JP5064612B2 - 還元された炭水化物類及び炭水化物誘導体で被覆された熱的に安定なコロイド状酸化鉄 - Google Patents
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Description
【０００１】
技術分野
本技術分野は、カルボキシメチル還元多糖である組成物、血漿増量剤としての使用のため及び酸化鉄粒子の被覆のための方法、還元多糖又は誘導体化された還元多糖で被覆された超常磁性及び非超常磁性の酸化鉄から成る組成物、及びＭＲＩの造影剤及び造血薬としての使用の方法に関する。
【０００２】
背景
磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）の発明以来、造影剤と呼ばれる注射可能な化学物質の対応する技術が発達した。造影剤は、診断の目的のためにより有用なＭＲＩ像を生じるのを助けるように、医療業務において重要な役割を演じる。特に、２種類の造影剤が開発され、臨床業務で採用された。これらは、Ｍａｇｎａｖｉｓｔ（登録商標）のような低分子量のガドリニウム錯体と、ＦｅｒｉｄｅｘＩ．Ｖ．（登録商標）及びＣｏｍｂｉｄｅｘ（登録商標）のようなコロイド状酸化鉄である。これら２種類の薬剤何れも理想的ではない。これらの薬剤が直面した問題を表１に示し、それらは、成分の費用、合成の非効率、最後の滅菌（オートクレーブ処理）の間の被覆剤の消失、画像化の目的での器官の取り込み量の狭い範囲、毒性の副作用、第一の段階又は平衡投与の何れかへの使用の制限、及びここで記載されたその他のものを含む。これらの問題を克服し、これら２種類の造影剤の特性を兼ね備える薬剤が大いに望まれている。
【０００３】
【表１】
【０００４】
概要
本発明の１つの態様は、哺乳類の被験体への投与のための酸化鉄錯体を提供する方法であって、該方法は、還元多糖の酸化鉄錯体を製造し、及び該錯体をオートクレーブ処理で滅菌することを含む。一般的に、還元多糖は、還元されたグルコースのポリマーである。還元されたグルコースのポリマーの一例は、還元デキストランである。還元多糖は、硼水素化塩から成る群から選択される試薬又は水素化触媒存在下での水素との多糖の反応を通して製造される。本方法のさらなる側面においては、酸化鉄は超常磁性である。
【０００５】
本発明のもう１つの好ましい態様は、哺乳類の被験体への投与のための酸化鉄錯体を提供する方法であって、該方法は、誘導体化された還元多糖の酸化鉄錯体を製造し、及び該錯体をオートクレーブ処理で滅菌することを含む。この方法によると、錯体の製造は、カルボキシアルキル化（例えば、カルボキシアルキル化はカルボキシメチル化である）によって還元多糖を誘導体化することを含むことができる。更に、この方法によると、還元多糖は、還元デキストランであり得る。誘導体化された還元多糖は、ナトリウム塩として単離することができ、１６５０乃至１８００ｃｍ−１の領域に赤外吸収ピークを含まない。本方法の１つの側面において、誘導体化された還元多糖の製造は、約５０℃未満の温度で達成される。本方法のもう１つの側面においては、誘導体化された還元多糖の製造は、約４０℃未満の温度で達成される。本方法の更なる側面においては、酸化鉄は超常磁性である。
【０００６】
更にもう１つの態様において、本発明は、還元多糖で被覆された酸化鉄錯体を調合する方法を提供する。この組成物は薬の用途のためであり、該組成物は、未処理多糖で被覆された類似の酸化鉄触媒に比較して減少した毒性を有する。このような酸化鉄錯体を調合する方法は、還元多糖の酸化鉄錯体を製造すること、及び該錯体をオートクレーブ処理で滅菌すること、を含む。該調合物は、多糖を、硼水素化塩から成る群から選択される還元剤の1つ又は水素化触媒の存在下での水素と反応させることにより製造される多糖を提供する。還元多糖の酸化鉄錯体はこのような減少した毒性を有する。本方法の更なる側面においては、酸化鉄は超常磁性である。
【０００７】
更にもう1つの態様において、本発明は、還元された誘導体化された多糖で被覆された酸化鉄錯体を調合する方法を提供する。この組成物は薬の用途のためであり、該組成物は、未処理の誘導体化された多糖で被覆された類似の酸化鉄錯体に比較して減少した毒性を有する。このような酸化鉄錯体を調合する方法は、還元された誘導体化された多糖の酸化鉄錯体を製造すること、及び該錯体をオートクレーブ処理で滅菌すること、を含む。本方法によると、錯体を製造することは、還元多糖をカルボキシアルキル化（例えば、カルボキシアルキル化はカルボキシメチル化である）により誘導体化することを含むことができる。更に、本方法によると、還元多糖は、還元デキストランであり得る。誘導体化された還元多糖は、ナトリウム塩として単離され得、１６５０乃至１８００ｃｍ−１の領域内に赤外吸収ピークを含まない。本方法の１つの側面において、誘導体化された還元多糖の製造は、約５０℃未満の温度で達成される。本方法のもう１つの側面において、誘導体化された還元多糖の製造は、約４０℃未満の温度で達成される。本方法の更なる側面において、酸化鉄は超常磁性である。
【０００８】
本発明のもう１つの態様は、造影剤にＴ１シーケンス（ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のシグナル増加及びＴ２シーケンスのシグナル減少を与えるＴ１及びＴ２緩和特性を有する還元された誘導体化された多糖の酸化鉄錯体を提供する。本態様の更なる側面は、還元された誘導体化された多糖の酸化鉄は、１回の検査において連続画像のため複数回投与され得る。本薬剤の更にもう１つの側面は、血管系、肝臓、脾臓、骨髄、及びリンパ節を含む複数の器官系を映すのに用いられ得る。
【０００９】
本発明のもう１つの態様は、静注用鉄補給剤として使用するために、還元多糖の酸化鉄錯体を提供する。
【００１０】
本発明のもう１つの態様は、静注用鉄補給剤として使用するための、還元された誘導体化された多糖の酸化鉄錯体を提供する。
【００１１】
また、更なる態様において、本発明は、哺乳類の被験体にオートクレーブ処理した還元多糖の酸化鉄錯体を投与する改良された方法を提供する。改良された投与方法は、１５ｍｌ以下の容量のオートクレーブ処理した還元多糖の酸化鉄錯体の注射を含む。本態様のもう１つの側面において、注射される容積は塊薬（ｂｏｌｕｓ）として注射される。本方法の更なる側面において、酸化鉄は超常磁性である。本態様の更なる側面において、注射される容積は、改良される画質を与える。
【００１２】
また、更なる態様において、本発明は、哺乳類の被験体にオートクレーブ処理した誘導体化された還元多糖の酸化鉄錯体を投与する改良された方法を提供する。改良された投与方法は、１５ｍｌ以下の容量のオートクレーブ処理した還元された誘導体化された多糖の酸化鉄錯体の注射を含む。本態様のもう１つの側面において、注射される容積は塊薬として注射される。本方法の更なる側面において、酸化鉄は超常磁性である。本態様の更なる側面において、注射される容積は、改良される画質を与える。
【００１３】
本発明の１つの態様は、該組成物が減少した毒性を与えるように、哺乳類の被験体に還元多糖の酸化鉄錯体を投与する改良された方法を提供し、ここで改良は、組成物の調合において還元多糖を利用することを含む。本態様の更なる側面において、酸化鉄は超常磁性である。
【００１４】
本発明の１つの態様は、該組成物が減少した毒性を与えるように、哺乳類の被験体に還元された誘導体化された多糖の酸化鉄錯体を投与する改良された方法を提供し、ここで改良は、組成物の調合において還元された誘導体化された多糖を利用することを含む。本態様の更なる側面において、酸化鉄は超常磁性である。
【００１５】
本発明の１つの態様は、還元多糖の酸化鉄錯体を提供し、ここで還元多糖は誘導体化され、例えば、還元された誘導体化された多糖はカルボキシアルキル多糖である。カルボキシアルキルは、カルボキシメチル、カルボキシエチル、及びカルボキシプロピルから成る群から選択される。更に、還元多糖は還元デキストランであり得、例えば、還元デキストランは還元カルボキシメチルデキストランであり得る。本発明の本態様の更なる側面は、還元デキストランの誘導体化の濃度は、多糖１ｇ当たりカルボキシル基が少なくとも７５０マイクロモルで、１５００マイクロモル未満であり、ここで、該組成物は、誘導体化の程度がより低い組成物に比べ減少した毒性を有する。
【００１６】
本発明の１つの態様は、少なくとも約１００℃の温度で安定であるような還元多糖の酸化鉄錯体を与える。好ましい態様において、そのような錯体は約１２１℃の温度で安定である。還元多糖の酸化鉄錯体のなお一層好ましい側面において、そのような錯体は、該錯体を滅菌するのに十分な時間、少なくとも１２１℃の温度で安定である。本態様の更なる側面において、酸化鉄は超常磁性である。
【００１７】
本発明の態様は、少なくとも約１００℃の温度で安定であるような還元された誘導体化された多糖の酸化鉄錯体を与える。好ましい態様において、そのような錯体は約１２１℃の温度で安定である。還元多糖の酸化鉄錯体のなお一層好ましい側面において、そのような錯体は、該錯体を滅菌するのに十分な時間、少なくとも１２１℃の温度で安定である。本態様の更なる側面において、酸化鉄は超常磁性である。
【００１８】
本発明の好ましい態様は、対応する未処理デキストランの酸化鉄に比べて増大したｐＨ安定性を有する還元多糖の酸化鉄錯体を、薬の用途のために配合する方法であり、該方法は、デキストランを与えること、及びデキストランを硼水素化塩又は水素化触媒の存在下で水素と反応させ、還元デキストランを鉄塩と反応させて安定なｐＨを有する調合物を与えること、を含む。
【００１９】
本発明の好ましい態様は、対応する未処理デキストランの酸化鉄に比べて増大したｐＨ安定性を有する還元された誘導体化された多糖の酸化鉄錯体を、薬の用途のために配合する方法であり、該方法は、デキストランを与えること、及びデキストランを硼水素化塩又は水素化触媒の存在下で水素と反応させ、還元デキストランを鉄塩と反応させて安定なｐＨを有する調合物を与えること、を含む。
【００２０】
もう１つの態様において、本発明は、薬の用途のための還元された誘導体化されたデキストラン組成物（ここで、該組成物は、未処理デキストランに比べ減少した毒性を有する）を配合する方法を提供し、還元された誘導体化された多糖を製造すること、及び生成物をオートクレーブ処理で滅菌することを含む。この方法によると、還元多糖は、未処理多糖を、硼水素化塩から成る群から選択されるいくつかの還元剤の１つ又は水素化触媒の存在下の水素と反応させることにより得られる。本態様の好ましい側面において、多糖はデキストランである。該組成物を製造することは、カルボキシアルキル化（例えば、ここではカルボキシアルキル化はカルボキシメチル化である）によって還元多糖を誘導体化することを含むことができる。更に、本方法によると、還元多糖は還元デキストランであり得る。誘導された還元多糖は、ナトリウム塩として単離され得、１６５０乃至１８００ｃｍ−１の領域内に赤外吸収ピークを含まない。本方法の１つの側面において、誘導体化された還元多糖の製造は、約５０℃未満の温度で達成される。本方法のもう１つの側面において、誘導体化された還元多糖の製造は、約４０℃未満の温度で達成される。
【００２１】
本発明の一態様は、該組成物が減少した毒性を与えるように還元された誘導体化された多糖を、哺乳類の被験体に投与する改良された方法を提供し、ここで該改良は組成物の調合に還元多糖を利用することを含む。
【００２２】
本発明の一態様は、還元多糖を提供し、ここで還元多糖は誘導体化され、例えば、還元された誘導体化された多糖はカルボキシアルキル多糖である。カルボキシアルキルは、カルボキシメチル、カルボキシエチル、及びカルボキシプロピルから成る群から選択される。更に、還元多糖は、還元デキストランであり得る。本発明の本態様の更なる側面は、還元デキストランの誘導体化の濃度が、多糖１ｇ当たりカルボキシル基が少なくとも７５０マイクロモルであり、ここで、該組成物は、誘導体化のレベルがより低い組成物に比べ減少した毒性を有することである。
【００２３】
本発明のもう１つの態様は、薬の用途のための、未処理デキストランに比べ減少した毒性を有するデキストラン組成物を調合する方法であり、該方法は、デキストランを提供すること、及び提供されたデキストランを、硼水素化塩又は水素化触媒の存在下での水素と反応させ、それに続いてカルボキシメチル化をすること、減少した毒性を有する還元されたカルボキシメチル化されたデキストラン、を含む。
【００２４】
本発明のもう１つの態様は、該組成物が減少した毒性を与えるように該組成物がデキストランを含むという種類の多糖組成物を、哺乳類の被験体に投与する改良された方法であり、ここで該改良は、配合物中においてデキストランの代わりに還元されたカルボキシメチル化されたデキストランを利用することを含む。もう１つの側面において、本発明の一態様は、該組成物が減少した毒性を与えるように多糖を哺乳類の被験体に投与する改良された方法であり、ここで該改良は、該組成物の調合において還元されたカルボキシメチル化された多糖を利用することを含む。
【００２５】
本発明の一態様は、還元された誘導体化されたデキストランの血液増量剤としての使用の方法を提供する。
【００２６】
特定の態様の詳細な説明
表１は、前に記載したＭＲＩ造影剤の２つの類の特徴を要約し、そしてそれらの特徴の理想的な造影剤の特徴に対する比較を示す。本発明の薬剤は、本明細書中に示されているように、理想的な特徴を具体化する。
【００２７】
驚くべきことに、本明細書中に示されているような望ましい特性を有する薬剤のような、多糖還元デキストラン及び還元デキストラン誘導体で被覆された極小超常磁性酸化鉄（ｕｌｔｒａｓｍａｌｌ ｓｕｐｅｒｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ ｉｒｏｎ ｏｘｉｄｅ）（ＵＳＰＩＯ）の製剤の開発及び合成は、１つの成分、即ち、デキストランＴ１０、の化学的性質の変化から導かれる。この変化は、アルコールへのその合成において使用される多糖の末端アルデヒド基のアルコールへの還元を含んだ（図解１）。図解１は、硼水素化ナトリウムによる処理時のデキストランのような多糖における化学的変化を図で説明する。多糖のヘミアセタール形態（構造１）は、多糖のアルデヒド形態（構造２）と平衡状態にある。構造２は平衡混合物の０．０１％未満を構成する（Ｂｒｕｃｋｅｒ，Ｇ．（１９７４）Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ： Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ， Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ．， Ｔａｎｋｏｎｙｋｉａｄｏ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｕｄａｐｅｓｔ， ｐ．９９１）。構造２の硼水素化ナトリウムによる処理は、多糖の線状ポリオール形態（構造３）への非可逆的な転化をもたらす。構造１と２の間の動的平衡は、硼水素化ナトリウムで処理されたとき、線状ポリオール（構造３）への完全な転化を可能にする。
【００２８】
図式１：
【化１】
【００２９】
デキストラン被覆された超常磁性酸化鉄粒子は、肝臓及びリンパの像の画質を高めるそれらの能力のために、核磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）造影剤として特別の重要性を有する。Ｆｅｒｉｄｅｘ Ｉ．Ｖ．（登録商標）（マサチューセッツ州ケンブリッジのＡｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．）は、デキストラン被覆された超常磁性酸化鉄ＭＲＩ造影剤であり、人において使用することが認可されている。Ｃｏｍｂｉｄｅｘ（登録商標）（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．）は、デキストラン被覆された極小超常磁性酸化鉄（ＵＳＰＩＯ）であり、これは肝臓の映像化及びリンパの映像化に対するフェーズＩＩＩの臨床試験を終了している。Ｃｏｍｂｉｄｅｘ（登録商標）はＦｅｒｉｄｅｘ Ｉ．Ｖ．（登録商標）（６０ｎｍ）よりも小さい平均直径（２０ｎｍ）を有し、このことはＣｏｍｂｉｄｅｘ（登録商標）に人体中における異なる生体分布（ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を与える。Ｃｏｍｂｉｄｅｘ（登録商標）は、デキストラン、塩化第二鉄、及び塩化第一鉄の溶液への塩基の添加によって製造される。この合成プロセスは、成分を組み合わせること、加熱すること、及び限外濾過によって精製することを含む。しかしながら、反応中の粒子に付加されるデキストランの収率は効率的ではない。薬品グレードのデキストランは、Ｃｏｍｂｉｄｅｘ（登録商標）の合成の最も高価な成分である。Ｃｏｍｂｉｄｅｘ（登録商標）の合成におけるデキストランのより効率的な使用が、製造コストを下げるために望ましい。
【００３０】
最終的滅菌（オートクレーブ処理）は注入用の薬剤を滅菌するための好ましい方法である。しかしながら、ＭＲＩ造影剤として使用される多くの超常磁性酸化鉄コロイドは、これらのコロイドの生体分布と除去に影響するポリマーの被覆（ｃｏａｔｉｎｇ）及び外被（ｃｏｖｅｒｉｎｇ）を使用して合成される。オートクレーブ処理プロセスの間に熱にさらされると、ポリマー被覆は酸化鉄の芯から分離する可能性がある。酸化鉄からのポリマーの分離の機能的な帰結は、凝集、生体分布の変化（プラズマ半減期の変化）、及び毒性の変化（有害な事象の潜在的増加）のような材料の物理的変化である。例えば、溶液のｐＨの実質的な低下が、鉄デキストラン粒子のオートクレーブ処理後に検出される可能性があり、ｐＨはその後の貯蔵時に低下し続ける。
【００３１】
熱応力に対する抵抗性を付与することから成るこの問題の幾つかの解決方法が記載されている。Ｐａｌｍａｃｃｉらの米国特許第５，２６２，１７６号（引用によって本明細書中に組み入れられている）は、オートクレーブ処理の前に酸化鉄粒子上の外被を安定化させるために、架橋されたデキストランを使用した。架橋プロセスは、エピクロロヒドリン及びエピブロモヒドリンのような有毒の薬剤を使用し、これらは架橋反応後にコロイドから除去されなければならない。
【００３２】
被覆の分離に影響しない熱応力によって引き起こされるコロイドの凝集を防ぐための方法も記載されている。これらの方法は、一般的に、オートクレーブ処理中の添加剤の使用を含む。Ｇｒｏｍａｎらの米国特許第４，８２７，９４５号及びＬｅｗｉｓらの米国特許第５，０５５，２８８号（両方の特許が引用によって本明細書中に組み入れられている）は、被覆が分離するとき粒子の凝集を防ぐためにシトレートを使用する。しかしながら、熱と組み合わされた高濃度のシトレートの使用は毒性を生じる可能性がある。Ｇｒｏｍａｎらの米国特許第５，１０２，６５２号（引用によって本明細書中に組み入れられている）は、オートクレーブ処理中の凝集を防ぐためにマンニトールのような低分子量炭水化物を使用する。これらの添加剤は製品の製造のコストと複雑さを増加させ、しかも鉄粒子からのポリマーの分離の問題を解決しない。
【００３３】
Ｊｏｓｅｐｈｓｏｎらの米国特許第５，１６０，７２６号（引用によって本明細書中に組み入れられている）は、コロイドを滅菌するために熱よりもむしろフィルター滅菌を使用することによって、被覆への熱応力を避ける。フィルター滅菌は、滅菌プロセスと容器の封止の両方を微生物を含まない環境中で行わなければならないため、費用がかかる。さらに、フィルター滅菌はオートクレーブ処理のプロセスよりも失敗の率が高く、これは完全に微生物を含まない濾過工程のための環境を得ることが不可能であることを反映している。
【００３４】
Ｍｕｒａｎｏらの米国特許第５，２０４，４５７号は、延長された期間８０℃まで改善された安定性を有するカルボキシメチル−デキストラン被覆された粒子を記載しているが、オートクレーブ処理による最終的滅菌の使用を教示していない。Ｈａｓｅｇａｗａら（Ｊａｐａｎ Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｐｈｙｓ．， Ｐａｒｔ Ｉ， ３７（３Ａ）：１０２９−１０３２，１９９８）は、８０℃において熱安定性を有するカルボキシメチルデキストラン被覆された鉄粒子を記載しているが、カルボキシメチル還元デキストランで被覆された粒子の使用も、オートクレーブ処理による最終的滅菌の使用も教示していない。
【００３５】
磁気共鳴画像化剤（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）は、主に水のプロトンについて、通常緩和時間に影響することによって作用する。２つのタイプの緩和が存在し、１つはスピン−スピン又はＴ１緩和として知られ、そして第２のものはスピン−格子又はＴ２緩和として知られている。Ｔ１緩和は、一般的に、シグナルの増加によって生じた像を明るくする。Ｔ１プロセスは、脈管系の映像化において最も有用である。Ｔ２緩和は、一般的に、シグナルの減少によって生じた像を暗くする。Ｔ２プロセスは、腫瘍のような病巣を含む肝臓、脾臓、又はリンパ節のような器官の映像化において最も有用である。全ての造影剤がＴ１及びＴ２特性の両方を有するが、Ｔ１又はＴ２緩和のいずれかが特定の造影剤の優勢な緩和特性を特徴付けることができる。低分子量のガドリニウムに基づく造影剤はＴ１剤であり、そして脳卒中及び動脈瘤のような血管に関係した医学上の問題及び脳の映像化において主要な用途を有する。酸化鉄に基づくコロイド状造影剤はＴ２剤であり、肝臓及びリンパ節の腫瘍（前立腺及び胸部のガン）の映像化において主要な用途を有する。Ｔ１及びＴ２特性の両方を有する造影剤が望ましいだろう。そのような造影剤の使用は、Ｔ１又はＴ２造影剤のいずれかの使用を必要する場合と比較して、（i）全ての用途に対して単一の薬剤を提供し、そして薬剤室の在庫品を簡単化し、（ii） ＭＲＩ一式における映像化を簡単化し、そして（iii） １回の検査の間に一人の患者の複数の医学上の問題を同時に検査できることにより患者の看護を改善するだろう。
【００３６】
デキストランは、人の静脈内に（ｉ．ｖ．）投与されたとき、致命的なアナフィラキシー反応を引き出すことがあり得る（Ｂｒｉｓｅｉｄ， Ｇ．ら，Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍｃｏｌ． ｅｔ Ｔｏｘｉｃｏｌ．， １９８０，４７：１１９−１２６；Ｈｅｄｉｎ， Ｈ．ら，Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ． Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １９９７：１１３：３５８−３５９）。関連する有害な反応が、磁性デキストラン被覆酸化鉄コロイドの投与についても観察された。造血剤として、特に最終段階の腎臓の透析患者用のエリトロポエチン治療に対する付加物として有用性を有する非磁性デキストラン被覆酸化鉄コロイドも同様な副作用を有する可能性がある。
【００３７】
脈管系内の解剖学的特徴に関する情報は、２つの方法で造影剤を使用して得ることができる。造影剤が塊薬（ｂｏｌｕｓ）として最初に投与されるとき、造影剤は初めに細かく分岐した管を比較的まとまった塊として通過する。所望の解剖学的特徴の映像化の時間を塊薬がその特徴を通過する時間に調整することによって、有用な情報を提供することができる。造影剤の使用のこの技術は、一次通過映像化（ｆｉｒｓｔ ｐａｓｓ ｉｍａｇｉｎｇ）と呼ばれる。後に、塊薬は混合によって希釈され、そして脈管系中において平衡濃度に達する。特定環境下において、この平衡又は定常状態は有用な情報を提供することができる。映像化は、初期の段階、即ち、造影剤の注入後数分以内（「一次通過」）、及び後の段階、即ち、造影剤の注入後約１０分から（平衡段階）、において行うことができる。ガドリニウム剤は、脈管系から組織の細胞間空間への拡散が容易であるため、一次通過映像化に対してのみ適している。前述のコロイド状酸化鉄は、延長された期間にわたって希釈されて投与される必要があるため、平衡に対して有用である。コロイド状酸化鉄は細胞間空間中に漏れず、数時間にわたって脈管系中に残ることができる。一次通過映像化及び平衡映像化の両方を行う機会を提供する造影剤が望ましいだろう。
【００３８】
「一次通過」映像化用の造影剤の医療セッティングにおける投与中に、映像化のタイミングと造影剤の「一次通過」の通過と映像化のタイミングは一致しないかもしれない。有用な像が得られなかった場合、もう１つの別の「一次通過」像を得るために造影剤の２回目の投与が望ましくなる。その他の場合において、放射線医学者は、関芯のある複数の部位の各々において「一次通過」像を得るために、造影剤の複数回の投与計画を必要として、患者において幾つかの体積を試験することが有用であることを見出す。ガドリニウム造影剤を使用した場合、この複数回投与「一次通過」の適用は可能ではない。なぜならば、ガドリニウムは血管空間から漏れ出して、関芯のある血管のまわりにぼやけたバックグラウンドを形成するからである。現在の酸化鉄コロイドに基づく造影剤は適していない。なぜならば、それらは塊薬として投与されずに、長時間にわたって希釈溶液として投与され、「一次通過」の用途を避けているからである。
【００３９】
ガン患者において腫瘍の進行の診断は、病気の段階を特徴付けるため、及び処置の決定のために重要である。コストと患者の不快感を最小化するために、ＭＲＩ検査において、病気によって影響を受けている可能性のある複数の器官系の評価を可能にする単一回分の造影剤の投与が望ましい。例えば、主に胸部のガンにおいては、胸部中の腫瘍の状態、及び肝臓、脾臓、骨髄、及びリンパ節を含む複数の転移部位における腫瘍の状態を評価するのが望ましい。ガドリニウムに基づく造影剤の投与は、それらの人体中における短い半減期、それらの脈管系中への漏れ、及び関芯のある器官内にそれらが集中できないことのために、この要件を満たすことができない。Ｃｏｍｂｉｄｅｘ（登録商標）のような酸化鉄コロイドに基づく造影剤はこの多様な機能において役立つことができるが、もう１つの酸化鉄コロイド造影剤であるＦｅｒｉｄｅｘ Ｉ．Ｖ．（登録商標）は肝臓と脾臓の映像化に限定される。
【００４０】
小体積（５ｍｌ未満）の造影剤の投与が望ましい。なぜならば、小体積の投与は一次通過映像化から得られる分解能を改善し、注入時間と患者の不快感を最小化するからである。ガドリニウムに基づく造影剤は、これらの薬剤の溶解度と効能によって生じる制約のために、約３０ｍｌの体積で投与される。現在、酸化鉄に基づく造影剤は、大体積（５０〜１００ｍｌ）の希釈溶液として延長された期間（３０分間）にわたって投与される。これらの制約は、酸化鉄に基づく薬剤の急激で濃縮された投与に関係する安全上の問題に起因する。塊薬注入は、一次通過映像化を可能にし、そして患者とヘルスケアプロバイダーとの間の接触時間を短縮する点で望ましい。さらに、塊薬注入は、被験者が検査中にＭＲＩ装置中に入っている間に、施術者が造影剤を投与することを可能にし、これによって装置の映像化時間の効率的な使用を最適化する。ガドリニウムに基づく造影剤は塊薬として投与できる。
【００４１】
ガドリニウムに基づく造影剤はキレート化分子とガドリニウムカチオンとから成る。ガドリニウムは毒性の元素であり、毒性を防ぐために体から排出されなければならない。コロイド状酸化鉄は体から排出されないが、肝臓及びその他の器官中で、ヘモグロビン中の鉄のような、代謝可能な鉄へ処理される。従って、本発明の組成物は、貧血症に悩んでいる患者のための鉄補給物として役立つことができ、そしてエリトロポエチンによる処置を受けている患者に対して特に有用である。
【００４２】
本発明の１つの態様は、材料が熱応力にさらされたときに被覆が酸化鉄から分離するのを軽減するように水溶性多糖被覆と結合した酸化鉄のコロイドを合成する方法を提供する。
【００４３】
本明細書及び添付の請求の範囲中において使用されるとき、「熱応力」は、中性のｐＨにおいて約３０分間約１２１℃以上にコロイドを加熱することとして、又は注入可能な薬剤をオートクレーブ処理する（又は最終的に滅菌する）ために本技術分野においてよく知られている時間、温度、及びｐＨのその他の組み合わせとして定義される。
【００４４】
本発明の１つの態様である方法は、多糖を硼水素化塩のような還元剤又はＰｔ又はＰｄのような適当な水素化触媒の存在下に水素で処理して還元された多糖を得る工程を含み、それによって末端の還元性の糖が還元されて開鎖多価アルコール構造を生じる。還元された多糖は、アラビノガラクタン、澱粉、セルロース、ヒドロキシエチル澱粉（ＨＥＳ）、イヌリン、又はデキストランでよい。さらに、多糖は粒子形成の前にさらに官能化されてもよい。この方法は、さらに、還元された多糖を第二鉄塩、第一鉄塩、又は第二鉄塩と第一鉄塩の混合物を含む群から選択される酸性溶液中の鉄塩と混合すること、溶液を冷却すること、溶液を塩基で中和すること、及び被覆された酸化鉄コロイドを収集することを含む。
【００４５】
本発明のさらなる態様によれば、コロイドを中和する工程のために使用できる塩基は、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、そしてより好ましくは水酸化アンモニウムである。本発明のさらなる態様においては、多糖誘導体は還元されたデキストランであり、そして鉄塩は第二及び第一鉄塩でよく、これらは最終的滅菌中の熱応力下に酸化鉄の芯から分離しない水溶性被覆を有する超常磁性酸化鉄コロイドを製造する。
【００４６】
本発明のもう１つの態様において、第二鉄塩のみが使用され、非超常磁性粒子を生成する。
【００４７】
もう１つの態様において、多糖を酸化鉄ゾル（液体中のコロイド分散体）に添加し、ｐＨを６〜８に調整し、そして被覆された酸化鉄コロイドを収集することによって、被覆されたコロイドを調製することができる。
【００４８】
本明細書及び添付の請求の範囲中において使用される「コロイド」という用語は、約２５０ｎｍ未満のサイズを有するマクロ分子又は粒子を包含するものである。本発明の酸化鉄多糖コロイドは、前に記載された材料と比較して、実質的に改善された物理的特性と製造性を有する。改善された物理的特性は、コロイドを１２１℃の温度に３０分間さらすことによって測定される、コロイドの熱応力に抵抗する能力において明白である。本発明に従って製造されたコロイド粒子は、応力下に多糖の分離のより少ない証拠しか示さず、コロイド状のままであり、そして容易に検知可能な程度のサイズの変化を示さない。不安定な多糖被覆を有するコロイドの例はＣｏｍｂｉｄｅｘ（登録商標）を含み、これは、熱応力にさらされたとき、そのデキストラン被覆の４３％を失い、粒子の直径サイズが２１ｎｍから５８７ｎｍまで増加し、材料のかなりの凝集が目視による分析時に観察された。米国特許第４，７７０，１８３号に従って調製された、もう１つの超常磁性酸化鉄デキストランコロイドであるＦｅｒｉｄｅｘ（登録商標）も、１２１℃でわずか３０分間の熱処理後に、熱処理されたコロイドが０．８μｍの細孔サイズを有するフィルターを通過できないことによって示されるように、粒度の増加を示した。
【００４９】
製造中に、本発明の１つの態様である方法は、典型的には、非還元多糖を使用する従来の製造において必要な量と比較して十分の一以下の量の多糖しか使用せず、本発明の方法の改善された効率によりかなりの原料コストの節約をもたらす。
【００５０】
多糖誘導体濃度、塩基濃度、及び／又はＦｅ（ＩＩＩ）／Ｆｅ（ＩＩ）濃度のような要素の変更によって、異なる磁化率及びサイズを有するコロイドを製造することができる。Ｆｅ（ＩＩＩ）／Ｆｅ（ＩＩ）比率の変更は粒度を変え、そして磁化率を変える。より高い比率（例えば、２．０モル／モル）は磁化率を低下させる傾向があり、一方より低い比率（１．５モル／モル未満）は粒度を増加させる傾向がある。
【００５１】
この方法は、多糖のタイプを変えることによって、そして合成後に粒子をさらに誘導体化することによって、異なる生物学的特性を有するコロイドを生成するように調整することができる。
【００５２】
本発明の１つの態様であるコロイドは、核磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）用の造影剤として、又は細胞の磁気分別、免疫アッセイ、磁気により目標に向けられる薬品の供給において、及び治療目的の注入可能な鉄補給物として使用することができる。これらのコロイドは非経口的投与に特に適している。なぜならば、最終の滅菌が典型的にはオートクレーブ処理（これはバクテリアの胞子、及びウイルスを含む全ての細胞状生命形態の生存能力を除去するので好ましい方法である）であるからである。従来のコロイドの製造方法は、オートクレーブ処理プロセス中に安定剤としてシトレート又は低分子量多糖のような添加物の添加を必要とした（米国特許第４，８２７，９４５号及び米国特許第５，１０２，６５２号を参照のこと）か、又はフィルター滅菌の使用によって熱応力を完全に避けた（米国特許第５，１５０，７２６号を参照のこと）。従って、コロイドの合成方法である本発明の態様、及びコロイド組成物を含む本発明の態様は、有意に改善されたＭＲＩ造影剤、及び鉄補給物である造血剤としての有用性を提供する。従来技術に対するこれらの薬剤において提供される改良点は、本明細書中の実施例において示される以下の事実中に見出される：本発明の態様である薬剤がオートクレーブ処理によって加熱滅菌され、そして従って環境温度での長期間の貯蔵に対して最適化されていること；これらの薬剤が滅菌又は貯蔵プロセス中に安定性を維持するための添加剤の添加を必要としないこと；これらの薬剤が人を含む哺乳類に対して非毒性であること；映像化のために使用される薬剤の有効投与量が、本技術分野において記載された薬剤よりも少ない量であること；及び投与後の薬物動態が、診療所への１回の訪問と映像装置の１回の使用中に追加の像を得るために、最初の投与分の投与後の短い間隔の後に投与される繰り返しの継続的な投与分を使用できるようなものであること。
【００５３】
デキストラン及びその誘導体の場合、この方法によって調製された配合物は、ラットモデルを使用して得られたデータによって、及び人間の被験者における臨床試験において示されているように、哺乳類における免疫反応が比較的小さい。デキストラン及びデキストラン誘導体で被覆された鉄粒子は、３つの哺乳類種、ラット、ブタ、及び人間において、心臓、肺、腎臓、及びその他の器官及び系の映像化を改善した。デキストラン及びデキストラン誘導体で被覆された鉄粒子は、また、透析患者、ガン患者、胃腸炎患者、及びエリトロポエチンの摂取者のような、慢性的に鉄の不足している患者の群に対して、真の経口鉄補給剤よりもより効率的に吸収される形態の鉄を供給するために、造血剤としても使用することができる。誘導体化された還元デキストランは、また、血漿増量剤としても使用することができ、これは、血液及び血液画分とは異なり、免疫学的にクロスマッチさせる必要がなく、そして人の血清アルブミン製剤と異なり、肝炎、ＣＭＶ及びＨＩＶの種、スポンジ状（ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ）脳炎、及びその他の伝染性の作用物を含むウイルスを破壊するように滅菌することができる。本発明の血漿増量剤は冷凍したり光や熱から遠ざけて貯蔵する必要がなく、従って、熱帯性気候においてさえ、外傷のような血液の損失によるショックの治療のような、緊急の医療的状況において有利である。
【００５４】
実施例１、２、及び３は、それぞれタイプＴ１、Ｔ５、及びＴ１０の還元デキストランを製造する方法を示す。実施例４は、還元プルランの製造を記載する。
【００５５】
実施例５〜９は、未処理デキストランＴ１０からの、様々な程度のカルボキシメチル化を有するカルボキシメチル還元デキストランＴ１０の合成を記載する（表２）。
【００５６】
実施例１０〜１５は、還元デキストランＴ１０から出発して、様々な程度のカルボキシメチル化を有するカルボキシメチル還元デキストランＴ１０の合成を記載する（表３）。
【００５７】
実施例１６〜１８は、未処理デキストランからの、カルボキシメチルデキストランＴ１０、Ｔ４０、及びＴ７０の合成を記載する。
【００５８】
実施例１９〜２６は、還元デキストラン及び未処理デキストランで被覆された酸化鉄の製造を記載する。これらの実施例中の反応の条件は、還元多糖又は非還元多糖のいずれかで被覆されたＵＳＰＩＯを製造するように選択された。未処理デキストラン酸化鉄製剤用の反応条件は、粒子の被覆における各々のデキストランの有効性の比較を可能にするために、同じ分子量の還元デキストラン製剤用のものと同じであった。（これらの実施例中において製造された）未処理多糖と比較された還元多糖を使用して得られた酸化鉄製剤の平均体積直径（ＭＶＤ）及び磁化率を表４中にまとめる。
【００５９】
実施例２７〜２９は、３０ｎｍ未満の粒子直径を有する酸化鉄コロイドを得るための、未処理Ｔ１、Ｔ５、及びＴ１０デキストランを使用するＵＳＰＩＯの製造手順を記載する。酸化鉄コロイドの合成と特性における未処理デキストラン（実施例２７〜２９）とそれらの各々の還元デキストラン（実施例１９、２１、及び２３）の効果の比較を表５に示す。
【００６０】
実施例３０〜３１は、カルボキシメチル未処理デキストランＴ１０及びカルボキシメチル還元デキストランＴ１０で被覆されたＵＳＰＩＯの製造を記載する。
【００６１】
実施例３２〜４１は、様々な程度のカルボキシメチル化を含むカルボキシメチル還元デキストランＴ１０製剤で被覆されたＵＳＰＩＯの製造を記載する。ＵＳＰＩＯのコロイドサイズに対するＣＭＲＤのカルボキシメチル化の程度の影響を表６に示す。塩化第二鉄／塩化第一鉄溶液の溶解度に対するＣＭＲＤのカルボキシメチル化の程度の影響を表７に示す。
【００６２】
実施例４２〜４８は、未処理デキストラン及び還元デキストラン及びＣＭＲＤを使用する酸化鉄ゾルの合成及びそれらの安定化を記載する。実施例４９は、塩化第二鉄とＣＭＲＤの塩基析出（ｂａｓｅ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）を使用するＣＭＲＤ被覆された非磁性酸化鉄コロイドの製造を記載する。
【００６３】
実施例５０は、還元デキストラン及び未処理デキストランで被覆されたＵＳＰＩＯの様々な製剤のオートクレーブ処理による滅菌のプロセスのこれらの粒子の特性に対する影響を試験する。結果は表８及び９に示されている。
【００６４】
実施例５１は、様々な造影剤の緩和特性を報告し、ガドリニウムに基づく造影剤と未処理デキストラン及びカルボキシメチル還元デキストランＴ１０を使用して製造されたＵＳＰＩＯの緩和特性を比較している（表１０）。
【００６５】
実施例５２〜５３においては、還元デキストラン及び非還元（未処理）デキストランで被覆されたＵＳＰＩＯのラットに対する毒性の徴候の存在が、アナフィラキシー型反応に関して、確認された。アナフィラキシー型反応の程度は、脚の浮腫の体積によって決定される。同様の研究を、未処理デキストラン、還元デキストラン、及びカルボキシメチル還元デキストランを使用して行った。結果を表１１〜１４にまとめる。
【００６６】
実施例５４及び図４及び５は、ラットの血液循環からのＣＭＲＤ被覆されたＵＳＰＩＯのクリアランスの速度を示す。薬剤の半減期が決定される。
【００６７】
ＣＭＲＤ被覆されたＵＳＰＩＯの投与の後の改善されたＭＲＩスキャンが実施例５５及び図６中に示されており、このスキャンはラットの心臓、大動脈、及びその他の心臓に関連した動脈の像を示している。実施例５６及び図７は、ブタの前面部のＣＭＲＤ被覆ＵＳＰＩＯで高められたＭＲＩスキャンを示す。実施例５７は、臨床試験の一部として、人の被験者へのＣＭＲＤ被覆ＵＳＰＩＯの注入が悪影響を生じないことを示す。実施例５７は、生体分布（図８）、映像化速度（図９及び表１５）、及び人中でのこの材料のＭＲＩ使用におけるバックグラウンドの不存在を記載する。この実施例中のデータは、本発明の実施者が、診療室への訪問又はＭＲＩ施設への訪問の実際の時間内に複数回の投与を行うことができそして続けて複数の映像を得ることができることを示す。
【００６８】
実施例
還元多糖の合成のための一般的手順
過剰の硼水素化ナトリウムによる処理によって還元された多糖を製造し、５サイクルの限外濾過によって一般的に精製した。実施例全体を通して蒸留水を使用する。多糖プルラン（ｐｕｌｌｕｌａｎ）の場合、さらに精製することなく還元混合物を使用した。全ての場合において、生成物は５％未満の残留アルデヒド含有率を示した。残留アルデヒド濃度は、改良されたテトラゾリウムブルー（ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｌｕｅ）アッセイを使用して決定した（Ｊｕｅ， Ｃ．Ｋ．ら， Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， １９８５，１１：１０９−１５）。デキストラン濃度はフェノール／硫酸アッセイによって決定した（Ｋｉｔｃｈｅｎ， Ｒ．， Ｐｒｏｃ． Ｓｕｇａｒ Ｐｒｏｃｅｓｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｎｆ．， １９８３， ２３２−４７）。限外濾過が省かれた場合、デキストランＴ１を除いて、残留ボレート塩は粒子形成に影響しないことが示された。実施例１から４までは、それぞれ、還元多糖Ｔ１、Ｔ５、及びＴ１０、及びプルランの合成方法を提供する。保持時間は、２０ｍＭの燐酸塩緩衝食塩水、０．４ｍｌ／分の流速で、ＷａｔｅｒｓのＵｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ２５０カラムであるＳＮ Ｔ５２２６２Ａ３３を使用して決定した。
【００６９】
実施例１．還元デキストランＴ１
デキストランＴ１（１０ｇ）を２５℃の１００ｍｌの水中に溶解し、１．０ｇの硼水素化ナトリウムを添加し、そして混合物を１２時間撹拌した。６ＭのＨＣｌを使用してｐＨを５．０にして、２００ｍｌのエタノール（無水）を添加した。析出物を遠芯分離によって収集した。エタノール／水層をデカンテーションし、そして残渣を１００ｍｌの水中に溶解した。２００ｍｌの無水エタノールを添加して２回目の析出を生じさせ、エタノール／水を再びデカンテーションした。析出した生成物を水中に溶解し、減圧下に凍結乾燥させて６０％の収率で白色固体を生成した。観察されたＨＰＬＣ保持時間（分）は、還元デキストランについては２４．４であり、そして未処理デキストランについては２４．４だった。
【００７０】
実施例２．還元デキストランＴ５
デキストランＴ５（４ｇ）を２５℃の２５ｍｌの水中に溶解し、８３ｍｇの硼水素化ナトリウムを添加し、そして混合物を１２時間撹拌した。６ＭのＨＣｌを使用してｐＨを５．０にした。混合物を１ｋＤａの分子量カットオフの（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔ−ｏｆｆ）（ＭＷＣＯ）膜フィルターに対して限外濾過した。生成物を減圧下に凍結乾燥させて白色固体を生成し、７０％の収率が得られた。観察されたＨＰＬＣ保持時間（分）は、還元デキストランについては２２．９であり、そして未処理デキストランについては２１．９だった。
【００７１】
実施例３．還元デキストランＴ１０
デキストランＴ１０（５，００３ｇ）を２６，０１１ｇの水中に溶解した。硼水素化ナトリウム（５２．５ｇ）を添加し、そして混合物を２４時間撹拌した。６ＮのＨＣｌを使用してｐＨを７．１に調整した。生成物を、３ｋＤａの限外濾過膜に対して繰り返し限外濾過することによって精製し、減圧下に凍結乾燥させて白色固体を生成した。収量：３１２９ｇ。観察されたＨＰＬＣ保持時間（分）は、還元デキストランについては２１．６であり、そして未処理デキストランについては２１．１だった。
【００７２】
実施例３．還元プルラン
プルラン（９０ｍｇ）を２５℃の０．８ｍｌの水中に溶解し、１ｍｇの硼水素化ナトリウムを添加した。混合物を１２時間撹拌し、ＵＳＰＩＯの製造において直接的に使用した。
【００７３】
基質として未処理デキストランＴ−１０を使用するカルボキシメチル還元デキストランの合成のための一般的手順
実施例５〜９は、未処理デキストランからのカルボキシメチル還元デキストランの合成を記載する。２つの一般的合成方法、即ち、未処理デキストランの出発濃度が７０ｍｇ／ｇであった低デキストラン濃度法（実施例５）、及び未処理デキストランの出発濃度が２４０ｍｇ／ｇであった高デキストラン濃度法（実施例６〜９）が示される。
【００７４】
実施例５．低デキストラン濃度法によって調製されたカルボキシメチル還元デキストランＴ１０
以下の溶液を調製し、５℃に冷却した：溶液Ａは１０．５リットルの水中に４，２００ｇの水酸化ナトリウムを含み、そして溶液Ｂは５，７００ｍｌの水中に２，３１０ｇのブロモ酢酸を含んだ。溶液Ｃは７，５００ｍｌの水中に３，０００ｇのデキストランＴ１０を含み、３８℃に加熱された。
【００７５】
水酸化ナトリウム（６００ｇ）を７．５リットルの水中に溶解し、３８℃まで暖めた。硼水素化ナトリウム（６０ｇ）を添加して、混合物を２分間撹拌し、その後溶液Ｃを添加し、続いて直ちに２回目の６０ｇの部分の硼水素化ナトリウムを添加した。混合物を３８℃で３０分間撹拌し、その後１５℃まで冷却した。溶液の温度を２５℃未満に維持しながら、溶液Ａを添加した。溶液Ｂを添加し、溶液の温度を２５℃未満に維持した。混合物を室温で２時間撹拌し、そして溶液温度を３５℃未満に維持しながら、５℃に冷却された６ＭのＨＣｌを使用してｐＨ７．５まで中和した。混合物を０．２μｍのフィルターを通して濾過し、そして８０リットルまで希釈した。３ｋＤａのＭＷＣＯ限外濾過膜を通して繰り返し限外濾過することによって生成物を精製し、０．２μｍのフィルターを通して再び濾過して、減圧下に凍結乾燥させた。
【００７６】
回収された固体、即ち、２，５６０ｇのカルボキシメチル還元デキストランＴ１０（ナトリウム塩）は、滴定によって決定して、生成物１ｇ当たり約１，２６５マイクロモルのカルボキシルのカルボキシル含有率を示した。ブロモ酢酸の使用は、クロロ酢酸の使用と比較して、より低い温度での反応の進行を可能にし、そしてそのＦＴＩＲスペクトル（図１）によって証明されるようにより清浄な生成物を製造した。図１は、クロロ酢酸を使用して製造された米国特許第５，２０４，４５７号中の生成物のＦＴＩＲとは異なり、１６００ｃｍ−１におけるカルボキシレートのもの以外のカルボニル吸収を示さない。
【００７７】
実施例６．高デキストラン濃度法によって調製されたカルボキシメチル還元デキストランＣＭＲＤ Ｔ１０
硼水素化ナトリウム（０．４ｇ）及び水中の水酸化ナトリウムの５０％重量／重量溶液の０．５ｇを５０ｇの水中の２５ｇのデキストランの溶液に添加した。混合物を室温で４時間撹拌し、１：１の水酸化ナトリウム溶液の１９．５ｇ及び６．２ｇのブロモ酢酸を添加し、そして氷浴を使用して温度を２５℃未満に保った。混合物をその後室温で１６時間撹拌した。
【００７８】
生成物を精製するために、混合物のｐＨを６ＭのＨＣｌを使用してｐＨ６．２に調節し、そして１２０ｍｌのエタノールを添加した。析出物が形成し、これを沈降させ、そして上澄液をデカンテーションによって除去した。残渣を６０ｍｌの水中に溶解し、そして２００ｍｇの塩化ナトリウムを添加し、続いて３０ｍｌのエタノールを添加し、そしてカルボキシメチル還元デキストランを沈降させた。水と塩化ナトリウムの添加、それに続く析出物の溶解、及びエタノール析出の順序をさらに２回繰り返した。残渣を６０ｍｌの水中に溶解し、そして１リットルのエタノールを添加した。カルボキシメチル還元デキストランを再び沈降させ、そして固体を中ガラス濾過器（ｍｅｄｉｕｍ ｆｒｉｔ ｇｌａｓｓ ｆｉｌｔｅｒ）上で収集した。白色固体を５０℃で２４時間乾燥させた。収量は、滴定によって決定して、１ｇ当たり１１０８マイクロモルのカルボキシルを有する生成物２７ｇであった（表２）。
【００７９】
実施例７．高デキストラン濃度法によって調製されたカルボキシメチル還元デキストランＴ１０
硼水素化ナトリウム（０．４ｇ）及び５０％水酸化ナトリウムの０．５ｇを５０ｇの水中の２５ｇのデキストランの溶液に添加した。混合物を室温で４時間撹拌し、５０％水酸化ナトリウムの２０．０ｇ及び６．９５ｇのブロモ酢酸を添加し、そして混合物を室温で１６時間撹拌しながら、氷浴を使用して温度を２５℃未満に保った。生成物を実施例６に記載したように精製した。収量は、滴定によって決定して、１ｇ当たり１２６２マイクロモルのカルボキシルを有する生成物２３．９ｇであった（表２）。
【００８０】
実施例８．高デキストラン濃度法によって調製されたカルボキシメチル還元デキストランＴ１０
硼水素化ナトリウム（０．４ｇ）及び５０％水酸化ナトリウムの０．５ｇを５０ｇの水中の２５ｇのデキストランの溶液に添加した。混合物を室温で４時間撹拌し、そして氷浴を使用して温度を２５℃未満に維持しながら、５０％水酸化ナトリウムの２０．６７ｇ及び７．６５ｇのブロモ酢酸を添加した。混合物を室温で１６時間撹拌した。生成物を実施例６に記載したように精製した。収量は、滴定によって決定して、１ｇ当たり１４０４マイクロモルのカルボキシルを有する生成物２４．５ｇであった（表２）。
【００８１】
実施例９．高デキストラン濃度法によって調製されたカルボキシメチル還元デキストランＣＭＲＤ Ｔ１０
硼水素化ナトリウム（０．４ｇ）及び５０％水酸化ナトリウム溶液の０．５ｇを５０ｇの水中の２５ｇのデキストランの溶液に添加した。混合物を室温で４時間撹拌し、そして氷浴を使用して温度を２５℃未満に維持しながら、５０％水酸化ナトリウムの２０．６７ｇ及び７．６５ｇのブロモ酢酸を添加した。混合物を室温で１６時間撹拌し、そして生成物を実施例６に記載したように精製した。収量は、滴定によって決定して、生成物の１ｇ当たり１５２８マイクロモルのカルボキシルを有する生成物２３．４ｇであった（表２）。
【００８２】
合成において使用されたブロモ酢酸の量とデキストランへのカルボキシル基の組み込みマイクロモル量の結果の関係を高デキストラン濃度法を使用して試験した。この関係は線形であることが判明した（表２及び図３を参照のこと）。実施例６から９の反応体の質量とカルボキシメチルの収量を表２に示す。
【００８３】
低デキストラン高塩基法による還元デキストランＴ−１０を使用するカルボキシメチル還元デキストラン製剤の合成
実施例１０〜１４は、低濃度の還元デキストランを使用して開始する様々な程度の置換を有するカルボキシメチル還元デキストランの合成を記載する。この方法においては、還元デキストランの開始濃度は７０ｍｇ／ｇであり、そしてＮａＯＨは少なくとも約１０７ｍｇ／ｇであった。表３は、反応中に使用されるブロモ酢酸の量が増加するにつれて、カルボキシメチル置換の程度が増加したことを示す。
【００８４】
【表２】
【００８５】
実施例１０．低デキストラン高塩基法を使用するカルボキシメチル還元デキストランＣＭＲＤ Ｔ１０
還元デキストランＴ１０（１５ｇ）を７２ｍｌの水中に溶解し、そして８Ｍの水酸化ナトリウムの７２ｍｌを添加した。混合物を２５℃にし、そして３ｍｌの水中の１．１５ｇのブロモ酢酸の溶液を添加した。混合物を室温で１時間撹拌し、その後７５ｍｌの体積の粉砕された氷に添加した。溶液のｐＨを６ＭのＨＣｌを使用してｐＨ６．０にした。３ｋＤａの限外濾過膜に対して繰り返し限外濾過した後、生成物を減圧下に凍結乾燥させた。収量は１３．２５ｇの生成物だった。回収された固体、カルボキシメチル還元デキストランＴ１０（ナトリウム塩）は、滴定によって決定して、１ｇ当たり約１１０マイクロモルのカルボキシルのカルボキシル含有率を示した（表３）。
【００８６】
実施例１１．低デキストラン高塩基法を使用するカルボキシメチル還元デキストランＴ１０
還元デキストランＴ１０（１５０ｇ）を７２０ｍｌの水中に溶解し、そして８Ｍの水酸化ナトリウムの７２０ｍｌを添加した。混合物を２５℃にし、そして１４０ｍｌの水中の１１．５ｇのブロモ酢酸の溶液を添加した。混合物を室温で１時間撹拌し、その後７５０ｍｌの体積の粉砕された氷に添加し、溶液のｐＨを６ＭのＨＣｌを使用してｐＨ６．０にした。３ｋＤａのＭＷＣＯ限外濾過膜に対して繰り返し限外濾過した後、生成物を減圧下に凍結乾燥させた。収量は、滴定によって決定して、生成物１ｇ当たり約１３０マイクロモルのカルボキシルのカルボキシル含有率を有する、回収された固体カルボキシメチル還元デキストランＴ１０（ナトリウム塩）の１２６．２１ｇであった（表３）。
【００８７】
実施例１２．低デキストラン高塩基法を使用するカルボキシメチル還元デキストランＣＭＲＤ Ｔ１０
還元デキストランＴ１０（１５０ｇ）を７２０ｍｌの水中に溶解し、そして８Ｍの水酸化ナトリウムの７２０ｍｌを添加した。混合物を２５℃にし、そして１４０ｍｌの水中の２６．６ｇのブロモ酢酸の溶液を添加し、混合物を室温で１時間撹拌し、その後７５０ｍｌの体積の粉砕された氷に添加した。溶液のｐＨを６ＭのＨＣｌを使用してｐＨ６．０にした。３ｋＤａのＭＷＣＯ限外濾過膜に対して繰り返し限外濾過した後、生成物を減圧下に凍結乾燥させた。収量は測定しなかった。回収された固体、カルボキシメチル還元デキストランＴ１０（ナトリウム塩）は、滴定によって決定して、生成物１ｇ当たり約２８０マイクロモルのカルボキシルのカルボキシル含有率を示した（表３）。
【００８８】
実施例１３．低デキストラン高塩基法を使用するカルボキシメチル還元デキストランＣＭＲＤ Ｔ１０
還元デキストランＴ１０（１５ｇ）を７２ｍｌの水中に溶解し、そして８Ｍの水酸化ナトリウムの７２ｍｌを添加した。混合物を２５℃にし、そして８ｍｌの水中の３．４５ｇのブロモ酢酸の溶液を添加した。混合物を室温で１時間撹拌し、その後７５ｍｌの体積の粉砕された氷に添加した。溶液のｐＨを６ＭのＨＣｌを使用してｐＨ６．０にした。３ｋＤａのＭＷＣＯ限外濾過膜に対して繰り返し限外濾過した後、生成物を減圧下に凍結乾燥させた。収量は、滴定によって決定して、生成物１ｇ当たり約４５０マイクロモルのカルボキシルのカルボキシル含有率を有する、回収された固体カルボキシメチル還元デキストランＴ１０（ナトリウム塩）の９．４ｇであった（表３）。
【００８９】
実施例１４．低デキストラン高塩基法を使用するカルボキシメチル還元デキストランＣＭＲＤ Ｔ１０
還元デキストランＴ１０（１５０ｇ）を７２０ｍｌの水中に溶解し、そして８Ｍの水酸化ナトリウムの７２０ｍｌを添加した。混合物を２５℃にし、そして１４０ｍｌの水中の５８．８ｇのブロモ酢酸の溶液を添加した。混合物を室温で１時間撹拌し、その後７５０ｍｌの体積の粉砕された氷に添加した。溶液のｐＨを６ＭのＨＣｌを使用してｐＨ６．０にした。３ｋＤａのＭＷＣＯ限外濾過膜に対して繰り返し限外濾過した後、生成物を減圧下に凍結乾燥させた。収量は、滴定によって決定して、生成物１ｇ当たり約５８０マイクロモルのカルボキシルのカルボキシル含有率を有する、回収された固体カルボキシメチル還元デキストランＴ１０（ナトリウム塩）の１２７．８８ｇであった（表３）。
【００９０】
表３は、観察されたカルボキシメチル置換の程度が、反応中に使用されたブロモ酢酸の量の関数であったことを示す。データは、一般的に反応中のブロモ酢酸の量の増加が生成物中のＣＯＯＨの濃度の増加をもたらしたことを示す。カルボキシメチルの組み込みの収率は、例えば、実施例１３及び１４のように、反応の規模のような条件によっても影響された。
【００９１】
【表３】
【００９２】
実施例１５．市販の源からのカルボキシメチル還元デキストランＴ１０
カルボキシメチル還元デキストランをＡｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａから購入した。この固体は、滴定によって決定して、生成物１ｇ当たり約１８８７マイクロモルのカルボキシルのカルボキシル含有率を示した。
【００９３】
実施例１６〜１８は、それぞれ、未処理、非還元デキストランＴ−１０、Ｔ−４０、及びＴ−７０からのカルボキシメチルデキストランの合成を記載する。
【００９４】
実施例１６．カルボキシメチルデキストランＴ１０
以下の溶液を調製し、５℃に冷却した：溶液Ａ：２５０ｍｌの水中の１０５．２ｇの水酸化ナトリウム；溶液Ｂ：１４２．５ｍｌの水中の５８．０ｇのブロモ酢酸；及び溶液Ｃ：１８７．５ｍｌの水中の７５．７ｇのデキストランＴ１０。
【００９５】
溶液の温度を２５℃未満に維持しながら、溶液Ｃと溶液Ａに１８７．５ｍｌの水中に溶解された水酸化ナトリウム（１４．４ｇ）を添加した。温度を２５℃未満に維持しながら、溶液Ｂを添加し、得られた溶液を室温で２時間撹拌し、その後溶液温度を３５℃未満に維持しながら、（５℃に冷却された）６ＭのＨＣｌを使用してｐＨ７．５まで中和した。混合物を０．２μｍの細孔サイズのフィルターに通して、そして２リットルまで希釈した。生成物を、３ｋＤａのＭＷＣＯ限外濾過膜に対して繰り返し限外濾過することによって精製し、０．２μｍのフィルターで再び濾過し、そして減圧下に凍結乾燥させた。収量は５３．１７ｇであり、回収された固体カルボキシメチルデキストランＴ１０（ナトリウム塩）は、滴定によって決定して、生成物１ｇ当たり約１２２０マイクロモルのカルボキシルのカルボキシル含有率を示した。
【００９６】
実施例１７．カルボキシメチルデキストランＴ４０
以下の溶液を調製し、５℃に冷却した：溶液Ａ：４８０ｍｌの水中の１５４ｇの水酸化ナトリウム；溶液Ｂ：２６０ｍｌの水中の７７ｇのブロモ酢酸；及び溶液Ｃ：４００ｍｌの水中の１００ｇのデキストランＴ４０。
【００９７】
溶液をＡを溶液Ｃに一度に全て添加した。５分後、溶液Ｂを添加し、温度を２０℃と２５℃との間に維持しながら、一緒にされた溶液を１２０分間撹拌した。混合物を６ＭのＨＣｌで中和し、０．２μｍのフィルターで濾過し、そして２リットルまで希釈した。生成物を、３ｋＤａのＭＷＣＯ限外濾過膜に対して繰り返し限外濾過することによって精製し、０．２μｍのフィルターで濾過し、そして減圧下に凍結乾燥させた。収量は１０５．１ｇの回収された固体カルボキシメチルデキストランＴ４０（ナトリウム塩）であり、これは、滴定によって決定して、生成物１ｇ当たり約１３９０マイクロモルのカルボキシルのカルボキシル含有率を示した。
【００９８】
実施例１８．カルボキシメチルデキストランＴ７０
以下の溶液を調製し、５℃に冷却した：溶液Ａ：４８０ｍｌの水中の１５４ｇの水酸化ナトリウム；溶液Ｂ：２６０ｍｌの水中の７７ｇのブロモ酢酸；及び溶液Ｃ：４００ｍｌの水中の１００ｇのデキストランＴ７０。
【００９９】
溶液をＡを溶液Ｃに一度に全て添加した。５分後、溶液Ｂを添加し、氷浴を使用して温度を２０℃と２５℃との間に維持しながら、一緒にされた溶液を撹拌した。１２０分後、溶液を６ＭのＨＣｌで中和した。溶液を０．２μｍのフィルターで濾過し、そして２リットルまで希釈した。生成物を、３ｋＤａのＭＷＣＯ限外濾過膜に対して繰り返し限外濾過することによって精製し、０．２μｍのフィルターで再び濾過し、そして減圧下に凍結乾燥させた。収量は、滴定によって決定して、生成物１ｇ当たり約１３８０マイクロモルのカルボキシルのカルボキシル含有率を有する、回収された固体カルボキシメチルデキストランＴ７０（ナトリウム塩）の１０６．９ｇであった。
【０１００】
還元多糖又は非還元多糖のいずれかで被覆されたＵＳＰＩＯ製剤の特性を比較するための超常磁性コロイドの製造のための一般的手順
実施例１９〜２６は、同一の分子量の未処理多糖と還元多糖のペアから得られる多糖被覆された酸化鉄生成物を比較するために行った。同一の分子量の未処理多糖と還元多糖の各々のペアに対するＵＳＰＩＯコロイドの製造のために同一の手順を使用した。より詳細に述べると、各々の分子量のペアに対して、同じ多糖の鉄に対する比率と鉄濃度を使用した。各々の未処理多糖と還元多糖のペアに対して使用された多糖の鉄に対する比率と鉄濃度は、還元多糖を使用して３０ｎｍ未満の直径及び２０，０００×１０−６ｃｇｓより大の磁化率を有する０．２μｍのフィルターを通して濾過可能なＵＳＰＩＯを生成するように選択された。
【０１０１】
一般的手順は、鉄塩（Ｆｅ＋３／Ｆｅ＋２）及び多糖の溶液への過剰の水酸化アンモニウムの添加、それに続く加熱、及び１００ｋＤａのＭＷＣＯ膜フィルターを使用する水に対する限外濾過の６サイクルの実施を含んだ。限外濾過後、還元多糖を使用して形成されたＵＳＰＩＯ製剤を０．２μｍのフィルターを通して濾過し、４℃で貯蔵した。
【０１０２】
未処理多糖を使用して製造された酸化鉄については、未処理デキストランＴ１０で被覆された酸化鉄のみが０．２μｍのフィルターを通して濾過可能であった。粒状材料を含むこれらのサンプルを除いて、サイズと磁化率をその後測定した。粒度は、Ｍｉｃｒｏｔｒａｃ（登録商標）ＵＰＡ装置（ペンシルバニア州、フォート・ワシントンのＨｏｎｅｙｗｅｌｌ ＩＡＣ Ｍｉｃｒｏｔｒａｃ製）中において動的光散乱を測定することによって決定し、平均体積直径（ｍｅａｎ ｖｏｌｕｍｅ ｄｉａｍｅｔｅｒ）（ＭＶＤ）として報告した。磁化率は、Ｍａｔｈｅｙ Ｊｏｈｎｓｏｎ磁化率天秤を使用して決定した。鉄濃度はビピリジルアッセイを使用して決定した（Ｋｕｍａｒ Ｋ．， Ｊ． Ｌｉｑ． Ｃｈｒｏｍａｔｇｒ． Ｒｅｌａｔ． Ｔｅｃｈｎｏｌ．， １９９７， ２０， ３３５１−３３６４）。
【０１０３】
実施例１９．還元デキストランＴ１被覆ＵＳＰＩＯの製造
還元デキストランＴ１（１．７ｇ）を２０ｍｌの水中に溶解し、３２ｇの水中の３ｇの六水和塩化第二鉄及び１．５ｇの四水和塩化第一鉄の溶液を添加した。混合物を窒素で３０分間パージし、５℃まで冷却し、そして１２．７ｇの２８％水酸化アンモニウムを２分間撹拌しながら添加した。混合物を６０℃に加熱し、この温度で４０分間維持し、その後８０℃で２時間インキュベートした。生成物に１００ｋＤａのＭＷＣＯ膜フィルターを使用する水に対する６サイクルの限外濾過を施した。限外濾過後、生成物を０．２μｍのフィルターを通して濾過し、４℃で貯蔵した。生成物は以下の特性を有することが観察された：平均体積直径（Ｍｉｃｒｏｔｒａｃ粒度分析器を使用して決定された）は１８ｎｍであった。磁化率は１３，３２３×１０−６ｃｇｓ／ｇＦｅであった。
【０１０４】
実施例２０．未処理デキストランＴ１被覆酸化鉄の製造
未処理デキストランＴ１を還元デキストランＴ１の代わりに使用したことを除いて、実施例１９において還元デキストランについて上で記載した方法によって、未処理デキストランＴ１酸化鉄を製造した。生成物は以下の特性を有することが観察された：平均体積直径（Ｍｉｃｒｏｔｒａｃ粒度分析器を使用して決定された）は２７６４ｎｍであった。磁化率は１，９５３×１０−６ｃｇｓ／ｇＦｅであった。
【０１０５】
実施例２１．還元デキストランＴ５被覆ＵＳＰＩＯの製造
還元デキストランＴ５（０．４５ｇ）を１３ｍｌの水中に溶解し、４．５ｇの水中の０．５ｇの六水和塩化第二鉄及び０．２５ｇの四水和塩化第一鉄の溶液を添加した。混合物を窒素で３０分間パージし、５℃まで冷却し、そして１．４２ｇの２８％水酸化アンモニウムを２分間撹拌しながら添加した。混合物を８０℃で２時間加熱し、実施例１９に記載されたようにして精製した。生成物は以下の特性を有することが観察された：平均体積直径（Ｍｉｃｒｏｔｒａｃ粒度分析器を使用して決定された）は１６ｎｍであった。磁化率は３３，９４３×１０−６ｃｇｓ／ｇＦｅであった。
【０１０６】
実施例２２．未処理デキストランＴ５被覆酸化鉄の製造
未処理デキストランＴ５を還元デキストランＴ５の代わりに使用したことを除いて、実施例２１において還元デキストランについて上で記載した方法によって、未処理デキストランＴ５酸化鉄を製造した。生成物は以下の特性を有することが観察された：平均体積直径（Ｍｉｃｒｏｔｒａｃ粒度分析器を使用して決定された）は１，９１６ｎｍであった。
【０１０７】
実施例２３．還元デキストランＴ１０被覆ＵＳＰＩＯの製造
還元デキストランＴ１０（２．７ｇ）を７０ｍｌの水中に溶解し、２７ｇの水中の２．０ｇの六水和塩化第二鉄及び１．０ｇの四水和塩化第一鉄の溶液を添加した。混合物を窒素で３０分間パージし、５℃まで冷却し、そして８．５ｇの２８％水酸化アンモニウムを２分間撹拌しながら添加した。混合物を８０℃で２時間加熱し、実施例１９に記載されたようにして精製した。生成物は以下の特性を有することが観察された：平均体積直径（Ｍｉｃｒｏｔｒａｃ粒度分析器を使用して決定された）は１２ｎｍであった。磁化率は３１，７４３×１０−６ｃｇｓ／ｇＦｅであった。
【０１０８】
実施例２４．未処理デキストランＴ１０被覆酸化鉄の製造
未処理デキストランＴ１０を還元デキストランＴ１０の代わりに使用したことを除いて、実施例２３において還元デキストランについて上で記載した方法によって、未処理デキストランＴ１０酸化鉄を製造した。生成物は以下の特性を有することが観察された：平均体積直径（Ｍｉｃｒｏｔｒａｃ粒度分析器を使用して決定された）は７５７ｎｍであった。磁化率は３１，２５２×１０−６ｃｇｓ／ｇＦｅであった。
【０１０９】
実施例２５．還元プルラン被覆ＵＳＰＩＯの製造
還元プルラン（０．０４５ｇ）を０．４ｍｌの水中に溶解し、１．３ｇの水中の０．１０６ｇの六水和塩化第二鉄及び０．０５ｇの四水和塩化第一鉄の溶液を添加した。混合物を窒素で３０分間パージし、５℃まで冷却し、そして０．０４４ｇの２８％水酸化アンモニウムを２分間撹拌しながら添加した。混合物を８０℃で０．６７時間加熱し、実施例１９に記載されたようにして精製した。生成物は以下の特性を有することが観察された：平均体積直径（Ｍｉｃｒｏｔｒａｃ粒度分析器を使用して決定された）は２０ｎｍであった。磁化率は２７，０６６×１０−６ｃｇｓ／ｇＦｅであった。
【０１１０】
実施例２６．未処理プルラン被覆酸化鉄の製造
未処理プルランを還元プルランの代わりに使用したことを除いて、実施例２５において還元プルランについて上で記載した方法によって、未処理プルラン酸化鉄を製造した。生成物は以下の特性を有することが観察された：平均体積直径（Ｍｉｃｒｏｔｒａｃ粒度分析器を使用して決定された）は１，１８４ｎｍであった。
【０１１１】
未処理多糖との比較において還元多糖を使用して得られた酸化鉄製剤の特性（実施例１９〜２６から得られたデータの比較）
ＭＲＩ造影剤に関して一般的に、小サイズの酸化鉄造影剤粒子、例えば、１０乃至５０ｎｍの範囲内の直径を有する粒子が好ましい。さらに、より大きい磁化率の、そしてより大きい同質性の酸化鉄が好ましい。
【０１１２】
実施例１９〜２６のデータから、酸化鉄を被覆するために使用される多糖の還元された末端糖の存在（還元多糖）が、未処理非還元多糖を使用して同様に製造された酸化鉄と比較して、各々の得られるコロイドの粒子の直径に対して予期されなかったかなりの影響を有することが観察された。表４は、平均体積直径（ＭＶＤ）によって示される、未処理多糖と還元多糖の各々のペアについて形成された粒子のサイズを示す。還元多糖と未処理多糖の濃度は、各々の分子量のグループ内において一定に保たれた。濃度は、還元多糖によるＵＳＰＩＯの合成を最適化するように選択された。全ての多糖に関して、未処理非還元多糖の使用は、一貫して還元多糖を使用した場合よりも大きい粒子を製造し、従って還元多糖は一貫して好ましいより小さい粒子を与えた。
【０１１３】
さらに、合成され試験された所定分子量の多糖の各々のペアに関して、還元多糖で被覆されたＵＳＰＩＯ製剤は、デキストランＴ１０を使用して得られたコロイド（これについては還元されたものの被覆と未処理のものの被覆の磁化率は同等だった）を除いて、未処理多糖を使用して合成された対応する酸化鉄製剤よりも高い磁化率を示した。
【０１１４】
これらのデータは、被覆されたＵＳＰＩＯコロイドの製造における還元多糖の使用が、磁化率の損失を伴うことなく、小サイズの好ましい粒子を生成することを示す。これらのデータは、多糖で被覆されたＵＳＰＩＯの合成に対して多糖のアルデヒドの還元が有する驚くべき効果を示す。
【０１１５】
【表４】
【０１１６】
３０ｎｍ未満の平均体積直径の未処理非還元Ｔ１、Ｔ５、及びＴ１０デキストランを使用して製造された酸化鉄の特性
実施例２７から２９は、未処理デキストランＴ１、Ｔ５、及びＴ１０から得られた酸化鉄の製造を示す。コロイドは還元デキストラン（実施例１９、２１、及び２３）に関して記載したようにして非還元（未処理）デキストランを使用して製造されたが、但し、これらの未処理非還元デキストラン粒子の製造は、対応するサイズの酸化鉄を製造するために、それらの対応する還元デキストラン同等物よりも約１０乃至３４倍のデキストランを必要とした。デキストラン使用量の増加の必要性は、示されている酸化鉄の対応する分子量のペアに関して生成物のデキストランの鉄に対する比率を比較することによって示される（表５）。
【０１１７】
データは、未処理デキストランＴ１、Ｔ５、及びＴ１０の各々を使用して製造された酸化鉄粒子の磁気特性及び合成中のデキストランの使用の効率が、各々の同等の還元デキストランを使用して製造された粒子の対応する特性と比較して劣っていたことを示す。
【０１１８】
実施例２７．未処理Ｔ１デキストランで被覆された酸化鉄の製造
０．４２ｇの六水和塩化第二鉄、０．２１ｇの四水和塩化第一鉄、及び７．２７ｇの水の混合物を０．２μｍのフィルターを通して濾過した。この混合物の１ｇの部分を０．１ｇデキストランＴ１／ｇ水の水溶液の１０ｍｌに添加した。混合物を窒素でパージし、その後２８％水酸化アンモニウム溶液の０．２２ｍｌを添加した。混合物を８０℃で１時間加熱し、室温まで冷却し、そして０．２μｍのフィルターを通して濾過した。生成物は以下の特性を有することが観察された：平均体積直径（Ｍｉｃｒｏｔｒａｃ粒度分析器を使用して決定された）は２７ｎｍであった。磁化率は２３２５×１０−６ｃｇｓ／ｇＦｅであった。
【０１１９】
実施例２８．未処理Ｔ５デキストランで被覆された酸化鉄の製造
デキストランＴ５（０．８ｇ）を９ｍｌの水中に溶解し、そして９．２ｍｌの水中の５１．８ｍｇの六水和塩化第二鉄及び２５．９ｍｇの四水和塩化第一鉄の０．２μｍのフィルターを通して濾過された溶液の０．６３ｍｌに添加した。混合物を窒素でパージし、その後２８％水酸化アンモニウム溶液の１．４ｍｌを添加した。混合物を８０℃で１時間加熱し、室温まで冷却し、そして０．２μｍのフィルターを通して濾過した。生成物は以下の特性を有することが観察された：平均体積直径（Ｍｉｃｒｏｔｒａｃ粒度分析器を使用して決定された）は２０ｎｍであった。磁化率は１２８５×１０−６ｃｇｓ／ｇＦｅであった。
【０１２０】
実施例２９．未処理Ｔ１０デキストランで被覆された酸化鉄の製造
デキストランＴ１０（９４２０ｇ）を１４９１５ｇの水中に溶解した。この混合物の１４９１５ｇの部分を０．２μｍのフィルターを通して濾過し、反応容器に添加した。六水和塩化第二鉄（８９１ｇ）を７１３ｇの水中に溶解した。１１２９ｇの部分を０．２μｍのフィルターを通して濾過し、デキストランを含む反応容器に添加した。この混合物に窒素の泡を吹き込みながら、混合物を一晩撹拌しながら５℃まで冷却した。この窒素のパージの最後の３０分間の前に、４７７ｇの水中の３５９ｇの四水和塩化第一鉄の０．２μｍのフィルターを通して濾過された溶液の５８０ｇの部分を添加した。この混合物に、２８％水酸化アンモニウム溶液の７８６ｇを添加し、５℃まで冷却した。混合物を８０℃に加熱し、８０℃で２時間インキュベートし、そしてその後８０℃に加熱された８０リットルの水中に注ぎ入れた。混合物を一晩放置して冷却させ、０．２μｍのフィルターを通して濾過し、そして１００ｋＤａ限外濾過膜を使用する限外濾過により精製した。生成物を０．２μｍのフィルターを通して濾過した。生成物は以下の特性を有することが観察された：平均体積直径（Ｍｉｃｒｏｔｒａｃ粒度分析器を使用して決定された）は２１ｎｍであった。磁化率は３２，７１２×１０−６ｃｇｓ／ｇＦｅであった。
【０１２１】
【表５】
【０１２２】
様々な程度のカルボキシメチル化を含むカルボキシメチル未処理デキストランＴ１０及びカルボキシメチル還元デキストランＴ１０で被覆されたＵＳＰＩＯの製造
実施例３０及び３１は、それぞれ、カルボキシメチル未処理デキストランＴ１０及びカルボキシメチル還元デキストランＴ１０で被覆されたＵＳＰＩＯの製造を記載する。実施例３２〜３６は、様々な程度のカルボキシメチル化を含むカルボキシメチル還元デキストランＴ１０製剤で被覆されたＵＳＰＩＯ組成物の合成を記載する。実施例３７〜４１は、塩化第二鉄及び様々な程度のカルボキシメチル化を含むカルボキシメチル還元デキストランＴ１０を含む製剤の溶解度を記載する。
【０１２３】
実施例３０．カルボキシメチルデキストランＴ１０で被覆されたＵＳＰＩＯの製造
カルボキシメチルデキストランＴ１０（６０ｇ、実施例１６の方法によって製造されたもの）を５３２ｇの水中に溶解した。１４．７ｇの六水和塩化第二鉄、７．２ｇの四水和塩化第一鉄、及び１００ｍｌの水から成る水溶液を０．２μｍのフィルターを通して濾過し、添加した。混合物を１０℃まで冷却し、窒素でパージし、そして５２．２ｍｌの２８％水酸化アンモニウム溶液を撹拌しながら添加した。混合物を７５℃に加熱し、７５℃で３０分間維持し、２．５リットルの水で希釈し、そして０．２μｍのフィルターを通して濾過した。生成物を１００ｋＤａのＭＷＣＯ膜に対して繰り返し限外濾過することによって精製し、２０ｍｇＦｅ／ｍｌまで濃縮し、そして０．２μｍのフィルターを通して再び濾過した。生成物は以下の特性を有することが観察された：ＭＶＤ（Ｍｉｃｒｏｔｒａｃ粒度分析器を使用して決定された）は１９ｎｍであった。磁化率は２７，８３５×１０−６ｃｇｓ／ｇＦｅであった。そしてカルボキシル含有率は、ＣＭＲＤの１ｇ当たり１，２２０マイクロモルであった。オートクレーブ処理に対する安定性を決定するために、生成物のサンプルを密閉された５ｍｌのガラスバイアルに入れ、そして１２１℃で３０分間加熱した（表９を参照のこと）。
【０１２４】
実施例３１．カルボキシメチル還元デキストランＴ１０で被覆されたＵＳＰＩＯの製造
還元されたカルボキシメチルデキストランＴ１０（４０ｇ、実施例５で製造されたもの）を１，０３８ｍｌの水中に溶解し、０．２μｍの細孔サイズのフィルターを通して濾過した。３７４ｍｌの水中の３０ｇの六水和塩化第二鉄及び１５ｇの四水和塩化第一鉄の０．２μｍのフィルターを通して濾過された溶液を、３１ｍｌの洗浄水と共に、デキストランに添加した。溶液を１０℃まで冷却し、そして１１４ｇの２８％水酸化アンモニウムを添加した。このコロイド混合物を７８℃に加熱し、その温度で１時間維持した。この溶液をその後水で３リットルまで希釈し、１０℃まで冷却し、そしてＹＭ−１００フィルター膜（１００ｋＤａのＭＷＣＯ）で６回限外濾過した。２１．１ｍｇＦｅ／ｇの最終濃度が得られた。生成物は以下の特性を有することが観察された：平均体積直径（Ｍｉｃｒｏｔｒａｃ粒度分析器を使用して決定された）は２１ｎｍであった。磁化率は３２，７３２×１０−６ｃｇｓ／ｇＦｅであった。そしてカルボキシル含有率は、ＣＭＲＤの１ｇ当たり１，２６５マイクロモルであった。粒子の内容物は、約５０％のＦｅと５０％のデキストランであることが判明した。オートクレーブ処理に対する安定性を決定するために、生成物のサンプルを密閉された５ｍｌのガラスバイアルに入れ、そして１２１℃で３０分間加熱した（表９を参照のこと）。
【０１２５】
実施例３２．１ｇ当たり１１０マイクロモルのカルボキシルを有するカルボキシメチル還元デキストランＴ１０で被覆されたＵＳＰＩＯの製造
カルボキシメチル還元デキストランＴ１０（４ｇ、実施例１０で製造されたもの）を８５ｍｌの水中に溶解した。これに、２．９９ｇの六水和塩化第二鉄、１．４９ｇの四水和塩化第一鉄、及び３７．３ｍｌの水から成る０．２μｍのフィルターを通して濾過された混合物を添加した。混合物を１０℃まで冷却し、窒素でパージし、そして撹拌しながら、１１．４ｇの２８％水酸化アンモニウム溶液を添加した。この混合物を９０℃まで加熱し、７８℃で６０分間維持し、その後混合物に空気の泡を吹き込みながら７８℃で維持した。この混合物を１．５リットルの水で希釈し、０．２μｍのフィルターを通して濾過した。生成物を１００ｋＤａのＭＷＣＯ膜に対して繰り返し限外濾過することによって精製し、そして０．２μｍのフィルターを通して再び濾過した。
【０１２６】
実施例３３．１ｇ当たり１３０マイクロモルのカルボキシルを有するカルボキシメチル還元デキストランＴ１０で被覆されたＵＳＰＩＯの製造
カルボキシメチル還元デキストランＴ１０（４０ｇ、実施例１１で製造されたもの）を８５０ｍｌの水中に溶解した。これに、２９．９ｇの六水和塩化第二鉄、１４．９ｇの四水和塩化第一鉄、及び３７３ｍｌの水から成る０．２μｍのフィルターを通して濾過された混合物を添加した。混合物を１０℃まで冷却し、窒素でパージし、そして撹拌しながら、１１４ｍｌの２８％水酸化アンモニウム溶液を添加し、この混合物を９０℃まで加熱し、７８℃で６０分間維持し、その後混合物に空気の泡を吹き込みながら７８℃で維持した。この混合物を１．５リットルの水で希釈し、０．２μｍのフィルターを通して濾過した。生成物を１００ｋＤａのＭＷＣＯ膜に対して繰り返し限外濾過することによって精製し、２０ｍｇＦｅ／ｍｌまで濃縮し、そして０．２μｍのフィルターを通して再び濾過した。
【０１２７】
実施例３４．１ｇ当たり２８０マイクロモルのカルボキシルを有するカルボキシメチル還元デキストランＴ１０で被覆されたＵＳＰＩＯの製造
カルボキシメチル還元デキストランＴ１０（４ｇ、実施例１２で製造されたもの）を８５ｍｌの水中に溶解した。これに、２．９９ｇの六水和塩化第二鉄、１．４９ｇの四水和塩化第一鉄、及び３７．３ｍｌの水から成る０．２μｍのフィルターを通して濾過された混合物を添加した。混合物を１０℃まで冷却し、窒素でパージした。この混合物に撹拌しながら、１１．４ｇの２８％水酸化アンモニウム溶液を添加し、この混合物を９０℃まで加熱し、７８℃で６０分間維持し、その後混合物に空気の泡を吹き込みながら７８℃で維持した。この混合物を１．５リットルの水で希釈し、０．２μｍのフィルターを通して濾過した。生成物を１００ｋＤａのＭＷＣＯ膜に対して繰り返し限外濾過することによって精製し、その後０．２μｍのフィルターを通して濾過した。
【０１２８】
実施例３５．１ｇ当たり４５０マイクロモルのカルボキシルを有するカルボキシメチル還元デキストランＴ１０で被覆されたＵＳＰＩＯの製造
カルボキシメチル還元デキストランＴ１０（４ｇ、実施例１３で製造されたもの）を８５ｍｌの水中に溶解した。これに、２．９９ｇの六水和塩化第二鉄、１．４９ｇの四水和塩化第一鉄、及び３７．３ｍｌの水から成る０．２μｍのフィルターを通して濾過された溶液を添加した。混合物を１０℃まで冷却し、窒素でパージし、その後撹拌しながら、１１．４ｇの２８％水酸化アンモニウム溶液を添加した。この混合物を９０℃まで加熱し、７８℃で６０分間維持し、その後混合物に空気の泡を吹き込みながら７８℃で維持した。この混合物を１．５リットルの水で希釈し、０．２μｍのフィルターを通して濾過し、そして１００ｋＤａのＭＷＣＯ膜に対して繰り返し限外濾過することによって精製し、その後０．２μｍのフィルターを通して再び濾過した。
【０１２９】
実施例３６．１ｇ当たり５８０マイクロモルのカルボキシルを有するカルボキシメチル還元デキストランＴ１０で被覆されたＵＳＰＩＯの製造
カルボキシメチル還元デキストランＴ１０（４０ｇ、実施例１４で製造されたもの）を８５ｍｌの水中に溶解した。これに、２９．９ｇの六水和塩化第二鉄、１４．９ｇの四水和塩化第一鉄、及び３７３ｍｌの水から成る０．２μｍのフィルターを通して濾過された溶液を添加した。混合物を１０℃まで冷却し、窒素でパージし、その後撹拌しながら、１１．４ｇの２８％水酸化アンモニウム溶液を添加した。この混合物を９０℃まで加熱し、７８℃で６０分間維持し、その後混合物に空気の泡を吹き込みながら７８℃で維持した。この混合物を１．５リットルの水で希釈し、０．２μｍのフィルターを通して濾過し、そして１００ｋＤａのＭＷＣＯ膜に対して繰り返し限外濾過することによって精製し、その後０．２μｍのフィルターを通して濾過した。
【０１３０】
ＣＭＲＤ被覆されたＵＳＰＩＯのカルボキシメチル化の程度のコロイドサイズに対する影響を比較した。実施例３１〜３６、表６。得られたコロイドのＭＶＤ値は、生成物１ｇ当たり１１０乃至１２６５マイクロモルのカルボキシルを含むＣＭＲＤ製剤の間でかなり均一であった。
【０１３１】
実施例３７．１ｇ当たり１，１０８マイクロモルのカルボキシルを有するカルボキシメチル還元デキストランＴ１０と塩化第二鉄溶液の混合
粒子の合成における１つの工程として、塩化第二鉄（０．３ｇ）を１５ｍｌの水中に溶解し、０．２μｍの細孔サイズのフィルターを通して濾過した。カルボキシメチル還元デキストラン（実施例６で調製されたもの）を添加し、混合物を振盪し、そして１０℃まで冷却した。沈殿物は観察されなかった。
【０１３２】
【表６】
【０１３３】
実施例３８．１ｇ当たり１，２６２マイクロモルのカルボキシルを有するカルボキシメチル還元デキストランＴ１０と塩化第二鉄溶液の混合
塩化第二鉄（０．３ｇ）を１５ｍｌの水中に溶解し、０．２μｍの細孔サイズのフィルターを通して濾過した。カルボキシメチル還元デキストラン（実施例７で調製されたもの）を添加し、混合物を振盪し、そして１０℃まで冷却した。沈殿物は観察されなかった。
【０１３４】
実施例３９．１ｇ当たり１，４０４マイクロモルのカルボキシルを有するカルボキシメチル還元デキストランＴ１０と塩化第二鉄溶液の混合
塩化第二鉄（０．３ｇ）を１５ｍｌの水中に溶解し、０．２μｍの細孔サイズのフィルターを通して濾過した。カルボキシメチル還元デキストラン（実施例８で調製されたもの）を添加し、混合物を振盪し、そして１０℃まで冷却した。沈殿物は観察されなかった。
【０１３５】
実施例４０．１ｇ当たり１，５２８マイクロモルのカルボキシルを有するカルボキシメチル還元デキストランＴ１０と塩化第二鉄溶液の混合
塩化第二鉄（０．３ｇ）を１５ｍｌの水中に溶解し、０．２μｍの細孔サイズのフィルターを通して濾過した。カルボキシメチル還元デキストラン（実施例９で調製されたもの）を添加し、混合物を振盪し、そして５℃まで冷却した。オレンジ白色の沈殿物が観察された。
【０１３６】
実施例４１．１ｇ当たり１，８８７マイクロモルのカルボキシルを有するカルボキシメチル還元デキストランＴ１０と塩化第二鉄の混合
六水和塩化第二鉄（３０．３ｇ）及び塩化第一鉄（１４．８ｇ）を４０２．９ｍｌの水中に溶解し、０．２μｍの細孔サイズのフィルターを通して濾過した。カルボキシメチル還元デキストランＴ１０（１，０３３ｍｌ中４０．３ｇ、実施例１５で調製されたもの）を添加し、混合物を振盪し、そして５℃まで冷却した。オレンジ白色の沈殿物が観察された。
【０１３７】
ＣＭＲＤ−ＵＳＰＩＯ合成の第１の工程、即ち、ＣＭＲＤの水性混合物を塩化鉄溶液と組み合わせる工程に対するＣＭＲＤのカルボキシメチル化の程度を変えることの影響を分析した。様々なＣＭＲＤ製剤を一定の鉄濃度で鉄塩と混合したが、これらのＣＭＲＤ製剤は実施例３７〜４１に記載されているようにカルボキシメチル化の程度においてのみ異なっていた。デキストラン１ｇ当たり１，１０８から１，４０４マイクロモルのカルボキシルまで、ＣＭＲＤは塩化第二鉄の存在下に均一な混合物を形成した（表７）。
【０１３８】
【表７】
【０１３９】
デキストラン１ｇ当たり１，４０４マイクロモルのカルボキシルを超えたところでは、ＵＳＰＩＯの合成の条件及び濃度下での塩化第二鉄のＣＭＲＤ溶液への添加は、オレンジ白色の沈殿物を生成した。多くの化合物が可溶性になるより高い温度においてさえ、沈殿は残った。表７中のデータは、ＣＭＲＤ−ＵＳＰＩＯの合成の好ましい方法中で使用できるＣＭＲＤの改質において上位の水準が存在することを示す。
【０１４０】
実施例４２．酸化鉄ゾルの合成及び未処理デキストラン、還元デキストラン、及びＣＭＲＤによるそれらの安定化：磁性ゾルの製造
磁性ゾルを製造するために、２５℃の６０ｇの２８％水酸化アンモニウムを、３２１ｇの水中に３０．０ｇの六水和塩化第二鉄及び１５．１ｇの四水和塩化第一鉄を有する溶液に添加した。５分間の混合後、十分に濃縮されたＨＣｌを添加して１．６のｐＨを得た。希釈剤として水を使用して、ゾルを１００ｋＤａのＭＷＣＯ膜フィルターで限外濾過して、３．２５のｐＨを達成した。磁性ゾルを細孔サイズ０．２μｍのフィルターに通し、その後５０ｍｇＦｅ／ｇまで濃縮し、そして５℃で貯蔵した。鉄の収率は５５％であり、そして生成物は１６ｎｍのＭＶＤを有することが観測された。
【０１４１】
実施例４３．酸化鉄ゾルの合成及び未処理デキストラン、還元デキストラン、及びＣＭＲＤによるそれらの安定化：非磁性ゾルの製造
３０ｍｌの水中の２．９ｇの六水和塩化第二鉄の溶液に、１０ｍｌの１０ＭのＮａＯＨを添加した。混合物を５分間撹拌し、水で２００ｍｌまで希釈し、そして生成物を濾過によって収集した。残渣を水と再び混合し、そして濾過した。残渣を４０ｍｌの水に添加し、そしてｐＨを２．０に調節した。生成物は１０ｎｍのＭＶＤを有することが観測された。
【０１４２】
実施例４４．酸化鉄ゾルの合成及び未処理デキストラン、還元デキストラン、及びＣＭＲＤによるそれらの安定化：還元デキストランＴ１０による磁性ゾルの被覆
還元デキストランＴ１０（６０ｍｇ；実施例３）を１．７４ｍｌの水中に溶解し、実施例４２に従って製造された磁性ゾル（１３ｍｇＦｅ）の０．２４ｍｌと組み合わせた。混合物を１５分間インキュベートし、そして水酸化ナトリウムでｐＨを７．４に調節した。粒度（ＭＶＤ）は８５ｎｍであることが判明した。
【０１４３】
実施例４５．酸化鉄ゾルの合成及び未処理デキストラン、還元デキストラン、及びＣＭＲＤによるそれらの安定化：未処理デキストランＴ１０による磁性ゾルの被覆
未処理デキストランＴ１０（６０．８ｍｇ）を１．７４ｍｌの水中に溶解し、実施例４２に従って製造された磁性ゾル（１３ｍｇＦｅ）の０．２４ｍｌと組み合わせた。混合物を１５分間インキュベートし、そして水酸化ナトリウムでｐＨを７．４に調節した。粒度（ＭＶＤ）は１，９７３ｎｍであることが判明した。
【０１４４】
実施例４６．酸化鉄ゾルの合成及び未処理デキストラン、還元デキストラン、及びＣＭＲＤによるそれらの安定化：ＣＭＲＤ Ｔ１０による磁性ゾルの被覆
７５ｍｇのＣＭＲＤ Ｔ１０（実施例５）を１．３４ｍｌの水中に溶解し、実施例４２に従って製造された磁性ゾル（３３ｍｇＦｅ）の０．６６ｍｌに添加した。混合物を３７℃で１５分間インキュベートし、そして水酸化ナトリウムでｐＨを７．９５（±０．４）に調節した。３００ｋＤａの限外濾過フィルターを使用して混合物を濃縮した。生成物は４１ｎｍのＭＶＤを有することが観測された。
【０１４５】
実施例４７．酸化鉄ゾルの合成及び未処理デキストラン、還元デキストラン、及びＣＭＲＤによるそれらの安定化：磁性ゾルのｐＨの７．４への調節
実施例４２において製造された磁性ゾルをｐＨ７．４に調節した。沈殿が観察された。
【０１４６】
実施例４８．酸化鉄ゾルの合成及び未処理デキストラン、還元デキストラン、及びＣＭＲＤによるそれらの安定化：ＣＭＲＤ Ｔ１０による非磁性ゾルの被覆
実施例４３に従って製造された非磁性ゾル（３５ｍｌ）を、実施例５に従って製造されたＣＭＲＤ Ｔ１０の５０ｍｇ／ｇ水溶液の３５ｍｌに滴下して加えた。１ＮのＮａＯＨを使用してｐＨを７．０に調節し、溶液を沸騰するまで加熱し、室温まで冷却し、そして６，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離を行った。上澄液を０．２μｍの細孔サイズを有するフィルターに通し、そして１２１℃で３０分間オートクレーブ処理した。生成物は８６ｎｍのＭＶＤを有することが観測された。
【０１４７】
実施例４２〜４８は、デキストランの不存在下、又は未処理デキストランの存在下においては、大きな鉄の沈殿が形成することを示す。還元デキストランとＣＭＲＤのみが安定なコロイドとして磁性ゾルを産出した。
【０１４８】
実施例４９．塩化第二鉄とＣＭＲＤの塩基共沈を使用するＣＭＲＤで被覆された非磁性酸化鉄コロイドの製造
カルボキシメチル還元デキストランＴ１０（１９．２ｇ）（実施例５）を３００ｇの水中に溶解し、０．２μｍのフィルターを通して濾過し、そして追加の１６０．８ｇの水を添加した。この溶液を、０．２μｍのフィルターで濾過された０．３Ｍの六水和塩化第二鉄水溶液の１２０ｍｌに添加した。この混合物に３２ｍｌの６Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加した。混合物を１００℃に３時間加熱し、室温まで冷却し、５０ｍｌの最終体積になるまで限外濾過した。生成物は３０ｎｍのＭＶＤを有することが観測された。この材料の一部を窒素下のビンに１２１℃で３０分間入れた。オートクレーブ処理された生成物は６９ｎｍのＭＶＤを有していた。
【０１４９】
実施例５０．オートクレーブ処理の還元デキストランコロイド及び未処理デキストランコロイドに対する影響：及び未処理デキストラン及び還元デキストラン及びＣＭＲＤで被覆されたＵＳＰＩＯのオートクレーブ処理に対する安定性
各々が２０ｍｇＦｅ／ｇの濃度の複数のコロイド製剤を１２１℃で３０分間オートクレーブ処理した。オートクレーブ処理に続いて、フェノール／硫酸アッセイを使用して、全デキストランと遊離デキストランの差として計算される結合されたデキストランの測定を行った。遊離のデキストランは限外濾過によってコロイドから分離された。表８は、還元デキストランで被覆されたＵＳＰＩＯを有するコロイド製剤が、未処理デキストランで被覆されたＵＳＰＩＯよりも大きい安定性を有することを示す。還元デキストランで被覆されたＵＳＰＩＯはオートクレーブ処理後にその小さいサイズを維持した。なぜならば、オートクレーブ処理後の材料のＭＶＤは、オートクレーブ処理前の材料のＭＶＤと比較して１．３倍しか増加していなかったからである。対照的に、未処理デキストランで被覆されたＵＳＰＩＯはオートクレーブ処理後にサイズが２８倍に増加した。これらのデータは、オートクレーブ処理後に、還元デキストランは、未処理デキストランと比較して、鉄粒子により緊密に結合したままであることを示す。
【０１５０】
ＵＳＰＩＯを被覆するために還元デキストランを使用することによって本発明において達成された増加した安定性の第２の種類は、バルク（ｂｕｌｋ）溶媒のｐＨの特性である。オートクレーブ処理後に還元デキストランで被覆されたＵＳＰＩＯのｐＨは０．９ｐＨ単位低下したが、これに対して未処理デキストランで被覆されたＵＳＰＩＯについては１．６ｐＨ単位低下した。
【０１５１】
オートクレーブ処理プロセスに対するさらに大きい安定性が、カルボキシメチル未処理デキストランとの比較において、カルボキシメチル還元デキストランで被覆された粒子に関して観察された。表９中のデータは、カルボキシメチル非還元未処理デキストランで被覆されたＵＳＰＩＯがオートクレーブ処理後に粒状物質の量の１０〜５０倍の増加を示したことを示している。対照的に、カルボキシメチル還元デキストランで被覆されたＵＳＰＩＯはオートクレーブ処理時にサイズや量の変化を受けなかった。コロイド懸濁液及びバルク溶媒に与えるカルボキシメチル還元多糖被覆の安定化効果のもう１つのしるしは、溶媒のｐＨの安定性であった。表８及び９の両方中のデータは、還元デキストランで被覆された粒子が、未処理デキストランで被覆されたものと比較して、オートクレーブ処理後にかなり改善されたｐＨ安定性を有したことを示す。
【０１５２】
実施例５１．様々な造影剤の緩和特性を決定するための手順
核磁気（ＮＭ）測定値（０．４７Ｔ）を２０ＭＨＺ（プロトン）で運転されるＢｒｕｋｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製ｐｃ１２０卓上ＮＭサンプル分析器中で得た。０．５ｍｌの各々のサンプルをミニスペック（ｍｉｎｉｓｐｅｃ）上の緩和性（ｒｅｌａｘｉｖｉｔｙ）測定用の１０ｍｍＮＭ管に入れた。サンプル室中のサンプルの配置を最適化した。標準サンプルを試験し、それらの値を対数で記録した。
【０１５３】
【表８】
【０１５４】
【表９】
【０１５５】
Ｔ１及びＴ２測定に対して標準的手順を使用し、それらの値を記録した。Ｔ１は逆転回復（ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ ｒｅｃｏｖｅｒｙ）技術を使用して測定した。ＩＲ技術によれば、磁化を検出の平面に入れるために、サンプルは１８０°のパルスにさらされ、その後９０°のパルスにさらされる。サンプリング後、１８０°のパルスと９０°のパルスとの間の時間が変えられ、そして再びサンプリングされる。これは幾つかの期間に対して行われる。得られるシグナルは、式[Ｍ∞−Ｍ（ｔ）]／Ｍ∞＝（１−ｃｏｓθ）ｅｘｐ（−ｔ／Ｔ１）によって決定される。データに対する３つのパラメータ適合が行われるとき、Ｍ∞、θ、及びＴ１が計算される。Ｔ２はＣＰＭＧ技術を使用して測定され、可変長さの１８０°パルスの線形の列がサンプルに供給される。毎秒ごとのエコーの大きさが測定される。２つのパラメータ（Ｍ０及びＴ２）適合を使用して、蓄積されたデータに対して適合が行われる。Ｍ（ｔ）＝Ｍ０ｅｘｐ（−ｔ／Ｔ２）の場合、ｔに対するｌｎ（Ｍ（ｔ））のグラフは−１／Ｔ２の傾きを有する直線である。Ｔ１及びＴ２の逆がサンプルの鉄濃度に対してグラフ化された。最良適合線の傾きから、緩和性が決定された。
【０１５６】
【表１０】
【０１５７】
実施例５２．ラットにおける毒性の研究。ラットにおける還元デキストラン、非還元デキストラン、及びＣＭＲＤ被覆されたコロイドの毒性
デキストランに対するアナフィラキシーショック型の反応が、ラットによって及び小さいが有意の割合の人の群によって示され得る（Ｓｑｕｉｒｅ， Ｊ．Ｒ．ら、“Ｄｅｘｔｒａｎ， Ｉｔｓ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ Ｕｓｅ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，” Ｃｈａｒｌｅｓ Ｃ． Ｔｈｏｍａｓ， Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ， ＩＬ， １９５５）。その反応はアナフィラキシーショックに似ているが、前もっての感化（ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ）を必要とせず、そしてラットにおいては疲労の急速な進行、広がった末梢の血管拡張、及び脚、鼻、及び舌の浮腫によって特徴付けられる（Ｖｏｏｒｈｅｅ， Ａ．Ｂ．ら，Ｐｒｏｃ． Ｓｏｃ． Ｅｘｐ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ． １９５１， ７６：２５４）。バルビツール酸塩麻酔が同時に行われる場合、それは著しい血圧低下及びチアノーゼを生じる（Ｈａｎｎａ， Ｃ．Ｈ．ら， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． １９５７， １９１：６１５）。
【０１５８】
酸化鉄コロイドの被覆中の、非還元の未処理デキストランよりもむしろ、還元デキストラン又はそれらの誘導体の存在が、静脈内注入時に可能性のある人の有害な反応を減少させることができるか又は除去できるかを決定するために、ラットの脚の浮腫反応の程度を測定する手順を使用した。ラットの脚の浮腫は、肢体容積計（これは示差体積測定装置である）を使用して、試験材料の注入の前後の脚の体積として測定される。試験材料の投与量を注入し、指示された時間間隔の後２回目の読み取りを行い、そして脚の体積の変化のパーセントが計算された。これらの研究において投与された１回分の投与量は、体重１ｋｇ当たり１００ｍｇＦｅであり、ラット、ブタ、及び人において映像化剤として使用される量よりもずっと多い投与量であった（実施例５３〜５６を参照のこと）。
【０１５９】
還元デキストランＴ１０及び非還元デキストランＴ１０の各々で被覆された酸化鉄の投与後に観察された結果を表１１に示す。未処理非還元デキストラン被覆を有するＵＳＰＩＯ製剤を投与されたラットと比較して、被覆として還元デキストラン又は還元デキストラン誘導体を有するＵＳＰＩＯ製剤を投与されたラットにおいては、浮腫状のアナフィラキシー反応の著しい減少が観察された。
【０１６０】
【表１１】
【０１６１】
浮腫のパーセントとして測定される、アナフィラキシー反応の程度に対する、カルボキシメチル置換の増加した水準を有するＣＭＲＤ−ＵＳＰＩＯ製造の影響が、表１２に示される。データは、浮腫反応を減少させるためには、ある最低水準の置換が必要であること、及び一旦この置換最低量が達成された後はラットのデキストランに対する反応の減少は浮腫反応の消滅という驚くべきものであることを示す。即ち、１ｇ当たり１，２６５マイクロモルのカルボキシルにおいては浮腫は観察されなかった。
【０１６２】
実施例５３．還元デキストラン及び非還元デキストランのラットにおける毒性の研究
被覆単独、即ち、非還元の未処理デキストランよりもむしろ還元デキストラン又はそれらの誘導体が、静脈内注入時に可能性のある人の有害な反応を除去できるかを決定するために、実施例５２において使用された手順を使用した。実施例５２と同様に、ラットの脚の浮腫を注入の前後の脚の体積として測定した。これらの研究において投与された１回分の投与量は、上述したように、体重１ｋｇ当たり１００ｍｇの試験物質であった。
【０１６３】
【表１２】
【０１６４】
還元Ｔ１０デキストラン及び非還元Ｔ１０デキストランの投与に続いて観察された結果は、各々の材料について同様であった（表１３）。還元デキストランＴ１０は、未処理デキストランＴ１０と同じ程度の浮腫を引き起こした。浮腫の消滅又は低減は、デキストランの還元のみに原因があるとすることはできなかった。
【０１６５】
【表１３】
【０１６６】
表１４は、浮腫のパーセントとして測定されるアナフィラキシー反応の程度に対する、還元デキストランのカルボキシメチル置換の水準を増加させることの影響を示す。これらのデータは、カルボキシメチル置換のある最低水準より上では、浮腫が減少したか又は消滅したことを示す。置換のこの最低水準より上のデキストランについて、デキストランに対するラットの毒性反応における減少は、反応の驚くべき消滅であった。即ち、浮腫は観察されなかった。
【０１６７】
【表１４】
【０１６８】
実施例５４．ラットにおけるＣＭＲＤ被覆されたＵＳＰＩＯの薬物動態：血液クリアランス
３匹の雄性のＣＤ（登録商標）ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，マサチューセッツ州ウィルミングトン；重量範囲２７２〜２９０ｇ）に長時間持続麻酔薬イナクチン（Ｉｎａｃｔｉｎ）（体重１ｋｇ当たり１００ｍｇ）で腹腔内麻酔を実施した。股動脈及び静脈を腰−大腿関節（ｈｉｐ−ｆｅｍｕｒ ｊｏｉｎｔ）のところで小切開によって露出させ、この動脈にヘパリン化された生理的食塩水（１ｍｌ当たり１０単位）の充填された１ｍｌのシリンジに接続されたＰＥ５０チューブでカニューレを挿入した。基準として役立てるために、０．２５ｍｌの動脈血を時間０で採取し、そしてＣＭＲＤ被覆されたＵＳＰＩＯ（実施例３１）を股動脈に注入した。０．２５ｍｌの血液サンプルを図４及び５中に示した時間に採取した。
【０１６９】
Ｔ２磁気緩和時間を各々のサンプルにおいて測定し、そして緩和性（１／Ｔ２）を計算した。一次反応速度論を使用して血液中のサンプルの半減期（ｔ１／２）を決定した。データの適合に使用した式は、
１／Ｔ２−１／Ｔ基準＝Ａｅ−ｋｔ
であり、式中、１／Ｔ２は注入後の時刻ｔにおける血液の緩和性であり；１／Ｔ基準は基準緩和性であり、そしてＡｅ−ｋｔは血液からの試験材料の一次減衰を表す。この式の各々の側の自然対数を取ると、
ｌｎ（１／Ｔ２−１／Ｔ基準）＝−ｋｔ＋ｌｎＡ０
が得られる。
【０１７０】
この第２の式によれば、血液からのＵＳＰＩＯの除去の速度が一次速度論に従うならば、時間ｔに対するｌｎ（１／Ｔ２−１／Ｔ基準）のグラフは、傾き−ｋ（一次速度定数）及び切片ｌｎＡ０（これは時間０でのｌｎ（１／Ｔ２−１／Ｔ基準）に等しい）を有する直線を与える。図５は、直線が得られたことを示す。半減期（ｔ１／２）（これは、ＣＭＲＤ被覆ＵＳＰＩＯの量が血液中のその濃度の半分まで減少したときの時間である）は６７分であることが決定され、９５％の信頼水準で６１〜７５分の範囲内である。
【０１７１】
実施例５５．ラットにおけるＣＭＲＤ被覆ＵＳＰＩＯを使用する核磁気共鳴映像化
体重１ｋｇ当たり５ｍｇのＣＭＲＤ被覆ＵＳＰＩＯ（実施例３１）を投与して直ぐに取ったラットのＭＲＩスキャンを図６Ｂに示す。心臓、大動脈、及び冠状動脈がこの薬剤を使用して容易に映像化されることが判明した。試験物質の投与によって生じたコントラストの大幅な上昇を示すために、薬剤の投与前に取られたラットの映像（図６Ａ）も添付した。
【０１７２】
実施例５６．ブタ中のＣＭＲＤ被覆ＵＳＰＩＯのＭＲＩ
図７は、ブタの心臓及びその周りの動脈、並びに肺及び腎臓の改善されたＭＲＩ視覚化を示す。サンプル（実施例３１）の体重１ｋｇ当たり０．４、０．８、１．６、及び２．２ｍｇの４種の投与量をそれぞれブタに順次的に投与した。各々の投与の後に２０ｍｌの生理的食塩水を投与し、そしてＭＲＩ映像は各々の投与の後に得た。図７Ｂに示す像は、各々の投与の後に得られた像を表すものである。薬剤によって生じたコントラストの大幅な上昇を示すために、ブタの投与前の像（図７Ａ）も添付した。
【０１７３】
低分子量のガドリニウムに基づく造影剤に関連する問題は、それらが血管空間から細胞間空間へ漏れ、ぼんやりとしたバックグラウンドを作り出すことである。このぼんやりとしたバックグラウンドは、単一回の検査中に投与される第２又は第３の造影剤の注入の有効使用を妨げる。そのような血管外への漏れは、カルボキシメチル還元デキストランで被覆されたＵＳＰＩＯについては、ガドリニウム造影剤の粒子のサイズと比較して、粒子のサイズが比較的大きいため、予想されないのかもしれない。
【０１７４】
この予想は、ラットの映像化（実施例５５）によって及びブタの映像化（図７Ｂ）によって得られたデータにおいて確認された。本発明のＣＭＲＤ ＵＳＰＩＯ組成物の使用の後にぼんやりとしたバックグラウンドは観察されなかった。この観察は、追加の投与量の連続的な投与の後、追加の血管の映像化検査の実施を可能にする。静脈内投与時に、本発明の態様であるＣＭＲＤ被覆ＵＳＰＩＯは、塊薬として速やかに動脈、器官、及び静脈に移動し、２０分後血液中において均一な分布を達成した。薬剤の第２の塊薬の投与時に、追加の良好な映像が得られた。第３及び第４の注入が同様な結果をともなって投与された（即ち、良好な映像が得られた）。このようにして、ＣＭＲＤ被覆ＵＳＰＩＯの塊薬注入と一次通過適用のプロセスが示された。さらに、第１の投与後かなり短い時間内の複数回の注入プロトコル（全体のプロトコルは映像化施設への人の被験者による１回の訪問に相当する期間内に行われる）の適用も示された。
【０１７５】
１回の検査中において複数回の塊薬注入を行い得ることの主要な利点は、１回の注入後に生じる可能性のある映像中の欠陥を修正する機会があること、及び１回の検査中に体の複数の部分を映像化する機会があることである。このようにして、より早期の通過からのスキャンとより早期の映像の分析の後短い期間の内に、被験者の体の追加の部分を映像化することができ、その後の造影剤の注入を異なる視界を得るため、又は１つ以上の物理的次元において視界を広げるために使用することができる。例えば、脚のような肢中の凝血塊の位置と大きさの詳細な分析を、第１、第２、及びそれに続く通過の各々において取られた連続する視界を使用して、行うことができる。
【０１７６】
第１の投与の後、本発明の組成物の投与の追加の複数回の通過を達成し、そして追加の循環のＭＲＩデータを得ることができる能力は、本発明の態様である組成物の強力な利点を提供する。ＭＲＩ分析は、過去において、映像化の必要な解剖学的特徴の物理的長さによって、及び所定期間内に単一の検出装置を使用して映像化できる構造の数によって、制約されてきた。
【０１７７】
ブタにおいて得られた結果は、人の被験者においても観察された（実施例５７及び５８）。
【０１７８】
実施例５７．通常の人の被験者へのＣＭＲＤ被覆されたＵＳＰＩＯの静脈内注入
この試験計画は、各々が実施例３１に従って製造されたＣＭＲＤ Ｔ１０被覆されたＵＳＰＩＯの１回分の投与量（増加量；体重１ｋｇ当たり１〜４ｍｇ）を投与された３５人の人間の被験者を使用した。実施例５７及び５８の目的は、この処置の可能性のある副作用に関して被験者を検査すること、ＭＲＩ造影剤としての組成物に関するデータを得ること、及び血液中の組成物の半減期を測定することである。
【０１７９】
最も多い投与量（４ｍｇ／ｋｇ）を含めて、全ての投与量において処置された被験者の中に、組成物の投与に原因がある可能性のある有害な反応は観察されなかった。比較のために述べると、Ｆｅｒｉｄｅｘ Ｉ．Ｖ．（登録商標）の臨床試験において、Ｆｅｒｉｄｅｘ Ｉ．Ｖ．（登録商標）及び同様な映像化製品は有害な結果を最小化し有用なコントラストを得るためにずっと少ない投与量（例えば、体重１ｋｇ当たり０．５６ｍｇ）で投与されるのにもかかわらず、約２〜３％の処置を受けた患者が背中の痛みを報告した。これらのデータは、有効投与量の本発明のＣＭＲＤ被覆ＵＳＰＩＯ粒子が有効投与量の以前に認可を受けた映像化剤であるＦｅｒｉｄｅｘ Ｉ．Ｖ．（登録商標）よりも安全であることを示してる。
【０１８０】
実施例５８．人の被験者中の速やかな映像化速度及び生体分布
実施例３１と同様にして製造されたＣＭＲＤ被覆ＵＳＰＩＯの人の被験者への最初の静脈内塊薬注入は、投与後１２秒以内に循環系の動脈部分の鮮明なＭＲＩをもたらした（図８Ｂ）。さらに１５秒後、ＭＲＩ露出は、器官と静脈の鮮明な像をもたらした。血管系全体にわたる薬剤の平衡は２０分以内に達成された。
【０１８１】
本発明のＣＭＲＤ被覆ＵＳＰＩＯの投与に続く初期の段階において映像化され得る器官は、心臓、動脈、及び静脈を含む。さらに、循環系の比較的大きいこれらの要素に加えて、四肢（指、足指）の細動脈及び細静脈を観察できた。この水準の解像度は、静脈炎の領域の検知と位置測定を含む、四肢内の血液循環における問題の診断への用途を可能にする。容易に映像化されたその他の器官は、脳、腎臓、肝臓、脾臓、及び骨髄を含む。リンパ節は、有効投与量の投与の後数時間までに映像化できた。血液中の薬剤の半減期はおおよそ１０〜１４時間であることが観察された（表１５及び図９を参照のこと）。
【０１８２】
粒子は、最終的には、細網内皮系によって吸収されることによって血液循環から除去された。血管系中に初期の段階において組成物が存在している間、及びまた細網内皮系（ＲＥＳ）中に後の又は血管後の段階において組成物が存在している間、この組成物の細胞間空間への侵入は観察されなかった。従って、その他の組成物、例えば、Ｍａｇｎｅｖｉｓｔ（登録商標）及びＤＯＴＯＲＥＭ（登録商標）のようなガドリニウムに基づくＭＲ造影剤の使用にともなって現れることが判明したぼんやりとしたバックグラウンドは、本明細書の実施例の方法によって合成されたＣＭＲＤ−ＵＳＰＩＯの使用中には避けられる。
【０１８３】
【表１５】
【図面の簡単な説明】
【図１】 実施例５で得られたカルボキシメチル還元デキストラン（ＣＭＲＤ）のフーリエ変換赤外（ＦＴＩＲ）スペクトル分析を示す。
【図２】 実施例３１で得られたＣＭＲＤナトリウム塩で被覆された超微粒な超常磁性の酸化鉄（ＵＳＰＩＯ、米国特許第５，０５５，２８８を参照）のＦＴＩRスペクトル分析を示す。
【図３】 出発物質の還元デキストランとの反応に用いられた臭化酢酸の量ｍｇ／グラム（横座標）の関数として、生成物１グラム当たりのカルボキシメチル基の量（マイクロモル）（縦座標）を表すグラフである。
【図４】 体重１ｋｇ当たり２．２ｍｇの鉄の静脈内投与後、三匹の雄性ラットの血液中でのＣＭＲＤ被覆ＵＳＰＩＯの薬物動態を示す。血液試料（０．２５ｍｌ）は、横座標で示された時間に採取され、緩和時間は、ＢｒｕｃｋｅｒＭｉｎｉｓｐｅｃ分光計で測定された。
【図５】 ラット血液中でのＣＭＲＤ被覆ＵＳＰＩＯの半減期（６７分）を決定するために用いられたグラフを示す。図４のデータは、図５中のグラフを作るために用いられた。６１乃至７５分の半減期の範囲は、９５％の信頼性係数内にある。
【図６】 ラットのＭＲＩ（造影剤の投与前（Ａ）及び投与後（Ｂ）、上が前方部）を示す。投与後の造影像を取る前に、ＣＭＲＤ被覆ＵＳＰＩＯ（体重１ｋｇ当たり５ｍｇの鉄）が大腿静脈に投与された。図は、ＣＭＲＤ被覆ＵＳＰＩＯの投与によって引き起こされた心臓及び周辺の動脈と静脈の高められた視覚化を例証する。映像化は、ジェネラル・エレクトリック社２テルサ磁気共鳴画像化機を用いて行われた。
【図７】 豚のＭＲＩ像（造影剤の投与前（Ａ）及び投与後（Ｂ）、上が前方部）を示す。投与後の造影像を取る前に、ＣＭＲＤ被覆ＵＳＰＩＯ（実施例３１、体重１ｋｇ当たり４ｍｇの鉄）が大腿静脈に投与された。図は、ＣＭＲＤ被覆ＵＳＰＩＯの投与によって引き起こされた心臓及び周辺の動脈と静脈の高められた視覚化を例証する。映像化は、ジーメンス社１．５Ｔ ＭａｇｎａｔｏｍＶｉｓｏｎ磁気共鳴画像化機を用いて行われた。
【図８】 造影画像剤の投与前（Ａ）及び投与後（Ｂ）の、正常な人被験体の前方部のＭＲＩ像を示す。造影化後の画像を取る前に、ＣＭＲＤ被覆ＵＳＰＩＯ（実施例３１、体重１ｋｇ当たり４ｍｇの鉄）が腕の静脈に塊薬として投与された。造影剤の投与後１５乃至３０分間、映像化が行われた。画像は、心臓及び周辺の動脈と静脈の高められた視覚化を例証する。
【図９】 人における画像化剤の血液クリアラス速度を示す。血液試料を取る前に、ＣＭＲＤ被覆ＵＳＰＩＯ（体重１ｋｇ当たり４ｍｇの鉄）が腕の静脈に塊薬として投与された。ＣＭＲＤ被覆ＵＳＰＩＯの血中濃度を決定するために、１／Ｔ２緩和について試料が分析された。グラフは、時間（横座標）の関数としてＣＭＲＤ被覆ＵＳＰＩＯの濃度（縦座標）を示す。
技術分野
本技術分野は、カルボキシメチル還元多糖である組成物、血漿増量剤としての使用のため及び酸化鉄粒子の被覆のための方法、還元多糖又は誘導体化された還元多糖で被覆された超常磁性及び非超常磁性の酸化鉄から成る組成物、及びＭＲＩの造影剤及び造血薬としての使用の方法に関する。
【０００２】
背景
磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）の発明以来、造影剤と呼ばれる注射可能な化学物質の対応する技術が発達した。造影剤は、診断の目的のためにより有用なＭＲＩ像を生じるのを助けるように、医療業務において重要な役割を演じる。特に、２種類の造影剤が開発され、臨床業務で採用された。これらは、Ｍａｇｎａｖｉｓｔ（登録商標）のような低分子量のガドリニウム錯体と、ＦｅｒｉｄｅｘＩ．Ｖ．（登録商標）及びＣｏｍｂｉｄｅｘ（登録商標）のようなコロイド状酸化鉄である。これら２種類の薬剤何れも理想的ではない。これらの薬剤が直面した問題を表１に示し、それらは、成分の費用、合成の非効率、最後の滅菌（オートクレーブ処理）の間の被覆剤の消失、画像化の目的での器官の取り込み量の狭い範囲、毒性の副作用、第一の段階又は平衡投与の何れかへの使用の制限、及びここで記載されたその他のものを含む。これらの問題を克服し、これら２種類の造影剤の特性を兼ね備える薬剤が大いに望まれている。
【０００３】
【表１】
概要
本発明の１つの態様は、哺乳類の被験体への投与のための酸化鉄錯体を提供する方法であって、該方法は、還元多糖の酸化鉄錯体を製造し、及び該錯体をオートクレーブ処理で滅菌することを含む。一般的に、還元多糖は、還元されたグルコースのポリマーである。還元されたグルコースのポリマーの一例は、還元デキストランである。還元多糖は、硼水素化塩から成る群から選択される試薬又は水素化触媒存在下での水素との多糖の反応を通して製造される。本方法のさらなる側面においては、酸化鉄は超常磁性である。
【０００５】
本発明のもう１つの好ましい態様は、哺乳類の被験体への投与のための酸化鉄錯体を提供する方法であって、該方法は、誘導体化された還元多糖の酸化鉄錯体を製造し、及び該錯体をオートクレーブ処理で滅菌することを含む。この方法によると、錯体の製造は、カルボキシアルキル化（例えば、カルボキシアルキル化はカルボキシメチル化である）によって還元多糖を誘導体化することを含むことができる。更に、この方法によると、還元多糖は、還元デキストランであり得る。誘導体化された還元多糖は、ナトリウム塩として単離することができ、１６５０乃至１８００ｃｍ−１の領域に赤外吸収ピークを含まない。本方法の１つの側面において、誘導体化された還元多糖の製造は、約５０℃未満の温度で達成される。本方法のもう１つの側面においては、誘導体化された還元多糖の製造は、約４０℃未満の温度で達成される。本方法の更なる側面においては、酸化鉄は超常磁性である。
【０００６】
更にもう１つの態様において、本発明は、還元多糖で被覆された酸化鉄錯体を調合する方法を提供する。この組成物は薬の用途のためであり、該組成物は、未処理多糖で被覆された類似の酸化鉄触媒に比較して減少した毒性を有する。このような酸化鉄錯体を調合する方法は、還元多糖の酸化鉄錯体を製造すること、及び該錯体をオートクレーブ処理で滅菌すること、を含む。該調合物は、多糖を、硼水素化塩から成る群から選択される還元剤の1つ又は水素化触媒の存在下での水素と反応させることにより製造される多糖を提供する。還元多糖の酸化鉄錯体はこのような減少した毒性を有する。本方法の更なる側面においては、酸化鉄は超常磁性である。
【０００７】
更にもう1つの態様において、本発明は、還元された誘導体化された多糖で被覆された酸化鉄錯体を調合する方法を提供する。この組成物は薬の用途のためであり、該組成物は、未処理の誘導体化された多糖で被覆された類似の酸化鉄錯体に比較して減少した毒性を有する。このような酸化鉄錯体を調合する方法は、還元された誘導体化された多糖の酸化鉄錯体を製造すること、及び該錯体をオートクレーブ処理で滅菌すること、を含む。本方法によると、錯体を製造することは、還元多糖をカルボキシアルキル化（例えば、カルボキシアルキル化はカルボキシメチル化である）により誘導体化することを含むことができる。更に、本方法によると、還元多糖は、還元デキストランであり得る。誘導体化された還元多糖は、ナトリウム塩として単離され得、１６５０乃至１８００ｃｍ−１の領域内に赤外吸収ピークを含まない。本方法の１つの側面において、誘導体化された還元多糖の製造は、約５０℃未満の温度で達成される。本方法のもう１つの側面において、誘導体化された還元多糖の製造は、約４０℃未満の温度で達成される。本方法の更なる側面において、酸化鉄は超常磁性である。
【０００８】
本発明のもう１つの態様は、造影剤にＴ１シーケンス（ｓｅｑｕｅｎｃｅ）のシグナル増加及びＴ２シーケンスのシグナル減少を与えるＴ１及びＴ２緩和特性を有する還元された誘導体化された多糖の酸化鉄錯体を提供する。本態様の更なる側面は、還元された誘導体化された多糖の酸化鉄は、１回の検査において連続画像のため複数回投与され得る。本薬剤の更にもう１つの側面は、血管系、肝臓、脾臓、骨髄、及びリンパ節を含む複数の器官系を映すのに用いられ得る。
【０００９】
本発明のもう１つの態様は、静注用鉄補給剤として使用するために、還元多糖の酸化鉄錯体を提供する。
【００１０】
本発明のもう１つの態様は、静注用鉄補給剤として使用するための、還元された誘導体化された多糖の酸化鉄錯体を提供する。
【００１１】
また、更なる態様において、本発明は、哺乳類の被験体にオートクレーブ処理した還元多糖の酸化鉄錯体を投与する改良された方法を提供する。改良された投与方法は、１５ｍｌ以下の容量のオートクレーブ処理した還元多糖の酸化鉄錯体の注射を含む。本態様のもう１つの側面において、注射される容積は塊薬（ｂｏｌｕｓ）として注射される。本方法の更なる側面において、酸化鉄は超常磁性である。本態様の更なる側面において、注射される容積は、改良される画質を与える。
【００１２】
また、更なる態様において、本発明は、哺乳類の被験体にオートクレーブ処理した誘導体化された還元多糖の酸化鉄錯体を投与する改良された方法を提供する。改良された投与方法は、１５ｍｌ以下の容量のオートクレーブ処理した還元された誘導体化された多糖の酸化鉄錯体の注射を含む。本態様のもう１つの側面において、注射される容積は塊薬として注射される。本方法の更なる側面において、酸化鉄は超常磁性である。本態様の更なる側面において、注射される容積は、改良される画質を与える。
【００１３】
本発明の１つの態様は、該組成物が減少した毒性を与えるように、哺乳類の被験体に還元多糖の酸化鉄錯体を投与する改良された方法を提供し、ここで改良は、組成物の調合において還元多糖を利用することを含む。本態様の更なる側面において、酸化鉄は超常磁性である。
【００１４】
本発明の１つの態様は、該組成物が減少した毒性を与えるように、哺乳類の被験体に還元された誘導体化された多糖の酸化鉄錯体を投与する改良された方法を提供し、ここで改良は、組成物の調合において還元された誘導体化された多糖を利用することを含む。本態様の更なる側面において、酸化鉄は超常磁性である。
【００１５】
本発明の１つの態様は、還元多糖の酸化鉄錯体を提供し、ここで還元多糖は誘導体化され、例えば、還元された誘導体化された多糖はカルボキシアルキル多糖である。カルボキシアルキルは、カルボキシメチル、カルボキシエチル、及びカルボキシプロピルから成る群から選択される。更に、還元多糖は還元デキストランであり得、例えば、還元デキストランは還元カルボキシメチルデキストランであり得る。本発明の本態様の更なる側面は、還元デキストランの誘導体化の濃度は、多糖１ｇ当たりカルボキシル基が少なくとも７５０マイクロモルで、１５００マイクロモル未満であり、ここで、該組成物は、誘導体化の程度がより低い組成物に比べ減少した毒性を有する。
【００１６】
本発明の１つの態様は、少なくとも約１００℃の温度で安定であるような還元多糖の酸化鉄錯体を与える。好ましい態様において、そのような錯体は約１２１℃の温度で安定である。還元多糖の酸化鉄錯体のなお一層好ましい側面において、そのような錯体は、該錯体を滅菌するのに十分な時間、少なくとも１２１℃の温度で安定である。本態様の更なる側面において、酸化鉄は超常磁性である。
【００１７】
本発明の態様は、少なくとも約１００℃の温度で安定であるような還元された誘導体化された多糖の酸化鉄錯体を与える。好ましい態様において、そのような錯体は約１２１℃の温度で安定である。還元多糖の酸化鉄錯体のなお一層好ましい側面において、そのような錯体は、該錯体を滅菌するのに十分な時間、少なくとも１２１℃の温度で安定である。本態様の更なる側面において、酸化鉄は超常磁性である。
【００１８】
本発明の好ましい態様は、対応する未処理デキストランの酸化鉄に比べて増大したｐＨ安定性を有する還元多糖の酸化鉄錯体を、薬の用途のために配合する方法であり、該方法は、デキストランを与えること、及びデキストランを硼水素化塩又は水素化触媒の存在下で水素と反応させ、還元デキストランを鉄塩と反応させて安定なｐＨを有する調合物を与えること、を含む。
【００１９】
本発明の好ましい態様は、対応する未処理デキストランの酸化鉄に比べて増大したｐＨ安定性を有する還元された誘導体化された多糖の酸化鉄錯体を、薬の用途のために配合する方法であり、該方法は、デキストランを与えること、及びデキストランを硼水素化塩又は水素化触媒の存在下で水素と反応させ、還元デキストランを鉄塩と反応させて安定なｐＨを有する調合物を与えること、を含む。
【００２０】
もう１つの態様において、本発明は、薬の用途のための還元された誘導体化されたデキストラン組成物（ここで、該組成物は、未処理デキストランに比べ減少した毒性を有する）を配合する方法を提供し、還元された誘導体化された多糖を製造すること、及び生成物をオートクレーブ処理で滅菌することを含む。この方法によると、還元多糖は、未処理多糖を、硼水素化塩から成る群から選択されるいくつかの還元剤の１つ又は水素化触媒の存在下の水素と反応させることにより得られる。本態様の好ましい側面において、多糖はデキストランである。該組成物を製造することは、カルボキシアルキル化（例えば、ここではカルボキシアルキル化はカルボキシメチル化である）によって還元多糖を誘導体化することを含むことができる。更に、本方法によると、還元多糖は還元デキストランであり得る。誘導された還元多糖は、ナトリウム塩として単離され得、１６５０乃至１８００ｃｍ−１の領域内に赤外吸収ピークを含まない。本方法の１つの側面において、誘導体化された還元多糖の製造は、約５０℃未満の温度で達成される。本方法のもう１つの側面において、誘導体化された還元多糖の製造は、約４０℃未満の温度で達成される。
【００２１】
本発明の一態様は、該組成物が減少した毒性を与えるように還元された誘導体化された多糖を、哺乳類の被験体に投与する改良された方法を提供し、ここで該改良は組成物の調合に還元多糖を利用することを含む。
【００２２】
本発明の一態様は、還元多糖を提供し、ここで還元多糖は誘導体化され、例えば、還元された誘導体化された多糖はカルボキシアルキル多糖である。カルボキシアルキルは、カルボキシメチル、カルボキシエチル、及びカルボキシプロピルから成る群から選択される。更に、還元多糖は、還元デキストランであり得る。本発明の本態様の更なる側面は、還元デキストランの誘導体化の濃度が、多糖１ｇ当たりカルボキシル基が少なくとも７５０マイクロモルであり、ここで、該組成物は、誘導体化のレベルがより低い組成物に比べ減少した毒性を有することである。
【００２３】
本発明のもう１つの態様は、薬の用途のための、未処理デキストランに比べ減少した毒性を有するデキストラン組成物を調合する方法であり、該方法は、デキストランを提供すること、及び提供されたデキストランを、硼水素化塩又は水素化触媒の存在下での水素と反応させ、それに続いてカルボキシメチル化をすること、減少した毒性を有する還元されたカルボキシメチル化されたデキストラン、を含む。
【００２４】
本発明のもう１つの態様は、該組成物が減少した毒性を与えるように該組成物がデキストランを含むという種類の多糖組成物を、哺乳類の被験体に投与する改良された方法であり、ここで該改良は、配合物中においてデキストランの代わりに還元されたカルボキシメチル化されたデキストランを利用することを含む。もう１つの側面において、本発明の一態様は、該組成物が減少した毒性を与えるように多糖を哺乳類の被験体に投与する改良された方法であり、ここで該改良は、該組成物の調合において還元されたカルボキシメチル化された多糖を利用することを含む。
【００２５】
本発明の一態様は、還元された誘導体化されたデキストランの血液増量剤としての使用の方法を提供する。
【００２６】
特定の態様の詳細な説明
表１は、前に記載したＭＲＩ造影剤の２つの類の特徴を要約し、そしてそれらの特徴の理想的な造影剤の特徴に対する比較を示す。本発明の薬剤は、本明細書中に示されているように、理想的な特徴を具体化する。
【００２７】
驚くべきことに、本明細書中に示されているような望ましい特性を有する薬剤のような、多糖還元デキストラン及び還元デキストラン誘導体で被覆された極小超常磁性酸化鉄（ｕｌｔｒａｓｍａｌｌ ｓｕｐｅｒｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ ｉｒｏｎ ｏｘｉｄｅ）（ＵＳＰＩＯ）の製剤の開発及び合成は、１つの成分、即ち、デキストランＴ１０、の化学的性質の変化から導かれる。この変化は、アルコールへのその合成において使用される多糖の末端アルデヒド基のアルコールへの還元を含んだ（図解１）。図解１は、硼水素化ナトリウムによる処理時のデキストランのような多糖における化学的変化を図で説明する。多糖のヘミアセタール形態（構造１）は、多糖のアルデヒド形態（構造２）と平衡状態にある。構造２は平衡混合物の０．０１％未満を構成する（Ｂｒｕｃｋｅｒ，Ｇ．（１９７４）Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ： Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ， Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ．， Ｔａｎｋｏｎｙｋｉａｄｏ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｕｄａｐｅｓｔ， ｐ．９９１）。構造２の硼水素化ナトリウムによる処理は、多糖の線状ポリオール形態（構造３）への非可逆的な転化をもたらす。構造１と２の間の動的平衡は、硼水素化ナトリウムで処理されたとき、線状ポリオール（構造３）への完全な転化を可能にする。
【００２８】
図式１：
【化１】
デキストラン被覆された超常磁性酸化鉄粒子は、肝臓及びリンパの像の画質を高めるそれらの能力のために、核磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）造影剤として特別の重要性を有する。Ｆｅｒｉｄｅｘ Ｉ．Ｖ．（登録商標）（マサチューセッツ州ケンブリッジのＡｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．）は、デキストラン被覆された超常磁性酸化鉄ＭＲＩ造影剤であり、人において使用することが認可されている。Ｃｏｍｂｉｄｅｘ（登録商標）（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．）は、デキストラン被覆された極小超常磁性酸化鉄（ＵＳＰＩＯ）であり、これは肝臓の映像化及びリンパの映像化に対するフェーズＩＩＩの臨床試験を終了している。Ｃｏｍｂｉｄｅｘ（登録商標）はＦｅｒｉｄｅｘ Ｉ．Ｖ．（登録商標）（６０ｎｍ）よりも小さい平均直径（２０ｎｍ）を有し、このことはＣｏｍｂｉｄｅｘ（登録商標）に人体中における異なる生体分布（ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を与える。Ｃｏｍｂｉｄｅｘ（登録商標）は、デキストラン、塩化第二鉄、及び塩化第一鉄の溶液への塩基の添加によって製造される。この合成プロセスは、成分を組み合わせること、加熱すること、及び限外濾過によって精製することを含む。しかしながら、反応中の粒子に付加されるデキストランの収率は効率的ではない。薬品グレードのデキストランは、Ｃｏｍｂｉｄｅｘ（登録商標）の合成の最も高価な成分である。Ｃｏｍｂｉｄｅｘ（登録商標）の合成におけるデキストランのより効率的な使用が、製造コストを下げるために望ましい。
【００３０】
最終的滅菌（オートクレーブ処理）は注入用の薬剤を滅菌するための好ましい方法である。しかしながら、ＭＲＩ造影剤として使用される多くの超常磁性酸化鉄コロイドは、これらのコロイドの生体分布と除去に影響するポリマーの被覆（ｃｏａｔｉｎｇ）及び外被（ｃｏｖｅｒｉｎｇ）を使用して合成される。オートクレーブ処理プロセスの間に熱にさらされると、ポリマー被覆は酸化鉄の芯から分離する可能性がある。酸化鉄からのポリマーの分離の機能的な帰結は、凝集、生体分布の変化（プラズマ半減期の変化）、及び毒性の変化（有害な事象の潜在的増加）のような材料の物理的変化である。例えば、溶液のｐＨの実質的な低下が、鉄デキストラン粒子のオートクレーブ処理後に検出される可能性があり、ｐＨはその後の貯蔵時に低下し続ける。
【００３１】
熱応力に対する抵抗性を付与することから成るこの問題の幾つかの解決方法が記載されている。Ｐａｌｍａｃｃｉらの米国特許第５，２６２，１７６号（引用によって本明細書中に組み入れられている）は、オートクレーブ処理の前に酸化鉄粒子上の外被を安定化させるために、架橋されたデキストランを使用した。架橋プロセスは、エピクロロヒドリン及びエピブロモヒドリンのような有毒の薬剤を使用し、これらは架橋反応後にコロイドから除去されなければならない。
【００３２】
被覆の分離に影響しない熱応力によって引き起こされるコロイドの凝集を防ぐための方法も記載されている。これらの方法は、一般的に、オートクレーブ処理中の添加剤の使用を含む。Ｇｒｏｍａｎらの米国特許第４，８２７，９４５号及びＬｅｗｉｓらの米国特許第５，０５５，２８８号（両方の特許が引用によって本明細書中に組み入れられている）は、被覆が分離するとき粒子の凝集を防ぐためにシトレートを使用する。しかしながら、熱と組み合わされた高濃度のシトレートの使用は毒性を生じる可能性がある。Ｇｒｏｍａｎらの米国特許第５，１０２，６５２号（引用によって本明細書中に組み入れられている）は、オートクレーブ処理中の凝集を防ぐためにマンニトールのような低分子量炭水化物を使用する。これらの添加剤は製品の製造のコストと複雑さを増加させ、しかも鉄粒子からのポリマーの分離の問題を解決しない。
【００３３】
Ｊｏｓｅｐｈｓｏｎらの米国特許第５，１６０，７２６号（引用によって本明細書中に組み入れられている）は、コロイドを滅菌するために熱よりもむしろフィルター滅菌を使用することによって、被覆への熱応力を避ける。フィルター滅菌は、滅菌プロセスと容器の封止の両方を微生物を含まない環境中で行わなければならないため、費用がかかる。さらに、フィルター滅菌はオートクレーブ処理のプロセスよりも失敗の率が高く、これは完全に微生物を含まない濾過工程のための環境を得ることが不可能であることを反映している。
【００３４】
Ｍｕｒａｎｏらの米国特許第５，２０４，４５７号は、延長された期間８０℃まで改善された安定性を有するカルボキシメチル−デキストラン被覆された粒子を記載しているが、オートクレーブ処理による最終的滅菌の使用を教示していない。Ｈａｓｅｇａｗａら（Ｊａｐａｎ Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｐｈｙｓ．， Ｐａｒｔ Ｉ， ３７（３Ａ）：１０２９−１０３２，１９９８）は、８０℃において熱安定性を有するカルボキシメチルデキストラン被覆された鉄粒子を記載しているが、カルボキシメチル還元デキストランで被覆された粒子の使用も、オートクレーブ処理による最終的滅菌の使用も教示していない。
【００３５】
磁気共鳴画像化剤（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）は、主に水のプロトンについて、通常緩和時間に影響することによって作用する。２つのタイプの緩和が存在し、１つはスピン−スピン又はＴ１緩和として知られ、そして第２のものはスピン−格子又はＴ２緩和として知られている。Ｔ１緩和は、一般的に、シグナルの増加によって生じた像を明るくする。Ｔ１プロセスは、脈管系の映像化において最も有用である。Ｔ２緩和は、一般的に、シグナルの減少によって生じた像を暗くする。Ｔ２プロセスは、腫瘍のような病巣を含む肝臓、脾臓、又はリンパ節のような器官の映像化において最も有用である。全ての造影剤がＴ１及びＴ２特性の両方を有するが、Ｔ１又はＴ２緩和のいずれかが特定の造影剤の優勢な緩和特性を特徴付けることができる。低分子量のガドリニウムに基づく造影剤はＴ１剤であり、そして脳卒中及び動脈瘤のような血管に関係した医学上の問題及び脳の映像化において主要な用途を有する。酸化鉄に基づくコロイド状造影剤はＴ２剤であり、肝臓及びリンパ節の腫瘍（前立腺及び胸部のガン）の映像化において主要な用途を有する。Ｔ１及びＴ２特性の両方を有する造影剤が望ましいだろう。そのような造影剤の使用は、Ｔ１又はＴ２造影剤のいずれかの使用を必要する場合と比較して、（i）全ての用途に対して単一の薬剤を提供し、そして薬剤室の在庫品を簡単化し、（ii） ＭＲＩ一式における映像化を簡単化し、そして（iii） １回の検査の間に一人の患者の複数の医学上の問題を同時に検査できることにより患者の看護を改善するだろう。
【００３６】
デキストランは、人の静脈内に（ｉ．ｖ．）投与されたとき、致命的なアナフィラキシー反応を引き出すことがあり得る（Ｂｒｉｓｅｉｄ， Ｇ．ら，Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍｃｏｌ． ｅｔ Ｔｏｘｉｃｏｌ．， １９８０，４７：１１９−１２６；Ｈｅｄｉｎ， Ｈ．ら，Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ． Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １９９７：１１３：３５８−３５９）。関連する有害な反応が、磁性デキストラン被覆酸化鉄コロイドの投与についても観察された。造血剤として、特に最終段階の腎臓の透析患者用のエリトロポエチン治療に対する付加物として有用性を有する非磁性デキストラン被覆酸化鉄コロイドも同様な副作用を有する可能性がある。
【００３７】
脈管系内の解剖学的特徴に関する情報は、２つの方法で造影剤を使用して得ることができる。造影剤が塊薬（ｂｏｌｕｓ）として最初に投与されるとき、造影剤は初めに細かく分岐した管を比較的まとまった塊として通過する。所望の解剖学的特徴の映像化の時間を塊薬がその特徴を通過する時間に調整することによって、有用な情報を提供することができる。造影剤の使用のこの技術は、一次通過映像化（ｆｉｒｓｔ ｐａｓｓ ｉｍａｇｉｎｇ）と呼ばれる。後に、塊薬は混合によって希釈され、そして脈管系中において平衡濃度に達する。特定環境下において、この平衡又は定常状態は有用な情報を提供することができる。映像化は、初期の段階、即ち、造影剤の注入後数分以内（「一次通過」）、及び後の段階、即ち、造影剤の注入後約１０分から（平衡段階）、において行うことができる。ガドリニウム剤は、脈管系から組織の細胞間空間への拡散が容易であるため、一次通過映像化に対してのみ適している。前述のコロイド状酸化鉄は、延長された期間にわたって希釈されて投与される必要があるため、平衡に対して有用である。コロイド状酸化鉄は細胞間空間中に漏れず、数時間にわたって脈管系中に残ることができる。一次通過映像化及び平衡映像化の両方を行う機会を提供する造影剤が望ましいだろう。
【００３８】
「一次通過」映像化用の造影剤の医療セッティングにおける投与中に、映像化のタイミングと造影剤の「一次通過」の通過と映像化のタイミングは一致しないかもしれない。有用な像が得られなかった場合、もう１つの別の「一次通過」像を得るために造影剤の２回目の投与が望ましくなる。その他の場合において、放射線医学者は、関芯のある複数の部位の各々において「一次通過」像を得るために、造影剤の複数回の投与計画を必要として、患者において幾つかの体積を試験することが有用であることを見出す。ガドリニウム造影剤を使用した場合、この複数回投与「一次通過」の適用は可能ではない。なぜならば、ガドリニウムは血管空間から漏れ出して、関芯のある血管のまわりにぼやけたバックグラウンドを形成するからである。現在の酸化鉄コロイドに基づく造影剤は適していない。なぜならば、それらは塊薬として投与されずに、長時間にわたって希釈溶液として投与され、「一次通過」の用途を避けているからである。
【００３９】
ガン患者において腫瘍の進行の診断は、病気の段階を特徴付けるため、及び処置の決定のために重要である。コストと患者の不快感を最小化するために、ＭＲＩ検査において、病気によって影響を受けている可能性のある複数の器官系の評価を可能にする単一回分の造影剤の投与が望ましい。例えば、主に胸部のガンにおいては、胸部中の腫瘍の状態、及び肝臓、脾臓、骨髄、及びリンパ節を含む複数の転移部位における腫瘍の状態を評価するのが望ましい。ガドリニウムに基づく造影剤の投与は、それらの人体中における短い半減期、それらの脈管系中への漏れ、及び関芯のある器官内にそれらが集中できないことのために、この要件を満たすことができない。Ｃｏｍｂｉｄｅｘ（登録商標）のような酸化鉄コロイドに基づく造影剤はこの多様な機能において役立つことができるが、もう１つの酸化鉄コロイド造影剤であるＦｅｒｉｄｅｘ Ｉ．Ｖ．（登録商標）は肝臓と脾臓の映像化に限定される。
【００４０】
小体積（５ｍｌ未満）の造影剤の投与が望ましい。なぜならば、小体積の投与は一次通過映像化から得られる分解能を改善し、注入時間と患者の不快感を最小化するからである。ガドリニウムに基づく造影剤は、これらの薬剤の溶解度と効能によって生じる制約のために、約３０ｍｌの体積で投与される。現在、酸化鉄に基づく造影剤は、大体積（５０〜１００ｍｌ）の希釈溶液として延長された期間（３０分間）にわたって投与される。これらの制約は、酸化鉄に基づく薬剤の急激で濃縮された投与に関係する安全上の問題に起因する。塊薬注入は、一次通過映像化を可能にし、そして患者とヘルスケアプロバイダーとの間の接触時間を短縮する点で望ましい。さらに、塊薬注入は、被験者が検査中にＭＲＩ装置中に入っている間に、施術者が造影剤を投与することを可能にし、これによって装置の映像化時間の効率的な使用を最適化する。ガドリニウムに基づく造影剤は塊薬として投与できる。
【００４１】
ガドリニウムに基づく造影剤はキレート化分子とガドリニウムカチオンとから成る。ガドリニウムは毒性の元素であり、毒性を防ぐために体から排出されなければならない。コロイド状酸化鉄は体から排出されないが、肝臓及びその他の器官中で、ヘモグロビン中の鉄のような、代謝可能な鉄へ処理される。従って、本発明の組成物は、貧血症に悩んでいる患者のための鉄補給物として役立つことができ、そしてエリトロポエチンによる処置を受けている患者に対して特に有用である。
【００４２】
本発明の１つの態様は、材料が熱応力にさらされたときに被覆が酸化鉄から分離するのを軽減するように水溶性多糖被覆と結合した酸化鉄のコロイドを合成する方法を提供する。
【００４３】
本明細書及び添付の請求の範囲中において使用されるとき、「熱応力」は、中性のｐＨにおいて約３０分間約１２１℃以上にコロイドを加熱することとして、又は注入可能な薬剤をオートクレーブ処理する（又は最終的に滅菌する）ために本技術分野においてよく知られている時間、温度、及びｐＨのその他の組み合わせとして定義される。
【００４４】
本発明の１つの態様である方法は、多糖を硼水素化塩のような還元剤又はＰｔ又はＰｄのような適当な水素化触媒の存在下に水素で処理して還元された多糖を得る工程を含み、それによって末端の還元性の糖が還元されて開鎖多価アルコール構造を生じる。還元された多糖は、アラビノガラクタン、澱粉、セルロース、ヒドロキシエチル澱粉（ＨＥＳ）、イヌリン、又はデキストランでよい。さらに、多糖は粒子形成の前にさらに官能化されてもよい。この方法は、さらに、還元された多糖を第二鉄塩、第一鉄塩、又は第二鉄塩と第一鉄塩の混合物を含む群から選択される酸性溶液中の鉄塩と混合すること、溶液を冷却すること、溶液を塩基で中和すること、及び被覆された酸化鉄コロイドを収集することを含む。
【００４５】
本発明のさらなる態様によれば、コロイドを中和する工程のために使用できる塩基は、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、そしてより好ましくは水酸化アンモニウムである。本発明のさらなる態様においては、多糖誘導体は還元されたデキストランであり、そして鉄塩は第二及び第一鉄塩でよく、これらは最終的滅菌中の熱応力下に酸化鉄の芯から分離しない水溶性被覆を有する超常磁性酸化鉄コロイドを製造する。
【００４６】
本発明のもう１つの態様において、第二鉄塩のみが使用され、非超常磁性粒子を生成する。
【００４７】
もう１つの態様において、多糖を酸化鉄ゾル（液体中のコロイド分散体）に添加し、ｐＨを６〜８に調整し、そして被覆された酸化鉄コロイドを収集することによって、被覆されたコロイドを調製することができる。
【００４８】
本明細書及び添付の請求の範囲中において使用される「コロイド」という用語は、約２５０ｎｍ未満のサイズを有するマクロ分子又は粒子を包含するものである。本発明の酸化鉄多糖コロイドは、前に記載された材料と比較して、実質的に改善された物理的特性と製造性を有する。改善された物理的特性は、コロイドを１２１℃の温度に３０分間さらすことによって測定される、コロイドの熱応力に抵抗する能力において明白である。本発明に従って製造されたコロイド粒子は、応力下に多糖の分離のより少ない証拠しか示さず、コロイド状のままであり、そして容易に検知可能な程度のサイズの変化を示さない。不安定な多糖被覆を有するコロイドの例はＣｏｍｂｉｄｅｘ（登録商標）を含み、これは、熱応力にさらされたとき、そのデキストラン被覆の４３％を失い、粒子の直径サイズが２１ｎｍから５８７ｎｍまで増加し、材料のかなりの凝集が目視による分析時に観察された。米国特許第４，７７０，１８３号に従って調製された、もう１つの超常磁性酸化鉄デキストランコロイドであるＦｅｒｉｄｅｘ（登録商標）も、１２１℃でわずか３０分間の熱処理後に、熱処理されたコロイドが０．８μｍの細孔サイズを有するフィルターを通過できないことによって示されるように、粒度の増加を示した。
【００４９】
製造中に、本発明の１つの態様である方法は、典型的には、非還元多糖を使用する従来の製造において必要な量と比較して十分の一以下の量の多糖しか使用せず、本発明の方法の改善された効率によりかなりの原料コストの節約をもたらす。
【００５０】
多糖誘導体濃度、塩基濃度、及び／又はＦｅ（ＩＩＩ）／Ｆｅ（ＩＩ）濃度のような要素の変更によって、異なる磁化率及びサイズを有するコロイドを製造することができる。Ｆｅ（ＩＩＩ）／Ｆｅ（ＩＩ）比率の変更は粒度を変え、そして磁化率を変える。より高い比率（例えば、２．０モル／モル）は磁化率を低下させる傾向があり、一方より低い比率（１．５モル／モル未満）は粒度を増加させる傾向がある。
【００５１】
この方法は、多糖のタイプを変えることによって、そして合成後に粒子をさらに誘導体化することによって、異なる生物学的特性を有するコロイドを生成するように調整することができる。
【００５２】
本発明の１つの態様であるコロイドは、核磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）用の造影剤として、又は細胞の磁気分別、免疫アッセイ、磁気により目標に向けられる薬品の供給において、及び治療目的の注入可能な鉄補給物として使用することができる。これらのコロイドは非経口的投与に特に適している。なぜならば、最終の滅菌が典型的にはオートクレーブ処理（これはバクテリアの胞子、及びウイルスを含む全ての細胞状生命形態の生存能力を除去するので好ましい方法である）であるからである。従来のコロイドの製造方法は、オートクレーブ処理プロセス中に安定剤としてシトレート又は低分子量多糖のような添加物の添加を必要とした（米国特許第４，８２７，９４５号及び米国特許第５，１０２，６５２号を参照のこと）か、又はフィルター滅菌の使用によって熱応力を完全に避けた（米国特許第５，１５０，７２６号を参照のこと）。従って、コロイドの合成方法である本発明の態様、及びコロイド組成物を含む本発明の態様は、有意に改善されたＭＲＩ造影剤、及び鉄補給物である造血剤としての有用性を提供する。従来技術に対するこれらの薬剤において提供される改良点は、本明細書中の実施例において示される以下の事実中に見出される：本発明の態様である薬剤がオートクレーブ処理によって加熱滅菌され、そして従って環境温度での長期間の貯蔵に対して最適化されていること；これらの薬剤が滅菌又は貯蔵プロセス中に安定性を維持するための添加剤の添加を必要としないこと；これらの薬剤が人を含む哺乳類に対して非毒性であること；映像化のために使用される薬剤の有効投与量が、本技術分野において記載された薬剤よりも少ない量であること；及び投与後の薬物動態が、診療所への１回の訪問と映像装置の１回の使用中に追加の像を得るために、最初の投与分の投与後の短い間隔の後に投与される繰り返しの継続的な投与分を使用できるようなものであること。
【００５３】
デキストラン及びその誘導体の場合、この方法によって調製された配合物は、ラットモデルを使用して得られたデータによって、及び人間の被験者における臨床試験において示されているように、哺乳類における免疫反応が比較的小さい。デキストラン及びデキストラン誘導体で被覆された鉄粒子は、３つの哺乳類種、ラット、ブタ、及び人間において、心臓、肺、腎臓、及びその他の器官及び系の映像化を改善した。デキストラン及びデキストラン誘導体で被覆された鉄粒子は、また、透析患者、ガン患者、胃腸炎患者、及びエリトロポエチンの摂取者のような、慢性的に鉄の不足している患者の群に対して、真の経口鉄補給剤よりもより効率的に吸収される形態の鉄を供給するために、造血剤としても使用することができる。誘導体化された還元デキストランは、また、血漿増量剤としても使用することができ、これは、血液及び血液画分とは異なり、免疫学的にクロスマッチさせる必要がなく、そして人の血清アルブミン製剤と異なり、肝炎、ＣＭＶ及びＨＩＶの種、スポンジ状（ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ）脳炎、及びその他の伝染性の作用物を含むウイルスを破壊するように滅菌することができる。本発明の血漿増量剤は冷凍したり光や熱から遠ざけて貯蔵する必要がなく、従って、熱帯性気候においてさえ、外傷のような血液の損失によるショックの治療のような、緊急の医療的状況において有利である。
【００５４】
実施例１、２、及び３は、それぞれタイプＴ１、Ｔ５、及びＴ１０の還元デキストランを製造する方法を示す。実施例４は、還元プルランの製造を記載する。
【００５５】
実施例５〜９は、未処理デキストランＴ１０からの、様々な程度のカルボキシメチル化を有するカルボキシメチル還元デキストランＴ１０の合成を記載する（表２）。
【００５６】
実施例１０〜１５は、還元デキストランＴ１０から出発して、様々な程度のカルボキシメチル化を有するカルボキシメチル還元デキストランＴ１０の合成を記載する（表３）。
【００５７】
実施例１６〜１８は、未処理デキストランからの、カルボキシメチルデキストランＴ１０、Ｔ４０、及びＴ７０の合成を記載する。
【００５８】
実施例１９〜２６は、還元デキストラン及び未処理デキストランで被覆された酸化鉄の製造を記載する。これらの実施例中の反応の条件は、還元多糖又は非還元多糖のいずれかで被覆されたＵＳＰＩＯを製造するように選択された。未処理デキストラン酸化鉄製剤用の反応条件は、粒子の被覆における各々のデキストランの有効性の比較を可能にするために、同じ分子量の還元デキストラン製剤用のものと同じであった。（これらの実施例中において製造された）未処理多糖と比較された還元多糖を使用して得られた酸化鉄製剤の平均体積直径（ＭＶＤ）及び磁化率を表４中にまとめる。
【００５９】
実施例２７〜２９は、３０ｎｍ未満の粒子直径を有する酸化鉄コロイドを得るための、未処理Ｔ１、Ｔ５、及びＴ１０デキストランを使用するＵＳＰＩＯの製造手順を記載する。酸化鉄コロイドの合成と特性における未処理デキストラン（実施例２７〜２９）とそれらの各々の還元デキストラン（実施例１９、２１、及び２３）の効果の比較を表５に示す。
【００６０】
実施例３０〜３１は、カルボキシメチル未処理デキストランＴ１０及びカルボキシメチル還元デキストランＴ１０で被覆されたＵＳＰＩＯの製造を記載する。
【００６１】
実施例３２〜４１は、様々な程度のカルボキシメチル化を含むカルボキシメチル還元デキストランＴ１０製剤で被覆されたＵＳＰＩＯの製造を記載する。ＵＳＰＩＯのコロイドサイズに対するＣＭＲＤのカルボキシメチル化の程度の影響を表６に示す。塩化第二鉄／塩化第一鉄溶液の溶解度に対するＣＭＲＤのカルボキシメチル化の程度の影響を表７に示す。
【００６２】
実施例４２〜４８は、未処理デキストラン及び還元デキストラン及びＣＭＲＤを使用する酸化鉄ゾルの合成及びそれらの安定化を記載する。実施例４９は、塩化第二鉄とＣＭＲＤの塩基析出（ｂａｓｅ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）を使用するＣＭＲＤ被覆された非磁性酸化鉄コロイドの製造を記載する。
【００６３】
実施例５０は、還元デキストラン及び未処理デキストランで被覆されたＵＳＰＩＯの様々な製剤のオートクレーブ処理による滅菌のプロセスのこれらの粒子の特性に対する影響を試験する。結果は表８及び９に示されている。
【００６４】
実施例５１は、様々な造影剤の緩和特性を報告し、ガドリニウムに基づく造影剤と未処理デキストラン及びカルボキシメチル還元デキストランＴ１０を使用して製造されたＵＳＰＩＯの緩和特性を比較している（表１０）。
【００６５】
実施例５２〜５３においては、還元デキストラン及び非還元（未処理）デキストランで被覆されたＵＳＰＩＯのラットに対する毒性の徴候の存在が、アナフィラキシー型反応に関して、確認された。アナフィラキシー型反応の程度は、脚の浮腫の体積によって決定される。同様の研究を、未処理デキストラン、還元デキストラン、及びカルボキシメチル還元デキストランを使用して行った。結果を表１１〜１４にまとめる。
【００６６】
実施例５４及び図４及び５は、ラットの血液循環からのＣＭＲＤ被覆されたＵＳＰＩＯのクリアランスの速度を示す。薬剤の半減期が決定される。
【００６７】
ＣＭＲＤ被覆されたＵＳＰＩＯの投与の後の改善されたＭＲＩスキャンが実施例５５及び図６中に示されており、このスキャンはラットの心臓、大動脈、及びその他の心臓に関連した動脈の像を示している。実施例５６及び図７は、ブタの前面部のＣＭＲＤ被覆ＵＳＰＩＯで高められたＭＲＩスキャンを示す。実施例５７は、臨床試験の一部として、人の被験者へのＣＭＲＤ被覆ＵＳＰＩＯの注入が悪影響を生じないことを示す。実施例５７は、生体分布（図８）、映像化速度（図９及び表１５）、及び人中でのこの材料のＭＲＩ使用におけるバックグラウンドの不存在を記載する。この実施例中のデータは、本発明の実施者が、診療室への訪問又はＭＲＩ施設への訪問の実際の時間内に複数回の投与を行うことができそして続けて複数の映像を得ることができることを示す。
【００６８】
実施例
還元多糖の合成のための一般的手順
過剰の硼水素化ナトリウムによる処理によって還元された多糖を製造し、５サイクルの限外濾過によって一般的に精製した。実施例全体を通して蒸留水を使用する。多糖プルラン（ｐｕｌｌｕｌａｎ）の場合、さらに精製することなく還元混合物を使用した。全ての場合において、生成物は５％未満の残留アルデヒド含有率を示した。残留アルデヒド濃度は、改良されたテトラゾリウムブルー（ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｌｕｅ）アッセイを使用して決定した（Ｊｕｅ， Ｃ．Ｋ．ら， Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， １９８５，１１：１０９−１５）。デキストラン濃度はフェノール／硫酸アッセイによって決定した（Ｋｉｔｃｈｅｎ， Ｒ．， Ｐｒｏｃ． Ｓｕｇａｒ Ｐｒｏｃｅｓｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｎｆ．， １９８３， ２３２−４７）。限外濾過が省かれた場合、デキストランＴ１を除いて、残留ボレート塩は粒子形成に影響しないことが示された。実施例１から４までは、それぞれ、還元多糖Ｔ１、Ｔ５、及びＴ１０、及びプルランの合成方法を提供する。保持時間は、２０ｍＭの燐酸塩緩衝食塩水、０．４ｍｌ／分の流速で、ＷａｔｅｒｓのＵｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ２５０カラムであるＳＮ Ｔ５２２６２Ａ３３を使用して決定した。
【００６９】
実施例１．還元デキストランＴ１
デキストランＴ１（１０ｇ）を２５℃の１００ｍｌの水中に溶解し、１．０ｇの硼水素化ナトリウムを添加し、そして混合物を１２時間撹拌した。６ＭのＨＣｌを使用してｐＨを５．０にして、２００ｍｌのエタノール（無水）を添加した。析出物を遠芯分離によって収集した。エタノール／水層をデカンテーションし、そして残渣を１００ｍｌの水中に溶解した。２００ｍｌの無水エタノールを添加して２回目の析出を生じさせ、エタノール／水を再びデカンテーションした。析出した生成物を水中に溶解し、減圧下に凍結乾燥させて６０％の収率で白色固体を生成した。観察されたＨＰＬＣ保持時間（分）は、還元デキストランについては２４．４であり、そして未処理デキストランについては２４．４だった。
【００７０】
実施例２．還元デキストランＴ５
デキストランＴ５（４ｇ）を２５℃の２５ｍｌの水中に溶解し、８３ｍｇの硼水素化ナトリウムを添加し、そして混合物を１２時間撹拌した。６ＭのＨＣｌを使用してｐＨを５．０にした。混合物を１ｋＤａの分子量カットオフの（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔ−ｏｆｆ）（ＭＷＣＯ）膜フィルターに対して限外濾過した。生成物を減圧下に凍結乾燥させて白色固体を生成し、７０％の収率が得られた。観察されたＨＰＬＣ保持時間（分）は、還元デキストランについては２２．９であり、そして未処理デキストランについては２１．９だった。
【００７１】
実施例３．還元デキストランＴ１０
デキストランＴ１０（５，００３ｇ）を２６，０１１ｇの水中に溶解した。硼水素化ナトリウム（５２．５ｇ）を添加し、そして混合物を２４時間撹拌した。６ＮのＨＣｌを使用してｐＨを７．１に調整した。生成物を、３ｋＤａの限外濾過膜に対して繰り返し限外濾過することによって精製し、減圧下に凍結乾燥させて白色固体を生成した。収量：３１２９ｇ。観察されたＨＰＬＣ保持時間（分）は、還元デキストランについては２１．６であり、そして未処理デキストランについては２１．１だった。
【００７２】
実施例３．還元プルラン
プルラン（９０ｍｇ）を２５℃の０．８ｍｌの水中に溶解し、１ｍｇの硼水素化ナトリウムを添加した。混合物を１２時間撹拌し、ＵＳＰＩＯの製造において直接的に使用した。
【００７３】
基質として未処理デキストランＴ−１０を使用するカルボキシメチル還元デキストランの合成のための一般的手順
実施例５〜９は、未処理デキストランからのカルボキシメチル還元デキストランの合成を記載する。２つの一般的合成方法、即ち、未処理デキストランの出発濃度が７０ｍｇ／ｇであった低デキストラン濃度法（実施例５）、及び未処理デキストランの出発濃度が２４０ｍｇ／ｇであった高デキストラン濃度法（実施例６〜９）が示される。
【００７４】
実施例５．低デキストラン濃度法によって調製されたカルボキシメチル還元デキストランＴ１０
以下の溶液を調製し、５℃に冷却した：溶液Ａは１０．５リットルの水中に４，２００ｇの水酸化ナトリウムを含み、そして溶液Ｂは５，７００ｍｌの水中に２，３１０ｇのブロモ酢酸を含んだ。溶液Ｃは７，５００ｍｌの水中に３，０００ｇのデキストランＴ１０を含み、３８℃に加熱された。
【００７５】
水酸化ナトリウム（６００ｇ）を７．５リットルの水中に溶解し、３８℃まで暖めた。硼水素化ナトリウム（６０ｇ）を添加して、混合物を２分間撹拌し、その後溶液Ｃを添加し、続いて直ちに２回目の６０ｇの部分の硼水素化ナトリウムを添加した。混合物を３８℃で３０分間撹拌し、その後１５℃まで冷却した。溶液の温度を２５℃未満に維持しながら、溶液Ａを添加した。溶液Ｂを添加し、溶液の温度を２５℃未満に維持した。混合物を室温で２時間撹拌し、そして溶液温度を３５℃未満に維持しながら、５℃に冷却された６ＭのＨＣｌを使用してｐＨ７．５まで中和した。混合物を０．２μｍのフィルターを通して濾過し、そして８０リットルまで希釈した。３ｋＤａのＭＷＣＯ限外濾過膜を通して繰り返し限外濾過することによって生成物を精製し、０．２μｍのフィルターを通して再び濾過して、減圧下に凍結乾燥させた。
【００７６】
回収された固体、即ち、２，５６０ｇのカルボキシメチル還元デキストランＴ１０（ナトリウム塩）は、滴定によって決定して、生成物１ｇ当たり約１，２６５マイクロモルのカルボキシルのカルボキシル含有率を示した。ブロモ酢酸の使用は、クロロ酢酸の使用と比較して、より低い温度での反応の進行を可能にし、そしてそのＦＴＩＲスペクトル（図１）によって証明されるようにより清浄な生成物を製造した。図１は、クロロ酢酸を使用して製造された米国特許第５，２０４，４５７号中の生成物のＦＴＩＲとは異なり、１６００ｃｍ−１におけるカルボキシレートのもの以外のカルボニル吸収を示さない。
【００７７】
実施例６．高デキストラン濃度法によって調製されたカルボキシメチル還元デキストランＣＭＲＤ Ｔ１０
硼水素化ナトリウム（０．４ｇ）及び水中の水酸化ナトリウムの５０％重量／重量溶液の０．５ｇを５０ｇの水中の２５ｇのデキストランの溶液に添加した。混合物を室温で４時間撹拌し、１：１の水酸化ナトリウム溶液の１９．５ｇ及び６．２ｇのブロモ酢酸を添加し、そして氷浴を使用して温度を２５℃未満に保った。混合物をその後室温で１６時間撹拌した。
【００７８】
生成物を精製するために、混合物のｐＨを６ＭのＨＣｌを使用してｐＨ６．２に調節し、そして１２０ｍｌのエタノールを添加した。析出物が形成し、これを沈降させ、そして上澄液をデカンテーションによって除去した。残渣を６０ｍｌの水中に溶解し、そして２００ｍｇの塩化ナトリウムを添加し、続いて３０ｍｌのエタノールを添加し、そしてカルボキシメチル還元デキストランを沈降させた。水と塩化ナトリウムの添加、それに続く析出物の溶解、及びエタノール析出の順序をさらに２回繰り返した。残渣を６０ｍｌの水中に溶解し、そして１リットルのエタノールを添加した。カルボキシメチル還元デキストランを再び沈降させ、そして固体を中ガラス濾過器（ｍｅｄｉｕｍ ｆｒｉｔ ｇｌａｓｓ ｆｉｌｔｅｒ）上で収集した。白色固体を５０℃で２４時間乾燥させた。収量は、滴定によって決定して、１ｇ当たり１１０８マイクロモルのカルボキシルを有する生成物２７ｇであった（表２）。
【００７９】
実施例７．高デキストラン濃度法によって調製されたカルボキシメチル還元デキストランＴ１０
硼水素化ナトリウム（０．４ｇ）及び５０％水酸化ナトリウムの０．５ｇを５０ｇの水中の２５ｇのデキストランの溶液に添加した。混合物を室温で４時間撹拌し、５０％水酸化ナトリウムの２０．０ｇ及び６．９５ｇのブロモ酢酸を添加し、そして混合物を室温で１６時間撹拌しながら、氷浴を使用して温度を２５℃未満に保った。生成物を実施例６に記載したように精製した。収量は、滴定によって決定して、１ｇ当たり１２６２マイクロモルのカルボキシルを有する生成物２３．９ｇであった（表２）。
【００８０】
実施例８．高デキストラン濃度法によって調製されたカルボキシメチル還元デキストランＴ１０
硼水素化ナトリウム（０．４ｇ）及び５０％水酸化ナトリウムの０．５ｇを５０ｇの水中の２５ｇのデキストランの溶液に添加した。混合物を室温で４時間撹拌し、そして氷浴を使用して温度を２５℃未満に維持しながら、５０％水酸化ナトリウムの２０．６７ｇ及び７．６５ｇのブロモ酢酸を添加した。混合物を室温で１６時間撹拌した。生成物を実施例６に記載したように精製した。収量は、滴定によって決定して、１ｇ当たり１４０４マイクロモルのカルボキシルを有する生成物２４．５ｇであった（表２）。
【００８１】
実施例９．高デキストラン濃度法によって調製されたカルボキシメチル還元デキストランＣＭＲＤ Ｔ１０
硼水素化ナトリウム（０．４ｇ）及び５０％水酸化ナトリウム溶液の０．５ｇを５０ｇの水中の２５ｇのデキストランの溶液に添加した。混合物を室温で４時間撹拌し、そして氷浴を使用して温度を２５℃未満に維持しながら、５０％水酸化ナトリウムの２０．６７ｇ及び７．６５ｇのブロモ酢酸を添加した。混合物を室温で１６時間撹拌し、そして生成物を実施例６に記載したように精製した。収量は、滴定によって決定して、生成物の１ｇ当たり１５２８マイクロモルのカルボキシルを有する生成物２３．４ｇであった（表２）。
【００８２】
合成において使用されたブロモ酢酸の量とデキストランへのカルボキシル基の組み込みマイクロモル量の結果の関係を高デキストラン濃度法を使用して試験した。この関係は線形であることが判明した（表２及び図３を参照のこと）。実施例６から９の反応体の質量とカルボキシメチルの収量を表２に示す。
【００８３】
低デキストラン高塩基法による還元デキストランＴ−１０を使用するカルボキシメチル還元デキストラン製剤の合成
実施例１０〜１４は、低濃度の還元デキストランを使用して開始する様々な程度の置換を有するカルボキシメチル還元デキストランの合成を記載する。この方法においては、還元デキストランの開始濃度は７０ｍｇ／ｇであり、そしてＮａＯＨは少なくとも約１０７ｍｇ／ｇであった。表３は、反応中に使用されるブロモ酢酸の量が増加するにつれて、カルボキシメチル置換の程度が増加したことを示す。
【００８４】
【表２】
実施例１０．低デキストラン高塩基法を使用するカルボキシメチル還元デキストランＣＭＲＤ Ｔ１０
還元デキストランＴ１０（１５ｇ）を７２ｍｌの水中に溶解し、そして８Ｍの水酸化ナトリウムの７２ｍｌを添加した。混合物を２５℃にし、そして３ｍｌの水中の１．１５ｇのブロモ酢酸の溶液を添加した。混合物を室温で１時間撹拌し、その後７５ｍｌの体積の粉砕された氷に添加した。溶液のｐＨを６ＭのＨＣｌを使用してｐＨ６．０にした。３ｋＤａの限外濾過膜に対して繰り返し限外濾過した後、生成物を減圧下に凍結乾燥させた。収量は１３．２５ｇの生成物だった。回収された固体、カルボキシメチル還元デキストランＴ１０（ナトリウム塩）は、滴定によって決定して、１ｇ当たり約１１０マイクロモルのカルボキシルのカルボキシル含有率を示した（表３）。
【００８６】
実施例１１．低デキストラン高塩基法を使用するカルボキシメチル還元デキストランＴ１０
還元デキストランＴ１０（１５０ｇ）を７２０ｍｌの水中に溶解し、そして８Ｍの水酸化ナトリウムの７２０ｍｌを添加した。混合物を２５℃にし、そして１４０ｍｌの水中の１１．５ｇのブロモ酢酸の溶液を添加した。混合物を室温で１時間撹拌し、その後７５０ｍｌの体積の粉砕された氷に添加し、溶液のｐＨを６ＭのＨＣｌを使用してｐＨ６．０にした。３ｋＤａのＭＷＣＯ限外濾過膜に対して繰り返し限外濾過した後、生成物を減圧下に凍結乾燥させた。収量は、滴定によって決定して、生成物１ｇ当たり約１３０マイクロモルのカルボキシルのカルボキシル含有率を有する、回収された固体カルボキシメチル還元デキストランＴ１０（ナトリウム塩）の１２６．２１ｇであった（表３）。
【００８７】
実施例１２．低デキストラン高塩基法を使用するカルボキシメチル還元デキストランＣＭＲＤ Ｔ１０
還元デキストランＴ１０（１５０ｇ）を７２０ｍｌの水中に溶解し、そして８Ｍの水酸化ナトリウムの７２０ｍｌを添加した。混合物を２５℃にし、そして１４０ｍｌの水中の２６．６ｇのブロモ酢酸の溶液を添加し、混合物を室温で１時間撹拌し、その後７５０ｍｌの体積の粉砕された氷に添加した。溶液のｐＨを６ＭのＨＣｌを使用してｐＨ６．０にした。３ｋＤａのＭＷＣＯ限外濾過膜に対して繰り返し限外濾過した後、生成物を減圧下に凍結乾燥させた。収量は測定しなかった。回収された固体、カルボキシメチル還元デキストランＴ１０（ナトリウム塩）は、滴定によって決定して、生成物１ｇ当たり約２８０マイクロモルのカルボキシルのカルボキシル含有率を示した（表３）。
【００８８】
実施例１３．低デキストラン高塩基法を使用するカルボキシメチル還元デキストランＣＭＲＤ Ｔ１０
還元デキストランＴ１０（１５ｇ）を７２ｍｌの水中に溶解し、そして８Ｍの水酸化ナトリウムの７２ｍｌを添加した。混合物を２５℃にし、そして８ｍｌの水中の３．４５ｇのブロモ酢酸の溶液を添加した。混合物を室温で１時間撹拌し、その後７５ｍｌの体積の粉砕された氷に添加した。溶液のｐＨを６ＭのＨＣｌを使用してｐＨ６．０にした。３ｋＤａのＭＷＣＯ限外濾過膜に対して繰り返し限外濾過した後、生成物を減圧下に凍結乾燥させた。収量は、滴定によって決定して、生成物１ｇ当たり約４５０マイクロモルのカルボキシルのカルボキシル含有率を有する、回収された固体カルボキシメチル還元デキストランＴ１０（ナトリウム塩）の９．４ｇであった（表３）。
【００８９】
実施例１４．低デキストラン高塩基法を使用するカルボキシメチル還元デキストランＣＭＲＤ Ｔ１０
還元デキストランＴ１０（１５０ｇ）を７２０ｍｌの水中に溶解し、そして８Ｍの水酸化ナトリウムの７２０ｍｌを添加した。混合物を２５℃にし、そして１４０ｍｌの水中の５８．８ｇのブロモ酢酸の溶液を添加した。混合物を室温で１時間撹拌し、その後７５０ｍｌの体積の粉砕された氷に添加した。溶液のｐＨを６ＭのＨＣｌを使用してｐＨ６．０にした。３ｋＤａのＭＷＣＯ限外濾過膜に対して繰り返し限外濾過した後、生成物を減圧下に凍結乾燥させた。収量は、滴定によって決定して、生成物１ｇ当たり約５８０マイクロモルのカルボキシルのカルボキシル含有率を有する、回収された固体カルボキシメチル還元デキストランＴ１０（ナトリウム塩）の１２７．８８ｇであった（表３）。
【００９０】
表３は、観察されたカルボキシメチル置換の程度が、反応中に使用されたブロモ酢酸の量の関数であったことを示す。データは、一般的に反応中のブロモ酢酸の量の増加が生成物中のＣＯＯＨの濃度の増加をもたらしたことを示す。カルボキシメチルの組み込みの収率は、例えば、実施例１３及び１４のように、反応の規模のような条件によっても影響された。
【００９１】
【表３】
実施例１５．市販の源からのカルボキシメチル還元デキストランＴ１０
カルボキシメチル還元デキストランをＡｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａから購入した。この固体は、滴定によって決定して、生成物１ｇ当たり約１８８７マイクロモルのカルボキシルのカルボキシル含有率を示した。
【００９３】
実施例１６〜１８は、それぞれ、未処理、非還元デキストランＴ−１０、Ｔ−４０、及びＴ−７０からのカルボキシメチルデキストランの合成を記載する。
【００９４】
実施例１６．カルボキシメチルデキストランＴ１０
以下の溶液を調製し、５℃に冷却した：溶液Ａ：２５０ｍｌの水中の１０５．２ｇの水酸化ナトリウム；溶液Ｂ：１４２．５ｍｌの水中の５８．０ｇのブロモ酢酸；及び溶液Ｃ：１８７．５ｍｌの水中の７５．７ｇのデキストランＴ１０。
【００９５】
溶液の温度を２５℃未満に維持しながら、溶液Ｃと溶液Ａに１８７．５ｍｌの水中に溶解された水酸化ナトリウム（１４．４ｇ）を添加した。温度を２５℃未満に維持しながら、溶液Ｂを添加し、得られた溶液を室温で２時間撹拌し、その後溶液温度を３５℃未満に維持しながら、（５℃に冷却された）６ＭのＨＣｌを使用してｐＨ７．５まで中和した。混合物を０．２μｍの細孔サイズのフィルターに通して、そして２リットルまで希釈した。生成物を、３ｋＤａのＭＷＣＯ限外濾過膜に対して繰り返し限外濾過することによって精製し、０．２μｍのフィルターで再び濾過し、そして減圧下に凍結乾燥させた。収量は５３．１７ｇであり、回収された固体カルボキシメチルデキストランＴ１０（ナトリウム塩）は、滴定によって決定して、生成物１ｇ当たり約１２２０マイクロモルのカルボキシルのカルボキシル含有率を示した。
【００９６】
実施例１７．カルボキシメチルデキストランＴ４０
以下の溶液を調製し、５℃に冷却した：溶液Ａ：４８０ｍｌの水中の１５４ｇの水酸化ナトリウム；溶液Ｂ：２６０ｍｌの水中の７７ｇのブロモ酢酸；及び溶液Ｃ：４００ｍｌの水中の１００ｇのデキストランＴ４０。
【００９７】
溶液をＡを溶液Ｃに一度に全て添加した。５分後、溶液Ｂを添加し、温度を２０℃と２５℃との間に維持しながら、一緒にされた溶液を１２０分間撹拌した。混合物を６ＭのＨＣｌで中和し、０．２μｍのフィルターで濾過し、そして２リットルまで希釈した。生成物を、３ｋＤａのＭＷＣＯ限外濾過膜に対して繰り返し限外濾過することによって精製し、０．２μｍのフィルターで濾過し、そして減圧下に凍結乾燥させた。収量は１０５．１ｇの回収された固体カルボキシメチルデキストランＴ４０（ナトリウム塩）であり、これは、滴定によって決定して、生成物１ｇ当たり約１３９０マイクロモルのカルボキシルのカルボキシル含有率を示した。
【００９８】
実施例１８．カルボキシメチルデキストランＴ７０
以下の溶液を調製し、５℃に冷却した：溶液Ａ：４８０ｍｌの水中の１５４ｇの水酸化ナトリウム；溶液Ｂ：２６０ｍｌの水中の７７ｇのブロモ酢酸；及び溶液Ｃ：４００ｍｌの水中の１００ｇのデキストランＴ７０。
【００９９】
溶液をＡを溶液Ｃに一度に全て添加した。５分後、溶液Ｂを添加し、氷浴を使用して温度を２０℃と２５℃との間に維持しながら、一緒にされた溶液を撹拌した。１２０分後、溶液を６ＭのＨＣｌで中和した。溶液を０．２μｍのフィルターで濾過し、そして２リットルまで希釈した。生成物を、３ｋＤａのＭＷＣＯ限外濾過膜に対して繰り返し限外濾過することによって精製し、０．２μｍのフィルターで再び濾過し、そして減圧下に凍結乾燥させた。収量は、滴定によって決定して、生成物１ｇ当たり約１３８０マイクロモルのカルボキシルのカルボキシル含有率を有する、回収された固体カルボキシメチルデキストランＴ７０（ナトリウム塩）の１０６．９ｇであった。
【０１００】
還元多糖又は非還元多糖のいずれかで被覆されたＵＳＰＩＯ製剤の特性を比較するための超常磁性コロイドの製造のための一般的手順
実施例１９〜２６は、同一の分子量の未処理多糖と還元多糖のペアから得られる多糖被覆された酸化鉄生成物を比較するために行った。同一の分子量の未処理多糖と還元多糖の各々のペアに対するＵＳＰＩＯコロイドの製造のために同一の手順を使用した。より詳細に述べると、各々の分子量のペアに対して、同じ多糖の鉄に対する比率と鉄濃度を使用した。各々の未処理多糖と還元多糖のペアに対して使用された多糖の鉄に対する比率と鉄濃度は、還元多糖を使用して３０ｎｍ未満の直径及び２０，０００×１０−６ｃｇｓより大の磁化率を有する０．２μｍのフィルターを通して濾過可能なＵＳＰＩＯを生成するように選択された。
【０１０１】
一般的手順は、鉄塩（Ｆｅ＋３／Ｆｅ＋２）及び多糖の溶液への過剰の水酸化アンモニウムの添加、それに続く加熱、及び１００ｋＤａのＭＷＣＯ膜フィルターを使用する水に対する限外濾過の６サイクルの実施を含んだ。限外濾過後、還元多糖を使用して形成されたＵＳＰＩＯ製剤を０．２μｍのフィルターを通して濾過し、４℃で貯蔵した。
【０１０２】
未処理多糖を使用して製造された酸化鉄については、未処理デキストランＴ１０で被覆された酸化鉄のみが０．２μｍのフィルターを通して濾過可能であった。粒状材料を含むこれらのサンプルを除いて、サイズと磁化率をその後測定した。粒度は、Ｍｉｃｒｏｔｒａｃ（登録商標）ＵＰＡ装置（ペンシルバニア州、フォート・ワシントンのＨｏｎｅｙｗｅｌｌ ＩＡＣ Ｍｉｃｒｏｔｒａｃ製）中において動的光散乱を測定することによって決定し、平均体積直径（ｍｅａｎ ｖｏｌｕｍｅ ｄｉａｍｅｔｅｒ）（ＭＶＤ）として報告した。磁化率は、Ｍａｔｈｅｙ Ｊｏｈｎｓｏｎ磁化率天秤を使用して決定した。鉄濃度はビピリジルアッセイを使用して決定した（Ｋｕｍａｒ Ｋ．， Ｊ． Ｌｉｑ． Ｃｈｒｏｍａｔｇｒ． Ｒｅｌａｔ． Ｔｅｃｈｎｏｌ．， １９９７， ２０， ３３５１−３３６４）。
【０１０３】
実施例１９．還元デキストランＴ１被覆ＵＳＰＩＯの製造
還元デキストランＴ１（１．７ｇ）を２０ｍｌの水中に溶解し、３２ｇの水中の３ｇの六水和塩化第二鉄及び１．５ｇの四水和塩化第一鉄の溶液を添加した。混合物を窒素で３０分間パージし、５℃まで冷却し、そして１２．７ｇの２８％水酸化アンモニウムを２分間撹拌しながら添加した。混合物を６０℃に加熱し、この温度で４０分間維持し、その後８０℃で２時間インキュベートした。生成物に１００ｋＤａのＭＷＣＯ膜フィルターを使用する水に対する６サイクルの限外濾過を施した。限外濾過後、生成物を０．２μｍのフィルターを通して濾過し、４℃で貯蔵した。生成物は以下の特性を有することが観察された：平均体積直径（Ｍｉｃｒｏｔｒａｃ粒度分析器を使用して決定された）は１８ｎｍであった。磁化率は１３，３２３×１０−６ｃｇｓ／ｇＦｅであった。
【０１０４】
実施例２０．未処理デキストランＴ１被覆酸化鉄の製造
未処理デキストランＴ１を還元デキストランＴ１の代わりに使用したことを除いて、実施例１９において還元デキストランについて上で記載した方法によって、未処理デキストランＴ１酸化鉄を製造した。生成物は以下の特性を有することが観察された：平均体積直径（Ｍｉｃｒｏｔｒａｃ粒度分析器を使用して決定された）は２７６４ｎｍであった。磁化率は１，９５３×１０−６ｃｇｓ／ｇＦｅであった。
【０１０５】
実施例２１．還元デキストランＴ５被覆ＵＳＰＩＯの製造
還元デキストランＴ５（０．４５ｇ）を１３ｍｌの水中に溶解し、４．５ｇの水中の０．５ｇの六水和塩化第二鉄及び０．２５ｇの四水和塩化第一鉄の溶液を添加した。混合物を窒素で３０分間パージし、５℃まで冷却し、そして１．４２ｇの２８％水酸化アンモニウムを２分間撹拌しながら添加した。混合物を８０℃で２時間加熱し、実施例１９に記載されたようにして精製した。生成物は以下の特性を有することが観察された：平均体積直径（Ｍｉｃｒｏｔｒａｃ粒度分析器を使用して決定された）は１６ｎｍであった。磁化率は３３，９４３×１０−６ｃｇｓ／ｇＦｅであった。
【０１０６】
実施例２２．未処理デキストランＴ５被覆酸化鉄の製造
未処理デキストランＴ５を還元デキストランＴ５の代わりに使用したことを除いて、実施例２１において還元デキストランについて上で記載した方法によって、未処理デキストランＴ５酸化鉄を製造した。生成物は以下の特性を有することが観察された：平均体積直径（Ｍｉｃｒｏｔｒａｃ粒度分析器を使用して決定された）は１，９１６ｎｍであった。
【０１０７】
実施例２３．還元デキストランＴ１０被覆ＵＳＰＩＯの製造
還元デキストランＴ１０（２．７ｇ）を７０ｍｌの水中に溶解し、２７ｇの水中の２．０ｇの六水和塩化第二鉄及び１．０ｇの四水和塩化第一鉄の溶液を添加した。混合物を窒素で３０分間パージし、５℃まで冷却し、そして８．５ｇの２８％水酸化アンモニウムを２分間撹拌しながら添加した。混合物を８０℃で２時間加熱し、実施例１９に記載されたようにして精製した。生成物は以下の特性を有することが観察された：平均体積直径（Ｍｉｃｒｏｔｒａｃ粒度分析器を使用して決定された）は１２ｎｍであった。磁化率は３１，７４３×１０−６ｃｇｓ／ｇＦｅであった。
【０１０８】
実施例２４．未処理デキストランＴ１０被覆酸化鉄の製造
未処理デキストランＴ１０を還元デキストランＴ１０の代わりに使用したことを除いて、実施例２３において還元デキストランについて上で記載した方法によって、未処理デキストランＴ１０酸化鉄を製造した。生成物は以下の特性を有することが観察された：平均体積直径（Ｍｉｃｒｏｔｒａｃ粒度分析器を使用して決定された）は７５７ｎｍであった。磁化率は３１，２５２×１０−６ｃｇｓ／ｇＦｅであった。
【０１０９】
実施例２５．還元プルラン被覆ＵＳＰＩＯの製造
還元プルラン（０．０４５ｇ）を０．４ｍｌの水中に溶解し、１．３ｇの水中の０．１０６ｇの六水和塩化第二鉄及び０．０５ｇの四水和塩化第一鉄の溶液を添加した。混合物を窒素で３０分間パージし、５℃まで冷却し、そして０．０４４ｇの２８％水酸化アンモニウムを２分間撹拌しながら添加した。混合物を８０℃で０．６７時間加熱し、実施例１９に記載されたようにして精製した。生成物は以下の特性を有することが観察された：平均体積直径（Ｍｉｃｒｏｔｒａｃ粒度分析器を使用して決定された）は２０ｎｍであった。磁化率は２７，０６６×１０−６ｃｇｓ／ｇＦｅであった。
【０１１０】
実施例２６．未処理プルラン被覆酸化鉄の製造
未処理プルランを還元プルランの代わりに使用したことを除いて、実施例２５において還元プルランについて上で記載した方法によって、未処理プルラン酸化鉄を製造した。生成物は以下の特性を有することが観察された：平均体積直径（Ｍｉｃｒｏｔｒａｃ粒度分析器を使用して決定された）は１，１８４ｎｍであった。
【０１１１】
未処理多糖との比較において還元多糖を使用して得られた酸化鉄製剤の特性（実施例１９〜２６から得られたデータの比較）
ＭＲＩ造影剤に関して一般的に、小サイズの酸化鉄造影剤粒子、例えば、１０乃至５０ｎｍの範囲内の直径を有する粒子が好ましい。さらに、より大きい磁化率の、そしてより大きい同質性の酸化鉄が好ましい。
【０１１２】
実施例１９〜２６のデータから、酸化鉄を被覆するために使用される多糖の還元された末端糖の存在（還元多糖）が、未処理非還元多糖を使用して同様に製造された酸化鉄と比較して、各々の得られるコロイドの粒子の直径に対して予期されなかったかなりの影響を有することが観察された。表４は、平均体積直径（ＭＶＤ）によって示される、未処理多糖と還元多糖の各々のペアについて形成された粒子のサイズを示す。還元多糖と未処理多糖の濃度は、各々の分子量のグループ内において一定に保たれた。濃度は、還元多糖によるＵＳＰＩＯの合成を最適化するように選択された。全ての多糖に関して、未処理非還元多糖の使用は、一貫して還元多糖を使用した場合よりも大きい粒子を製造し、従って還元多糖は一貫して好ましいより小さい粒子を与えた。
【０１１３】
さらに、合成され試験された所定分子量の多糖の各々のペアに関して、還元多糖で被覆されたＵＳＰＩＯ製剤は、デキストランＴ１０を使用して得られたコロイド（これについては還元されたものの被覆と未処理のものの被覆の磁化率は同等だった）を除いて、未処理多糖を使用して合成された対応する酸化鉄製剤よりも高い磁化率を示した。
【０１１４】
これらのデータは、被覆されたＵＳＰＩＯコロイドの製造における還元多糖の使用が、磁化率の損失を伴うことなく、小サイズの好ましい粒子を生成することを示す。これらのデータは、多糖で被覆されたＵＳＰＩＯの合成に対して多糖のアルデヒドの還元が有する驚くべき効果を示す。
【０１１５】
【表４】
３０ｎｍ未満の平均体積直径の未処理非還元Ｔ１、Ｔ５、及びＴ１０デキストランを使用して製造された酸化鉄の特性
実施例２７から２９は、未処理デキストランＴ１、Ｔ５、及びＴ１０から得られた酸化鉄の製造を示す。コロイドは還元デキストラン（実施例１９、２１、及び２３）に関して記載したようにして非還元（未処理）デキストランを使用して製造されたが、但し、これらの未処理非還元デキストラン粒子の製造は、対応するサイズの酸化鉄を製造するために、それらの対応する還元デキストラン同等物よりも約１０乃至３４倍のデキストランを必要とした。デキストラン使用量の増加の必要性は、示されている酸化鉄の対応する分子量のペアに関して生成物のデキストランの鉄に対する比率を比較することによって示される（表５）。
【０１１７】
データは、未処理デキストランＴ１、Ｔ５、及びＴ１０の各々を使用して製造された酸化鉄粒子の磁気特性及び合成中のデキストランの使用の効率が、各々の同等の還元デキストランを使用して製造された粒子の対応する特性と比較して劣っていたことを示す。
【０１１８】
実施例２７．未処理Ｔ１デキストランで被覆された酸化鉄の製造
０．４２ｇの六水和塩化第二鉄、０．２１ｇの四水和塩化第一鉄、及び７．２７ｇの水の混合物を０．２μｍのフィルターを通して濾過した。この混合物の１ｇの部分を０．１ｇデキストランＴ１／ｇ水の水溶液の１０ｍｌに添加した。混合物を窒素でパージし、その後２８％水酸化アンモニウム溶液の０．２２ｍｌを添加した。混合物を８０℃で１時間加熱し、室温まで冷却し、そして０．２μｍのフィルターを通して濾過した。生成物は以下の特性を有することが観察された：平均体積直径（Ｍｉｃｒｏｔｒａｃ粒度分析器を使用して決定された）は２７ｎｍであった。磁化率は２３２５×１０−６ｃｇｓ／ｇＦｅであった。
【０１１９】
実施例２８．未処理Ｔ５デキストランで被覆された酸化鉄の製造
デキストランＴ５（０．８ｇ）を９ｍｌの水中に溶解し、そして９．２ｍｌの水中の５１．８ｍｇの六水和塩化第二鉄及び２５．９ｍｇの四水和塩化第一鉄の０．２μｍのフィルターを通して濾過された溶液の０．６３ｍｌに添加した。混合物を窒素でパージし、その後２８％水酸化アンモニウム溶液の１．４ｍｌを添加した。混合物を８０℃で１時間加熱し、室温まで冷却し、そして０．２μｍのフィルターを通して濾過した。生成物は以下の特性を有することが観察された：平均体積直径（Ｍｉｃｒｏｔｒａｃ粒度分析器を使用して決定された）は２０ｎｍであった。磁化率は１２８５×１０−６ｃｇｓ／ｇＦｅであった。
【０１２０】
実施例２９．未処理Ｔ１０デキストランで被覆された酸化鉄の製造
デキストランＴ１０（９４２０ｇ）を１４９１５ｇの水中に溶解した。この混合物の１４９１５ｇの部分を０．２μｍのフィルターを通して濾過し、反応容器に添加した。六水和塩化第二鉄（８９１ｇ）を７１３ｇの水中に溶解した。１１２９ｇの部分を０．２μｍのフィルターを通して濾過し、デキストランを含む反応容器に添加した。この混合物に窒素の泡を吹き込みながら、混合物を一晩撹拌しながら５℃まで冷却した。この窒素のパージの最後の３０分間の前に、４７７ｇの水中の３５９ｇの四水和塩化第一鉄の０．２μｍのフィルターを通して濾過された溶液の５８０ｇの部分を添加した。この混合物に、２８％水酸化アンモニウム溶液の７８６ｇを添加し、５℃まで冷却した。混合物を８０℃に加熱し、８０℃で２時間インキュベートし、そしてその後８０℃に加熱された８０リットルの水中に注ぎ入れた。混合物を一晩放置して冷却させ、０．２μｍのフィルターを通して濾過し、そして１００ｋＤａ限外濾過膜を使用する限外濾過により精製した。生成物を０．２μｍのフィルターを通して濾過した。生成物は以下の特性を有することが観察された：平均体積直径（Ｍｉｃｒｏｔｒａｃ粒度分析器を使用して決定された）は２１ｎｍであった。磁化率は３２，７１２×１０−６ｃｇｓ／ｇＦｅであった。
【０１２１】
【表５】
様々な程度のカルボキシメチル化を含むカルボキシメチル未処理デキストランＴ１０及びカルボキシメチル還元デキストランＴ１０で被覆されたＵＳＰＩＯの製造
実施例３０及び３１は、それぞれ、カルボキシメチル未処理デキストランＴ１０及びカルボキシメチル還元デキストランＴ１０で被覆されたＵＳＰＩＯの製造を記載する。実施例３２〜３６は、様々な程度のカルボキシメチル化を含むカルボキシメチル還元デキストランＴ１０製剤で被覆されたＵＳＰＩＯ組成物の合成を記載する。実施例３７〜４１は、塩化第二鉄及び様々な程度のカルボキシメチル化を含むカルボキシメチル還元デキストランＴ１０を含む製剤の溶解度を記載する。
【０１２３】
実施例３０．カルボキシメチルデキストランＴ１０で被覆されたＵＳＰＩＯの製造
カルボキシメチルデキストランＴ１０（６０ｇ、実施例１６の方法によって製造されたもの）を５３２ｇの水中に溶解した。１４．７ｇの六水和塩化第二鉄、７．２ｇの四水和塩化第一鉄、及び１００ｍｌの水から成る水溶液を０．２μｍのフィルターを通して濾過し、添加した。混合物を１０℃まで冷却し、窒素でパージし、そして５２．２ｍｌの２８％水酸化アンモニウム溶液を撹拌しながら添加した。混合物を７５℃に加熱し、７５℃で３０分間維持し、２．５リットルの水で希釈し、そして０．２μｍのフィルターを通して濾過した。生成物を１００ｋＤａのＭＷＣＯ膜に対して繰り返し限外濾過することによって精製し、２０ｍｇＦｅ／ｍｌまで濃縮し、そして０．２μｍのフィルターを通して再び濾過した。生成物は以下の特性を有することが観察された：ＭＶＤ（Ｍｉｃｒｏｔｒａｃ粒度分析器を使用して決定された）は１９ｎｍであった。磁化率は２７，８３５×１０−６ｃｇｓ／ｇＦｅであった。そしてカルボキシル含有率は、ＣＭＲＤの１ｇ当たり１，２２０マイクロモルであった。オートクレーブ処理に対する安定性を決定するために、生成物のサンプルを密閉された５ｍｌのガラスバイアルに入れ、そして１２１℃で３０分間加熱した（表９を参照のこと）。
【０１２４】
実施例３１．カルボキシメチル還元デキストランＴ１０で被覆されたＵＳＰＩＯの製造
還元されたカルボキシメチルデキストランＴ１０（４０ｇ、実施例５で製造されたもの）を１，０３８ｍｌの水中に溶解し、０．２μｍの細孔サイズのフィルターを通して濾過した。３７４ｍｌの水中の３０ｇの六水和塩化第二鉄及び１５ｇの四水和塩化第一鉄の０．２μｍのフィルターを通して濾過された溶液を、３１ｍｌの洗浄水と共に、デキストランに添加した。溶液を１０℃まで冷却し、そして１１４ｇの２８％水酸化アンモニウムを添加した。このコロイド混合物を７８℃に加熱し、その温度で１時間維持した。この溶液をその後水で３リットルまで希釈し、１０℃まで冷却し、そしてＹＭ−１００フィルター膜（１００ｋＤａのＭＷＣＯ）で６回限外濾過した。２１．１ｍｇＦｅ／ｇの最終濃度が得られた。生成物は以下の特性を有することが観察された：平均体積直径（Ｍｉｃｒｏｔｒａｃ粒度分析器を使用して決定された）は２１ｎｍであった。磁化率は３２，７３２×１０−６ｃｇｓ／ｇＦｅであった。そしてカルボキシル含有率は、ＣＭＲＤの１ｇ当たり１，２６５マイクロモルであった。粒子の内容物は、約５０％のＦｅと５０％のデキストランであることが判明した。オートクレーブ処理に対する安定性を決定するために、生成物のサンプルを密閉された５ｍｌのガラスバイアルに入れ、そして１２１℃で３０分間加熱した（表９を参照のこと）。
【０１２５】
実施例３２．１ｇ当たり１１０マイクロモルのカルボキシルを有するカルボキシメチル還元デキストランＴ１０で被覆されたＵＳＰＩＯの製造
カルボキシメチル還元デキストランＴ１０（４ｇ、実施例１０で製造されたもの）を８５ｍｌの水中に溶解した。これに、２．９９ｇの六水和塩化第二鉄、１．４９ｇの四水和塩化第一鉄、及び３７．３ｍｌの水から成る０．２μｍのフィルターを通して濾過された混合物を添加した。混合物を１０℃まで冷却し、窒素でパージし、そして撹拌しながら、１１．４ｇの２８％水酸化アンモニウム溶液を添加した。この混合物を９０℃まで加熱し、７８℃で６０分間維持し、その後混合物に空気の泡を吹き込みながら７８℃で維持した。この混合物を１．５リットルの水で希釈し、０．２μｍのフィルターを通して濾過した。生成物を１００ｋＤａのＭＷＣＯ膜に対して繰り返し限外濾過することによって精製し、そして０．２μｍのフィルターを通して再び濾過した。
【０１２６】
実施例３３．１ｇ当たり１３０マイクロモルのカルボキシルを有するカルボキシメチル還元デキストランＴ１０で被覆されたＵＳＰＩＯの製造
カルボキシメチル還元デキストランＴ１０（４０ｇ、実施例１１で製造されたもの）を８５０ｍｌの水中に溶解した。これに、２９．９ｇの六水和塩化第二鉄、１４．９ｇの四水和塩化第一鉄、及び３７３ｍｌの水から成る０．２μｍのフィルターを通して濾過された混合物を添加した。混合物を１０℃まで冷却し、窒素でパージし、そして撹拌しながら、１１４ｍｌの２８％水酸化アンモニウム溶液を添加し、この混合物を９０℃まで加熱し、７８℃で６０分間維持し、その後混合物に空気の泡を吹き込みながら７８℃で維持した。この混合物を１．５リットルの水で希釈し、０．２μｍのフィルターを通して濾過した。生成物を１００ｋＤａのＭＷＣＯ膜に対して繰り返し限外濾過することによって精製し、２０ｍｇＦｅ／ｍｌまで濃縮し、そして０．２μｍのフィルターを通して再び濾過した。
【０１２７】
実施例３４．１ｇ当たり２８０マイクロモルのカルボキシルを有するカルボキシメチル還元デキストランＴ１０で被覆されたＵＳＰＩＯの製造
カルボキシメチル還元デキストランＴ１０（４ｇ、実施例１２で製造されたもの）を８５ｍｌの水中に溶解した。これに、２．９９ｇの六水和塩化第二鉄、１．４９ｇの四水和塩化第一鉄、及び３７．３ｍｌの水から成る０．２μｍのフィルターを通して濾過された混合物を添加した。混合物を１０℃まで冷却し、窒素でパージした。この混合物に撹拌しながら、１１．４ｇの２８％水酸化アンモニウム溶液を添加し、この混合物を９０℃まで加熱し、７８℃で６０分間維持し、その後混合物に空気の泡を吹き込みながら７８℃で維持した。この混合物を１．５リットルの水で希釈し、０．２μｍのフィルターを通して濾過した。生成物を１００ｋＤａのＭＷＣＯ膜に対して繰り返し限外濾過することによって精製し、その後０．２μｍのフィルターを通して濾過した。
【０１２８】
実施例３５．１ｇ当たり４５０マイクロモルのカルボキシルを有するカルボキシメチル還元デキストランＴ１０で被覆されたＵＳＰＩＯの製造
カルボキシメチル還元デキストランＴ１０（４ｇ、実施例１３で製造されたもの）を８５ｍｌの水中に溶解した。これに、２．９９ｇの六水和塩化第二鉄、１．４９ｇの四水和塩化第一鉄、及び３７．３ｍｌの水から成る０．２μｍのフィルターを通して濾過された溶液を添加した。混合物を１０℃まで冷却し、窒素でパージし、その後撹拌しながら、１１．４ｇの２８％水酸化アンモニウム溶液を添加した。この混合物を９０℃まで加熱し、７８℃で６０分間維持し、その後混合物に空気の泡を吹き込みながら７８℃で維持した。この混合物を１．５リットルの水で希釈し、０．２μｍのフィルターを通して濾過し、そして１００ｋＤａのＭＷＣＯ膜に対して繰り返し限外濾過することによって精製し、その後０．２μｍのフィルターを通して再び濾過した。
【０１２９】
実施例３６．１ｇ当たり５８０マイクロモルのカルボキシルを有するカルボキシメチル還元デキストランＴ１０で被覆されたＵＳＰＩＯの製造
カルボキシメチル還元デキストランＴ１０（４０ｇ、実施例１４で製造されたもの）を８５ｍｌの水中に溶解した。これに、２９．９ｇの六水和塩化第二鉄、１４．９ｇの四水和塩化第一鉄、及び３７３ｍｌの水から成る０．２μｍのフィルターを通して濾過された溶液を添加した。混合物を１０℃まで冷却し、窒素でパージし、その後撹拌しながら、１１．４ｇの２８％水酸化アンモニウム溶液を添加した。この混合物を９０℃まで加熱し、７８℃で６０分間維持し、その後混合物に空気の泡を吹き込みながら７８℃で維持した。この混合物を１．５リットルの水で希釈し、０．２μｍのフィルターを通して濾過し、そして１００ｋＤａのＭＷＣＯ膜に対して繰り返し限外濾過することによって精製し、その後０．２μｍのフィルターを通して濾過した。
【０１３０】
ＣＭＲＤ被覆されたＵＳＰＩＯのカルボキシメチル化の程度のコロイドサイズに対する影響を比較した。実施例３１〜３６、表６。得られたコロイドのＭＶＤ値は、生成物１ｇ当たり１１０乃至１２６５マイクロモルのカルボキシルを含むＣＭＲＤ製剤の間でかなり均一であった。
【０１３１】
実施例３７．１ｇ当たり１，１０８マイクロモルのカルボキシルを有するカルボキシメチル還元デキストランＴ１０と塩化第二鉄溶液の混合
粒子の合成における１つの工程として、塩化第二鉄（０．３ｇ）を１５ｍｌの水中に溶解し、０．２μｍの細孔サイズのフィルターを通して濾過した。カルボキシメチル還元デキストラン（実施例６で調製されたもの）を添加し、混合物を振盪し、そして１０℃まで冷却した。沈殿物は観察されなかった。
【０１３２】
【表６】
実施例３８．１ｇ当たり１，２６２マイクロモルのカルボキシルを有するカルボキシメチル還元デキストランＴ１０と塩化第二鉄溶液の混合
塩化第二鉄（０．３ｇ）を１５ｍｌの水中に溶解し、０．２μｍの細孔サイズのフィルターを通して濾過した。カルボキシメチル還元デキストラン（実施例７で調製されたもの）を添加し、混合物を振盪し、そして１０℃まで冷却した。沈殿物は観察されなかった。
【０１３４】
実施例３９．１ｇ当たり１，４０４マイクロモルのカルボキシルを有するカルボキシメチル還元デキストランＴ１０と塩化第二鉄溶液の混合
塩化第二鉄（０．３ｇ）を１５ｍｌの水中に溶解し、０．２μｍの細孔サイズのフィルターを通して濾過した。カルボキシメチル還元デキストラン（実施例８で調製されたもの）を添加し、混合物を振盪し、そして１０℃まで冷却した。沈殿物は観察されなかった。
【０１３５】
実施例４０．１ｇ当たり１，５２８マイクロモルのカルボキシルを有するカルボキシメチル還元デキストランＴ１０と塩化第二鉄溶液の混合
塩化第二鉄（０．３ｇ）を１５ｍｌの水中に溶解し、０．２μｍの細孔サイズのフィルターを通して濾過した。カルボキシメチル還元デキストラン（実施例９で調製されたもの）を添加し、混合物を振盪し、そして５℃まで冷却した。オレンジ白色の沈殿物が観察された。
【０１３６】
実施例４１．１ｇ当たり１，８８７マイクロモルのカルボキシルを有するカルボキシメチル還元デキストランＴ１０と塩化第二鉄の混合
六水和塩化第二鉄（３０．３ｇ）及び塩化第一鉄（１４．８ｇ）を４０２．９ｍｌの水中に溶解し、０．２μｍの細孔サイズのフィルターを通して濾過した。カルボキシメチル還元デキストランＴ１０（１，０３３ｍｌ中４０．３ｇ、実施例１５で調製されたもの）を添加し、混合物を振盪し、そして５℃まで冷却した。オレンジ白色の沈殿物が観察された。
【０１３７】
ＣＭＲＤ−ＵＳＰＩＯ合成の第１の工程、即ち、ＣＭＲＤの水性混合物を塩化鉄溶液と組み合わせる工程に対するＣＭＲＤのカルボキシメチル化の程度を変えることの影響を分析した。様々なＣＭＲＤ製剤を一定の鉄濃度で鉄塩と混合したが、これらのＣＭＲＤ製剤は実施例３７〜４１に記載されているようにカルボキシメチル化の程度においてのみ異なっていた。デキストラン１ｇ当たり１，１０８から１，４０４マイクロモルのカルボキシルまで、ＣＭＲＤは塩化第二鉄の存在下に均一な混合物を形成した（表７）。
【０１３８】
【表７】
デキストラン１ｇ当たり１，４０４マイクロモルのカルボキシルを超えたところでは、ＵＳＰＩＯの合成の条件及び濃度下での塩化第二鉄のＣＭＲＤ溶液への添加は、オレンジ白色の沈殿物を生成した。多くの化合物が可溶性になるより高い温度においてさえ、沈殿は残った。表７中のデータは、ＣＭＲＤ−ＵＳＰＩＯの合成の好ましい方法中で使用できるＣＭＲＤの改質において上位の水準が存在することを示す。
【０１４０】
実施例４２．酸化鉄ゾルの合成及び未処理デキストラン、還元デキストラン、及びＣＭＲＤによるそれらの安定化：磁性ゾルの製造
磁性ゾルを製造するために、２５℃の６０ｇの２８％水酸化アンモニウムを、３２１ｇの水中に３０．０ｇの六水和塩化第二鉄及び１５．１ｇの四水和塩化第一鉄を有する溶液に添加した。５分間の混合後、十分に濃縮されたＨＣｌを添加して１．６のｐＨを得た。希釈剤として水を使用して、ゾルを１００ｋＤａのＭＷＣＯ膜フィルターで限外濾過して、３．２５のｐＨを達成した。磁性ゾルを細孔サイズ０．２μｍのフィルターに通し、その後５０ｍｇＦｅ／ｇまで濃縮し、そして５℃で貯蔵した。鉄の収率は５５％であり、そして生成物は１６ｎｍのＭＶＤを有することが観測された。
【０１４１】
実施例４３．酸化鉄ゾルの合成及び未処理デキストラン、還元デキストラン、及びＣＭＲＤによるそれらの安定化：非磁性ゾルの製造
３０ｍｌの水中の２．９ｇの六水和塩化第二鉄の溶液に、１０ｍｌの１０ＭのＮａＯＨを添加した。混合物を５分間撹拌し、水で２００ｍｌまで希釈し、そして生成物を濾過によって収集した。残渣を水と再び混合し、そして濾過した。残渣を４０ｍｌの水に添加し、そしてｐＨを２．０に調節した。生成物は１０ｎｍのＭＶＤを有することが観測された。
【０１４２】
実施例４４．酸化鉄ゾルの合成及び未処理デキストラン、還元デキストラン、及びＣＭＲＤによるそれらの安定化：還元デキストランＴ１０による磁性ゾルの被覆
還元デキストランＴ１０（６０ｍｇ；実施例３）を１．７４ｍｌの水中に溶解し、実施例４２に従って製造された磁性ゾル（１３ｍｇＦｅ）の０．２４ｍｌと組み合わせた。混合物を１５分間インキュベートし、そして水酸化ナトリウムでｐＨを７．４に調節した。粒度（ＭＶＤ）は８５ｎｍであることが判明した。
【０１４３】
実施例４５．酸化鉄ゾルの合成及び未処理デキストラン、還元デキストラン、及びＣＭＲＤによるそれらの安定化：未処理デキストランＴ１０による磁性ゾルの被覆
未処理デキストランＴ１０（６０．８ｍｇ）を１．７４ｍｌの水中に溶解し、実施例４２に従って製造された磁性ゾル（１３ｍｇＦｅ）の０．２４ｍｌと組み合わせた。混合物を１５分間インキュベートし、そして水酸化ナトリウムでｐＨを７．４に調節した。粒度（ＭＶＤ）は１，９７３ｎｍであることが判明した。
【０１４４】
実施例４６．酸化鉄ゾルの合成及び未処理デキストラン、還元デキストラン、及びＣＭＲＤによるそれらの安定化：ＣＭＲＤ Ｔ１０による磁性ゾルの被覆
７５ｍｇのＣＭＲＤ Ｔ１０（実施例５）を１．３４ｍｌの水中に溶解し、実施例４２に従って製造された磁性ゾル（３３ｍｇＦｅ）の０．６６ｍｌに添加した。混合物を３７℃で１５分間インキュベートし、そして水酸化ナトリウムでｐＨを７．９５（±０．４）に調節した。３００ｋＤａの限外濾過フィルターを使用して混合物を濃縮した。生成物は４１ｎｍのＭＶＤを有することが観測された。
【０１４５】
実施例４７．酸化鉄ゾルの合成及び未処理デキストラン、還元デキストラン、及びＣＭＲＤによるそれらの安定化：磁性ゾルのｐＨの７．４への調節
実施例４２において製造された磁性ゾルをｐＨ７．４に調節した。沈殿が観察された。
【０１４６】
実施例４８．酸化鉄ゾルの合成及び未処理デキストラン、還元デキストラン、及びＣＭＲＤによるそれらの安定化：ＣＭＲＤ Ｔ１０による非磁性ゾルの被覆
実施例４３に従って製造された非磁性ゾル（３５ｍｌ）を、実施例５に従って製造されたＣＭＲＤ Ｔ１０の５０ｍｇ／ｇ水溶液の３５ｍｌに滴下して加えた。１ＮのＮａＯＨを使用してｐＨを７．０に調節し、溶液を沸騰するまで加熱し、室温まで冷却し、そして６，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離を行った。上澄液を０．２μｍの細孔サイズを有するフィルターに通し、そして１２１℃で３０分間オートクレーブ処理した。生成物は８６ｎｍのＭＶＤを有することが観測された。
【０１４７】
実施例４２〜４８は、デキストランの不存在下、又は未処理デキストランの存在下においては、大きな鉄の沈殿が形成することを示す。還元デキストランとＣＭＲＤのみが安定なコロイドとして磁性ゾルを産出した。
【０１４８】
実施例４９．塩化第二鉄とＣＭＲＤの塩基共沈を使用するＣＭＲＤで被覆された非磁性酸化鉄コロイドの製造
カルボキシメチル還元デキストランＴ１０（１９．２ｇ）（実施例５）を３００ｇの水中に溶解し、０．２μｍのフィルターを通して濾過し、そして追加の１６０．８ｇの水を添加した。この溶液を、０．２μｍのフィルターで濾過された０．３Ｍの六水和塩化第二鉄水溶液の１２０ｍｌに添加した。この混合物に３２ｍｌの６Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加した。混合物を１００℃に３時間加熱し、室温まで冷却し、５０ｍｌの最終体積になるまで限外濾過した。生成物は３０ｎｍのＭＶＤを有することが観測された。この材料の一部を窒素下のビンに１２１℃で３０分間入れた。オートクレーブ処理された生成物は６９ｎｍのＭＶＤを有していた。
【０１４９】
実施例５０．オートクレーブ処理の還元デキストランコロイド及び未処理デキストランコロイドに対する影響：及び未処理デキストラン及び還元デキストラン及びＣＭＲＤで被覆されたＵＳＰＩＯのオートクレーブ処理に対する安定性
各々が２０ｍｇＦｅ／ｇの濃度の複数のコロイド製剤を１２１℃で３０分間オートクレーブ処理した。オートクレーブ処理に続いて、フェノール／硫酸アッセイを使用して、全デキストランと遊離デキストランの差として計算される結合されたデキストランの測定を行った。遊離のデキストランは限外濾過によってコロイドから分離された。表８は、還元デキストランで被覆されたＵＳＰＩＯを有するコロイド製剤が、未処理デキストランで被覆されたＵＳＰＩＯよりも大きい安定性を有することを示す。還元デキストランで被覆されたＵＳＰＩＯはオートクレーブ処理後にその小さいサイズを維持した。なぜならば、オートクレーブ処理後の材料のＭＶＤは、オートクレーブ処理前の材料のＭＶＤと比較して１．３倍しか増加していなかったからである。対照的に、未処理デキストランで被覆されたＵＳＰＩＯはオートクレーブ処理後にサイズが２８倍に増加した。これらのデータは、オートクレーブ処理後に、還元デキストランは、未処理デキストランと比較して、鉄粒子により緊密に結合したままであることを示す。
【０１５０】
ＵＳＰＩＯを被覆するために還元デキストランを使用することによって本発明において達成された増加した安定性の第２の種類は、バルク（ｂｕｌｋ）溶媒のｐＨの特性である。オートクレーブ処理後に還元デキストランで被覆されたＵＳＰＩＯのｐＨは０．９ｐＨ単位低下したが、これに対して未処理デキストランで被覆されたＵＳＰＩＯについては１．６ｐＨ単位低下した。
【０１５１】
オートクレーブ処理プロセスに対するさらに大きい安定性が、カルボキシメチル未処理デキストランとの比較において、カルボキシメチル還元デキストランで被覆された粒子に関して観察された。表９中のデータは、カルボキシメチル非還元未処理デキストランで被覆されたＵＳＰＩＯがオートクレーブ処理後に粒状物質の量の１０〜５０倍の増加を示したことを示している。対照的に、カルボキシメチル還元デキストランで被覆されたＵＳＰＩＯはオートクレーブ処理時にサイズや量の変化を受けなかった。コロイド懸濁液及びバルク溶媒に与えるカルボキシメチル還元多糖被覆の安定化効果のもう１つのしるしは、溶媒のｐＨの安定性であった。表８及び９の両方中のデータは、還元デキストランで被覆された粒子が、未処理デキストランで被覆されたものと比較して、オートクレーブ処理後にかなり改善されたｐＨ安定性を有したことを示す。
【０１５２】
実施例５１．様々な造影剤の緩和特性を決定するための手順
核磁気（ＮＭ）測定値（０．４７Ｔ）を２０ＭＨＺ（プロトン）で運転されるＢｒｕｋｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製ｐｃ１２０卓上ＮＭサンプル分析器中で得た。０．５ｍｌの各々のサンプルをミニスペック（ｍｉｎｉｓｐｅｃ）上の緩和性（ｒｅｌａｘｉｖｉｔｙ）測定用の１０ｍｍＮＭ管に入れた。サンプル室中のサンプルの配置を最適化した。標準サンプルを試験し、それらの値を対数で記録した。
【０１５３】
【表８】
【表９】
Ｔ１及びＴ２測定に対して標準的手順を使用し、それらの値を記録した。Ｔ１は逆転回復（ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ ｒｅｃｏｖｅｒｙ）技術を使用して測定した。ＩＲ技術によれば、磁化を検出の平面に入れるために、サンプルは１８０°のパルスにさらされ、その後９０°のパルスにさらされる。サンプリング後、１８０°のパルスと９０°のパルスとの間の時間が変えられ、そして再びサンプリングされる。これは幾つかの期間に対して行われる。得られるシグナルは、式[Ｍ∞−Ｍ（ｔ）]／Ｍ∞＝（１−ｃｏｓθ）ｅｘｐ（−ｔ／Ｔ１）によって決定される。データに対する３つのパラメータ適合が行われるとき、Ｍ∞、θ、及びＴ１が計算される。Ｔ２はＣＰＭＧ技術を使用して測定され、可変長さの１８０°パルスの線形の列がサンプルに供給される。毎秒ごとのエコーの大きさが測定される。２つのパラメータ（Ｍ０及びＴ２）適合を使用して、蓄積されたデータに対して適合が行われる。Ｍ（ｔ）＝Ｍ０ｅｘｐ（−ｔ／Ｔ２）の場合、ｔに対するｌｎ（Ｍ（ｔ））のグラフは−１／Ｔ２の傾きを有する直線である。Ｔ１及びＴ２の逆がサンプルの鉄濃度に対してグラフ化された。最良適合線の傾きから、緩和性が決定された。
【０１５６】
【表１０】
実施例５２．ラットにおける毒性の研究。ラットにおける還元デキストラン、非還元デキストラン、及びＣＭＲＤ被覆されたコロイドの毒性
デキストランに対するアナフィラキシーショック型の反応が、ラットによって及び小さいが有意の割合の人の群によって示され得る（Ｓｑｕｉｒｅ， Ｊ．Ｒ．ら、“Ｄｅｘｔｒａｎ， Ｉｔｓ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ Ｕｓｅ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，” Ｃｈａｒｌｅｓ Ｃ． Ｔｈｏｍａｓ， Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ， ＩＬ， １９５５）。その反応はアナフィラキシーショックに似ているが、前もっての感化（ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ）を必要とせず、そしてラットにおいては疲労の急速な進行、広がった末梢の血管拡張、及び脚、鼻、及び舌の浮腫によって特徴付けられる（Ｖｏｏｒｈｅｅ， Ａ．Ｂ．ら，Ｐｒｏｃ． Ｓｏｃ． Ｅｘｐ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ． １９５１， ７６：２５４）。バルビツール酸塩麻酔が同時に行われる場合、それは著しい血圧低下及びチアノーゼを生じる（Ｈａｎｎａ， Ｃ．Ｈ．ら， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． １９５７， １９１：６１５）。
【０１５８】
酸化鉄コロイドの被覆中の、非還元の未処理デキストランよりもむしろ、還元デキストラン又はそれらの誘導体の存在が、静脈内注入時に可能性のある人の有害な反応を減少させることができるか又は除去できるかを決定するために、ラットの脚の浮腫反応の程度を測定する手順を使用した。ラットの脚の浮腫は、肢体容積計（これは示差体積測定装置である）を使用して、試験材料の注入の前後の脚の体積として測定される。試験材料の投与量を注入し、指示された時間間隔の後２回目の読み取りを行い、そして脚の体積の変化のパーセントが計算された。これらの研究において投与された１回分の投与量は、体重１ｋｇ当たり１００ｍｇＦｅであり、ラット、ブタ、及び人において映像化剤として使用される量よりもずっと多い投与量であった（実施例５３〜５６を参照のこと）。
【０１５９】
還元デキストランＴ１０及び非還元デキストランＴ１０の各々で被覆された酸化鉄の投与後に観察された結果を表１１に示す。未処理非還元デキストラン被覆を有するＵＳＰＩＯ製剤を投与されたラットと比較して、被覆として還元デキストラン又は還元デキストラン誘導体を有するＵＳＰＩＯ製剤を投与されたラットにおいては、浮腫状のアナフィラキシー反応の著しい減少が観察された。
【０１６０】
【表１１】
浮腫のパーセントとして測定される、アナフィラキシー反応の程度に対する、カルボキシメチル置換の増加した水準を有するＣＭＲＤ−ＵＳＰＩＯ製造の影響が、表１２に示される。データは、浮腫反応を減少させるためには、ある最低水準の置換が必要であること、及び一旦この置換最低量が達成された後はラットのデキストランに対する反応の減少は浮腫反応の消滅という驚くべきものであることを示す。即ち、１ｇ当たり１，２６５マイクロモルのカルボキシルにおいては浮腫は観察されなかった。
【０１６２】
実施例５３．還元デキストラン及び非還元デキストランのラットにおける毒性の研究
被覆単独、即ち、非還元の未処理デキストランよりもむしろ還元デキストラン又はそれらの誘導体が、静脈内注入時に可能性のある人の有害な反応を除去できるかを決定するために、実施例５２において使用された手順を使用した。実施例５２と同様に、ラットの脚の浮腫を注入の前後の脚の体積として測定した。これらの研究において投与された１回分の投与量は、上述したように、体重１ｋｇ当たり１００ｍｇの試験物質であった。
【０１６３】
【表１２】
還元Ｔ１０デキストラン及び非還元Ｔ１０デキストランの投与に続いて観察された結果は、各々の材料について同様であった（表１３）。還元デキストランＴ１０は、未処理デキストランＴ１０と同じ程度の浮腫を引き起こした。浮腫の消滅又は低減は、デキストランの還元のみに原因があるとすることはできなかった。
【０１６５】
【表１３】
表１４は、浮腫のパーセントとして測定されるアナフィラキシー反応の程度に対する、還元デキストランのカルボキシメチル置換の水準を増加させることの影響を示す。これらのデータは、カルボキシメチル置換のある最低水準より上では、浮腫が減少したか又は消滅したことを示す。置換のこの最低水準より上のデキストランについて、デキストランに対するラットの毒性反応における減少は、反応の驚くべき消滅であった。即ち、浮腫は観察されなかった。
【０１６７】
【表１４】
実施例５４．ラットにおけるＣＭＲＤ被覆されたＵＳＰＩＯの薬物動態：血液クリアランス
３匹の雄性のＣＤ（登録商標）ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，マサチューセッツ州ウィルミングトン；重量範囲２７２〜２９０ｇ）に長時間持続麻酔薬イナクチン（Ｉｎａｃｔｉｎ）（体重１ｋｇ当たり１００ｍｇ）で腹腔内麻酔を実施した。股動脈及び静脈を腰−大腿関節（ｈｉｐ−ｆｅｍｕｒ ｊｏｉｎｔ）のところで小切開によって露出させ、この動脈にヘパリン化された生理的食塩水（１ｍｌ当たり１０単位）の充填された１ｍｌのシリンジに接続されたＰＥ５０チューブでカニューレを挿入した。基準として役立てるために、０．２５ｍｌの動脈血を時間０で採取し、そしてＣＭＲＤ被覆されたＵＳＰＩＯ（実施例３１）を股動脈に注入した。０．２５ｍｌの血液サンプルを図４及び５中に示した時間に採取した。
【０１６９】
Ｔ２磁気緩和時間を各々のサンプルにおいて測定し、そして緩和性（１／Ｔ２）を計算した。一次反応速度論を使用して血液中のサンプルの半減期（ｔ１／２）を決定した。データの適合に使用した式は、
１／Ｔ２−１／Ｔ基準＝Ａｅ−ｋｔ
であり、式中、１／Ｔ２は注入後の時刻ｔにおける血液の緩和性であり；１／Ｔ基準は基準緩和性であり、そしてＡｅ−ｋｔは血液からの試験材料の一次減衰を表す。この式の各々の側の自然対数を取ると、
ｌｎ（１／Ｔ２−１／Ｔ基準）＝−ｋｔ＋ｌｎＡ０
が得られる。
【０１７０】
この第２の式によれば、血液からのＵＳＰＩＯの除去の速度が一次速度論に従うならば、時間ｔに対するｌｎ（１／Ｔ２−１／Ｔ基準）のグラフは、傾き−ｋ（一次速度定数）及び切片ｌｎＡ０（これは時間０でのｌｎ（１／Ｔ２−１／Ｔ基準）に等しい）を有する直線を与える。図５は、直線が得られたことを示す。半減期（ｔ１／２）（これは、ＣＭＲＤ被覆ＵＳＰＩＯの量が血液中のその濃度の半分まで減少したときの時間である）は６７分であることが決定され、９５％の信頼水準で６１〜７５分の範囲内である。
【０１７１】
実施例５５．ラットにおけるＣＭＲＤ被覆ＵＳＰＩＯを使用する核磁気共鳴映像化
体重１ｋｇ当たり５ｍｇのＣＭＲＤ被覆ＵＳＰＩＯ（実施例３１）を投与して直ぐに取ったラットのＭＲＩスキャンを図６Ｂに示す。心臓、大動脈、及び冠状動脈がこの薬剤を使用して容易に映像化されることが判明した。試験物質の投与によって生じたコントラストの大幅な上昇を示すために、薬剤の投与前に取られたラットの映像（図６Ａ）も添付した。
【０１７２】
実施例５６．ブタ中のＣＭＲＤ被覆ＵＳＰＩＯのＭＲＩ
図７は、ブタの心臓及びその周りの動脈、並びに肺及び腎臓の改善されたＭＲＩ視覚化を示す。サンプル（実施例３１）の体重１ｋｇ当たり０．４、０．８、１．６、及び２．２ｍｇの４種の投与量をそれぞれブタに順次的に投与した。各々の投与の後に２０ｍｌの生理的食塩水を投与し、そしてＭＲＩ映像は各々の投与の後に得た。図７Ｂに示す像は、各々の投与の後に得られた像を表すものである。薬剤によって生じたコントラストの大幅な上昇を示すために、ブタの投与前の像（図７Ａ）も添付した。
【０１７３】
低分子量のガドリニウムに基づく造影剤に関連する問題は、それらが血管空間から細胞間空間へ漏れ、ぼんやりとしたバックグラウンドを作り出すことである。このぼんやりとしたバックグラウンドは、単一回の検査中に投与される第２又は第３の造影剤の注入の有効使用を妨げる。そのような血管外への漏れは、カルボキシメチル還元デキストランで被覆されたＵＳＰＩＯについては、ガドリニウム造影剤の粒子のサイズと比較して、粒子のサイズが比較的大きいため、予想されないのかもしれない。
【０１７４】
この予想は、ラットの映像化（実施例５５）によって及びブタの映像化（図７Ｂ）によって得られたデータにおいて確認された。本発明のＣＭＲＤ ＵＳＰＩＯ組成物の使用の後にぼんやりとしたバックグラウンドは観察されなかった。この観察は、追加の投与量の連続的な投与の後、追加の血管の映像化検査の実施を可能にする。静脈内投与時に、本発明の態様であるＣＭＲＤ被覆ＵＳＰＩＯは、塊薬として速やかに動脈、器官、及び静脈に移動し、２０分後血液中において均一な分布を達成した。薬剤の第２の塊薬の投与時に、追加の良好な映像が得られた。第３及び第４の注入が同様な結果をともなって投与された（即ち、良好な映像が得られた）。このようにして、ＣＭＲＤ被覆ＵＳＰＩＯの塊薬注入と一次通過適用のプロセスが示された。さらに、第１の投与後かなり短い時間内の複数回の注入プロトコル（全体のプロトコルは映像化施設への人の被験者による１回の訪問に相当する期間内に行われる）の適用も示された。
【０１７５】
１回の検査中において複数回の塊薬注入を行い得ることの主要な利点は、１回の注入後に生じる可能性のある映像中の欠陥を修正する機会があること、及び１回の検査中に体の複数の部分を映像化する機会があることである。このようにして、より早期の通過からのスキャンとより早期の映像の分析の後短い期間の内に、被験者の体の追加の部分を映像化することができ、その後の造影剤の注入を異なる視界を得るため、又は１つ以上の物理的次元において視界を広げるために使用することができる。例えば、脚のような肢中の凝血塊の位置と大きさの詳細な分析を、第１、第２、及びそれに続く通過の各々において取られた連続する視界を使用して、行うことができる。
【０１７６】
第１の投与の後、本発明の組成物の投与の追加の複数回の通過を達成し、そして追加の循環のＭＲＩデータを得ることができる能力は、本発明の態様である組成物の強力な利点を提供する。ＭＲＩ分析は、過去において、映像化の必要な解剖学的特徴の物理的長さによって、及び所定期間内に単一の検出装置を使用して映像化できる構造の数によって、制約されてきた。
【０１７７】
ブタにおいて得られた結果は、人の被験者においても観察された（実施例５７及び５８）。
【０１７８】
実施例５７．通常の人の被験者へのＣＭＲＤ被覆されたＵＳＰＩＯの静脈内注入
この試験計画は、各々が実施例３１に従って製造されたＣＭＲＤ Ｔ１０被覆されたＵＳＰＩＯの１回分の投与量（増加量；体重１ｋｇ当たり１〜４ｍｇ）を投与された３５人の人間の被験者を使用した。実施例５７及び５８の目的は、この処置の可能性のある副作用に関して被験者を検査すること、ＭＲＩ造影剤としての組成物に関するデータを得ること、及び血液中の組成物の半減期を測定することである。
【０１７９】
最も多い投与量（４ｍｇ／ｋｇ）を含めて、全ての投与量において処置された被験者の中に、組成物の投与に原因がある可能性のある有害な反応は観察されなかった。比較のために述べると、Ｆｅｒｉｄｅｘ Ｉ．Ｖ．（登録商標）の臨床試験において、Ｆｅｒｉｄｅｘ Ｉ．Ｖ．（登録商標）及び同様な映像化製品は有害な結果を最小化し有用なコントラストを得るためにずっと少ない投与量（例えば、体重１ｋｇ当たり０．５６ｍｇ）で投与されるのにもかかわらず、約２〜３％の処置を受けた患者が背中の痛みを報告した。これらのデータは、有効投与量の本発明のＣＭＲＤ被覆ＵＳＰＩＯ粒子が有効投与量の以前に認可を受けた映像化剤であるＦｅｒｉｄｅｘ Ｉ．Ｖ．（登録商標）よりも安全であることを示してる。
【０１８０】
実施例５８．人の被験者中の速やかな映像化速度及び生体分布
実施例３１と同様にして製造されたＣＭＲＤ被覆ＵＳＰＩＯの人の被験者への最初の静脈内塊薬注入は、投与後１２秒以内に循環系の動脈部分の鮮明なＭＲＩをもたらした（図８Ｂ）。さらに１５秒後、ＭＲＩ露出は、器官と静脈の鮮明な像をもたらした。血管系全体にわたる薬剤の平衡は２０分以内に達成された。
【０１８１】
本発明のＣＭＲＤ被覆ＵＳＰＩＯの投与に続く初期の段階において映像化され得る器官は、心臓、動脈、及び静脈を含む。さらに、循環系の比較的大きいこれらの要素に加えて、四肢（指、足指）の細動脈及び細静脈を観察できた。この水準の解像度は、静脈炎の領域の検知と位置測定を含む、四肢内の血液循環における問題の診断への用途を可能にする。容易に映像化されたその他の器官は、脳、腎臓、肝臓、脾臓、及び骨髄を含む。リンパ節は、有効投与量の投与の後数時間までに映像化できた。血液中の薬剤の半減期はおおよそ１０〜１４時間であることが観察された（表１５及び図９を参照のこと）。
【０１８２】
粒子は、最終的には、細網内皮系によって吸収されることによって血液循環から除去された。血管系中に初期の段階において組成物が存在している間、及びまた細網内皮系（ＲＥＳ）中に後の又は血管後の段階において組成物が存在している間、この組成物の細胞間空間への侵入は観察されなかった。従って、その他の組成物、例えば、Ｍａｇｎｅｖｉｓｔ（登録商標）及びＤＯＴＯＲＥＭ（登録商標）のようなガドリニウムに基づくＭＲ造影剤の使用にともなって現れることが判明したぼんやりとしたバックグラウンドは、本明細書の実施例の方法によって合成されたＣＭＲＤ−ＵＳＰＩＯの使用中には避けられる。
【０１８３】
【表１５】
【図面の簡単な説明】
【図１】 実施例５で得られたカルボキシメチル還元デキストラン（ＣＭＲＤ）のフーリエ変換赤外（ＦＴＩＲ）スペクトル分析を示す。
【図２】 実施例３１で得られたＣＭＲＤナトリウム塩で被覆された超微粒な超常磁性の酸化鉄（ＵＳＰＩＯ、米国特許第５，０５５，２８８を参照）のＦＴＩRスペクトル分析を示す。
【図３】 出発物質の還元デキストランとの反応に用いられた臭化酢酸の量ｍｇ／グラム（横座標）の関数として、生成物１グラム当たりのカルボキシメチル基の量（マイクロモル）（縦座標）を表すグラフである。
【図４】 体重１ｋｇ当たり２．２ｍｇの鉄の静脈内投与後、三匹の雄性ラットの血液中でのＣＭＲＤ被覆ＵＳＰＩＯの薬物動態を示す。血液試料（０．２５ｍｌ）は、横座標で示された時間に採取され、緩和時間は、ＢｒｕｃｋｅｒＭｉｎｉｓｐｅｃ分光計で測定された。
【図５】 ラット血液中でのＣＭＲＤ被覆ＵＳＰＩＯの半減期（６７分）を決定するために用いられたグラフを示す。図４のデータは、図５中のグラフを作るために用いられた。６１乃至７５分の半減期の範囲は、９５％の信頼性係数内にある。
【図６】 ラットのＭＲＩ（造影剤の投与前（Ａ）及び投与後（Ｂ）、上が前方部）を示す。投与後の造影像を取る前に、ＣＭＲＤ被覆ＵＳＰＩＯ（体重１ｋｇ当たり５ｍｇの鉄）が大腿静脈に投与された。図は、ＣＭＲＤ被覆ＵＳＰＩＯの投与によって引き起こされた心臓及び周辺の動脈と静脈の高められた視覚化を例証する。映像化は、ジェネラル・エレクトリック社２テルサ磁気共鳴画像化機を用いて行われた。
【図７】 豚のＭＲＩ像（造影剤の投与前（Ａ）及び投与後（Ｂ）、上が前方部）を示す。投与後の造影像を取る前に、ＣＭＲＤ被覆ＵＳＰＩＯ（実施例３１、体重１ｋｇ当たり４ｍｇの鉄）が大腿静脈に投与された。図は、ＣＭＲＤ被覆ＵＳＰＩＯの投与によって引き起こされた心臓及び周辺の動脈と静脈の高められた視覚化を例証する。映像化は、ジーメンス社１．５Ｔ ＭａｇｎａｔｏｍＶｉｓｏｎ磁気共鳴画像化機を用いて行われた。
【図８】 造影画像剤の投与前（Ａ）及び投与後（Ｂ）の、正常な人被験体の前方部のＭＲＩ像を示す。造影化後の画像を取る前に、ＣＭＲＤ被覆ＵＳＰＩＯ（実施例３１、体重１ｋｇ当たり４ｍｇの鉄）が腕の静脈に塊薬として投与された。造影剤の投与後１５乃至３０分間、映像化が行われた。画像は、心臓及び周辺の動脈と静脈の高められた視覚化を例証する。
【図９】 人における画像化剤の血液クリアラス速度を示す。血液試料を取る前に、ＣＭＲＤ被覆ＵＳＰＩＯ（体重１ｋｇ当たり４ｍｇの鉄）が腕の静脈に塊薬として投与された。ＣＭＲＤ被覆ＵＳＰＩＯの血中濃度を決定するために、１／Ｔ２緩和について試料が分析された。グラフは、時間（横座標）の関数としてＣＭＲＤ被覆ＵＳＰＩＯの濃度（縦座標）を示す。
Claims (26)
- 哺乳類の被験体への投与のための酸化鉄錯体を生産する方法であって、該方法は、多糖を硼水素化塩、または水素化触媒の存在下での水素と反応させて、還元多糖を製造する工程、該還元多糖をカルボキシアルキル化する工程、該カルボキシアルキル化された還元多糖を鉄の塩と錯体化し、それによって、カルボキシアルキル化された還元多糖の酸化鉄錯体の溶液を製造する工程、水酸化アンモニウムを加えて該溶液を中和する工程、及び該錯体をオートクレーブ処理で滅菌する工程からなり、製造された該錯体が少なくとも１００℃の温度で安定である、方法。
- 前記還元多糖が、還元されたグルコースのポリマーである、請求項１に記載の方法。
- 前記還元されたグルコースのポリマーが、還元デキストランである、請求項２に記載の方法。
- 前記鉄の塩が、第二鉄塩と第一鉄塩の混合物である、請求項１に記載の方法。
- 哺乳類の被験体への投与が、人への投与である、請求項１に記載の方法。
- ナトリウム塩として単離された、カルボキシアルキル化された還元多糖が、１６５０ｃｍ−１乃至１８００ｃｍ−１の領域に赤外吸収ピークを含まない、請求項１に記載の方法。
- 前記カルボキシアルキル化された還元多糖の製造が、５０℃より低い温度で達成される、請求項１に記載の方法。
- 前記カルボキシアルキル化された還元多糖の製造が、４０℃より低い温度で達成される、請求項７に記載の方法。
- 前記酸化鉄が超常磁性である、請求項１に記載の方法。
- 請求項１に記載の方法により得られ得るカルボキシル化された還元多糖の酸化鉄錯体。
- 製造された錯体が１２１℃の温度で安定である、請求項１０に記載のカルボキシアルキル化された還元多糖の酸化鉄錯体。
- 請求項１１に記載のカルボキシル化された還元多糖の酸化鉄錯体であって、該錯体が少なくとも１２１℃の温度で、該錯体を滅菌するのに有効な時間安定である、錯体。
- 請求項１２に記載の還元多糖の酸化鉄錯体であって、前記カルボキシアルキル化された還元多糖が、カルボキシメチル還元多糖、カルボキシエチル還元多糖、及びカルボキシプロピル還元多糖から成る群から選択される、錯体。
- 請求項１３に記載の還元多糖の酸化鉄錯体であって、前記還元多糖が還元デキストランである、錯体。
- 請求項１３に記載の還元多糖の酸化鉄錯体であって、前記カルボキシアルキル化された還元デキストランがカルボキシメチル還元デキストランである、錯体。
- 請求項１４に記載の還元多糖の酸化鉄錯体であって、前記カルボキシアルキル化された還元デキストランが、多糖１ｇ当たり少なくとも７５０マイクロモルのカルボキシル基を含む、錯体。
- 請求項１６に記載の還元多糖の酸化鉄錯体であって、前記カルボキシアルキル化された還元デキストランが、多糖１ｇ当たり少なくとも９００マイクロモルのカルボキシル基を含む、錯体。
- 請求項１７に記載の還元多糖の酸化鉄錯体であって、前記カルボキシアルキル化された還元デキストランが、多糖１ｇ当たり少なくとも１１００マイクロモルのカルボキシル基を含む、錯体。
- 請求項１７に記載の還元多糖の酸化鉄錯体であって、前記カルボキシアルキル化された還元デキストランが、多糖１ｇ当たり１５００マイクロモルより少ないカルボキシル基を含み、該錯体が、実質的な粒子を形成しない、錯体。
- 被験体の生体内ＭＲＩ用の造影剤を生産する請求項１に記載の方法であって、該方法は、請求項１に記載の方法に従って製造されるカルボキシメチル化された還元された超微粒な超常磁性の酸化鉄錯体である組成物を配合する工程、及び最後に該組成物をオートクレーブ処理によって滅菌する工程からなり、生産された該造血剤が少なくとも１００℃の温度で安定である、方法。
- 鉄の不足した被験体を治療するための造血剤を生産する方法であって、該方法は、請求項１に記載の方法に従って製造されるカルボキシメチル化された還元された超微粒な超常磁性の酸化鉄錯体である組成物を配合する工程、及び最後に該組成物をオートクレーブ処理によって滅菌する工程からなり、生産された該造血剤が少なくとも１００℃の温度で安定である、方法。
- オートクレーブされた組成物を単位投与量で生産する更なる工程を有する、請求項２０又は２１に記載の方法。
- 請求項１の方法に従って製造される、カルボキシアルキル化された還元多糖の酸化鉄錯体であって、該錯体は１２１℃の温度で安定であり、該錯体のナトリウム塩は、１６５０ｃｍ−１乃至１８００ｃｍ−１の領域に赤外吸収ピークを含まない、錯体。
- 前記多糖が、カルボキシメチル化される、請求項２３に記載のカルボキシアルキル化された還元多糖の酸化鉄錯体。
- 請求項１に記載の方法に従って製造される、注入可能なカルボキシメチル化された還元デキストランの酸化鉄錯体を含有する、バイアル入薬学的組成物であって、該カルボキシメチル化された還元デキストランが、デキストラン１ｇ当たり少なくとも７５０マイクロモルのカルボキシル基を含み、かつ、１５００マイクロモルより少ないカルボキシル基を含み、ここで、該錯体が少なくとも１００℃の温度で安定である、組成物。
- 前記注入可能な錯体が、少なくとも１２１℃の温度でバイアル内部にて最後に滅菌可能である、請求項２５に記載のバイアル入薬学的組成物。
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