JP6431920B2 - 免疫反応を誘導する炭水化物ワクチンの組成とがんの治療におけるその使用 - Google Patents

免疫反応を誘導する炭水化物ワクチンの組成とがんの治療におけるその使用 Download PDF

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Description

本発明は全般としてがんの免疫治療のためのコンポジション（compositon、組成、組成物、構成、構成物、調合、調合物、配合、配合物、混合物（混成物）、成分、成分構成、以下、「組成物」に統一して記載する）及び方法を含み、特に抗がん免疫反応を誘発可能な抗原性の複合糖質を含む。
合成された炭水化物の抱合体（コンジュゲート）が抗体を引き出すことがGoebelとAveryとによって示されたのは1929年のことである。（Goebel, W. F., and Avery, O. T., J. Exp. Med., 1929, 50, 521; Avery, O. T., and Goebel, W. F., J. Exp. Med., 1929, 50, 533.）炭水化物とキャリアタンパク質との結合はベンゼンジアゾニウム配糖体を介していた。ウサギに対して合成抗原で免疫処置することでポリクローナル抗体を生じた。他の研究者はタンパク質キャリアに対して炭水化物を接合する同様の技術を開発した（Allen, P. Z., and Goldstein, I. J., Biochemistry, 1967, 6, 3029; Rude, E., and Delius, M. M., Carbohydr. Res., 1968, 8, 219; Himmelspach, K., et al., Eur. J. Immunol., 1971, 1, 106; Fielder, R. J., et al., J. Immunol., 1970, 105, 265）。
配糖体をワクチン接種による能動免疫療法に用いることで、腫瘍細胞上の標的として知られている因子を特異的な標的とすることができる。Ｔ細胞は腫瘍に対する、体の拒絶反応を補助するが、炭水化物抗原に対する反応では通常、Ｔ細胞が利用されない。抱合体のワクチン接種によって腫瘍に対する完全な拒絶反応が確実に得られるものではないが、このような処置により免疫監視機構を後押しし、新たな腫瘍コロニーの再発を減少させることができる。（Dennis, J., Oxford Glycosystems Glyconews Second, 1992; Lloyd, K. O., in Specific Immunotherapy of Cancer with Vaccines, 1993, New York Academy of Sciences, 50−58）。Toyokuni及びSinghalでは合成配糖体によるIgGの力価の活性化が有意な結果として測定されたことが述べられているが、これはIgGの存在が一般的にヘルパーT細胞の関与を伴っていることによる。
炭水化物抗原であるGlobo H（Fucα１→２ Galβ１→３ GalNAcβ１→３ Galα１→４ Galβ１→４ Glc）は1984年にHakomoriらによって初めて特定され、乳がんMCF-7細胞よりセラミド結合糖脂質として単離された。（Bremer E G, et al. (1984) J Biol Chem 259:14773−14777）。さらに抗Globo Hモノクローナル抗体を用いた研究により、Globo Hが他の多くのがんの表面に存在していることが示された。その中には前立腺がん、胃がん、膵臓がん、肺がん、卵巣がん及び結腸がんが含まれる。ただし通常の分泌組織の管腔側表面に最小限度の発現をしているのみであり、また、かかる場所には免疫機構が容易に到達できない。（Ragupathi G, et al. (1997) Angew Chem Int Ed 36:125−128）。さらに乳がん患者の血清には高い水準で抗Globo H抗体が含まれるという知見が確立している。（Gilewski T et al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98:3270−3275; Huang C−Y, et al. (2006) Proc Natl Acad Sci USA 103:15−20; Wang C-C, et al. (2008) Proc Natl Acad Sci USA 105(33):11661−11666）。Globo H-陽性の腫瘍を有する患者は、Globo H−陰性の腫瘍を有する患者に比べて生存期間が短い。（Chang, Y−J, et al. (2007) Proc Natl Acad Sci USA 104(25):10299−10304）。これらの知見は、六糖の抗原決定基であるGlobo Hが腫瘍マーカーとして興味深いものであり、またがんワクチンの開発を実現可能な標的であることを示している。
合成Globo Hワクチンを免疫アジュバントと組み合わせることで、前立腺がん及び転移性乳がんの患者の双方において、主にIgM抗体を誘導し、またそれよりも低い水準でIgG抗体を誘導することが示された。第Ｉ相臨床試験において、ワクチンの毒性は最小限であり、ワクチン接種部位における局所的な皮膚の反応が一時的に起こった。（Gilewski T et al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98:3270−3275; Ragupathi G, et al. (1997) Angew Chem Int Ed 36:125−128; Slovin S F et al (1997) Proc Natl Acad Sci USA 96:5710−5715）。若干の感冒のような症状が何人かの患者で見られたが、QS−21の副作用に伴うものと考えらえる。五価の（pentavalent）ワクチンであって、前立腺がん及び乳がんに関連する５種の炭水化物抗原――Globo-H、GM2、STn、TF及び Tn――を含有し、これらがマレイミドにより修飾されたＫＬＨキャリアタンパク質に結合したものが、抗Globo-H血清を生ずることが報告されている。かかる血清ではELISA分析においてIgMよりもIgGの方が、力価が高い。（Zhu J. et al. (2009) J. Am. Chem. Soc. 131(26):9298−9303）。
KLHはグリコシル化されたポリペプチドのサブユニットを有する。これらは会合して十量体（10-mer）、二十量体（20-mer）、及びそれよりも大きい粒子を形成する。これらの多量体構造は超遠心技術により特定されてきた。超遠心技術において解離したサブユニットの沈降係数は11-19Sであり、二十量体の沈降係数は92-107Sであった。さらに様々な因子が軟体動物のヘモシアニンの大きさの分布に影響を及ぼすことが知られており、ヘモシアニンにはKLHが含まれる。これらの因子にはイオン強度、pH、温度、pO2、及びいくつかの二価イオンが含まれ、二価イオンは特にカルシウム及びマグネシウムが相当する。本願の発明者らは効能を高めた組成物を開発した。かかる組成物は主として複数のGlobo H成分と結合したKLHの二量体及び三量体で構成される。
ワクチンがGlobo Hに対する抗体を誘導するように開発がすすめられる一方で、これらの抗がん作用は十分ではないのは、Globo Hの抗原性が低いことによる。新しいワクチンによって、Globo Hを標的として誘導し得る免疫反応の水準を高めることが必要であった。
本発明は全体としてGlobo Hを含有する治療及び／又は予防のための組成物を提供するものである。また、免疫治療法、ワクチン、剤形、キット、製造方法、及びそれらの処理を提供するものである。
一態様において、本発明は、単離された治療用の抱合体であって、スカシ貝ヘモシアニン（keyhole limpet hemocyanin、KLH）成分のサブユニットに結合したGlobo H成分を有するものである。ある態様において、結合は共有結合である。
他の一態様において、本発明は単離された治療用の抱合体であって、スカシ貝ヘモシアニン（KLH）成分のサブユニットに共有結合したGlobo H成分を有するものである。ここでKLHはKLH誘導体である。ここで、「共有結合した」の用語がGlobo- H及びKLHに係るときは次を意味する：Globo Hは直接KLHと共有結合している、又はGlobo HはKLH誘導体と共有結合している（本明細書で述べるとおり）、又はGlobo Hはリンカー基（リンカー原子団）を介してKLHと共有結合性の結合をしている（本明細書で述べるとおり）、又はGlobo Hはリンカー基及びKLH誘導体の双方を介してKLHと共有結合性の結合をしている。
一態様として例示すると、本発明のKLH誘導体は以下の構造を有する。
他の態様において、本発明は単離された治療用の抱合体であって、リンカー分子を介してスカシ貝ヘモシアニン（KLH）成分のサブユニットに共有結合性の結合をしているGlobo H成分を有するものを提供する。
好ましい態様において、Globo H成分はKLH成分のサブユニットのリジン残基に結合している。
一態様において、合計で、ちょうど又は約145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160個の総リジン残基がKLH成分のサブユニット当たりに存在している。これらはGlobo H成分に用いることができる、又は実際に、直接または間接にGlobo H成分と結合している。
他の一態様において、本発明は単離された治療用の抱合体であって、スカシ貝ヘモシアニン（KLH）成分のサブユニットに共有結合性の結合をしているGlobo H成分を有するものであって、結合が４−（４−Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシルヒドラジド（MMCCH）リンカー基を介しているものを提供する。本発明のMMCCHリンカーは以下の構造を有する。
他の例示となる一態様において、本発明は単離された治療用の抱合体であって、以下の一般構造を有するものを提供する：
ここでｎは約１から約１６０までの整数である。一態様において、単量体のKLH成分に約１から約１６０のGlobo H成分を含んでいてもよい。当業者に理解されるよう、その構造としてイミニウム塩酸塩を例に挙げて説明するがイミンの形態で存在又は共存していてもよい。すなわち、本発明はイミンと同様にその塩を提供するに係るものであり、その中にはイミニウム塩酸塩が含まれる。ある態様において、単量体のKLH成分に、約１から約１２５のGlobo H成分を含んでもいてもよい。ある態様において、単量体KLH成分に、約１から約７５のGlobo H成分を含んでもいてもよい。ある態様において、単量体KLH成分に、約１から約５０のGlobo H成分を含んでもいてもよい。ある態様において、単量体KLH成分に、約１から約２５のGlobo H成分を含んでもいてもよい。ある態様において、単量体KLH成分に、約１から約１０のGlobo H成分を含んでもいてもよい。
ある態様において、Globo H成分がKLH成分に対して塩基性アミノ酸残基上にて抱合していてもよい。ある態様において、塩基性アミノ酸残基はアルギニン、リジン、ヒスチジン又はこれらの組み合わせでもよい。
他の一態様においてGlobo H成分は単量体KLH成分サブユニットのリジン抱合部位に結合していてもよい。
他の一態様において、ちょうど又は約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109若しくは110個のリジン抱合部位が各単量体KLH成分サブユニット上に位置する、あるいは実際にGlobo H成分に結合している。他の一態様において、
かかるリジン抱合部位が各KLH成分サブユニット上に62、66、67、68、70、72、76、86、87、88、90、92、93、100個ある。
ある治療用の組成物の態様においては成分サブユニット（KLH1及びKLH2又はこれらの変異体など）の混成物を含有する。かかる態様においては（双方のサブユニットにおいて）利用できるリジンは、種々のサブユニット型で通算した場合、ちょうど又は約290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309若しくは310個あってもよい。かかる態様においては、種々のサブユニット型（KLH1及びKLH2又はこれらの変異体など）で通算した場合、ちょうど又は約130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159若しくは160個のリジン抱合部位がある。かかる態様の他の形態においては、136、137、141、140、143、147又は155個のリジン抱合部位がある。
他の例示となる一態様において、本発明は単離された治療用の抱合体であって、以下の一般構造を有するものを提供する：
ここでｎは約１から約３０００までの独立した整数であるとともに、ｍは約１から約２０までの独立した整数である。ある態様において、凝集は共有結合に基づく。ある態様において、ｍが１より大きいとき、KLH成分は凝集することで多量体構造を形成していてもよい。ある態様において、凝集は共有結合に基づく。ある他の態様において、凝集は共有結合によるものではない（凝集が水素結合又は疎水性相互作用によって形成される等）。ある態様において、単量体KLH成分（すなわちｍ＝１であるとき）は約１個から約１６０個のGlobo H成分を有していてもよい。ある態様において、二量体KLH成分（すなわちｍ＝２であるとき）は約１個から約３００個のGlobo H成分を有していてもよい。ある態様において、三量体KLH成分（すなわちｍ＝３であるとき）は約１個から約４５０個のGlobo H成分を有していてもよい。ある態様において、四量体KLH成分（すなわちｍ＝４であるとき）は約１個から約６００個のGlobo H成分を有していてもよい。ある態様において、五量体KLH成分（すなわちｍ＝５であるとき）は約１個から約７５０個のGlobo H成分を有していてもよい。
他の例示となる一態様において、本発明は単離された治療用の抱合体であって、以下の一般構造を有するものを提供する：
ここでｎは約１から約１５０までの独立した整数であるとともに、ｍは約１から約２０までの独立した整数である。
他の一態様において、本発明は単離された治療用の抱合体であって、以下の一般構造を有するものを提供する：
ここでｎは約１から約１６０までの独立した整数であるとともに、ｍは約１から約２０までの独立した整数である。ある態様において、ｍは約１から約５までの整数である。ｍは約１から約３までの整数である。ある態様においてｍは１である。ある態様においてｍは２である。ある態様においてｍは３である。ある態様においてｍは４である。ある態様においてｍは５である。ある態様においてｍは６である。ある態様においてｍは７である。ある態様においてｍは８である。ある態様においてｍは９である。ある態様においてｍは１０である。ある態様においてｍは１１である。ある態様においてｍは１２である。ある態様においてｍは１３である。ある態様においてｍは１４である。ある態様においてｍは１５である。ある態様においてｍは１６である。ある態様においてｍは１７である。ある態様においてｍは１８である。ある態様においてｍは１９である。ある態様においてｍは２０である。ある態様において、上記態様に対して、ｍが１から２０までであるとき、各ｎはそれぞれ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、又は160である。
ある態様において、１個よりも多いGlobo H成分が各単量体KLH成分に結合している。ある例示となる態様において、１個よりも多いGlobo H成分であって各KLH成分に結合しているものはリンカーを介して結合している。他の例示となる態様において、１個よりも多いGlobo H成分であって各KLH成分に結合しているものはリンカーを介して結合しているとともに、誘導体型のKLH成分に結合している。
他の一態様において、KLH成分サブユニットに対するGlobo H成分の比率は少なくとも１である。他の一態様において、KLH成分サブユニットに対するGlobo H成分の比率は少なくとも１０である。他の一態様において、KLH成分サブユニットに対するGlobo H成分の比率は少なくとも２５である。他の一態様において、KLH成分サブユニットに対するGlobo H成分の比率は少なくとも５０である。他の一態様において、KLH成分サブユニットに対するGlobo H成分の比率は少なくとも１００である。他の一態様において、KLH成分サブユニットに対するGlobo H成分の比率は少なくとも１５０である。また一態様において、KLH成分サブユニットに対するGlobo H成分の比率は少なくとも５００である。またさらに一態様において、KLH成分サブユニットに対するGlobo H成分の比率は少なくとも７５０である。さらなる一態様において、KLH成分サブユニットに対するGlobo H成分の比率は少なくとも１０００である。さらなる一態様において、KLH成分サブユニットに対するGlobo H成分の比率は少なくとも１５００である。さらなる一態様において、KLH成分サブユニットに対するGlobo H成分の比率は少なくとも２０００である。
様々な態様において、本発明は単一の単量体であるKLHから複数のKLHサブユニット（2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20）のものまでを提供する。それぞれに複数のGlobo H成分が結合している。ある態様において、Globo H成分に対するKLH成分の比率は同一である。他の態様においてGlobo H成分に対するKLH成分の比率は相異なる。
本発明の他の一態様は少なくとも２個のKLH成分を有する組成物である。２個のKLH成分は、例えば、二量体となっている誘導体型のKLH成分である。他の一態様において、少なくとも２個のKLH成分が互いに同一となっている。他の一態様において、少なくとも２個のKLH成分が互いに異なるものとなっている。さらに一態様では、少なくとも２個のKLH成分においてKLH成分サブユニットに対するGlobo H成分の比率が同一となっている。また、さらに一態様においては、少なくとも２個のKLH成分においてKLH成分サブユニットに対するGlobo H成分の比率が互いに異なるものとなっている。
本発明の一態様は少なくとも３個のKLH成分を有する治療用組成物である。３個のKLH成分は、例えば三量体となっている誘導体型のKLH成分である。ある態様において、少なくとも３個のKLH成分が互いに同一となっている。他の一態様において、少なくとも３個のKLH成分が互いに非同一となっている。さらに一態様では、少なくとも３個のKLH成分においてKLH成分サブユニットに対するGlobo H成分の比率が同一となっている。また、さらに一態様においては、少なくとも３個のKLH成分においてKLH成分サブユニットに対するGlobo H成分の比率が互いに異なるものとなっている。
本発明の他の一態様は少なくとも４個のKLH成分を有する治療用組成物である。４個のKLH成分は、例えば四量体となっている誘導体型のKLH成分である。ある態様において、少なくとも４個のKLH成分が互いに同一となっている。他の一態様において、少なくとも４個のKLH成分が互いに非同一となっている。さらに一態様では、少なくとも４個のKLH成分においてKLH成分サブユニットに対するGlobo H成分の比率が同一となっている。また、さらに一態様においては、少なくとも４個のKLH成分においてKLH成分サブユニットに対するGlobo H成分の比率が互いに異なるものとなっている。
本発明の他の一態様は少なくとも５個のKLH成分を有する治療用組成物である。５個のKLH成分は、例えば五量体となっている誘導体型のKLH成分である。ある態様において、少なくとも５個のKLH成分が互いに同一となっている。他の一態様において、少なくとも５個のKLH成分が互いに非同一となっている。さらに一態様では、少なくとも５個のKLH成分においてKLH成分サブユニットに対するGlobo H成分の比率が同一となっている。また、さらに一態様においては、少なくとも５個のKLH成分においてKLH成分サブユニットに対するGlobo H成分の比率が互いに異なるものとなっている。
本発明の他の一態様は少なくとも６個のKLH成分を有する治療用組成物である。６個のKLH成分は、例えば六量体となっている誘導体型のKLH成分である。ある態様において、少なくとも６個のKLH成分が互いに同一となっている。他の一態様において、少なくとも６個のKLH成分が互いに非同一となっている。さらに一態様では、少なくとも６個のKLH成分においてKLH成分サブユニットに対するGlobo H成分の比率が同一となっている。また、さらに一態様においては、少なくとも６個のKLH成分においてKLH成分サブユニットに対するGlobo H成分の比率が互いに異なるものとなっている。
一態様において、Globo H成分は（Fucα１→２ Galβ１→３ GalNAcβ１→３ Galα１→４ Galβ１→４ Glc）を有する。さらに、一態様において、KLH成分サブユニットはKLH-1成分若しくはKLH-2成分又はこれらの組み合わせである。本明細書において、KLHの用語はKLH-1、KLH-2、及び／又はこれらの組み合わせを表すものとする。
他の一態様において、KLH成分サブユニットは対応する天然のKLH成分サブユニットに対して少なくとも99%の相同性を有する。
他の一態様において、KLH成分サブユニットは対応する天然のKLH成分サブユニットに対して少なくとも95%の相同性を有する。
他の一態様において、KLH成分サブユニットは対応する天然のKLH成分サブユニットに対して少なくとも90%の相同性を有する。
他の一態様において、KLH成分サブユニットは対応する天然のKLH成分サブユニットに対して少なくとも80%の相同性を有する。
他の一態様において、KLH成分サブユニットは対応する天然のKLH成分サブユニットに対して少なくとも70%の相同性を有する。
他の一態様において、KLH成分サブユニットは対応する天然のKLH成分サブユニットに対して少なくとも60%の相同性を有する。
他の一態様において、Globo H成分はスカシ貝ヘモシアニン（keyhole limpet hemocyanin、KLH）成分サブユニットに対してリンカーを介して共有結合性の結合をしている。また、他の態様において、Globo H成分はスカシ貝ヘモシアニン（keyhole limpet hemocyanin、KLH）成分サブユニットに対して共有結合性の結合をしており、その結合は４−（４−Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシルヒドラジド（MMCCH）によるものである。さらに、他の一態様においてまた、Globo H成分は誘導体型のスカシ貝ヘモシアニン（keyhole limpet hemocyanin、KLH）成分サブユニットに対して共有結合性の結合をしており、その結合は４−（４−Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシルヒドラジド（MMCCH）によるものである。
他の一態様において、単離された治療用の抱合体における抗原決定基の割合（抗原決定基レシオ）は、分子量が約350kDaから約400kDaのKLH単量体を基準として少なくとも又は約150である。他の一態様において、単離された治療用の抱合体における抗原決定基の割合は少なくとも又は約100である。他の一態様において、単離された治療用の抱合体における抗原決定基の割合は少なくとも又は約75である。さらに他の一態様において、単離された治療用の抱合体における抗原決定基の割合は少なくとも又は約50である。なおさらに他の一態様において、単離された治療用の抱合体における抗原決定基の割合は少なくとも又は約25である。なお他の一態様において、単離された治療用の抱合体における抗原決定基の割合は少なくとも又は約15である。なお他の一態様において、単離された治療用の抱合体における抗原決定基の割合は少なくとも又は約5である。なお他の一態様において、単離された治療用の抱合体における抗原決定基の割合は少なくとも又は約1である。
本発明の他の一態様は治療用の組成物であってKLH成分サブユニットを含有するものである。ここで各KLH成分サブユニットは１個の、又は１個よりも多いGlobo H成分であって、スカシ貝ヘモシアニン（keyhole limpet hemocyanin、KLH）成分のサブユニットに対して共有結合性の結合をしているGlobo H成分を有する。ある態様において、医薬組成物は二以上のKLH成分サブユニットからなる二量体を含有する。ここで各KLH成分サブユニットは１個の、又は１個よりも多いGlobo H成分であって、KLH成分のサブユニットに対して共有結合性の結合をしているGlobo H成分を有する。ある態様において、医薬組成物は三以上のKLH成分サブユニットからなる三量体を含有する。ここで各KLH成分サブユニットは１個の、又は１個よりも多いGlobo H成分であって、KLH成分のサブユニットに対して共有結合性の結合をしているGlobo H成分を有する。ある態様において、医薬組成物は四以上のKLH成分サブユニットを含有する。ここで各KLH成分サブユニットは１個の、又は１個よりも多いGlobo H成分であって、KLH成分のサブユニットに対して共有結合性の結合をしているGlobo H成分を有する。ある態様において、医薬組成物はKLH成分サブユニットからなるもの（単量体、二量体、三量体、四量体、五量体、その他など）の混合物である。ここで各KLH成分サブユニットは１個の、又は１個よりも多いGlobo H成分であって、KLH成分のサブユニットに対して共有結合性の結合をしているGlobo H成分を有する。
本発明の他の一態様は医薬組成物であって、KLH成分の単量体、二量体、三量体、四量体、五量体、又はこれらの組み合わせに関する。ここで各KLH成分サブユニットは１個の、又は１個よりも多いGlobo H成分であって、スカシ貝ヘモシアニン（keyhole limpet hemocyanin、KLH）成分のサブユニットに対して共有結合性の結合をしているGlobo H成分を有する。
本発明の一態様において、組成物中の治療用の抱合体における抗原決定基の割合は、約１から３０００である。さらに一態様において、組成物中の治療用の抱合体における抗原決定基の割合は、約７５から２０００である。さらに他の一態様において、組成物中の治療用の抱合体における抗原決定基の割合は、約１００から１０００である。さらに別の一態様において、組成物中の治療用の抱合体における抗原決定基の割合の平均は約１５０から５００である。
他の一態様において、組成物中の治療用の抱合体の約１％から９９％がKLH単量体である。別の一態様において、組成物中の治療用の抱合体の約０％から９９％がKLH単量体である。さらに他の一態様において、組成物中の治療用の抱合体の約０％から９９％がKLH三量体である。また、さらに他の一態様において、組成物中の治療用の抱合体の約０％から９９％がKLH四量体である。別の一態様において、組成物中の治療用の抱合体の約０％から９９％がKLH五量体である。さらに他の一態様において、組成物中の治療用の抱合体の約０％から９９％が6個のKLHサブユニットからなる。さらに他の一態様において、組成物中の治療用の抱合体の約０％から９９％が7個のKLHサブユニットからなる。さらに他の一態様において、組成物中の治療用の抱合体の約０％から９９％が8個のKLHサブユニットからなる。さらに他の一態様において、組成物中の治療用の抱合体の約０％から９９％が9個のKLHサブユニットからなる。さらに他の一態様において、組成物中の治療用の抱合体の約０％から９９％が10個のKLHサブユニットからなる。さらに他の一態様において、組成物中の治療用の抱合体の約０％から９９％が11個のKLHサブユニットからなる。さらに他の一態様において、組成物中の治療用の抱合体の約０％から９９％が12個のKLHサブユニットからなる。さらに他の一態様において、組成物中の治療用の抱合体の約０％から９９％が13個のKLHサブユニットからなる。さらに他の一態様において、組成物中の治療用の抱合体の約０％から９９％が14個のKLHサブユニットからなる。さらに他の一態様において、組成物中の治療用の抱合体の約０％から９９％が15個のKLHサブユニットからなる。さらに他の一態様において、組成物中の治療用の抱合体の約０％から９９％が16個のKLHサブユニットからなる。さらに他の一態様において、組成物中の治療用の抱合体の約０％から９９％が17個のKLHサブユニットからなる。さらに他の一態様において、組成物中の治療用の抱合体の約０％から９９％が18個のKLHサブユニットからなる。さらに他の一態様において、組成物中の治療用の抱合体の約０％から９９％が19個のKLHサブユニットからなる。さらに他の一態様において、組成物中の治療用の抱合体の約０％から９９％が20個のKLHサブユニットからなる。また他の一態様において、組成物中の治療用の抱合体の約１％から９９％が単量体、二量体、三量体、四量体、五量体、又はこれらの組み合わせである。また他の一態様において、組成物中の治療用の抱合体の約９９％が単量体、二量体、三量体、四量体、五量体、又はこれらの組み合わせである。
他の一態様において、治療用組成物はアジュバントを含有する。かかるアジュバントには、フロインドアジュバント、トール（Toll）様受容体分子、LPS、リポタンパク質、リポペプチド、フラジェリン、二重鎖RNA、ウイルスRNA、非メチル化CpGアイランド、レバミソール、カルメット・ゲラン桿菌、イソプリノシン、ザダキシン（Zadaxin）、PD-1拮抗物質、PD-1抗体、CTLA拮抗物質、CTLA抗体、インターロイキン、サイトカイン、GM-CSF、糖脂質、アルミニウム塩系物質、リン酸アルミニウム、ミョウバン、水酸化アルミニウム、リポソーム、TLR2作用物質、リポペプチド、ナノ粒子、モノホスホリルリピドA、OBI-821サポニン、QS-21サポニン、水中油型ナノ乳剤、及びバクテリア様粒子が含まれるが、これらに限定されない。
他の一態様において、医薬組成物はサイトカインを含有する。かかるサイトカインはIL-2、IL-12、IL-18、IL-2、IFN-γ、TNF、IL-4、IL-10、IL-13、IL-21、GM-CSF及びTGF-βからなる群から選ばれる。別の一態様において医薬組成物は炎症性細胞遊走因子（ケモカイン）を含有する。
別の一態様において、治療薬を医薬組成物として投与する。
さらに一態様において、医薬組成物は単クローンの（モノクローナル）抗体、化学療法剤、ホルモン治療剤、レチノイド受容体修飾物質（モジュレーター）、細胞毒性物質／細胞増殖抑制剤、抗悪性腫瘍薬、抗増殖剤、抗mTOR剤、抗Her2剤、抗EGFR剤、タンパク質プレニル基転移酵素（プレニル−プロテイントランスフェラーゼ）阻害剤、HMG-CoA還元酵素阻害剤、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、血管新生阻害剤、ベバシズマブ、細胞増殖シグナル経路及び生存シグナル経路の阻害剤、アポトーシス誘導剤、細胞周期チェックポイントに干渉する薬剤、受容体型チロシンリン酸化酵素（RTK）に干渉する薬剤、インテグリン遮断薬、NSAID、PPAR作用物質、固有の多剤耐性（MDR）に対する阻害剤、鎮吐剤、貧血症の治療において有用な薬剤、好中球減少症の治療において有用な薬剤、免疫増強剤、ビスホスホネート、芳香化酵素阻害剤、新生物の細胞に対する最終分化の誘導剤、γセクレターゼの阻害剤、がんワクチン（例えば、能動免疫療法）、モノクローナル抗体治療薬（例えば、受動免疫療法）、及びこれらの任意の組み合わせを含有する。
他の一態様において、本発明の治療用組成物はさらにPD-1/PD-L1の阻害剤（細胞傷害性T細胞リンパ球（CTLs）による免疫療法）、CTLA-4免疫療法、CDK4/6阻害剤（標的療法）、PI3K阻害剤（標的療法）、mTOR阻害剤（標的療法）、AKT阻害剤（標的療法） 、汎Her阻害剤（Pan-Herインヒビター）（標的療法）を含有する。また、これらの阻害剤に対して、それぞれのモノクローナル抗体を生成するために修飾してもよい。かかる抗体を本発明の治療用組成物に含有させてもよい。
他の一態様において、医薬組成物は医薬として可能な範囲においてキャリアを含有していてもよい。他の一態様において、医薬組成物はがんワクチンである。さらに他の一態様において、医薬組成物は皮下投与のために処方される。さらに他の一態様において、医薬組成物は筋肉内投与のために処方される。さらに他の一態様において、医薬組成物は動脈内投与のために処方される。さらに他の一態様において、医薬組成物は静脈内投与のために処方される。
本発明の他の一態様は、治療を必要とする患者を治療する方法であり、治療効果のある分量の治療用組成物であってGlobo H及びKLHを含有するものを患者に投与することが含まれる。一態様において、患者はがんである診断された患者か、がんであることが疑われる患者である。他の一態様において、がんは上皮がんである。別の一態様において、がんは乳がんである。さらに他の一態様において、医薬／治療用組成物における治療効果のあるGlobo H成分の量は約0.001μｇ／ｋｇから約250ｍｇ／ｋｇであってもよい。さらに別の一態様において、医薬／治療用組成物における、治療効果のある分量のGlobo H成分には、一回の投与当たり、約10μｇ／ｋｇから約50μｇ／ｋｇの一の治療用抱合体が含まれる。さらに別の一態様において、医薬／治療用組成物における、治療効果のある分量のGlobo H成分には、一回の投与当たり、約0.10μｇ／ｋｇから約0.75μｇ／ｋｇの一の治療用抱合体が含まれる。
さらに他の一態様において、治療用組成物における、治療効果のある分量のGlobo-H-KLH複合体は約0.001μｇ／ｋｇから約250ｍｇ／ｋｇの範囲にあってもよい。さらに別の一態様において、治療用組成物における、治療効果のある分量のGlobo-H-KLH複合体には、一回の投与当たり、約10μｇ／ｋｇから約50μｇ／ｋｇの一の治療用抱合体が含まれる。さらに別の一態様において、治療用組成物における、治療効果のある分量のGlobo-H-KLH複合体には、一回の投与当たり、約0.60μｇ／ｋｇから約4.50μｇ／ｋｇの一の治療用抱合体が含まれる。
さらに他の一態様は、対照となる偽薬を基準として、約又は少なくとも１週間、無増悪生存期間を延ばすことのできる方法である。さらに他の一態様は、対照となる偽薬を基準として、約又は少なくとも２週間、無増悪生存期間を延ばすことのできる方法である。さらに他の一態様は、対照となる偽薬を基準として、約又は少なくとも１カ月間、無増悪生存期間を延ばすことのできる方法である。さらに他の一態様は、対照となる偽薬を基準として、約又は少なくとも３カ月間、無増悪生存期間を延ばすことのできる方法である。さらに他の一態様は、対照となる偽薬を基準として、約又は少なくとも６カ月間、無増悪生存期間を延ばすことのできる方法である。さらに他の一態様は、対照となる偽薬を基準として、約又は少なくとも１２カ月間、無増悪生存期間を延ばすことのできる方法である。
後述する詳細な説明とともに添付した図面を参照することで本発明のより完全な理解を図ることができる。図面によって示す実施形態は本発明の例示に過ぎず、本発明を図示された実施形態に限定するものではない。
図１ＡはGlobo Hの化学構造を示す。またいくつかのGlobo H類縁体を例示している。Glcはグルコースを表す。Galはガラクトースを表す。GalNAcはＮ−アセチルガラクトサミンを表す。Fucはフコースを表す。図１ＢはMMCCHリンカーによって抱合しているGlobo H-KLHサブユニットを例示している。
図２ＡはGlobo H-KLHサブユニットの抱合体の合成経路を表す。図２Ｂは本発明のGlobo H- KLH二量体及び三量体と、Slovin et al (1999), Proc Natl Acad Sci USA 96:5710-5及びGilewski et al (2001), Proc Natl Acad Sci USA 98: 3270-5において開示されたGlobo H抱合体との比較を表している。
天然のKLH（8.3 MDa）に対する多角度レーザー散乱分光測定（MALS）の結果を表す。
天然のKLH（8.3 MDa）に対する分子ふるいクロマトグラフィー（size exclusion chromatography）の結果を表す。
本発明に係るGlobo H-KLH複合糖質で免疫されたルイス（Lewis）ラット中のB/CD3+T/CD4+T/CD8+T細胞数の経時的な変化を表す。図５Ａ―ＤはそれぞれB細胞、CD3 T細胞、CD4 T細胞及びCD8 T細胞の細胞数を表す。数値は表示されている群の細胞数の百分率をPBS群の細胞数の百分率で標準化したものを表している。二方向の分散分析（two-way ANOVA）によって複数の比較分析を行った後、ボンフェローニの事後検定を行った。PBSとの比較で*, p<0.05、**, p<0.01及び***, p<0.001。 上記参照。 上記参照。 上記参照。
(A) IgM及び(B) IgGの逆数による力価（reciprocal titers）の経時変化を表す。抗体は本発明の複合糖質（Globo H-KLH）により免疫を行ったルイスラットの血中のものである。 上記参照。
マウスにおけるIgM抗体の力価を表す。本発明の複合糖質（Globo H-KLH）に対する反応の力価である。
図８（Ａ）及び（Ｂ）は、C57BL/6マウスにおける免疫原性を表す。マウスは０、５及び１０日目にPBS、アジュバントのみ、又はGlobo H-KLH＋アジュバントで免疫した。血清を１４日目に回収してELISA分析を行い、抗Globo H IgG及びIgMの産生量を測定した。
補体依存性の細胞傷害（complement dependent cytotoxicity）を表す。かかる試験ではGlobo H(+)又はGlobo H(-)のTOV21G細胞を９６穴プレートに播種した。抗Globo H血清又は対照となる血清を添加して1:50又は1:100に希釈した。さらにプレートに補体を添加した／しなかった。補体依存性の細胞傷害（CDC）はLDH分析によって測定した。
図１０（Ａ）〜（Ｃ）は、９６穴プレートに播種したGlobo H(+)又はGlobo H(-)のTOV21G細胞に対する細胞傷害を表す。抗Globo H血清又は対照となる血清を添加して1:50又は1:100に希釈した。末梢血単核球（PBMCs）からヒトNK細胞を単離し、抗CD3抗体で活性化することで、効果器細胞（エフェクター細胞）として用いた。効果器細胞を加えて又は加えないで抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）反応を誘導した。ET比が4:1、2:1又は1:1であった。細胞傷害は、種々のET比において、各細胞のマウス血清を添加しない対照群によって標準化した。
１×１０６個のGlobo-H陽性TOV21G細胞を腹腔内に注射したNOD-SCIDマウスに対して０日目に照射を行ったものである。抗血清は別途C57BL/6マウスから回収したが、３つの異なる処理（PBS、アジュバントのみ、及びGlobo H-KLH／アジュバント）において３回のワクチン接種を行った後、回収した。NOD-SCIDマウスの腹腔内に200μｌの上述の抗血清を投与した。０、２、４、６、９、１１、１３及び１６日目のマウスにそれぞれ投与した。腫瘍像はIVIS撮像システムによって３、７及び９日目に描出した。
Globo H KLHで免疫したC57BL/6マウスのLLC1（肺がん上皮がん細胞株）腫瘍を表す。マウスに皮下に対してPBS、アジュバントのみ、又はGlobo H-KLH／アジュバントのワクチン接種を０、５及び１１日目に行った。１×１０５個のLLC1細胞を各マウスの皮下に対して１６日目に注射した。その後、処理薬は皮下に対して２９及び３４日目に投与した。腫瘍の大きさを１６、２１、２５、２９，３２、３４及び３７日目に観察した。
ペプチドの特定に係る表の概要を示す。
試料１のGlobo H抱合ペプチドの特定に係る詳細（第一LC-MS/MS）をKLH1 (a)及びKLH2 (b)について表す。配列番号３〜３２番をそれぞれ順番に示している。 図１４の続きである。 図１４の続きである。"Start"及び"End"はKLH1又はKLH2の残基の数を示す。"Observed"の列が調査のための走査（survey scan）において観察されたm/z値を示す一方で"Mr(expt)"、"Mr(calc)"、"ppm"が実験上の分子量（MW）、算出されたMW、並びに観察されたMW及び理論上のMWの間の差異をそれぞれ示す。"Enzyme"の列においてはT、C、G及びThがトリプシン、キモトリプシン、Glu-C及びサーモリシンをそれぞれ表す。MCは切断されなかったことを表す。ScoreはMascotデータベースサーチエンジンから直接取り寄せたペプチドイオンの値である。E valueは特定されたペプチドに対する期待値を示す。ペプチド配列に加えてその修飾が"Peptide"の列に一覧にされている。"Mod_site"はKのアミノ酸部位を示し、そこはKLH1又はKLH2の配列に対して修飾されたGlobo_H_MMCCH、K_MMCCH_NL308、K_MMCCH_NL511、K_MMCCH_NL673、K_MMCCH_NL835、又はK_MMCCH_NL997であると特定される。
試料２のGlobo H抱合ペプチドの特定に係る詳細（第一LC-MS/MS）をKLH1 (a)及びKLH2 (b)について表す。配列番号３３〜５３番をそれぞれ順番に示している。 図１５の続きである。 図１５の続きである。"Start"及び"End"はKLH1又はKLH2の残基の数を示す。"Observed"の列が調査のための走査（survey scan）において観察されたm/z値を示す一方で"Mr(expt)"、"Mr(calc)"、"ppm"が実験上の分子量（MW）、算出されたMW、並びに観察されたMW及び理論上のMWの間の差異をそれぞれ示す。"Enzyme"の列においてはT、C、G及びThがトリプシン、キモトリプシン、Glu-C及びサーモリシンをそれぞれ表す。MCは切断されなかったことを表す。ScoreはMascotデータベースサーチエンジンから直接取り寄せたペプチドイオンの値である。E valueは特定されたペプチドに対する期待値を示す。ペプチド配列に加えてその修飾が"Peptide"の列に一覧にされている。"Mod_site"はKのアミノ酸部位を示し、そこはKLH1又はKLH2の配列に対して修飾されたGlobo_H_MMCCH、K_MMCCH_NL308、K_MMCCH_NL511、K_MMCCH_NL673、K_MMCCH_NL835、又はK_MMCCH_NL997であると特定される。
試料３のGlobo H抱合ペプチドの特定に係る詳細（第一LC-MS/MS）をKLH1 (a)及びKLH2 (b)について表す。配列番号５４〜６４番をそれぞれ順番に示している。 図１６の続きである。"Start"及び"End"はKLH1又はKLH2の残基の数を示す。"Observed"の列が調査のための走査（survey scan）において観察されたm/z値を示す一方で"Mr(expt)"、"Mr(calc)"、"ppm"が実験上の分子量（MW）、算出されたMW、並びに観察されたMW及び理論上のMWの間の差異をそれぞれ示す。"Enzyme"の列においてはT、C、G及びThがトリプシン、キモトリプシン、Glu-C及びサーモリシンをそれぞれ表す。MCは切断されなかったことを表す。ScoreはMascotデータベースサーチエンジンから直接取り寄せたペプチドイオンの値である。E valueは特定されたペプチドに対する期待値を示す。ペプチド配列に加えてその修飾が"Peptide"の列に一覧にされている。"Mod_site"はKのアミノ酸部位を示し、そこはKLH1又はKLH2の配列に対して修飾されたGlobo_H_MMCCH、K_MMCCH_NL308、K_MMCCH_NL511、K_MMCCH_NL673、K_MMCCH_NL835、又はK_MMCCH_NL997であると特定される。
試料４のGlobo H抱合ペプチドの特定に係る詳細（第一LC-MS/MS）をKLH1 (a)及びKLH2 (b)について表す。配列番号６５〜８３番をそれぞれ順番に示している。 図１７の続きである。"Start"及び"End"はKLH1又はKLH2の残基の数を示す。"Observed"の列が調査のための走査（survey scan）において観察されたm/z値を示す一方で"Mr(expt)"、"Mr(calc)"、"ppm"が実験上の分子量（MW）、算出されたMW、並びに観察されたMW及び理論上のMWの間の差異をそれぞれ示す。"Enzyme"の列においてはT、C、G及びThがトリプシン、キモトリプシン、Glu-C及びサーモリシンをそれぞれ表す。MCは切断されなかったことを表す。ScoreはMascotデータベースサーチエンジンから直接取り寄せたペプチドイオンの値である。E valueは特定されたペプチドに対する期待値を示す。ペプチド配列に加えてその修飾が"Peptide"の列に一覧にされている。"Mod_site"はKのアミノ酸部位を示し、そこはKLH1又はKLH2の配列に対して修飾されたGlobo_H_MMCCH、K_MMCCH_NL308、K_MMCCH_NL511、K_MMCCH_NL673、K_MMCCH_NL835、又はK_MMCCH_NL997であると特定される。
試料１のGlobo H抱合ペプチドの特定に係る詳細（第二LC-MS/MS）をKLH1 (a)及びKLH2 (b)について表す。配列番号８４〜１１１番をそれぞれ順番に示している。 図１８の続きである。 図１８の続きである。"Start"及び"End"はKLH1又はKLH2の残基の数を示す。"Observed"の列が調査のための走査（survey scan）において観察されたm/z値を示す一方で"Mr(expt)"、"Mr(calc)"、"ppm"が実験上の分子量（MW）、算出されたMW、並びに観察されたMW及び理論上のMWの間の差異をそれぞれ示す。"Enzyme"の列においてはT、C、G及びThがトリプシン、キモトリプシン、Glu-C及びサーモリシンをそれぞれ表す。MCは切断されなかったことを表す。ScoreはMascotデータベースサーチエンジンから直接取り寄せたペプチドイオンの値である。E valueは特定されたペプチドに対する期待値を示す。ペプチド配列に加えてその修飾が"Peptide"の列に一覧にされている。"Mod_site"はKのアミノ酸部位を示し、そこはKLH1又はKLH2の配列に対して修飾されたGlobo_H_MMCCH、K_MMCCH_NL308、K_MMCCH_NL511、K_MMCCH_NL673、K_MMCCH_NL835、又はK_MMCCH_NL997であると特定される。
試料２のGlobo H抱合ペプチドの特定に係る詳細（第二LC-MS/MS）をKLH1 (a)及びKLH2 (b)について表す。配列番号１１２〜１３３番をそれぞれ順番に示している。 図１９の続きである。 図１９の続きである。"Start"及び"End"はKLH1又はKLH2の残基の数を示す。"Observed"の列が調査のための走査（survey scan）において観察されたm/z値を示す一方で"Mr(expt)"、"Mr(calc)"、"ppm"が実験上の分子量（MW）、算出されたMW、並びに観察されたMW及び理論上のMWの間の差異をそれぞれ示す。"Enzyme"の列においてはT、C、G及びThがトリプシン、キモトリプシン、Glu-C及びサーモリシンをそれぞれ表す。MCは切断されなかったことを表す。ScoreはMascotデータベースサーチエンジンから直接取り寄せたペプチドイオンの値である。E valueは特定されたペプチドに対する期待値を示す。ペプチド配列に加えてその修飾が"Peptide"の列に一覧にされている。"Mod_site"はKのアミノ酸部位を示し、そこはKLH1又はKLH2の配列に対して修飾されたGlobo_H_MMCCH、K_MMCCH_NL308、K_MMCCH_NL511、K_MMCCH_NL673、K_MMCCH_NL835、又はK_MMCCH_NL997であると特定される。
試料３のGlobo H抱合ペプチドの特定に係る詳細（第二LC-MS/MS）をKLH1 (a)及びKLH2 (b)について表す。配列番号１３４〜１４４番をそれぞれ順番に示している。 図２０の続きである。"Start"及び"End"はKLH1又はKLH2の残基の数を示す。"Observed"の列が調査のための走査（survey scan）において観察されたm/z値を示す一方で"Mr(expt)"、"Mr(calc)"、"ppm"が実験上の分子量（MW）、算出されたMW、並びに観察されたMW及び理論上のMWの間の差異をそれぞれ示す。"Enzyme"の列においてはT、C、G及びThがトリプシン、キモトリプシン、Glu-C及びサーモリシンをそれぞれ表す。MCは切断されなかったことを表す。ScoreはMascotデータベースサーチエンジンから直接取り寄せたペプチドイオンの値である。E valueは特定されたペプチドに対する期待値を示す。ペプチド配列に加えてその修飾が"Peptide"の列に一覧にされている。"Mod_site"はKのアミノ酸部位を示し、そこはKLH1又はKLH2の配列に対して修飾されたGlobo_H_MMCCH、K_MMCCH_NL308、K_MMCCH_NL511、K_MMCCH_NL673、K_MMCCH_NL835、又はK_MMCCH_NL997であると特定される。
試料４のGlobo H抱合ペプチドの特定に係る詳細（第二LC-MS/MS）をKLH1 (a)及びKLH2 (b)について表す。配列番号１４５〜１６４番をそれぞれ順番に示している。 図２１の続きである。"Start"及び"End"はKLH1又はKLH2の残基の数を示す。"Observed"の列が調査のための走査（survey scan）において観察されたm/z値を示す一方で"Mr(expt)"、"Mr(calc)"、"ppm"が実験上の分子量（MW）、算出されたMW、並びに観察されたMW及び理論上のMWの間の差異をそれぞれ示す。"Enzyme"の列においてはT、C、G及びThがトリプシン、キモトリプシン、Glu-C及びサーモリシンをそれぞれ表す。MCは切断されなかったことを表す。ScoreはMascotデータベースサーチエンジンから直接取り寄せたペプチドイオンの値である。E valueは特定されたペプチドに対する期待値を示す。ペプチド配列に加えてその修飾が"Peptide"の列に一覧にされている。"Mod_site"はKのアミノ酸部位を示し、そこはKLH1又はKLH2の配列に対して修飾されたGlobo_H_MMCCH、K_MMCCH_NL308、K_MMCCH_NL511、K_MMCCH_NL673、K_MMCCH_NL835、又はK_MMCCH_NL997であると特定される。
図１４は試料１のMMCCH抱合ペプチドの特定に係る詳細（第一LC-MS/MS）をKLH1 (a)及びKLH2 (b)について表す。配列番号１６５〜３９３番をそれぞれ順番に示している。 図２２の続きである。 図２２の続きである。 図２２の続きである。 図２２の続きである。 図２２の続きである。 図２２の続きである。 図２２の続きである。 図２２の続きである。 図２２の続きである。 図２２の続きである。"Start"及び"End"はKLH1又はKLH2の残基の数を示す。"Observed"の列が調査のための走査（survey scan）において観察されたm/z値を示す一方で"Mr(expt)"、"Mr(calc)"、"ppm"が実験上の分子量（MW）、算出されたMW、並びに観察されたMW及び理論上のMWの間の差異をそれぞれ示す。"Enzyme"の列においてはT、C、G及びThがトリプシン、キモトリプシン、Glu-C及びサーモリシンをそれぞれ表す。MCは切断されなかったことを表す。ScoreはMascotデータベースサーチエンジンから直接取り寄せたペプチドイオンの値である。E valueは特定されたペプチドに対する期待値を示す。ペプチド配列に加えてその修飾が"Peptide"の列に一覧にされている。"Mod_site"はKLH1又はKLH2に対するリシン抱合部位を示す。
試料２のMMCCH抱合ペプチドの特定に係る詳細（第一LC-MS/MS）をKLH1 (a)及びKLH2 (b)について表す。配列番号３９４〜５９７番をそれぞれ順番に示している。 図２３の続きである。 図２３の続きである。 図２３の続きである。 図２３の続きである。 図２３の続きである。 図２３の続きである。 図２３の続きである。 図２３の続きである。 図２３の続きである。 図２３の続きである。"Start"及び"End"はKLH1又はKLH2の残基の数を示す。"Observed"の列が調査のための走査（survey scan）において観察されたm/z値を示す一方で"Mr(expt)"、"Mr(calc)"、"ppm"が実験上の分子量（MW）、算出されたMW、並びに観察されたMW及び理論上のMWの間の差異をそれぞれ示す。"Enzyme"の列においてはT、C、G及びThがトリプシン、キモトリプシン、Glu-C及びサーモリシンをそれぞれ表す。MCは切断されなかったことを表す。ScoreはMascotデータベースサーチエンジンから直接取り寄せたペプチドイオンの値である。E valueは特定されたペプチドに対する期待値を示す。ペプチド配列に加えてその修飾が"Peptide"の列に一覧にされている。"Mod_site"はKLH1又はKLH2に対するリシン抱合部位を示す。
試料３のMMCCH抱合ペプチドの特定に係る詳細（第一LC-MS/MS）をKLH1 (a)及びKLH2 (b)について表す。配列番号５９８〜８１２番をそれぞれ順番に示している。 図２４の続きである。 図２４の続きである。 図２４の続きである。 図２４の続きである。 図２４の続きである。 図２４の続きである。 図２４の続きである。 図２４の続きである。 図２４の続きである。 図２４の続きである。"Start"及び"End"はKLH1又はKLH2の残基の数を示す。"Observed"の列が調査のための走査（survey scan）において観察されたm/z値を示す一方で"Mr(expt)"、"Mr(calc)"、"ppm"が実験上の分子量（MW）、算出されたMW、並びに観察されたMW及び理論上のMWの間の差異をそれぞれ示す。"Enzyme"の列においてはT、C、G及びThがトリプシン、キモトリプシン、Glu-C及びサーモリシンをそれぞれ表す。MCは切断されなかったことを表す。ScoreはMascotデータベースサーチエンジンから直接取り寄せたペプチドイオンの値である。E valueは特定されたペプチドに対する期待値を示す。ペプチド配列に加えてその修飾が"Peptide"の列に一覧にされている。"Mod_site"はKLH1又はKLH2に対するリシン抱合部位を示す。
試料４のMMCCH抱合ペプチドの特定に係る詳細（第一LC-MS/MS）をKLH1 (a)及びKLH2 (b)について表す。配列番号８１３〜１００８番をそれぞれ順番に示している。 図２５の続きである。 図２５の続きである。 図２５の続きである。 図２５の続きである。 図２５の続きである。 図２５の続きである。 図２５の続きである。 図２５の続きである。 図２５の続きである。 図２５の続きである。"Start"及び"End"はKLH1又はKLH2の残基の数を示す。"Observed"の列が調査のための走査（survey scan）において観察されたm/z値を示す一方で"Mr(expt)"、"Mr(calc)"、"ppm"が実験上の分子量（MW）、算出されたMW、並びに観察されたMW及び理論上のMWの間の差異をそれぞれ示す。"Enzyme"の列においてはT、C、G及びThがトリプシン、キモトリプシン、Glu-C及びサーモリシンをそれぞれ表す。MCは切断されなかったことを表す。ScoreはMascotデータベースサーチエンジンから直接取り寄せたペプチドイオンの値である。E valueは特定されたペプチドに対する期待値を示す。ペプチド配列に加えてその修飾が"Peptide"の列に一覧にされている。"Mod_site"はKLH1又はKLH2に対するリシン抱合部位を示す。
試料１のMMCCH抱合ペプチドの特定に係る詳細（第二LC-MS/MS）をKLH1 (a)及びKLH2 (b)について表す。配列番号１００９〜１２１２番をそれぞれ順番に示している。 図２６の続きである。 図２６の続きである。 図２６の続きである。 図２６の続きである。 図２６の続きである。 図２６の続きである。 図２６の続きである。 図２６の続きである。 図２６の続きである。 図２６の続きである。"Start"及び"End"はKLH1又はKLH2の残基の数を示す。"Observed"の列が調査のための走査（survey scan）において観察されたm/z値を示す一方で"Mr(expt)"、"Mr(calc)"、"ppm"が実験上の分子量（MW）、算出されたMW、並びに観察されたMW及び理論上のMWの間の差異をそれぞれ示す。"Enzyme"の列においてはT、C、G及びThがトリプシン、キモトリプシン、Glu-C及びサーモリシンをそれぞれ表す。MCは切断されなかったことを表す。ScoreはMascotデータベースサーチエンジンから直接取り寄せたペプチドイオンの値である。E valueは特定されたペプチドに対する期待値を示す。ペプチド配列に加えてその修飾が"Peptide"の列に一覧にされている。"Mod_site"はKLH1又はKLH2に対するリシン抱合部位を示す。
試料２のMMCCH抱合ペプチドの特定に係る詳細（第二LC-MS/MS）をKLH1 (a)及びKLH2 (b)について表す。配列番号１２１３〜１４０４番をそれぞれ順番に示している。 図２７の続きである。 図２７の続きである。 図２７の続きである。 図２７の続きである。 図２７の続きである。 図２７の続きである。 図２７の続きである。 図２７の続きである。 図２７の続きである。"Start"及び"End"はKLH1又はKLH2の残基の数を示す。"Observed"の列が調査のための走査（survey scan）において観察されたm/z値を示す一方で"Mr(expt)"、"Mr(calc)"、"ppm"が実験上の分子量（MW）、算出されたMW、並びに観察されたMW及び理論上のMWの間の差異をそれぞれ示す。"Enzyme"の列においてはT、C、G及びThがトリプシン、キモトリプシン、Glu-C及びサーモリシンをそれぞれ表す。MCは切断されなかったことを表す。ScoreはMascotデータベースサーチエンジンから直接取り寄せたペプチドイオンの値である。E valueは特定されたペプチドに対する期待値を示す。ペプチド配列に加えてその修飾が"Peptide"の列に一覧にされている。"Mod_site"はKLH1又はKLH2に対するリシン抱合部位を示す。
試料３のMMCCH抱合ペプチドの特定に係る詳細（第二LC-MS/MS）をKLH1 (a)及びKLH2 (b)について表す。配列番号１４０５〜１６１６番をそれぞれ順番に示している。 図２８の続きである。 図２８の続きである。 図２８の続きである。 図２８の続きである。 図２８の続きである。 図２８の続きである。 図２８の続きである。 図２８の続きである。 図２８の続きである。 図２８の続きである。"Start"及び"End"はKLH1又はKLH2の残基の数を示す。"Observed"の列が調査のための走査（survey scan）において観察されたm/z値を示す一方で"Mr(expt)"、"Mr(calc)"、"ppm"が実験上の分子量（MW）、算出されたMW、並びに観察されたMW及び理論上のMWの間の差異をそれぞれ示す。"Enzyme"の列においてはT、C、G及びThがトリプシン、キモトリプシン、Glu-C及びサーモリシンをそれぞれ表す。MCは切断されなかったことを表す。ScoreはMascotデータベースサーチエンジンから直接取り寄せたペプチドイオンの値である。E valueは特定されたペプチドに対する期待値を示す。ペプチド配列に加えてその修飾が"Peptide"の列に一覧にされている。"Mod_site"はKLH1又はKLH2に対するリシン抱合部位を示す。
試料４のMMCCH抱合ペプチドの特定に係る詳細（第二LC-MS/MS）をKLH1 (a)及びKLH2 (b)について表す。配列番号１６１７〜１８０３番をそれぞれ順番に示している。 図２９の続きである。 図２９の続きである。 図２９の続きである。 図２９の続きである。 図２９の続きである。 図２９の続きである。 図２９の続きである。 図２９の続きである。 図２９の続きである。"Start"及び"End"はKLH1又はKLH2の残基の数を示す。"Observed"の列が調査のための走査（survey scan）において観察されたm/z値を示す一方で"Mr(expt)"、"Mr(calc)"、"ppm"が実験上の分子量（MW）、算出されたMW、並びに観察されたMW及び理論上のMWの間の差異をそれぞれ示す。"Enzyme"の列においてはT、C、G及びThがトリプシン、キモトリプシン、Glu-C及びサーモリシンをそれぞれ表す。MCは切断されなかったことを表す。ScoreはMascotデータベースサーチエンジンから直接取り寄せたペプチドイオンの値である。E valueは特定されたペプチドに対する期待値を示す。ペプチド配列に加えてその修飾が"Peptide"の列に一覧にされている。"Mod_site"はKLH1又はKLH2に対するリシン抱合部位を示す。
Globo-H抱合リジンの同定の概要について（第一LC-MS/MS）をKLH1 (a)及びKLH2 (b)について表し、また（第二LC-MS/MS）をKLH1 (c)及びKLH2 (d)について表す。 図３０の続きである。 図３０の続きである。 図３０の続きである。
MMCCH抱合リジンの同定の概要について（第一LC-MS/MS）をKLH1 (a)及びKLH2 (b)について表し、また（第二LC-MS/MS）をKLH1 (c)及びKLH2 (d)について表す。 図３１の続きである。 図３１の続きである。 図３１の続きである。
Globo-H抱合体の分析の概要を第一（ａ）及び第二（ｂ）のLC-MS/MSの測定に沿って表す。"Total K"はKLH1及びKLH2由来のリシン残基の個数を示す。"Globo H-conjugated K"は特定されたGlobo H抱合リシンの個数を示す。"MMCCH-conjugated K"は特定されたMMCCH抱合リシンの個数を示す。
図３３（ａ）は化学式：C(56) H(91) N(5) O(33) S(1)、モノアイソトピック質量（Monoisotopic MW addition）：1393.5317 Daを表す。図３３（ｂ）は以下を表す。１．化学式：C(18) H(28) N(4) O(4) S(1)、モノアイソトピック質量（Monoisotopic MW addition）：396.1831；２．化学式：C(24) H(38) N(4) O(9) S(1)、モノアイソトピック質量（Monoisotopic MW addition）：558.2360 Da；３．化学式：C(30) H(48) N(4) O(14) S(1)、モノアイソトピック質量（Monoisotopic MW addition）：720.2888 Da；４．化学式：C(36) H(58) N(4) O(19) S(1)、モノアイソトピック質量（Monoisotopic MW addition）：882.3416 Da；５．化学式：C(44) H(71) N(5) O(24) S(1)、モノアイソトピック質量（Monoisotopic MW addition）：1085.4210 Da。
図３４（ａ）はMMCCH類縁体の化学構造、化学式：C(16) H(24) N(4) O(3) S(1)、モノアイソトピック質量（Monoisotopic MW addition）：352.1569 Daを表す。図３４（ｂ）は脱アミド化されたMMCCH類縁体の化学構造、化学式：C(16) H(22) N(2) O(4) S(1)、モノアイソトピック質量（Monoisotopic MW addition）：338.1300 Daを表す。
本発明の実施においては、特に言及しない限り、分子生物学、微生物学及び免疫学の通常の技術であって当該技術分野の技術に含まれるものを利用する。これらの技術については文献中に十分に説明されている。例えば以下を参照のこと。Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)；DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985)；Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987)；Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986)；B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984)；the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory)；Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987)；Antibodies: A Laboratory Manual, by Harlow and Lanes (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988)；及びHandbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986)。
"a"又は"an"という単語は、請求項及び／又は明細書において"comprising"という用語と結びつけられた使用された場合、「一つ」（"one"）を意味する場合があるものとする。ただし、「一以上（"one or more"）」、「少なくとも一つ（"at least one"）」及び「一又は一より多い（"one or more than one"）」の意味も有するものとする。
本願全体にわたり、「約（"about"）」の用語は表すのは値であり、かかる値には、例えば測定器具、当該値を測定するための方法における誤差の内在的なバラつき、又は被験物に内在しているバラつきが含まれる。かかる用語により状況に応じたバラつきを表すが、概ね又は1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%又は20%より小さいことが典型である。
本明細書において、「アルキル（"alkyl"）」の用語は直鎖状又は分枝状である一価の炭化水素を表し、特に言及しない限り、１−２０の炭素原子を有するものとする。例えばC1-C8又はC1-C4とする。アルキルは置換されていても置換されていなくてもよい。アルキルの例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、及びｔ−ブチルがあるが、これらに限定されない。
請求項における「又は（"or"）」の用語の使用は「及び／又は（"and/or"）」を表すものとする。ただし、明示的に単なる選択肢であることを示した場合、または相互に排他的な選択肢であることを示した場合はこの限りではない。なお単なる選択肢を意味することとと、「及び／又は」を意味することとの両方が定義されるよう根拠記載が開示されている場合であってもこれに該当するものとする。
本明細書及び請求の範囲で用いられるところの「からなる（"comprising"並びにcomprisingの他の記載態様、"comprise"及び"comprises"）」、「有する（"having"並びにhavingの他の記載態様、"have"及び"has"）」、「有する（"having"並びにhavingの他の記載態様、"have"及び"has"）」、「包含する（"including"並びにincludingの他の記載態様、"includes"及び"include"）」又は「含有する（"containing"並びにcontainingの他の記載態様、"contains"及び"contain"）」は包括的、又は非制限的（オープンエンド）であることを表す。これらは列挙されていない要素、又は方法における工程の追加を除外するものではない。本明細書に記載のあらゆる実施形態が、本発明のあらゆる方法又は組成に関して、実施可能なものとする。またその逆についても同様とする。さらに、本発明の組成は本発明の方法を完全に実施するために用いるものとする。
本明細書において「処置する（"Treating"又は"treating"）」は、対象への治療用組成物の投与を指す。投与は疾患、疾患の症状、疾患に対して続発する病態、又は疾病の素因に関する治療、緩和、軽減、改善、予防、又は回復を目的として行われる。
「有効量（"effective amount"）」とは、処置を受けた対象において、本明細書に記載されるように、医学的に望ましい結果を得ることのできる、治療用組成物の量である。医学的に望ましい結果は、客観的なもの（すなわち、何らかの試験又は標識によって測定可能）であってもよく、あるいは主観的なもの（すなわち、効果に対する被験者の申告や反応）であってもよい。
本明細書において「治療用組成物によって治療可能な疾病（"disease amenable to treatment with a therapeutic composition"）」とは、様々な手順、状態、障害、慢性症状、及び／又は病気であって、本明細書で開示する治療用組成物の投与によって治療可能なものを意味する。
「増殖性疾患（"proliferative disorder"）」とは、特定種の細胞が過剰量産生された結果、健康を害していることをいう。増殖性疾患には良性のものと悪性のものが含まれる。増殖性疾患には例えば、がんが含まれる。
本明細書の開示に係る治療用組成物によって治療可能な「がん（"cancer"）」とは、異常な細胞増殖のことである。がん細胞は通常の制御機構を喪失していることから、持続的に増殖し、隣り合う組織に浸潤し、体の中の離れた場所に転移し、さらに血管新生により細胞が養分を得ようとする。本明細書において、がんには悪性のものと良性のものとがある。がんは体内のあらゆる組織から生じる。細胞は成長するとともに増殖することで組織塊を形成し、これを腫瘍と呼ぶ。腫瘍（tumor）の用語は、異常成長又は異常な塊のことを指す。腫瘍はがん性（悪性）の場合も、非がん性（良性）の場合もある。がん性腫瘍は隣り合う組織に浸潤するとともに、全身に対して拡がる（転移する）。しかしながら、良性の腫瘍は一般的に隣り合う組織に浸潤せず、また全身に拡がることもない。がんは血液及び造血組織のがん（白血病及びリンパ腫）及び「固形（"solid"）」腫瘍に分けられる。「固形」腫瘍はがん種である場合と、肉腫である場合がある。
本発明の治療用組成物で治療できるがんには以下の部位により分類されるがんがある。口腔及び咽頭のがん（唇、舌、唾液腺、口腔底、歯肉及び口の他の部分、鼻咽頭、扁桃、中咽頭、下咽頭、口腔及び咽頭の他の部分）；消化器系のがん（食道；胃；小腸；結腸及び直腸；肛門、肛門管、及び肛門から直腸にかけての部分（anorectum）；肝臓；肝内胆管；胆嚢；他の胆管；膵臓；後腹膜；腹膜、大網、及び腸間膜；他の消化器）；呼吸器系のがん（鼻腔、中耳、及び副鼻腔；喉頭；肺及び気管支；胸膜；気管、縦隔、及び他の呼吸器）；中皮腫のがん；骨及び関節；並びに柔組織、心臓を含む；皮膚がん、黒色腫及び上皮以外の皮膚がんを含む；カポジ肉腫及び乳がん；女性生殖器系のがん（子宮頸部；子宮体；子宮、卵巣；膣；外陰部；及び他の女性生殖器）；男性生殖器系のがん（前立腺；精巣；陰茎；及び他の男性生殖器）；泌尿器系のがん（膀胱；腎臓及び腎盂；尿管；並びにその他の泌尿器）；内分泌系のがん（甲状腺、及び胸腺を含む他の内分泌系）；リンパ腫（ホジキン病及び非ホジキン型のリンパ腫）、多発性骨髄腫、及び白血病（リンパ球性白血病；骨髄性白血病；単球性白血病；及び他の白血病）。
他のがんであって、組織型によって分類され、本発明に係る治療用組成物に適した対象であると考えられるものとして以下が含まれるが、これらに限定されない；悪性新生物；がん、特定不能（NOS）；がん、未分化、特定不能（NOS）；巨大細胞がん及び紡錘細胞がん；小細胞がん、特定不能（NOS）；乳頭がん、特定不能（NOS）；扁平上皮がん、特定不能（NOS）；リンパ腫；基底細胞がん、特定不能（NOS）；悪性石灰化上皮腫（Pilomatrix carcinoma）；移行上皮がん、特定不能（NOS）；乳頭状移行上皮がん；腺がん、特定不能（NOS）；ガストリン産生腫瘍（Gastorinoma）、悪性；胆管がん；肝細胞がん、特定不能（NOS）；肝細胞がんと胆管がんとの組み合わせ；小柱腺がん；腺様嚢胞がん；腺腫性ポリープ内の腺がん；腺がん、家族性大腸腺腫症；固形がん、特定不能（NOS）；カルチノイド腫瘍、悪性；細気管支肺胞腺がん；乳頭腺がん、特定不能（NOS）；嫌色素性がん；好酸性がん；好酸性腺がん（Oxyphilic adenocarcinoma）；好塩基性がん；明細胞腺がん、特定不能（NOS）；顆粒細胞がん；濾胞腺がん、特定不能（NOS）；乳頭状の濾胞腺がん；非被包性硬化性がん；副腎皮質がん；子宮内膜がん；皮膚付属器がん；アポクリン腺がん；皮脂腺がん；耳垢腺がん；粘膜表皮がん；嚢胞腺がん、特定不能（NOS）；乳頭状嚢胞腺がん、特定不能（NOS）；乳頭状漿液性嚢胞腺がん；粘液性嚢胞腺がん、特定不能（NOS）；粘液性腺がん；印環細胞がん；浸潤性導管がん；髄様がん、特定不能（NOS）；小葉がん；炎症性がん；パジェット病、乳房；腺房細胞がん；腺扁平上皮がん；腺がん w/ 扁平上皮化生；胸腺腫、悪性；卵巣間質腫瘍、悪性；莢膜細胞種、悪性；顆粒細胞腫瘍、悪性； アンドロブラストーマ（Androblastoma）、悪性；セルトリ細胞がん；ライディッヒ細胞腫瘍、悪性；脂質細胞腫瘍、悪性；傍神経節腫、悪性；乳房外傍神経節腫（Extra-mammary paraganglioma）、悪性；褐色細胞腫；グロムス肉腫（Glomangiosarcoma）；悪性黒色腫、特定不能（NOS）；メラニン欠乏性黒色腫；表在拡大型黒色腫；巨大色素性母斑の悪性黒色腫（Malig melanoma in giant pigmented nevus）；類上皮細胞黒色腫；青色母斑、悪性；肉腫、特定不能（NOS）；線維肉腫、特定不能（NOS）；線維性組織球腫、悪性；粘液肉腫；脂肪肉腫、特定不能（NOS）；平滑筋肉腫、特定不能（NOS）；横紋筋肉腫、特定不能（NOS）；胎児性横紋筋肉腫；歯槽横紋筋肉腫；間質肉腫、特定不能（NOS）；混合腫瘍、悪性、特定不能（NOS）；ミュラー管混合腫瘍；腎芽腫；肝芽腫；がん肉腫、特定不能（NOS）；間葉腫、悪性；ブレンナー腫瘍、悪性；葉状腫瘍、悪性；滑膜肉腫、特定不能（NOS）；中皮腫、悪性；未分化胚細胞腫；胎児性がん、特定不能（NOS）；奇形腫、悪性、特定不能（NOS）；卵巣甲状腺腫、悪性；絨毛がん；中腎腫、悪性；血管肉腫；血管内皮腫、悪性；カポジ肉腫；血管周囲細胞腫、悪性；リンパ管肉腫；骨肉腫、特定不能（NOS）；傍骨性骨肉腫；軟骨肉腫、特定不能（NOS）；軟骨芽細胞腫、悪性；間葉性軟骨肉腫；骨の巨細胞腫；ユーイング肉腫；歯原性腫瘍、悪性；エナメル上皮肉腫；エナメル上皮腫、悪性；エナメル上皮線維肉腫；松果体腫、悪性；脊索腫；神経膠腫、悪性；上衣腫、特定不能（NOS）；星細胞腫、特定不能（NOS）；原形質性星細胞腫；線維性星細胞腫；星状芽；神経膠芽腫、特定不能（NOS）；乏突起神経膠腫、特定不能（NOS）；乏突起神経膠芽細胞腫；原始神経外胚葉；小脳肉腫、特定不能（NOS）；神経節芽細胞腫；神経芽細胞腫、特定不能（NOS）；網膜芽細胞腫、特定不能（NOS）；嗅覚神経原性腫瘍；髄膜腫、悪性；神経線維肉腫；神経鞘腫、悪性；顆粒細胞腫瘍、悪性；悪性リンパ腫、特定不能（NOS）；ホジキン病、特定不能（NOS）；ホジキン側肉芽腫、特定不能（NOS）；悪性リンパ腫、小リンパ球；悪性リンパ腫、大細胞、びまん；悪性リンパ腫、濾胞性、特定不能（NOS）；菌状息肉症；その他に特定された非ホジキンリンパ腫；悪性組織球症；多発性骨髄腫；マスト細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病、特定不能（NOS）；リンパ性白血病、特定不能（NOS）；形質細胞白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞性白血病（Lymphosarcoma cell leukemia）；骨髄性白血病、特定不能（NOS）；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病、特定不能（NOS）；マスト細胞白血病；巨核芽球性白血病；骨髄性肉腫；及び有毛細胞性白血病。
本明細書において定義される「上皮がん」は、上皮又は皮膚、管腔臓器及び他の組織における関連する組織から生じるがんである。上皮がんには乳がん、肺がん、肝がん、口腔がん、胃がん、結腸がん、鼻咽頭がん、皮膚がん、腎臓がん、脳腫瘍、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、子宮体がん、腸がん、膵臓がん、及び膀胱がんが含まれるがこれらに限定されない。
明細書中で用いられる「患者若しくは罹患動物（"Patient"）」又は「対象（"subject"）」は、哺乳動物の対象であって、がんのような増殖性の疾患を有する若しくはかかる疾患になりつつあると診断された又は疑いのある対象を指すものとする。患者若しくは罹患動物の例としては、ヒト、サル、イヌ、ブタ、ウシ、ネコ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ロバ及び他の哺乳動物でもよく、がんのような増殖性の疾患になりつつある場合に利益のある動物が含まれる。
明細書中で用いられる「実質的に精製されたもの（"substantially purified"）」又は「実質的に単離されたもの（"substantially isolated"）」とは、分子（例えば、化合物）であって、通常、天然の状態で混ざっている他の全ての分子から実質的に分離された状態の分子を指すものとする。実質的に精製された分子は標本中において支配的な分子種となっていることが好ましい。特に、実質的に精製された分子は天然の混合物中において（溶媒を除外した）他の分子に対して60%よりも高い純度（"60% free"）を有していてもよく、かかる純度は好ましくは75%（"75% free"）よりも高く、より好ましくは90%（90% free）よりも高く、最も好ましくは95%（"95% free"）よりも高い。「実質的に精製されたもの（"substantially purified"）」又は「実質的に単離されたもの（"substantially isolated"）」の用語は、それらの天然の状態で存在する分子又は物質に限られない。ある実施形態において、「実質的に精製されたもの（"substantially purified"）」又は「実質的に単離されたもの（"substantially isolated"）」の用語には、一のKLH成分を他のKLH成分から精製することを含む（例えば、KLH二量体成分をKLH三量体成分から実質的に精製する、又は実質的に単離する）。他の態様において、「実質的に精製されたもの（"substantially purified"）」又は「実質的に単離されたもの（"substantially isolated"）」の用語には、一のKLH成分を他のKLH成分から精製しないが（例えば、KLH二量体及びKLH三量体が実質的に精製された、又は実質的に単離された組成物中に含まれる）、不純物は実質的に除去されていることが含まれる。
本明細書において「投与（"Administering"）」は本発明の治療用組成物を患者に与えることを指す。一例として、静脈内（i.v.）注射、皮下（s.c.）注射、皮内（i.d.）注射、腹腔内（i.p.）注射、又は筋肉内（i.m.）注射によって注射等の組成物の投与を行ってもよいがこれらに限定されない。一又は二以上のこれらの経路を用いることができる。非経口投与においては例えばボーラス投与してもよく、また時間をかけて緩やかな灌流により投与してもよい。また、かわりに、又は同時に経口経路で投与してもよい。さらにボーラスを外科的に設置することにより、又は医療器具の設置により投与を行ってもよい。
「それらを必要とする患者（"A patient in need thereof"）」には、増殖性の疾患を有すると診断された又は有する疑いのある患者を指すものとする。一態様において、患者はがんを患っている又はがんになりつつあるものとする。
本明細書において用いられる用語「抗原（"antigen"）」とは、タンパク質及び／若しくはアジュバントの補助により又は補助によらず、免疫反応を誘導するあらゆる物質として定義する。好ましくは本発明の組成物の抗原には炭水化物が含まれ、より好ましくはグリカン抗原が含まれ、最も好ましくはGlobo H成分が含まれる。
本明細書において用いられる「免疫原性（"immunogenicity"）」の用語は免疫原、抗原又はワクチンの免疫反応を刺激する働きのことを指す。
本明細書において用いられる「免疫療法（"immunotherapy"）」の用語は、免疫系を制御することで予防及び／又は治療の目的を達成しようとする考えに基づく一連の治療戦略のことを指す。
本明細書において用いられる「抗原決定基（"epitope"）」の用語は、抗原分子の部分であって、抗体又はＴ細胞受容器の抗原結合部位に結合するものとして定義される。
本発明の「治療用組成物（"therapeutic compositions"）」には、「治療用抱合体（"therapeutic conjugates"）」及び／又は「治療用抗体（"therapeutic antibodies"）」が含まれることが好ましい。治療用抱合体は担体に連結された少なくとも１個の抗体を有する。治療用抱合体における連結は共有結合性であることが好ましい。治療用抱合体の一態様において、抗原はGlobo H成分のようなグリカンであることが好ましく、また担体はKLH成分及び又はKLH成分サブユニットであることが好ましい。また治療用抱合体の範囲には一又は二以上のKLH成分サブユニットであって一又は二以上のGlobo H成分と連結されたものが含まれる。一態様において、治療用抱合体の範囲には一又は二以上のKLH成分サブユニットであって少なくとも1、10、102又は103個のGlobo H成分と連結されたものが含まれる。他の一態様において、治療用抱合体の用語の範囲には一又は二以上のKLH成分サブユニットであって約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、又はそれより大きいGlobo H成分と連結されたものが含まれる。他の態様には、二量体、三量体、四量体、五量体若しくは六量体の上記Globo Hの連結されたKLH成分サブユニット、又はこれらの組み合わせの単離されたものが含まれる。
一態様において、治療用抱合体は：（Fucα（１→２） Galβ（１→３） GalNAcβ（１→３） Galα（１→４） Galβ（１→４）Gluβ（１−Ｏ−エチルヒドラジル−１−カルボニル−シクロヘキシル−４−（メチル−Ｎ−マレイミド）−３−（チオブチル−イミジル）−スカシ貝ヘモシアニン（Keyhole Limpet Hemocyanin、KLH）であり、別名OBI-822である。
「治療用抗体（"Therapeutic antibodies"）」とは、本発明の治療用抱合体に特異的に結合する抗体であって、好ましくは（さらに次の通り定義する）治療用抱合体のGlobo H成分であるものとする。
本明細書において用いられる「ワクチン（"vaccine"）」とは、治療用抱合体を含有する治療用組成物であって、治療用抱合体が、抗原が関与する疾患に対する免疫性を付与するために用いられるものである。がんワクチンは、肉体が本来備える、肉体自信の防御力であって、がん細胞のように損傷を受けた又は異常な細胞によって被る危険に対して、免疫系を通じて発揮される防御力を高められるように設計される。防御的な免疫反応とは疾患の激しさを軽減するものであり、その中には疾患を予防すること、疾患の発症を遅らせること、症状の激しさを抑えること、罹患率を下げること、及び死亡を遅らせることが含まれるがこれらに限定されない。ワクチンによって液性免疫反応を活性化すること（例えばＢリンパ球による抗体の産生を刺激すること）及び細胞性免疫反応（例えばＴリンパ球並びに／又はＮＫ細胞及びマクロファージのような他の細胞によって行われる免疫反応）を活性化することができることが好ましい。免疫反応を調べるために標準的な解析法が開発されており、例えば酵素結合免疫吸着測定（ELISA）、フローサイトメトリー、細胞増殖解析、CTL解析、及びADCC/CDC解析がある。
本明細書で用いられる「グリカン（"glycan"）」とは、多糖類、又はオリゴ糖を指す。本明細書で用いられるグリカンはまた複合糖質の炭水化物成分を指し、ここで複合糖質とは、糖たんぱく質、糖脂質、糖ペプチド、グリコプロテオーム（glycoproteome）、ペプチドグリカン、リポ多糖類又はプロテオグリカン等がある。グリカンは通常、単糖類の間のO-グリコシド結合のみによって構成される。例えば、セルロースはβ−１，４結合により結合したグルコースからなるグリカン（より具体的にはグルカン）であり、キチンはβ−１，４結合により結合したＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンである。グリカンは単糖類の残基のホモ多量体でもヘテロ多量体でもよく、直線状でも分枝状でもよい。グリカンは、糖たんぱく質又はプロテオグリカンのようにタンパク質に結合していてもよい。これらは一般に細胞の外表面に見られる。Ｏ−結合性及びＮ−結合性のグリカンは真核生物において非常によく見られるが、原核生物ではほとんど見られない。Ｎ−結合性グリカンはシークオン中のアスパラギンのＲ基窒素（Ｎ）に結合している。シークオンの配列はAsn-X-Ser又はAsn-X-Thrであり、ここでXはプロリンを除く任意のアミノ酸である。グリカンはGlobo H成分であることが好ましい。
Globo Hは、抗原性炭水化物に属する種類の六糖類であり、様々な種類のがん、特に乳がん、前立腺がん、膵臓がん、胃がん、卵巣がん、結腸がん、及び肺がんでにおいて高発現している。具体的な態様において、免疫開始時においてGlobo H抗体が見られなかった水準の、一定数の患者でも、本発明の治療用組成物による免疫後に高い力価が検出される。他の具体的な態様において、免疫開始時において一定数の患者がGlobo H抗体を呈し、また本発明の治療用組成物による免疫後に高い力価が検出される。ある態様において、抗Globo H抗体は糖脂質やあるいは糖たんぱく質のようにがん細胞の表面に表れる。他の態様において、乳がん患者の血清にはGlobo H抗原決定基に対する抗体が高い水準で含有されている。ある態様では、かかる抗原決定基はまた免疫組織学的分析においてモノクローナル抗体Mrb1、VK9及び抗SSEA-3の標的となる。また一定の正常な組織もまたMbr1に対して反応し、これには正常な乳房、膵臓、小腸及び前立腺の組織を含み、これらの組織の抗原は免疫系による干渉が制限されているセクレタリー境界（secretary borders）において支配的に局在している。
本明細書において「Globo H成分（"Globo H moiety"）」とは、グリカン（すなわち糖成分を有する分子）であってGlobo H又はその断片若しくは類縁体である。Globo Hは六糖類の抗原決定基（Fucα１→２ Galβ１→３ GalNAcβ１→３ Galα１→４ Galβ１→４ Glc）を含有するグリカンであり、糖ではない成分をさらに含有していてもよい。その断片は六糖類の抗原決定基の断片を含んでいるグリカンであり、可能であれば、糖ではない成分も含んでいる。これらのオリゴ糖類は通常の方法で調製することができる。（Huang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:15-20 (2006)参照）。必要な場合には、これらを糖ではない成分と連結することができる。米国特許出願シリアル番号（Ser. No.）12/485,546はGlobo H又はその断片に特異的な抗体を製造する方法に関するものであり、かかる方法では、非ヒト哺乳類（マウス、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、又はウマ等）に対して上述の免疫組成物を投与するとともにGlobo H又はその断片に結合する哺乳類抗体を単離する。
Globo Hの類縁体はグリカンマイクロアレイを用いて生成することができる。またWang et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 August 19; 105(33): 11661−11666で開示されたものが含まれる。図１にGlobo Hの類縁体を示す。
Globo H類縁体はVK-9、Mbr1、及び抗SSEA-3の各抗体に結合するものが好ましい。Globo H類縁体の結合は特定の解離定数（KD,surf）を有することが好ましい。ラングミュアの等温式を用いて結合曲線を分析し表面に対する解離定数（KD,surf）を求めてもよい。恒温平衡状態において、複製たスポットの蛍光度の平均（Fobs）は以下のように記述される：
ここでFmaxは蛍光強度の最大値であり、表面上の活性のある炭水化物の量の測定値であり、[P]は全体の抗体濃度であり、KD,surfは表面の炭水化物及び抗体の平衡状態の解離定数である。Wang et al.に示される通りである。いくつかの態様において、Globo H類縁体のWang et al.に示されるVK-9、Mbr1、及び抗SSEA-3の各抗体に対する（KD,surf）は、少なくとも約又はちょうど0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5若しくは1.6 mMである。
「スカシ貝ヘモシアニン（"Keyhole Limpet Hemocyanin"、KLH）」は大型で、複数のサブユニット構造で、酸素を有している、金属タンパク質であり、大型のスカシ貝である、Megathura crenulataの血リンパ中に見られる。KLHは異種性のグリコシル化タンパク質であり、分子量約350,000から約390,000のサブユニットからなり、凝集することで分子量約400 kDa（KLH単量体等）から約8,000 kDa（二十量体等）になる。各KLHサブユニットのドメインは２個の銅原子を有し、これらが互いに１個の酸素分子に結合している。酸素がヘモシアニンに結合している時、分子は特有の、透明で乳白光を発する青色を呈する。一定の態様において、KLHタンパク質は強力な免疫原性を有するがヒトには安全である。一定の態様において、KLHはMegathura crenulataの血リンパから硫酸アンモニウム沈殿及び透析を含む一連の工程によって精製してもよく、またクロマトグラフィーによる精製をして純度を高めてもよい。一定の態様において、KLHの精製では内毒素を除去してもよいが、抗体産生のために注射した際、内毒素をアジュバントとすることができるので、除去しなくてもよい。高い純度のKLHであって透明な乳白光を発する青色ものが調製できれば、これでKLHの可溶性を最もよく判定できる。一定の態様において、KLHの単量体単位が組み合わさって大きな多量体（十量体又は二十量体）となることで、総分子量が約4,000 kDaから8,000 kDaとなる。本明細書において「スカシ貝ヘモシアニン成分（"Keyhole Limpet Hemocyanin moiety"）」又は「KLH成分（"KLH moiety"）」はKLH1（配列番号１）又はKLH2（配列番号２）のタンパク質、若しくは実質的にこれらと同一のタンパク質、又はこれらの混合物である。ここで、実質的に同一であるとは、各KLH成分が、天然の野生型のKLHに対して、少なくとも約又はちょうど：100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76又は75パーセントの相同性を有するアミノ酸配列を有することをいう。一定の態様において、本発明のKLHは免疫原性の活性が高められており、特に抗腫瘍活性が高められている。一定の態様において、本発明の組成物中のKLHは分子量約400,000で分解を受けていないそのままのサブユニットからなる。他の態様において、本発明のKLHはより大きな多量体である。
一定の態様において、より大きな多量体の分子量は約800万から1,000万であり、沈降係数が約92−107Ｓである。より大きなKLH多量体の示す数値は沈降平衡及び／又は沈降速度の超遠心分析に基づく。他の態様において、本発明のKLHでは免疫原性の活性が高められており、特に抗腫瘍活性が高められている。免疫原性の活性を高めることは、例えば（ａ）KLHの注射（アジュバント無し）、（ｂ）アジュバント有のKLHの使用、（ｃ）ハプテン又は弱い免疫原性抗原に対するキャリア抗原としてのKLHの使用、及び（ｄ）抗腫瘍剤としてのKLHの使用において、見られるがこれらに限定されない。本発明のKLH組成物は多くの腫瘍に対して高い抗腫瘍活性を示し、腫瘍には膀胱がん、乳がん、卵巣がん等が含まれるがこれらに限定されない。一定の態様において、２個のKLH成分はKLH単量体間での共有結合性の結合により二量体を形成してもよい。理論的に制限される場合を除き、KLH成分間の共有結合性の結合はジスルフィド結合であると考えられる。一定の態様において、二又は三以上のKLH成分は、KLH単量体、二量体、三量体等の間での共有結合性の結合により二量体、三量体、四量体、五量体等を形成してもよい。理論的に制限される場合を除き、KLH成分間の共有結合性の結合はジスルフィド結合であると考えられる。
KLH成分を抗原に連結するために様々な方法をとることができ、その中には直接結合や４−（４−Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシルヒドラジド（MMCCH）のような二官能性のリンカー基による結合が含まれる。このような連結手法は米国特許6,544,952号に開示されている。いくつかの態様において、本発明の治療用抱合体を調製するため、例えば、Globo Hアルキルグリコシドをオゾン分解によりアルデヒドに変換し、アルデヒド基を架橋剤MMCCHのNH基に結合させて、Globo H-MMCCHを生じてもよく；キャリアタンパク質であるKLHをチオール化することでKLH-SHを生じてもよく；またチオール化されたKLH上のスルフヒドリル基をMMCCH上のマレイミド基に結合させることでGlobo H-KLH抱合体を生成してもよい。
一態様において、Globo Hアリルグリコシドを化学合成により調製してもよい。チオール化剤、２−イミノチオラン及びcGMP等級のKLH並びに４−（４−Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシルヒドラジド（MMCCH）を用いてもよい。いくつかの態様において、以下の工程を実施する：１）Globo HアリルグリコシドをGlobo H-アルデヒドに変換する；２）Globo H-アルデヒドにMMCCHを共役させて、Globo H-MMCCHを個別に生成する；３）KLHを化学的にチオール化する；４）Globo H-MMCCHをチオール化されたKLHに結合させる；また５）Globo H-KLH抱合体（OBI-822）を精製する。例として図２ａを参照。
一定の態様において、Globo H成分のタンパク質とKLH成分とを結合する際、一定の態様におけるKLH成分タンパク質の分子量がそのままの分子よりも減少する。かかる減少はGlobo H成分のサブユニットの解離によることが好ましい。他の態様において、本明細書において開示する結合方法であって、KLHサブユニットの解離をもたらすものは公知ではない。具体的な理論に結び付けられるものではないが、本発明のGlobo H成分−KLH成分のサブユニット抱合体のグリコシル化の水準が高いことでGlobo H成分間で水素結合を形成していることが予想される。このように、一定の態様においては、KLH成分サブユニット間でのファンデルワールス力及び疎水性相互作用がGlobo Hの水素結合によって置き換えられ、これによりKLH成分サブユニットの分離をもたらす。結合により、Globo H成分−KLH成分のサブユニット抱合体のKLH部分サブユニットは凝集して新たな単量体、二量体、三量体、四量体、五量体若しくは六量体又はこれらの組み合わせを形成する。その結果得られた治療用のGlobo H成分−KLH成分抱合体は、予想外に大きな抗原決定基の比を有するため、予想外に優れた免疫原性を発揮する。一定の態様において、Globo H成分はKLH1及びKLH2のリシンに結合している。他の態様において、Globo H成分はKLH1及びKLH2のリシンに結合していない。一定の態様において、Globo H結合リシンはペプチドマッピング分析において保存されていることが分かることから、Globo H-KLH組成物の構造は独特であることが示唆される。
一態様において、本発明の治療用組成物には一又は二以上のKLH成分サブユニットが包含される。ここで、少なくとも１個のかかるサブユニットが少なくとも約又はちょうど１、１０、１０２又は１０３回：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159若しくは160個又はそれ以上のGlobo Hに結合している。
発明者らは質量分光分析を用いて、Globo H成分がKLHのリシン残基に結合していることを発見した。したがって、一定の態様において、Globo H成分はリシン残基に結合していることが好ましい。
一態様において、総量でちょうど又は約145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160個のリシン残基がKLH成分サブユニット毎にある。他の態様において、KLH成分サブユニットあたり、ちょうど又は約150若しくは156個のリシン残基がある。他の一態様において、ちょうど又は約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109若しくは110個のリシン結合部位が各KLH成分サブユニットにあり、Globo H成分との結合に利用できる又は実際に結合している。他の一態様において、62、66、67、68、70、72、76、86、87、88、90、92、93、100個のこのようなリシン結合部位が各KLH成分サブユニットにある。リシン結合部位はKLH成分の上記リシン残基であり、Globo H成分及び／又は例えばMMCCHリンカーのようなGlobo H成分とのリンカーとの結合に利用できる又は実際に結合している。
一定の治療のための実施態様においては、成分サブユニット（KLH1及びKLH2又はそれらの変異体等）の混成物であり、（いずれのサブユニットにも）利用可能なリシンの総量は、種々のサブユニット種間で通算して、その数字がちょうど又は約290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309又は310であってもよい。かかる態様において、種々のサブユニット（KLH1及びKLH2又はそれらの変異体等）間で通算して、ちょうど又は約130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159又は160個のリシン結合部位があってもよい。上記態様の他の態様において、136、137、141、140、143、147又は155個のリシン結合部位があってもよい。
最も好ましい態様として、KLH1/KLH2の全306個のリシン残基中、136、137、140、141、143、147又は155個のリシン結合部位があることが好ましい。
一定の態様において、本発明の治療用組成物はKLH成分サブユニット−Globo H成分サブユニット抱合体はの混合物を含有し、これらの抱合体は単量体のままでもよく、また二量体、三量体、四量体、五量体若しくは六量体又はそれらの組み合わせでもよい。他の態様において、本発明の治療用組成物はKLH成分サブユニット−Globo H成分サブユニット抱合体の単量体、二量体、三量体若しくは四量体又はそれらの組み合わせであって単離されたものでもよい。さらに他の態様において、本発明の治療用組成物にはKLH成分サブユニット−Globo H成分サブユニット抱合体の二量体及び三量体だけが含まれる。
他の一態様において、治療用組成物は少なくとも２個のKLH成分サブユニットを含有し、ここで、２個のKLH成分サブユニットは各々異なるグリカンに連結されている。他のKLH成分サブユニットと連結可能な腫瘍関連グリカン抗原にはGM2、GD2、GD3、フコシル、GM1、sTn、シアリル−ルイスＸ、ルイスＸ、シアリルルイスａ、ルイスａ、sTn、TF、ポリシアル酸、ルイスｙ、ムチン、Ｔ抗原などがあるがこれらに限定されない。いくつかの態様において、治療用組成物中の少なくとも又は約10、20、30、40、50、60、70、80、90又は100パーセントのKLH成分サブユニットだけがGlobo H成分と連結されている一方で治療用組成物中の残りのKLH成分サブユニットが他の腫瘍関連グリカン抗原と連結されている。
本明細書において用いられるように、「抗原決定基の比（"epitope ratio"）」は本明細書に開示される治療用組成物に関連し、例えば、治療用抱合体中の抗原抗原決定基とキャリア分子の関係を指す。Globo H成分とKLH成分の関係を指すことが好ましい。治療用抱合体の抗原決定基の比は以下の式を用いて計算されることが最も好ましい。式＝（実際のGlobo H成分の質量／Globo H成分の分子量）／実際のKLH成分の質量／KLH成分の分子量）。抗原決定基の比は当業者によって容易に定めることができる。Globo H成分の質量は、例えば、アンペロメトリック電気化学検出付きの高速陰イオン交換クロマトグラフィー（HPAEC-PAD）によって決定することが好ましい。
本発明の治療用抱合体の抗原決定基の比は約、少なくとも又はちょうど：1、10、25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、1025、1050、1075、1100、1125、1150、1175、1200、1225、1250、1275、1300、1325、1350、1375、1400、1425、1450、1475、1500、1525、1550、1575、1600、1625、1650、1675、1700、1725、1750、1775、1800、1825、1850、1875、1900、1925、1950、1975、2000、2025、2050、2075、2100、2125、2150、2175、2200、2225、2250、2275、2300、2325、2350、2375、2400、2425、2450、2475、2500、2525、2550、2575、2600、2625、2650、2675、2700、2725、2750、2775、2800、2825、2850、2875、2900、2925、2950、2975又は3000であることが好ましい。
一態様において、本発明の治療用組成物は所定の抗原決定基の比の範囲の治療用抱合体の混合物である。一態様において、治療用組成物中の治療用抱合体の抗原決定基の比の、所定の範囲、平均値又は中央値は、約10から約3,200であるか、約800から約2,500であるか、約1,000から約2,000であるか、約1,250から約1,750であるか、約1,400から約1,600である。他の一態様において、治療用組成物中の治療用抱合体の抗原決定基の比の、かかる範囲、平均値又は中央値は、約10から約150であるか、約40から約125であるか、約50から約100であるか、約62から約87であるか、約70から約80である。他の一態様において、治療用組成物中の治療用抱合体の抗原決定基の比の、かかる範囲、平均値又は中央値は、約20から約300であるか、約80から約250であるか、約100から約200であるか、約125から約175であるか、約140から約160である。他の一態様において、治療用組成物中の治療用抱合体の抗原決定基の比の、かかる範囲、平均値又は中央値は、約30から約450であるか、約120から約375であるか、約150から約300であるか、約185から約260であるか、約210から約240である。いくつかの医薬組成物において、少なくとも又は約30、40、50、60、70、80、90、95、98、99、若しくは100%の治療用抱合体が単量体として存在し、又は二量体、三量体、四量体、五量体、又はこれらの組み合わせとして存在する。
［治療用抱合体に対する抗体］
一定の具体的な態様において、本発明の範囲にはまた、単離された治療用の抗体であって本明細書に開示される治療用抱合体に親和性があり特異的に結合するものが含まれ、さらに増殖性疾患の治療及び／又は診断におけるそれらの使用が含まれる。
本明細書において、「抗体（"antibody"）」及び「（複数の）抗体（"antibodies" (immunoglobulins)）」の用語の範囲にはモノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多選択性抗体（二重特異性抗体等）であって少なくとも２個の無処置の抗体からなるもの、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、キメラ抗体、一本鎖Fv（scFv）、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン抗体、Fab断片、F(ab')2断片、所望の生物学的活性を呈する抗体の断片、ジスルフィド結合Fv（sdFv）、及び抗イディオタイプ（抗Id）抗体（本発明の抗体に対する抗Id抗体）、細胞内抗体、並びに上記いずれかの抗原決定基結合性断片が含まれる。特に、抗体には免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性のある断片、すなわち抗原結合性部位を含有する分子が含まれる。免疫グロブリン分子はどのような種類（IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及びIgY等）、クラス（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及びIgA2等）又はサブクラスでもよい。
抗体の抗原決定基、例えば本明細書に記載される治療において用いられる治療用抱合体のGlobo H成分に対する「親和性（"Affinity"）」とは当業者によく知られた用語であり、抗体の抗原決定機に対する結合の程度又は強さを意味する。親和性はいくつかの公知の方法によって測定してもよく、かつ／または表現してもよく、例えば平衡解離定数（KD又はKd）、見かけ上の平衡解離定数（KD'又はKd'）、及びIC50（拮抗試験において50%阻害効果をもたらすのに必要な量）があるが、これらに限定されない。本発明の目的の範囲において、親和性とは、所定の抗体の集団であって抗原決定機に結合するものの平均的な親和性と考えてよい。本明細書においてmL当たりのmg IgG又はmg/mLで表すKD'の値は血清mL当たりのmg IgGを示すものとし、また血清は血漿でもよい。抗体の親和性が本明細書に記載される治療方法に係る投与又は本明細書に記載される治療方法の選択の基準として用いられる時は、抗体の親和性を治療前及び／又は治療中に測定してもよく、このように得られた値は、臨床医がヒトの患者が治療の候補者として適するどうかを調べるために用いてもよい。
本明細書において用いられるように、「特異的に結合している（"specifically binding"）」の用語は、結合している両者（抗体及び抗原等）の間の相互作用を指す。様々な例として、特異的に結合していることを、少なくとも又は約10−6モル／リットルの、約10−7モル／リットルの、若しくは約10−8モル／リットルの、又はそれより小さい結合定数として例示することができる。
［生物学的分析］
一態様において、患者に投与された時、本発明の治療用抱合体を含有する治療用組成物は、同じ試験において、抗Globo H抗体の力価を、投与前（すなわち治療前の基準となる力価）の同じ抗Globo H抗体の力価に比べて、少なくとも又は約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、50、100、250、500、1000、1500、2000、2500、3000、4000、若しくは5000倍に高めることができる。一定の態様において、抗Globo H抗体はIgM抗体である。他の一態様において、抗Globo H抗体はIgG抗体である。
本発明の治療用組成物は対象における液性及び細胞性の反応の双方を誘導することができる。一定の態様において、本発明のワクチン組成物はGlobo H成分特異的なIgG及びIgM抗体の産生と、Ｂ細胞及びＴ細胞（CD3+T細胞、CD4+T細胞及び／又はCD8+T細胞等）の増殖とを誘導する。これらの免疫反応は、投与後、経時的に起きることが典型的である。特定の例において、投与後、Ｂ細胞の産生は約3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、60日で見られ、さらにIgG及びIgM抗体が約10、20、30、60、又は90日で産生するとともに、続いてＴ細胞が約24、30、40、50、60、90、120、150、又は180日で産生する。本発明のワクチン組成物は少数のがん細胞が成長することを阻害する免疫学的な防御効果を長期間にわたり発揮するものと考えられる。このため、微小残存病変に対して好適であり、疾患を安定させるとともに生存期間を向上させることができる。
「抗体依存性細胞媒介性細胞障害（"Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity"）」及び「ADCC」は細胞媒介性の反応であり、かかる反応では、非特異的な細胞障害性の細胞（ナチュラルキラー（NK）細胞、好中球、マクロファージ等）が標的の細胞に結合している抗体を認識するとともに、続いて標的細胞を溶解させる。一態様において、このような細胞はヒト細胞である。特定の反応機構に限定するものではないが、これらの細胞障害性の細胞であってADCCを媒介するものは一般的にFc受容体（FcRs）を発現している。ADCCを媒介する最初の細胞、NK細胞がFcγRIIを発現する一方で、単球はFcγRI、FcγRII、FcγRIII及び／又はFcγRIVを発現する。造血細胞におけるFcRの発現はRavetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991)にまとめられている。分子のADCC活性を評価するために、in vitroのADCC分析を米国特許第5,500,362号や第5,821,337号に記載されるように実施してもよい。これらの分析に有用なエフェクター細胞には末梢血単核球（PBMC）及びナチュラルキラー（NK）細胞が含まれる。またさらに、本発明の治療用抱合体のADCC活性は、Clynes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 95:652-656 (1998)に開示されるような動物モデルによりin vivoで評価することもできる。
「補体依存性細胞傷害（”Complement dependent cytotoxicity”）」又は「CDC」とは、治療用抱合体が補体活性化を起こすことで補体の存在下で標的を溶解する能力のことである。補体活性化経路は最初の補体系の補体（C1q）が、関連する抗原と複合体を形成している分子（抗体等）に結合することで開始される。補体活性化を評価するために、例えばGazzano-Santaro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996)に開示されるようなCDC分析を実施してもよい。
他の一態様において、患者に対して本発明の治療用抱合体を含有する治療用組成物を投与した時、患者／対象において抗Globo H免疫血清を誘導することができる。かかる血清はGlobo H陽性がん細胞株、例えばMCF-7細胞に特異的に結合する。
［組み合わせ］
治療用組成物には、他の抗がん／抗増殖剤が含まれていてもよく、またアジュバント及び、サイトカインやケモカインのような他の免疫調節因子が含まれていてもよい。これらの剤はいずれも、別体の容器又は一つの容器に入れられて、キットとして一緒に供給されるものでもよい。上記の剤は投与の時に組み合わせてもよく、また投与の少なくとも又は約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23若しくは24分前、時間前又は日前に組み合わせてもよい。
アジュバントは薬学的な又は免疫学的な剤であり、他の剤の効果を調節するものである。これらは無機又は有機の化学物質、巨大分子又は全がん細胞若しくはそれらの一部であり、標的となる抗原に対する免疫反応を増強するものである。アジュバントには完全長及び不完全長のフロイントアジュバント、Toll様受容体分子及びその模倣化合物（ミメティック）、LPS、リポタンパク質、リポペプチド、フラジェリン、二本鎖RNA、非メチル化CpGアイランド、レバミゾール、カルメット・ゲラン桿菌、オクトレオチド、イソプリノシン及びザダキシン、様々な形態のDNA及びRNAであって細菌やウイルスによって放出される古典的なもの、PD-1拮抗薬並びにCTLA拮抗薬が含まれる。
一定の態様において、サポニンアジュバントはOBI-821サポニンであり、実質的に純粋なものである。他の態様においてOBI-821サポニンは、これの生物学的に活性のある断片である。アジュバントの範囲には純粋ではない形態のOBI-821サポニンが含まれてもよい。OBI-821サポニンがアジュバントとしての強く働くのは、本明細書に記載されるワクチンとともに投与した時、または他の実質的に純粋なサポニンやサポニンではないアジュバントと混合した時である。
OBI-821サポニンは天然由来のグリコシドであり、シャボンノキ（Quillaja saponaria Molina tree）の樹皮から高い純度で抽出される。かかる抽出は、高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）、低圧液体シリカクロマトグラフィー、及び親水性相互作用クロマトグラフィー（HILIC）によって、例えば米国特許第5,057,540号及び第6,524,584号に記載されているように行うことができる。それらの全てについて、参考資料としてその内容を取り込む。高圧液体クロマトグラフィー分析によりOBI-821は関連する構造を有する異性体化合物の混合物であることが示された。本明細書において他の精製されたOBI-821サポニンの異性体化合物を特定するとともに開示する。
一定の態様において、OBI-821は一以上の単離された下記式Ｉの化合物で構成される：
式（Ｉ）
ここで
Ｒ１はβ−Ｄ−アピオース又はβ−Ｄ−キシロースであり、また
Ｒ２及びＲ３は各々Ｈ、アルキル、
（1989化合物の脂肪族アシル成分）、又は
（1857化合物の脂肪族アシル成分）である。
またOBI-821サポニンは単離された式Ｉの化合物で構成されていてもよく、ここで
（ｉ） Ｒ１がβ−Ｄ−アピオースであり、Ｒ２が上述の1989化合物の脂肪族アシル成分であり、またＲ３がＨである（1989化合物V1A）；
（ｉｉ） （ｉｉ）Ｒ１がβ−Ｄ−アピオースであり、Ｒ２がＨであり、またＲ３が上述の1989化合物の脂肪族アシル成分である（1989化合物V1B）；
（ｉｉｉ） （ｉｉｉ）Ｒ１がβ−Ｄ−キシロースであり、Ｒ２が上述の1989化合物の脂肪族アシル成分であり、またＲ３がＨである（1989化合物V2A）；または
（ｉｖ） （ｉｖ）Ｒ１がβ−Ｄ−キシロースであり、Ｒ２がＨであり、またＲ３が上述の1989化合物の脂肪族アシル成分である（1989化合物V2B）；1989化合物V1A、1989化合物V1B、1989化合物V2A及び1989化合物V2Bをまとめたものを「1989化合物混合物」と呼ぶものとする。
テーブル１（表１）は1989化合物の官能基及び1857化合物混合物中における各1857化合物のモル％をまとめたものである。
OBI-821サポニンは式Ｉの単離された化合物から構成されていてもよく、ここで：
（ｉ） Ｒ１がβ−Ｄ−アピオースであり、Ｒ２が上述の1857化合物の脂肪族アシル成分であり、またＲ３がＨである（1857化合物V1A）；
（ｉｉ） Ｒ１がβ−Ｄ−アピオースであり、Ｒ２がＨであり、またＲ３が上述の1857化合物の脂肪族アシル成分である（1857化合物V1B）；
（ｉｉｉ） Ｒ１がβ−Ｄ−キシロースであり、Ｒ２が上述の1857化合物の脂肪族アシル成分であり、またＲ３がＨである（1857化合物V2A）；または
（ｉｖ） Ｒ１がβ−Ｄ−キシロースであり、Ｒ２がＨであり、またＲ３が上述の1857化合物の脂肪族アシル成分である（1857化合物V2B）；1857化合物V1A、1857化合物V1B、1857化合物V2A及び1857化合物V2Bをまとめたものを「1857化合物混合物」と呼ぶものとする。
テーブル２（表２）は1857化合物の官能基及び1857化合物混合物中における各1857化合物のモル％をまとめたものである。
OBI-821サポニンは一又は二以上の下記の化合物から構成される：
（ｉ）1857化合物V1A；（ｉｉ）1857化合物V1B；
（ｉｉ）1857化合物V2A；
（ｉｉｉ）1857化合物V2B；
（ｉｖ）1989化合物V1A；
（ｖ）1989化合物V1B；
（ｖｉ）1989化合物V2A；又は
（ｖｉｉ）1989化合物V2B。
OBI-821サポニン中の1857化合物混合物及び1989化合物混合物の百分率は以下の範囲とすることができる：
（ｉ）1857化合物混合物で構成されるOBI-821を約１モル％から約１５モル％
（ｉｉ）1989化合物混合物で構成されるOBI-821を約８５モル％から約９９モル％
モル％はいずれも0.1％の刻みの増加により変動してもよい（約87モル％から約90モル％、約90.5モル％から約97モル％、約3.5モル％から約11モル％、約10モル％から約14モル％等）。
1989化合物混合物は約60-70モル％の1989化合物V1A；約1-5モル％の1989化合物V1B；約30-40モル％の1989化合物V2A；及び約0.1-3モル％の1989化合物V2Bを含むものでもよい。上記のモル％はいずれも0.1％の刻みの増加により変動してもよい（65%、2.5%、35.6%等）。
1857化合物混合物は約60-70モル％の1857化合物V1A；約1-5モル％の1857化合物V1B；約30-40モル％の1857化合物V2A；及び約0.1-3モル％の1857化合物V2Bを含むものでもよい。上記のモル％はいずれも0.1％の刻みの増加により変動してもよい（65%、2.5%、35.6%等）。
他の一態様において、実質的に純粋なOBI-821をシャボンノキ（Quillaja saponaria）の粗抽出物から精製する。ここでOBI-821は単一の支配的なピークに特徴があり、溶媒のピークを除くクロマトグラムの全てのピークの面積の90%以上がそこに含まれる。この時の分析条件は次の通りである。５μｍの粒子サイズのシンメトリー（商標）C18カラムで行う逆相HPLC、１００Å孔径、4.6 mm ID×25 cm L。溶出プログラムは移動相Ａ：Ｂが95%：5%から75%：25%で11分間、ここで移動相Ａは0.1%のトリフルオロ酢酸を含む蒸留水、移動相Ｂは0.1%のトリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル、流速は１ｍｌ／分。
一態様において、医薬組成物は式（Ｉ）の化合物で構成される。
式（Ｉ）
ここで、
Ｒ１はβ−Ｄ−アピオース又はβ−Ｄ−キシロースであり、また
Ｒ２及びＲ３は各々Ｈ、アルキル、
（1857化合物の脂肪族アシル成分）
及び薬剤として許容可能なキャリアである。
ワクチンは炭水化物抗原又は免疫原性断片と、OBI-821サポニンとで構成されていてもよい。さらに一態様において、ワクチンは炭水化物抗原又はその免疫原性断片；キャリアタンパク質及びOBI-821サポニンで構成されていてもよい。他の一態様において、ワクチンはGlobo H、KLH及びOBI-821サポニンから選ばれる抗原である。キャリアタンパク質の例としてKLHが含まれるがこれに限定されない。
本明細書で用いられる「サイトカイン（"cytokine"）」とは、あらゆる種類の数多くの小型の分泌タンパク質であって、免疫反応の強度と持続時間を制御し、免疫細胞の分化過程に影響を与えるものを指す。また、その分化過程には通常、遺伝子発現の変化が見られ、これにより前駆細胞がはっきりとした特定の細胞種になるものを指す。サイトカインには様々な名称があり、それらの予想される働き、分泌細胞又は標的となる反応に基づき、例えばリンホカイン、インターロイキン、及びケモカインと称される。例えば普通のインターロイキンには、IL-2、IL-12、IL-18、IL-2、IFN-γ、TNF、IL-4、IL-10、IL-13、IL-21、GM-CSF及びTGF-βが含まれるがこれらに限定されない。
本明細書で用いられる「ケモカイン（"chemokine"）」とは、あらゆる種類の走化作用を有する小型のサイトカインであって、感染部位から放出されるものであり、リンパ球の移動及び活性化のための手段となるものである。ケモカインは感染部位に白血球を誘導する。ケモカインは保存されたシステイン残基を有し、これにより４つのグループに分類される。代表的なケモカインとともに各グループを示すと、C-Cケモカイン（RANTES、MCP-1、MIP-1α、及びMIP-1β）、C-X-Cケモカイン（IL-8）、Cケモカイン（リンホタクチン）、及びCXXXCケモカイン（フラクタルカイン）となる。
本発明の治療用組成物にはさらに、PD-1/PD-L1阻害剤（細胞傷害性Ｔ細胞リンパ球（CTLs）免疫療法）、CTLA-4免疫療法、CDK4/6阻害剤（標的療法）、PI3K阻害剤（標的療法）、mTOR阻害剤（標的療法）、AKT阻害剤（標的療法）、Pan-Her阻害剤（標的療法）が含まれていてもよい。またこれらの阻害剤を調節することで個々のモノクローナル抗体を生成してもよい。このような抗体は本発明の治療用組成物に含まれいてもよい。
治療用組成物には他の抗がん剤／抗増殖剤又は化学療法剤を含まれていてもよい。いくつかの態様において、このような剤の例をCancer Principles and Practice of Oncology by V.T. Devita and S. Hellman (editors), 6th edition (February 15, 2001), Lippincott Williams & Wilkins Publishersに求めてもよい。このような抗がん剤には以下が含まれるがこれらに限定されない：ホルモン療法剤（選択性エストロゲン受容体調節剤、アンドロゲン受容体調節剤等）、モノクローナル抗体療法、化学療法、レチノイド受容体調節剤、細胞傷害性薬物／細胞増殖抑制剤、抗腫瘍剤、抗増殖剤、プレニル−タンパク質転移酵素阻害剤、HMG-CoA還元酵素阻害剤、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、血管新生阻害剤（ベバシズマブ等）、細胞増殖及び生存シグナル経路の阻害剤、アポトーシス誘発剤、細胞周期チェックポイントを妨害する薬剤、受容体チロシンキナーゼ（RTKs）を妨害する薬剤、哺乳動物におけるラパマイシンの標的（mTOR）の阻害剤、ヒト上皮成長因子受容体2（HER2）阻害剤、上皮成長因子受容体（EGFR）阻害剤、インテグリン遮断薬、NSAID類、PPARアゴニスト、固有の多剤耐性（MDR）の阻害剤、抗嘔吐剤、貧血の治療において有用な薬剤、好中球減少症の治療において有用な薬剤、免疫増強薬、ビスホスホネート、アロマターゼ阻害剤、新生細胞の最終分化を誘導する薬剤、γセクレターゼ阻害剤、がんワクチン、並びにそれらのあらゆる組み合わせ。
［本発明の処方］
治療用組成物（また本明細書において医薬組成物とされるもの）には、総じて、薬剤として許容可能なキャリアが含まれていてもよい。本明細書において用いられるように、「薬剤として許容可能なキャリア（"pharmaceutically acceptable carrier"）」の言葉には、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張性のための及び吸収遅延のための剤等の薬剤としての投与に適合するものが含まれる。また補助活性物質を組成物に取り入れてもよい。医薬組成物は意図した投与経路に適合するように処方される。投与経路の例には、腸管外投与、例えば静脈内、皮内、皮下、筋肉内、動脈内、経口（吸入等）、経皮（局所）、経粘膜、及び直腸の各投与経路がある。腸管外、皮内、又は皮下に適用するための溶液又は懸濁液には以下の成分が含まれていてもよい：水のような注射のための滅菌希釈剤、生理食塩水、リン酸塩緩衝食塩水、トリス緩衝食塩水、不揮発油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒；ベンジルアルコール又はメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩、又はリン酸塩等の緩衝液及び塩化ナトリウム又はデキストロース等の浸透圧の調整のための薬剤。pHは塩酸又は水酸化ナトリウムなどの酸又は塩基により調整してもよい。腸管外の製剤はアンプル、使い捨ての注射筒、又は複数回の分量のバイアルであってガラス又はプラスチック製のものに封入してもよい。
注射での使用に適した医薬組成物には滅菌した水性溶液（水に溶ける場合）又は分散剤及び滅菌した粒子を含ませてもよく、これにより滅菌されていて注射可能な溶液又は分散液をすぐに調製できる。静脈内投与において適当なキャリアとしては生理食塩水、静菌水、クレモフォールEL（登録商標、BASF, Parsippany, N.J.）、又はリン酸塩生理食塩水がある。いかなる場合も、組成物は滅菌されているとともに、容易に注射できる液剤である必要がある。製造中及び保管中に安定している必要があり、また細菌や真菌等の微生物による汚染が起こらないように保存する必要がある。キャリアは溶媒又は分散媒でもよく、例えば水、エタノール、ポリオール（グリセリン、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール等）、及びそれらの適当な混合物を含むものでもよい。例えばレシチン等によるコーティングの利用、分散時に必要な粒子の大きさを維持、及び界面活性剤の利用により適切な流動性を維持することができる。微生物の活動を抑制は、様々な抗菌及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等により行うことができる。多くの場合、等張性を担保する薬剤、例えば、糖、マンニトールのような多価アルコール、ソルビトール、又は塩化ナトリウムを組成物中に含ませることが好ましい。注射することのできる組成物が持続的に吸収されるようにするには、組成物が吸収を遅らせる剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムやゼラチンを含むようにしてもよい。
滅菌された注射用組成物を調製するには、活性物資を所定の分量で上述の成分のうちの一つ又は組み合わせとともに適切な溶媒に添加し、必要に応じて濾過滅菌してもよい。総じて、分散系を調製するには、活性物質を、基本的な分散媒及び他の所定の成分であって上述のものを含有するとともに滅菌された媒体に添加してもよい。滅菌された注射液を調製するための滅菌された粉末の場合の調製方法は、活性成分に加えて追加したい成分を含む粉末を形成するには、予め濾過滅菌したそれらを含む溶液に対する真空乾燥及び凍結乾燥を行う。
口腔内に投与する組成物には総じて不活性な溶媒又は食用のキャリアを含ませる。口腔内への治療のための投与を行うために、活性物質を賦形剤とともに含ませてもよく、また錠剤、トローチ剤又はゼラチンカプセル等のカプセル剤の剤形で用いることができる。また口腔内に投与する組成物は、うがい薬に使用される液体キャリアを用いて調製してもよい。組成物を薬剤とするのに適切な結合剤、又はアジュバント材料を組成物の一部として含ませてもよい。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤等には以下のあらゆる成分又は同様の性質の化合物を含ませてもよい：微結晶性セルロース、トラガカントゴム若しくはゼラチン等の結着剤；デンプン若しくはラクトース、又はアルギン酸、プリモゲル、若しくはコーンスターチ等の崩壊剤のような賦形剤；ステアリン酸マグネシウム若しくはステロート（sterote）等の潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素等の流動促進剤；スクロース若しくはサッカリンなどの甘味剤；又はペパーミント、サリチル酸メチル、若しくはオレンジ香料等の香味剤。
吸入による投与の場合には、適当な噴射剤、例えば二酸化炭素等の気体で加圧された容器又は調合器からエアゾールスプレーの形態で化合物を送り込む。またはネブライザーとする。
全身投与の場合は、経粘膜投与又は経皮投与とすることもできる。経粘膜又は経皮投与では、適切な透過剤を使用して処方することで障壁を透過できるようにする。このような透過剤は、当該技術分野において公知であり、例えば、経粘膜投与であれば、界面活性剤、胆汁塩、及びフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は、鼻腔用スプレー又は坐剤を用いることで行うことができる。経皮投与の場合は、当該技術分野において公知の軟膏剤、塗り薬、ゲル剤、又はクリーム剤によって活性物質を処方する。化合物を直腸に送り込むために、（カカオバター及び他のグリセリド等の一般的な坐剤用基剤を用いた）坐剤、又は貯留浣腸の形態で調製することもできる。
実際には徐放製剤のように活性物質をキャリアとともに調製することで体内からの急速な排出から守る。これにはインプラント及びマイクロカプセル型の送達系を含む。生分解性であり、生体適合性のある高分子を使用することができ、エチレン酢酸ビニル、ポリアンヒドリド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルソエステル、及びポリ乳酸等が挙げられる。上記製剤の調製方法は、当業者には明らかであると考えられる。材料は市場から調達できる。リポソーム懸濁液（細胞特異的な抗原に対するモノクローナル抗体を利用することで感染細胞を標的としているリポソームを含有するもの）を用いて、薬剤として許容可能なキャリアとしてもよい。これらを当業者に知られる方法に従い調製してもよく、例えば米国特許第4,522,811号に記載されるものでもよい。本明細書において参照することでこれを取り込む。
口腔内又は腸管外に投与する組成物を用量単位の形態で処方することが、投与を容易にし、用量を統一する上で好ましい。本明細書において用量単位の形態（Dosage unit form）とは物理的に分離された単位を指し、治療を受ける対象にとって単位用量として適当なものをいう。ここで、所定量の活性物質を含有する単位の数値は、所定の医薬キャリアとともに所望の治療効果を奏するよう、単位ごとに算出される。
［剤形］
上記治療用組成物の毒性及び治療効果の評価は細胞培養又は実験動物における標準的な薬学的手法、例えばLD50（集団中の50%が致死となる用量）及びED50（集団中の50%に治療効果のある用量）の決定により行うことができる。毒性のある用量と及び治療効果のある用量の比が治療指数であり、LD50／ED50の比で表してもよい。治療用組成物は治療指数の大きいことが好ましい。副作用としての毒性を有する化合物を使用してもよいが、患部を上記化合物の標的とする送達系を設計することに注意を払うことで、非感染細胞に対する潜在的な被害を最小限とし、副作用を減らす必要がある。
細胞培養分析及び動物実験により得られたデータを、ヒトへの使用上の処方用量の範囲を決めるために用いてもよい。上記化合物の用量を決めるに当たり、循環系における濃度の範囲内においてED50が含まれるとともに、かかる範囲内において毒性が無いか、ほとんど無いようにすることが好ましい。用量を上記範囲内で変更することで、適用する剤形及び利用する投与経路に合わせてもよい。開示する方法で用いる、あらゆる化合物に関して、治療効果のある用量を、まずは細部培養分析によって見積もってもよい。処方上の用量は動物モデルによって決めることができる。その際、循環血漿における濃度範囲に、細胞培養によって決定したIC50（すなわち、症状の最大限の抑制の半分の効果に達する被験物質の濃度）が含まれるようにする。上記の情報を用いることでヒトにおいて有用な用量をより正確に決定してもよい。血漿中の水準を測定してもよく、例えば高圧液体クロマトグラフィーで測定してもよい。
いくつかの態様において、治療効果のある分量の治療用組成物（すなわち有効薬量）は約0.001 g/kgから約250 g/kg、0.01 g/kgから10 g/kg、又は0.1 g/kgから1 g/kgの範囲内にあってもよい。あるいは有効薬量は、患者の体重１kgあたり、約又は少なくとも：0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009; 0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09;0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、125、150、175、200、225、又は250グラム若しくはマイクログラムでもよい。あるいは当業者が過度の実験を行わずとも明らかに分かるものであれば、他の範囲でもよい。当業者であれば効果的に対象を治療するのに必要な用量及びタイミングに影響するいくつかの要因について認識できると考える。かかる要因には、疾患又は疾病の重症度、治療歴、全体的な健康状態又は対象の年齢、及び他の疾患の有することが含まれるが、これらに限定されない。
他の態様において、治療用組成物中のGlobo-H成分の治療効果のある分量（すなわち有効薬量）は約0.001 g/kgから約250 g/kg、0.01 g/kgから10 g/kg、又は0.1 g/kgから1 g/kgの範囲内にあってもよい。あるいは有効薬量は、患者の体重１kgあたり、約又は少なくとも：0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009; 0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09;0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、125、150、175、200、225、又は250グラム若しくはマイクログラムでもよい。あるいは当業者が過度の実験を行わずとも明らかに分かるものであれば、他の範囲でもよい。当業者であれば効果的に対象を治療するのに必要な用量及びタイミングに影響するいくつかの要因について認識できると考える。かかる要因には、疾患又は疾病の重症度、治療歴、全体的な健康状態又は対象の年齢、及び他の疾患の有することが含まれるが、これらに限定されない。
一定の態様において、本明細書に開示する治療用組成物には少なくとも一の治療用抱合体又は治療用抗体が含まれる又は付随する。したがって一以上のそれぞれの治療用抱合体又は治療用抗体が一回分の用量中に以下の値と概ね同じか、より小さいか又はより大きい濃度で存在する：用量あたり10-9、10-8、10-7、10-7、10-6、10-5、10-4、10-3、10-2、10-1モルに対して、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99のいずれかの数をかけた値。治療用組成物の一回の用量中に約1-100、2-60、3-50、4-40、5-30、6-20、7-15、8-10、2-18、3-16、4-14、5-12、6-10又は7-8μＭの濃度で治療用抱合体が存在することが好ましい。
いくつかの態様において、本明細書に開示する治療用組成物には少なくとも一の治療用抱合体又は治療用抗体が含まれる又は付随する。したがって一以上のそれぞれの治療用抱合体又は治療用抗体が一回分の用量中に以下の値と概ね同じか、より小さいか又はより大きい濃度で存在する：用量あたり10-3、10-2、10-1、又は10マイクログラムに対して、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98又は99のいずれかの数をかけた値。一定の態様において、用量当たり約又は少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150マイクログラム又はそれ以上の質量の一の治療用抱合体又は一の治療用抗体が含まれる。
一定の態様において、本明細書で開示する治療用組成物は、以下の値と概ね同じか、より小さいか又はより大きい値で投与される：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23又は24日間か、週間か、月間か、又は年間と概ね同じか、より短いか又はより長い期間にわたって、一日当たり、一週当たり又は一月当たり1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23又は24倍。
［キット］
他の観点において、当業者であれば、一又は二以上の、キット（パートの一式、kits of parts）を認識することができる。かかるキットによって本明細書で開示される一以上の方法を実施できる。キットは、一又は二以上の治療用抱合体、抗がん剤／抗増殖剤、アジュバント、サイトカイン及び／又はケモカインから構成される。一以上の上記方法に沿って本明細書で開示される有効量の治療用組成物を単独で又は組み合わせて構成される治療用組成物。上述の剤は単一の容器に入れてもよく、またキット中の異なる容器に入れてもよい。
キットにはまた、生物学的現象の識別子又は他の化合物であって、当業者であれば、本件の開示を読めば識別可能なものが含まれる。キットはまた、本明細書で開示する有効量の治療用組成物で構成される一以上の組成物で構成される。当業者であれば識別できる手法に従い、本明細書で開示される一以上の方法を実施するためのキットの治療用組成物。
開示にはまた、本明細書に記載の治療用組成物を利用して増殖性の疾患を治療する方法が含まれる。一態様において、方法には、乳がんなどのがんの治療が含まれる。総じて方法とは増殖性の疾患を治療するのに有効な量の、本明細書で開示される治療用組成物を、これを必要とする患者に供給することに関する。
いくつかの態様において、本発明の治療用組成物はこれを必要とする対象（乳がんなどのがんを有する患者）に投与される。この際、リン酸緩衝生理食塩水プラセボ等の対照のプラセボと比較して無増悪生存期間又は全生存期間の伸長の平均が約又は少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40日、週、月又は年である。
いくつかの態様において、許容できない毒性又は疾患の進行の無い限り、治療用組成物は0-2、6、14、及び26週目に皮下に投与される。
いくつかの態様において、本発明の治療用組成物を、これを必要とする対象（乳がんなどのがんを有する者等）に投与する。この際、患者における腫瘍体積の縮小の平均は、リン酸緩衝生理食塩水プラセボ等の対照のプラセボと比較して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40日、週、月又は年の期間において、約又は少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、74、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％又はそれ以上の割合である。
一態様において、CTスキャンにより、10mmを最小サイズとして、腫瘍の体積は少なくとも一つの次元において正確に測定してもよい（最長径測定平面におけるが記録される）（CTスキャンの切片の厚みは2.5 mmから5mmであることが推奨される）。
［本発明の組成物の合成方法］
本発明の治療用組成物におけるGlobo Hの六糖成分はアリルグリコシドとして化学的に合成してからKLHとの抱合体を調製した。
具体的な一態様として、Globo Hの化学合成には以下の工程の全体を含む：
KLHは水性緩衝液内で2-イミノチオレンにて処理した。その後、チオール化KLHをサイズにより排除するカラムであるセファデックスG-15カラムを用いて未反応の2-イミノチオレンから分離した。チオール化KLHは不活性ガス（窒素又はアルゴン）雰囲気中で保管し、すぐにGlobo H MMCCHとの抱合に用いた。
実施例１：本発明の糖抱合体（Globo H-KLH）の調製
Globo H allyl grycoside（市場から調達できるもの）をオゾン分解によりアルデヒドに変換した。Globo HアルデヒドをM2C2H（リンカー）及びNaCNBH3と反応させることでGlobo H-MMCCHを生成した。混合物をカラム精製することでGlobo H-MMCCHを得た。Globo H-MMCCH陽性の画分のあることを高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）で確認した後、共にプールした。KLHをチオール化緩衝液に溶解し、2-イミノチオレンを反応液に分注し添加した。反応が完了するまで反応液を恒温に保った後、KLH-SHをカラムで精製した。Globo H-MMCCH及びKLH-SHを組み合わせた ２。反応完了まで反応液を撹拌した。その後Globo H-KLHを精製することで最終産物を得た。
実施例２：糖抱合体におけるKLHに対するGlobo Hの質量比の分析
調製した糖抱合体におけるKLHに対するGlobo Hの質量比を高速陰イオン交換クロマトグラフィー（HPAEC-PAD）にて確認した。結果をテーブル３（表４）に示す。
テーブル３：糖抱合体におけるGlobo H及びKLHの質量比
実施例３：糖抱合体におけるKLHに対するGlobo Hの抗原決定基の比の分析
KLH二十量体の分子量は約7.5MDa〜8.6MDaであり、Micron 30 (1999) 597-623等の文献に記載される通りである。天然のKLHをサイズ除外クロマトグラフィー及び複数の角度のレーザーの散乱による分光分析（multi-angle laser scattering spectrometry (MALS)）によって確認したところ、分子量は約8.6 MDaだった（図３及び４を参照）。本発明の糖抱合体（サンプル番号５、KLHに対するGlobo Hの質量比は0.17:1である）をサイズ除外クロマトグラフィーで分析した。結果から、本発明の糖抱合体の分子量は、天然の凝集したKLH二十量体に比べて小さい質量であることが示された。図４参照。さらに分子比をテーブル４（表５）の通り算出した。
テーブル４：KLHに対するGlobo Hの分子比の算出
＊上記分子比は以下の式に従い算出した。
＊＊KLHの分子量は単量体、二量体又は二十量体の形態に依拠する。
上記より、本発明の糖抱合体においてはGlobo Hの抱合の後にKLH単量体単位が単量体、二量体及び／又は三量体を形成していることが分かった。
実施例４：ワクチン組成物の調製及びラットにおける免疫
糖抱合体（Globo H-KLH）の試料を、別途、実施例１に従い調製し、４℃で保管するとともに、ラミナーフローフードの下でサポニンアジュバントと混合した。得られたワクチン組成物を氷上に置き、続く免疫処理のため動物実験施設に輸送した。
テーブル５に示すように、ルイスラットの３つの集団に対して種々のワクチン組成物で免疫した。
テーブル５：免疫されたラットの集団
＊GH：KLH＝0.17：1（w/w）
GH：Globo H
SC：皮下
PBS：リン酸塩緩衝生理食塩水
ラットには0日、7日、14日、及び21日目に免疫した。末梢血単核球（PBMC）及び血漿を0、3、10、17、24及び31日目に採取した。脾臓、リンパ節、及び腹膜を洗浄したものを31日目に回収した。
実施例５：ラットにおける液性及び細胞性の免疫反応の誘導の分析
実施例５．１ フローサイトメトリーによる免疫エフェクター細胞のサブポピュレーションの分析
末梢血単核球（PBMCs）を動物から単離した後、PBMC中の様々な免疫エフェクター細胞のサブポピュレーションを、細胞マーカーの違いに対して特異的な抗体を用いてフローサイトメトリーで特定した。免疫したラットから0、3、10、17、24及び31日目に単離したPBMCを種々の蛍光（FITC）−抱合抗体で染色し、30分間氷上に置いた。恒温で放置した後、細胞を洗浄用緩衝液（１％ウシ血清アルブミン（シグマ）及び0.1% NaN3（シグマ）を含むリン酸塩緩衝生理食塩水（UniRegion Biotech））で洗浄し、350gで5分間遠心した。FACS Canto（BD Bioscience）で蛍光を測定するために細胞を洗浄用緩衝液に再度懸濁した。データをBD FACSDiva（BD Bioscience)ソフトウェアで解析した。結果から、本発明の糖抱合体で免疫したラットにおいてT細胞、B細胞、CD4+ T細胞、及びCD8+ T細胞がPBS対照群に比べて有意に増えていたことが示された。特にB細胞の集団は3日目に初めて見られるようになり、続いてCD3+ T、CD4+ T及びCD8+ T細胞が24日目に見られるようになった。図５（Ａ）−（Ｄ）参照。
実施例５．２ ELISAによるGlobo H−特異的抗体の試験
免疫ラット由来の血漿中におけるGlobo H特異的抗体の産生をELISA分析で定量した。結果からGlobo H−特異的IgGの力価が免疫後10日で上がり始め、17日にピークを迎えることが示された。Globo H−特異的IgM抗体の産生においても同様のパターンが観察された。図５（Ａ）−（Ｂ）参照。PBSで処理したラット中ではGlobo H−特異的IgG及びIgM抗体の反応が無かった。またKLHにアジュバントを添加したものでも同様であった（データは示していない）。
以上をまとめると、免疫したラットでは、Ｂ細胞の産生は3日目に生じ、次いで抗Globo H IgM及びIgG抗体が10日目に生じ、次いでCD3+ T、CD4+ T及びCD8+ T細胞が24日目に生じる。本発明の糖抱合体（Globo H-KLH）は液性及び細胞性の免疫反応の双方に対して作用することが分かった。
実施例６：マウスでの免疫とELISAによる抗体の試験
糖抱合体（Globo H-KLH）の種々の試料を４℃で保管し、ラミナーフローフードの下でサポニンアジュバントと混合した。得られたワクチン組成物を氷上に置き、続く免疫処理のため動物実験施設に輸送した。
約８週齢のBalb/cマウスに、炭水化物とタンパク質との比（Globo H：KLH）が様々のGlobo H-KLHを１週間に１回ずつ４週にわたり（0、7、14、and 21日）皮下に注射した。免疫前又は0日目、及び各ワクチン接種後3日目（10、17及び24日目）に抗凝固薬は使わずに後眼窩又は顔面静脈から血液試料を採取した。試料を遠心して血清及び赤血球を分離した。血清を収集して-20℃で保管し、後にELISAで分析した。マンホイットニーのＴ検定を用いて統計解析をした。
図６に示すように、動物モデルにおいて、本発明の、サポニンアジュバントと組み合わせた糖抱合体（Globo H-KLH）は、PBS対照群と比べた時、Globo H特異的IgM抗体反応を有意に誘導することが分かった。特に、質量比0.17：1（Globo H：KLH）の糖抱合体はによって誘導される抗体の力価は、質量比0.07：1（Globo H：KLH）の糖抱合体に比べて高かった。
以上をまとめると、本発明の、サポニンアジュバントと組み合わせた糖抱合体（Globo H-KLH）は、動物モデルにおいて液性及び細胞性の免疫反応を、特にＢ細胞及びＴ細胞の増殖を、予想を超えて強く誘導した。その中には、がん免疫療法にとって重要なCTL並びにIgM及びIgGの反応が含まれる。
実施例７：マウスにおけるアジュバント有り又は無しのワクチンのGlobo H - KLHの免疫原性の調査
本発明のGlobo H組成物をアジュバントと組み合わせた時に免疫反応の誘導能をマウスにおいて発揮させた。免疫療法におけるGlobo H特異的抗体の量はELISA及びFACSで定量した。
６週齢のメスC57BL/6マウスの皮下にGlobo H-KLH及びアジュバントで免疫した。Globo H-KLHの投与量の水準はGlobo H-KLH中のGlobo-H（μｇでの）の量で揃えた。Globo H-KLH中のGlobo-Hが0.6μｇから5.0μｇに相当する範囲の投与量と、20μｇのアジュバントを含有するものをそれぞれ注射した。免疫付与は0、8、及び14日目に行った。またELISA及びFACSによる比較分析のため血清を0日目（注射前）及び24日目に収集した。血清学的な反応をELISAで測定し、抗Globo Hセラミド抗体の力価を定量した。またFACSでGlobo H陽性MCF-7細胞に対する細胞表面の反応性を定量した。
免疫処理を通じて、ワクチン接種後、行動、食欲、全体的な外見、及び毛づくろいに明瞭な変化は無かった。3回目のワクチン接種後10日目に血清を収集して、IgG及びIgM抗Globo H抗体の力価をELISAで定量した。処理前の値に比べて力価が8倍になった時を陽性反応の基準とした。図２に示すように、Globo H、Globo H KLH抱合体又はアジュバントのみで処理したマウスでは反応が無かった。これとは対照的にGlobo H-KLH＋アジュバントで処理したマウスの14匹/15匹において、有意にIgG抗Globo Hの力価の反応が見られたが、Globo H-KLHの投与量が0.6から5μｇの範囲では投与量への依存は見られなかった。各投与量におけるIgGの力価は処理前の値に比べて13から17.5倍に増加した。IgM抗Globo Hについては１５匹中１匹のマウスでアジュバント＋Globo H-KLでの免疫後に力価が８倍増加した。しかしながら5匹／15匹では処理前の血清に対してIgMの力価が4倍であった。また6匹/15匹の全体では2倍であった。各投与におけるIgMの力価の平均は、処理前の値に対して2.5倍に増えた。
Globo H発現乳がん細胞株、MCF-7に対する免疫血清の結合能を1:25倍に希釈した血清を用いてFACS分析で定量した。処理後の値は処理前の値より30%大きかった（すなわち≧1.3倍増加）が本分析では陽性と考えた。図３に示すように、全てのアジュバント＋Globo H-KLH処理群由来の免疫血清にはIgM抗体が含まれており、MCF-7細胞と反応したが、未処理の基準線に比べて５〜６倍の範囲にあった。さらに0.6μｇ又は2μｇのGlobo H-KLHで処理したマウスの５分の３と、5μｇのGlobo H-KLHで処理したものの５分の２と、に由来する免疫血清ではMCF-7細胞に結合可能なIgG抗体が見られた。平均すると結合能は未処理の基準線から1.3から2.0倍増加した。
Globo H-KLH及びアジュバントによるワクチン処理によりIgG及びIgMの双方の抗Globo H反応がメスのC57BL/6マウスで誘導されたことが分かった。免疫血清にはGlobo H発現乳がん細胞MCF-7細胞に対する結合能があった。
実施例８：KLHにおけるGlobo-H抱合部位のLC-MS/MS分析
複数の酵素による消化及びLC-MS/MSを利用して、4種のKLH試料におけるGlobo H抱合部位を特定した。4個のGlobo H-抱合KLH試料を初めに4種の異なる酵素で消化した後、LC-MS/MS及びMascotデータベース検索で分析した。二種の類縁体が特定された：Globo H類縁体（Globo H＋MMCCH）及びMMCCH誘導体（MMCCH単独）。Globo Hの類縁体及びニュートラルロス形態（neutral loss form）をGlobo H抱合部位の特定を説明できるものとして取り入れた。MMCCH体及びその脱アミノ化体をMMCCH抱合部位の説明をできるものとして取り入れた。これらのペプチドのうち質の高いMS/MSスペクトル及びMascotの値を呈するものだけをGlobo H抱合の分析を説明できるものとして取り入れた。OBI-822-13001-DP（試料１）に対するLC-MS/MS分析を２回繰り返したところ31個及び28個の抱合リシンが観察された；OBI-822-13002-DP（試料２）に対するLC-MS/MS分析を２回繰り返したところ19個及び21個の抱合リシンが観察された；OBI-822-13003-DP（試料３）に対するLC-MS/MS分析を２回繰り返したところ10個及び11個の抱合リシンが観察された；OBI-822-13004-DP（試料４）に対するLC-MS/MS分析を２回繰り返したところ18個及び19個の抱合リシンが観察された。MMCCH抱合分析については、OBI-822-13001-DP（試料１）に対するLC-MS/MS分析を２回繰り返したところ155個及び141個の抱合リシンが観察された；OBI-822-13002-DP（試料２）に対するLC-MS/MS分析を２回繰り返したところ143個及び137個の抱合リシンが観察された；OBI-822-13003-DP（試料３）に対するLC-MS/MS分析を２回繰り返したところ147個及び143個の抱合リシンが観察された；OBI-822-13004-DP（試料４）に対するLC-MS/MS分析を２回繰り返したところ140個及び136個の抱合リシンが観察された。
実施例８ 材料及び方法：
本章における略号は以下の通りである：K＝リシン；LC-MS/MS＝液体クロマトグラフィー−直列する質量分析；DTT＝ジチオスレイトール；IAM＝ヨードアセトアミド；ACN＝アセトニトリル；FA＝ギ酸；Glu-C＝エンドプロテアーゼGlu-C；ABC＝炭酸水素アンモニウム；RT＝室温；MW＝分子量。
4種のKLH試料、試料１−４に対して初めに緩衝液の交換をし、100 kDaで除外するAmicon Ultra Centrifugal Filterで50 mMの炭酸水素アンモニウム緩衝液中にあるようにし、６Mの尿素で変性した。試料を10 mMのDTTにて37℃、1時間で還元し、50 mMのIAMを用いて30分、暗環境下、室温でアルキル化し、50 mMのDTTにて室温、５分でクエンチした。得られたタンパク質を尿素濃度が１Ｍとなるまで希釈し、以下の章で述べる通り種々の酵素による溶液内での消化に供した。
種々の酵素による溶液内での消化を以下の消化条件で実施した：（１）３７℃で２４時間トリプシン消化（タンパク質：酵素＝４０：１）；（２）３７℃で２４時間Glu-C消化（タンパク質：酵素＝２５：１）；（３）室温で２４時間キモトリプシン消化（タンパク質：酵素＝２５：１）；（４）３７℃で２４時間サーモリシン消化（タンパク質：酵素＝２５：１）。
消化反応はギ酸を添加することで終了させ、４種全ての消化した試料をLC-MS/MS分析に供した。
Ultimate 3000 RSLCシステム（Dionex）と組み合わせたQ Exactive質量分析器（Thermo Scientific）で試料を分析した。LC分離はC18カラム（Acclaim PepMap RSLC、75μｍ×150ｍｍ、2μｍ、100Å)を用いて以下に示す濃度勾配で行った。
移動相Ａ：5% CAN／0.1% FA
移動相Ｂ：95% CAN／0.1% FA
インソースCIDは45 eVにて設定した。m/z 350-2000の範囲でMS分析をフルで実施した。また、MS分析由来の最も強いイオン10個をMSスペクトルの断片化に用いた。原データをProteome Discoverer 1.4 for Mascot database searchで加工してピークの一覧とした。
KLH1及びKLH2［KLH1, EMBL accession # CAG28307.1; KLH2, EMBL accession # CAG28308.1］を対象に、Mascot version 2.4.1及びThermo Proteome Discoverer version 1.4でデータベース検索を実施した。パラ−メーターは以下を用いた：Enzyme: Trypsin, Glu-C, Chymotrypsin and Thermolysin according to the digestion method; Fixed modification: Carbamidomethyl (C)。
Variable modifications for MMCCH derivatives (MMCCH alone):Deamidated (NQ), Oxidation (M), dK_MMCCH-1 (K), dK_MMCCH-2 (K)。
Variable modifications for Globo H derivatives (Globo H + MMCCH): Deamidated (NQ), Oxidation (M), Globo_H_MMCCH (K), dK_MMCCH_NL997 (K), dK_MMCCH_NL835 (K), dK_MMCCH_NL673 (K), dK_MMCCH_NL511 (K), dK_MMCCH_NL308 (K),Deamidated (NQ), Oxidation (M), Peptide Mass Tolerance: ± 10 ppm; Fragment Mass Tolerance: ± 0.05 Da; Max Missed Cleavages: 5; Instrument type: ESI-TRAP; Ion cut-off score: 13。
探索パラメーター中「dK_MMCCH-1」は、MWの増分が352.1569 DaであるMMCCH抱合リシンを示す。
探索パラメーター中「dK_MMCCH-2」は、MWの増分が338.1300 DaであるMMCCH抱合リシンを示す。
探索パラメーター中「Globo_H_MMCCH (K)」は、MWの増分が1393.5317 DaであるGlobo H−抱合リシンを示す。
探索パラメーター中「dK_MMCCH_NL997」は、MWの増分が396.1831 Daであるニュートラルロス形態（neutral loss form）のGlobo H−抱合リシンを示す。
探索パラメーター中「dK_MMCCH_NL835」は、MWの増分が558.2360 Daであるニュートラルロス形態（neutral loss form）のGlobo H−抱合リシンを示す。
探索パラメーター中「dK_MMCCH_NL673」は、MWの増分が720.2888 Daであるニュートラルロス形態（neutral loss form）のGlobo H−抱合リシンを示す。
探索パラメーター中「dK_MMCCH_NL511」は、MWの増分が882.3416 Daであるニュートラルロス形態（neutral loss form）のGlobo H−抱合リシンを示す。
探索パラメーター中「dK_MMCCH_NL308」は、MWの増分が1085.4210 Daであるニュートラルロス形態（neutral loss form）のGlobo H−抱合リシンを示す。
「MWの増分（"MW addition"）」は未変化のリシン残基と比較した時の分子量の増加分を表す。
実施例８：結果
LC-MS/MSに基づく技術を、タンパク質を特定し、アミノ酸修飾を分類するための手段とした。ペプチド配列及び修飾部位についての詳細な情報は、MS/MSスペクトルにより得られる断片のイオンの決定によりが得られる。Mascotはサーチエンジンであり、その確率に基づく評価アルゴリズムは広く受け入れられている。この調査において、Mascotの値は、タンパク質の配列決定及びGlobo H又はMMCCH抱合体部位の特定における信頼性の基準とした。試料１−４におけるGlobo H又はMMCCHの抱合部位の分布を広範囲に分析するために、これらの試料を複数の酵素で消化した後、LC-MS/MS分析をした。
Globo H誘導体（Globo H＋MMCCH）の予想される化学構造を図３３Ａに示す。また結果において、リシン含有ペプチド上の、対応するMWの増分が1393.53 Daであった。また、LC-MS分析におけるエレクトロスプレー化の間にニュートラルロス（neutral loss）を通じて不安定な多糖類が脱落する傾向がある。このため、図３３Ｂに示すように、複合糖質化されたペプチドに対して、ニュートラルロスの結果として生じる分子量の増分、396.18 Da、558.24 Da、720.29 Da、882.34 Da及び1085.42 Daが観察された。誘導された形態の全てがGlobo H抱合部位を特定するものであると考えられた。
さらに、これらのGlobo H抱合KLH試料中にMMCCH誘導体も観察された（MMCCH単独）。MMCCH誘導体の予想される化学構造及びその脱アミド化形態を図３４Ａ及び図３４Ｂに示す。またリシン含有ペプチド上での、対応するMWの増分がそれぞれ352.16 Da及び338.13 Daを結果の中に見ることができる。誘導体はMMCCH抱合部位を特定するものであると考えられた。Globo H誘導体からMMCCHへの転換は不明であったが、試料の処理中に起こると考えられる。
質量の正確性は、前駆体イオンに対して±10 ppmであり、また断片イオンに対して±0.05 Daであるが、タンパク質の同定及びスペクトルの解釈の基準として用いた。Globo H誘導体と同様にそのニュートラルロス形態をGlobo H抱合部位の同定のための様々な修飾として選択した。またMMCCH誘導体と同様にその脱アミド化体をMMCCH抱合部位の同定のための様々な修飾として選択した。スポンサーから提供されたKLH1及びKLH2の配列を対象として、データベース探索を実施した。これらのペプチドのうち質の高いMS/MSスペクトル（イオンスコア≧13、p<0.05）ものだけ、報告中に一覧とした。
再現性のある結果を示すために、LC-MS/MS分析を２回実施し、Globo H抱合部位の同定及びMMCCH抱合部位の同定の双方につき、個別にMascotデータベース検索を行った。これを図17にまとめた。
Globo H抱合部位の分析において、31個及び28個のリシンはそれぞれ試料１に対する１回目のLC-MS/MS及び２回目のLC-MS/MS中に見られ；19個及び21個のリシンはそれぞれ試料２に対する１回目のLC-MS/MS及び２回目のLC-MS/MS中に見られ；10個及び11個のリシンはそれぞれ試料３に対する１回目のLC-MS/MS及び２回目のLC-MS/MS中に見られ；18個及び19個のリシンはそれぞれ試料４に対する１回目のLC-MS/MS及び２回目のLC-MS/MS中に見られた。同定の詳細は図１４−２１の一覧にした。MMCCHの抱合の分析において、155個及び141個のリシンはそれぞれ試料１に対する１回目のLC-MS/MS及び２回目のLC-MS/MS中に見られ；143個及び137個のリシンはそれぞれ試料２に対する１回目のLC-MS/MS及び２回目のLC-MS/MS中に見られ；147個及び143個のリシンはそれぞれ試料３に対する１回目のLC-MS/MS及び２回目のLC-MS/MS中に見られ；140個及び136個のリシンはそれぞれ試料４に対する１回目のLC-MS/MS及び２回目のLC-MS/MS中に見られた。同定の詳細は図２２−２９の一覧にした。
複数の酵素による試験に由来するGlobo H抱合部位は図３０にまとめた。また、MMCCH抱合部位は図３１にまとめた。Globo H抱合試料についての抱合部位の分析結果の全体は図３２にまとめた。
実施例８ 結論：
Globo H誘導体の抱合したペプチドについての質量分析のシグナルがMMCCH抱合ペプチドよりも低かったのは複数のニュートラルロス形態及び多糖類の低いイオン化効率によるものである。このためGlobo Hの抱合を直接同定することより困難にしている。また同定されたペプチドの数がMMCCHの抱合の分析よりも多い理由である。このため、MMCCHの結果はGlobo Hの抱合を示すのに用いてもよい。
抱合部位の分析により、試料１−４のKLH1/KLH2の中の全306個のリシン残基中にはそれぞれ155、143、147及び140個のリシン抱合部位がある。繰り返し試験において、試料１−４には、141、137、143及び136個のリシン抱合部位がそれぞれ同定された。
特別に定義しない限り、本明細書で用いられる全ての技術的及び科学的な用語並びにアクロニムは、本発明の属する技術分野の当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で述べたものと近似する又は等価である情報を伝えるためのいかなる組成物、方法、キット、及び手段を、本発明を実施するために用いることができるが、情報を伝えるのに適した組成物、方法、キット、及び手段が本明細書で述べられている。
法上許される最大限の範囲で、本明細書で参照した全ての参考文献を参考として本明細書に取り込む。これらの参考文献についての述べたことは単にそれらの著者の主張の要約に過ぎない。いかなる参考文献も（又はいかなる参考文献の部分も）関連する先行技術であることを認めるものではない。出願人は、引用したあらゆる参考文献の正確性及び妥当性について異議を述べる権利を留保する。

Claims (35)

  1. 次の構造を有する化合物：
    ここで
    ｎは独立的に１から１５００の整数であり、
    前記化合物のKLHは単量体、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体、十量体、又はこれらの組み合わせであり、かつ
    ここで各Globo H成分はKLH成分に対して、構造に示す通りリンカーを介して塩基性のアミノ酸残基上で共有結合性の結合をしており、かつ
    ここで前記化合物の抗原決定基の割合は７５０から３０００である。
  2. 前記化合物の前記KLHは単量体であり、ｎは１から１５０である、
    請求項１の化合物。
  3. 前記化合物の前記KLHは二量体であり、ｎは１から３００である、
    請求項１の化合物。
  4. 前記化合物の前記KLHは三量体であり、ｎは１から４５０である、
    請求項１の化合物。
  5. 前記化合物の前記KLHは四量体であり、ｎは１から６００である、
    請求項１の化合物。
  6. 前記化合物の前記KLHは五量体であり、ｎは１から７５０である、
    請求項１の化合物。
  7. 次の構造を有する化合物と：
    ここでｎは独立的に１から１５００の整数であり、
    またここで前記化合物のKLHは単量体、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体、十量体、又はこれらの組み合わせであり、
    選択的に、薬剤として許容可能なキャリアと：
    を有する医薬組成物であり、さらにここで
    前記化合物の抗原決定基の割合は７５０から３０００である。
  8. 前記化合物のKLHは単量体であり、ｎは１から１５０である、
    請求項７の医薬組成物。
  9. 前記化合物のKLHは二量体であり、ｎは１から３００である、
    請求項７の医薬組成物。
  10. 前記化合物のKLHは三量体であり、ｎは１から４５０である、
    請求項７の医薬組成物。
  11. 前記化合物のKLHは四量体であり、ｎは１から６００である、
    請求項７の医薬組成物。
  12. 前記化合物のKLHは五量体であり、ｎは１から７５０である、
    請求項７の医薬組成物。
  13. 前記組成物中の前記化合物の１％から９９％が単量体である、
    請求項７の医薬組成物。
  14. 前記組成物中の前記化合物の１％から９９％が二量体である、
    請求項７の医薬組成物。
  15. 前記組成物中の前記化合物の１％から９９％が三量体である、
    請求項７の医薬組成物。
  16. 前記組成物中の前記化合物の１％から９９％が四量体である、
    請求項７の医薬組成物。
  17. 前記組成物中の前記化合物の１％から９９％が五量体である、
    請求項７の医薬組成物。
  18. さらにアジュバントを含有し、ここで
    前記アジュバントは完全なフロインドアジュバント及び不完全なフロインドアジュバント、トール（Toll）様受容体分子、LPS、リポタンパク質、リポペプチド、フラジェリン、二重鎖RNA、ウイルスRNA、非メチル化CpGアイランド、レバミソール、カルメット・ゲラン桿菌、イソプリノシン、ザダキシン（Zadaxin）、PD-1拮抗物質、PD-1抗体、CTLA拮抗物質、CTLA抗体、インターロイキン、サイトカイン、GM-CSF、糖脂質、アルミニウム塩系物質、リン酸アルミニウム、ミョウバン、水酸化アルミニウム、リポソーム、TLR2作用物質、リポペプチド、ナノ粒子、モノホスホリルリピドA、OBI-821サポニン、水中油型ナノ乳剤、並びにバクテリア様粒子である、
    請求項７の医薬組成物。
  19. IL-2、IL-12、IL-18、IL-2、IFN-γ、TNF、IL-4、IL-10、IL-13、IL-21、GM-CSF及びTGF-βからなる群から選ばれるサイトカインをさらに含有する、
    請求項７の医薬組成物。
  20. さらにケモカインを含有する、
    請求項７の医薬組成物。
  21. ホルモン療法剤（選択性エストロゲン受容体調節剤、アンドロゲン受容体調節剤等）、モノクローナル抗体療法、化学療法、レチノイド受容体調節剤、細胞傷害性薬物／細胞増殖抑制剤、抗腫瘍剤、抗増殖剤、プレニル−タンパク質転移酵素阻害剤、HMG-CoA還元酵素阻害剤、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、血管新生阻害剤（ベバシズマブ等）、細胞増殖及び生存シグナル経路の阻害剤、アポトーシス誘発剤、細胞周期チェックポイントを妨害する薬剤、受容体チロシンキナーゼ（RTKs）を妨害する薬剤、哺乳動物におけるラパマイシンの標的（mTOR）の阻害剤、ヒト上皮成長因子受容体2（HER2）阻害剤、上皮成長因子受容体（EGFR）阻害剤、インテグリン遮断薬、NSAID類、PPARアゴニスト、固有の多剤耐性（MDR）の阻害剤、抗嘔吐剤、貧血の治療において有用な薬剤、好中球減少症の治療において有用な薬剤、免疫増強薬、ビスホスホネート、アロマターゼ阻害剤、新生細胞の最終分化を誘導する薬剤、γセクレターゼ阻害剤、がんワクチン、PD-1/PD-L1阻害剤（細胞傷害性Ｔ細胞リンパ球（CTLs）免疫療法）、CTLA-4免疫療法、CDK4/6阻害剤（標的療法）、PI3K阻害剤（標的療法）、mTOR阻害剤（標的療法）、AKT阻害剤（標的療法）、Pan-Her阻害剤（標的療法）、並びにそれらの組み合わせ、からなる群から選ばれる薬剤をさらに含有する、
    請求項７の医薬組成物。
  22. 医薬として許容可能なキャリアを含有する、
    請求項７の医薬組成物。
  23. 前記医薬組成物はがんワクチンである、
    請求項７の医薬組成物。
  24. 皮下注射用に処方される、
    請求項７の医薬組成物。
  25. 静脈内投与用に処方される、
    請求項７の医薬組成物。
  26. 筋肉内投与用に処方される、
    請求項７の医薬組成物。
  27. がん治療を必要としているがん患者を治療するための、請求項７に記載の医薬組成物であって、
    患者に投与し治療効果のある分量を投与する、医薬組成物。
  28. 前記がんは卵巣がんである、
    請求項２７の医薬組成物。
  29. 前記がんは上皮がんであり、
    前記上皮がんは、乳がん、肺がん、肝がん、口腔がん、胃がん、結腸がん、鼻咽頭がん、皮膚がん、腎臓がん、脳腫瘍、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、子宮体がん、腸がん、膵臓がん、又は膀胱がんである、
    請求項２７の医薬組成物。
  30. 前記がんは乳がんである、
    請求項２７の医薬組成物。
  31. 前記組成物中の治療効果のある量のGlobo H成分が0.01μｇ／ｋｇから250ｍｇ／ｋｇである、
    請求項２７の医薬組成物。
  32. 前記組成物中の治療効果のある量のGlobo H成分が0.10μｇ／ｋｇから0.75ｇ／ｋｇである、
    請求項２７の医薬組成物。
  33. 前記組成物中の治療効果のある量のGlobo-H-KLH複合体が0.01μｇ／ｋｇから250ｍｇ／ｋｇである、
    請求項２７の医薬組成物。
  34. 前記組成物中の治療効果のある量のGlobo-H-KLH複合体が0.60μｇ／ｋｇから4.50μｇ／ｋｇである、
    請求項２７の医薬組成物。
  35. 請求項１から６の前記化合物、及び請求項７から３４の前記医薬組成物のいずれかの、動物又はヒトにおいて抗体を誘導するための製剤の製造における使用。
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