KR20160055861A - 암치료에서 면역반응을 유도하기 위한 탄수화물 백신의 조성물 - Google Patents

암치료에서 면역반응을 유도하기 위한 탄수화물 백신의 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 Globo H-KLH 접합체 및/또는 치료학적 항체를 포함하는 치료학적 조성물뿐만 아니라, 암과 같은 증식성 질병을 치료하기 위한 그의 제조 및 사용 방법을 포함한다. 상기 치료학적 접합체는 담체에 결합된 항원을 포함한다. 특히 상기 치료학적 접합체는 Globo H 부분 및 KLH 부분 및/또는 링커를 통해 임의로 결합된 유도체화된 KLH 부분 서브유닛을 포함한다. 상기 치료학적 조성물은 부분적으로, 손상된 세포 또는 이상 세포, 예를 들어 암세포에 의해 부과된 위험으로부터 면역계를 통해 자신을 보호하는 신체의 고유 능력을 증대시키기 위한 암 백신으로서 작용하는 것으로 구상된다. 유효 면역 반응은 비제한적으로 질병의 예방, 질병 개시의 지연, 증상의 감소된 중증도, 감소된 이환율 및 지연된 사망률을 포함하여, 질병의 중증도를 감소시키는 것이다.

Description

면역반응을 유도하기 위한 탄수화물 백신의 조성물 및 암 치료에서 그의 사용법{COMPOSITIONS OF A CARBOHYDRATE VACCINE FOR INDUCING IMMUNE RESPONSES AND USES THEREOF IN CANCER TREATMENT}
본 발명은 일반적으로 암 면역요법을 위한 조성물 및 방법에 관한 것으로, 특히 항암 면역 반응을 유도할 수 있는 면역원성 당접합체를 포함한다.
항체를 유도하기 위한 합성 탄수화물 접합체의 용도는 1929년 괴벨과 에버리에 의해 최초로 입증되었다(Goebel, W. F., and Avery, O. T., J. Exp. Med., 1929, 50, 521; Avery, O. T., and Goebel, W. F., J. Exp. Med., 1929, 50, 533). 탄수화물을 벤젠디아조늄 글리코시드를 통해 담체 단백질에 결합시켰다. 상기 합성 항원에 의한 토끼의 면역화는 다클론 항체를 생성하였다. 다른 연구자들(Allen, P. Z., and Goldstein, I. J., Biochemistry, 1967, 6, 3029; Rude, E., and Delius, M. M., Carbohydr. Res., 1968, 8, 219; Himmelspach, K., et al., Eur. J. Immunol., 1971, 1, 106; Fielder, R. J., et al., J. Immunol., 1970, 105, 265)은 탄수화물을 단백질 담체에 접합시키기 위해 유사한 기법들을 개발하였다.
종양세포 상의 공지된 표적제를 특이적으로 표적화하기 위해서, 백신접종으로부터 생성된 능동 면역요법에 당접합체를 사용할 수 있다. 탄수화물 항원에 대한 반응은 통상적으로, 종양의 신체 거부를 돕는 T-세포의 사용을 위한 협력을 구하지 못한다. 접합체(conjugate)에 의한 백신접종의 결과로서 완전한 종양 거부의 확률이 있을 것 같지 않은 것으로 생각되지만, 상기와 같은 치료는 면역 감시를 증대시킬 것이고, 새로운 종양 콜로니의 재발을 감소시킬 수 있다(Dennis, J., Oxford Glycosystems Glyconews Second, 1992; Lloyd, K. O., in Specific Immunotherapy of Cancer with Vaccines, 1993, New York Academy of Sciences, 50-58). 토요쿠니와 싱할(Toyokuni and Singhal)은 측정 가능한 IgG 역가(IgG 반응이 헬퍼 T 세포의 편입과 일반적으로 관련되기 때문에 중요한 결과이다)를 자극하는 합성 당접합체를 개시하였다(Toyokuni, T., et al., J. Am. Chem. Soc., 1994, 116, 395).
탄수화물 항원 Globo H(Fucα1 → 2 Galβ1 → 3 GalNAcβ1 → 3 Galα1 → 4 Galβ1 → 4 Glc)는 1984년에 하코모리(Hakomori) 등에 의해 유방암 MCF-7 세포로부터 세라미드-결합된 당지질로서 최초로 단리되고 동정되었다(Bremer E G, et al. (1984) J Biol Chem 259:14773-14777). 항-Globo H 단클론 항체에 대한 추가의 연구는 Globo H가 다수의 다른 암, 예를 들어 전립선암, 위암, 췌장암, 폐암, 난소암 및 결장암 상에 존재하고, 면역계에 쉽게 접근할 수 없는 통상적인 분비 조직의 관강 표면 상에서는 단지 최소로 발현됨을 입증하였다(Ragupathi G, et al. (1997) Angew Chem Int Ed 36:125-128). 또한, 유방암 환자의 혈청이 높은 수준의 항-Globo H 항체를 함유하는 것이 확립되었다(Gilewski T et al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98:3270-3275; Huang C-Y, et al. (2006) Proc Natl Acad Sci USA 103:15-20; Wang C-C, et al. (2008) Proc Natl Acad Sci USA 105(33):11661-11666). Globo H-양성 종양이 있는 환자는 Globo H-음성 종양이 있는 환자에 비해 더 짧은 생존을 나타내었다(Chang, Y-J, et al. (2007) Proc Natl Acad Sci USA 104(25):10299-10304). 이러한 발견들은 Globo H, 헥사사카라이드 에피토프를 매력적인 종양 마커, 및 암 백신 개발에 적합한 표적으로 만든다.
합성 Globo H 백신은 면역학적 항원보강제(adjuvant)와 함께 전립선 및 전이성 유방암 환자 모두에게서 주로 IgM 및 보다 적은 정도의 IgG 항체를 유도하는 것으로 나타났다. I기 임상 시험에서, 상기 백신은 또한 백신접종 부위에서 일시적인 국소 피부 반응을 갖는 최소의 독성을 나타내었다(Gilewski T et al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98:3270-3275; Ragupathi G, et al. (1997) Angew Chem Int Ed 36:125-128; Slovin S F et al (1997) Proc Natl Acad Sci USA 96:5710-5715). 상기 환자들 중 일부에서 관찰된 가벼운 독감-유사 증상은 추정상 QS-21의 부작용과 관련이 있다. 말레이미드-변형된 담체 단백질 KLH에 접합된 5개의 전립선 및 유방암 관련 탄수화물 항원, 즉 Globo-H, GM2, STn, TF 및 Tn을 함유하는 5가 백신이 ELISA 분석에서 IgM보다 더 높은 역가의 IgG를 갖는 항-Globo H 혈청을 생산하는 것으로 보고되었다(Zhu J. et al. (2009) J. Am. Chem. Soc. 131(26):9298-9303).
KLH는 조립되어 십량체(10량체), 이십량체(20량체), 및 보다 큰 입자를 형성하는 글리코실화된 폴리펩티드 서브유닛을 함유하는 것으로 공지되어 있다. 상기 다량체 구조들은 해리된 서브유닛의 경우 11 내지 19S 및 상기 20량체 다량체의 경우 92 내지 107S의 침강 계수를 제공하는 초원심분리 기법에 의해 특성화되었다. 다수의 인자들이 KLH를 포함한 연체동물 헤모시아닌의 크기 분포에 영향을 미칠 수 있는 것이 추가로 공지되어 있다. 이들 인자는 이온 강도, pH, 온도, pO2, 및 몇몇 2가 양이온, 특히 칼슘 및 마그네슘의 유효성을 포함한다. 본 발명자들은 다수의 Globo H 부분(moiety)에 결합된 KLH의 이량체 및 삼량체로 주로 구성된, 증가된 효능을 갖는 조성물을 개발하였다.
백신들이 Globo H에 대한 항체 반응을 유도하도록 개발되었지만, 그들의 항암 효능은 Globo H의 낮은 항원성으로 인해 만족스럽지 못하다. Globo H를 표적화하는 높은 수준의 면역 반응을 유도할 수 있는 신규의 백신이 필요하다.
발명의 요약
본 발명은 일반적으로 Globo H를 포함하는 치료학적 및/또는 예방학적 조성물뿐만 아니라, 면역요법, 백신, 투여형, 키트와, 그의 제조 및 치료 방법을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 부분 서브유닛에 결합된 Globo H 부분을 포함하는 단리된 치료학적 접합체를 포함한다. 몇몇 구현예에서, 상기 결합은 공유 결합이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 부분 서브유닛에 공유 결합된 Globo H 부분을 포함하는 단리된 치료학적 접합체를 포함하며, 여기에서 상기 KLH는 유도체화된 KLH이다. 본원에서 사용한 바와 같이, "공유 결합된"이란 용어는 Globo-H 및 KLH에 관하여 언급할 때, Globo-H가 KLH에 직접 공유 결합되거나, 또는 Globo-H가 유도체화된 KLH(본원에서 설명한 바와 같은)에 공유 결합되거나, 또는 Globo-H가 링커기(본원에서 설명한 바와 같은)를 통해 KLH에 공유 결합되거나, 또는 Globo-H가 링커기 및 유도체화된 KLH 모두를 통해 KLH에 공유 결합되는 것을 의미한다.
몇몇 예시적인 구현예에서, 본 발명의 유도체화된 KLH는 하기의 화학식을 갖는다:
Figure pct00001
유도체화된 KLH
또 다른 구현예에서, 본 발명은 링커 분자를 통해 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 부분 서브유닛에 공유 결합된 Globo H 부분을 포함하는 단리된 치료학적 접합체를 포함한다.
바람직한 구현예에서 상기 Globo H 부분은 KLH 부분 서브유닛의 리신 잔기에 결합된다.
하나의 구현예에서, KLH 부분 서브유닛당, Globo H 부분에 이용될 수 있거나 또는 상기에 실제로 직접 또는 간접적으로 결합되는, 총, 정확하게 또는 약 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160개의 총 리신 잔기가 존재한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 4-(4-N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실 히드라지드(MMCCH) 링커기를 통해 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 부분 서브유닛에 공유 결합된 Globo H 부분을 포함하는 단리된 치료학적 접합체를 포함한다. 본 발명의 MMCCH 링커는 하기의 화학식을 갖는다:
Figure pct00002
MMCCH 링커
또 다른 예시적인 구현예에서, 본 발명은 하기의 일반적인 구조를 갖는 단리된 치료학적 접합체를 포함한다:
Figure pct00003
상기 식에서, n은 약 1 내지 약 160의 정수이다. 몇몇 구현예에서, 단량체성 KLH 부분은 약 1 내지 약 160개의 Globo H 부분을 포함할 수 있다. 당해 분야의 통상적인 숙련가는 상기 구조가 이미늄 하이드로클로라이드염으로서 예시되지만, 이민 형태로서 또한 존재하거나 또는 공존할 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 본 발명은 이민뿐만 아니라, 상기 이미늄 하이드로클로라이드염을 포함한 그의 염을 모두 포함한다. 몇몇 구현예에서, 단량체성 KLH 부분은 약 1 내지 약 125개의 Globo H 부분을 포함할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 단량체성 KLH 부분은 약 1 내지 약 100개의 Globo H 부분을 포함할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 단량체성 KLH 부분은 약 1 내지 약 75개의 Globo H 부분을 포함할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 단량체성 KLH 부분은 약 1 내지 약 50개의 Globo H 부분을 포함할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 단량체성 KLH 부분은 약 1 내지 약 25개의 Globo H 부분을 포함할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 단량체성 KLH 부분은 약 1 내지 약 10개의 Globo H 부분을 포함할 수 있다.
몇몇 구현예에서, 상기 Globo H 부분은 상기 KLH 부분에 염기성 아미노산 잔기 상에서 공유적으로 접합된다. 몇몇 구현예에서, 상기 염기성 아미노산 잔기는 아르기닌, 리신, 히스티딘, 또는 이들의 조합이다.
또 다른 구현예에서 상기 Globo H 부분은 단량체성 KLH 부분 서브유닛 상의 리신 접합 부위에 결합된다.
또 다른 구현예에서, Globo H 부분에의 결합에 이용될 수 있거나 또는 상기 부분에 실제로 결합된 각각의 단량체성 KLH 부분 서브유닛 상에 정확하게 또는 약 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109 또는 110개의 리신 접합 부위가 존재한다. 또 다른 구현예에서, 각 KLH 부분 서브유닛 상에 62, 66, 67, 68, 70, 72, 76, 86, 87, 88, 90, 92, 93, 100개의 상기와 같은 리신 접합 부위가 존재한다.
부분 서브유닛들(가령, KLH1 및 KLH2 또는 이들의 변체)의 혼합물을 함유하는 몇몇 치료학적 조성물 구현예에서, 총 이용 가능한 리신(상기 두 서브유닛 모두에 대해서)은 상이한 서브유닛 유형들 전체에 대해 함께 계산되어 정확하게 약 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309 또는 310개일 수 있다. 상기와 같은 구현예에서, 상이한 서브유닛들 전체(가령, KLH1 및 KLH2 또는 이들의 변체)와 함께 정확하게 또는 약 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159 또는 160개의 리신 접합 부위가 존재하거나 존재할 수 있다. 다른 상기와 같은 구현예에서, 136, 137, 141, 140, 143, 147 또는 155개의 리신 접합 부위가 존재한다.
또 다른 예시적인 구현예에서, 본 발명은 하기의 일반적인 구조를 갖는 단리된 치료학적 접합체를 포함한다:
Figure pct00004
상기 식에서, n은 독립적으로 약 1 내지 약 3000의 정수이고 m은 독립적으로 약 1 내지 약 20의 정수이다. 몇몇 구현예에서, m이 1을 초과하는 경우, KLH 부분은 응집되어 다량체 구조를 형성할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 상기 응집은 공유 결합이다. 몇몇 다른 구현예에서, 상기 응집은 공유 결합이 아니다(가령, 상기 응집은 H-결합 또는 소수성 상호작용에 의해 형성된다). 몇몇 구현예에서, 단량체성 KLH 부분(즉, m=1인 경우)은 약 1 내지 약 160개의 Globo H 부분을 포함할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 이량체성 KLH 부분(즉, m=2인 경우)은 약 1 내지 약 300개의 Globo H 부분을 포함할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 삼량체성 KLH 부분(즉, m=3인 경우)은 약 1 내지 약 450개의 Globo H 부분을 포함할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 사량체성 KLH 부분(즉, m=4인 경우)은 약 1 내지 약 600개의 Globo H 부분을 포함할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 오량체성 KLH 부분(즉, m=5인 경우)은 약 1 내지 약 750개의 Globo H 부분을 포함할 수 있다.
또 다른 예시적인 구현예에서, 본 발명은 하기의 일반적인 구조를 갖는 단리된 치료학적 접합체를 포함한다:
Figure pct00005
상기 식에서, n은 독립적으로 약 1 내지 약 150의 정수이고 m은 독립적으로 약 1 내지 약 20의 정수이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 하기의 일반적인 구조를 갖는 단리된 치료학적 접합체를 포함한다:
Figure pct00006
상기 식에서, n은 독립적으로 약 1 내지 약 160의 정수이고 m은 독립적으로 약 1 내지 약 20의 정수이다. 몇몇 구현예에서, m은 약 1 내지 약 5의 정수이다. 몇몇 구현예에서, m은 약 1 내지 약 3의 정수이다. 몇몇 구현예에서, m은 1이다. 몇몇 구현예에서, m은 2이다. 몇몇 구현예에서, m은 3이다. 몇몇 구현예에서, m은 4이다. 몇몇 구현예에서, m은 5이다. 몇몇 구현예에서, m은 6이다. 몇몇 구현예에서, m은 7이다. 몇몇 구현예에서, m은 8이다. 몇몇 구현예에서, m은 9이다. 몇몇 구현예에서, m은 10이다. 몇몇 구현예에서, m은 11이다. 몇몇 구현예에서, m은 12이다. 몇몇 구현예에서, m은 13이다. 몇몇 구현예에서, m은 14이다. 몇몇 구현예에서, m은 15이다. 몇몇 구현예에서, m은 16이다. 몇몇 구현예에서, m은 17이다. 몇몇 구현예에서, m은 18이다. 몇몇 구현예에서, m은 19이다. 몇몇 구현예에서, m은 20이다. 몇몇 구현예에서, 상기 구현예들 중 임의의 구현예의 경우, m은 1 내지 20일 때, n은 각각 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 또는 160이다.
몇몇 구현예에서, 각각의 단량체성 KLH 부분에 결합된 하나 초과의 Globo H 부분이 존재한다. 몇몇 예시적인 구현예에서, 상기 각각의 KLH 부분에 결합된 하나 초과의 Globo H 부분은 링커를 통해 결합된다. 다른 예시적인 구현예에서, 상기 각각의 KLH 부분에 결합된 하나 초과의 Globo H 부분은 링커를 통해 결합되고 유도체화된 KLH 부분에 결합된다.
또 다른 구현예에서, 상기 Globo H 부분 대 KLH 부분 서브유닛의 비는 적어도 1이다. 또 다른 구현예에서, 상기 Globo H 부분 대 KLH 부분 서브유닛의 비는 적어도 10이다. 또 다른 구현예에서, 상기 Globo H 부분 대 KLH 부분 서브유닛의 비는 적어도 25이다. 또 다른 구현예에서, 상기 Globo H 부분 대 KLH 부분 서브유닛의 비는 적어도 50이다. 또 다른 구현예에서, 상기 Globo H 부분 대 KLH 부분 서브유닛의 비는 적어도 100이다. 또 다른 구현예에서, 상기 Globo H 부분 대 KLH 부분 서브유닛의 비는 적어도 150이다. 더욱 또 다른 구현예에서, 상기 Globo H 부분 대 KLH 부분 서브유닛의 비는 적어도 500이다. 더욱 또 다른 구현예에서, 상기 Globo H 부분 대 KLH 부분 서브유닛의 비는 적어도 750이다. 더욱 또 다른 구현예에서, 상기 Globo H 부분 대 KLH 부분 서브유닛의 비는 적어도 1000이다. 더욱 또 다른 구현예에서, 상기 Globo H 부분 대 KLH 부분 서브유닛의 비는 적어도 1500이다. 더욱 또 다른 구현예에서, 상기 Globo H 부분 대 KLH 부분 서브유닛의 비는 적어도 2000이다.
다양한 구현예에서, 본 발명은, 단일의 KLH 단량체 내지, 각각이 결합된 다수의 Globo H 부분을 갖는 다수의 KLH 서브유닛(가령, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20)을 포함한다. 몇몇 구현예에서 상기 Globo H 부분 대 KLH 부분의 비는 동일하다. 다른 구현예에서, 상기 Globo H 부분 대 KLH 부분의 비는 상이하다.
본 발명의 또 다른 구현예는 적어도 2개의 KLH 부분을 포함하는 조성물을 포함한다. 예를 들어, 유도체화된 KLH 부분은 이량체의 형태이다. 또 다른 구현예에서, 상기 적어도 2개의 KLH 부분은 동일하다. 또 다른 구현예에서, 상기 적어도 2개의 KLH 부분은 상이하다. 추가의 구현예에서, 상기 적어도 2개의 KLH 부분은 동일한 Globo H 부분 대 KLH 부분 서브유닛 비를 갖는다. 더욱 추가의 구현예에서, 상기 적어도 2개의 KLH 부분은 상이한 Globo H 부분 대 KLH 부분 서브유닛 비를 갖는다.
본 발명의 또 다른 구현예는 적어도 3개의 KLH 부분, 예를 들어 삼량체 형태의 유도체화된 KLH 부분을 포함하는 치료학적 조성물을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 상기 적어도 3개의 KLH 부분은 동일하다. 또 다른 구현예에서, 상기 적어도 3개의 KLH 부분은 동일하지 않다. 추가의 구현예에서, 상기 적어도 3개의 KLH 부분은 동일한 Globo H 부분 대 KLH 부분 서브유닛 비를 갖는다. 더욱 추가의 구현예에서, 상기 적어도 3개의 KLH 부분은 상이한 Globo H 부분 대 KLH 부분 서브유닛 비를 갖는다.
본 발명의 또 다른 구현예는 적어도 4개의 KLH 부분, 예를 들어 사량체 형태의 유도체화된 KLH 부분을 포함하는 치료학적 조성물을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 상기 적어도 4개의 KLH 부분은 동일하다. 또 다른 구현예에서, 상기 적어도 4개의 KLH 부분은 동일하지 않다. 추가의 구현예에서, 상기 적어도 4개의 KLH 부분은 동일한 Globo H 부분 대 KLH 부분 서브유닛 비를 갖는다. 더욱 추가의 구현예에서, 상기 적어도 4개의 KLH 부분은 상이한 Globo H 부분 대 KLH 부분 서브유닛 비를 갖는다.
본 발명의 또 다른 구현예는 적어도 5개의 KLH 부분, 예를 들어 오량체 형태의 유도체화된 KLH 부분을 포함하는 치료학적 조성물을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 상기 적어도 5개의 KLH 부분은 동일하다. 또 다른 구현예에서, 상기 적어도 5개의 KLH 부분은 동일하지 않다. 추가의 구현예에서, 상기 적어도 5개의 KLH 부분은 동일한 Globo H 부분 대 KLH 부분 서브유닛 비를 갖는다. 더욱 추가의 구현예에서, 상기 적어도 5개의 KLH 부분은 상이한 Globo H 부분 대 KLH 부분 서브유닛 비를 갖는다.
본 발명의 또 다른 구현예는 적어도 6개의 KLH 부분, 예를 들어 육량체 형태의 유도체화된 KLH 부분을 포함하는 치료학적 조성물을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 상기 적어도 6개의 KLH 부분은 동일하다. 또 다른 구현예에서, 상기 적어도 6개의 KLH 부분은 동일하지 않다. 추가의 구현예에서, 상기 적어도 6개의 KLH 부분은 동일한 Globo H 부분 대 KLH 부분 서브유닛 비를 갖는다. 더욱 추가의 구현예에서, 상기 적어도 6개의 KLH 부분은 상이한 Globo H 부분 대 KLH 부분 서브유닛 비를 갖는다.
하나의 구현예에서, 상기 Globo H 부분은 (Fucα1 → 2 Galβ1 → 3 GalNAcβ1 → 3 Galα1 → 4 Galβ1 → 4 Glc)를 포함한다. 추가의 구현예에서, 상기 KLH 부분 서브유닛은 KLH-1 또는 KLH-2 부분 또는 이들의 조합이다. 본원에서 사용한 바와 같이, "KLH"란 용어는 KLH-1, KLH-2, 및/또는 이들의 조합을 지칭한다.
또 다른 구현예에서, 상기 KLH 부분 서브유닛은 상응하는 천연 KLH 부분 서브유닛과 적어도 99% 일치한다.
또 다른 구현예에서, 상기 KLH 부분 서브유닛은 상응하는 천연 KLH 부분 서브유닛과 적어도 95% 일치한다.
또 다른 구현예에서, 상기 KLH 부분 서브유닛은 상응하는 천연 KLH 부분 서브유닛과 적어도 90% 일치한다.
또 다른 구현예에서, 상기 KLH 부분 서브유닛은 상응하는 천연 KLH 부분 서브유닛과 적어도 80% 일치한다.
또 다른 구현예에서, 상기 KLH 부분 서브유닛은 상응하는 천연 KLH 부분 서브유닛과 적어도 70% 일치한다.
또 다른 구현예에서, 상기 KLH 부분 서브유닛은 상응하는 천연 KLH 부분 서브유닛과 적어도 60% 일치한다.
또 다른 구현예에서, 상기 Globo H 부분을 링커를 통해 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 부분 서브유닛에 공유 결합시킨다. 더욱 추가의 구현예에서, 상기 Globo H 부분을 4-(4-N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카복실 히드라지드(MMCCH) 결합에 의해 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 부분 서브유닛에 공유 결합시킨다. 또 다른 추가의 구현예에서, 상기 Globo H 부분을 유도체화된 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 부분 서브유닛에 공유 결합시키고 4-(4-N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카복실 히드라지드(MMCCH) 결합에 의해 결합시킨다.
또 다른 구현예에서, 상기 단리된 치료학적 접합체는 적어도 또는 약 150의, 약 350 KDa 내지 약 400 KDa의 분자량을 갖는 KLH 단량체를 기준으로 하는 에피토프 비를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 상기 단리된 치료학적 접합체는 적어도 또는 약 100의 에피토프 비를 갖는다. 추가의 구현예에서, 상기 단리된 치료학적 접합체는 적어도 또는 약 75의 에피토프 비를 갖는다. 더욱 추가의 구현예에서, 상기 단리된 치료학적 접합체는 적어도 또는 약 50의 에피토프 비를 갖는다. 더욱 추가의 구현예에서, 상기 단리된 치료학적 접합체는 적어도 또는 약 25의 에피토프 비를 갖는다. 더욱 또 다른 구현예에서, 상기 단리된 치료학적 접합체는 적어도 또는 약 15의 에피토프 비를 갖는다. 더욱 또 다른 구현예에서, 상기 단리된 치료학적 접합체는 적어도 또는 약 5의 에피토프 비를 갖는다. 더욱 또 다른 구현예에서, 상기 단리된 치료학적 접합체는 적어도 또는 약 1의 에피토프 비를 갖는다.
본 발명의 또 다른 구현예는 KLH 부분 서브유닛을 포함하는 약학 조성물을 포함하며, 여기에서 각각의 KLH 부분 서브유닛은 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 부분 서브유닛에 공유 결합된 하나 이상의 Globo H 부분을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 상기 약학 조성물은 적어도 2개의 KLH 부분 서브유닛의 이량체를 포함하며, 여기에서 각각의 KLH 부분 서브유닛은 KLH 부분 서브유닛에 공유 결합된 하나 이상의 Globo H 부분을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 상기 약학 조성물은 적어도 3개의 KLH 부분 서브유닛의 삼량체를 포함하며, 여기에서 각각의 KLH 부분 서브유닛은 KLH 부분 서브유닛에 공유 결합된 하나 이상의 Globo H 부분을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 상기 약학 조성물은 적어도 4개의 KLH 부분 서브유닛을 포함하며, 여기에서 각각의 KLH 부분 서브유닛은 KLH 부분 서브유닛에 공유 결합된 하나 이상의 Globo H 부분을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 상기 약학 조성물은 KLH 부분 서브유닛(가령, 단량체, 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체 등)의 혼합물을 포함하며, 여기에서 각각의 KLH 부분 서브유닛은 KLH 부분 서브유닛에 공유 결합된 다수의 Globo H 부분을 포함한다.
본 발명의 또 다른 태양은 KLH 부분의 단량체, 이량체, 삼량체, 사량체, 또는 오량체 또는 이들의 조합을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이며, 여기에서 각각의 KLH는 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 부분 서브유닛에 공유 결합된 하나 이상의 Globo H 부분을 포함한다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 조성물 중의 상기 치료학적 접합체의 에피토프 비는 약 1 내지 3000의 범위이다. 추가의 구현예에서, 상기 조성물 중의 상기 치료학적 접합체의 에피토프 비는 약 75 내지 2000의 범위이다. 더욱 또 다른 구현예에서, 상기 조성물 중의 상기 치료학적 접합체의 에피토프 비는 약 100 내지 1000의 범위이다. 더욱 추가의 구현예에서, 상기 조성물 중의 상기 치료학적 접합체의 평균 에피토프 비는 약 150 내지 500의 범위이다.
또 다른 구현예에서, 상기 조성물 중의 상기 치료학적 접합체의 약 1% 내지 99%는 KLH 단량체이다. 추가의 구현예에서, 상기 조성물 중의 상기 치료학적 접합체의 약 0% 내지 99%는 KLH 이량체이다. 더욱 또 다른 구현예에서, 상기 조성물 중의 상기 치료학적 접합체의 약 0% 내지 99%는 KLH 삼량체이다. 더욱 또 다른 구현예에서, 상기 조성물 중의 상기 치료학적 접합체의 약 0% 내지 99%는 KLH 사량체이다. 추가의 구현예에서, 상기 조성물 중의 상기 치료학적 접합체의 약 1% 내지 99%는 KLH 오량체이다. 더욱 또 다른 구현예에서, 상기 조성물 중의 상기 치료학적 접합체의 약 0% 내지 99%는 6개의 KLH 서브유닛을 포함한다. 더욱 또 다른 구현예에서, 상기 조성물 중의 상기 치료학적 접합체의 약 0% 내지 99%는 7개의 KLH 서브유닛을 포함한다. 더욱 또 다른 구현예에서, 상기 조성물 중의 상기 치료학적 접합체의 약 0% 내지 99%는 8개의 KLH 서브유닛을 포함한다. 더욱 또 다른 구현예에서, 상기 조성물 중의 상기 치료학적 접합체의 약 0% 내지 99%는 9개의 KLH 서브유닛을 포함한다. 더욱 또 다른 구현예에서, 상기 조성물 중의 상기 치료학적 접합체의 약 0% 내지 99%는 10개의 KLH 서브유닛을 포함한다. 더욱 또 다른 구현예에서, 상기 조성물 중의 상기 치료학적 접합체의 약 0% 내지 99%는 11개의 KLH 서브유닛을 포함한다. 더욱 또 다른 구현예에서, 상기 조성물 중의 상기 치료학적 접합체의 약 0% 내지 99%는 12개의 KLH 서브유닛을 포함한다. 더욱 또 다른 구현예에서, 상기 조성물 중의 상기 치료학적 접합체의 약 0% 내지 99%는 13개의 KLH 서브유닛을 포함한다. 더욱 또 다른 구현예에서, 상기 조성물 중의 상기 치료학적 접합체의 약 0% 내지 99%는 14개의 KLH 서브유닛을 포함한다. 더욱 또 다른 구현예에서, 상기 조성물 중의 상기 치료학적 접합체의 약 0% 내지 99%는 15개의 KLH 서브유닛을 포함한다. 더욱 또 다른 구현예에서, 상기 조성물 중의 상기 치료학적 접합체의 약 0% 내지 99%는 16개의 KLH 서브유닛을 포함한다. 더욱 또 다른 구현예에서, 상기 조성물 중의 상기 치료학적 접합체의 약 0% 내지 99%는 17개의 KLH 서브유닛을 포함한다. 더욱 또 다른 구현예에서, 상기 조성물 중의 상기 치료학적 접합체의 약 0% 내지 99%는 18개의 KLH 서브유닛을 포함한다. 더욱 또 다른 구현예에서, 상기 조성물 중의 상기 치료학적 접합체의 약 0% 내지 99%는 19개의 KLH 서브유닛을 포함한다. 더욱 또 다른 구현예에서, 상기 조성물 중의 상기 치료학적 접합체의 약 0% 내지 99%는 20개의 KLH 서브유닛을 포함한다. 더욱 또 다른 구현예에서, 상기 조성물 중의 상기 치료학적 접합체의 약 1% 내지 99%는 단량체, 이량체, 삼량체, 사량체 또는 이들의 조합이다. 더욱 또 다른 구현예에서, 상기 조성물 중의 상기 치료학적 접합체의 약 99%는 단량체, 이량체, 삼량체, 사량체 또는 이들의 조합이다.
또 다른 구현예에서, 상기 약학 조성물은 항원보강제, 예를 들어 비제한적으로 프로인트 항원보강제, 톨형 수용체 분자, LPS, 리포단백질, 리포펩티드, 플라젤린, 이중가닥 RNA, 바이러스 DNA, 메틸화되지 않은 CpG 섬, 레바미솔, 바실러스 칼메트-게랭, 이소프리노신, 자닥신, PD-1 길항물질, PD-1 항체, CTLA 길항물질, CTLA 항체, 인터류킨, 사이토킨, GM-CSF, 당지질, 알루미늄염 기재, 알루미늄 포스페이트, 알룸, 수산화 알루미늄, 리포솜, TLR2 작용물질, 리포펩티드, 나노입자, 모노포스포릴 지질 A, OPT-821 사포닌, QS-21 사포닌, 수중 유적형 나노유화액, 및 세균형 입자를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 상기 약학 조성물은 IL-2, IL-12, IL-18, IL-2, IFN-γ, TNF, IL-4, IL-10, IL-13, IL-21, GM-CSF 및 TGF-β로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 사이토킨을 포함한다. 추가의 구현예에서, 상기 약학 조성물은 케모킨을 포함한다.
추가의 구현예에서, 상기 치료제를 약학 조성물로서 투여한다.
더욱 또 다른 구현예에서, 상기 약학 조성물은 단클론 항체, 화학요법제, 호르몬 치료제, 레티노이드 수용체 조절제, 세포독성/세포발육정지제, 종양억제제, 증식억제제, 항-mTOR제, 항-Her2제, 항-EGFR제, 프레닐-단백질 트랜스퍼라제 억제제, HMG-CoA 리덕타제 억제제, 질소 머스터드, 니트로소 우레아, 혈관형성 억제제, 베바시주맵, 세포증식 및 생존 신호전달 경로의 억제제, 세포사멸 유도제, 세포주기 검사점을 방해하는 작용제, 수용체 티로신 키나제(RTK)를 방해하는 작용제, 인테그린 차단제, NSAID, PPAR 작용물질, 내재성 다중약물 내성(MDR)의 억제제, 구토방지제, 빈혈 치료에 유용한 작용제, 호중구감소증의 치료에 유용한 작용제, 면역학적-증대 약물, 비포스포네이트, 아로마타제 억제제, 종양세포의 말단 분화를 유도하는 작용제, γ-세크레타제 억제제, 암 백신(가령, 능동 면역요법), 단클론 항체 치료제(가령, 수동 면역요법), 및 이들의 임의의 조합을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 치료학적 조성물은 PD-1/PD-L1 억제제(세포독성 T 세포 림프구(CTL) 면역요법제), CTLA-4 면역요법제, CDK4/6 억제제(표적 요법제), PI3K 억제제(표적 요법제), mTOR 억제제(표적 요법제), AKT 억제제(표적 요법제), Pan-Her 억제제(표적 요법제)를 추가로 포함할 수 있다. 이들 억제제를 변형시켜 각각의 단클론 항체를 또한 생성할 수 있다. 상기와 같은 항체를 본 발명의 치료학적 조성물에 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 추가의 구현예에서, 상기 약학 조성물은 암 백신이다. 더욱 또 다른 구현예에서, 상기 약학 조성물을 피하 투여용으로 제형화한다. 더욱 또 다른 구현예에서, 상기 약학 조성물을 근육내 투여용으로 제형화한다. 더욱 또 다른 구현예에서, 상기 약학 조성물을 동맥내 투여용으로 제형화한다. 더욱 또 다른 구현예에서, 상기 약학 조성물을 정맥내 투여용으로 제형화한다.
본 발명의 또 다른 구현예는 치료가 필요한 환자에게 치료 유효량의, Globo H 및 KLH를 포함하는 치료학적 조성물을 투여함을 포함하는, 상기 환자의 치료 방법을 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 환자는 암에 걸린 것으로 진단되었거나, 또는 암에 걸린 것으로 의심된다. 또 다른 구현예에서, 상기 암은 상피암이다. 추가의 구현예에서, 상기 암은 유방암이다. 더욱 또 다른 구현예에서, 상기 약학/치료학적 조성물 중의 Globo-H 부분의 치료 유효량은 약 0.001 ㎍/㎏ 내지 약 250 ㎎/㎏의 범위일 수 있다. 더욱 추가의 구현예에서, 상기 약학/치료학적 조성물 중의 Globo-H 부분의 치료 유효량은 용량당 약 10 ㎍/㎏ 내지 약 50 ㎍/㎏의 하나의 치료학적 접합체를 포함한다. 더욱 추가의 구현예에서, 상기 약학/치료학적 조성물 중의 Globo-H 부분의 치료 유효량은 용량당 약 0.10 ㎍/㎏ 내지 약 0.75 ㎍/㎏의 하나의 치료학적 접합체를 포함한다.
더욱 또 다른 구현예에서, 상기 치료학적 조성물 중의 Globo-H-KLH 복합체의 치료 유효량은 약 0.001 ㎍/㎏ 내지 약 250 ㎎/㎏의 범위일 수 있다. 더욱 추가의 구현예에서, 상기 치료학적 조성물 중의 Globo-H-KLH 복합체의 치료 유효량은 용량당 약 10 ㎍/㎏ 내지 약 50 ㎍/㎏의 하나의 치료학적 접합체를 포함한다. 더욱 추가의 구현예에서, 상기 치료학적 조성물 중의 Globo-H-KLH 복합체의 치료 유효량은 용량당 약 0.60 ㎍/㎏ 내지 약 4.50 ㎍/㎏의 하나의 치료학적 접합체를 포함한다.
더욱 또 다른 구현예에서, 상기 방법은 대조용 위약보다 약 또는 적어도 1주일까지 무진행 생존을 연장시킬 수 있다. 더욱 또 다른 구현예에서, 상기 방법은 대조용 위약보다 약 또는 적어도 2주일까지 무진행 생존을 연장시킬 수 있다. 더욱 또 다른 구현예에서, 상기 방법은 대조용 위약보다 약 또는 적어도 1개월까지 무진행 생존을 연장시킬 수 있다. 더욱 또 다른 구현예에서, 상기 방법은 대조용 위약보다 약 또는 적어도 3개월까지 무진행 생존을 연장시킬 수 있다. 더욱 또 다른 구현예에서, 상기 방법은 대조용 위약보다 약 또는 적어도 6개월까지 무진행 생존을 연장시킬 수 있다. 더욱 또 다른 구현예에서, 상기 방법은 대조용 위약보다 약 또는 적어도 12개월까지 전체 생존을 연장시킬 수 있다.
후속의 상세한 설명과 함께 고려시, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 보다 완전한 이해를 얻을 수 있다. 도면에 예시된 구현예들은 오직 본 발명을 예시하고자 하는 것이며, 본 발명이 상기 예시된 구현예들로 제한되는 것으로 해석해서는 안 된다.
도 1a는 Globo H 화학식뿐만 아니라, 다수의 예시적인 Globo H 유사체들을 도시한다. Glc는 글루코스를 나타내고, Gal은 갈락토스를 나타내고, GalNAc는 N-아세틸갈락토스아민을 나타내고, Fuc는 퓨코스를 나타낸다. 도 1b는 MMCCH 링커에 의해 접합된 예시적인 Globo H-KLH 서브유닛을 도시한다.
도 2a는 예시적인 Globo H-KLH 서브유닛 접합 합성 경로를 도시한다. 도 2b는 문헌[Slovin et al (1999), Proc Natl Acad Sci USA 96:5710-5] 및 문헌[Gilewski et al (2001), Proc Natl Acad Sci USA 98: 3270-5]에 개시된 Globo H 접합체와 비교한 본 발명의 Globo H-KLH 이량체 및 삼량체를 도시한다.
도 3은 고유 KLH(8.3 MDa)의 다각도 레이저 산란 분광분석(MALS)의 결과를 도시한다.
도 4는 고유 KLH(8.3 MDa)의 크기 배제 크로마토그래피의 결과를 도시한다.
도 5a 내지 도 5d는 본 발명에 따르는 Globo H-KLH 당접합체로 면역화된 루이스 래트에서 B/CD3+T/CD4+T/CD8+T 세포 집단의 연대순 확대를 도시한다. 패널 A 내지 D는 각각 B 세포, CD3 T 세포, CD4 T 세포, 및 CD8 T 세포 집단을 나타내었다. 데이터를 PBS 그룹의 세포수의 백분율에 대해 표준화된 지시된 그룹의 세포수의 백분율로서 나타내었다. 다중비교를 2원 ANOVA에 이어서 본페로니의 사후검증을 사용하여 분석하였다. PBS와 비교한, *, p<0.05, **, p<0.01 및 ***, p<0.001.
도 6a 및 도 6b는 본 발명의 당접합체(Globo H-KLH)로 면역화된 루이스 래트로부터의 혈액 중 IgM(도 6a) 및 IgG 항체(도 6b)의 상호 역가의 연대순 변화를 도시한다.
도 7은 본 발명의 당접합체(Globo H-KLH)에 응답하는 마우스의 IgM 항체 역가를 도시한다.
도 8a 및 도 8b는 0, 5 및 10일째에 PBS, 항원보강제 단독, 또는 Globo H-KLH + 항원보강제로 면역화된 C57BL/6 마우스의 면역원성을 나타낸다. 상기 혈청들을 ELISA 분석을 위해 14일째에 수집하여 항-Globo H IgG 및 IgM 생산을 측정하였다.
도 9는 보체 의존성 세포독성을 예시하며, 여기에서 Globo H(+) 또는 Globo H(-) TOV21G 세포를 96-웰 플레이트에 도말하였다. 항-Globo H 혈청 또는 대조용 혈청을 1:50 또는 1:100의 희석비로 첨가하였다. 이어서 상기 플레이트를 보체와 함께/보체 없이 첨가하였다. 상기 보체 의존성 세포독성(CDC)을 LDH 분석에 의해 측정하였다.
도 10a 내지 도 10c는 96-웰 플레이트에 도말된 Globo H(+) 또는 Globo H(-) TOV21G 세포의 세포독성을 나타낸다. 항-Globo H 혈청 또는 대조용 혈청을 1:50 또는 1:100의 희석비로 첨가하였다. 말초 혈액 단핵세포(PBMC)로부터 단리되고 항-CD3 항체로 활성화된 인간 NK 세포를 효과기 세포로서 사용하였다. 상기 효과기 세포를 4:1, 2:1 또는 1:1의 ET 비로 항체-의존성 세포-매개된 세포독성(ADCC) 반응에 첨가하거나 첨가하지 않았다. 상기 세포독성을 상이한 ET 비로 각 세포의 마우스 혈청 대조군 없이 표준화하였다.
도 11은 0일째에 1 x 10 6의 Globo H-양성 TOV21G 세포를 복강내 주사한 방사선 조사된 NOD-SCID 마우스를 나타낸다. 항-혈청들을 3개의 상이한 처리(PBS, 항원보강제 단독, 및 Globo H-KLH/항원보강제)의 3 회 백신접종 후에 C57BL/6 마우스로부터 별도로 수집하였다. 상기 NOD-SCID 마우스에게 0, 2, 4, 6, 9, 11, 13 및 16일째에 각 마우스에 대해 상기 언급한 항-혈청 200 ㎕를 복강내로 제공하였다. 상기 종양 상들을 3, 7 및 9일째에 IVIS 영상화 시스템에 의해 추적하였다.
도 12는 0, 5 및 11일째에 PBS, 항원보강제 단독, 또는 Globo H-KLH/항원보강제로 피하 백신접종한 Globo H KLH 면역화된 C57BL/6 마우스 상에서의 LLC1(폐암 상피암 세포주) 종양 성장을 나타낸다. 1 x 105 LLC1 세포를 16일째에 각 마우스에게 피하 주사하였다. 이어서 상기 처리를 29일 및 34일째에 피하 투여하였다. 종양 크기를 16, 21, 25, 29, 32, 34, 37일째에 모니터하였다.
도 13은 펩티드 식별에 대한 표 요약을 도시한다.
도 14a 내지 도 14c는 KLH1(a) 및 KLH2(b)에 대한 샘플 1(1차 LC-MS/MS)에 대한 Globo-H 접합된 펩티드의 식별 세부사항을 나타낸다.
도 15a 내지 도 15c는 KLH1(a) 및 KLH2(b)에 대한 샘플 2(1차 LC-MS/MS)에 대한 Globo-H 접합된 펩티드의 식별 세부사항을 나타낸다.
도 16a 및 도 16b는 KLH1(a) 및 KLH2(b)에 대한 샘플 3(1차 LC-MS/MS)에 대한 Globo-H 접합된 펩티드의 식별 세부사항을 나타낸다.
도 17a 및 도 17b는 KLH1(a) 및 KLH2(b)에 대한 샘플 4(1차 LC-MS/MS)에 대한 Globo-H 접합된 펩티드의 식별 세부사항을 나타낸다.
도 18a 내지 도 18c는 KLH1(a) 및 KLH2(b)에 대한 샘플 1(2차 LC-MS/MS)에 대한 Globo-H 접합된 펩티드의 식별 세부사항을 나타낸다.
도 19a 내지 도 19c는 KLH1(a) 및 KLH2(b)에 대한 샘플 2(2차 LC-MS/MS)에 대한 Globo-H 접합된 펩티드의 식별 세부사항을 나타낸다.
도 20a 및 도 20b는 KLH1(a) 및 KLH2(b)에 대한 샘플 3(2차 LC-MS/MS)에 대한 Globo-H 접합된 펩티드의 식별 세부사항을 나타낸다.
도 21a 및 도 21b는 KLH1(a) 및 KLH2(b)에 대한 샘플 4(1차 LC-MS/MS)에 대한 Globo-H 접합된 펩티드의 식별 세부사항을 나타낸다.
도 22a 내지 도 22k는 KLH1(a) 및 KLH2(b)에 대한 샘플 1(1차 LC-MS/MS)에 대한 MMCCH-접합된 펩티드의 식별 세부사항을 나타낸다.
도 23a 내지 도 23k는 KLH1(a) 및 KLH2(b)에 대한 샘플 2(1차 LC-MS/MS)에 대한 MMCCH-접합된 펩티드의 식별 세부사항을 나타낸다.
도 24a 내지 도 24k는 KLH1(a) 및 KLH2(b)에 대한 샘플 3(1차 LC-MS/MS)에 대한 MMCCH-접합된 펩티드의 식별 세부사항을 나타낸다.
도 25a 내지 도 25k는 KLH1(a) 및 KLH2(b)에 대한 샘플 4(1차 LC-MS/MS)에 대한 MMCCH-접합된 펩티드의 식별 세부사항을 나타낸다.
도 26a 내지 도 26k는 KLH1(a) 및 KLH2(b)에 대한 샘플 1(2차 LC-MS/MS)에 대한 MMCCH-접합된 펩티드의 식별 세부사항을 나타낸다.
도 27a 내지 도 27j는 KLH1(a) 및 KLH2(b)에 대한 샘플 2(2차 LC-MS/MS)에 대한 MMCCH-접합된 펩티드의 식별 세부사항을 나타낸다.
도 28a 내지 도 28k는 KLH1(a) 및 KLH2(b)에 대한 샘플 3(2차 LC-MS/MS)에 대한 MMCCH-접합된 펩티드의 식별 세부사항을 나타낸다.
도 29a 내지 도 29j는 KLH1(a) 및 KLH2(b)에 대한 샘플 4(1차 LC-MS/MS)에 대한 MMCCH-접합된 펩티드의 식별 세부사항을 나타낸다.
도 30a 내지 도 30d는 KLH1(a) 및 KLH2(b)에 대한 (1차 LC-MS/MS) 및 KLH1(c) 및 KLH2(d)에 대한 (2차 LC-MS/MS)에 대한 Globo-H 접합된 리신 식별의 요약을 나타낸다.
도 31a 내지 도 31d는 KLH1(a) 및 KLH2(b)에 대한 (1차 LC-MS/MS) 및 KLH1(c) 및 KLH2(d)에 대한 (2차 LC-MS/MS)에 대한 MMCCH-접합된 리신 식별의 요약을 나타낸다.
도 32는 1차 (a) 및 2차 (b) LC-MS/MS 실행에서 Globo-H 접합 분석의 요약을 나타낸다.
도 33(a)는 화학식: C(56) H(91) N(5) O(33) S(1), 모노아이소토픽 MW 가중: 1393.5317 Da를 나타낸다. 도 33(b)는 화학식 : 1. C(18) H(28) N(4) O(4) S(1), 모노아이소토픽 MW 가중: 396.1831 Da; 2. 화학식: C(24) H(38) N(4) O(9) S(1), 모노아이소토픽 MW 가중: 558.2360 Da; 3. 화학식: C(30) H(48) N(4) O(14) S(1), 모노아이소토픽 MW 가중: 720.2888 Da; 4. 화학식: C(36) H(58) N(4) O(19) S(1), 모노아이소토픽 MW 가중: 882.3416 Da; 5. 화학식: C(44) H(71) N(5) O(24) S(1), 모노아이소토픽 MW 가중: 1085.4210 Da를 나타낸다.
도 34(a)는 MMCCH 유도체의 화학식을 나타낸다. 화학식: C(16) H(24) N(4) O(3) S(1), 모노아이소토픽 MW 가중: 352.1569 Da를 나타내고, 도 34(b)는 탈아미드화된 MMCCH 유도체, 화학식: C(16) H(22) N(2) O(4) S(1), 모노아이소토픽 MW 가중: 338.1300 Da를 나타낸다.
본 발명의 실시는, 달리 가리키지 않는 한, 분자 생물학, 미생물학 및 면역학의 통상적인 기술을 사용할 것이며, 상기 기술들은 당해 분야의 기술 내에 있다. 상기와 같은 기법들은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들어, 하기의 문헌들을 참조하면 된다: Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Antibodies: A Laboratory Manual, by Harlow and Lanes (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988); and Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986).
"하나의"란 단어의 사용은 특허청구범위 및/또는 명세서에서 "포함하는"이란 용어와 함께 사용될 때 "하나"를 의미할 수 있지만, 상기 단어는 또한 "하나 이상", "적어도 하나" 및 "하나 또는 하나 초과"의 의미와 일치한다.
본 출원의 전체를 통해서, "약"이란 용어는 하나의 값이 예를 들어, 측정 장치, 상기 값을 측정하는데 사용되는 방법, 또는 연구 주제 중에 존재하는 변동에 대한 오차의 고유 변동을 포함하는 것을 가리키는데 사용된다. 전형적으로 상기 용어는 상기 상황에 따라 대략 또는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% 또는 20% 미만의 변동성을 포함하는 것으로 여겨진다.
본원에서 사용한 바와 같이, "알킬"이란 용어는 달리 서술하지 않는 한, 치환되거나 치환되지 않을 수도 있는 1 내지 20개의 탄소 원자, 예를 들어 C1-C8 또는 C1-C4를 함유하는 직쇄 또는 분지된 1가 탄화수소를 지칭한다. 알킬의 예는 비제한적으로 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-부틸, i-부틸, 및 t-부틸을 포함한다.
특허청구범위에서 "또는"이란 용어의 사용은, 오직 양자택일만을 지칭하거나 또는 상기 양자택일이 상호 배타적임을 명백히 가리키지 않는 한, "및/또는"을 의미하는데 사용하지만, 본 명세서는 오직 양자택일만을 지칭하는 정의와 "및/또는"을 지지한다.
본 명세서 및 특허청구범위(들)에서 사용하는 바와 같이, "포함하는"(및 포함하는의 임의의 형태, 예를 들어 "포함하다"), "갖는"(및 갖는의 임의의 형태, 예를 들어 "갖다"), "내포하는"(및 내포하는의 임의의 형태, 예를 들어 "내포하다") 또는 "함유하는"(및 함유하는의 임의의 형태, 예를 들어 "함유하다")이란 단어들은 일체를 포함하거나 또는 제약을 두지 않으며, 추가적인, 인용되지 않은 요소들 또는 방법 단계들을 제외하지 않는다. 본 명세서에서 논의된 임의의 구현예를 본 발명의 임의의 방법 또는 조성물에 관하여 실행할 수 있으며, 이와 역으로 실행할 수 있음이 고려된다. 더욱 또한, 본 발명의 조성물을 사용하여 본 발명의 방법을 달성할 수 있다.
"치료하는"은 본 발명에서 질환, 상기 질환의 증상, 상기 질환에 부차적인 질병 상태, 또는 상기 질환에 대한 소인을 치유하거나, 경감시키거나, 완화시키거나, 교정하거나, 예방하거나 개선시킬 목적으로 환자에게 치료학적 조성물을 투여하는 것을 지칭한다.
"유효량"은 치료되는 환자에게서 본 발명에 묘사된 바와 같은 의학적으로 바람직한 결과를 생성할 수 있는 치료학적 조성물의 양이다. 상기 의학적으로 바람직한 결과는 객관적(즉, 일부 시험 또는 마커에 의해 측정가능한)이거나 주관적(즉, 환자가 효과의 표시 또는 감정을 제공한다)일 수 있다.
본 발명에서 언급한 바와 같은 "치료학적 조성물로 치료 가능한 질병"은 본원에 개시한 치료학적 조성물의 투여에 의해 치료할 수 있는 임의의 과정, 상태, 질환, 병 및/또는 질병을 의미한다.
"증식성 질환"은 일부 유형의 세포가 너무 많이 생성되어 건강을 악화시키는 것이다. 증식성 질환은 양성이거나 악성일 수 있다. 증식성 질환은 예를 들어, 암을 포함할 수 있다.
본원에 개시한 치료학적 조성물에 의해 치료할 수 있는 "암"은 세포의 이상 성장이다. 암세포는 정상적인 조절 기전을 상실했으며, 따라서 연속적으로 확대되고, 인접 조직을 침입하며, 신체의 먼 부분까지 이동하고, 상기 세포가 영양분을 획득하는 새로운 혈관의 성장을 촉진할 수 있다. 본원에서 사용한 바와 같이, 암은 악성이거나 양성일 수 있다. 암은 신체내 임의의 조직으로부터 발생할 수 있다. 세포가 성장하고 번식함에 따라, 종양(tumor)이라 칭하는 조직 덩어리를 형성한다. 종양이란 용어는 비정상적인 성장 또는 덩어리를 지칭한다. 종양은 암성(악성)이거나 또는 비암성(양성)일 수 있다. 암성 종양은 이웃하는 조직을 침입하고 전신을 통해 확산될 수 있다(전이). 그러나, 양성 종양은 일반적으로 이웃하는 조직을 침입하지 않으며 신체 전체를 통해 확산되지 않는다. 암을 혈액 및 혈액-형성 조직의 암(백혈병 및 림프종)과 "고형" 종양으로 나눌 수 있다. "고형" 종양은 암종(carcinomas) 또는 육종(sarcomas)일 수 있다.
본 발명의 치료학적 조성물에 의해 치료할 수 있는 암은 부위에 의해 분류될 수 있는 것들을 포함하며, 구강 및 인두(입술, 혀, 침샘, 구강바닥, 잇몸 및 다른 입, 비인두, 편도선, 구강인두, 하인두, 다른 구강/인두)의 암(cancer of the oral cavity and pharynx (lip, tongue, salivary gland, floor of mouth, gum and other mouth, nasopharynx, tonsil, oropharynx, hypopharynx, other oral/pharynx)); 소화계(식도; 위; 소장; 결장 및 직장; 항문, 항문관, 및 항문직장; 간; 간내 담도; 쓸개; 다른 담낭; 췌장; 복막후강; 복막, 장막, 및 장간막; 다른 소화기)의 암(cancers of the digestive system (esophagus; stomach; small intestine; colon and rectum; anus, anal canal, and anorectum; liver; intrahepatic bile duct; gallbladder; other biliary; pancreas; retroperitoneum; peritoneum, omentum, and mesentery; other digestive)); 호흡계(비강, 중이, 및 부비강; 후두; 폐 및 기관지; 흉막; 기관, 종격, 및 다른 호흡기)의 암(cancers of the respiratory system (nasal cavity, middle ear, and sinuses; larynx; lung and bronchus; pleura; trachea, mediastinum, and other respiratory)); 중피종; 뼈 및 관절; 및 연조직, 예를 들어 심장의 암(cancers of the mesothelioma; bones and joints; and soft tissue, including heart); 흑색종 및 다른 비상피 피부암을 포함한 피부암(skin cancers, including melanomas and other non-epithelial skin cancers); 카포시 육종 및 유방암(Kaposi's sarcoma and breast cancer); 여성 생식계(자궁경관; 자궁체; 자궁, 난소; 질; 외음부; 및 다른 여성 생식기)의 암(cancer of the female genital system (cervix uteri; corpus uteri; uterus, ovary; vagina; vulva; and other female genital)); 남성 생식계(전립선; 고환; 음경; 및 다른 남성 생식기)의 암(cancers of the male genital system (prostate gland; testis; penis; and other male genital)); 비뇨계(방광; 신장 및 신우; 요관; 및 다른 비뇨기)의 암(cancers of the urinary system (urinary bladder; kidney and renal pelvis; ureter; and other urinary)); 눈 및 안와의 암; 뇌 및 신경계(뇌; 및 다른 신경계)의 암(cancers of the eye and orbit; cancers of the brain and nervous system (brain; and other nervous system)); 내분비계(갑상선, 및 흉선을 포함한 다른 내분비선)의 암(cancers of the endocrine system (thyroid gland and other endocrine, including thymus)); 림프종(호지킨병 및 비-호지킨 림프종)(lymphomas (Hodgkin's disease and non-Hodgkin's lymphoma)), 다발성 골수종(multiple myeloma), 및 백혈병(림프구성 백혈병; 골수성 백혈병; 단핵구성 백혈병; 및 다른 백혈병)(leukemias (lymphocytic leukemia; myeloid leukemia; monocytic leukemia; and other leukemias))을 포함한다.
본 발명에 따르는 치료학적 조성물에 적합한 표적일 수 있는, 조직 유형에 의해 분류된 다른 암은 비제한적으로 악성 종양(neoplasm, malignant); 암종, NOS(Carcinoma, NOS); 미분화된 암종, NOS(Carcinoma, undifferentiated, NOS); 거대 방추세포 암종(Giant and spindle cell carcinoma); 소세포 암종, NOS(Small cell carcinoma, NOS); 유두상 암종, NOS(Papillary carcinoma, NOS); 편평세포 암종, NOS(Squamous cell carcinoma, NOS); 림프상피암종(Lymphoepithelial carcinoma); 기저세포 암종, NOS(Basal cell carcinoma, NOS); 섬모기질암종(Pilomatrix carcinoma); 이행세포 암종, NOS(Transitional cell carcinoma, NOS); 유두상 이행세포 암종(Papillary transitional cell carcinoma); 선암종, NOS(Adenocarcinoma, NOS); 악성 가스트리노마(Gastrinoma, malignant); 담관암종(Cholangiocarcinoma); 간세포 암종, NOS(Hepatocellular carcinoma, NOS); 복합 간세포 암종 및 담관암종(Combined hepatocellular carcinoma and cholangiocarcinoma); 육주상의 선암종(Trabecular adenocarcinoma); 선양 낭포암종(Adenoid cystic carcinoma); 선종폴립 중 선암종(Adenocarcinoma in adenomatous polyp); 선종성 가족성 결장 폴립증(Adenocarcinoma, familial polyposis coli); 고형 암종, NOS(Solid carcinoma, NOS); 악성 유암종(Carcinoid tumor, malignant); 세기관지폐포 암종(Bronchioloalveolar adenocarcinoma); 유두상 선암종, NOS(Papillary adenocarcinoma, NOS); 혐색소성 암종(Chromophobe carcinoma); 호산성 암종(Acidophil carcinoma); 호산세포성 선암종(Oxyphilic adenocarcinoma); 호염기성 암종(Basophil carcinoma); 투명세포 선암종, NOS(Clear cell adenocarcinoma, NOS); 과립세포 암종(Granular cell carcinoma); 여포성 선암종, NOS(Follicular adenocarcinoma, NOS); 유두상 및 여포성 선암종(Papillary and follicular adenocarcinoma); 비캡슐화 경화성 암종(Nonencapsulating sclerosing carcinoma); 부신피질 암종(Adrenal cortical carcinoma); 자궁내막 암종(Endometroid carcinoma); 피부부속물 암종(Skin appendage carcinoma); 아포크린 선암종(Apocrine adenocarcinoma); 피지성 선암종(Sebaceous adenocarcinoma); 귀지의 선암종(Ceruminous adenocarcinoma); 점액표피양 암종(Mucoepidermoid carcinoma); 낭선암종, NOS(Cystadenocarcinoma, NOS); 유두상 낭선암종, NOS(Papillary cystadenocarcinoma, NOS); 유두상 장액 낭선암종(Papillary serous cystadenocarcinoma); 점액성 낭선암종, NOS(Mucinous cystadenocarcinoma, NOS); 점액성 선암종(Mucinous adenocarcinoma); 인환세포 암종(Signet ring cell carcinoma); 침윤성 관암종(Infiltrating duct carcinoma); 수질 암종, NOS(Medullary carcinoma, NOS); 소엽 암종(Lobular carcinoma); 염증성 암종(Inflammatory carcinoma); 유방의 파제트병(Paget's disease, mammary); 샘꽈리세포 암종(Acinar cell carcinoma); 선편평세포 암종(Adenosquamous carcinoma); 편평세포 화생을 동반한 선암종(Adenocarcinoma w/ squamous metaplasia); 악성 흉선종(Thymoma, malignant); 악성 난소기질 종양(Ovarian stromal tumor, malignant); 악성 협막세포종(Thecoma, malignant); 악성 과립막세포종(Granulosa cell tumor, malignant); 악성 남성모세포종(Androblastoma, malignant); 세르톨리세포암종(Sertoli cell carcinoma); 악성 라이디히 세포종(Leydig cell tumor, malignant); 악성 지질세포종(Lipid cell tumor, malignant); 악성 부신경절종(Paraganglioma, malignant); 악성 유방외 부신경절종(Extra-mammary paraganglioma, malignant); 갈색세포종(Pheochromocytoma); 사구맥관육종(Glomangiosarcoma); 악성 흑색종, NOS(Malignant melanoma, NOS); 무색소성 흑색종(Amelanotic melanoma); 표재 확산성 흑색종(Superficial spreading melanoma); 거대 색소모반 중 악성 흑색종(Malig melanoma in giant pigmented nevus); 상피세포 흑색종(Epithelioid cell melanoma); 악성 청색모반(Blue nevus, malignant); 육종, NOS(Sarcoma, NOS); 섬유육종, NOS(Fibrosarcoma, NOS); 악성 섬유성 조직구종(Fibrous histiocytoma, malignant); 점액육종(Myxosarcoma); 지방육종, NOS(Liposarcoma, NOS); 평활근육종, NOS(Leiomyosarcoma, NOS); 횡문근육종, NOS(Rhabdomyosarcoma, NOS); 배아 횡문근육종(Embryonal rhabdomyosarcoma); 포상 횡문근육종(Alveolar rhabdomyosarcoma); 기질육종, NOS(Stromal sarcoma, NOS); 악성 혼합종양, NOS(Mixed tumor, malignant, NOS); 뮐러의 혼합 종양(Mullerian mixed tumor); 신아세포종(Nephroblastoma); 간모세포종(Hepatoblastoma); 암육종, NOS(Carcinosarcoma, NOS); 악성 간엽종(Mesenchymoma, malignant); 악성 브레너 종양(Brenner tumor, malignant); 악성 엽상종양(Phyllodes tumor, malignant); 활막 육종, NOS(Synovial sarcoma, NOS); 악성 중피종(Mesothelioma, malignant); 미분화배세포종(Dysgerminoma); 배아 암종, NOS(Embryonal carcinoma, NOS); 악성 기형종, NOS(Teratoma, malignant, NOS); 악성 난소갑상선종(Struma ovarii, malignant); 융모막암종(Choriocarcinoma); 악성 중신종(Mesonephroma, malignant); 혈관종(Hemangiosarcoma); 악성 혈관내피종(Hemangioendothelioma, malignant); 카포시 육종(Kaposi's sarcoma); 악성 혈관주위세포종(Hemangiopericytoma, malignant); 림프관육종(Lymphangiosarcoma); 골육종, NOS(Osteosarcoma, NOS); 피질주위 골육종(Juxtacortical osteosarcoma); 연골육종, NOS(Chondrosarcoma, NOS); 악성 연골모세포종(Chondroblastoma, malignant); 중간엽 연골육종(Mesenchymal chondrosarcoma); 뼈의 거대세포 종양(Giant cell tumor of bone); 유잉 육종(Ewing's sarcoma); 악성 치성 종양(Odontogenic tumor, malignant); 법랑아세포 치성 육종(Ameloblastic odontosarcoma); 악성 법랑아세포종(Ameloblastoma, malignant); 법랑아세포성 섬유육종(Ameloblastic fibrosarcoma); 악성 송과체종(Pinealoma, malignant); 척색종(Chordoma); 악성 신경교종(Glioma, malignant); 상의세포종, NOS(Ependymoma, NOS); 성상세포종, NOS(Astrocytoma, NOS); 원형질성 성상세포종(Protoplasmic astrocytoma); 섬유성 성상세포종(Fibrillary astrocytoma); 성상모세포종(Astroblastoma); 교모세포종, NOS(Glioblastoma, NOS); 핍지교종, NOS(Oligodendroglioma, NOS); 핍지모세포종(Oligodendroblastoma); 원시신경외배엽성 종양(Primitive neuroectodermal); 소뇌육종, NOS(Cerebellar sarcoma, NOS); 신경절신경모세포종(Ganglioneuroblastoma); 신경모세포종, NOS(Neuroblastoma, NOS); 망막모세포종, NOS(Retinoblastoma, NOS); 후각 신경원성 종양(Olfactory neurogenic tumor); 악성 뇌수막종(Meningioma, malignant); 신경섬유육종(Neurofibrosarcoma); 악성 신경초종(Neurilemmoma, malignant); 악성 과립세포 종양(Granular cell tumor, malignant); 악성 림프종, NOS(Malignant lymphoma, NOS); 호지킨병, NOS(Hodgkin's disease, NOS); 호지킨병(Hodgkin's); 부육아종, NOS(paragranuloma, NOS); 소림프구성 악성 림프종(Malignant lymphoma, small lymphocytic); 대세포 확산성 악성 림프종(Malignant lymphoma, large cell, diffuse); 여포성 악성 림프종, NOS(Malignant lymphoma, follicular, NOS); 균상 식육종(Mycosis fungoides); 다른 특이성 비-호지킨 림프종(Other specified non-Hodgkin's lymphomas); 악성 조직구증(Malignant histiocytosis); 다발성 골수종(Multiple myeloma); 비만세포 육종(Mast cell sarcoma); 면역증식성 소장 질병(Immunoproliferative small intestinal disease); 백혈병, NOS(Leukemia, NOS); 림프구성 백혈병, NOS(Lymphoid leukemia, NOS); 혈장세포 백혈병(Plasma cell leukemia); 적백혈병(Erythroleukemia); 림프육종 세포 백혈병(Lymphosarcoma cell leukemia); 골수성 백혈병, NOS(Myeloid leukemia, NOS); 호중성 백혈병(Basophilic leukemia); 호산성 백혈병(Eosinophilic leukemia); 단핵구성 백혈병, NOS(Monocytic leukemia, NOS); 비만세포 백혈병(Mast cell leukemia); 거대핵모세포성 백혈병(Megakaryoblastic leukemia); 골수성 육종(Myeloid sarcoma); 및 털세포 백혈병(Hairy cell leukemia)을 포함한다.
본원에서 정의한 바와 같은 "상피암(Epithelial cancers)"은 피부, 중공 내장 및 다른 기관의 상피 또는 관련 조직으로부터 발생하는 암(들)을 지칭한다. 상피암은 비제한적으로 유방암, 폐암, 간암, 구강암, 위암, 결장암, 비인두암, 피부암, 신장암, 뇌종양, 전립선암, 난소암, 경부암, 내막암, 장암, 췌장암 및 방광암을 포함한다.
본원에서 사용한 바와 같은 "환자" 또는 "피실험자"는 암과 같은 증식성 질병이 있거나 또는 발병한 것으로 진단되거나 의심되는 포유동물 환자를 지칭한다. 예시적인 환자는 인간, 원숭이, 개, 돼지, 소, 고양이, 말, 염소, 양, 설치류, 및 암과 같은 증식성 질병의 발달에 이득이 될 수 있는 다른 포유동물일 수 있다.
본원에서 사용한 바와 같이, "실질적으로 정제된" 또는 "실질적으로 단리된"은 고유의 상태에서 통상적으로 결합된 실질적으로 모든 다른 분자들로부터 분리된 상태의 분자(가령, 화합물)를 지칭한다. 바람직하게, 실질적으로 정제된 분자는 제제 중에 존재하는 우세한 종이다. 특히, 실질적으로 정제된 분자는 천연 혼합물 중에 존재하는 다른 분자(용매 제외)가 60% 초과, 바람직하게는 75%, 보다 바람직하게는 90%, 및 가장 바람직하게는 95% 없을 수 있다. "실질적으로 정제된" 또는 "실질적으로 단리된"이란 용어는 고유의 상태에서 존재하는 분자 또는 물질을 포함하고자 하지 않는다. 몇몇 구현예에서, "실질적으로 정제된" 또는 "실질적으로 단리된"이란 용어는 하나의 KLH 부분을 또 다른 KLH 부분으로부터 정제하는(가령, KLH 이량체 부분을 KLH 삼량체 부분으로부터 실질적으로 정제하거나 실질적으로 단리하는) 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, "실질적으로 정제된" 또는 "실질적으로 단리된"이란 용어는 하나의 KLH 부분을 또 다른 KLH 부분으로부터 정제하는 것을 포함하지 않지만(가령, KLH 이량체 및 KLH 삼량체를 실질적으로 정제되거나 실질적으로 단리된 조성물 중에 포함시킨다) 불순물은 실질적으로 제거된다.
"투여"는 본원에서 환자에게 본 발명의 치료학적 조성물을 제공하는 것으로 지칭한다. 예로서, 비제한적으로, 조성물 투여, 예를 들어 주사를 정맥내(i.v.) 주사, 피하(s.c.) 주사, 피내(i.d.) 주사, 복강내(i.p.) 주사, 또는 근육내(i.m.) 주사에 의해 수행할 수 있다. 하나 이상의 상기와 같은 경로를 사용할 수 있다. 비경구 투여를 예를 들어, 일시 주사에 의해서, 또는 시간에 걸쳐 점차적인 관류에 의해 수행할 수 있다. 한편으로, 또는 동시에, 투여를 경구 경로에 의할 수 있다. 추가로, 투여를 또한 일시주사의 수술적 침착 또는 의료 장치의 배치에 의할 수 있다.
"그의 실제 환자"는 본원에서 증식성 질환으로 진단되었거나 상기 질환이 의심되는 환자로도 지칭한다. 하나의 구현예에서, 상기 환자는 암이 발병했거나 또는 발병할 가능성이 있다.
본원에서 사용한 바와 같이, "항원"이란 용어는 단백질 담체 및/또는 항원보강제의 도움으로 또는 상기 도움 없이 면역 반응을 이끌어낼 수 있는 임의의 물질로서 정의된다. 바람직하게 본 발명의 항원 조성물은 탄수화물 및 보다 바람직하게 글리칸-항원 및 가장 바람직하게 Globo H 부분을 포함한다.
본원에서 사용한 바와 같이, "면역원성"이란 용어는 면역 반응을 자극하는 면역원, 항원, 또는 백신의 능력을 지칭한다.
본원에서 사용한 바와 같이, "면역요법"이란 용어는 예방학적 및/또는 치료학적 목적을 달성하기 위해 면역계를 조절하는 개념에 기반한 다수의 치료 전략을 지칭한다.
본원에서 사용한 바와 같이, "에피토프"란 용어는 항체 또는 T 세포 수용체의 항원 결합 부위와 접촉하는 항원 분자 부분으로서 정의된다.
본 발명의 "치료학적 조성물"은 바람직하게는 "치료학적 접합체" 및/또는 "치료학적 항체"를 포함한다. 상기 치료학적 접합체는 담체에 결합된 적어도 하나의 항원을 포함한다. 바람직하게, 상기 치료학적 접합체의 결합은 공유결합이다. 상기 치료학적 접합체의 하나의 구현예에서, 상기 항원은 글리칸, 예를 들어 Globo H 부분이고, 상기 담체는 KLH 부분 및/또는 KLH 부분 서브유닛이다. 이와 같이, 상기 치료학적 접합체란 용어는 하나 이상의 Globo H 부분에 결합된 하나 이상의 KLH 부분 서브유닛을 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 치료학적 접합체란 용어는 약 또는 적어도 1, 10, 102 또는 103개의 Globo H 부분에 결합된 하나 이상의 KLH 부분을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 치료학적 접합체란 용어는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160개 또는 그 이상의 Globo H 부분에 결합된 하나 이상의 KLH 부분을 포함한다. 또 다른 구현예는 상기와 같은 Globo H 결합된 KLH 부분 서브유닛의 단리된 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체 또는 육량체, 또는 이들의 조합을 포함한다.
하나의 구현예에서, 상기 치료학적 접합체는 Fucα(1→2)Galβ(1→3)GalNAcβ(1→3)Galα(1→4)Galβ(1→4)Gluβ(1-O-에틸히드라질-1-카보닐-사이클로헥실-4-(메틸-N-말레이미도)-3-(티오부틸-이미딜)-키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)(또한 OPT-822로도 지칭한다)이다.
"치료학적 항체"는 본 발명의 치료학적 접합체 및 바람직하게는 상기 치료학적 접합체의 Globo H 부분과 특이적으로 결합되는 항체(하기에 추가로 정의한 바와 같은)인 것으로 정의된다.
본원에서 사용한 바와 같이, "백신"이란 용어는 항원과 관련된 질병에 대한 면역성을 부여하는데 사용되는 치료학적 접합체를 함유하는 치료학적 조성물을 지칭한다. 암 백신은 면역계를 통해, 손상된 세포 또는 이상 세포, 예를 들어 암세포에 의해 부과된 위험으로부터 자신을 보호하는 신체의 고유 능력을 증대시키도록 설계된다. 보호성 면역반응은 질병의 중증도를 감소시키는 것, 예를 들어 비제한적으로 질병의 예방, 질병 개시의 지연, 증상의 감소된 중증도, 감소된 이환율, 및 지연된 사망률이다. 바람직하게, 백신은 체액 면역반응(가령, B 림프구에 의한 항체 생산의 자극) 및 세포 면역반응(가령, T-림프구 및/또는 다른 세포, 예를 들어 NK 세포 및 대식세포에 의해 매개되는 면역반응)을 모두 활성화시킬 수 있다. 상기 면역반응을 측정하기 위한 표준 분석, 예를 들어 효소-결합된 면역흡수 분석(ELISA), 유동 세포측정, 세포증식 분석, CTL 분석, 및 ADCC/CDC 분석이 개발되었다.
본원에서 사용한 바와 같이, "글리칸"이란 용어는 폴리사카라이드, 또는 올리고사카라이드를 지칭한다. 글리칸은 또한 본 발명에서 당접합체, 예를 들어 당단백질, 당지질, 글리코펩티드, 글리코프로테옴, 펩티도글리칸, 리포폴리사카라이드 또는 프로테오글리칸의 탄수화물 부분을 지칭하는데 사용된다. 글리칸은 대개 모노사카라이드들 간의 O-글리코시드 결합만으로 이루어진다. 예를 들어, 셀룰로스는 β-1,4-결합된 D-글루코스로 구성된 글리칸(또는 보다 구체적으로 글루칸)이고, 키틴은 β-1,4-결합된 N-아세틸-D-글루코스아민으로 구성된 글리칸이다. 글리칸은 모노사아카라이드 잔기의 호모 또는 헤테로중합체일 수 있으며, 선형이거나 또는 분지될 수 있다. 글리칸은 당단백질 및 프로테오글리칸에서와 같이 단백질에 결합되어 존재할 수 있다. 상기는 일반적으로 세포의 외부 표면 상에서 발견된다. O- 및 N-결합된 글리칸은 진핵생물에 매우 통상적이나, 원핵생물에서도, 덜 흔하기는 하지만, 또한 발견될 수 있다. N-결합된 글리칸은 상기 시퀀 중에 아스파라진의 R-기 질소(N)에 결합되어 존재한다. 상기 시퀀은 Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr 서열이며, 이때 X는 프랄린을 제외한 임의의 아미노산이다. 바람직한 글리칸은 Globo H 부분이다.
Globo H는 헥사사카라이드로, 다양한 유형의 암, 특히 유방, 전립선, 췌장, 위, 난소, 결장 및 폐암 상에서 고도로 발현되는 항원성 탄수화물 계열의 일원이다. 예시적인 구현예에서, 몇몇 환자는 0시간째에 항-Globo H 항체 수준을 나타내지 않았으며, 본 발명의 치료학적 조성물로 면역화 후에 높은 역가가 검출되었다. 다른 예시적인 구현예에서, 몇몇 환자는 0시간째에 항-Globo H 항체 수준을 나타내었으며, 본 발명의 치료학적 조성물로 면역화 후에 높은 역가가 검출되었다. 몇몇 구현예에서, 상기 항-Globo H 항체는 암세포 표면 상에서 당지질 및 가능하게는 당단백질로서 발현된다. 다른 구현예에서, 유방암 환자의 혈청은 상기 Globo H 에피토프에 대한 높은 수준의 항체를 함유하였다. 몇몇 구현예에서, 상기 에피토프는 또한 면역조직화학 연구에서 단클론 항체 Mbr1, VK9 및 항-SSEA-3에 의해 표적화된다. 정상 유방, 췌장, 소장 및 전립선 조직을 포함한 몇몇 정상 조직이 또한 Mbr1과 반응하지만, 이들 조직 중 항원은 우세하게는, 면역계로의 출입이 제한된 분비 경계에 배치된다.
"Globo H 부분"은 본 발명에서 Globo H 또는 그의 단편이나 유사체인 글리칸(즉, 당 부분을 함유하는 분자)인 것으로 정의된다. Globo H는 헥사사카라이드 에피토프(Fucα1 → 2 Galβ1 → 3 GalNAcβ1 → 3 Galα1 → 4 Galβ1 → 4 Glc), 및 임의로 비-당 부분을 함유하는 글리칸이다. 그의 단편은 상기 헥사사카라이드 에피토프의 단편, 및 적용 가능한 경우, 비-당 부분을 함유하는 글리칸이다. 이들 올리고사카라이드는 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다(문헌[Huang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:15-20 (2006)] 참조). 경우에 따라, 상기를 비-당 부분에 결합시킬 수 있다. 미국특허 출원 제 12/485,546 호는 비-인간 포유동물(가령, 마우스, 토끼, 염소, 양, 또는 말)에게 상술한 면역 조성물을 투여하고 Globo H 또는 그의 단편에 결합되는 포유동물 항체로부터 단리함으로써, Globo H 또는 그의 단편에 특이적인 항체를 생성하는 방법에 관한 것이다.
Globo H의 유사체를 글리칸 미세배열을 사용하여 생성할 수 있으며, 문헌[Wang et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 August 19; 105(33): 11661-11666]에 개시되고, 도 1에 도시된 것들을 포함한다.
Globo H 유사체는, 바람직하게는 항체 VK-9, Mbr1 및 항-SSEA-3에 결합된다. 바람직하게, 상기 Globo H 유사체는 특정한 해리 상수(KD,surf)로 결합한다. 표면 상 해리 상수(KD,surf)를 생성하기 위해 결합 곡선을 분석하는데 있어서, 랭뮤어 등온식을 사용할 수 있다. 배양 중 동등한 조건에서, 복제된 스폿들의 평균 형광(Fobs)을 하기에 의해 개시할 수 있다:
Figure pct00007
상기에서, Fmax는 표면 상의 활성 탄수화물량의 크기인 최대 형광 강도이고, [P]는 총 항체 농도이고, KD,surf는 표면 탄수화물 및 항체에 대한 평형 해리 상수이다. 왕(Wang) 등의 문헌에 개시된 바와 같이, 일부 구현예에서, Globo H 유사체의 바람직한 (KD,surf)는 상기 왕 등에 개시된 VK-9, Mbr1 및 항-SSEA-3 항체에 관하여 적어도, 약 또는 정확히 0.4, 0.5., 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5 또는 1.6 nm이다.
"키홀 림펫 헤모시아닌"(KLH)은 거대 키홀 림펫인 메가투라 크레눌라타(Megathura crenulata)의 혈림프에서 발견되는 큰, 다중 서브유닛, 산소-운반 금속단백질이다. KLH는 약 400 kDa(가령, KLH 단량체) 내지 약 8000 kDa(가령, KLH 20량체)의 분자량을 갖는 응집체 중의 약 350,000 내지 약 390,000의 분자량을 갖는 서브유닛들로 이루어지는 이종 글리코실화된 단백질이다. KLH 서브유닛의 각 도메인은 단일 산소 분자에 함께 결합하는 2개의 구리 원자를 함유한다. 산소가 헤모시아닌에 결합되는 경우, 상기 분자는 특유의 투명한 유백빛 청색을 띤다. 몇몇 구현예에서, 상기 KLH 단백질은 인간에서 효능 있는 면역원성이지만 안전하다. 몇몇 구현예에서, KLH를, 전형적으로 암모늄 설페이트 침전 및 투석을 포함하고, 크로마토그래피 정제를 포함하여 최고의 순도를 획득할 수 있는 일련의 단계에 의해 메가투라 크레눌라타의 혈림프로부터 정제할 수 있다. 몇몇 구현예에서, KLH 정제는 또한 내독소 제거를 포함할 수 있지만, 상기 단계는 상기 내독소가 항체 생산을 위해 주사될 때 항원보강제로서 작용할 수 있기 때문에 불필요할 수도 있다. 바람직하게, 투명한 유백빛 청색을 갖는 양질의 KLH 제제가 KLH 용해도의 최선의 지시자이다. 몇몇 구현예에서, 상기 KLH 단량체 단위들은 약 4,000 kDa 내지 8,000 kDa의 총 분자량을 갖는 큰 다량체(십량체 또는 20량체)로 조립된다. "키홀 림펫 헤모시아닌 부분" 또는 "KLH 부분"은 본 발명에서 KLH1(서열번호 1) 또는 KLH2(서열번호 2) 단백질 또는 이와 실질적으로 동일한 단백질 또는 이들의 혼합물인 것으로 정의된다. 이러한 맥락에서 실질적으로 동일하다는 것은 각 KLH 부분이 고유의 야생형 KLH의 아미노 서열과 적어도, 약 또는 정확하게 100, 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 89, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 79, 78, 77, 76 또는 75퍼센트 일치하는 아미노 서열을 가짐을 의미한다. 몇몇 구현예에서, 본 발명의 KLH는 증대된 면역원 활성, 특히 증대된 항-종양 활성을 갖는다. 몇몇 구현예에서, 본 발명의 조성물 중의 KLH는 대략 400,000 분자량의 완전한, 분해되지 않은 서브유닛을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 KLH는 보다 높은 KLH 다량체를 포함한다.
몇몇 구현예에서, 상기 보다 높은 KLH 다량체는 약 92 내지 107S의 침강 계수와 함께 대략 8백만 내지 1천만의 분자량을 갖는다. 상기 존재하는 보다 높은 KLH 다량체의 양은 침강-평형 및/또는 침강-속도 초원심분리 분석에 근거한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 KLH는 증대된 면역원성 활성, 특히 증대된 항-종양 활성을 나타낸다. 상기 증대된 면역원성 활성은 예를 들어, (a) KLH의 주사(항원보강제 없이), (b) 항원보강제로서 사용된 KLH, (c) 합텐 또는 약하게 면역원성인 항원에 대한 담체 면역원으로서 KLH, 및 (d) 항-종양제로서 사용된 KLH에 의해 나타나지만, 이들로 제한되지 않는다. 본 발명의 KLH 조성물은 다수의 종양, 예를 들어 비제한적으로 방광, 유방, 난소 종양 등에 대해 증대된 항-종양 활성을 나타낸다. 몇몇 구현예에서, 2개의 KLH 부분은 KLH 단량체들 간의 공유 결합을 통해 이량체를 형성할 수 있다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, KLH 부분들 간의 공유 결합은 디설파이드 결합을 통해서인 것으로 여겨진다. 몇몇 구현예에서, 2개 이상의 KLH 부분은 KLH 단량체들, 이량체들, 삼량체들 등 간의 공유 결합을 통해 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체 등을 형성할 수 있다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, KLH 부분들 간의 공유 결합은 디설파이드 결합을 통해서인 것으로 여겨진다.
항원에 대한 KLH 부분의 결합을 위한 다양한 방법들, 예를 들어 직접 접합 및 이작용성 링커기, 예를 들어 4-(4-N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실 히드라지드(MMCCH)와의 접합이 존재한다. 상기와 같은 결합 기법은 미국특허 제 6,544,952 호에 개시되어 있다. 몇몇 구현예에서, 본 발명의 치료학적 접합체를 제조하기 위해, 예를 들어 Globo H 알릴 글리코시드를 가오존분해에 의해 알데히드로 전환시키고, 상기 알데히드기를 상기 가교결합제 MMCCH 상의 NH기에 결합시켜, Globo H-MMCCH를 제공하고; 상기 담체 단백질, KLH에 티올화를 가하여 KLH-SH를 생성하고; 이어서 티올화된 KLH 상의 설프히드릴기를 상기 MMCCH 상의 말레이미드기에 결합시켜 Globo H-KLH 접합체를 생성한다.
하나의 구현예에서, Globo H 알릴 글리코시드는 화학 합성을 통해 제조된다. 티올화 시약, 2-이미노티올란 및 cGMP-등급 KLH 및 4-(4-N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카복실 히드라지드(MMCCH) 링커가 또한 사용된다. 일부 구현예에서 하기의 단계들을 수행한다: 1) Globo H 알릴 글리코시드의 Globo H-알데히드로의 전환; 2) 별도로, Globo H-알데히드와 MMCCH의 Globo H-MMCCH로의 커플링; 3) KLH의 화학적 티올화; 4) Globo H-MMCCH의 티올화된 KLH에의 접합; 및 5) Globo H-KLH 접합체(OPT-822)의 정제. 예를 들어, 도 2a를 참조하면 된다.
몇몇 구현예에서, Globo H 부분 단백질의 KLH 부분에의 접합 중에, 몇몇 구현예에서 KLH 부분 단백질은, 바람직하게는 Globo H 부분 서브유닛 해리로 인해 완전한 분자에 비해 분자량의 감소를 나타낸다. 다른 구현예에서, 본원에 개시한 접합 방법은 앞서 보고되지 않은 KLH 서브유닛 해리를 생성한다. 임의의 특정한 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 본 발명의 Globo H 부분-KLH 부분 서브유닛 접합체의 높은 글리코실화 수준은, 상기 Globo H 부분들 사이에 수소 결합을 형성시키는 것으로 예상된다. 이와 같이, 몇몇 구현예에서, 상기 KLH 부분 서브유닛들 간의 반데르 발스력 및 소수성 상호작용이 Globo H 수소 결합에 의해 치환되고, 이는 KLH 부분 서브유닛 분리를 유도한다. 접합에 이어서, Globo H 부분-KLH 부분 접합체의 KLH 부분 서브유닛은, 바람직하게는 응집되어 새로운 단량체, 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체 또는 육량체 또는 이들의 임의의 조합을 형성한다. 상기 생성되는 치료학적 Globo H 부분-KLH 부분 접합체는 뜻밖에도 큰 에피토프 비를 가져서, 예기치 않게 우수한 면역원성 성질을 생성한다. 몇몇 구현예에서, 상기 Globo H 부분은 KLH1 및 KLH2 상의 리신에 접합된다. 다른 구현예에서, 상기 Globo H 부분은 KLH1 및 KLH2 상의 리신에 접합되지 않는다. 몇몇 구현예에서, 상기 Globo H-접합된 리신 부위는 펩티드 지도분석에서 보존되는 것으로 발견되며, 이는 상기 Globo H-KLH 조성물이 구조상 독특함을 암시한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 치료학적 조성물은 하나 이상의 KLH 부분 서브유닛을 포함하며, 여기에서 적어도 하나의 상기와 같은 서브유닛은 적어도, 약 또는 정확하게 1, 10, 102 또는 103 배로 접합된다: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159 또는 160개 이상의 Globo H 부분.
발명자들은 질량 분광분석법을 사용하여 상기 Globo H 부분이 KLH의 리신 잔기에 접합됨을 발견하였다. 따라서, 몇몇 구현예에서, 상기 Globo H 부분은 리신 잔기에 접합되는 것이 바람직하다.
하나의 구현예에서, KLH 부분 서브유닛당 총 정확하게 또는 약 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160개의 총 리신 잔기가 존재한다. 또 다른 구현예에서, KLH 부분 서브유닛당 정확하게 또는 약 150 또는 156개의 리신 잔기가 존재한다. 또 다른 구현예에서, Globo H 부분에 결합하기 위해 이용가능하거나 또는 상기 부분에 실제로 결합된 각각의 KLH 부분 서브유닛 상에 정확하게 또는 약 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109 또는 110개의 리신 접합 부위가 존재한다. 또 다른 구현예에서 각각의 KLH 부분 서브유닛 상에 62, 66, 67, 68, 70, 72, 76, 86, 87, 88, 90, 92, 93, 100개의 상기와 같은 리신 접합 부위가 존재한다. 리신 접합 부위는 Globo H 부분 및/또는 Globo H 부분에 대한 링커, 예를 들어 MMCCH 링커에 결합하기 위해 이용가능하거나 또는 상기 부분에 실제로 결합되는 KLH 부분 중의 리신 잔기들이다.
부분 서브유닛들(가령, KLH1 및 KLH2 또는 이들의 변체)의 혼합물을 함유하는 몇몇 치료학적 구현예에서, 상이한 서브유닛 유형 전체에 대해 계산되는 총 이용 가능한 리신(상기 두 서브유닛 모두에 대해서)은 정확히 약 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309 또는 310개이거나 또는 일 수 있다. 상기와 같은 구현예에서, 상이한 서브유닛(가령, KLH1 및 KLH2 또는 이들의 변체) 전체에 대해 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159 또는 160개의 리신 접합 부위가 존재하거나 또는 정확하게 또는 약 상기와 같이 존재할 수 있다. 다른 상기와 같은 구현예에서, 136, 137, 141, 140, 143, 147 또는 155개의 리신 접합 부위가 존재한다.
가장 바람직한 구현예에서 KLH1/KLH2 중의 총 306개 리신 잔기 중 136, 137, 140, 141, 143, 147 또는 155개의 리신 접합 부위가 존재한다.
몇몇 구현예에서, 본 발명의 치료학적 조성물은 KLH 부분 서브유닛-Globo H 부분 접합체들의 혼합물을 함유하며, 여기에서 상기와 같은 접합체는 단량체로 남아있거나 또는 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체 또는 육량체 또는 임의의 이들의 조합을 형성한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 치료학적 조성물은 단리된 KLH 부분 서브유닛-Globo H 부분 접합체 단량체, 이량체, 삼량체 또는 사량체 또는 이들의 조합을 포함한다. 추가의 구현예에서, 본 발명의 치료학적 조성물은 오직 KLH 부분 서브유닛-Globo H 부분 접합체 이량체 및 삼량체만을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 상기 치료학적 조성물은 적어도 2개의 KLH 부분 서브유닛을 함유하며, 여기에서 상기 두 KLH-부분 서브유닛은 각각 상이한 글리칸에 결합된다. KLH 부분 서브유닛에 결합할 수 있는 다른 종양-관련된 글리칸 항원은 비제한적으로 GM2, GD2, GD3, 푸코실, GM1, sTn, 시알릴-루이스x, 루이스x, 시알릴 루이스a, 루이스a, sTn, TF, 폴리시알산, 루이스y, 뮤신, T 항원 등을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 치료학적 조성물 중 단지, 적어도 또는 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 퍼센트의 KLH 부분 서브유닛이 Globo H 부분에 결합되는 반면, 상기 치료학적 조성물 중의 나머지 KLH 부분 서브유닛은 다른 종양-관련된 글리칸 항원에 결합된다.
본원에서 사용한 바와 같이, 본원에 개시한 치료학적 접합체에 관한 "에피토프 비"는 예를 들어, 치료학적 접합체 중의 항원 에피토프 대 담체 분자의 관계를 지칭한다. 바람직하게, 상기는 Globo H 부분 대 KLH 부분의 관계를 지칭한다. 가장 바람직하게 치료학적 접합체의 에피토프 비를 하기 식 = (실제 Globo H 부분 중량/Globo H 부분 분자량)/(실제 KLH 부분 중량/KLH 부분 분자량)을 사용하여 계산한다. 에피토프 비를 당해 분야의 숙련가들에 의해 쉽게 측정할 수 있다. 바람직하게, 상기 Globo H의 중량을 예를 들어, 고성능 음이온 교환 크로마토그래피와 펄스화된 전류측정 검출(HPAEC-PAD)에 의해 측정한다.
바람직하게, 본 발명의 치료학적 접합체의 에피토프 비는 약, 적어도 또는 정확하게 하기와 같다: 1, 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975, 1000, 1025, 1050, 1075, 1100, 1125, 1150, 1175, 1200, 1225, 1250, 1275, 1300, 1325, 1350, 1375, 1400, 1425, 1450, 1475, 1500, 1525, 1550, 1575, 1600, 1625, 1650, 1675, 1700, 1725, 1750, 1775, 1800, 1825, 1850, 1875, 1900, 1925, 1950, 1975, 2000, 2025, 2050, 2075, 2100, 2125, 2150, 2175, 2200, 2225, 2250, 2275, 2300, 2325, 2350, 2375, 2400, 2425, 2450, 2475, 2500, 2525, 2550, 2575, 2600, 2625, 2650, 2675, 2700, 2725, 2750, 2775, 2800, 2825, 2850, 2875, 2900, 2925, 2950, 2975 또는 3000.
하나의 구현예에서, 본 발명의 치료학적 조성물은 일련의 에피토프 비를 갖는 치료학적 접합체들의 혼합물을 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 치료학적 조성물 중의 상기 치료학적 접합체의 범위, 평균 또는 중간 에피토프 비는 약 10 내지 약 3200, 약 800 내지 약 2500, 약 1000 내지 약 2000, 약 1250 내지 약 1750 또는 약 1400 내지 약 1600이다. 또 다른 구현예에서, 상기 치료학적 조성물 중의 상기 치료학적 접합체의 범위, 평균 또는 중간 에피토프 비는 약 10 내지 약 150, 약 40 내지 약 125, 약 50 내지 약 100, 약 62 내지 약 87, 또는 약 70 내지 약 80이다. 또 다른 구현예에서, 상기 치료학적 조성물 중의 상기 치료학적 접합체의 범위, 평균 또는 중간 에피토프 비는 약 20 내지 약 300, 약 80 내지 약 250, 약 100 내지 약 200, 약 125 내지 약 175, 또는 약 140 내지 약 160이다. 또 다른 구현예에서, 상기 치료학적 조성물 중의 상기 치료학적 접합체의 범위, 평균 또는 중간 에피토프 비는 약 30 내지 약 450, 약 120 내지 약 375, 약 150 내지 약 300, 약 185 내지 약 260, 또는 약 210 내지 약 240이다. 일부 약학 조성물에서 상기 치료학적 접합체의 적어도 또는 약 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98, 99 또는 100%가 단량체로서, 또는 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체 또는 이들의 혼합물로서 존재한다.
치료학적 접합체에 대한 항체
몇몇 예시적인 구현예에서, 본 발명은 또한 본원에 개시한 치료학적 접합체와 친화성으로 특이적으로 결합되는 단리된 치료학적 항체뿐만 아니라, 증식성 질병의 치료 및/또는 진단에서의 그의 사용법을 포함한다.
본원에서 사용한 바와 같이, "항체" 및 "항체들"(면역글로불린)이란 용어는 단클론 항체(전체길이 단클론 항체 포함), 다클론 항체, 적어도 2개의 완전 항체로부터 형성된 다중특이성 항체(예를 들어 이중특이성 항체), 인간 항체, 인간화된 항체, 카멜화된(camelised) 항체, 키메릭 항체, 단쇄 Fv(scFv), 단쇄 항체, 단일 도메인 항체, 도메인 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, 목적하는 생물 활성을 나타내는 항체 단편, 디설파이드-결합된 Fv(sdFv), 및 항-유전자형(항-Id) 항체(가령, 본 발명의 항체에 대한 항-Id 항체 포함), 인트라바디, 및 상기 중 어느 하나의 에피토프-결합 단편을 포함한다. 특히, 항체는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자, 즉 항원-결합 부위를 함유하는 분자의 면역학적으로 활성인 단편을 포함한다. 면역글로불린 분자는 임의의 유형(가령, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 부류(가령, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위부류의 것일 수 있다.
본원에 개시한 치료제(들)에 사용되는 에피토프, 예를 들어 치료학적 접합체의 Globo H 부분에 대한 항체의 "친화성"은 당해 분야에서 충분히 이해되는 용어이며 에피토프에 대한 항체의 결합 정도 또는 강도를 의미한다. 친화성을 당해 분야에 공지된 다수의 방식, 예를 들어 비제한적으로 평형 해리 상수(KD 또는 Kd), 겉보기 평형 해리 상수(KD' 또는 Kd') 및 IC50(경쟁 분석에서 50% 억제를 수행하는데 필요한 양)으로 측정하고/하거나 나타낼 수 있다. 본 발명의 목적을 위해서, 친화성은 에피토프에 결합되는 항체의 주어진 집단에 대한 평균 친화성인 것으로 이해하면 된다. ㎎ IgG/㎖ 또는 ㎎/㎖에 의해 본 발명에서 보고된 KD'의 값은 Ig ㎎/혈청 ㎖을 가리키지만, 혈장을 사용할 수도 있다. 항체 친화성이 본원에 개시한 치료 방법의 투여, 또는 본원에 개시한 치료 방법의 선택에 대한 기준으로서 사용될 때, 항체 친화성을 치료 전 및/또는 치료 도중에 측정할 수 있으며, 획득된 값은 인간 환자가 치료에 적합한 후보인지의 여부를 평가하는데 있어서, 임상의가 사용할 수 있다.
본원에서 사용한 바와 같이, "특이적으로 결합되는"이란 용어는 결합쌍(가령, 항체와 항원) 간의 상호작용을 지칭한다. 다양한 경우에, 특이적으로 결합되는 것은 적어도 또는 약 10-6 몰/리터, 약 10-7 몰/리터, 또는 약 10-8 몰/리터 또는 그 이하의 친화성 상수에 의해 구현될 수 있다.
생물학적 분석
하나의 구현예에서, 본 발명의 치료학적 접합체를 함유하는 치료학적 조성물은 환자에게 투여시, 동일한 실험에서 상기 투여 전의 동일한 항-Globo H 항체 역가(즉, 전처리 기준선 역가)보다 적어도 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 50, 100, 250, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 4000, 또는 5000 배 초과의 항-Globo H 항체 역가를 유도할 수 있다. 몇몇 구현예에서 상기 항-Globo H 항체는 IgM 항체이다. 또 다른 구현예에서, 상기 항-Globo H 항체는 IgG 항체이다.
본 발명의 치료학적 조성물은 환자에게서 체액 및 세포 반응 모두를 유도할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 본 발명의 백신 조성물은 Globo H 부분-특이성 IgG 및 IgM 항체의 생산 및 B 세포 및 T 세포(가령, CD3+T 세포, CD4+T 세포 및/또는 CD8+T 세포)의 확대를 유도한다. 전형적으로, 이들 면역 반응은 투여 후 연대순으로 발생한다. 특정한 예에서, 투여 후 상기 B 세포 생산은 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30 또는 60일째에 나타나고, 이어서 약 10, 20, 30, 60, 또는 90일째에 IgG 및 IgM 항체가 생산되고 이어서 약 24, 30, 40, 50, 60, 90, 120, 150 또는 180일째에 T 세포가 생산된다. 본 발명의 백신 조성물은 질병 안정화 및 생존 개선을 달성하도록 소량의 암세포의 성장을 예방할 수 있고, 이에 의해 미세잔존질병에 이상적일 수 있는 장기적인 면역학적 보호 효과를 잠재적으로 제공한다.
"항체-의존성 세포-매개된 세포독성" 및 "ADCC"는 비-특이적인 세포독성 세포(가령, 천연 살해(NK) 세포, 호중구, 및 대식세포)가 표적 세포상의 결합된 항체를 인식하고 이어서 상기 표적 세포의 용해를 야기하는 세포-매개된 반응을 지칭한다. 하나의 구현예에서, 상기와 같은 세포는 인간 세포이다. 임의의 특정한 작용 기전에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, ADCC를 매개하는 상기 세포독성 세포는 일반적으로 Fc 수용체(FcRs)를 발현한다. ADCC를 매개하는 주요 세포인 NK 세포는 FcγRIII을 발현하는 반면, 단핵세포는 FcγRI, FcγRII, FcγRIII 및/또는 RcγRIV를 발현한다. 조혈세포상의 FcR 발현은 문헌[Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991)]에 요약되어 있다. 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해서, 시험관내 ADCC 분석, 예를 들어 미국특허 제 5,500,362 호 또는 미국특허 제 5,821,337 호에 개시된 분석을 수행할 수 있다. 상기와 같은 분석에 유용한 효과기 세포는 말초혈액 단핵세포(PBMC) 및 천연 살해(NK) 세포를 포함한다. 한편으로, 또는 추가로, 본 발명의 치료학적 접합체의 ADCC 활성을 생체내에서, 예를 들어 문헌[Clynes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 95:652-656 (1998)]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다.
"보체 의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체 활성화를 개시하고 보체의 존재하에서 표적을 용해시키는 치료학적 접합체의 능력을 지칭한다. 상기 보체 활성화 경로는 상기 보체 시스템(C1q)의 제1 성분의, 동족 항원과 착화된 분자(가령, 항체)에의 결합에 의해 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해서, 예를 들어 문헌[Gazzano-Santaro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996)]에 개시된 바와 같은 CDC 분석을 수행할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 치료학적 접합체를 함유하는 치료학적 조성물은 환자에게 투여시, Globo H 양성 암세포주, 예를 들어 MCF-7 세포에 특이적으로 결합되는 항-Globo H 면역 혈청의 환자/피실험자에서의 생성을 유도할 수 있다.
조합
치료학적 조성물은 다른 항암/증식억제 약물뿐만 아니라, 항원보강제 및 다른 면역조절 분자, 예를 들어 사이토킨 또는 케모킨을 포함할 수 있다. 이들 작용제를 모두 별도의 용기 중에서 또는 단일 용기 중에서 함께 키트 중에서 전달할 수 있다. 상기 작용제들을 투여시에 또는 투여전 적어도 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24분, 시간 또는 일 전에 합할 수 있다.
항원보강제는 다른 작용제의 효과를 변형시키는 약물학적 또는 면역학적 작용제이다. 상기는 주어진 항원에 대해 면역 반응을 증대시키는 무기 또는 유기 화학물질, 거대분자 또는 전체 암세포 또는 그의 일부일 수 있다. 항원보강제는 완전 및 불완전 프로인트 항원보강제, 톨형 수용체 분자 및 그의 유사물질, LPS, 리포단백질, 리포펩티드, 플라젤린, 이중-가닥 RNA, 메틸화되지 않은 CpG 섬, 레바미솔, 바실러스 칼메트-게랭, 옥트레오티드, 이소프리노신 및 자닥신, 세균 및 바이러스에 의해 전형적으로 방출되는 다양한 형태의 DNA 및 RNA, PD-1 길항물질 및 CTLA 길항물질을 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 항원보강제는 사포닌 항원보강제이다.
몇몇 구현예에서, 상기 사포닌 항원보강제는 OPT-821 사포닌이며, 이는 실질적으로 순수하다. 다른 구현예에서, 상기 OPT-821 사포닌은 그의 생물학적으로 활성인 단편이다. 상기 항원보강제는 또한 순수하지 않은 형태의 OPT-821 사포닌을 포함할 수 있다. 상기 정제된 OPT-821 사포닌은 본원에 개시한 백신과 함께 투여되거나 다른 실질적으로 순수한 사포닌 또는 비-사포닌 항원보강제와 혼합될 때 증대된 항원보강제 효과를 나타낸다.
OPT-821 사포닌은, 예를 들어 미국특허 제 5,057,540 호 및 미국특허 제 6,524,584 호(내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)에 개시된 바와 같은 고압 액체 크로마토그래피(high pressure liquid chromatography, HPLC), 저압 액체 실리카 크로마토그래피, 및 친지성 상호작용성 크로마토그래피(hydrophilic interactive chromatography, HILIC)에 의해, 퀼라자 사포나리아(Quillaja saponaria) 몰리나 나무의 껍질로부터 높은 순도로 추출된 천연 글리코시드이다. 고압 액체 크로마토그래피 분석은 OPT-821이 구조적으로 관련된 이성체성 화합물들의 혼합물임을 나타낸다. OPT-821 사포닌의 상이한 정제된 이성체성 화합물은 본원에서 확인 및 개시하였다.
몇몇 구현예에서, OPT-821 사포닌은 하기와 같은 화학식 I의 적어도 하나의 단리된 화합물을 포함한다:
[화학식 I]
Figure pct00008
상기 식에서,
R1은 β-D-아피오스 또는 β-D-자일로스이고;
R2 및 R3은 독립적으로 H, 알킬,
Figure pct00009
(화합물 1989에 대한 지방 아실 부분), 또는
Figure pct00010
(화합물 1857에 대한 지방 아실 부분)이다.
OPT-821 사포닌은 또한
(i) R1이 β-D-아피오스이고, R2가 상기 묘사된 1989 화합물에 대한 지방 아실 부분이고, R3이 H이거나(1989 화합물 V1A);
(ii) (ii) R1이 β-D-아피오스이고, R2가 H이고, R3이 상기 묘사된 1989 화합물에 대한 지방 아실 부분 지방 아실 부분이거나(1989 화합물 V1B);
(iii) (iii) R1이 β-D-자일로스이고, R2가 상기 묘사된 1989 화합물에 대한 지방 아실 부분 지방 아실 부분이고, R3이 H이거나(1989 화합물 V2A); 또는
(iv) (iv) R1이 β-D-자일로스이고, R2가 H이고, R3이 상기 묘사된 1989 화합물에 대한 지방 아실 부분 지방 아실 부분인(1989 화합물 V2B)
화학식 I의 단리된 화합물을 포함할 수 있다. 종합적으로, 1989 화합물 V1A, 1989 화합물 V1B, 1989 화합물 V2A 및 1989 화합물 V2B를 "1989 화합물 혼합물"이라 칭한다.
표 1은 1989 화합물들의 작용기들 및 1857 화합물 혼합물 중의 각 1857 화합물의 몰%를 요약하였다.
Figure pct00011
Figure pct00012
OPT-821 사포닌은 또한
(i) R1이 β-D-아피오스이고, R2가 상기 묘사된 1857 화합물에 대한 지방 아실 부분이고, R3이 H이거나(1857 화합물 V1A);
(ii) R1이 β-D-아피오스이고, R2가 H이고, R3이 상기 묘사된 1857 화합물에 대한 지방 아실 부분이거나(1857 화합물 V1B);
(iii) R1이 β-D-자일로스이고, R2가 상기 묘사된 1857 화합물에 대한 지방 아실 부분이고, R3이 H이거나(1857 화합물 V2A); 또는
(iv) R1이 β-D-자일로스이고, R2가 H이고, R3이 상기 묘사된 1857 화합물에 대한 지방 아실 부분인(1857 화합물 V2B)
화학식 I의 단리된 화합물을 포함할 수 있다.
종합적으로, 1857 화합물 V1A, 1857 화합물 V1B, 1857 화합물 V2A 및 1857 화합물 V2B를 "1857 화합물 혼합물"이라 칭한다.
표 2는 1857 화합물들의 작용기들 및 1857 화합물 혼합물 중의 각 1857 화합물의 몰%를 요약하였다. HPLC.
Figure pct00013
Figure pct00014
OPT-821 사포닌은 하기의 화합물들 중 하나 이상을 포함한다:
(i) 1857 화합물 V1A;
(ii) 1857 화합물 V1B;
(ii) 1857 화합물 V2A;
(iii) 1857 화합물 V2B;
(iv) 1989 화합물 V1A;
(v) 1989 화합물 V1B;
(vi) 1989 화합물 V2A; 및
(vii) 1989 화합물 V2B.
OPT-821 사포닌 중 1857 화합물 혼합물 및 1989 화합물 혼합물의 백분율은 하기와 같은 범위일 수 있다:
(i) 1857 화합물 혼합물을 포함하는 OPT-821의 약 1 몰% 내지 약 15 몰%; 및
(ii) 1989 화합물 혼합물을 포함하는 OPT-821의 약 85 몰% 내지 약 99 몰%.
상기 몰%는 모두 0.1%의 증분까지 변할 수 있다(가령, 약 87% 내지 약 90%, 약 90.5% 내지 약 97%, 약 3.5% 내지 약 11%, 약 10% 내지 약 14%).
상기 1989 화합물 혼합물은 약 60 내지 70 몰%의 1989 화합물 V1A; 약 1 내지 5 몰%의 1989 화합물 V1B; 약 30 내지 40 몰%의 1989 화합물 V2A; 및 약 0.1 내지 3 몰%의 1989 화합물 V2B를 포함할 수 있다. 상기 몰%는 모두 0.1%의 증분까지 변할 수 있다(가령, 65%, 2.5%, 35.6%).
상기 1857 화합물 혼합물은 약 60 내지 70 몰%의 1857 화합물 V1A; 약 1 내지 5 몰%의 1857 화합물 V1B; 약 30 내지 40 몰%의 1857 화합물 V2A; 및 약 0.1 내지 3 몰%의 1857 화합물 V2B를 포함할 수 있다. 상기 몰%는 모두 0.1%의 증분까지 변할 수 있다(가령, 65%, 2.5%, 35.6%).
또 다른 구현예에서, 상기 실질적으로 순수한 OPT-821을 조 퀼라자 사포나리아 추출물로부터 정제하며, 여기에서 상기 OPT-821은, 11분 동안 A:B 95%:5% 내지 75%:25%의 이동상(여기에서 이동상 A는, 1 ㎖/분의 유량의, 0.1% 트리플루오로아세트산과 함께 증류수이고 이동상 B는 0.1% 트리플루오로아세트산과 함께 아세토니트릴이다)을 포함하는 용리 프로그램으로 5 um 입자 크기, 100 Å 기공, 4.6 ㎜ ID x 25 ㎝ L을 갖는 시메트리(Symmetry) C18 컬럼 상의 역상-HPLC 상에서 분석시, 용매 피크를 제외하고, 크로마토그램의 모든 피크의 전체 면적의 90% 이상을 차지하는 단일의 우세한 피크를 특징으로 한다.
하나의 구현예에서, 상기 약학 조성물은 하기 화학식 I의 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다:
화학식 I
Figure pct00015
상기 식에서,
R1은 β-D-아피오스 또는 β-D-자일로스이고;
R2 및 R3은 독립적으로 H, 알킬, 또는
Figure pct00016
(화합물 1857에 대한 지방 아실 부분)이다.
상기 백신은 탄수화물 항원 또는 그의 면역원성 단편 및 OPT-821 사포닌을 포함할 수 있다. 더욱 또 다른 구현예에서, 상기 백신은 탄수화물 항원 또는 그의 면역원성 단편; 담체 단백질 및 OPT-821 사포닌을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 백신은 Globo H, KLH, 및 OPT-821 사포닌 중에서 선택된 탄수화물 항원을 포함한다. 담체 단백질의 비제한적인 예는 KLH를 포함한다.
본원에서 사용한 바와 같이, "사이토킨"이란 용어는, 일반적으로 전구체 세포를 별개의 특수 세포 유형으로 만드는 유전자 발현의 변화를 수반하는 면역세포 분화 과정에 영향을 미침으로써, 상기 면역 반응의 강도 및 지속기간을 조절하는 임의의 다수의 작은 분비 단백질을 지칭한다. 사이토킨은 추정되는 기능, 분비 세포, 또는 작용 표적을 근거로 림포킨, 인터류킨 및 케모킨으로서 다양하게 명명되어 왔다. 예를 들어, 일부 통상적인 인터류킨은 비제한적으로 IL-2, IL-12, IL-18, IL-2, IFN-γ, TNF, IL-4, IL-10, IL-13, IL-21, GM-CSF, 및 TGF-β를 포함한다.
본원에서 사용한 바와 같이, "케모킨"이란 용어는 림프구의 동원 및 활성화 수단을 제공하는 감염 부위에서 방출된 임의의 다양한 작은 화학주화성 사이토킨을 지칭한다. 케모킨은 감염 부위로 백혈구를 끌어당긴다. 케모킨은 4개의 그룹으로 지정되는 보존된 시스테인 잔기를 갖는다. 전형적인 케모킨과 함께 상기 그룹은 C-C 케모킨(RANTES, MCP-1, MIP-1α 및 MIP-1β), C-X-C 케모킨(IL-8), C 케모킨(림포탁틴), 및 CXXXC 케모킨(프랙탈킨)이다.
본 발명의 치료학적 조성물은 PD-1/PD-L1 억제제(세포독성 T 세포 림프구(CTL) 면역요법제), CTLA-4 면역요법제, CDK4/6 억제제(표적 요법제), PI3K 억제제(표적 요법제), mTOR 억제제(표적 요법제), AKT 억제제(표적 요법제), Pan-Her 억제제(표적 요법제)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 억제제들을 변형시켜 또한 각각의 단클론 항체를 생성할 수 있다. 상기와 같은 항체는 본 발명의 치료학적 조성물 중에 포함될 수 있다.
상기 치료학적 조성물은 다른 항암/증식억제제 또는 화학요법제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기와 같은 작용제의 예는 문헌[Cancer Principles and Practice of Oncology by V.T. Devita and S. Hellman (editors), 6th edition (February 15, 2001), Lippincott Williams & Wilkins Publishers]에서 발견된다. 상기와 같은 항암제는 비제한적으로 하기를 포함한다: 호르몬 치료제(가령, 선택성 에스트로젠 수용체 조절제, 안드로젠 수용체 조절제), 단클론 항체 요법, 화학요법, 레티노이드 수용체 조절제, 세포독성/세포발육정지제, 종양억제제, 증식억제제, 프레닐-단백질 트랜스퍼라제 억제제, HMG-CoA 리덕타제 억제제, 질소 머스터드, 니트로소 우레아, 혈관형성 억제제(가령, 베바시주맵), 세포 증식 및 생존 신호전달 경로의 억제제, 세포사멸 유도제, 세포주기 검사점을 방해하는 작용제, 수용체 티로신 키나제(RTK)를 방해하는 작용제, 라파미신의 포유동물 표적(mTOR) 억제제, 인간 상피 성장인자 수용체 2(HER2) 억제제, 상피 성장인자 수용체(EGFR) 억제제, 인테그린 차단제, NSAID, PPAR 작용물질, 내재성 다중약물 내성(MDR)의 억제제, 구토방지제, 빈혈 치료에 유용한 작용제, 호중구감소증의 치료에 유용한 작용제, 면역학적-증대 약물, 비포스포네이트, 아로마타제 억제제, 종양세포의 말단 분화를 유도하는 작용제, γ-세크레타제 억제제, 암 백신, 및 이들의 임의의 조합.
본 발명의 제형
상기 치료학적 조성물(또한 본 발명에서 약학 조성물로도 지칭한다)은 일반적으로 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 본원에서 사용한 바와 같이 "약학적으로 허용 가능한 담체"란 말은 약제 투여에 적합한 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 보충적인 활성 화합물이 또한 상기 조성물에 혼입될 수 있다. 약학 조성물을 목적하는 투여 경로에 적합하도록 제형화한다. 투여 경로의 예는 비경구, 예를 들어 정맥내, 피내, 피하, 근육내, 동맥내, 경구(또는 흡입), 경피(국소), 점막흡수, 및 직장 투여를 포함한다. 비경구, 피내 또는 피하 적용에 사용되는 용액 또는 현탁액은 하기의 성분들을 포함할 수 있다: 멸균 희석제, 예를 들어 주사용수, 염수 용액, 포스페이트 완충 염수, 트리스-완충 염수, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜, 또는 기타 합성 용매; 항균제, 예를 들어 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 산화방지제, 예를 들어 아스코르브산 또는 나트륨 비설파이트; 킬레이트제, 예를 들어 에틸렌 디아민 테트라아세트산; 완충제, 예를 들어 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트 및 긴장성 조절제, 예를 들어 염화 나트륨 또는 덱스트로스. pH를 산 또는 염기, 예를 들어 염산 또는 수산화 나트륨으로 조절할 수 있다. 비경구 제제를 앰풀, 일회용 주사기, 또는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 다중 용량 바이알 중에 넣을 수 있다.
주사용으로 적합한 약학 조성물은 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 주사성 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여를 위해서, 적합한 담체는 생리식염수, 정균수, 크레모포어(Cremophor) EL(등록상표)(BASF, 미국 뉴저지주 팔시파니 소재), 또는 포스페이트 완충 염수(PBS)를 포함한다. 모든 경우에, 상기 조성물은 멸균성이어야 하며, 용이한 주사성이 존재할 정도로 유동성이어야 한다. 상기는 제조 및 보관 조건하에서 안정성이어야 하며, 미생물, 예를 들어 세균 및 진균의 오염 작용으로부터 보호되어야 한다. 상기 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(가령, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산액 매질일 수 있다. 적합한 유동성을 예를 들어, 코팅제, 예를 들어 레시틴의 사용에 의해서, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해서, 및 계면활성제의 사용에 의해서 유지할 수 있다. 미생물 작용의 예방은 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 여러 경우에, 상기 조성물 중에 등장성제, 예를 들어 당, 폴리알콜, 예를 들어 만니톨, 솔비톨, 또는 염화 나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 상기 주사성 조성물의 연장된 흡수는 상기 조성물 중에 흡수 지연제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함함으로써 발생할 수 있다.
멸균 주사성 용액을, 상기 활성 화합물을 적합한 용매 중에서 필요한 양으로, 상기 열거된 성분들 중 하나 또는 이들의 조합과 함께 혼입시킨 다음, 필요한 경우 여과 살균하여 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 상기 활성 화합물을 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것들 중 필요한 다른 성분들을 함유하는 멸균 비히클에 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사성 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 제조 방법은 상기 활성 성분에 미리 멸균-여과한 용액으로부터의 임의의 추가적인 목적하는 성분을 합한 분말을 제공하는 진공 건조 및 동결-건조를 포함한다.
경구 조성물은 일반적으로 불활성 희석제 또는 식용 담체를 포함한다. 경구용 치료학적 투여를 위해서, 상기 활성 화합물을 부형제와 함께 혼입시키고 정제, 트로키제, 또는 캡슐, 예를 들어 젤라틴 캡슐 형태로 사용할 수 있다. 경구 조성물을 또한 구강세정제용 유동 담체를 사용하여 제조할 수 있다. 약학적으로 적합한 결합제, 또는 항원보강제 물질을 상기 조성물의 일부로서 포함할 수 있다. 정제, 환제, 캡슐, 트로키제 등은 하기의 성분들 및 유사한 성질의 화합물들 중 임의의 것을 함유할 수 있다: 결합제, 예를 들어 미정질 셀룰로스, 검 트라가칸트 또는 젤라틴; 부형제, 예를 들어 전분 또는 락토스, 붕해제, 예를 들어 알긴산, 프리모젤, 또는 옥수수 전분; 윤활제, 예를 들어 마그네슘 스테아레이트 또는 스테로트; 윤활제, 예를 들어 콜로이드성 이산화 규소; 감미제, 예를 들어 슈크로스 또는 사카린; 또는 풍미제, 예를 들어 페퍼민트, 메틸 살리실레이트, 또는 오렌지향.
흡입에 의한 투여를 위해서, 상기 화합물을 적합한 추진제, 예를 들어 기체, 예를 들어 이산화 탄소를 함유하는 가압 용기 또는 분배기, 또는 분무기로부터 에어로졸 스프레이의 형태로 전달한다.
전신 투여는 또한 점막흡수 또는 경피일 수 있다. 점막흡수 또는 경피 투여의 경우, 침투시켜야 할 장벽에 적합한 침투제를 상기 제형에 사용한다. 상기와 같은 침투제는 당해 분야에 일반적으로 공지되어 있으며, 예를 들어 점막흡수 투여의 경우 세제, 담즙염, 및 푸시딘산 유도체를 포함한다. 점막흡수 투여를 코 스프레이 또는 좌약의 사용을 통해서 수행할 수 있다. 경피 투여의 경우, 상기 활성 화합물을 당해 분야에 일반적으로 공지된 바와 같은 연고, 고약, 젤 또는 크림으로 제형화한다. 상기 화합물을 또한 좌약(가령, 통상적인 좌약 베이스, 예를 들어 코코아 버터 및 다른 글리세라이드를 사용하여) 또는 직장 전달의 경우 관장약의 형태로 제조할 수 있다.
실행에 따라, 상기 활성 화합물을 신체로부터의 빠른 제거에 대해 상기 화합물을 보호하는 담체로, 예를 들어 이식물 및 미세캡슐화된 전달 시스템을 포함한 조절된 방출 제형으로 제조한다. 생분해성, 생체적합성 중합체, 예를 들어 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오쏘에스테르, 및 폴리락트산을 사용할 수 있다. 상기와 같은 제형의 제조 방법은 당해 분야의 숙련가들에게 자명할 것이다. 상기 물질을 또한 상업적으로 입수할 수 있다. 리포솜 현탁액(세포-특이성 항원에 대한 단클론 항체와 함께 감염된 세포에 표적화된 리포솜을 포함한다)을 또한 약학적으로 허용 가능한 담체로서 사용할 수 있다. 이들을 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 방법에 따라, 예를 들어 본 발명에 참고로 인용된 미국특허 제 4,522,811 호에 개시된 바와 같이 제조할 수 있다.
경구 또는 비경구 조성물을 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 단위 투여형으로 제형화하는 것이 유리하다. 본원에서 사용한 바와 같은 단위 투여형은 치료하려는 환자에게 단일 투여량으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하며; 각 단위는 필요한 약학 담체와 함께 목적하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 소정량의 활성 화합물을 함유한다.
투여형
상기와 같은 치료학적 조성물의 독성 및 치료학적 효능을 세포 배양 또는 실험 동물에서, 예를 들어 LD50(집단의 50%에 치사적인 용량) 및 ED50(집단의 50%에서 치료학적으로 유효한 용량)의 측정을 위한 표준 약학 과정에 의해서 측정할 수 있다. 독성과 치료학적 효과 간의 용량 비는 치료 지수이며, 이를 LD50/ED50 비로서 나타낼 수 있다. 높은 치료 지수를 나타내는 치료학적 조성물이 바람직하다. 독성 부작용을 나타내는 화합물을 사용할 수 있지만, 상기와 같은 화합물을 감염된 위치의 부위에 표적화하는 전달 시스템은, 감염되지 않은 세포에 대한 잠재적인 손상을 최소화하고 그로 인한 부작용이 감소되도록 주의해서 설계해야 한다.
세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 획득한 데이터를 인간에 사용하기 위한 투여량 범위의 제형화에 사용할 수 있다. 상기와 같은 화합물의 투여량은 바람직하게는 상기 ED50을 독성 없이 또는 거의 없이 포함하는 순환 농도의 범위 내에 둔다. 상기 투여량은 사용하는 투여형 및 사용하는 투여 경로에 따라 상기 범위 내에서 변화시킬 수 있다. 본 명세서의 방법에서 사용하는 임의의 화합물에 대해서, 상기 치료 유효량을 처음에 세포 배양 분석을 통해 추정할 수 있다. 용량을 동물 모델에서 세포 배양물에서 측정된 바와 같은 IC50(즉, 증상의 최대-절반 억제를 달성하는 시험 화합물의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하도록 제형화할 수 있다. 상기와 같은 정보를 사용하여 인간에서 유용한 용량을 보다 정확하게 측정할 수 있다. 혈장 중 수준을 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정할 수 있다.
일부 구현예에서, 치료학적 조성물의 치료 유효량(즉, 유효 투여량)은 약 0.001 ㎍/㎏ 내지 약 250 g/㎏, 0.01 ㎍/㎏ 내지 10 g/㎏, 또는 0.1 ㎍/㎏ 내지 1 g/㎏, 또는 약 또는 적어도 0.001, 0.002, 0.003, 0.004, 0.005, 0.006, 0.007, 0.008, 0.009; 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09;0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 또는 250 그램 또는 마이크로그램/환자의 체중 킬로그램의 범위, 또는 과도한 실험 없이 숙련가에게 자명하고 이해되는 다른 범위일 수 있다. 상기 숙련가는 예를 들어, 비제한적으로 질병 또는 질환의 중증도, 선행 치료, 환자의 일반적인 건강 또는 연령, 및 존재하는 다른 질병을 포함한 몇몇 인자가 환자를 유효하게 치료하기 위해 필요한 투여량 및 시기에 영향을 미칠 수 있음을 인식할 것이다.
다른 구현예에서, 상기 치료학적 조성물 중의 Globo-H 부분의 치료 유효량(즉, 유효 투여량)은 0.001 ㎍/㎏ 내지 약 250 g/㎏, 0.01 ㎍/㎏ 내지 10 g/㎏, 또는 0.1 ㎍/㎏ 내지 1 g/㎏, 또는 약 또는 적어도 0.001, 0.002, 0.003, 0.004, 0.005, 0.006, 0.007, 0.008, 0.009; 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09;0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 또는 250 그램 또는 마이크로그램/환자의 체중 킬로그램의 범위, 또는 과도한 실험 없이 숙련가에게 자명하고 이해되는 다른 범위일 수 있다. 상기 숙련가는 예를 들어, 비제한적으로 질병 또는 질환의 중증도, 선행 치료, 환자의 일반적인 건강 또는 연령, 및 존재하는 다른 질병을 포함한 몇몇 인자가 환자를 유효하게 치료하기 위해 필요한 투여량 및 시기에 영향을 미칠 수 있음을 인식할 것이다.
몇몇 구현예에서, 본원에 개시한 치료학적 조성물은 적어도 하나의 치료학적 접합체 또는 치료학적 항체를 함유하거나 또는 이와 관련되며, 이때 각각의 적어도 하나의 치료학적 접합체 또는 치료학적 항체는 용량당 매번 10-9, 10-8, 10-710-710-610-5 10-410-310-210-1 몰로, 약, 적어도 또는 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99 초과 농도의 단일 용량으로 존재한다. 바람직하게, 상기 치료학적 접합체는 약 1-100, 2-60, 3-50, 4-40, 5-30, 6-20, 7-15, 8-10, 2-18, 3-16, 4-14, 5-12, 6-10 또는 7-8 μM 농도의 단일 용량으로 존재한다.
일부 구현예에서, 본원에 개시한 치료학적 조성물은 적어도 하나의 치료학적 접합체 또는 치료학적 항체를 함유하거나 또는 이와 관련되며, 이때 각각의 적어도 하나의 치료학적 접합체 또는 치료학적 항체는 매번 10-3, 10-2, 10-1 또는 10 마이크로그램으로, 약, 적어도 또는 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99 초과 농도의 단일 용량으로 존재한다. 몇몇 구현예에서, 용량당 약 또는 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150 이상 마이크로그램의 하나의 치료학적 접합체 또는 치료학적 항체가 포함된다.
몇몇 구현예에서, 본원에 개시한 치료학적 조성물을 약 또는 적어도 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24일, 주, 개월 또는 년 초과의 기간에 걸쳐 하루, 1주일 또는 1개월당 약 또는 적어도 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24회 초과의 용량으로 투여한다.
키트
또 다른 태양에 따라, 당해 분야의 숙련가는 하나 이상의 부분들의 키트를 구상할 수 있으며, 상기 부분들의 키트는 본원에 개시한 방법들 중 적어도 하나를 수행하고, 상기 부분들의 키트는 하나 이상의 치료학적 접합체, 항암/증식억제제, 항원보강제, 사이토킨 및/또는 케모킨을 포함한다. 상기 치료학적 조성물은 상기에 언급된 방법들 중 적어도 하나에 따른 유효량의 본원에 개시한 치료학적 조성물을 단독으로 또는 함께 포함한다. 상기 언급된 작용제들을 상기 키트 중의 단일 용기 또는 상이한 용기들에 넣을 수 있다.
상기 키트는, 가능하게는 생물학적 사건의 식별자, 또는 본 명세서의 판독시 숙련가라면 식별할 수 있는 다른 화합물을 또한 포함한다. 상기 키트는 또한 유효량의 본원에 개시한 치료학적 조성물을 포함하는 적어도 하나의 조성물을 포함할 수 있다. 본 발명의 적어도 하나의 방법을 수행하기 위한 키트의 치료학적 조성물을 당해 분야의 숙련가라면 식별가능한 과정에 따라 개시하였다.
본 명세서는 또한 본원에 개시한 치료학적 조성물을 사용하여 증식성 질병을 치료하는 방법을 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 방법은 암, 예를 들어 유방암의 치료를 포함한다. 상기 방법은 일반적으로 본원에 개시한 치료학적 조성물을 상기 조성물이 필요한 환자에게 상기 증식성 질환을 치료하기에 유효한 양으로 제공함을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 치료학적 조성물을 상기 조성물이 필요한 환자(예를 들면, 유방암과 같은 암이 있는 환자)에게, 평균적으로 무진행 생존 또는 전체 생존을 대조용 위약, 예를 들어 포스페이트 완충 염수 위약에 비해 약 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40일, 주, 개월 또는 년까지 연장시키는 방법으로 투여한다.
일부 구현예에서, 상기 치료학적 조성물을 허용될 수 없는 독성 또는 질병 진행의 부재하에서 0 내지 2, 6, 14 및 26주째에 피하 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 치료학적 조성물을 상기 조성물이 필요한 환자(예를 들면, 유방암과 같은 암이 있는 환자)에게, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40일, 주, 개월 또는 년의 과정에 걸쳐, 평균적으로 상기 환자의 종양 부피가 대조용 위약, 예를 들어 포스페이트 완충 염수 위약에 비해 약 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 74 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 퍼센트 이상까지 수축시키는 방법으로 투여한다.
일부 구현예에서, 종양 부피를 CT 스캔(CT 스캔 조각 두께는 2.5 ㎜ 내지 5 ㎜인 것이 권장된다)에 의해 10 ㎜의 최소 크기로, 적어도 하나의 치수(측정면 중 최장 직경이 기록된다)에서 정확하게 측정할 수 있다.
본 발명 조성물의 합성 방법
본 발명의 치료학적 조성물의 Globo H 헥사사카라이드 부분을 알릴 글리코시드로서 화학적으로 합성하고 이어서 KLH와의 접합을 위해 제조하였다.
하나의 예시적인 구현예에서, 상기 Globo H의 화학 합성은 하기의 일반적인 단계를 포함한다:
Figure pct00017
Figure pct00018
KLH를 수성 완충제 중에서 2-이미노티올란으로 처리하였다. 이어서 상기 티올화된 KLH를 세파덱스 G-15 컬럼의 크기 배제 컬럼을 통해, 반응하지 않은 2-이미노티올란으로부터 단리하였다. 상기 티올화된 KLH를 불활성 기체(질소 또는 아르곤) 분위기하에서 보관하고 Globo HMMCCH와의 접합을 위해 즉시 사용하였다.
실시예
실시예 1: 본 발명의 당접합체(Globo H-KLH)의 제조
Globo H 알릴 글리코시드(상업적으로 입수할 수 있다)를 가오존분해에 의해 알데히드로 전환시켰다. Globo H 알데히드를 M2C2H(링커) 및 NaCNBH3와 반응시켜 Globo H-MMCCH를 제공하였다. 상기 혼합물을 컬럼으로 정제하여 Globo H-MMCCH를 수득했다. Globo H-MMCCH 양성 분획을 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 확인하고 이어서 함께 모았다. KLH를 티올화 완충액에 용해시키고 2-이미노티올란을 상기 반응물에 나누어 첨가하였다. 상기 반응이 완료되도록 배양하고 이어서 KLH-SH를 컬럼에 의해 정제하였다. Globo H-MMCCH 및 KLH-SH 둘을 합하였다. 상기 반응이 완료되도록 교반하였다. 이어서 Globo H-KLH를 정제하여 최종 생성물을 제공하였다.
실시예 2: 당접합체 중의 Globo H 대 KLH의 중량비의 분석
상기 제조된 바와 같은 당접합체 중의 Globo H 및 KLH의 중량비를 고성능 음이온 교환 크로마토그래피와 펄스화된 전류측정 검출(HPAEC-PAD)에 의해 확인하였다. 결과를 표 3에 나타낸다.
Figure pct00019
실시예 3: 당접합체 중의 Globo H 대 KLH의 에피토프 비의 분석
KLH 20량체(천연 응집된 형태)의 분자량은 문헌, 예를 들어 문헌[Micron 30(1999) 597-623]에 개시된 바와 같이, 대략 7.5 MDa 내지 8.6 MDa이다. 고유 KLH는 크기 배제 크로마토그래피 및 다각도 레이저 산란 분광분석(multi-angle laser scattering spectrometry, MALS)에 의해 대략 8.6 MDa의 분자량을 갖는 것을 확인하였다(도 3 및 4를 참조하면 된다). 본 발명의 당접합체(샘플 번호 5, Globo H 대 KLH의 중량비는 0.17:1)를 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분석하였다. 상기 결과는 본 발명의 당접합체가 고유의 응집된 KLH 20량체에 비해 감소된 질량 분자량을 나타내었음을 보여준다. 도 4를 참조하면 된다. 이어서 상기 분자비를 표 4에서와 같이 계산하였다.
Figure pct00020
상기에 제공된 바와 같이, 본 발명의 당접합체에서 KLH 단량체 단위는 Globo H에 접합 후 단량체, 이량체 및/또는 삼량체를 형성하는 것으로 추정되었다.
실시예 4: 백신 조성물의 제조 및 래트에서 면역화
실시예 1에서 제조된 바와 같은 당접합체(Globo H-KLH)의 상이한 샘플들을 4 ℃에서 보관하고, 층류 후드하에서 사포닌 항원보강제와 혼합하였다. 생성된 백신 조성물을 얼음 위에 놓고 후속의 면역화를 위해 동물 시설로 옮겼다.
3개 그룹의 루이스 래트를 표 5에 나타낸 바와 같은 다양한 백신 조성물로 면역화시켰다.
Figure pct00021
상기 래트를 0, 7, 14 및 21일째에 면역화시켰다. 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC) 및 혈장을 0, 3, 10, 17, 24 및 31일째에 수집하였다. 비장, 림프절 및 복막 세척액을 31일째에 수거하였다.
실시예 5: 래트에서 체액 및 세포 면역 반응의 유도에 대한 분석
실시예 5.1 유동 세포측정에 의한 면역 효과기 세포 아집단의 분석
상기 말초혈액 단핵세포(PBMC)를 상기 동물로부터 단리하고 이어서 상기 PBMC 중의 다양한 면역 효과기 세포 아집단을 상이한 세포 마커에 대한 특이성 항체를 사용하여 유동 세포측정에 의해 확인하였다. 0, 3, 10, 17, 24 및 31일째에 상기 면역화된 래트로부터 단리된 PBMC를 상이한 형광(FITC)-접합된 항체로 염색하고 30분 동안 얼음 위에 두었다. 배양 후에, 세포를 세척 완충액(포스페이트 완충 염수(유니리젼 바이오테크(UniRegion Biotech)) 중의 1% 소 혈청 알부민(시그마(Sigma)) 및 0.1% NaN3(시그마))로 세척하고, 350 g에서 5분 동안 원심분리하였다. 세포를 FACS 칸토(Canto)(BD 바이오사이언스(Bioscience))에 의해 형광 측정을 위해 세척 완충액 중에 재현탁시켰다. 상기 데이터를 BD FACSDiva(BD 바이오사이언스) 소프트웨어로 분석하였다. 상기 결과는 본 발명의 당접합체에 의해 면역화된 래트에서, T 세포, B 세포, CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포가 PBS 대조용 그룹에 비해 현저하게 확대되었음을 보여준다. 구체적으로, 상기 B 세포 집단이 3일째에 처음 나타났으며 이어서 24일째에 CD3+ T, CD4+ T 및 CD8+ T 세포가 나타났다. 도 5(A) 내지 (D)를 참조하면 된다.
실시예 5.2 ELISA에 의한 Globo H-특이성 항체 시험
상기 면역화된 래트로부터의 혈장 중 Globo H-특이성 항체의 생산을 ELISA 분석에 의해 측정하였다. 상기 결과는 Globo H-특이성 IgG의 역가가 10일째에 상승하기 시작하여 면역 후 17일째에 최대였음을 보여준다. 유사한 패턴이 Globo H-특이성 IgM 항체의 생산에서 관찰되었다. 도 5(A) 내지 (B)를 참조하면 된다. PBS, 또는 KLH + 항원보강제 단독으로 처리한 래트에서는 Globo H-특이성 IgG 및 IgM 항체의 반응이 없었다(데이터 도시생략).
요약하면, 상기 면역화된 래트에서, B 세포 생산은 3일째에 나타나고, 이어서 10일째에 Globo H에 대한 IgM 및 IgG 항체의 생산이 나타나며, 이어서 24일째에 CD3+ T, CD4+ T 및 CD8+ T 세포가 나타난다. 본 발명의 당접합체(Globo H-KLH)는 체액 및 세포 반응 모두의 유도에 유효하다.
실시예 6: 마우스에서 면역화 및 ELISA에 의한 항체 시험
상기 당접합체(Globo H-KLH)로부터의 상이한 샘플들을 4 ℃에서 보관하고, 층류 후드하에서 사포닌 항원보강제와 혼합하였다. 생성된 백신 조성물을 얼음 위에 놓고 후속 면역화를 위해 동물 설비로 옮겼다.
대략 8주된 Balb/c 마우스에게 피하 주사를 통해 4주 동안 매주 1회(0, 7, 14 및 21일) 상이한 탄수화물 대 단백질(Globo H:KLH) 비로 Globo H-KLH를 제공하였다. 혈액 샘플을 면역전 또는 0일째, 및 각각의 백신화 후 3일째(10, 17 및 24일)에 응고방지제 없이 후안와 또는 안면 정맥을 통해 채혈하였다. 이어서 샘플을 원심분리시켜 혈청과 적혈구를 분리하였다. 혈청을 수집하고 -20 ℃에서 보관하였으며, 이를 나중에 ELISA에 의해 분석하였다. 만-휘트니 t-검정을 통계분석에 사용하였다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따르는 당접합체(Globo H-KLH)는 사포닌 항원보강제와 함께, PBS 대조군과 비교시 상기 동물 모델에서 Globo H-특이성 IgM 항체 반응을 현저하게 유도하는 것이 입증되었다. 구체적으로, 0.17:1(Globo H:KLH)의 중량비를 갖는 당접합체는 0.07:1(Globo H:KLH)의 중량비를 갖는 당접합체보다 더 양호한 항체 역가를 유도하였다.
요약하면, 본 발명에 따르는 당접합체(Globo H-KLH)는 적합한 항원보강제와 함께 상기 동물 모델에서 뜻밖에도 우수한 체액 및 세포 면역 반응, 특히 암 면역요법에 중요한, CTL과 IgM 및 IgG 반응을 포함한 B 세포 및 T 세포의 확대를 유도하는 것이 입증되었다.
실시예 7: 마우스에서 항원보강제 백신의 존재 또는 부재하의 Globo H-KLH의 면역원성 연구
항원보강제와 짝을 이루었을 때, 마우스에서 면역 반응을 유도하는 본 발명의 Globo H 조성물의 능력이 수행되었다. 상기 면역요법에 의해 유도된 Globo H 특이성 항체의 양을 ELISA 및 FACS에 의해 정량분석하였다.
6주 된 암컷 C57BL/6 마우스의 그룹을 Globo H-KLH 및 항원보강제로 피하 면역시켰다. Globo H-KLH 용량 수준은 Globo H-KLH 중의 Globo H의 양(㎍으로)과 등가이다. 각각의 주사는 Globo H-KLH 중의 0.6 ㎍ 내지 5.0 ㎍의 Globo-H 및 20 ㎍의 항원보강제와 동등한 범위의 용량을 함유하였다. 상기 면역화는 0, 8 및 14일째에 발생하였으며, ELISA 및 FACS에 의한 비교 분석을 위해 0일째(주사전) 및 24일째에 혈청을 수집하였다. Globo H 세라미드에 대한 항체의 역가를 측정하기 위해 ELISA, 및 Globo H 양성 MCF-7 세포에 대한 세포 표면 반응성을 측정하기 위해 FACS에 의해 혈청학적 반응을 측정하였다.
상기 면역화 전체를 통해, 백신접종 후 행동, 식욕, 일반적인 외관 및 털 손질의 명백한 변화는 없었다. 세 번째 면역화 후 10일째에, 양성 반응에 대한 기준으로서 전처리 값의 ≥8배 역가를 사용하여, ELISA에 의한 IgG 및 IgM 항-Globo H 항체 역가의 측정을 위해 혈청을 수집하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, Globo H 단독, Globo H KLH 접합체, 또는 항원보강제 단독으로 처리한 마우스에서 반응은 없었다. 대조적으로, Globo H-KLH + 항원보강제로 처리한 14/15 마우스는 상당한 IgG 항-Globo H 역가(0.6 내지 5 ㎍의 Globo H-KLH 투여량에서 용량 의존적인 것으로 보이지 않았다)로 응답하였다. 각 투여량에 대한 평균 IgG 역가는 상기 전처리 값에 비해 13 내지 17.5배까지 증가하였다. IgM 항-Globo H에 관하여, 상기 15마리 마우스 중 한 마리가 항원보강제 + Globo H-KLH에 의한 면역화 후 8배의 역가 증가를 보였다. 그러나, 5/15는 면역전 혈청의 ≥4배의 IgM 역가를 가졌으며 총 6/15은 ≥2배의 역가를 가졌다. 각 투여량에 대한 평균 IgM 역가는 상기 전처리 값에 비해 2.5배까지 증가하였다.
Globo H-발현 유방암 세포주, MCF-7과의 면역 혈청의 결합 능력을 1:25 혈청 희석비로 FACS 분석에 의해 측정하였다. 상기 전처리 값보다 30% 이상의 후-처리 값(즉, ≥1.3배 증가)이 상기 분석에서 양성으로 간주하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 상기 항원보강제 + Globo H-KLH 처리된 그룹 모두로부터의 면역 혈청은 MCF-7 세포와 반응하는 IgM 항체를 함유하였으며, 그 범위는 전처리 기준선에 비해 5 내지 6배의 범위였다. 더욱이, 0.6 ㎍ 또는 2 ㎍ Globo H-KLH + 항원보강제로 처리한 마우스의 3/5 및 5 ㎍ Globo H-KLH + 항원보강제로 처리한 마우스의 2/5로부터의 면역 혈청이 MCF-7 세포와 결합할 수 있는 IgG 항체를 나타내었다. 상기 평균 결합 능력이 상기 전처리 기준선에 비해 1.3 내지 2.0배 증가하였다.
Globo H-KLH 및 항원보강제에 의한 백신접종은 암컷 C57BL/6 마우스에서 IgG 및 IgM 항-Globo H 반응을 모두 유도하는 것으로 입증되었다. 상기 면역 혈청은 Globo H 발현 유방암 MCF-7 세포와 결합하는 능력을 가졌다.
실시예 8: KLH 상의 Globo H 접합 부위의 LC-MS/MS 분석
다중 효소 절단 및 LC-MS/MS를 사용하여 4개의 KLH 샘플 중의 Globo H 접합 부위를 확인하였다. 상기 4개의 Globo H-접합된 KLH 샘플을 먼저 4개의 상이한 효소로 절단하고 이어서 LC-MS/MS 및 마스코트(Mascot) 데이터베이스 검색에 의해 분석하였다. 2가지 유형의 유도체가 확인되었다: Globo H 유도체(Globo H + MMCCH) 및 MMCCH 유도체(MMCCH 단독). 상기 Globo H 유도체 및 그의 중성 소실 형태를 Globo H 접합 부위 식별로 고려하였다. 상기 MMCCH 형태 및 그의 탈아미드화된 형태는 MMCCH 접합 부위 식별로 고려하였다. 양질의 MS/MS 스펙트럼 및 마스코트 점수를 갖는 펩티드들만을 고려하였다. Globo H 접합 분석의 경우, 31 및 28 접합 리신(conjugated lysines)이 OPT-822-13001-DP(샘플 1)의 2개의 반복 LC-MS/MS 분석을 통해 관찰되었으며; 19 및 21 접합 리신은 OPT-822-13002-DP(샘플 2)의 2개의 반복 LC-MS/MS 분석을 통해 관찰되었고; 10 및 11 접합 리신은 OPT-822-13003-DP(샘플 3)의 2개의 반복 LC-MS/MS 분석을 통해 관찰되었으며; 18 및 19 접합 리신은 OPT-822-13004-DS(샘플 4)의 2개의 반복 LC-MS/MS 분석을 통해 관찰되었다. MMCCH 접합 분석의 경우, 155 및 141 접합 리신이 OPT-822-13001-DP(샘플 1)의 2개의 반복 LC-MS/MS 분석을 통해 발견되었고; 143 및 137 접합 리신은 OPT-822-13002-DS(샘플 2)의 2개의 반복 LC-MS/MS 분석을 통해 발견되었으며; 147 및 143 접합 리신은 OPT-822-13003-DP(샘플 3)의 2개의 반복 LC-MS/MS 분석을 통해 발견되었고; 140 및 136 접합 리신은 OPT-822-13004-DS(샘플 4)의 2개의 반복 LC-MS/MS 분석을 통해 발견되었다.
실시예 8 물질 및 방법:
본 섹션에서 약어는 하기와 같다: K = 리신; LC-MS/MS = 액체 크로마토그래피-병행된 질량 분석법; DTT = 디티올쓰레이톨; IAM = 요오도아세트아미드; ACN = 아세토니트릴; FA = 포름산; Glu-C = 엔도프로테이나제 Glu-C; ABC = 암모늄 비카보네이트; RT = 실온; MW = 분자량.
4개의 KLH 샘플, 샘플 1 내지 4를 먼저 100 kDa 컷오프 아미콘(Amicon) 초원심분리 필터에 의해 50 mM 암모늄 비카보네이트 완충 용액으로 완충제 교환 처리하고 6M 우레아로 변성시켰다. 이어서 상기 샘플을 37 ℃에서 1시간 동안 10 mM DTT로 환원시키고, 50 mM IAM을 사용하여 30분 동안 암실에서 RT에서 알킬화하고 RT에서 5분 동안 50 mM DTT로 급냉시켰다. 생성 단백질을 상기 우레아 농도가 1M로 될 때까지 희석하고, 하기 섹션에 개시하는 바와 같이 상이한 효소로 용해 절단을 행하였다.
상이한 효소에 의한 용해 절단을 하기의 절단 조건으로 수행하였다: (1) 37 ℃에서 24시간 동안 트립신 절단(단백질:효소 = 40:1) (2) 37 ℃에서 24시간 동안 Glu-C 절단(단백질:효소 = 25:1); (3) RT에서 24시간 동안 키모트립신 절단(단백질:효소 = 25:1); (4) 37 ℃에서 24시간 동안 써모리신 절단(단백질:효소 = 25:1).
절단 반응들을 포름산을 첨가하여 종결하고 4개의 절단된 샘플 모두에 LC-MS/MS 분석을 첨가하였다.
샘플들을 얼티메이트(Ultimate) 3000 RSLC 시스템(디오넥스(Dionex))과 결합된 Q 이그젝티브(Exactive) 질량 분광계(써모 사이언티픽(Thermo Scientific))로 분석하였다. 상기 LC 분리를 하기에 나타낸 구배로 C18 컬럼(어클레임(Acclaim) PepMap RSLC, 75 ㎛ x 150 ㎜, 2 ㎛, 100 Å)을 사용하여 수행하였다:
Figure pct00022
이동상 A: 5% ACN/0.1% FA
이동상 B: 95% ACN/0.1% FA
인-소스 CID를 45 eV로 설정하였다. 전체 MS 스캔을 m/z 350 내지 2000의 범위로 수행하였으며, MS 스캔으로부터 10개의 가장 강한 이온에 MS/MS 스펙트럼에 대한 단편화를 수행하였다. 원 데이터를 마스코트 데이터베이스 검색을 위해 프로테옴 디스커버러(Proteome Discoverer) 1.4에 의해 피크 목록으로 처리하였다.
데이터베이스 검색을 KLH1 및 KLH2[KLH1, EMBL 수납# CAG28307.1; KLH2, EMBL 수납# CAG28308.1]에 대해 마스코트 버전 2.4.1 및 써모 프로테옴 디스커버러 버전 1.4로 수행하였다. 상기 사용된 매개변수들은 하기와 같았다: 효소: 상기 절단 방법에 따른 트립신, Glu-C, 키모트립신 및 써모리신; 고정된 변형: 카브아미도메틸(C).
MMCCH 유도체(MMCCH 단독)에 대한 가변성 변형: 탈아미드화된(NQ), 산화(M), dK_MMCCH-1(K), dK_MMCCH-2(K).
Globo H 유도체(Globo H + MMCCH)에 대한 가변성 변형: 탈아미드화된(NQ), 산화(M), Globo_H_MMCCH(K), dK_MMCCH_NL997(K), dK_MMCCH_NL835(K), dK_MMCCH_NL673(K), dK_MMCCH_NL511(K), dK_MMCCH_NL308(K), 탈아미드화된(NQ), 산화(M), 펩티드 질량 허용: ±10 ppm; 단편 질량 허용: ±0.05 Da; 최대 누락된 틈: 5; 장치 유형: ESI-TRAP; 이온 컷오프 점수: 13.
상기 검색 매개변수들에서 "dK_MMCCH-1"은 352.1569 Da의 MW 가중을 갖는 MMCCH-접합 리신을 가리킨다.
상기 검색 매개변수들에서 "dK_MMCCH-2"는 338.1300 Da의 MW 가중을 갖는 MMCCH-접합 리신의 탈아미드화된 형태를 가리킨다.
상기 검색 매개변수들에서 "Globo_H_MMCCH(K)"는 1393.5317 Da의 MW 가중을 갖는 Globo H-접합 리신을 가리킨다.
상기 검색 매개변수들에서 "dK_MMCCH_NL997"은 396.1831 Da의 MW 가중을 갖는 Globo H-접합 리신의 중성 소실 형태를 가리킨다.
상기 검색 매개변수들에서 "dK_MMCCH_NL835"는 558.2360 Da의 MW 가중을 갖는 Globo H-접합 리신의 중성 소실 형태를 가리킨다.
상기 검색 매개변수들에서 "dK_MMCCH_NL673"은 720.2888 Da의 MW 가중을 갖는 Globo H-접합 리신의 중성 소실 형태를 가리킨다.
상기 검색 매개변수들에서 "dK_MMCCH_NL511"은 882.3416 Da의 MW 가중을 갖는 Globo H-접합 리신의 중성 소실 형태를 가리킨다.
상기 검색 매개변수들에서 "dK_MMCCH_NL308"은 1085.4210 Da의 MW 가중을 갖는 Globo H-접합 리신의 중성 소실 형태를 가리킨다.
상기 "MW 가중"은 완전한 리신 잔기에 비해 분자량 부가를 암시한다.
실시예 8: 결과
LC-MS/MS 기반 기법은 단백질의 식별 및 아미노산 변형의 특성화를 위한 도구이다. 펩티드 서열 및 변형 부위에 관한 상세한 정보를 MS/MS 스펙트럼에 의해 제공된 단편 이온의 지정에 의해 획득할 수 있다. 마스코트는 검색 엔진이며 그의 확률 기반 득점 연산은 잘 허용되었다. 마스코트 점수가 단백질 서열분석 및 Globo H 또는 MMCCH 접합 부위 식별을 위한 신뢰도 기준으로서 본 연구에 채택되었다. 샘플 1 내지 4 중의 Globo H 또는 MMCCH 접합 부위의 분포를 광범위하게 분석하기 위해서, 이들 샘플을 다수의 효소로 절단한 다음 LC-MS/MS 분석을 수행하였다.
Globo H 유도체(Globo H + MMCCH)에 대한 예상되는 화학 구조를 도 33A에 도시하며, 리신-함유 펩티드상의 1393.53 Da의 상응하는 MW 가중을 상기 결과에서 관찰할 수 있다. 그 밖에, 상기 불안정한 폴리사카라이드는 LC-MS 분석에서 전기분무 이온화 동안 중성 소실을 통해 떨어져 나가는 경향이 있다. 따라서, 중성 소실로부터 생성되는 396.18 Da, 558.24 Da, 720.29 Da, 882.34 Da 및 1085.42 Da의 분자량 가중이 또한 도 33B에 도시된 바와 같이, 당접합된 펩티드에 대해 관찰될 수 있다. 모든 유도체화 형태를 Globo H 접합 부위의 식별을 위해 고려하였다.
또한, 상기 MMCCH 유도체가 상기 Globo H 접합된 KLH 샘플에서 또한 관찰된다(MMCCH 단독). MMCCH 유도체 및 그의 탈아미드화된 형태에 대한 예상된 화학 구조를 도 34A 및 34B에 도시하며, 리신-함유 펩티드상의 각각 352.16 Da 및 338.13 Da의 상응하는 MW 가중이 상기 결과에서 관찰될 수 있다. 상기 두 유도체화 형태를 모두 MMCCH 접합 부위의 식별을 위해 고려하였다. Globo H 유도체에서 MMCCH로의 전환은 분명하지 않지만, 상기 샘플 처리 동안 일어나는 것으로 추측된다.
전구체 이온에 대해 ±10 ppm 및 단편 이온에 대해 ±0.05 Da의 질량 정확도를 단백질 식별 및 스펙트럼 해석을 위한 기준으로서 사용하였다. 상기 Globo H 유도체 뿐만 아니라, 그의 중성 소실 형태를 Globo H 접합 부위 식별에 대한 가변성 변형으로서 선택하였으며, MMCCH 유도체 뿐만 아니라, 그의 탈아미드화된 형태를 MMCCH 접합 부위 식별을 위한 가변성 변형으로서 선택하였다. 데이터베이스 검색을 스폰서에 의해 제공된 KLH1 및 KLH2의 서열에 대해 수행하였다. 양질의 MS/MS 스펙트럼(이온 점수 ≥13, p < 0.05)을 갖는 펩티드만을 보고서에 실었다.
반복성 결과를 입증하기 위해서, 도 17에 요약한 바와 같이, 상기 LC-MS/MS 분석을 2회 수행한 다음, Globo H 접합 부위 식별 및 MMCCH 접합 부위 식별 모두를 위한 개별적인 마스코트 데이터베이스 검색을 수행하였다.
Globo H 접합 부위 분석에서, 31 및 28 리신이 각각 샘플 1에 대해서 1차 LC-MS/MS 및 2차 LC-MS/MS에서 발견되었고; 19 및 21 리신이 각각 샘플 2에 대해서 1차 LC-MS/MS 및 2차 LC-MS/MS에서 발견되었고; 10 및 11 리신이 각각 샘플 3에 대해서 1차 LC-MS/MS 및 2차 LC-MS/MS에서 발견되었고; 18 및 19 리신이 각각 샘플 4에 대해서 1차 LC-MS/MS 및 2차 LC-MS/MS에서 발견되었다. 상기 식별 세부사항들을 도 14 내지 21에 나열한다. MMCCH 접합 분석에서, 155 및 141 리신이 각각 샘플 1에 대해서 1차 LC-MS/MS 및 2차 LC-MS/MS에서 발견되었고; 143 및 137 리신이 각각 샘플 2에 대해서 1차 LC-MS/MS 및 2차 LC-MS/MS에서 발견되었고; 147 및 143 리신이 각각 샘플 3에 대해서 1차 LC-MS/MS 및 2차 LC-MS/MS에서 발견되었고; 140 및 136 리신이 각각 샘플 4에 대해서 1차 LC-MS/MS 및 2차 LC-MS/MS에서 발견되었다. 상기 식별 세부사항들을 도 22 내지 29에 나열한다.
다중 효소 실험으로부터의 Globo H 접합 부위를 도 30에 요약하였고 MMCCH 접합 부위를 도 31에 요약하였다. Globo H 접합된 샘플들에 대한 전체적인 접합 부위 분석 결과를 도 32에 요약하였다.
실시예 8 결론:
Globo H 유도체 접합된 펩티드의 질량 분광분석 신호는 폴리사카라이드의 다수의 중성 소실 형태 및 보다 낮은 이온화 효율로 인해 MMCCH 접합된 펩티드의 경우보다 더 낮으며, 이는 Globo H 접합의 직접적인 식별을 보다 어렵게 한다. 이것이, 식별된 펩티드의 수가 MMCCH 접합 분석의 경우 더 높은 이유이다. 따라서, 상기 MMCCH 결과를 사용하여 상기 Globo H 접합을 나타낼 수 있다.
상기 접합 부위 분석은 각각 샘플 1 내지 4에 대해서 KLH1/KLH2 중, 총 306개의 리신 잔기 중에서 식별된 155, 143, 147 및 140 리신 접합 부위가 존재하는 것을 암시한다. 상기 반복 분석에서, 141, 137, 143 및 136 접합 부위가 각각 샘플 1 내지 4에 대해 식별되었다.
달리 정의하지 않는 한, 본 발명에 사용한 모든 과학기술 용어 및 임의의 약어들은 본 발명의 분야의 통상적인 숙련가가 통상적으로 이해하는 바와 같은 의미를 갖는다. 본원에 개시한 경우와 유사하거나 동등한 정보 전달을 위한 임의의 조성물, 방법, 키트 및 수단을 사용하여 본 발명을 수행할 수 있지만, 정보 전달을 위해 바람직한 조성물, 방법, 키트 및 수단을 본 발명에 개시한다.
본 발명에서 인용한 모든 참고문헌들은 법이 허용하는 최대한으로 본 발명에 참고로 인용된다. 상기 참고문헌들에 대한 논의는 단지 상기 문헌 저자들에 의해 수행된 주장을 요약하고자 하는 것이다. 임의의 참고문헌(또는 임의의 참고문헌의 일부)이 관련된 종래 기술임을 인정하는 것은 아니다. 출원인들은 임의의 인용된 참고문헌의 정확성 및 적절성에 도전할 권리를 유보한다.

Claims (57)

  1. 하기의 구조를 포함하는 화합물:
    Figure pct00023

    상기 식에서,
    n은 독립적으로 약 1 내지 약 800의 정수이고,
    m은 독립적으로 약 1 내지 약 5의 정수이며,
    Globo H 부분은 염기성 아미노산 잔기 상의 KLH 부분(들)에 공유 결합된다.
  2. 제 1 항에 있어서, m은 1이고, n은 약 1 내지 약 150인 화합물.
  3. 제 1 항에 있어서, m은 2이고, n은 약 1 내지 약 300인 화합물.
  4. 제 1 항에 있어서, m은 3이고, n은 약 1 내지 약 450인 화합물.
  5. 제 1 항에 있어서, m은 4이고, n은 약 1 내지 약 600인 화합물.
  6. 제 1 항에 있어서, m은 5이고, n은 약 1 내지 약 750인 화합물.
  7. 제 1 항에 있어서, n은 약 60 내지 약 100인 화합물.
  8. 제 1 항에 있어서, n은 약 70 내지 약 90인 화합물.
  9. 제 1 항에 있어서, n은 약 75 내지 약 80인 화합물.
  10. 제 1 항에 있어서, n은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 또는 160인 화합물.
  11. 하나 이상의 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin, KLH) 부분에 공유 결합된 복수의 Globo H 부분을 포함하는 치료학적 조성물로서, 상기 Globo H 부분 대 KLH 부분의 수의 비가 하나의 단량체성 KLH 부분에 대한 Globo H 분자의 수로서 나타내어 약 1:1 내지 약 150:1인 치료학적 조성물.
  12. 하나의 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 부분에 공유 결합된 복수의 Globo H 부분을 포함하는 치료학적 조성물로서, 상기 Globo H 부분의 수가 하나의 단량체성 KLH 부분에 대한 Globo H 분자의 수로서 나타내어 약 1 내지 약 150인 치료학적 조성물.
  13. 2개의 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 부분에 공유 결합된 복수의 Globo H 부분을 포함하는 치료학적 조성물로서, 상기 Globo H 부분의 수가 하나의 이량체성 KLH 부분에 대한 Globo H 분자의 수로서 나타내어 약 1 내지 약 300인 치료학적 조성물.
  14. 3개의 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 부분에 공유 결합된 복수의 Globo H 부분을 포함하는 치료학적 조성물로서, 상기 Globo H 부분의 수가 하나의 삼량체성 KLH 부분에 대한 Globo H 분자의 수로서 나타내어 약 1 내지 약 450인 치료학적 조성물.
  15. 4개의 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 부분에 공유 결합된 복수의 Globo H 부분을 포함하는 치료학적 조성물로서, 상기 Globo H 부분의 수가 하나의 사량체성 KLH 부분에 대한 Globo H 분자의 수로서 나타내어 약 1 내지 약 600인 치료학적 조성물.
  16. 5개의 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 부분에 공유 결합된 복수의 Globo H 부분을 포함하는 치료학적 조성물로서, 상기 Globo H 부분의 수가 하나의 오량체성 KLH 부분에 대한 Globo H 분자의 수로서 나타내어 약 1 내지 약 750인 치료학적 조성물.
  17. 하기의 구조를 포함하는 화합물, 및 선택적으로 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물:
    Figure pct00024

    상기 식에서,
    n은 독립적으로 약 1 내지 약 750의 정수이고,
    m은 독립적으로 약 1 내지 약 5의 정수이다.
  18. 제 17 항에 있어서, m은 1이고, n은 약 1 내지 약 150인 조성물.
  19. 제 17 항에 있어서, m은 2이고, n은 약 1 내지 약 300인 조성물.
  20. 제 17 항에 있어서, m은 3이고, n은 약 1 내지 약 50인 조성물.
  21. 제 17 항에 있어서, m은 4이고, n은 약 1 내지 약 600인 조성물.
  22. 제 17 항에 있어서, m은 5이고, n은 약 1 내지 약 750인 조성물.
  23. 제 17 항에 있어서, n은 약 60 내지 약 100인 화합물.
  24. 제 17 항에 있어서, n은 약 70 내지 약 90인 화합물.
  25. 제 17 항에 있어서, n은 약 75 내지 약 80인 화합물.
  26. 제 17 항에 있어서, n은 약 62, 66, 67, 68, 70, 72, 76, 86, 87, 88, 90, 92, 93 또는 100인 화합물.
  27. 하나 이상의 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 부분 서브유닛에 공유 결합된 복수의 Globo H 부분을 포함하는 치료학적 접합체를 포함하는 약학 조성물로서, 상기 KLH 부분 서브유닛에 대한 Globo H 부분의 수가 약 1:1 내지 약 150:1인 약학 조성물.
  28. 하나 이상의 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 부분 서브유닛에 공유 결합된 복수의 Globo H 부분을 포함하는 치료학적 접합체를 포함하는 약학 조성물로서, 상기 KLH 부분은 단량체, 이량체, 삼량체, 사량체 및 오량체로서 존재하는 약학 조성물.
  29. 하나 이상의 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 부분 서브유닛에 공유 결합된 복수의 Globo H 부분을 포함하는 치료학적 접합체를 포함하는 약학 조성물로서, 상기 KLH 부분 서브유닛에 대한 Globo H 부분의 수가 하나의 이량체성 KLH 부분에 대한 Globo H 분자의 수로서 나타내어 약 1:1 내지 약 300:1인 약학 조성물.
  30. 하나 이상의 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 부분 서브유닛에 공유 결합된 복수의 Globo H 부분을 포함하는 단리된 치료학적 접합체를 포함하는 약학 조성물로서, 상기 KLH 부분 서브유닛에 대한 Globo H 부분의 수가 하나의 삼량체성 KLH 부분에 대한 Globo H 분자의 수로서 나타내어 약 1:1 내지 약 450:1인 약학 조성물.
  31. 하나 이상의 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 부분 서브유닛에 공유 결합된 복수의 Globo H 부분을 포함하는 단리된 치료학적 접합체를 포함하는 약학 조성물로서, 상기 KLH 부분 서브유닛에 대한 Globo H 부분의 수가 하나의 사량체성 KLH 부분에 대한 Globo H 분자의 수로서 나타내어 약 1:1 내지 약 600:1인 약학 조성물.
  32. 하나 이상의 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 부분 서브유닛에 공유 결합된 복수의 Globo H 부분을 포함하는 단리된 치료학적 접합체를 포함하는 약학 조성물로서, 상기 KLH 부분 서브유닛에 대한 Globo H 부분의 수가 하나의 오량체성 KLH 부분에 대한 Globo H 분자의 수로서 나타내어 약 10:1 내지 약 750:1인 약학 조성물.
  33. KLH 부분의 단량체, 이량체, 삼량체, 사량체 또는 오량체 또는 이들의 조합을 포함하는 약학 조성물로서, 각각의 KLH 부분이 KLH 부분에 공유 결합된 하나 이상의 Globo H 부분을 포함하는 약학 조성물.
  34. 제 33 항에 있어서, 조성물 중의 치료학적 접합체의 약 1% 내지 약 99%가 단량체인 약학 조성물.
  35. 제 33 항에 있어서, 조성물 중의 치료학적 접합체의 약 1% 내지 약 99%가 이량체인 약학 조성물.
  36. 제 33 항에 있어서, 조성물 중의 치료학적 접합체의 약 1% 내지 약 99%가 삼량체인 약학 조성물.
  37. 제 33 항에 있어서, 조성물 중의 치료학적 접합체의 약 1% 내지 약 99%가 사량체인 약학 조성물.
  38. 제 33 항에 있어서, 조성물 중의 치료학적 접합체의 약 1% 내지 약 99%가 오량체인 약학 조성물.
  39. 하나 이상의 KLH 부분 서브유닛에 공유 결합된 복수의 Globo H 부분을 포함하는 약학 조성물로서, 상기 조성물 중의 KLH 부분의 약 1% 내지 99%가 단량체, 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 또는 이들의 조합인 약학 조성물.
  40. 제 33 항에 있어서, 항원보강제를 더 포함하고, 상기 항원보강제는 완전 및 불완전 프로인트 항원보강제, 톨형 수용체 분자, LPS, 리포단백질, 리포펩티드, 플라젤린, 이중가닥 RNA, 바이러스 DNA, 메틸화되지 않은 CpG 섬, 레바미솔, 바실러스 칼메트-게랭, 이소프리노신, 자닥신, PD-1 길항물질, PD-1 항체, CTLA 길항물질, CTLA 항체, 인터류킨, 사이토킨, GM-CSF, 당지질, 알루미늄염 기재, 알루미늄 포스페이트, 알룸, 수산화 알루미늄, 리포솜, TLR2 작용물질, 리포펩티드, 나노입자, 모노포스포릴 지질 A, OPT-821 사포닌, 수중 유적형 나노유화액, 및 세균형 입자인 약학 조성물.
  41. 제 33 항에 있어서, IL-2, IL-12, IL-18, IL-2, IFN-γ, TNF, IL-4, IL-10, IL-13, IL-21, GM-CSF 및 TGF-β로 이루어지는 군에서 선택된 사이토킨을 더 포함하는 약학 조성물.
  42. 제 33 항에 있어서, 케모킨을 더 포함하는 약학 조성물.
  43. 제 33 항에 있어서, 호르몬 치료제(가령, 선택적인 에스트로젠 수용체 조절제, 안드로젠 수용체 조절제), 단클론 항체 요법제, 화학요법제, 레티노이드 수용체 조절제, 세포독성/세포발육정지제, 종양억제제, 증식억제제, 프레닐-단백질 트랜스퍼라제 억제제, HMG-CoA 리덕타제 억제제, 질소 머스터드, 니트로소 우레아, 혈관형성 억제제(가령, 베바시주맵), 세포증식 및 생존 신호전달 경로의 억제제, 세포사멸 유도제, 세포주기 검사점을 방해하는 작용제, 수용체 티로신 키나제(receptor tyrosine kinases, RTKs)를 방해하는 작용제, 라파미신의 포유동물 표적(mammalian target of rapamycin, mTOR) 억제제, 인간 상피 성장인자 수용체 2(human epidermal growth factor receptor 2, HER2) 억제제, 상피 성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor, EGFR) 억제제, 인테그린 차단제, NSAID, PPAR 작용물질, 내재성 다중약물 내성(inherent multidrug resistance, MDR)의 억제제, 구토방지제, 빈혈 치료에 유용한 작용제, 호중구감소증의 치료에 유용한 작용제, 면역학적-증대 약물, 비포스포네이트, 아로마타제 억제제, 종양세포의 말단 분화를 유도하는 작용제, γ-세크레타제 억제제, 암 백신, PD-1/PD-L1 억제제(세포독성 T 세포 림프구(CTL) 면역요법제), CTLA-4 면역요법제, CDK4/6 억제제(표적 요법제), PI3K 억제제(표적 요법제), mTOR 억제제(표적 요법제), AKT 억제제(표적 요법제), Pan-Her 억제제(표적 요법제), 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 작용제를 더 포함하는 약학 조성물.
  44. 제 33 항에 있어서, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  45. 제 44 항에 있어서, 상기 약학 조성물은 암 백신인, 약학 조성물.
  46. 제 33 항에 있어서, 피하 주사용으로 제형화된 약학 조성물.
  47. 제 33 항에 있어서, 정맥내 투여용으로 제형화된 약학 조성물.
  48. 제 33 항에 있어서, 근육내 투여용으로 제형화된 약학 조성물.
  49. 암 치료가 필요한 환자에게 치료 유효량의 제 33 항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 환자의 암 치료 방법.
  50. 제 49 항에 있어서, 상기 암은 난소암인 방법.
  51. 제 49 항에 있어서, 상기 암은 상피암인 방법.
  52. 제 49 항에 있어서, 상기 암은 유방암인 방법.
  53. 제 49 항에 있어서, 조성물 중의 Globo-H 부분의 치료 유효량이 약 0.01 ㎍/㎏ 내지 약 250 ㎎/㎏을 포함하는 방법.
  54. 제 49 항에 있어서, 조성물 중의 Globo-H 부분의 치료 유효량이 약 0.10 ㎍/㎏ 내지 약 0.75 ㎍/㎏을 포함하는 방법.
  55. 제 49 항에 있어서, 조성물 중의 Globo-H-KLH 복합체의 치료 유효량이 약 0.01 ㎍/㎏ 내지 약 250 ㎎/㎏을 포함하는 방법.
  56. 제 49 항에 있어서, 조성물 중의 Globo-H-KLH 복합체의 치료 유효량이 약 0.60 ㎍/㎏ 내지 약 4.50 ㎍/㎏을 포함하는 방법.
  57. 치료용 또는 진단용 단클론 항체를 생성하기 위해 동물 또는 인간에서 항체를 유도하는 방법으로서, 상기 동물 또는 인간에게 유효량의 제 49 항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는 방법.
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