CN116327927A - 通过磁场增强光敏剂活性的方法 - Google Patents

通过磁场增强光敏剂活性的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN116327927A
CN116327927A CN202111556554.6A CN202111556554A CN116327927A CN 116327927 A CN116327927 A CN 116327927A CN 202111556554 A CN202111556554 A CN 202111556554A CN 116327927 A CN116327927 A CN 116327927A
Authority
CN
China
Prior art keywords
magnetic field
photosensitizer
under
compounds
light
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202111556554.6A
Other languages
English (en)
Inventor
张俊龙
高松
杨字舒
周礼楠
张少君
王炳武
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Peking University
South China University of Technology SCUT
Original Assignee
Peking University
South China University of Technology SCUT
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Peking University, South China University of Technology SCUT filed Critical Peking University
Priority to CN202111556554.6A priority Critical patent/CN116327927A/zh
Priority to PCT/CN2022/138126 priority patent/WO2023109694A1/zh
Publication of CN116327927A publication Critical patent/CN116327927A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0057—Photodynamic therapy with a photosensitizer, i.e. agent able to produce reactive oxygen species upon exposure to light or radiation, e.g. UV or visible light; photocleavage of nucleic acids with an agent
    • A61K41/0071—PDT with porphyrins having exactly 20 ring atoms, i.e. based on the non-expanded tetrapyrrolic ring system, e.g. bacteriochlorin, chlorin-e6, or phthalocyanines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0052—Thermotherapy; Hyperthermia; Magnetic induction; Induction heating therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0057—Photodynamic therapy with a photosensitizer, i.e. agent able to produce reactive oxygen species upon exposure to light or radiation, e.g. UV or visible light; photocleavage of nucleic acids with an agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
    • A61N5/00—Radiation therapy
    • A61N5/06—Radiation therapy using light
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
    • A61N5/00—Radiation therapy
    • A61N5/06—Radiation therapy using light
    • A61N5/0613—Apparatus adapted for a specific treatment
    • A61N5/062—Photodynamic therapy, i.e. excitation of an agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E10/00—Energy generation through renewable energy sources
    • Y02E10/50—Photovoltaic [PV] energy
    • Y02E10/542—Dye sensitized solar cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明提供了一种通过磁场增强光敏剂活性的方法，所述方法，在光照条件下，使光敏剂置于磁场中，提高光敏剂对肿瘤细胞的细胞毒性，实现光敏剂活性的提高，进而利用光动力治疗方法进一步增强癌症细胞的凋亡或肿瘤组织的抑制作用，有助于提高光动力治疗的效果。

Description

通过磁场增强光敏剂活性的方法
技术领域
本发明属于非线性光学光敏剂应用技术领域，具体涉及一 种通过磁场增强光敏剂活性的方法。
背景技术
目前，肿瘤治疗主要通过手术切除、放疗和化疗等手段， 传统手段对身体损伤大，容易受到限制，无法实现治疗等诸多 问题。光动力治疗作为一种肿瘤治疗的新方法，可以在某些方 面弥补现有手段中的不足。在肿瘤的综合治疗中，可以兼顾肿 瘤控制和改善患者生活质量，具有良好的应用前景。对于一些 不适合手术的早期癌症，有望通过光动力治疗得到治愈。
光动力治疗是通过特定波长的激光照射吸收光敏剂的肿瘤 组织，光敏剂收到激发，使氧转化为活性强的单线态氧或自由 基等分子，与相邻的生物大分子发生氧化反应，产生细胞毒性 作用，使癌症细胞受损，进而使癌细胞凋亡、微血管损伤以及 诱导局部免疫等，从而实现治疗。
光动力治疗过程中，具备肿瘤杀伤活性最强的是单线态氧， 是光敏剂将能量传递给氧气产生能态跃迁产生的，因此，改善 肿瘤部位乏氧的特性是光动力治疗肿瘤急需克服的，如何增强 单线态氧的利用率，提高治疗效果，是光动力治疗过程中需要 解决的问题。
发明内容
为解决上述问题，本发明人提供了一种通过磁场增强光敏 剂活性的方法，在激光照射条件下，通过控制磁场强度条件， 增强光敏剂受激发产生的单线态氧作用与肿瘤细胞的效果，实 现进一步提高细胞毒性，诱导细胞凋亡，从而完成本发明。
本发明提供了一种通过磁场增强光敏剂活性的方法，所述 方法，在光照条件下，使光敏剂置于磁场中，提高光敏剂活性。
优选地，所述方法中，在磁场和光照作用下，增强光敏剂 产生的单线态氧的氧化效率。
所述磁场强度为15-700mT，优选为35-600mT，更优选为 50-450mT。
本发明提供的通过磁场增强光敏剂活性的方法具有以下有 益效果：
(1)本发明中使光敏剂置于一定强度的磁场中，能够增强 光敏剂的作用强度及效率，提高单线态氧的氧化性。从而增强 其对肿瘤细胞的细胞毒性，从而实现肿瘤组织的抑制或杀伤作 用。
(2)本发明中通过对光敏剂额外施加磁场即可完成光敏剂 活性的大幅提高，该方法容易实现，效果明显，对生物体无其 他伤害或副作用，容易在实际应用中推广应用。
(3)通过实验证明，本发明中的方法能够增强在光照条件 下产生单线态氧的光敏剂的活性，所以光敏剂的可选择性大幅 提高，即该方法可以在大范围内进行应用。
附图说明
图1示出本发明实施例1中mfer随磁场强度的变化趋势图；
图2示出本发明实施例2中在照射条件下0-14mT磁场作用 下光敏剂RB和KI反应产物350nm处的吸光度-时间曲线图；
图3示出本发明实施例2中在照射条件下14-135mT磁场作 用下光敏剂RB和KI反应产物350nm处的吸光度-时间曲线图；
图4示出本发明实施例2中在照射条件下135-800mT磁场作 用下光敏剂RB和KI反应产物350nm处的吸光度-时间曲线图；
图5示出本发明实施例2中随磁场强度的增大，以RB为光敏 剂时，反应速率R的变化率mfeR的变化趋势图；
图6示出本发明实施例2中磁场强度为100mT时，350nm处 的吸光度-时间曲线；
图7示出本发明实施例2中反应速率R的变化率mfeR分别在 无磁场条件和磁场强度为100mT时的变化趋势图；
图8示出本发明实施例3中在0-800mT的磁场强度下细胞存 活率CV随时间的变化趋势图；
图9示出本发明实施例3中分别在RB和PBS缓冲液处理下， 在各磁场强度下，培养后细胞的数量外观图；
图10示出本发明实施例3中在各磁场强度下的相对细胞存 活率；
图11示出本发明实施例4中HeLa细胞分别置于0、250、 800mT的磁场条件下的荧光图像；
图12示出本发明实施例4中加入RB的HeLa细胞在光照及0、 250或800mT的磁场条件下，荧光强度变化率对比图；
图13示出本发明实施例4中在0、250或800mT的磁场条件 下，HeLa细胞经光照发生凋亡情况的双参数直方图点图。
图14示出本发明实施例5中HeLa细胞置于0、250或800mT 的磁场条件下，切割的Caspase-3蛋白酶、Bax和Bcl-2的 Westernblot分析图；
图15示出本发明实施例5中不同磁场条件下的Caspase-3蛋 白酶、Bax和Bcl-2的Westernblot分析定量结果图；
图16示出本发明实施例6中小鼠体内(2)组、(4)组、(5) 组、(7)组、(8)组的相对肿瘤体积变化率图；
图17示出本发明实施例6中(2)组、(3)组、(4)组、(5) 组、(7)组、(8)组的肿瘤组织外观图；
图18示出本发明实施例6中(5)组、(7)组、(8)组的肿 瘤组织质量变化率图；
图19示出本发明实施例6中肿瘤组织切片的Bax、Bcl-2和切 割的Caspase-3的免疫组化(IHC)染色测试图；
图20示出本发明实施例6中小鼠主要器官的苏木精-伊红 (H&E)染色测试图；
图21示出本发明实施例2中单线态氧(1O2)的量子产率ΦΔ 随着磁场强度的增大的变化趋势；
图22示出本发明实施例2中单线态氧(1O2)的寿命τΔ随着 磁场强度的增大的变化趋势。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明进行详细说明，本发明的 特点和优点将随着这些说明而变得更为清楚、明确。
本发明提供的通过磁场增强光敏剂活性的方法，在光照条 件下，通过控制外界磁场作用，进一步提高光敏剂的活性，从 而利用光动力治疗方法实现增强癌症细胞的凋亡或肿瘤组织的 抑制作用，有助于提高光动力治疗的效果。
本发明提供了一种通过磁场增强光敏剂活性的方法，所述 方法，在光照条件下，使光敏剂置于磁场中，从而提高光敏剂 活性。
优选地，所述方法中，在磁场和光照作用下，增强光敏剂 产生的单线态氧的氧化效率。
相比于单一光照条件下，磁场强度为34-355mT时，单线态 氧的氧化速率增大；磁场强度为50-220mT时，单线态氧的氧化 速率增大大于20％。
所述光照波长根据光敏剂的激发波长进行确定。所述光敏 剂选自能够在照射条件下受激发产生能量跃迁，诱导产生单线 态氧的光敏剂，优选选自卟啉类化合物及其金属配合物、二氢 卟吩类化合物及其金属配合物、菌绿素类化合物及其金属配合 物、酞菁类化合物及其金属配合物、氟硼二吡咯类化合物和荧 光素类化合物中的一种或几种，更优选为卟啉类化合物、二氢 卟吩类化合物或荧光素类化合物，如孟加拉玫瑰红(RB，照射 波长500～570nm)、二氢卟吩e6(Ce6，照射波长630～670nm)、 替莫卟吩(Temoporfin，照射波长520/550/590或650nm)、酞菁 锌(ZnPc，照射波长600～700nm)、8-(4-甲基苯基)-1,3,5,7-四碘-氟硼二吡咯(照射波长560-590nm)。
所述光敏剂浓度为0.5-70μmol/L，优选为1-50μmol/L，更优 选为2-30μmol/L。
所述磁场强度为15-700mT，优选为35-600mT，更优选为 50-450mT。在本发明中，通过测试光敏剂在磁场和照射条件下， 对碘离子(I-)、体外细胞毒性和小鼠体内肿瘤细胞的作用反应， 发现当磁场强度为700mT以上时，磁场将抑制单线态氧和I-的 反应速率、促进体外的肿瘤细胞生长、对小鼠体内肿瘤细胞抑 制减弱。若磁场太弱单线态氧对I-、体外细胞毒性和小鼠体内 肿瘤细胞的作用较弱，磁场效应不明显。在对小鼠的体内肿瘤 组织进行作用时，在光照条件一定时，在250-700mT的磁场强 度下，即可对肿瘤组织产生抑制作用，在200-300mT的磁场强 度下，对肿瘤组织细胞产生杀伤作用，此时肿瘤组织在小鼠体内的深度为0.2-5mm。
相比于单一光照条件下，当磁场强度为200-500mT时，对 体外HeLa细胞表现为进一步抑制细胞增长，即在该磁场条件 下，对HeLa细胞的增长抑制率大于单一光照条件下的增长抑制 率。
所述磁场和照射的作用时间为3-20min，优选为3-15min， 更优选为3-10min，磁场和照射的作用时间过短，磁场增强光敏 剂活性效应不明显，磁场作用时间过长对光敏剂的增强效果不 会进一步加强。
所述照射强度为1-200mW·cm-2，优选为3-150mW·cm-2，更 优选为5-100mW·cm-2。照射强度根据照射位置的深度进行选 择。在本发明的一种优选实施方式中，照射深度为小于0.2mm， 照射强度为1-20mW·cm-2，优选为4-10mW·cm-2；照射深度为 0.2-5mm，照射强度为50-150mW·cm-2，优选为80-120mW·cm-2。
本发明中，通过控制磁场和光照强度，能够进一步增强光 敏剂的活性，促进单线态氧对肿瘤细胞或肿瘤组织氧化反应， 从而增强对肿瘤细胞的细胞毒性，促使细胞凋亡，从而实现增 强光动力治疗的效果。
实施例
实施例1
(1)将光敏剂孟加拉玫瑰红(RB)(RB纯度≥98％，购自 萨恩化学技术(上海)有限公司，品牌为安耐吉化学)和单线态 氧荧光探针(SOSG)溶解在水中(SOSG购自ThermoFisher 科学(中国)有限公司)，得到的溶液中，光敏剂和SOSG的浓 度均为10μmol/L。在一定的磁场强度下，将溶液暴露于561nm 的LED灯(发光二极管)下，功率为5mW·cm-2，分别测试光 照时间为0、15、30、45、60、90、120和180秒时测试荧光光 谱，得到发射强度(I525nm)–时间(t)曲线。分别在磁场强度 为0、10、35、85、180、300mT下，进行上述荧光光谱测试(外 部磁场由钕铁硼永磁体提供)。
(2)将光敏剂二氢卟吩e6(Ce6，Chlorin e6)(购自萨恩 化学技术(上海)有限公司，品牌为安耐吉化学)和单线态氧荧 光探针(SOSG)溶解在水中，得到的溶液中，光敏剂和SOSG 的浓度均为10μmol/L。在一定的磁场强度下，将溶液暴露于 640nm的LED灯(发光二极管)下，功率为5mW·cm-2，分别 测试光照时间为0、15、30、45、60、90、120和180秒时测试 荧光光谱，得到发射强度(I525nm)–时间(t)曲线。分别在磁 场强度为0、10、30、70、150、250mT下，进行上述荧光光谱 测试。
外部磁场由钕铁硼永磁体提供。采用爱丁堡FLS980稳态 瞬态荧光光谱仪测试荧光光谱，检测器为PMT R928，光源为 450W无臭氧氙灯，激发波长为λex＝488nm。
在光照条件下，光敏剂受激发产生单线态氧1O2，荧光探 针SOSG与1O2反应，生成具有绿色荧光发射特性的内过氧化 物，在488nm的激发波长条件下，其发射波长为525nm。该反 应的反应速率为r。
在施加光照和磁场条件下，本发明通过反应速率r的变化 率mfer对磁场效应(MFEs)进行量化mfer＝(rB-r0)/r0×100％， 其中，r0为磁场强度为0mT时的反应速率，rB为磁场强度为B mT时的反应速率。其中，反应速率(r)与发射强度(I525nm) –时间(t)曲线的切线斜率(曲线的一阶导数)成正比。0、10、 35、85、180、300mT的磁场强度下，开始接受光照及磁场作 用时(记为0时刻)，I525nm—t曲线的一阶导数为1、1.05、1.09、 0.99、1.12、1.14(已归一化)。
通过上述测试，得到以RB为光敏剂时的mfer～磁场强度B 曲线，具体如图1所示。
从如图1可知，当施加的磁场从0mT增加到250mT时，r 随之增大，并在磁场强度为250mT时，达到峰值，此时mfer为25％，表明施加一定强度的磁场可以提高SOSG与1O2的反 应速率。
以Ce6为光敏剂时，mfer随磁场强度B的变化规律与以 RB为光敏剂时类似，0、10、30、70、150、250mT下，I525nm—t曲线0时刻的一阶导数为1、1.09、1.33、1.23、1.16、1.12 (已归一化)。说明光敏剂的种类对SOSG与1O2反应的影响不 大。
实施例2
(1)将光敏剂孟加拉玫瑰红(RB)和碘化钾KI溶解在水 中，得到的溶液中，光敏剂和KI的浓度分别为10μmol/L和 10mmol/L。在一定的磁场强度下，将溶液暴露于561nm的LED灯(发光二极管)下，功率为5mW·cm-2，在5min内每15秒 测试一次吸收光谱，并记录350nm处的吸光度，得到吸光度- 时间曲线，具体如图2、图3、图4所示。分别在磁场强度0～850mT 范围内，进行上述紫外-可见吸收光谱测试。
(2)将光敏剂二氢卟吩e6(Ce6，Chlorin e6)和碘化钾 KI溶解在水中，得到的溶液中，光敏剂和KI的浓度分别为 10μmol/L和10mmol/L。在一定的磁场强度下，将溶液暴露于635nm的LED灯(发光二极管)下，功率为5mW·cm-2，在5min 内每15秒测试一次吸收光谱，并记录350nm处的吸光度，得 到吸光度-时间曲线。分别在磁场强度0～850mT范围内，进行 上述紫外-可见吸收光谱。
外部磁场由东变(北京)EM4电磁铁提供。采用配备安捷 伦89090A恒温器(±0.1℃)的安捷伦8453紫外/可见光谱仪测 试紫外-可见吸收光谱。
在光照条件下，光敏剂受激发产生单线态氧1O2，KI与1O2反应，生成I2和目标检测物碘三离子I3 -，紫外-可见吸收光谱 中，其特征是吸收带集中在300和350nm处。该反应的反应速 率为R，其与碘三离子I3 -在350nm处的吸光度-时间曲线的斜 率成比例。
本发明通过反应速率R的变化率mfeR对磁场效应(MFEs) 进行量化mfeR＝(RB-R0)/R0×100％，其中，R0为磁场强度为0mT 时的反应速率，RB为磁场强度为B mT时的反应速率。
随磁场强度的增大，以RB为光敏剂时，反应速率R的变 化率mfeR的变化趋势如图2、图3、图4所示。由图2、图3、 图4可知，当磁场强度(MF)从0mT增加至14mT时，mfeR先降低，在MF＝14mT时最小为33％；而后开始增加，在 MF＝80～135mT范围内达到最大为46％。当MF继续从135mT 增加到850mT时，mfeR迅速减小。即在MF＝80～135mT的磁场 条件下，变化率mfeR达到最大值，反应速率最高，反应的磁场 效应处于“开启”状态。mfeR(％)随磁场强度B变化趋势具 体如图5所示，当磁场强度为34-355mT时，mfeR>0；当磁场 强度为50-220mT时，mfeR>20。
以Ce6为光敏剂时，反应速率R的变化率mfeR随磁场强 度B的变化规律与以RB为光敏剂时类似，说明光敏剂的种类 对KI与1O2反应的影响不大。
(3)将本实施例实验(1)中的RB/KI溶液置于方波调制 的磁场中(第一个周期为90s，前45s磁场强度为0mT，后45s 磁场强度为100mT；后三个周期为60s，前30s磁场强度为0mT， 后30s磁场强度为100mT)。在561nm的LED灯(发光二极管) 照射下，功率为5mW·cm-2，在5min内每5秒测试一次吸收光 谱，并记录350nm处的吸光度，得到吸光度-时间曲线，具体如图6所示。增加的MF使R值明显突然增强，从图6中可以 看到吸光度-时间曲线的前半个周期的一阶导数(近似为斜率) 明显小于后半个周期，即前半个周期的R值明显小于后半个周期，产物的累积，吸光度表现为持续上涨。分别计算0mT和 100mT下各时间的R平均值，具体如图7所示，磁场为100mT 时，R值比0mT时增大约平均45％。
(4)通过以下实验进行单线态氧(1O2)量子产率(ΦΔ) 和寿命(τΔ)检测。在RB(10μmol/L)的空气饱和D2O溶液 中测定了在1270nm处生成的单线态氧(1O2)的磷光。溶液在561nm激发。
磁场效应MFs(ΦΔ,B)由以下公式计算得到：
ΦΔ,B＝ΦΔ,0×(IB/I0)，其中，IB和I0分别为在磁场强度B下和 没有磁场强度下放射峰的峰面积。
磁场效应变化率为：
mfeΦ＝(ΦΔ,B-ΦΔ,0)/ΦΔ,0×100％＝(IB-I0)/I0×100％；
磁场效应对单线态氧(1O2)寿命(τΔ)的影响为：
mfeτΔ＝(τΔ,B-τΔ,0)/τΔ,0×100％
单线态氧(1O2)的量子产率ΦΔ值显示了随着磁场强度的 增大，1O2发光量子产率受磁场影响很小(变化率为-5％～+10％)， 具体如图21所示。通过实验，证明其变化不显著，波动误差认 为是测试过程差异等系统误差的影响。另一方面，单线态氧 (1O2)寿命τΔ值测试数据如表1所示，以磁场为0mT为100％ 计算的mfeτΔ变化趋势如图22所示，说明单线态氧(1O2)寿命 τΔ在实验磁场强度范围内变化不大。实验结果说明无论是否有 外场，RB单线态氧(1O2)的荧光变化不大，表明在光敏剂激 发态不受磁场影响。因此，磁场强度对1O2和碘离子的反应速 率影响较大。
表1：
MF(mT) τΔ(μs)
0 66.7±2.8
30 65.8±7.1
50 60.7±2.0
90 62.6±3.2
120 69.5±4.7
150 62.8±0.8
200 65.4±4.5
实施例3
(1)将适量HeLa细胞加入到DMEM培养基(美国康宁， 高糖型(葡萄糖浓度小于4.5g/L)中培养，添加适量的10wt％ 胎牛血清(FBS)、1wt％青霉素和链霉素。细胞在37℃、含体 积分数为5％CO2的增湿空气中培养2天。
在无光照条件下，取上述HeLa细胞(2×103个/孔)接种 于96孔培养皿中培养24h。再分别加入100μL培养基和100μL 浓度为80、40、20、10、5μmol/L的RB水溶液或100μL0.01mol/L 的PBS缓冲液(磷酸缓冲盐溶液)处理24小时后，用PBS缓 冲液洗涤细胞3次。
在无光照条件下，向上述96孔培养皿中加入DMEM(含 FBS)培养液培养24小时。再向每个孔中添加10μL的Cell Counting Kit-8(CCK-8试剂盒)(碧云天生物技术有限公司)和90μL的DMEM，控制光照及磁场强度条件，进行30分钟的 后续培养。使用酶标仪读取450nm处的吸光度。使用以下方程 式计算HeLa细胞的存活率(Cell Viability，CV)：
CV＝(As–Ab)/(Ac–Ab)×100％
式中，As为含有光敏剂(PS)的Hela细胞的吸光度，Ac为不含PS的Hela细胞吸光度，Ab为无PS和Hela细胞的吸光 度。
不同磁场强度条件下，半数抑制浓度的变化率mfeP(Cell Ciability(％))为：mfeP＝(IC50,0-IC50,B)/IC50,B×100％，其中，IC50,0为磁场强度为0mT的半数抑制浓度，IC50,B为磁场强度为B的 半数抑制浓度。
在光照条件为400-700nm的白光照射，功率为5mW·cm-2， 分别在0-800mT的磁场强度下进行测试，光照及磁场作用时间 为10min，在不同浓度的RB条件下，各磁场强度下mfeP(Cell Ciability(％))的测试计算结果如图8所示，根据图8通过逻辑 回归模型拟合计算得到磁场强度为B时，RB半数抑制浓度 μmol/L具体如下表2所示。
表2：
Figure BDA0003418908680000121
Figure BDA0003418908680000131
从图8中可以看出，相比没有磁场的条件下，施加14mT 的磁场强度，14mT下的光敏剂对细胞增殖的半数抑制浓度高 于无磁场条件下的，即对细胞毒性降低(mfeP＝-21％)；施加的 磁场强度从14mT逐渐增强到400mT，400mT时，IC50值最小， 细胞毒性最高，此时mfeP为-24％；当施加的磁场强度从400mT 逐渐增强到800mT时，800mT时mfeP为-58％，表现为对细胞 增殖的促进作用。上述结果与实施例1中mfer的变化趋势高度 一致。因此，光细胞毒性中的MFE可能来自磁场作用下的1O2和生物分子的反应速率。
在上述实验中，使光敏剂的最终浓度为30μmol/L，各磁场 强度下测试计算得到的CV(％)和mfe(CV)(％)具体如表3所示， 其中，mfe(CV)＝(CV0-CVB)/CV0×100％。
表3：
MF(mT) CV(％) mfe(CV)(％)
0 71.1±0.5 0
14 89.8±4.2 -26.3
150 72.5±3.2 -1.97
250 59.9±2.6 15.8
400 42.3±6.7 40.5
575 74.1±0.6 -4.2
700 78.3±3.2 -10.12658
800 83.0±0.5 -16.7
(2)将HeLa细胞(1×103个/孔)接种于6孔板中，加入 30μL RB水溶液(终浓度为30μM)或等体积0.01M PBS缓冲 液作为对照，在DMEM(含FBS)培养皿中培养24小时后， 用PBS缓冲液洗涤细胞3次。
黑暗中或光照10min(561nm白光，5mW·cm-2)，分别在 0mT、250mT、800mT的磁场条件下处理上述细胞。黑暗中继 续培养，每隔一天更换培养基，14天后，用PBS缓冲液冲洗，用甲醇冲洗后，加入0.1wt％结晶紫水溶液对细胞染色，培养皿 中细胞数量如图9所示；在0mT、250mT、800mT的磁场条件 下，浓度为30μmol/L RB的HeLa细胞的相对细胞活性如图10所示。
从图9中可以看出，没有RB共同培养Hela细胞的条件下， 在有无光照条件下，均没有显示出细胞毒性；在没有光照的条 件下，无论在有没有磁场的作用下，RB对HeLa细胞都没有显 示出细胞毒性；存在光敏剂RB时，仅在光照条件下，细胞数 量相对于仅有PBS处理条件下明显减低，在250mT条件下， 细胞数量最少，在800mT条件下，细胞数量较0mT和250mT条件下多，而比仅有PBS缓冲液处理条件下的数量减少。
从图10中可以看出，在250mT磁场条件下，细胞活性收 到抑制，细胞数量相对于0mT减少了17％；在800mT磁场条 件下，细胞活性增强，细胞数量相对于0mT增加了32％。 *p<0.01，、**p<0.05被认为是显著的，p为进行t检验的显著性 水平。
实施例4
(1)将HeLa细胞接种在无菌玻璃盖玻片上，放入DMEM (含FBS)培养皿中培养12h。然后分别加入适量30μmol/L RB 或0.01mol/L PBS缓冲液。避光培养24小时后，加入H2DCFDA (二氯荧光素二乙酸酯，≥97％，购于Sigma-Aldrich)，使其 最终浓度为10μmol/L，并将细胞再培养30分钟，用PBS缓冲 液洗涤细胞3次。
将上述HeLa细胞分别置于0、250、800mT的磁场条件下， 无光照条件或光照(561nm，5mW·cm-2)10分钟。采用尼康 A1R-si激光扫描共焦显微镜(488nm激发，515±15nm接收荧 光)测试得到荧光图像。其中，H2DCFDA是一种与细胞单线 态氧1O2反应以增加荧光发射强度(激发、发射波长分别为504、 529nm)的指示剂。
荧光测试图像如图11所示(标尺表示25μm)。从图中可 以看出，在无磁场条件下，加入RB的HeLa细胞较加入PBS 的荧光强度强；加入RB的HeLa细胞，在光照和磁场共同作用下，在250mT的磁场强度较无磁场和800mT的磁场条件下的 荧光强度强。在光照时间一定的条件下，在不同的磁场强度中， 1O2的生成量接近，因此结果表明，250mT的磁场强度增强了细胞中的氧化速率，这与实施例1中的实验结果保持一致。
加入RB的HeLa细胞在光照及0、250或800mT的磁场条 件下，荧光强度变化率如图12所示。荧光强度变化率为(IB-I0) /I0×100％，IB为磁场强度为B时的荧光强度，I0为无磁场条件 下的荧光强度。图12中，**为统计概率p<0.01；***为p<0.005， p<0.05被认为是显著的。
(2)将HeLa细胞(2×104个/孔)接种在6孔板中培养24 小时，分别加入RB溶液(最终浓度为30μmol/L)或PBS缓冲 液(终浓度为0.01mol/L)处理，24小时后，用PBS缓冲液洗涤细胞3次。
将上述细胞置于0、250或800mT的磁场条件下，同时进 行光照(561nm，5mW·cm-2)或在黑暗中，处理10分钟。然 后在黑暗中培养24小时后，用膜联蛋白Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒(购于碧云天生物技术有限公司)染色细胞，并通过 流式细胞仪(型号BDFACSVerse，Becton Dickinson)进行检 测，每组进行3次可行的统计分析。测试结果如图13所示。图 13中，每个测试图中象限Q4为健康细胞数量，Q1为早期凋亡 细胞数量、Q2为晚期凋亡细胞数量和Q3为坏死细胞数量。
从图中可以看出，培养后，加入PBS缓冲液、无磁场的 HeLa细胞健康细胞数量高；加入光敏剂RB后，仅有光照、无 磁场的条件下，健康细胞数量有所减少，晚期凋亡细胞数量增 多，发现63.8％的凋亡细胞；加入光敏剂RB，施加光照和250mT 磁场的条件下，健康细胞数量进一步减少，凋亡细胞的百分比 增加至75.9％，显示出19％的增加，而施加光照和800mT磁场 的条件下，健康细胞数量较加入RB无磁场条件下明显增多， 只有32.9％的细胞是凋亡细胞。上述结果说明，加入光敏剂RB 后，在光照条件下，产生的单线态氧能够抑制HeLa细胞的生 长，再额外施加250mT磁场后，抑制效果增强；但额外施加 800mT磁场反而促使HeLa癌症细胞的生长(较加入PBS缓冲 液、无磁场条件下增长的少)。研究结果表明，暴露于低静态磁 场(250mT)可以促使细胞凋亡，但高强度的磁场(800mT) 具有相反的效果。这与本实施例实验(1)中的荧光测试结果相 一致。
实施例5
将HeLa细胞(2×104个/孔)接种在6孔板中培养24小时， 分别加入RB溶液(最终浓度为30μmol/L)或PBS缓冲液处理 (最终浓度为0.01mol/L)，24小时后，用PBS缓冲液洗涤细胞3次。
将上述细胞置于0、250或800mT的磁场条件下，同时进 行光照(561nm，5mW·cm-2)或在黑暗中，处理24小时后， 用PBS缓冲液清洗细胞并通过离心收集细胞。使用RIPA裂解缓冲液(中等裂解强度)从细胞中提取蛋白质。用一级抗体检 测靶蛋白，分别识别切割Caspase-3蛋白酶、Bax (BCL2-Associated X的蛋白质)和Bcl-2(B淋巴细胞瘤-2基 因)，以β-Actin抗体作为参照。图像由Bio-Rad ChemiDoc触 摸成像系统采集，测试结果如图14所示，图中A组为PBS缓 冲液处理HeLa细胞(光照、无磁场)；B组为RB处理的HeLa 细胞(光照、无磁场)；C组为RB处理的HeLa细胞(光照、 250mT磁场)；D组为RB处理的HeLa细胞(光照、800mT磁 场)。
与B组相比，C组中的切割Caspase-3和Bax/Bcl-2比率急 剧增加，而D组则下降。这些数据表明，低静态磁场(如250mT) 可以促进Hela细胞凋亡，但高静态磁场(如800mT)诱导Hela 细胞增长。蛋白表达量变化率为(AB-A0)/A0×100％，其中AB、 A0分别为有、无磁场时蛋白的表达量(通过ImageJ软件分析 图14中条带所得)。如图15所示，在250mT和800mT时，蛋白表达量变化率如下表所示，图中**为统计概率p<0.01；*** 为p<0.005，p<0.05被认为是显著的。
Figure BDA0003418908680000171
实施例6
选取24只五周龄雌性BALB/c裸鼠，将1×106个HeLa细 胞(在200μL 0.01mol/LPBS缓冲液中)皮下接种到每只小鼠 的背部右后侧，建立移植瘤模型。(从北京农学院获得五周龄雌 性BALB/c裸鼠，并在标准环境条件下饲养。所有动物程序均 获北京农学院动物保护与利用委员会批准。)待长出肿瘤之后， 瘤内注射25μL RB(1.0mg/kg)或等体积的浓度为0.01mol/L PBS缓冲液。
将小鼠分为8组(每组3只小鼠)的处理条件为：
(1)注射PBS缓冲液-无光照-无磁场(PBS-dark-0mT)；
(2)注射PBS缓冲液-光照-无磁场(PBS-light-0mT)；
(3)注射PBS缓冲液-光照-250mT磁场(PBS-light-250mT)；
(4)注射PBS缓冲液-光照-800mT磁场(PBS-light-800mT)；
(5)注射RB-光照-无磁场(RB-light-0mT)；
(6)注射RB-光照-100mT磁场(RB-light-100mT)；
(7)注射RB-光照-250mT磁场(RB-light-250mT)；
(8)注射RB-光照-800mT磁场(RB-light-800mT)。
除第(1)组外的所有组在注射后5分钟接受光照，光照波 长为400-700nm，功率为100mW·cm-2，光照时间为10min。第 (3)、(4)和(6)～(8)组小鼠的肿瘤区域在光照期间使用电磁铁，使小鼠暴露于相应的静态磁场。
测试(一)：在随后的14天内每隔一天用数字卡尺监测肿 瘤大小(体外进行肿瘤的外周测量)，计算肿瘤为体积＝长度× 宽度×高度÷2。(2)组、(4)组、(5)组、(7)组、(8)组的 测试结果如图16所示，图中**为统计概率p<0.01；***为 p<0.005，p<0.05被认为是显著的。各组于注射后第14天处死 3只小鼠，收集肿瘤组织进行拍照和称重，取出(2)组、(3)组、(4)组、(5)组、(7)组、(8)组的肿瘤组织如图17所示； (5)组、(7)组、(8)组的肿瘤组织质量变化率如图18所示， 质量变化率为(ωB-ω0)/ω0×100％，其中，ωB为磁场条件下肿瘤质 量，ω0为(5)组肿瘤质量。
从(1)～(8)组的肿瘤体积和质量的测量结果比较来看， 注射PBS缓冲液的治疗组，即(1)～(4)组，肿瘤生长较迅 速；(5)组(RB-light-0mT)显示肿瘤生长受到抑制，(7)组(RB-light-250mT)显示肿瘤生长进一步受到抑制，(6)组 (RB-light-100mT)和(8)(RB-light-800mT)组的磁场效应对 肿瘤生长没有显著影响。似乎与体外结果相矛盾，推测是由于 肿瘤组织具有相当的体积，而磁极距离有限，这导致肿瘤区域 的磁场分布不均匀，且受到的磁场效应受到影响。
测试(二)：第14天处死小鼠后，收集肿瘤组织和主要器 官(心、肝、脾、肺和肾)进行组织学检查。用10％中性福尔 马林溶液固定肿瘤组织和主要器官。采用苏木精-伊红(H&E) 染色分析光照及磁场效应对肿瘤和正常器官的毒性。采用末端 脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)染色 检测肿瘤组织中的细胞凋亡，同时检测肿瘤组织中切割的 Caspase-3、Bax和Bcl-2的表达。
图19为肿瘤组织切片的Bax、Bcl-2和切割的Caspase-3 的免疫组化(IHC)染色测试图，其显示光动力治疗后肿瘤切 片发生了显著的凋亡，其中，加入RB且磁场为250mT的肿瘤 切片细胞凋亡更显著，但加入RB且磁场为800mT的细胞凋亡 情况并不显著。这说明蛋白质在体外的表达，并表明暴露于中 度静态磁场(250mT)可提高体内抗肿瘤光动力治疗的效果， 而800mT的磁场则相反。所有组均未观察到体重减轻或其他异 常的迹象，表明RB和磁场的副作用很小。
图20为主要器官的苏木精-伊红(H&E)染色测试图，其 显示所有组的器官功能良好，说明本发明中提供的磁场效应及 光动力综合治疗不会导致全身毒性，有助于肿瘤组织的针对性 抑制。
以上结合具体实施方式和/或范例性实例以及附图对本发 明进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本发明的限 制。本领域技术人员理解，在不偏离本发明精神和范围的情况 下，可以对本发明技术方案及其实施方式进行多种等价替换、 修饰或改进，这些均落入本发明的范围内。本发明的保护范围 以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种通过磁场增强光敏剂活性的方法，其特征在于，所述方法，在光照条件下，使光敏剂置于磁场中，从而提高光敏剂活性。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中，在磁场和光照作用下，增强光敏剂产生的单线态氧的氧化效率。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磁场强度15-700mT，优选为35-600mT，更优选为50-450mT。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，相比于单一光照条件下，磁场强度为34-355mT时，单线态氧的氧化速率增大；磁场强度为50-220mT时，单线态氧的氧化速率增大大于20％。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述照射强度为1-200mW·cm-2，优选为3-150mW·cm-2，更优选为5-100mW·cm-2。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，照射深度为小于0.2mm，照射强度为1-20mW·cm-2，优选为4-10mW·cm-2。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，照射深度为0.2-5mm，照射强度为50-150mW·cm-2，优选为80-120mW·cm-2。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述光敏剂浓度为0.5-70μmol/L，优选为1-50μmol/L。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述光敏剂浓度为2-30μmol/L。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述光敏剂选自能够在照射条件下受激发产生能量跃迁，诱导产生单线态氧的光敏剂，优选选自卟啉类化合物、二氢卟吩类化合物、菌绿素类化合物、酞菁类化合物、氟硼二吡咯类化合物和荧光素类化合物中的一种或几种，更优选为卟啉类化合物、二氢卟吩类化合物或荧光素类化合物。
CN202111556554.6A 2021-12-17 2021-12-17 通过磁场增强光敏剂活性的方法 Pending CN116327927A (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111556554.6A CN116327927A (zh) 2021-12-17 2021-12-17 通过磁场增强光敏剂活性的方法
PCT/CN2022/138126 WO2023109694A1 (zh) 2021-12-17 2022-12-09 通过磁场增强光敏剂活性的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111556554.6A CN116327927A (zh) 2021-12-17 2021-12-17 通过磁场增强光敏剂活性的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116327927A true CN116327927A (zh) 2023-06-27

Family

ID=86774902

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111556554.6A Pending CN116327927A (zh) 2021-12-17 2021-12-17 通过磁场增强光敏剂活性的方法

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN116327927A (zh)
WO (1) WO2023109694A1 (zh)

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009044289A1 (en) * 2007-03-06 2009-04-09 Novocure Ltd. Treating cancer using electromagnetic fields in combination with photodynamic therapy
CN105214095B (zh) * 2015-10-21 2017-11-21 哈尔滨工程大学 金属有机框架介孔结构的多功能纳米材料及制备方法
TWI722252B (zh) * 2016-11-04 2021-03-21 中央研究院 光觸發病毒療法之遠端控制
CN106668871B (zh) * 2017-01-17 2019-08-06 华南师范大学 一种抑制乳腺癌细胞生长的光敏型磁性纳米粒体系的制备方法及应用
CN107812190A (zh) * 2017-11-10 2018-03-20 中国医学科学院生物医学工程研究所 一种用于直肠肿瘤治疗的光动力试剂盒及制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2023109694A1 (zh) 2023-06-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Tang et al. An aza-BODIPY photosensitizer for photoacoustic and photothermal imaging guided dual modal cancer phototherapy
Shi et al. Tumor-targeting, enzyme-activated nanoparticles for simultaneous cancer diagnosis and photodynamic therapy
Hajji et al. Arginine deprivation alters microglial polarity and synergizes with radiation to eradicate non-arginine-auxotrophic glioblastoma tumors
CN108567980B (zh) 光动力诱导的co可控递送系统及其构建方法
Zhou et al. Copper-cysteamine nanoparticle-mediated microwave dynamic therapy improves cancer treatment with induction of ferroptosis
US10525146B2 (en) Metal oxide nanoparticle for cell lysis
CN103585644A (zh) 一种聚乙二醇修饰的磁性纳米颗粒及其应用
Hu et al. 808 nm near-infrared light-excited UCNPs@ mSiO2-Ce6-GPC3 nanocomposites for photodynamic therapy in liver cancer
Zhou et al. Mitochondria-anchoring and AIE-active photosensitizer for self-monitored cholangiocarcinoma therapy
Yan et al. Effects of hydroxyl radicals produced by a zinc phthalocyanine photosensitizer on tumor DNA
Zhao et al. A novel ruthenium polypyridyl complex for the selective imaging and photodynamic targeting of the Golgi apparatus
Rubio et al. Spatial and temporal dynamics of in vitro photodynamic cell killing: extracellular hydrogen peroxide mediates neighbouring cell death
Liu et al. Apoptosis induced by hematoporphyrin monomethyl ether combined with He–Ne laser irradiation in vitro on canine breast cancer cells
Wu et al. A transformable gold nanocluster aggregate-based synergistic strategy for potentiated radiation/gene cancer therapy
Hu et al. A thermally activated delayed fluorescence photosensitizer for photodynamic therapy of oral squamous cell carcinoma under low laser intensity
Hirschberg et al. Effects of ALA‐mediated photodynamic therapy on the invasiveness of human glioma cells
Jia et al. Design and structural regulation of AIE photosensitizers for imaging-guided photodynamic anti-tumor application
Xiong et al. Selective photodynamic eradication of senescent cells with a β-galactosidase-activated photosensitiser
Xu et al. De Novo Designed Ru (II) Metallacycle as a Microenvironment‐Adaptive Sonosensitizer and Sonocatalyst for Multidrug‐Resistant Biofilms Eradication
Chen et al. Design and development of a mitochondrial-targeted photosensitizer for two-photon fluorescence imaging and photodynamic therapy
Zhang et al. Moderating hypoxia and promoting immunogenic photodynamic therapy by HER-2 nanobody conjugate nanoparticles for ovarian cancer treatment
Kulbacka et al. Investigating the photodynamic efficacy of chlorin e6 by millisecond pulses in metastatic melanoma cells
CN116327927A (zh) 通过磁场增强光敏剂活性的方法
CN115364235B (zh) 一种锌离子驱动氧气节约和基因沉默的生物活性纳米载体及其制备方法和应用
US7842801B2 (en) Phthalocyanine dyes and their preparation and use

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination