mucosa. Kobiyama y col., 25 de febrero de 2014, PNAS 111(8):3086-3091, describen que el ligando de dectina-1 no agonista transforma los CpG en un agonista de TLR nanoparticulado multitarea. Omar y col., 15 de marzo de 2014, vol. 74(6), páginas 1670-1681, describen la identificación de factores inmunitarios que regulan la inmunidad antitumoral usando vacunas poliméricas con múltiples adyuvantes.

Problema Técnico

[0006] Sin embargo, la vacuna que se administra en la membrana mucosa local de la cavidad nasal o similares tiene baja eficacia para infiltrar un antígeno y es difícil entregar apropiadamente el antígeno a las células dendríticas que residen en la membrana mucosa. Asimismo, existe el problema de que el efecto solo se espera alrededor del punto de administración y la inducción de la respuesta inmunitaria sistémica es débil. Además, existe el problema de que la respuesta inmunitaria nasal no puede inducir la respuesta inmunitaria de la mucosa en otros tejidos de membrana mucosa tales como el tracto gastrointestinal.

[0007] Asimismo, se han usado adyuvantes que pueden mejorar la respuesta de Th1, que es particularmente eficaz en la defensa contra la infección, en las vacunas que se han desarrollado convencionalmente. Sin embargo, tal adyuvante no confiere la función de inducir la respuesta inmunitaria de la mucosa.

[0008] Por lo tanto, los presentes inventores pensaron que se puede desarrollar una manera totalmente nueva de inmunización que pueda inducir eficazmente la respuesta inmunitaria de la mucosa, además de la respuesta inmunitaria sistémica, seleccionando adyuvantes que confieran la función necesaria para la inducción de la respuesta inmunitaria de la mucosa sobre las células dendríticas y examinaron la posibilidad.

[0009] Por tanto, un objetivo de la presente invención es proporcionar una vacuna que contiene un adyuvante que puede inducir simultáneamente anticuerpos de IgA específicos del antígeno y la respuesta de Th17, así como anticuerpos de IgG específicos del antígeno y la respuesta de Th1, como una manera totalmente nueva de inmunización.

Solución del problema

[0010] Uematsu, S. y col., Nat Immunol., julio de 2008; 9 (7): 769-76 (Bibliografía no de patentes 1) describen que las células dendríticas especiales que pueden inducir anticuerpos de IgA específicos del antígeno y los linfocitos Th17, a diferencia de las células dendríticas que residen en el bazo y la médula ósea, residen en el tracto intestinal. La Bibliografía no de patentes 1 también describe que tales células dendríticas intestinales especiales expresan Raldh2, una enzima que cataliza la síntesis de ácido retinoico, y pueden sintetizar ácido retinoico, y esta capacidad para sintetizar ácido retinoico es esencial para la inducción de anticuerpos de IgA.

[0011] Asimismo, Yokota A. y col. Int Inmunol. Abril de 2009; 21 (4): 361-377 (Bibliografía no de patentes 2) describen que las células dendríticas intestinales se producen por la entrada de células sanguíneas mononucleares en la lámina propia de la mucosa intestinal y la diferenciación de las células bajo la influencia del GM-CSF y la IL-4 en el intestino.

[0012] Por tanto, los presentes inventores encontraron que el tratamiento de células dendríticas que residen en el bazo con GM-CSF, en base al contenido descrito por estos documentos, hace posible que las células dendríticas expresen Raldh2 e induzcan anticuerpos de IgA específicos del antígeno. Asimismo, encontraron que los compuestos a base de glucano, tales como p-1,3-glucano, inducen la expresión de Raldh2 en las células dendríticas y, como resultado, las células dendríticas adquieren la capacidad de inducir anticuerpos de IgA específicos del antígeno.

[0013] Además, encontraron que la administración de un antígeno con un adyuvante que contiene una combinación de p-1,3-glucano y un oligodesoxinucleótido CpG, que es un agonista del TLR9, induce anticuerpos de IgG específicos del antígeno en la sangre y también anticuerpos de IgA específicos del antígeno en las heces. Mediante este procedimiento, la inducción de la producción de anticuerpos de IgG específicos del antígeno se prolongó durante un periodo de tiempo largo, pero la producción de anticuerpos de IgA se disipó después de un aumento transitorio. Sin embargo, los presentes inventores encontraron que realizar la inmunización de refuerzo administrando solo el antígeno sobre la superficie de la membrana mucosa induce dosis altas de anticuerpos de IgA específicos del antígeno y que la producción de IgA se prolonga 3 meses o más.

[0014] Asimismo, los presentes inventores encontraron que, aunque se ha descrito que el p-1,3-glucano que usaron los presentes inventores activa los receptores de inmunidad natural distintos de la dectina-1, el receptor diana sobre el que actúa el p-1,3-glucano tras la inducción de la producción de anticuerpos de IgA es la dectina-1, ya que la inducción de la producción de anticuerpos de IgA específicos del antígeno desapareció en los ratones con inactivación (KO) de la dectina-1 a los que se administró un adyuvante que contenía una combinación de p-1,3-glucano y un oligodesoxinucleótido CpG con un antígeno. Esto sugiere que no solo el p-1,3-glucano, sino también otras sustancias que estimulan la dectina-1, tienen un efecto similar.

[0015] Como se describió anteriormente, los presentes inventores han encontrado que el uso de una combinación de un ligando de dectina-1 y un agonista de TLR en las células dendríticas como adyuvante induce la respuesta de Th1 sistémica y la producción de anticuerpos de IgG, así como la respuesta de Th17 en la membrana mucosa y la producción de anticuerpos de IgA, y que realizar la inmunización de refuerzo a través de una vía de administración seleccionada vuelve a inducir la respuesta de Th17 y la producción de anticuerpos de IgA en una membrana mucosa deseada, tal como la del tracto intestinal y las vías respiratorias.

[0016] La presente invención es como se define en las reivindicaciones.

Efectos ventajosos de la invención

[0017] Según la presente invención, se puede conseguir la inhibición tanto de la entrada de patógenos como del agravamiento de la enfermedad, ya que se puede inducir eficazmente tanto la respuesta inmunitaria sistémica, representada por la respuesta de Th1 y la producción de anticuerpos de IgG específicos del antígeno, como la respuesta inmunitaria de la mucosa, representada por la respuesta de Th17 y la producción de anticuerpos de IgA específicos del antígeno, a un antígeno deseado mediante un procedimiento sencillo que implica el uso de una combinación de un ligando de dectina-1 y un agonista de TLR como adyuvante.

[0018] Asimismo, aunque la inducción de la respuesta inmunitaria de la mucosa desaparece en un periodo de tiempo relativamente corto, mientras que la inducción de la respuesta inmunitaria sistémica se prolonga durante un periodo de tiempo largo, cuando la respuesta inmunitaria se induce con tal adyuvante, la inmunización de refuerzo posterior, que implica administrar solo el antígeno sobre la superficie de la membrana mucosa, puede hacer que la inducción de la respuesta inmunitaria de la mucosa se prolongue durante un periodo de tiempo largo. También es posible inducir la respuesta inmunitaria de la mucosa en el punto deseado, tal como el tracto intestinal y las vías respiratorias, seleccionando la vía de administración del antígeno según proceda en la inmunización de refuerzo.

Breve descripción de los dibujos

[0019]

La Figura 1 ilustra el resultado de administrar por vía intraperitoneal células dendríticas obtenidas del bazo estimuladas con un antígeno (OVA), CpG ODN y GM-CSF a ratones, a continuación administrar por vía oral el antígeno y medir el total de IgG específica del antígeno en el suero e IgA específica del antígeno en las heces. La Figura 2 ilustra el resultado de estimular células dendríticas obtenidas del bazo con compuesto a base de glucano (cimosano o curdlano) o diversos agonistas de TLR y medir la expresión de Raldh2.

La Figura 3 ilustra el resultado de administrar una emulsión de IFA que contiene un antígeno (OVA) y un adyuvante (CpG ODN y/o curdlano) a ratones mediante inyección intramuscular y medir el total de IgG específica del antígeno en el suero e IgA específica del antígeno en las heces a lo largo del tiempo.

La Figura 4 ilustra el resultado de administrar una emulsión de IFA que contiene un antígeno (toxina del cólera) y un adyuvante (CpG ODN y curdlano) a ratones mediante inyección intramuscular y medir el total de IgG específica del antígeno en el suero e IgA específica del antígeno en las heces 3 semanas después.

La Figura 5 ilustra el resultado de administrar por vía oral la toxina del cólera a los ratones después del experimento de la Figura 4 y examinar los síntomas de la diarrea.

La Figura 6 ilustra el resultado de administrar una emulsión de IFA que contiene un antígeno (OVA) y un adyuvante (CpG ODN y/o curdlano) a ratones mediante inyección intramuscular, realizar la inmunización de refuerzo con el antígeno 42 días después y medir el total de IgG específica del antígeno en el suero e IgA específica del antígeno en las heces en el día y 1 semana después.

La Figura 7 ilustra el resultado de administrar una emulsión de IFA que contiene un antígeno (OVA) y un adyuvante (CpG ODN y/o curdlano) a ratones mediante inyección intramuscular, realizar la inmunización de refuerzo con el antígeno 42 días después y a continuación medir el total de IgG específica del antígeno en el suero e IgA específica del antígeno en las heces a lo largo del tiempo. Después de la primera inmunización de refuerzo, se realizó la segunda inmunización de refuerzo en la decimotercera semana.

La Figura 8 ilustra el resultado de administrar una emulsión de IFA que contiene un antígeno (OVA) y un adyuvante (CpG ODN y/o curdlano) a ratones mediante inyección intramuscular, realizar la inmunización de refuerzo 42 días después, extraer células del bazo y de la lámina propia de la mucosa intestinal de los ratones 7 días después, cultivar las células en presencia del antígeno y medir la producción de IFN-y, IL-4 e IL-174 días después.

La Figura 9 ilustra el resultado de administrar una emulsión de IFA que contiene un antígeno (OVA) y un adyuvante (CpG ODN y/o curdlano) a ratones mediante inyección intramuscular, administrar el antígeno mediante administración intranasal 35 días después para realizar la inmunización de refuerzo y medir el total de IgG específica del antígeno en el suero e IgA específica del antígeno en el líquido del lavado broncoalveolar 7 días después.

La Figura 10 ilustra el resultado de administrar una emulsión de IFA que contiene un antígeno (OVA) y un adyuvante (CpG ODN y/o curdlano) a ratones mediante inyección intramuscular, administrar el antígeno por vía intranasal 35 días después para realizar la inmunización de refuerzo, extraer células de la lámina propia de la mucosa pulmonar de los ratones 7 días después, cultivar las células en presencia del antígeno y medir la producción de IFN-y e IL-17 mediante ELISA 4 días después.

La Figura 11 ilustra el resultado de administrar una emulsión de IFA que contiene un antígeno (OVA) y un adyuvante (CpG ODN y/o curdlano) a ratones mediante inyección intramuscular, administrar medroxiprogesterona 35 días después, administrar por vía intravaginal el antígeno 42 días después para realizar la inmunización de refuerzo y medir la IgA específica del antígeno en el líquido de lavado vaginal 7 días después.

La Figura 12 ilustra el resultado de medir la expresión de dectina-1, un receptor de p-1,3-glucano, en células dendríticas obtenidas del bazo, con o sin estimulación de CpG ODN.

La Figura 13 ilustra el resultado de administrar una emulsión de IFA que contiene un antígeno (OVA) y un adyuvante (solo R-848 o R-848 y curdlano) a ratones mediante inyección intramuscular, administrar por vía oral el antígeno en el 28° día para realizar la inmunización de refuerzo y a continuación medir el total de IgG específica del antígeno en el suero e IgA específica del antígeno en las heces a lo largo del tiempo. La segunda inmunización de refuerzo se realizó 4 semanas después de la primera inmunización de refuerzo.

La Figura 14 ilustra el resultado de administrar una emulsión de IFA que contiene un antígeno (OVA) y un adyuvante (CpG ODN y/o lentinano) a ratones mediante inyección intramuscular y medir el total de IgG específica del antígeno en el suero e IgA específica del antígeno en las heces a lo largo del tiempo.

La Figura 15 ilustra el resultado de administrar una emulsión de IFA que contiene un antígeno (OVA) y un adyuvante (CpG ODN y/o lentinano) a ratones mediante inyección intramuscular, realizar la inmunización de refuerzo con el antígeno 42 días después y medir el total de IgG específica del antígeno en el suero e IgA específica del antígeno en las heces en el día y 1 semana después.

La Figura 16 ilustra el resultado de administrar una emulsión de IFA que contiene un antígeno (OVA) y un adyuvante (CpG ODN y/o lentinano) a ratones mediante inyección intramuscular, realizar la inmunización de refuerzo 42 días después, extraer células del bazo y de la lámina propia de la mucosa intestinal de los ratones 7 días después, cultivar las células en presencia del antígeno y medir la producción de IFN-y e IL-174 días después. La Figura 17 ilustra el resultado de administrar una emulsión de IFA que contiene un antígeno (OVA) y un adyuvante (CpG ODN y curdlano) a ratones deficientes en dectina-1 mediante inyección intramuscular y medir el total de IgG específica del antígeno en el suero e IgA específica del antígeno en las heces 21 días después. La Figura 18 ilustra el resultado de administrar una emulsión de IFA que contiene un antígeno (OVA) y un adyuvante (CpG ODN y lentinano) a ratones deficientes en dectina-1 mediante inyección intramuscular, realizar la inmunización de refuerzo con el antígeno 42 días después y medir el total de IgG específica del antígeno en el suero e IgA específica del antígeno en las heces en el día y 1 semana después.

La Figura 19 ilustra el resultado de administrar una emulsión de IFA que contiene un antígeno (OVA) y un adyuvante (CpG ODN y curdlano) a ratones deficientes en dectina-1 mediante inyección intramuscular, realizar la inmunización de refuerzo 42 días después, extraer células del bazo y de la lámina propia de la mucosa intestinal de los ratones 7 días después, cultivar las células en presencia del antígeno y medir la producción de IFN-^y e IL-174 días después.

Descripción detallada

Adyuvante para vacuna

[0020] Un adyuvante para vacuna descrito en esta memoria comprende un ligando de dectina-1 y un agonista de TLR.

[0021] Como se emplea en esta memoria, el término «vacuna» se refiere a un preparado farmacéutico usado para la prevención de una infección y que contiene un antígeno desactivado o atenuado. La vacuna puede inducir la respuesta inmunitaria cuando se administra a un animal, tal como un ser humano, e impedir la infección (lo que incluye reacciones alérgicas) con el antígeno contenido en la vacuna y el agravamiento de la infección después de la inducción. Las razones por las que la vacuna que contiene adyuvante para uso según la presente invención tiene el efecto según la presente invención y similares se explicarán a continuación principalmente mediante los efectos de vacunas (o adyuvantes para vacuna) de la técnica convencional o las funciones fisiológicas de los animales.

[0022] En primer lugar, mientras que las vacunas que se administran sobre la membrana mucosa, tales como las vacunas intranasales u orales, inducen la respuesta inmunitaria de la mucosa y la respuesta inmunitaria sistémica, las vacunas convencionales que se administran por vía intramuscular solo inducen la respuesta inmunitaria sistémica, pero no la respuesta inmunitaria de la mucosa. Aquí, las células dendríticas residen generalmente en los tejidos y, tras el reconocimiento de un antígeno que ha entrado en el cuerpo, se mueven a los ganglios linfáticos vecinos e inducen y propagan por todo el cuerpo la respuesta específica del antígeno que incluye la producción de anticuerpos. Las células dendríticas de los tejidos mucosos o los ganglios linfáticos asociados a los mismos también tienen la función de inducir la producción de anticuerpos de IgA, a diferencia de las células dendríticas de los tejidos no mucosos. Las células productoras de anticuerpos de IgA inducidas están bajo la influencia de tales células dendríticas y son estimuladas para transferirse a un tejido mucoso asociado para proporcionar una defensa local fuerte. Se deduce que tal diferencia entre las propiedades de las células dendríticas tiene una gran influencia sobre la diferencia entre los efectos de la administración de una vacuna en la mucosa y la administración de la vacuna mediante inyección intramuscular. Por lo tanto, las vacunas convencionales no pueden inducir la respuesta inmunitaria de la mucosa cuando se administran por vía intramuscular, ya que no residen ahí células dendríticas que puedan inducir la respuesta de IgA, y la respuesta inmunitaria de la mucosa se induce solo cuando la inmunización se administra a través de la superficie de la membrana mucosa. En general, la inmunización se debe administrar a través de la mucosa de las vías respiratorias cuando se desea inducir la respuesta de IgA en el órgano respiratorio, a través de la mucosa gastrointestinal cuando se desea inducir la respuesta de IgA en el órgano digestivo y a través de la mucosa genital cuando se desea inducir la respuesta de IgA en el órgano genital. Por otro lado, el uso de la vacuna según la presente invención permite inducir anticuerpos de IgA específicos del antígeno en los tejidos mucosos incluso cuando el antígeno se administra en el músculo, que no es tejido mucoso, y se puede proporcionar adicionalmente la inducción simultánea de anticuerpos de IgG específicos del antígeno.

[0023] A continuación, se explicará la dificultad de inducir la respuesta inmunitaria sistémica administrando una vacuna sobre la membrana mucosa. En general, la eficacia de inducción de la respuesta inmunitaria es baja en el tejido mucoso, si se hace la comparación entre administrar la vacuna sobre la membrana mucosa y administrar la vacuna en el tejido no mucoso. Una causa de esto es la dificultad de tener un antígeno que penetre eficazmente a través de la membrana mucosa para alcanzar las células dendríticas internas. Otras causas de esto incluyen los hechos de que la capa epitelial actúa como una barrera física en la superficie de la membrana mucosa (p. ej., se forma una capa con huecos pequeños mediante un enlace fuerte entre las células epiteliales), que el antígeno es difundido por el moco que tiene fluidez alta, que el antígeno es degradado por las enzimas digestivas y similares. A menudo se realiza la inmunización intranasal de las vacunas convencionales porque la mucosa nasal es relativamente fina en comparación con otras membranas mucosas, pero la eficacia de la inducción de la inmunidad sigue siendo insuficiente. Como uno de los medios para vencer el problema, por ejemplo, se puede usar una toxina bacteriana que rompa la capa epitelial como adyuvante, pero esto puede dañar el nervio en el caso de la inmunización intranasal y causar deterioro olfativo (porque los bulbos olfatorios están cerca) y parálisis facial. Asimismo, otra de las causas es que el mecanismo para inducir la ausencia de respuesta inmunitaria (inmunotolerancia) a los antígenos se desarrolla en el tejido mucoso. Las membranas mucosas de la cavidad nasal o del tracto intestinal están expuestas a un amplio abanico de antígenos exógenos cada día y normalmente se mantienen las respuestas negativas a ellos. En particular, el tracto gastrointestinal tiene un sistema de inmunotolerancia oral y tiene un mecanismo para inhibir fuertemente la inmunidad a los alimentos. Por lo tanto, las vacunas orales no activan la inmunidad, sino que la inhiben. Por otro lado, la respuesta de defensa se induce cuando un patógeno entra en el cuerpo porque los componentes corporales del patógeno activan los receptores inmunitarios innatos e inducen la inflamación y eliminan las respuestas negativas. Por lo tanto, se prueba la combinación con un adyuvante convencional que activa un receptor inmunitario innato para aumentar la eficacia de inducción de la respuesta inmunitaria. Sin embargo, el efecto no es suficiente en comparación con la inmunidad inducida por la inyección intramuscular, que implica la inyección directa de un antígeno en el cuerpo con el problema de la permeabilidad descrito anteriormente.

[0024] Se describirán maneras de superar los obstáculos descritos anteriormente cuando la vacuna que contiene adyuvante para uso según la presente invención se administra mediante inyección intramuscular. En ocasiones, se han usado convencionalmente adyuvantes en combinación con el fin de activar las células dendríticas para aumentar la eficacia de inducción de la respuesta inmunitaria, pero el propósito principal de esto es mejorar la respuesta de Th1 eficaz para eliminar los patógenos infecciosos. Como se describió anteriormente, las células dendríticas de los tejidos no mucosos normalmente no tienen ninguna función de inducción de IgA y no se ha planteado la idea de usar un adyuvante en combinación con el fin de conferir la función de inducción de IgA a tales células dendríticas. Lo que es destacable en la presente invención, además de esta idea, es que la administración del antígeno se realiza sobre la superficie de la membrana mucosa, además de la inmunización mediante inyección intramuscular. Usando la combinación de un ligando de dectina-1, que convierte células dendríticas en las del tipo de la mucosa, y un agonista de TLR, que activa las células dendríticas, la respuesta inmunitaria sistémica, que incluye la fuerte respuesta de Th1 específica del antígeno, así como las células de memoria productoras IgA específica del antígeno y los linfocitos Th17 específicos del antígeno, se puede inducir y transferir a la membrana mucosa en todo el cuerpo. Asimismo, cargando posteriormente al menos el antígeno sobre la superficie de la membrana mucosa deseada para tener la inducción de IgA con el fin de obtener un título superior de anticuerpos de IgA específica del antígeno, se puede inducir una dosis superior de IgA específica del antígeno. En el procedimiento convencional, la mera carga de un antígeno sobre la membrana mucosa sin inmunización difícilmente da como resultado la adquisición de inmunidad, pero induce inmunotolerancia. Sin embargo, como se ha inducido una cierta cantidad de células de memoria de IgA en todo el cuerpo mediante la inmunización por inyección intramuscular, estas aumentan enormemente con la inmunización de refuerzo posterior y producen IgA. Paralelamente, también se induce la respuesta de IgG y Th1 mediante el uso de un adyuvante que activa el sistema inmunitario sistémico, tal como el uso convencional de un único agonista de TLR, pero las células de memoria de IgA no se producen a menos que se use un ligando de dectina-1 en combinación como en la presente invención.

[0025] Como se describió anteriormente, la vacuna que contiene adyuvante para uso en la inducción de la inmunidad como se define en las reivindicaciones, según la presente invención, es una creación innovadora ideada en base al conocimiento de las propiedades de las células dendríticas que residen en la membrana mucosa y de los detalles de la respuesta inmunitaria de la mucosa, lo que incluye el conocimiento de que, en presencia de IgA de memoria, las células productoras de IgA proliferan rápidamente tras la carga de antígeno e inducen una dosis alta de IgA y pueden adquirir todas las ventajas de la inmunización convencional mediante inyección intramuscular y de la inmunidad en la mucosa.

[0026] Como se emplea en esta memoria, el término «adyuvante» significa una sustancia que se administra con un antígeno y aumenta de ese modo la antigenicidad del antígeno para facilitar la inducción de la respuesta inmunitaria. En la vacuna para uso según la presente invención, se usa un ligando de dectina-1, que se describirá pormenorizadamente más adelante, y un agonista de TLR como adyuvante. El adyuvante para vacuna puede ser una composición que contiene el ligando de dectina-1 y el agonista de TLR, pero el ligando de dectina-1 y el agonista de TLR pueden ser independientes desde el punto de vista de la estabilidad del adyuvante durante almacenamiento.

[0027] Como se emplea en esta memoria, el término «dectina-1» se refiere a un receptor de las células dendríticas que es un receptor específico para sustancias que tienen la estructura de glucano representada por p-1,3-glucano. El «gen Raldh2» es un gen cuyo producto de traducción se conoce como una enzima que cataliza la síntesis de ácido retinoico a partir de retinal. En esta memoria, el «gen Raldh2» puede ser un gen de cualquier organismo vivo y se conoce como ALDH1A2 en los seres humanos. El ARNm de Raldh2 humano está identificado por el número de entrada de GenBank: NM_001206897, la proteína Raldh2 humana está identificada por el número de entrada de GenBank: NP_001193826, el ARNm de Raldh2 murino está identificado por el número de entrada de GenBank: NM_009022 y la proteína Raldh2 murina está identificada por el número de entrada de GenBank: NP_033048.

[0028] Como se emplea en esta memoria, el término «ligando de dectina-1» significa una sustancia que se une específicamente a la dectina-1 y abarca agonistas que se unen a la dectina-1. Asimismo, el ligando de dectina-1 es preferentemente un inductor de la expresión de Raldh2, ya que se deduce que tiene un efecto según la presente invención mediante la inducción de la expresión de Raldh2.

[0029] Como se emplea en esta memoria, el término «inductor de la expresión de Raldh2» significa una sustancia que aumenta significativamente la expresión de Raldh2 al menos en las células dendríticas tras la administración de la misma o de una composición que contiene la sustancia. Como se emplea en esta memoria, el término «expresión» incluye, a menos que se indique específicamente de otro modo, tanto el concepto de transcripción, mediante la cual se sintetiza el ARNm en base a una secuencia de ADN, como el de traducción, mediante el cual se sintetiza una proteína en base a una secuencia de ARNm.

[0030] El inductor de la expresión de Raldh2 no está particularmente limitado siempre y cuando aumente significativamente la expresión (transcripción o traducción) de Raldh2 en las células dendríticas y puede ser, por ejemplo, un factor estimulante de colonias de granulocitos y monocitos (GM-CSF) o un compuesto a base de glucano.

[0031] Como se emplea en esta memoria, el término «compuesto a base de glucano» se refiere a una sustancia que tiene la estructura de glucano denominada generalmente glucano y no está particularmente limitado siempre y cuando sea una sustancia que proporcione el efecto según la presente invención, y los ejemplos del mismo incluyen p-1,3-glucano. El p-1,3-glucano puede ser cualquier compuesto cuya cadena principal tiene una estructura en la que la glucosa está enlazada mediante el enlace p-1,3 y puede tener una estructura en la que la glucosa está enlazada mediante el enlace p1-6 o similares en una o más cadenas laterales. Los ejemplos específicos de p-1,3-glucano incluyen curdlano, curdlano carboximetilado, sizofirano, cimosano, lentinano y similares. Entre los compuestos a base de glucano, se prefiere el p-1,3-glucano desde el punto de vista de actuar como un ligando de dectina-1 con mayor seguridad.

[0032] Como se emplea en esta memoria, el término «agonista de TLR» se refiere a una molécula que proporciona, cuando se une a TLR, estimulación similar a la proporcionada cuando un ligando natural se une a TLR. Los agonistas de TLR incluyen ligandos naturales. Como se emplea en esta memoria, el agonista de TLR puede ser un agonista de cualquier TLR. Se puede usar un agonista de TLR conocido o comercializado.

[0033] Los ejemplos del agonista de TLR incluyen agonistas de los TLR1-9. Estos agonistas de TLR presentan un efecto común en, por ejemplo, los seres humanos y los ratones, ya que los TLR1-9 tienen homologías en ellos.

[0034] Los ejemplos de agonista del TLR1 incluyen diversos triacil-lipopéptidos, fragmentos funcionales o análogos de los mismos, Pam3Cys-Ser-(Lys)4 y similares.

[0035] Los ejemplos de agonista del TLR2 incluyen diversos lipopéptidos, peptidoglucanos, proteínas de choque térmico, fragmentos funcionales o análogos de los mismos, Pam3Cys-Ser-(Lys)4, MALP-2, FSL-1, Hib-OMPC y similares.

[0036] Los ejemplos de agonista del TLR3 incluyen ARN bicatenario, análogos de ARN bicatenario tales como ácido poliinosínico-policitidílico (Poli(I:C)).

[0037] Los ejemplos de agonista del TLR4 incluyen diversos lipopolisacáridos, proteínas de choque térmico, fibrinógeno, sulfato de heparina, ácido hialurónico y fragmentos funcionales o análogos de los mismos, fosfatos de aminoalquilglucosamínidos (AGP), monofosforil lípido A (MPLA), RC-529 y similares.

[0038] Se sabe que el TLR5 se expresa específicamente en células positivas para CD11c en la lámina propia de la mucosa del intestino delgado y reconoce la flagelina sobre bacterias patógenas para inducir la respuesta inmunitaria. Los ejemplos de agonista del TLR5 incluyen flagelina recombinante, CBLB502 y similares.

[0039] Los ejemplos de agonista del TLR6 incluyen diversos diacil-lipopéptidos, fragmentos funcionales o análogos de los mismos, FSL-1, Pam2Cys y similares.

[0040] El TLR7 reconoce ARN monocatenario procedente de virus y activa el sistema inmunitario innato. Los ejemplos de agonista del TLR7 incluyen imiquimod, R-848, que es un derivado de imiquimod, loxoribina, bropirimina, gardiquimod y similares. El imiquimod, la loxoribina, el gardiquimod y R-848 también se conocen como agonistas del TLR8 humano.

[0041] El TLR9 reconoce el oligodesoxinucleótido CpG (CpG ODN) procedente de bacterias y virus y activa el sistema inmunitario innato en el organismo vivo. El CpG ODN se refiere a un oligodesoxinucleótido sintético corto que contiene el motivo CpG. El CpG ODN se puede usar como agonista del TLR9 en el adyuvante para vacuna, pero no se limita a esto. El CpG ODN que va a ser agonista del TLR9 puede ser diseñado por los expertos en la materia según proceda y también se pueden usar CpG ODN comercializados. Cuando se usa en la presente invención, el CpG ODN puede ser una sal del mismo y puede ser, por ejemplo, una sal sódica. El CpG ODN puede ser un CpG ODN no metilado. Los ejemplos del mismo incluyen CpG-ODN 1668, 2006, 1826, 2395 y similares.

[0042] Entre los agonistas de TLR, desde el punto de vista de tener el efecto según la presente invención con seguridad, se prefieren el agonista del TLR2, el agonista del TLR4, el agonista del TLR5, el agonista del TLR7 y el agonista del t LR9, que pueden presentar respuestas similares en las células, y el agonista del TLR7 y el agonista del TLR9 son más preferidos. El agonista del TLR7 puede ser un agonista del TLR8.

[0043] En un aspecto, la vacuna que contiene adyuvante para uso según la presente invención comprende adyuvante incompleto de Freund además del ligando de dectina-1 y el agonista de TLR. El «adyuvante de Freund» es un adyuvante que forma una emulsión de agua en aceite y, a diferencia del adyuvante completo de Freund, que contiene bacilo de la tuberculosis muerto por calor, tal adyuvante sin bacilo de la tuberculosis muerto por calor se denomina adyuvante incompleto de Freund.

[0044] El adyuvante para vacuna descrito en esta memoria puede contener, siempre y cuando proporcione el efecto según la presente invención, una o más sustancias adyuvantes adicionales distintas del ligando de dectina-1 y el agonista de TLR. Los ejemplos no limitantes de tal sustancia adyuvante incluyen adyuvantes sedimentarios tales como hidróxido de aluminio, hidróxido de sodio, fosfato de aluminio, fosfato de calcio, alúmina, polímero de carboxivinilo, adyuvante completo de Freund, parafina líquida, lanolina, Montanide ISA763AV, Montanide ISA51 y similares.

[0045] El adyuvante para vacuna descrito en esta memoria es preferentemente un adyuvante para administración con al menos un antígeno para que tenga el efecto según la presente invención con mayor seguridad. El antígeno que se va a usar aquí es similar al antígeno que se va a usar en la vacuna como se describe a continuación.

Vacuna

[0046] La vacuna para uso según la presente invención comprende al menos un antígeno además del adyuvante para vacuna, como se define en las reivindicaciones. La vacuna puede ser una composición de vacuna que contiene el adyuvante para vacuna antes mencionado y el antígeno antes mencionado, pero, desde el punto de vista de la estabilidad de la vacuna durante el almacenamiento, el adyuvante para vacuna antes mencionado y el antígeno antes mencionado pueden ser independientes.

[0047] Como se emplea en esta memoria, el término «antígenos» se refiere a un término genérico para sustancias extrañas, o una parte de las mismas, que entran al organismo vivo desde el exterior y causan la respuesta inmunitaria en el organismo vivo. Los antígenos incluyen patógenos exógenos tales como bacterias y virus que causan diversas infecciones, así como alérgenos que causan la reacción alérgica como pólenes, alimentos y similares.

[0048] Los ejemplos no limitantes de los antígenos víricos incluyen uno o más preparados inactivados o atenuados de al menos un virus seleccionado del grupo que consiste en virus de la gripe, norovirus, rotavirus, virus del papiloma humano, virus de la varicela, virus del sarampión, virus de las paperas, virus de la polio, adenovirus, virus del herpes, coronavirus humano, virus de la rubéola, VIH, virus de la viruela, virus del Ébola, virus de la hepatitis, virus de la encefalitis japonesa, parvovirus y virus de la viruela vacuna, o una parte o un componente de los mismos.

[0049] Los ejemplos no limitantes de los antígenos bacterianos incluyen uno o más preparados inactivados o atenuados de al menos una bacteria seleccionada del grupo que consiste en Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Bordetella pertussis, bacilos del tétanos, Corynebacterium diphtheriae, bacilos de la tuberculosis, Escherichia coli, tal como Escherichia coli enterohemorrágica, Vibrio cholerae, salmonela y Staphylococcus aureus resistente a la meticilina, o una parte o un componente de los mismos.

[0050] Los ejemplos no limitantes de los alérgenos incluyen polen (polen de cedro, polen de poáceas, polen de compuestas y similares), hongos, insectos, alimentos (soja, huevo, leche y similares) y fármacos (penicilina y similares).

[0051] La vacuna para uso según la presente invención induce la respuesta inmunitaria de la mucosa, representada por la producción de anticuerpos de IgA específicos del antígeno y la respuesta de Th17, además de la respuesta inmunitaria sistémica representada por la producción de anticuerpos de IgG específicos del antígeno y la respuesta de Th1. Se puede confirmar si se ha inducido o no la respuesta inmunitaria de la mucosa mediante un procedimiento in vitro o in vivo conocido. Por ejemplo, en un procedimiento in vivo, se puede determinar que se ha inducido la respuesta inmunitaria de la mucosa si se mide la cantidad de anticuerpos de IgA específicos del antígeno en el suero o en las heces mediante ELISA o similares y la cantidad de los anticuerpos ha aumentado. Asimismo, en un procedimiento in vitro, se puede determinar que se ha inducido la respuesta inmunitaria de la mucosa si, por ejemplo, se cultivan células productoras de anticuerpos de IgA, tales como células de la placa de Peyer, se mide la cantidad de anticuerpos de IgA específicos del antígeno contenidos en el sobrenadante del cultivo mediante ELISA o similares y la cantidad de los anticuerpos ha aumentado.

[0052] También se puede confirmar si se ha inducido o no la respuesta inmunitaria sistémica mediante un procedimiento in vitro o in vivo conocido. Por ejemplo, en un procedimiento in vivo, se puede determinar que se ha inducido la respuesta inmunitaria sistémica si se mide la cantidad de anticuerpos de IgG específicos del antígeno en el suero mediante ELISA o similares y la cantidad de los anticuerpos ha aumentado.

[0053] La vacuna para uso según la presente invención se administra mediante inyección intramuscular. La respuesta de Th1 sistémica y la producción de anticuerpos de IgG se inducen más eficazmente administrando la vacuna mediante administración intramuscular. Como se emplea en esta memoria, administración intramusculares un concepto que abarca términos tales como inyección intramuscular, inyección i.m., administración mediante inyección intramuscular e inmunización mediante inyección intramuscular.

[0054] Como se ilustra en los Ejemplos que se describen más adelante, después de la administración de la vacuna según la presente invención, la producción de anticuerpos de IgG específicos del antígeno se prolonga durante un periodo de tiempo largo (al menos 10 semanas) y la producción de anticuerpos de IgA específicos del antígeno se prolonga hasta un nivel que alcanza su máximo de 2 a 3 semanas después de la administración. Asimismo, los presentes inventores encontraron que la producción de un título muy alto de anticuerpos de IgA específicos del antígeno se puede mantener adicionalmente durante aproximadamente 3 meses realizando la inmunización de refuerzo que implica administrar solo el antígeno sobre la superficie de la membrana mucosa un cierto periodo de tiempo después de la administración de la vacuna y que la producción de anticuerpos de IgA específicos del antígeno se puede restaurar repetidamente y mantener repitiendo la inmunización de refuerzo que implica administrar al menos el antígeno sobre diversas superficies de la membrana mucosa. También encontraron que se puede inducir la respuesta fuerte de Th17 específicos del antígeno sobre la superficie de la membrana mucosa mediante la administración del antígeno en la inmunización de refuerzo.

[0055] En la presente invención, el uso de una combinación de un ligando de dectina-1 y un agonista de TLR en las células dendríticas como adyuvante induce la respuesta de Th1 sistémica y la producción de anticuerpos de IgG, así como la respuesta de Th17 en la membrana mucosa y la producción de anticuerpos de IgA, y la inmunización de refuerzo por una vía de administración seleccionada puede volver a inducir la respuesta de Th17 y la producción de anticuerpos de IgA en una membrana mucosa deseada, tal como la del tracto intestinal y las vías respiratorias, y se puede impedir eficazmente tanto de la entrada del patógeno como el agravamiento de la enfermedad.

[0056] Como se emplea en esta memoria, la «inmunización de refuerzo que implica administrar un antígeno» puede implicar administrar el antígeno en cualquier modo siempre y cuando sea posible restaurar y mantener la producción de anticuerpos de IgA, y los ejemplos del modo de administración incluyen modos de administración que implican la aplicación directa sobre las membranas mucosas, tales como la administración por vía oral, administración por vía intranasal, administración por vía transmucosa, administración por vía transvaginal, administración por vía oftálmica o administración por vía intrarrectal. La respuesta de Th17 y la producción de anticuerpos de IgA se pueden inducir más eficazmente sobre la membrana mucosa deseada, tal como la del tracto intestinal y las vías respiratorias, mediante la administración en un modo de administración que implica la aplicación directa sobre la membrana mucosa y se puede administrar al sujeto más fácilmente mediante administración por vía oral.

[0057] En la inmunización de refuerzo que implica administrar un antígeno, el antígeno se puede administrar sin usar ningún adyuvante o el antígeno se puede administrar con uno o más adyuvantes.

[0058] Por ejemplo, se ha confirmado, como ilustran los Ejemplos que se describen más adelante, que se puede inducir la producción de IgA específica del antígeno en el pulmón realizando la inmunización de refuerzo mediante administración intranasal y la producción de IgA específica del antígeno en el tracto gastrointestinal se induce realizando la inmunización de refuerzo mediante administración por vía oral. Además, se considera que la vacuna para el virus del papiloma humano, que causa cáncer del cuello uterino, se administrará mediante administración transvaginal para impedir la infección.

[0059] El tiempo transcurrido desde la administración de la vacuna hasta la inmunización de refuerzo que implica administrar solo el antígeno no está particularmente limitado y su duración puede ser, por ejemplo, 3 semanas, 2 a 3 meses, 1 año, varios años o similares. Si la vacuna se administra una vez, entonces la inmunización de refuerzo se puede realizar posteriormente en cualquier momento, cuando se desee inducir la respuesta inmunitaria de la mucosa.

[0060] Por ejemplo, cuando se usa el virus de la gripe como antígeno, la propia infección del virus de la gripe puede ser inhibida por la inmunidad de la mucosa administrando previamente una vacuna que contiene varios antígenos y realizando la inmunización de refuerzo, antes de la época en la que la gripe es prevalente cada año, con un antígeno que se espera que sea prevalente en ese año.

Procedimiento para inducir inmunidad

[0061] Un procedimiento para inducir inmunidad comprende una etapa de administrar la vacuna descrita en esta memoria. Asimismo, un procedimiento para inducir inmunidad comprende además una etapa de administrar un antígeno, un cierto periodo de tiempo después de la etapa de administrar una vacuna, para realizar al menos una vez la inmunización de refuerzo.

Procedimiento de prevención

[0062] La presente invención abarca una vacuna para uso en un procedimiento para impedir una infección vírica o una infección bacteriana induciendo una respuesta inmunitaria de la mucosa; donde la vacuna se administra mediante inyección intramuscular; y donde la vacuna comprende al menos un antígeno obtenido de un virus o una bacteria y un adyuvante para vacuna que comprende un ligando de dectina-1 y un agonista de TLR. Asimismo, la presente invención también abarca una vacuna para uso en un procedimiento para impedir una infección vírica o bacteriana como se define en las reivindicaciones, donde el procedimiento comprende además una etapa de administrar un antígeno, un cierto periodo de tiempo después de la etapa de administrar una vacuna, para realizar la inmunización de refuerzo.

[0063] El «procedimiento de prevención» significa un procedimiento para impedir una infección o una reacción alérgica causadas por un antígeno antes de su aparición.

Procedimiento de tratamiento

[0064] Como se emplea en esta memoria, el término «vacuna» se refiere a un preparado farmacéutico usado para la prevención de una infección y que contiene un antígeno desactivado o atenuado. La vacuna puede inducir la respuesta inmunitaria cuando se administra a un animal, tal como un ser humano, e impedir la infección con el antígeno contenido en la vacuna y el agravamiento de la infección después de la inducción.

[0065] La presente invención también abarca una vacuna para uso en un procedimiento para tratar una infección vírica o una infección bacteriana como se define en las reivindicaciones, que comprende una etapa de administrar un inductor de inmunidad que comprende un ligando de dectina-1 y un agonista de TLR a un sujeto infectado por una infección vírica o bacteriana. Asimismo, la presente invención también abarca una vacuna para uso en un procedimiento para tratar una infección vírica o bacteriana como se define en las reivindicaciones, donde el procedimiento comprende además una etapa de administrar un antígeno, un cierto periodo de tiempo después de la etapa de administrar un inductor de inmunidad, para realizar la inmunización de refuerzo.

[0066] El «procedimiento de tratamiento» significa un procedimiento para tratar una infección o una reacción alérgica causadas por un antígeno después de su aparición.

[0067] En el procedimiento para inducir inmunidad descrito anteriormente y la vacuna para uso en un procedimiento para la prevención o el tratamiento como se define en las reivindicaciones, la vacuna se administra mediante inyección intramuscular. Administrando la vacuna mediante inyección intramuscular, se induce la respuesta de Th1 sistémica y la producción de anticuerpos de IgG más eficazmente.

[0068] En el procedimiento para inducir inmunidad descrito anteriormente y la vacuna para uso en un procedimiento para la prevención o el tratamiento como se define en las reivindicaciones, «después de un cierto periodo de tiempo» puede ser en cualquier momento después de la desaparición de la inducción de la producción de anticuerpos de IgA mediante la administración de la primera vacuna. Por ejemplo, puede ser 3 semanas, de 2 a 3 meses, 1 año o varios años después de la administración de la vacuna, y la inmunización de refuerzo se puede realizar cuando se desee inducir la respuesta inmunitaria de la mucosa.

[0069] En el procedimiento para inducir inmunidad descrito anteriormente y la vacuna para uso en un procedimiento para la prevención o el tratamiento como se define en las reivindicaciones, la etapa de administrar un antígeno para realizar al menos una vez la inmunización de refuerzo puede ser administrar el antígeno en cualquier modo, siempre y cuando sea posible restaurar y mantener la producción de anticuerpos de IgA, y los ejemplos del modo de administración incluyen modos de administración que implican la aplicación directa sobre las membranas mucosas, tales como la administración por vía oral, administración por vía intranasal, administración por vía transmucosa, administración por vía transvaginal, administración por vía oftálmica, administración por vía intrarrectal o similares. La respuesta de Th17 y la producción de anticuerpos de IgA se pueden inducir más eficazmente sobre la membrana mucosa deseada, tal como la del tracto intestinal y las vías respiratorias, mediante la administración en un modo de administración que implica la aplicación directa sobre la membrana mucosa y se puede administrar al sujeto más fácilmente mediante administración por vía oral.

[0070] En la etapa de administrar un antígeno para realizar al menos una vez la inmunización de refuerzo, el antígeno se puede administrar o el antígeno se puede administrar con un adyuvante.

Ejemplos

[0071] La presente invención se describirá específicamente a continuación en base a Ejemplos, pero la presente invención no se limita a esto.

1. Inducción de IgA por células dendríticas clásicas («CDc del bazo») obtenidas del bazo estimuladas con GM-CSF

[0072] Se estimularon CDc del bazo durante 24 horas usando ovoalbúmina (OVA; 100 |jg/ml) como antígeno y CpG ODN 1668 (1 jg/ml) solo o la combinación de CpG ODN y GM-CSF (10 ng/ml) como adyuvante.

[0073] Aquí, el fraccionamiento de las células de la lámina propia de la mucosa de intestino delgado murino con el marcador de células dendríticas CD11c y el marcador de macrófagos CD11b produce los 4 grupos: R1 (células dendríticas) (CD11c alto CD11b bajo), R2 (células dendríticas) (CD11c alto CD11b alto), R3 (macrófagos) (cD11c int CD11b int), R4 (acidófilos) (CD11c int CD11b alto). Las células dendríticas R2 expresan específicamente Raldh2 e inducen la respuesta de Th17 y la producción de IgA (Bibliografía no de patentes 1). Por lo tanto, las células dendríticas R2 se estimularon con OVA (100 jg/ml) y CpG ODN 1668 (1 jg/ml) como control positivo. Se estimularon CDc del bazo con OVA (100 jg/ml) y CpG ODN 1668 (1 jg/ml), con o sin GM-CSF (10 ng/ml).

[0074] El Día 0 y el Día 14 después de la estimulación, se administraron por vía intraperitoneal células dendríticas (cada día 5 x 104 células) (o PBS) que absorbieron el antígeno por vía intraperitoneal a ratones CD57BL/6. Del Día 21 al Día 25, se administró 1 mg/ratón de OVA por vía oral diariamente y, el Día 32, se midió el total de IgG específica del antígeno en el suero e IgA específica del antígeno en las heces mediante ELISA.

[0075] El resumen y los resultados del experimento se ilustran en la Figura 1. La estimulación de CDc del bazo (SPDC en la figura) con OVA y solo CpG ODN indujo poca producción de IgA, pero la adición de GM-CSF (SPDC GM-CSF en la figura), que se sabe que induce la expresión de Raldh2, indujo la producción de IgA más de lo que lo hicieron las células dendríticas R2 (LPDC en la figura).

2. Inducción de la expresión de Raldh2 en CDc del bazo por glucano

[0076] A continuación, se usaron cimosano (componente de la pared celular de la levadura de Saccharomyces cerevisiae; 25 ng/ml) y curdlano (p-1,3-glucano obtenido de Agrobacterium spp., Alcaligenes spp.; 25 ng/ml) como compuesto a base de glucano. Se estimularon CDc del bazo con estas sustancias durante 24 horas y, después de recoger el ARN, se midió la expresión de ARNm de Raldh2 mediante RT-PCR.

[0077] El resumen y los resultados del experimento se ilustran en la Figura 2. El curdlano y el cimosano indujeron la expresión de Raldh2 en CDc del bazo igual que el GM-CSF.

3. Inducción de IgA específica del tracto gastrointestinal mediante inmunización (inyección intramuscular) con CpG ODN curdlano

[0078] Se administraron 200 jl/ratón de una emulsión de IFA, en la que se añadió OVA (500 jg/ml) como antígeno y CpG ODN 1668 (5 jg/ml) y/o curdlano (5 mg/ml) como adyuvante al adyuvante incompleto de Freund (IFA), mediante inyección intramuscular a los ratones. Posteriormente, se recogieron los sueros y las heces a lo largo del tiempo (una vez a la semana) y se midió el total de IgG específica del antígeno (OVA) en el suero e IgA específica del antígeno en las heces mediante ELISA.

[0079] El resumen y los resultados del experimento se ilustran en la Figura 3. Usando cualquiera de los adyuvantes, aparte del control que no contenía OVA, se indujo IgG específica del antígeno y este estado se prolongó durante al menos 7 semanas. En cambio, solo se indujo IgA cuando se administró tanto CpG ODN como curdlano.

4. Inducción de IgA específica de la toxina del cólera (TC) mediante inmunización (inyección intramuscular) con CpG ODN curdlano

[0080] A continuación, se realizó un experimento similar a 3. usando TC (1 jg/ratón) como antígeno. 3 semanas después de la inmunización mediante inyección intramuscular, se midió el total de IgG específica del antígeno en el suero e IgA específica del antígeno en las heces mediante ELISA.

[0081] El resumen y los resultados del experimento se ilustran en la Figura 4. Como se ilustra en el gráfico izquierdo de la figura, se indujo IgG a niveles iguales con IFA más TC y con estos con CpG ODN y curdlano añadidos. En cambio, se indujo IgA a un nivel notablemente superior que con IFA más TC cuando se añadieron CpG ODN y curdlano.

5. Mejora de la diarrea causada por TC mediante inmunización (inyección intramuscular) con CpG ODN curdlano

[0082] Después del experimento de 4., se administraron 20 |jg de TC por vía oral a ratones y se examinaron los síntomas de la diarrea. El resumen y los resultados del experimento se ilustran en la Figura 5. En el intestino normal, se encontraron heces sólidas y el apéndice también era pequeño. Sin embargo, con la administración de IFA solo o de IFA más TC solo, se observaron heces líquidas y el agrandamiento del apéndice. En cambio, en los ratones a los que se administró IFA, TC, CpG ODN y curdlano, se encontraron heces sólidas y ausencia de agrandamiento del apéndice.

6. Efecto de la inmunización de refuerzo solo con antígeno después de la inmunización (inyección intramuscular) con CpG ODN curdlano (1)

[0083] Después de la inmunización de los ratones mediante inyección intramuscular con IFA, al que se añadió OVA y CpG ODN y/o curdlano o ninguno de ellos, el Día 42, se administró por vía oral una única dosis de 1 mg/ratón de ^o V^a para realizar la inmunización de refuerzo y, el día de la administración por vía oral y 1 semana después, se midió la IgA específica del antígeno en las heces mediante ELISA y se midieron las células productoras de IgA específica del antígeno mediante ELISpot.

[0084] El resumen y los resultados del experimento se ilustran en la Figura 6. En todos los casos, se indujo la producción de IgG y el efecto se mantuvo antes y después de la inmunización de refuerzo. Sin embargo, apenas se detectó IgA el día de la administración por vía oral de OVA, pero 1 semana después de la inmunización de refuerzo, se indujo la producción de IgA específica del antígeno a un nivel notablemente superior cuando el adyuvante contenía tanto CpG ODN como curdlano, en comparación con el nivel cuando se usaron otros adyuvantes. También aumentaron notablemente las células productoras de IgA específica del antígeno cuando contenía tanto CpG ODN como curdlano, en comparación con los niveles obtenidos cuando se usaron otros adyuvantes.

7. Efecto de la inmunización de refuerzo solo con antígeno después de la inmunización (inyección intramuscular) con CpG ODN curdlano (2)

[0085] Después de realizar un experimento similar a 6., se midió el total de IgG específica del antígeno en el suero e IgA específica del antígeno en las heces a lo largo del tiempo durante un periodo de tiempo más prolongado. El resumen y los resultados del experimento se ilustran en la Figura 7. La cantidad de IgG específica del antígeno apenas disminuyó durante las 13 semanas posteriores a la inmunización de refuerzo y, en la 13.a semana, la ligera reducción se recuperó hasta el nivel original mediante la segunda inmunización de refuerzo. Sin embargo, la cantidad de IgA específica del antígeno en las heces disminuyó gradualmente y fue casi cero en la 13.a semana. Pero, en la 13.a semana, se recuperó notablemente mediante la segunda inmunización de refuerzo con la administración por vía oral de una única dosis de 1 mg/ratón de OVA.

8. Efecto de la inmunización de refuerzo solo con antígeno después de la inmunización (inyección intramuscular) con CpG ODN curdlano (3)

[0086] 7 días después de realizar un experimento similar a 6. y la inmunización de refuerzo mediante administración por vía oral de OVA, se extrajeron células del bazo y de la lámina propia de la mucosa intestinal, se cultivaron en presencia del antígeno (OVA 100 jg/ml) y, 4 días después, se midió la producción de IFN-y, IL-4 e IL-17 mediante ELISA.

[0087] El resumen y los resultados del experimento se ilustran en la Figura 8. Como se ilustra, se confirmó que, cuando el adyuvante contenía curdlano y CpG ODN, se inducía la producción de IFN-^y e IL-17 en las células de la lámina propia de la mucosa intestinal y que, mediante la inmunización de refuerzo por administración por vía oral de OVA, se inducían las respuestas de Th1 y Th17 en el tracto gastrointestinal. Sin embargo, no se indujo la producción de IL-4 y se consideró que no se inducía la respuesta de Th2.

9. Efecto de la inmunización de refuerzo solo con antígeno después de la inmunización (inyección intramuscular) con CpG ODN curdlano (4)

[0088] Se administró IFA, IFA OVA CpG ODN, IFA OVA curdlano e IFA OVA CpG ODN curdlano a ratones mediante inyección intramuscular, respectivamente. El Día 35, se administró 1 jg/ratón de OVA mediante administración intranasal para realizar la inmunización de refuerzo y, 7 días después, se midió el total de IgG específica del antígeno en el suero e IgA específica del antígeno en el líquido del lavado broncoalveolar mediante ELISA.

[0089] El resumen y los resultados del experimento se ilustran en la Figura 9. Se confirmó que, cuando el adyuvante contiene tanto CpG como curdlano, se puede inducir la producción de IgA específica del antígeno en los pulmones mediante la inmunización de refuerzo por administración intranasal de OVA.

10. Efecto de la inmunización de refuerzo solo con antígeno después de la inmunización (inyección intramuscular) con CpG ODN curdlano (5)

[0090] En el experimento de 9., 7 días después de la administración intranasal de OVA, se extrajeron células de la lámina propia de la mucosa pulmonar de los ratones, se cultivaron en presencia del antígeno (OVA 100 |jg/ml) durante 4 días y se midió la producción de IFN-y, IL-4 e IL-17 mediante ELISA.

[0091] El resumen y los resultados del experimento se ilustran en la Figura 10. Se confirmó que, cuando el adyuvante contiene al menos uno de CpG ODN y curdlano, se induce la producción de IFN-y y se induce la respuesta de Th1 en el pulmón. Sin embargo, se confirmó que la producción de IL-17 se induce a un nivel notablemente superior cuando el adyuvante contiene tanto CpG ODN como curdlano y que la respuesta de Th17 se induce fuertemente cuando se usa esta combinación como adyuvante. Sin embargo, no se indujo la producción de IL-4 y se consideró que no se inducía la respuesta de Th2 (datos no mostrados).

11. Efecto de la inmunización de refuerzo solo con antígeno después de la inmunización (inyección intramuscular) con CpG ODN curdlano (6)

[0092] Se añadió solo OVA, OVA y CpG ODN, OVA y curdlano, u OVA y CpG ODN y curdlano al IFA y cada una de estas combinaciones se administró a ratones mediante inyección intramuscular (Día 0). El Día 35, se administraron 2 mg por ratón de medroxiprogesterona por vía subcutánea. El Día 42, se administraron 100 jg por ratón de OVA por vía intravaginal y se midió la IgA específica del antígeno en el líquido del lavado vaginal mediante ELISA 1 semana después.

[0093] El resultado del experimento se ilustra en la Figura 11. Se confirmó que, cuando el adyuvante contiene tanto CpG como curdlano, se puede inducir la producción de IgA específica del antígeno en la vagina mediante la inmunización de refuerzo por administración intravaginal de OVA.

12. Mejora de la expresión de dectina-1 en CDc del bazo mediante estimulación con CpG ODN

[0094] A continuación, se midió la expresión de dectina-1, que es un receptor que reconoce el p-1,3-glucano, en células dendríticas. El resumen y el resultado del experimento se ilustran en la Figura 12. Como se ilustra en el gráfico izquierdo de la figura, se confirmó que, en las células dendríticas obtenidas del bazo, la expresión de dectina-1 no es alta, pero la expresión de dectina-1 aumenta más de 3 veces estimulando las células con CpG ODN. Se sabe que la dectina-1 induce la respuesta de Th17. Esto indica el mecanismo de la presente invención, en la que la adición de tanto CpG ODN como p-1,3-glucano al adyuvante facilita que las células dendríticas reciban la estimulación con p-1,3-glucano e induce la respuesta de Th17.

13. Efecto de la inmunización (inyección intramuscular) con R-848 curdlano y la inmunización de refuerzo con antígeno

[0095] Se administró IFA, IFA OVA R-848 (100 jg/ratón) o IFA OVA R-848 curdlano por vía intramuscular a ratones. 28 días después, se administró una única dosis de 1 mg/ratón de OVA por vía oral para proporcionar la inmunización de refuerzo y se midió el total de IgG específica del antígeno en el suero e IgA específica del antígeno en las heces mediante ELISA a lo largo del tiempo. R-848 es un agonista del TLR7/8.

[0096] El resumen y los resultados del experimento se ilustran en la Figura 13. En todos los casos, se indujo la producción de IgG específica del antígeno y el efecto se prolongó hasta la 5.a semana. Sin embargo, la producción de IgA alcanzó un máximo en la 3.a semana posterior a la inyección intramuscular y a continuación disminuyó, pero la inmunización de refuerzo en la 4.a semana indujo la producción de IgA a un nivel considerablemente superior al del primer máximo.

14. Inducción de IgA específica del tracto gastrointestinal mediante inmunización (inyección intramuscular) con CpG ODN lentinano

[0097] Se administraron 200 jl/ratón de una emulsión de IFA, en la que se añadió OVA (500 jg/ml) como antígeno y CpG ODN 1668 (5 jg/ml) y/o lentinano (5 mg/ml) como adyuvante al IFA, mediante inyección intramuscular a los ratones. Posteriormente, se recogieron los sueros y las heces a lo largo del tiempo y se midió el total de IgG específica del antígeno en el suero y de IgA específica del antígeno en las heces mediante ELISA.

[0098] El resumen y los resultados del experimento se ilustran en la Figura 14. Usando cualquiera de los adyuvantes, aparte del control que no contenía OVA, se indujo IgG específica del antígeno y este estado se prolongó durante al menos 5 semanas. Sin embargo, solo se indujo IgA cuando el adyuvante contenía tanto CpG ODN como lentinano y esta inducción desapareció rápidamente después de haber alcanzado un máximo en la 3.a semana. 15. Efecto de la inmunización de refuerzo solo con antígeno después de la inmunización (inyección intramuscular) con CpG ODN lentinano (1)

[0099] Después de la inmunización de los ratones mediante inyección intramuscular con IFA, al que se añadió OVA y CpG ODN y/o lentinano o ninguno de ellos, el Día 42, se administró por vía oral una única dosis de 1 mg/ratón de o Va para realizar la inmunización de refuerzo y, el día de la administración por vía oral y 1 semana después, se midió la IgA específica del antígeno en las heces mediante ELISA y se midieron las células productoras de IgA específica del antígeno mediante ELISpot.

[0100] El resumen y los resultados del experimento se ilustran en la Figura 15. En todos los casos, se indujo la producción de IgG y el efecto se mantuvo antes y después de la inmunización de refuerzo. Sin embargo, apenas se detectó IgA el día de la administración por vía oral de OVA, pero 1 semana después de la inmunización de refuerzo, se indujo la producción de IgA específica del antígeno a un nivel notablemente superior cuando el adyuvante contenía tanto CpG ODN como lentinano, en comparación con el nivel obtenido cuando se usaron otros adyuvantes. También aumentaron notablemente las células productoras de IgA específica del antígeno cuando contenía tanto CpG ODN como lentinano, en comparación con los niveles obtenidos cuando se usaron otros adyuvantes.

16. Efecto de la inmunización de refuerzo solo con antígeno después de la inmunización (inyección intramuscular) con CpG ODN lentinano (2)

[0101] Se realizó un experimento similar a 15. El Día 7 después de la inmunización de refuerzo mediante administración por vía oral de OVA, se extrajeron células del bazo y de la lámina propia de la mucosa intestinal de los ratones, se cultivaron en presencia del antígeno (OVA 100 pg/ml) y, 4 días después, se midió la producción de IFN-y, IL-4 e IL-17 mediante ELISA.

[0102] El resumen y los resultados del experimento se ilustran en la Figura 16. Como se ilustra, se confirmó que, cuando el adyuvante contiene lentinano y CpG ODN, se induce la producción de IFN-^y e IL-17 en las células de la lámina propia de la mucosa intestinal y que, mediante la inmunización de refuerzo por administración por vía oral de OVA, se inducen las respuestas de Th1 y Th17 en el tracto gastrointestinal. En ninguno de los tejidos se indujo la producción de IL-4 y se consideró que no se inducía la respuesta de Th2.

17. Inducción de IgA específica del tracto gastrointestinal mediante inmunización (inyección intramuscular) con CpG ODN curdlano en ratones deficientes en dectina-1

[0103] Se administraron 200 pl/ratón de una emulsión de IFA, en la que se añadió OVA (500 pg/ml) como antígeno y CpG ODN 1668 (5 pg/ml) y curdlano (5 mg/ml) como adyuvante al IFA, a ratones heterodeficientes en dectina-1 (Clec7a /-) y ratones homodeficientes en dectina-1 (Clec7a -/-) mediante inyección intramuscular. 3 semanas después, se recogieron los sueros y las heces y se midió el total de IgG específica del antígeno en el suero e IgA específica del antígeno en las heces mediante ELISA.

[0104] El resumen y los resultados del experimento se ilustran en la Figura 17. Se indujo IgG específica del antígeno tanto en los ratones heterodeficientes en dectina-1 como en los ratones homodeficientes en dectina-1. Sin embargo, no se detectó IgA en los ratones homodeficientes en dectina-1, pero sí se detectó en los ratones heterodeficientes en dectina-1.

18. Efecto de la inmunización de refuerzo solo con antígeno después de la inmunización (inyección intramuscular) con CpG ODN curdlano en ratones deficientes en dectina-1 (1)

[0105] Después de la inmunización de ratones heterodeficientes en dectina-1 y ratones homodeficientes en dectina-1 con IFA, al que se añadió OVA, CpG ODN y curdlano, mediante inyección intramuscular, el Día 42, se administró por vía oral una única dosis de 1 mg/ratón de OVA para realizar la inmunización de refuerzo y, el día de la administración por vía oral y 1 semana después, se midió la IgA específica del antígeno en las heces mediante ELISA.

[0106] El resumen y los resultados del experimento se ilustran en la Figura 18. En ambos tipos de ratones, se indujo la producción de IgG y el efecto se mantuvo antes y después de la inmunización de refuerzo. Sin embargo, apenas se detectó IgA en ninguno de los ratones el día de la administración por vía oral de OVA, pero 1 semana después de la inmunización de refuerzo, mientras que la producción de IgA específica del antígeno en los ratones heterodeficientes en dectina-1 se indujo a un nivel notablemente alto, la inducción de la producción de IgA en los ratones homodeficientes en dectina-1 fue notablemente reducida.

19. Efecto de la inmunización de refuerzo solo con antígeno después de la inmunización (inyección intramuscular) con CpG ODN curdlano en ratones deficientes en dectina-1 (2)

[0107] Se realizó un experimento similar a 18. El Día 7 después de la inmunización de refuerzo mediante administración por vía oral de OVA, se extrajeron células del bazo y de la lámina propia de la mucosa intestinal de los ratones, se cultivaron en presencia del antígeno (OVA 100 pg/ml) y, 4 días después, se midió la producción de IFN-y, IL-4 e IL-17 mediante ELISA.

[0108] El resumen y los resultados del experimento se ilustran en la Figura 19. Como se ilustra, se confirmó que, en los ratones heterodeficientes en dectina-1, se indujo la producción de IFN-y e IL-17en las células de la lámina propia de la mucosa intestinal y que, mediante la inmunización de refuerzo por administración por vía oral de OVA, se indujeron las respuestas de Th1 y Th17 en el tracto gastrointestinal. Sin embargo, la producción de IFN-^y e IL-17 fue notablemente reducida en los ratones homodeficientes en dectina-1. En ninguno de los tejidos se indujo la producción de IL-4 y se consideró que no se inducía la respuesta de Th2.

Aplicación Industrial

[0109] La vacuna que contiene adyuvante para uso según la presente invención es útil en la industria como una vacuna contra diversas infecciones causadas por patógenos exógenos, tales como bacterias y virus, así como contra reacciones alérgicas causadas por el polen y alimentos como alérgeno.

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Vacuna para uso en la prevención de una infección, el tratamiento de una infección o la prevención de una reacción alérgica en un sujeto induciendo una respuesta inmunitaria de la mucosa, en la que la vacuna se administra mediante inyección intramuscular y comprende:

al menos un antígeno y

un adyuvante para vacuna que comprende:

(i) un ligando de dectina-1 y

(ii) un agonista de TLR.

2. Vacuna para uso según la reivindicación 1, en la que el al menos un antígeno es un virus inactivado o atenuado o una parte del mismo o un componente del mismo, una bacteria inactivada o atenuada o una parte de la misma o un componente de la misma, o un alérgeno.

3. Vacuna para uso según la reivindicación 1, en la que la infección es una infección vírica o una infección bacteriana y donde el al menos un antígeno se deriva de un virus o una bacteria.

4. Vacuna para uso según la reivindicación 3, en la que el al menos un antígeno es un virus inactivado o atenuado o una parte del mismo o un componente del mismo, o una bacteria inactivada o atenuada o una parte de la misma o un componente de la misma.

5. Vacuna para uso según cualquiera de las reivindicaciones 2-4, en la que el al menos un antígeno es una bacteria de Streptococcus pneumoniae inactivada o atenuada, o una parte o un componente de la misma.

6. Vacuna para uso según cualquiera de las reivindicaciones 2-4, en la que el al menos un antígeno es un norovirus o rotavirus inactivado o atenuado, o una parte o un componente del mismo.

7. Vacuna para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que el ligando de dectina-1 es un inductor de la expresión de un gen Raldh2; tal como el factor estimulante de colonias de granulocitos y monocitos (GM-CSF) o un compuesto a base de glucano.

8. Vacuna para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que comprende además un adyuvante incompleto de Freund.

9. Vacuna para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en la que la vacuna induce la producción de IgA específica del antígeno; tal como donde la vacuna induce la producción de IgA específica del antígeno y la producción de IgG específica del antígeno.

10. Vacuna para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en la que la vacuna se usa en un procedimiento que comprende administrar la vacuna y a continuación realizar al menos una inmunización de refuerzo que implica administrar un antígeno un cierto periodo de tiempo después de la administración de la vacuna.

11. Vacuna para uso según la reivindicación 10, en la que la inmunización de refuerzo se realiza administrando un antígeno mediante administración por vía oral, intranasal, transmucosa, transvaginal, oftálmica o intrarrectal; y/o en la que la inmunización de refuerzo se realiza administrando un antígeno sin usar ningún adyuvante.