CN105708792A - 一种还原型羧烷基葡聚糖铁注射液及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本申请提供了一种还原型羧烷基葡聚糖铁注射液，其包括作为活性成分的还原型羧烷基葡聚糖铁，任选的酸碱调节剂和注射用水。本申请还提供了一种还原型羧烷基葡聚糖铁注射液的制备方法。本申请所提供的注射液具有比现有技术获得的铁注射液更低的可见异物检出率，具有良好的性能如物理稳定性好和/或化学稳定性好。

Description

一种还原型羧烷基葡聚糖铁注射液及其制备方法

技术领域

本申请涉及一种含铁的注射液，特别是涉及一种含有还原型羧烷基葡聚糖铁的注射液及其制备方法。

背景技术

众所周知，铁是人体必须的微量元素，由于摄入不足、利用受限或其他原因引起的铁缺乏相当普遍，缺铁性贫血是当今世界上分布最广的营养缺乏病。因此，除积极进行膳食调整，增加富铁食物的摄入外，各种补铁剂和铁强化食品的研究也十分必要。贫血乃世界第一大疾病，据世界卫生组织(WHO)统计，世界上约1/4人口(16亿人)患不同程度的贫血。

贫血病因很多，以饮食缺铁或铁利用障碍者为主的缺铁性贫血(IDA)为多，导致红细胞缺乏，使患者出现一系列临床症状和体征。临床上还有一类相对更严重的称为肾性贫血的疾病，是在慢性肾脏疾病(ChironicKidneyDisease，CKD)的基础上发生，多由肾脏促红细胞生成素(Erythropoietin，EPO)的生成不足所致，EPO的主要合成位置是在肾小管的内皮细胞中，肾病患者合成EPO的能力随着肾小球滤过率能力的降低而降低。肾性贫血的其他病因还有：铁缺乏、炎症和感染、透析不充分、严重的甲状旁腺功能充进、出血、反复抽血化验、透析失血、营养缺乏、铝中毒等。国外统计显示CKD患者中肾性贫血的患病率为40％-60％，维持性血液净化(MHD)治疗者中贫血患病率为70％-90％，即将进5165透析阶段的肾病患者中贫血患者约占75％。在2000年NKF-K/DOQI肾性贫血的临床实践指南中指出：肾性贫血(CKD贫血)会引起心脏扩大、心室肥厚、心绞痛、心输出量增力口、充血性心衰、月经周期紊乱、免疫应答障碍等一系列生理异常，儿童肾衰贫血还可以引起生长发育迟缓、智能减退等。

在治疗铁缺乏病症，存在使用口服铁盐制剂和注射补充铁盐这两种方法。目前常用的铁剂如：硫酸亚铁，存在着铁离子的腥涩味，致口感不佳，又有胃肠道刺激性，易致恶心、呕吐的缺点，难于坚持使用；而且亚铁容易氧化成高铁，致使生物利用度下降；而利用动物蛋白提取的血红素作为补铁剂，虽然吸收效果好，但是原料来源少，成本高。肌肉和静脉注射补铁途径中，铁剂与转铁蛋白结合可迅速到达骨髓，供给骨髓造血，为红细胞的生成所用，吸收好，生物利用度高，起效快，较口服铁剂的副作用更小，越来越多的被临床医生所采纳和推荐。尤其是在血液透析(HD)患者中静脉补铁的应用越来越广。

目前临床中常用的静脉注射补铁剂有低分子右旋糖酐铁(low-molecular-weightirondextran)、高分子右旋糖酐铁(high-molecular-weightirondextran)、葡萄糖酸铁钠(sodiumferricgluconate)、蔗糖铁(ironsucrose)和超顺磁氧化铁(Ferumoxytol)等。我国长期以来右旋糖酐铁占主导地位，但是由于右旋糖酐铁易发生过敏反应，会出现皮肤瘙痒、水肿和哮喘等，严重的还会使患者出现血压下降、心跳骤停的情况，因此近年来，由于静脉注射蔗糖铁具有不易发生过敏反应及急性铁中毒，不良反应发生率较低，且起效快，能够在短时期内纠正透析患者的贫血状态的优点，其临床应用已呈明显上升趋势。

上述静脉注射补铁剂均为胶体溶液，化学结构为球形的铁-碳水化合物纳米粒，纳米粒中心均为的氢氧化铁或氧化铁的核心，各种不同的碳水化合物在络合作用下包绕核心形成外壳，起到稳定核心、控制铁离子的降解、释放并维持纳米粒的悬浮状态的作用。上述静脉注射补铁剂的铁核是通过将铁盐如氯化铁用碱中和至pH为12左右，饱和氢氧根离子与铁离子形成不溶性的氢氧化铁，并在此过程中与适宜的碳水化合物如蔗糖、葡聚糖等通过其羟基或者其他基团替换铁核外表面结合的水分子而与铁核原位络合，形成一定粒径稳定的纳米颗粒。

静脉注射补铁剂的铁核心的大小和颗粒表面不同碳水化合物外壳的构成和密度上的差异，决定了上述铁剂在药理学和生物学性质的同。上述几种铁制剂分子量大小依次是：超顺磁氧化铁(Ferumoxytol)(780kD)>高分子右旋糖酐铁>低分子右旋糖酐铁>蔗糖铁>葡萄糖酸铁钠，铁核大小也如此顺序。在进行体内给药时，蔗糖铁络合物(或其它例如用葡糖酸盐、右旋糖酐、山梨醇或糊精制备的三价铁胶体)作为颗粒被网状内皮系统的巨噬细胞从血流中除去并代谢，以补充机体的血铁黄素、铁蛋白和运铁蛋白的铁贮存。

胶体铁核的粒径和表面分子的组成决定了在血液中去除的速率。铁核越小，铁制剂越不稳定，活性铁离子释放越快，由活性铁离子引起的不良反应可能性更高，也更易被机体清除，临床应用间隔时间较短，单次给药剂量也不能更高。具有较大分子量和粒径的铁核意味着更安全和长效。对提高单次给药量，减少给药次数和减少给药时间，大幅减少医疗成本，减少了患者的治疗时间和痛苦有巨大的社会意义。

为了克服右旋糖酐铁易发生过敏反应，使患者出现皮肤瘙痒、水肿、哮喘，甚至出现血压下降、心跳骤停等副作用，同时克服蔗糖铁在临床应用中存在给药次数多，单次给药量小，给药时间长的缺点，本申请提出一种新型的铁制剂。

使用还原型羧烷基葡聚糖制得的注射液没有上述口服铁的缺点，而且快速高效、定位准确、危险性低。还原型羧烷基葡聚糖铁是由氢氧化铁胶体和还原型羧烷基葡聚糖络合制备的，是一种水溶性的氢氧化铁还原型羧烷基葡聚糖复合物，其包含的铁处于非离子状态。在分子中氢氧化铁胶体组成多核铁母核，而还原型羧烷基葡聚糖通过其活泼羟基取代铁母核表面的水分子与之结合，二者的结合力为非共价键分子间力。在还原型羧烷基葡聚糖铁中，还原型羧烷基葡聚糖作为氢氧化铁胶体的增溶剂存在，还原型羧烷基葡聚糖与氢氧化铁胶体存在一个动态的平衡。这种多核約氢氧化铁核心被大量非共价键的还原型羧烷基葡聚糖分子浅浅的包绕，从而形成一个大约500Kda的大分子复合物(特别是还原型羧烷基葡聚糖铁的分子量(Mw)通常在约400000至600000道尔顿范围内)，该多核心的铁复合物结构上类似于天然存在的铁蛋白。该物质稳定性良好，可保证在生理状态下没有离子铁释放，这种稳定性能够很好的适应生理性铁的吸收利用，因此，局部组织反应和其他不良反应几乎没有发生。对还原型羧烷基葡聚糖铁稳定性的控制主要是通过控制其浊点来实现的。

具有合适的分子量范围和具有合适的稳定性是还原型羧烷基葡聚糖铁在生理状态下有序释放生理性铁和避免不良反应的很重要的前提条件。同时保证获得的注射液在不溶性微粒、热源、微生物限度等指标上符合药典对注射液的通用规定也是保证注射液安全性的条件。但是如上所述，还原型羧烷基葡聚糖铁分子中还原型羧烷基葡聚糖和铁核的结合是键能相对较小的非共价键，所以如何保证在还原型羧烷基葡聚糖铁注射液的制剂工艺中，原料药有效组分还原型羧烷基葡聚糖铁分子的分子量和稳定性不发生变化是十分重要的。

还原型羧烷基葡聚糖铁作为静脉铁剂已经有较长的使用时间，例如在美国临床上应用的有商品名为Ferumoxytol的超顺磁氧化铁注射液(17mL:510mg铁和510mg还原型羧烷基葡聚糖)以及其它一些厂家生产的产品。该剂型是还原型羧烷基葡聚糖包裹氧化铁纳米颗粒形成的一种复合物，该复合物初期是作为一种核磁共振的造影剂来使用，后发现具有一定的补贴功能而进行临床应用的。该复合物由于是氧化铁纳米颗粒，铁离子释放较慢，所以铁的动员较右旋糖酐铁、蔗糖铁等制剂较慢，在临床使用中存在一定问题。

因此，本领域仍然需要一种新型的还原型羧烷基葡聚糖铁注射液，期待这种还原型羧烷基葡聚糖铁注射液具有良好的性能例如物理稳定性和/或化学稳定性等。

发明内容

为了克服现有传统静脉注剂的缺陷，尤其右旋糖酐铁易发生过敏反应，使患者出现皮肤瘙痒、水肿、哮喘，甚至出现血压下降、心跳骤停等副作用，同时克服蔗糖铁在临床应用中存在给药次数多，单次给药量小，给药时间长的缺点，本申请的目的之一在于提供还原型羧烷基葡聚糖铁注射液。本申请发明人发现使用特定的处理工序配制的还原型羧烷基葡聚糖铁注射液显示出在物理性能和/或化学性能方面至少一种出人意料的有益效果。

所述还原型羧烷基葡聚糖铁注射液，其特征在于，含有还原型羧烷基葡聚糖铁、酸碱调节剂和注射用水；

所述还原型羧烷基葡聚糖铁为还原型羧烷基葡聚糖铁纳米颗粒，由氢氧化铁纳米核体和半合成多糖层构成，所述半合成多糖层包覆在所述氢氧化铁纳米核体外，所述氢氧化铁纳米核体为水溶性胶体粒子。

优选地，所述还原型羧烷基葡聚糖铁纳米颗粒的直径为15～75nm。

优选地，所述氢氧化铁纳米核体的直径为0.5～10nm。进一步优选地，所述氢氧化铁纳米核体的直径范围上限选自10nm、8nm、7nm；下限选自0.5nm、1nm、2nm、4nm、5nm。更进一步优选地，所述氢氧化铁纳米核体的直径为2～8nm。

优选地，所述半合成多糖为山梨醇羧烷基醚葡聚糖。进一步优选地，所述半合成多糖为山梨醇羧甲基醚葡聚糖和/或山梨醇羧乙基醚葡聚糖。

优选地，每1mL所述注射液中含有还原型羧烷基葡聚糖铁以铁元素的质量计为15～50mg。进一步优选地，每1mL所述注射液中含有还原型羧烷基葡聚糖铁以铁元素的质量计为18～42mg。更进一步优选地，每1mL所述注射液中含有还原型羧烷基葡聚糖铁以铁元素的质量计为19～21mg。作为一个具体的实施方式，每1mL所述注射液中含有还原型羧烷基葡聚糖铁以铁元素的质量计为20mg。

优选地，所述注射液的pH值为10.5～11.1。进一步优选地，所述注射液的pH值为10.5～11.0。更进一步优选地，所述注射液的pH值为10.7～10.9。

优选地，所述注射液的渗透压为1100～1400mOsmol/L，优选为1150～1350mOsmol/L，更优选为1200～1300mOsmol/L，最优选为1250mOsmol/L；

优选地，所述的酸碱调节剂选自氢氧化钠、氢氧化钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、盐酸、磷酸、硝酸和硫酸中的至少一种。进一步优选地，所述的酸碱调节剂是盐酸溶液或者氢氧化钠溶液。更进一步优选地，所述的酸碱调节剂是1M盐酸溶液或者1M氢氧化钠溶液。

优选地，所述还原型羧烷基葡聚糖铁的制备方法至少包括以下步骤：

1)将葡聚糖用水溶解后加入碱溶液，再加入还原剂或加氢催化剂，于室温下进行还原反应后，加入碱溶液和卤代烷酸进行羧基化反应，最后用酸终止反应，得到山梨醇羧烷基醚葡聚糖；

2)再将步骤1)得到的山梨醇羧烷基醚葡聚糖制成山梨醇羧烷基醚葡聚糖水溶液，将碱溶液滴加至所述山梨醇羧烷基醚葡聚糖水溶液中，在滴加碱溶液的同时滴加含有Fe³⁺的盐溶液至反应体系的pH值为5～6；

3)再用碱溶液调整步骤2)得到的反应体系的pH值至6～7，反应后，得到溶液I；

4)将步骤3)得到的溶液I通过乙醇沉淀、干燥，即得所述还原型羧烷基葡聚糖铁。

进一步优选地，所述还原型羧烷基葡聚糖铁的制备方法至少包括以下步骤：

1)将分子量为3000～2000000的葡聚糖用水溶解后，加入NaOH溶液和还原剂或加氢催化剂，于室温下进行还原反应12～24小时，然后加入NaOH溶液和卤代烷酸进行羧基化反应，最后加入4M盐酸至pH＝7.0终止反应沉淀后得到山梨醇羧烷基醚葡聚糖；

所述还原剂为硼氢化钠、硼氢化钾；

所述加氢催化剂选自钯碳、雷尼镍、铂炭、铜基催化剂中的至少一种；

所述卤代烷酸为氯乙酸、溴乙酸、氯丙酸或溴丙酸；

2)将步骤1)得到的所述山梨醇羧烷基醚葡聚糖制成山梨醇羧烷基醚葡聚糖水溶液，再于90～95℃下，20分钟内将浓度为1M的NaOH溶液滴加至所述山梨醇羧烷基醚葡聚糖水溶液中，然后再于55～60℃下，2.5～3h内同时滴加质量百分含量为20％的NaOH溶液和质量百分含量为40％的FeCl₃溶液至反应体系的pH值为5～6；

3)再用NaOH溶液调整步骤2)得到的反应体系的pH值至6～7，加热至90～95℃下反应后冷却至室温，得到溶液I；

4)将步骤3)得到的溶液I通过乙醇沉淀、干燥，即得所述还原型羧烷基葡聚糖铁；优选地，将步骤3)得到的溶液I与乙醇按照体积比3：1混合沉淀，再将制得的沉淀物在80℃以下干燥，即得所述还原型羧烷基葡聚糖铁。

更进一步优选地，所述步骤1)中所用葡聚糖的分子量为5000～70000。

更进一步优选地，所述步骤1)中还原剂为硼氢化钠、硼氢化钾。

更进一步优选地，所述步骤1)中加氢催化剂选自钯碳、雷尼镍、铂炭、C207催化剂、KT-02催化剂、6504K催化剂中的至少一种。

更进一步优选地，所述步骤1)中卤代烷酸为氯乙酸、溴乙酸、氯丙酸或溴丙酸。

已经出人意料地发现，本申请的还原型羧烷基葡聚糖铁注射液具有比之于现有技术获得的还原型羧烷基葡聚糖铁注射液显著更低的可见异物检出率。

本申请提出一种新型的还原型羧烷基葡聚糖铁注射液。本申请使用对进行还原和羧烷基化修饰葡聚糖(Dextran)衍生物作为原料，该原料相较未修饰的葡聚糖具有更低的免疫原性和更高的生物安全性。使用新的材料和制备工艺，制备了以氢氧化铁颗粒为核心的新型铁制剂，该制剂不同于超顺磁氧化铁(Ferumoxytol)以氧化铁作为铁核。本发明中得到铁核是数纳米的氢氧化铁颗粒，不具有超顺磁性。氢氧化铁核心由更高生物安全性的半合成多糖包裹形成稳定的胶体粒子，该多糖的生物安全性高，诱发过敏等反应几率低。该多糖的外壳还能控制氧化铁颗粒在体内以缓慢的速率释放铁离子，与普通的铁制剂相比，该制剂有效地降低了高浓度的铁离子对人体的副反应，可以大幅减少静脉注射的时间，生物活性高、效果好、副反应少、同时大大减少给药次数。由于大幅度降低了游离铁离子的浓度，该制剂单次安全剂量可以高达1000mg铁，给药间隔时间也延长至1-2周，大幅减少医疗成本，也减少了患者的治疗时间和痛苦。

根据本申请的又一个方面，提供了上述还原型羧烷基葡聚糖铁注射液的制备方法，包括步骤：

(a)将处方计算量的还原型羧烷基葡聚糖铁溶解于适量注射用水中；

(b)向步骤(a)所得药液中加入0.05～0.2％(w/v)活性炭，再在搅拌下用酸碱调节剂调节溶液的pH值至5.5～6.5；优选用盐酸溶液调节溶液的pH值至5.8～6.2；接着使药液在60～70℃温度下保温吸附20～30分钟；再用酸碱调节剂调节溶液pH值至10.0～11.5，继续使药液在60～70℃温度下保温吸附10～15分钟，过滤脱炭；

(c)补加注射用水至处方全量，检查溶液的pH值，必要时用酸碱调节剂调节溶液的pH值至10.0～11.5范围内；使药液依次用0.4μm和0.22μm微孔滤膜过滤，将药液分装到玻璃瓶中，密封，115℃热压灭菌30min，即得所述的还原型羧烷基葡聚糖铁注射液。

优选地，所述步骤(a)中适量注射用水为处方全量的30～60％的注射用水。进一步优选地，所述适量注射用水为处方全量的45～55％的注射用水。更进一步优选地，所述适量注射用水为处方全量的50％的注射用水。

在本发明上述制备方法的步骤中，虽然其描述的具体步骤在某些细节上或者语言描述上与下文具体实施方式部分的制备例中所描述的步骤有所区别，然而，本领域技术人员根据本发明全文的详细公开完全可以概括出以上所述方法步骤。

本发明的任一方面的任一实施方案，可以与其它实施方案进行组合，只要它们不会出现矛盾。此外，在本申请任一方面的任一实施方案中，任一技术特征可以适用于其它实施方案中的该技术特征，只要它们不会出现矛盾。

本申请的还原型羧烷基葡聚糖铁注射液具有良好的性能，特别是其诸多理化参数例如注射液的pH值、浑浊点、重均分子量、数均分子量、分子量分布等参数均符合美国药典和/或英国药典的规定。

根据本申请的还原型羧烷基葡聚糖铁注射液，其为溶液型的注射剂即注射液。在一个实施方案中，该注射液为单剂量制剂(例如玻璃瓶装的注射液)，每一单位剂量中包含的还原型羧烷基葡聚糖铁以铁(Fe)计其量可以在10～1000mg范围内，例如但不限于约10mg、约20mg、约50mg、约100mg、约150mg、约200mg、约250mg、约300mg、约400mg、约500mg、或约1000mg。

如今，已经研制出多种含铁制剂。静脉内注射胶体氢氧化铁制剂、特别是还原型羧烷基葡聚糖铁在临床上适用于治疗接受补充红细胞生成素治疗、进行长期血液透析的患者的缺铁性贫血。

还原型羧烷基葡聚糖铁被制备成胶体混悬液并作为前药施用，其被网状内皮系统的细胞摄取，释放出铁离子。铁离子与运铁蛋白结合，运铁蛋白进而将其转运至骨髓用于红细胞生成或者转运至铁蛋白和骨髓、脾和肝中的铁贮存池。

铁的生理学和代谢：人体以铁蛋白和血铁黄素形式贮存三价铁。铁蛋白包括含有贮存腔的蛋白质外壳，所述贮存腔用于容纳组成约为[(FeOOH)8(Fe)OPO₃H₂]n的多核氢氧化铁磷酸铁核。铁蛋白的蛋白质外壳、即脱铁铁蛋白包括24个多肽亚单位，所述的多肽亚单位形成平均分子量为约440000的脱铁铁蛋白分子。脱铁铁蛋白外壳的直径约13纳米，内腔约7纳米。

铁蛋白的蛋白质壳、即脱铁铁蛋白在结合和氧化二价铁中作为亚铁氧化酶发挥作用，然后所述的二价铁作为多核氢氧化铁磷酸铁核贮存在蛋白质壳的空腔中。铁蛋白可含有多达4500个聚合的铁离子，整个分子的分子量为700000至800000。铁蛋白分子中30％以上的重量可以是铁。

当可利用的铁的量超过铁蛋白的离子贮存机制时，可形成称为血铁黄素的聚集的铁蛋白，其为单核细胞-巨噬细胞系统的正常成分。血铁黄素包括失去其部分蛋白质壳并聚集的铁蛋白分子。血铁黄素构成正常铁贮存量的约三分之一，作为不溶性颗粒，其在网状内皮系统的细胞中积聚。

铁蛋白是水溶性的，并且可通过渗透作用进入血流。铁蛋白的正常血清水平取决于性别/年龄，为40至160ng/mL。据认为，在血流中铁蛋白缓慢释放出二价铁和还原剂如还原性黄素单核苷酸及较少量的抗坏血酸。二价铁被血浆铜蓝蛋白氧化为三价铁，然后与血蛋白脱铁运铁蛋白紧密结合形成运铁蛋白。运铁蛋白的分子量为约76000，每个分子含有两个铁离子结合位点。

当施用于患者时，还原型羧烷基葡聚糖铁络合物(或其它例如用葡糖酸盐、右旋糖酐、山梨醇或糊精制备的三价铁胶体)作为颗粒被网状内皮系统的巨噬细胞从血流中除去并代谢，以补充机体的血铁黄素、铁蛋白和运铁蛋白的铁贮存。从血流中除去的速率取决于胶体氢氧化铁的粒径和组成。

铁碳水化合物络合物的合成：铁碳水化合物络合物如还原型羧烷基葡聚糖铁包含与还原型羧烷基葡聚糖络合的胶体氢氧化铁颗粒(即核)。这些铁核通过将氯化铁用碱中和至pH为2而制得。在该pH下，饱和氢氧根离子使得形成胶体氢氧化铁，其在形成后与适宜的碳水化合物如还原型羧烷基葡聚糖原位络合。铁核的结构遵循经典的配位化学。碳水化合物通过其羟基替换与铁核外表面结合的水分子而与铁核络合。

铁核与碳水化合物之间的结合是非共价的分子间力，例如铁核表面铁原子的部分正电荷对碳水化合物羟基的偶极矩负端的吸引力。

例如，还原型羧烷基葡聚糖铁的分子量(Mw)为约340000至600000道尔顿，其分子式如下：

[Na₂Fe₅O₈(OH)·3(H₂O)]n·m(C₁₂H₂₂O₁₁)

其中n是铁聚合度，m是与多核聚合铁核[Na₂Fe₅O₈(OH)·3(H₂O)]n络合的还原型羧烷基葡聚糖分子(C₁₂H₂₂O₁₁)数。

本申请涉及的还原型羧烷基葡聚糖铁注射液，其中的多核氢氧化铁(111)核心表面被大量非共价结合的还原型羧烷基葡聚糖分子所包围，从而形成一个平均分子量为430kDa的复合物。这种大分子结构可以避免从肾脏被消除。这种复合物结构稳定，在生理条件下不会释放出铁离子。多核核心的铁被环绕的结构与生理状态下的铁蛋白结构相似。使用本品会引起人体生理的改变，其中包括对铁的摄入。本品毒性很低。白色小鼠静脉给予本品后的LD50>200毫克铁/公斤体重，因此治疗指数约为30(200/7)。

本申请的有益效果包括但不限于：

(1)本申请所提供的注射液，能够用于治疗铁缺乏病症。

(2)本申请所提供的注射液，生物活性高、效果好、副反应少。

(3)本申请所提供的注射液，安全性高，诱发过敏等反应几率低，有效地降低了高浓度的铁离子对人体的副反应，可以大幅药物服用次数。

附图说明

图1为本申请一种实施方式的还原型羧烷基葡聚糖铁电镜照片。

图2为本申请一种实施方式的山梨醇羧甲基醚葡聚糖的红外光谱图。

具体实施方式

名词解释:

本申请中提到的葡聚糖、右旋糖酐为一种化合物的两种的称法，化学名称为聚(α-[1-6]-D-吡喃葡萄糖)；

本申请中提到还原型羧烷基葡聚糖或者还原型羧烷基右旋糖酐为同一种化合物的不同命名，其化学名称是聚葡萄糖山梨醇羧甲醚(PSC)或者称羧烷基聚(α-[1—6]-D-吡喃葡萄糖)-山梨醇。

下面对本申请作进一步的描述

本申请所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本申请不一致时，以本申请的表述为准。此外，本申请使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本申请仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本申请所表述的含义为准。

在本申请中，符号％，根据其所使用的语境，可以具有本领域技术人员容易理解的含义。

还原型羧烷基葡聚糖铁注射液

本申请提供了一种可供静脉补铁治疗缺铁性贫血的还原型羧烷基葡聚糖铁注射液。本申请还原型羧烷基葡聚糖铁注射液的pH值通常在10.0～11.5，例如为10.5～11.1，例如为10.5～11.0，例如为10.7～10.9。

本申请还原型羧烷基葡聚糖铁注射液的浑浊点(例如可参照美国药典USP35-NF30还原型羧烷基葡聚糖铁注射液浑浊点(Turbidity)项下的定义和检测方法测定)以pH计在4.4～5.3范围内。

本申请还原型羧烷基葡聚糖铁注射液的重均分子量(Mw)在340000–600000Da范围内，例如在34000–54000Da范围内。

本申请还原型羧烷基葡聚糖铁注射液的数均分子量(Mn)不小于240000Da。

用法与用量

还原型羧烷基葡聚糖铁注射液只能与0.9％w/v生理盐水混合使用，通常不能与其他的治疗药品混合使用。使用前需要肉眼检查安瓿是否有沉淀和破损，如有沉淀或破损，则不可使用。通常而言，还原型羧烷基葡聚糖铁注射液应以滴注或缓慢注射的方式静脉给药，或直接注射到透析器的静脉端，该药不适合肌肉注射或按照病人需要铁的总量一次全剂量给药。在新病人第一次治疗前，应按照推荐的方法先给予一个小剂量进行测试，成人用1-2.5mL(20-50mg)铁，体重＞14公斤的儿童用1mL(20mg铁)，体重＜14公斤的儿童用日剂量的一半(1.5mg/kg)且应备有心肺复苏设备。如果在给药15分钟后未出现不良反应，继续给予余下的药液。

输液

还原型羧烷基葡聚糖铁注射液的首选给药方式是滴注(为了减少低血压发生和静脉外的注射危险)。1mL本品最多只能稀释到20mL0.9％w/v生理盐水中，稀释液配好后应立即使用(如：5mL本品最多稀释到100mL0.9％生理盐水中，而25mL本品最多稀释到500mL0.9％w/v生理盐水中)。药液的滴注速度应为：100mL铁至少滴注15分钟；200mL至少滴注30分钟；300mL至少滴住1.5小时；400mL至少滴住2.5小时；500mL至少滴注3.5小时。如果临床需要，本品的0.9％生理盐水的稀释液体积可以小于特定的数量，配成较高浓度的本品药液。然而，滴注的速度必须根据每分钟给予铁的剂量来确定(如：10mL本品＝200mg铁应至少30分钟滴完；25mL本品＝500mg铁应至少3.5小时滴完)。为保证药液的稳定，不允许将药液配成更稀的溶液。

静脉注射

还原型羧烷基葡聚糖铁注射液可不经稀释缓慢静脉注射，推荐速度为每分钟5mL本品(至少注射5分钟20mL本品)，每次的最大注射剂量是30mL本品(1000mg铁)。静脉注射后，应伸展病人的胳膊。

往透析器里注射

本品可直接注射到透析器的静脉端，情况同前面的“静脉注射”。

剂量

成人和老年人的常用剂量为：根据血红蛋白水平每周用药2至3次，每次15-30mL(500-1000mg铁)。

儿童的常用剂量为：根据血红蛋白水平每周用药一次或者两周一次，每次每公斤体重0.15mL本品(＝3mg铁/公斤体重)。

还原型羧烷基葡聚糖铁注射液药代动力学

本申请涉及的还原型羧烷基葡聚糖铁注射液，其中的多核氢氧化铁(111)核心表面被大量非共价结合的还原型羧烷基葡聚糖分子所包围，从而形成一个平均分子量为430kDa的复合物。这种大分子结构可以避免从肾脏被消除。这种复合物结构稳定，在生理条件下不会释放出铁离子。多核核心的铁被环绕的结构与生理状态下的铁蛋白结构相似。使用本品会引起人体生理的改变，其中包括对铁的摄入。本品毒性很低。白色小鼠静脉给予本品后的LD50>200毫克铁/公斤体重，因此治疗指数约为30(200/7)。

给健康志愿者单剂量静脉注射含500mg铁的本品，10分钟后的水平达到最高，平均为538μmol/L。中央室分布容积与血浆容积相等(大约3L)。注射的铁在血浆中被快速排除，半衰期约为6小时。稳态分布容积约为8L，说明铁在人体中分布少。由于本品比转铁蛋白稳定性低，可以看到铁到转铁蛋白的竞争性交换。结果铁的转运速率为31mg铁/24小时。注射本品后的前4小时铁清除量不到全部清除量的5％。在120小时后，血浆中铁的水平下降到注射前铁的水平，约75％的还原型羧烷基葡聚糖被排泄。

下面结合具体实施例，对本申请进行进一步说明。

除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均可从正规渠道商购获得。

实施例1山梨醇羧烷基醚葡聚糖铁颗粒的制备

制备山梨醇羧烷基醚葡聚糖

将50g的葡聚糖溶于50g的纯化水中，搅拌使其完全溶解后，加入20g浓度为50％的NaOH溶液和10.4g的硼氢化钠(试验1^#)或11.3g硼氢化钾(试验2^#)进行还原或者利用催化加氢(试验3^#～6^#)进行还原，详见表1，室温下反应，然后加入的34g浓度为50％的NaOH溶液和卤代烷酸如27.6g氯乙酸或31.8g溴乙酸进行羧烷基化反应，12h后，加入4M盐酸至pH7.0终止反应，沉淀法得到白色的产物。试验1^#反应产物的红外光谱图见图2所示，其符合山梨醇羧甲基醚葡聚糖的红外光谱图。试验2^#～试验6^#的反应产物的红外光谱图类似，其中试验2^#、试验5^#和试验6^#的反应产物符合山梨醇羧甲基醚葡聚糖的红外光谱图；试验3^#和试验4^#的反应产物符合山梨醇羧乙基醚葡聚糖的红外光谱图。

表1

制备山梨醇羧烷基醚葡聚糖铁

具体操作条件见表2所示。取上述步骤制备的山梨醇羧烷基醚葡聚糖(CMRD)加水加热溶解制成浓度为40％(w/w)的水溶液，于温度T₁下搅拌，并同时在时间t₁内滴加20％(w/w)NaOH溶液至体系中至NaOH的浓度达到1M。降温至T₂下滴加40％(w/w)FeCl₃溶液，待体系的pH达到5～6，停止滴加。用酸度计监控pH，并在时间t₂内同时滴加完20％(w/w)的NaOH和40％(w/w)的FeCl₃溶液，再用20％(w/w)的NaOH溶液调整pH至6～7。加热至T₃下反应时间t₃后冷却至室温，得到深褐色的山梨醇羧烷基醚葡聚糖铁胶体溶液，粒度仪测得的颗粒直径和电镜下观察得到的核体直径见表2所示。典型的电镜照片见图1所示。

表2

实施例2山梨醇羧烷基醚葡聚糖铁注射剂的制备

将实施例1中的试验1^#～试验6^#制备得到的山梨醇羧烷基醚葡聚糖铁按照表3所示处方量的溶解于适量注射用水中。加入0.05～0.2％(w/v)活性炭，在搅拌下用1M盐酸溶液调节溶液的pH值至5.5～6.5，接着使药液在60～70℃温度下保温吸附20～30分钟。再用1M氢氧化钠溶液调节溶液pH值至10.0～11.5，继续使药液在60-70℃温度下保温吸附10～15分钟，过滤脱炭。补加注射用水至处方全量，检查溶液的pH值，必要时用酸碱调节剂调节溶液的pH值至10.0～11.5范围内；使药液依次用0.4μm和0.22μm微孔滤膜过滤，将药液分装到玻璃瓶中，密封，115℃热压灭菌30min，即得到本申请的还原型羧烷基葡聚糖铁注射液，依次记为注射剂1^#～注射剂6^#。

表3

注射剂编号	活性成分	活性成分含量
			注射剂1#	山梨醇羧甲基醚葡聚糖铁T-3	15mg/mL
注射剂2#	山梨醇羧甲基醚葡聚糖铁T-5	18mg/mL
			注射剂3#	山梨醇羧乙基醚葡聚糖铁T-10	19mg/mL
注射剂4#	山梨醇羧乙基醚葡聚糖铁T-40	20mg/mL
			注射剂5#	山梨醇羧甲基醚葡聚糖铁T-70	4mg/mL
注射剂6#	山梨醇羧甲基醚葡聚糖铁T-2000	50mg/mL

实施例3测试

可见异物检测：

将注射剂1^#～注射剂6^#在经冷热循环处置后，照2010年版中华人民共和国药典二部(在本申请中可简称“中国药典2010版二部”或类似简称)附录IXH可见异物检查法中的第一法(灯检法)(该方法在本申请中亦可简称为“灯检法”或类似简称)进行检查，同时也对已经上市超顺磁氧化铁(Ferumoxytol)、高分子右旋糖酐铁、低分子右旋糖酐铁、蔗糖铁和葡萄糖酸铁钠进行测试，可见异物检出率见表4所示。本申请实施例得到的与现有产品相比，明显具有更低的可见异物检出率。

在本申请中，上述“冷热循环处置”是指，使经上述灯检法检测均未检测到可见异物的注射液至少100瓶，在25±1℃的温度下放置3天，接着转移到4±1℃的温度下放置3天，完成一次冷热循环；如此重复进行以在30天内总计完成五次冷冻循环。

在本申请中，上述“可见异物”包括明显可见异物和微细可见异物二者的总和。

在本申请中，上述“可见异物检出率”是指，经灯检法检测均未检测到可见异物的注射液至少100瓶，在经历五次冷冻循环的所述冷热循环处置后，再经灯检法检查各瓶注射液中的可见异物，检出可见异物的注射液瓶数占总试验瓶数的百分数。

渗透压测试

使用Osmometer渗透压测试仪，测试注射剂1^#～注射剂6^#的pH和渗透压，结果如表4所示。

重均分子量测试

使用分子凝胶排阻色谱(请补充具体的测试条件)对粉剂1^#～粉剂6^#和注射剂1^#～注射剂6^#进行重均分子量的测试，同时也对已经上市超顺磁氧化铁(Ferumoxytol)、高分子右旋糖酐铁、低分子右旋糖酐铁、蔗糖铁和葡萄糖酸铁钠进行测试，结果如下表4所示。

可以发现山梨醇羧烷基醚葡聚糖制备的胶体铁络合物分子量大于高分子右旋糖酐铁、低分子右旋糖酐铁、蔗糖铁和葡萄糖酸铁钠等制剂，具有更高的载药量。

表4

实施例4急性毒性实验

将注射剂1^#～注射剂6^#用注射液用生理盐水溶解制成相同浓度的溶液，同时也对已经上市超顺磁氧化铁(Ferumoxytol)、高分子右旋糖酐铁、低分子右旋糖酐铁、蔗糖铁和葡萄糖酸铁钠进行测试；取体重18～22g的小鼠900只，随机分为9组，每组100只(雌雄各半)，根据预试结果设定每支小鼠给药剂量为5mg，尾静脉注射给药，给药后连续观察14天，观察内容包括：动物体重、外观、食欲、呼吸、大小便、腺体分泌、行为活动、死亡时间、濒死前反应等过敏反应；饲养室温度为20～26℃，湿度为40％～70％。

结果：各组小鼠均无死亡，在给定的剂量下不同的制剂出现轻微的呼吸急促、惊厥、扭体、精神萎靡、食量减退等副作用症状的小鼠数量见表5，表明本申请的山梨醇羧烷基醚葡聚糖铁低毒、安全、免疫原性低。

实施例5最大安全剂量测试

将注射剂1^#～注射剂6^#用注射液用注射液用生理盐水溶解制成相同浓度的溶液，同时也对已经上市超顺磁氧化铁(Ferumoxytol)、高分子右旋糖酐铁、低分子右旋糖酐铁、蔗糖铁和葡萄糖酸铁钠进行测试；取体重18～22g的小鼠900只，随机分为9组，每组100只(雌雄各半)，每小组分10个给药梯度，分别是1mg、2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg和10mg，浓度为30mg/ml，尾静脉注射给药，给药后连续观察14天，观察内容包括:动物体重、外观、食欲、呼吸、大小便、腺体分泌、行为活动、死亡时间、濒死前反应等过敏反应；当有超过两只小鼠死亡时，我们认为剂量过高，不适合，当出现轻微的呼吸急促、惊厥、扭体、精神萎靡、食量减退等副作用症状的小鼠数量小于等于两只时我们认为是最大安全剂量。饲养室温度为20～26℃，湿度为40％～70％。

结果：现有剂型的对小鼠的最大给药剂量是3mg，本申请中的剂型最大给药量是7mg，详细数据见表5，表明本申请的山梨醇羧烷基醚葡聚糖铁注射液相对未改性修饰的葡聚糖有3倍以上的安全给药剂量。同时由于本申请的山梨醇羧烷基醚葡聚糖铁分子量大于高分子右旋糖酐铁、低分子右旋糖酐铁、蔗糖铁和葡萄糖酸铁钠等制剂，具有更高的载药量。相应地，更高的给药剂量会降低给药频率，减少患者痛苦，节约患者时间。

表5

以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。

Claims (10)

1.一种还原型羧烷基葡聚糖铁注射液，其特征在于，含有还原型羧烷基葡聚糖铁、酸碱调节剂和注射用水；

所述还原型羧烷基葡聚糖铁为还原型羧烷基葡聚糖铁纳米颗粒，由氢氧化铁纳米核体和半合成多糖层构成，所述半合成多糖层包覆在所述氢氧化铁纳米核体外，所述氢氧化铁纳米核体为水溶性胶体粒子。

2.根据权利要求1所述的注射液，其特征在于，所述还原型羧烷基葡聚糖铁纳米颗粒的直径为15～75nm；所述氢氧化铁纳米核体的直径为0.5～10nm；优选地，所述氢氧化铁纳米核体的直径为2～8nm。

3.根据权利要求1所述的注射液，其特征在于，所述半合成多糖为山梨醇羧烷基醚葡聚糖。

4.根据权利要求1所述的注射液，其特征在于，所述半合成多糖为山梨醇羧甲基醚葡聚糖和/或山梨醇羧乙基醚葡聚糖。

5.根据权利要求1所述的注射液，其特征在于，每1mL所述注射液中含有还原型羧烷基葡聚糖铁以铁元素的质量计为15～50mg；优选每1mL所述注射液中含有还原型羧烷基葡聚糖铁以铁元素的质量计为18～42mg；更优选每1mL所述注射液中含有还原型羧烷基葡聚糖铁以铁元素的质量计为19～21mg；最优选每1mL所述注射液中含有还原型羧烷基葡聚糖铁以铁元素的质量计为20mg。

6.根据权利要求1所述的注射液，其特征在于，

所述注射液的pH值为10.5～11.1，优选为10.5～11.0，更优选为10.7～10.9；

所述注射液的渗透压为1100～1400mOsmol/L，优选为1150～1350mOsmol/L，更优选为1200～1300mOsmol/L，最优选为1250mOsmol/L；

所述的酸碱调节剂选自氢氧化钠、氢氧化钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、盐酸、磷酸、硝酸和硫酸中的至少一种；优选所述的酸碱调节剂是盐酸溶液或者氢氧化钠溶液；更优选1M盐酸溶液或者1M氢氧化钠溶液。

7.根据权利要求1所述的注射液，其特征在于，所述还原型羧烷基葡聚糖铁的制备方法至少包括以下步骤：

1)将葡聚糖用水溶解后加入碱溶液，再加入还原剂或加氢催化剂，于室温下进行还原反应后，加入碱溶液和卤代烷酸进行羧基化反应，最后用酸终止反应，得到山梨醇羧烷基醚葡聚糖；

2)再将步骤1)得到的山梨醇羧烷基醚葡聚糖制成山梨醇羧烷基醚葡聚糖水溶液，将碱溶液滴加至所述山梨醇羧烷基醚葡聚糖水溶液中，在滴加碱溶液的同时滴加含有Fe³⁺的盐溶液至反应体系的pH值为5～6；

3)再用碱溶液调整步骤2)得到的反应体系的pH值至6～7，反应后，得到溶液I；

4)将步骤3)得到的溶液I通过乙醇沉淀、干燥，即得所述还原型羧烷基葡聚糖铁。

8.根据权利要求1所述的注射液，其特征在于，所述还原型羧烷基葡聚糖铁的制备方法至少包括以下步骤：

1)将分子量为3000～2000000的葡聚糖用水溶解后，加入NaOH溶液和还原剂或加氢催化剂，于室温下进行还原反应12～24小时，然后加入NaOH溶液和卤代烷酸进行羧基化反应，最后加入4M盐酸至pH＝7.0终止反应沉淀后得到山梨醇羧烷基醚葡聚糖；

所述还原剂为硼氢化钠、硼氢化钾；

所述加氢催化剂选自钯碳、雷尼镍、铂炭、铜基催化剂中的至少一种；

所述卤代烷酸为氯乙酸、溴乙酸、氯丙酸或溴丙酸；

2)将步骤1)得到的所述山梨醇羧烷基醚葡聚糖制成山梨醇羧烷基醚葡聚糖水溶液，再于90～95℃下，20分钟内将浓度为1M的NaOH溶液滴加至所述山梨醇羧烷基醚葡聚糖水溶液中，然后再于55～60℃下，2.5～3h内同时滴加质量百分含量为20％的NaOH溶液和质量百分含量为40％的FeCl₃溶液至反应体系的pH值为5～6；

3)再用NaOH溶液调整步骤2)得到的反应体系的pH值至6～7，加热至90～95℃下反应后冷却至室温，得到溶液I；

4)将步骤3)得到的溶液I通过乙醇沉淀、干燥，即得所述还原型羧烷基葡聚糖铁；优选地，将步骤3)得到的溶液I与乙醇按照体积比3：1混合沉淀，再将制得的沉淀物在80℃以下干燥，即得所述还原型羧烷基葡聚糖铁；

优选地，所述步骤1)中所用葡聚糖的分子量为5000～70000。

9.权利要求1至8任一项所述注射液的制备方法，其特征在于，包括步骤：

(a)将处方计算量的还原型羧烷基葡聚糖铁溶解于适量注射用水中；

(b)向步骤(a)所得药液中加入0.05～0.2％(w/v)活性炭，再在搅拌下用酸碱调节剂调节溶液的pH值至5.5～6.5；优选用盐酸溶液调节溶液的pH值至5.8～6.2；接着使药液在60-70℃温度下保温吸附20～30分钟；再用酸碱调节剂调节溶液pH值至10.0～11.5，继续使药液在60-70℃温度下保温吸附10～15分钟，过滤脱炭；

(c)补加注射用水至处方全量，检查溶液的pH值，必要时用酸碱调节剂调节溶液的pH值至10.0～11.5范围内；使药液依次用0.4μm和0.22μm微孔滤膜过滤，将药液分装到玻璃瓶中，密封，115℃热压灭菌30min，即得所述的还原型羧烷基葡聚糖铁注射液。

10.根据权利要求9所述的注射液制备方法，其特征在于，

所述步骤(a)中适量注射用水为处方全量的30～60％的注射用水；优选所述适量注射用水为处方全量的45～55％的注射用水；更优选所述适量注射用水为处方全量的50％的注射用水。