ES2334555T3 - Oxidos de hierro coloidal recubiertos estables frente al calor. - Google Patents

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Abstract

Un complejo de óxido de hierro polisacárido reducido derivado esterilizable en autoclave concebido para su administración a un sujeto mamífero, caracterizado porque puede obtenerse: haciendo reaccionar un polisacárido con una sal de borohidruro o hidrógeno en presencia de un catalizador de hidrogenación para producir un polisacárido reducido; derivando el polisacárido reducido; el polisacárido reducido derivado estando producido a una temperatura inferior a 50ºC; formando un complejo con el polisacárido reducido derivado y una sal de hierro para producir un complejo de óxido de hierro polisacárido reducido derivado; comprendiendo el complejo la adición de una mezcla de sales férricas y ferrosas, el enfriamiento de la solución resultante y la incorporación de hidróxido de amonio para neutralizar la solución; y esterilizando el complejo mediante autoclave; siendo dicho complejo estable a una temperatura de al menos 100ºC.

Description

Óxidos de hierro coloidal recubiertos estables frente al calor.
Campo técnico
La invención se refiere a composiciones que son polisacáridos reducidos con carboximetilo, y a procedimientos para su uso como extensores de plasma y para recubrimiento de partículas de óxido de hierro, y a composiciones compuestas por óxidos de hierro superparamagnético y no superparamagnético recubiertos con un polisacárido reducido o un polisacárido reducido derivado, y procedimientos para su uso como agentes de contraste de formación de imágenes por resonancia magnética (IRM) y hematínicos.
Antecedentes
Desde la invención de la formación de imágenes por resonancia magnética (IRM), se ha desarrollado una tecnología paralela de químicos inyectables llamados agentes de contraste. Los agentes de contraste juegan un rol importante en la práctica de la medicina puesto que ayudan a producir imágenes IRM más útiles para la formulación de diagnósticos. En particular, en la práctica clínica se han desarrollado y adoptado dos clases de agentes de formación de imagen. Estos son: complejos de gadolinio de bajo peso molecular como Magnvist®; y óxidos de hierro coloidal. Ninguno de estos dos tipos de agente es el ideal. La Tabla 1 muestra los problemas que presentan estos agentes, que incluyen: costo de los componentes; ineficiencia de la síntesis; pérdida de recubrimiento frente a la esterilización por autoclave; rango estrecho de captación en órganos para toma de imágenes; efectos secundarios; restricción de uso tanto en el primer paso como en la dosificación de equilibrio y otros descritos en la presente invención. Los agentes que resuelven estos problemas y que combinan las propiedades de estos dos tipos de agentes de contraste son altamente deseables.
Por ejemplo, se puede hacer referencia al documento WO-A-91/09678, relacionado con partículas organometálicas recubiertas para uso en separaciones, y al documento WO-A-96/09840, que refiere a agentes de contraste.
Sumario
En una primera realización, la presente invención comprende un complejo de óxido de hierro polisacárido reducido derivado esterilizable en autoclave para administración a un sujeto mamífero, caracterizado porque puede obtenerse:
haciendo reaccionar un polisacárido con borohidruro de sodio o hidrógeno en presencia de un catalizador de hidrogenación para producir un polisacárido reducido;
derivando el polisacárido reducido;
produciendo el polisacárido reducido derivado a una temperatura inferior a 50ºC;
formando un complejo con el polisacárido reducido derivado y una sal de hierro para producir un complejo de óxido de hierro polisacárido reducido derivado; comprendiendo el complejo la adición de una mezcla de sales férricas y ferrosas, el enfriamiento de la solución resultante y la incorporación de hidróxido de amonio para neutralizar la solución;
y
esterilizando el complejo mediante autoclave;
siendo dicho complejo estable a una temperatura de al menos 100ºC.
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En una segunda realización, la presente invención comprende un procedimiento para producir dicho complejo de la manera anteriormente descrita.
En otros aspectos, el complejo de acuerdo con la presente invención o producido mediante un procedimiento de acuerdo con la presente invención tiene la forma de un agente de contraste destinado para IRM in vivo de un mamífero o de un agente hematínico destinado para tratamiento de un mamífero con deficiencia de hierro.
Habiéndose establecido el alcance de la presente invención, ahora se procederá a describirla e ilustrarla en términos más generales.
En general, la invención se refiere a un procedimiento para la obtención de un complejo de óxido de hierro para la administración a un mamífero, comprendiendo el procedimiento: la producción de un complejo de óxido de hierro polisacárido reducido y la esterilización del complejo mediante autoclave. En general, el polisacárido reducido es un polímero de glucosa reducido. Un ejemplo de un polímero de glucosa reducido es un dextrano reducido.
TABLA 1 Comparación de las propiedades ideales de los agentes de contraste para IRM con las propiedades de los agentes de contraste en base a gadolinio de bajo peso molecular y óxidos de hierro coloidal
1
El polisacárido reducido se produce mediante la reacción de un polisacárido con un reactivo seleccionado del grupo que comprende una sal de borohidruro o hidrógeno en presencia de un catalizador de hidrogenación. El óxido de hierro es preferentemente superparamagnético.
La invención también se refiere a un procedimiento para la obtención de un complejo de óxido de hierro para la administración a un mamífero, comprendiendo el procedimiento la producción de un complejo de óxido de hierro polisacárido reducido derivado y la esterilización del complejo mediante autoclave. De acuerdo con este procedimiento, la producción del complejo puede incluir la derivación de un polisacárido reducido mediante carboxialquilación, por ejemplo, cuando la carboxialquilación es una carboximetilación. Asimismo, de acuerdo con este procedimiento, el polisacárido reducido puede ser un dextrano reducido. El polisacárido reducido derivado puede ser aislado como la sal de sodio y no contiene un pico de absorción infrarrojo en la región de 1650-1800 cm^{-1}. En un aspecto del procedimiento, la producción del polisacárido reducido derivado se logra a una temperatura menor a aproximadamente 50ºC. En otro aspecto del procedimiento, la producción del polisacárido reducido derivado se logra a una temperatura menor a aproximadamente 40ºC. Incluso en otro aspecto del procedimiento, el óxido de hierro es superparamag-
nético.
Asimismo, la invención se refiere a un procedimiento para la formulación de un complejo de óxido de hierro recubierto con un polisacárido reducido. Esta composición es para uso farmacológico y la composición tiene una toxicidad reducida en comparación con un complejo de óxido de hierro análogo recubierto con un polisacárido nativo. El procedimiento para la formulación de dicho complejo de óxido de hierro comprende: la producción de un complejo de óxido de hierro polisacárido reducido y la esterilización del complejo mediante autoclave. La formulación proporciona un polisacárido producido mediante la reacción del polisacárido con uno de los agentes reductores seleccionado del grupo compuesto por una sal de borohidruro o hidrógeno en presencia de un catalizador de hidrogenación. El complejo de óxido de hierro polisacárido reducido tiene dicha toxicidad reducida. En otro aspecto adicional del procedimiento, el óxido de hierro es superparamagnético.
La invención también se refiere a un procedimiento para la formulación de un complejo de óxido de hierro recubierto con un polisacárido derivado reducido. Esta composición es para uso farmacológico y la composición tiene una toxicidad reducida en comparación con un complejo de óxido de hierro análogo recubierto con un polisacárido derivado nativo. El procedimiento para la formulación de dicho complejo de óxido de hierro comprende: la producción de un complejo de óxido de hierro polisacárido derivado reducido; y la esterilización del complejo mediante autoclave. De acuerdo con este procedimiento, la producción del complejo puede incluir la derivación de un polisacárido reducido mediante carboxialquilación, por ejemplo, en la que la carboxialquilación es una carboximetilación. Asimismo, de acuerdo con este procedimiento, el polisacárido reducido puede ser un dextrano reducido. El polisacárido reducido derivado puede ser aislado como la sal de sodio y no contiene un pico de absorción infrarrojo en la región de 1650-1800 cm^{-1}. En un aspecto del procedimiento, la producción del polisacárido reducido derivado se logra a una temperatura menor a aproximadamente 50ºC. En otro aspecto del procedimiento, la producción del polisacárido reducido derivado se logra a una temperatura menor a aproximadamente 40ºC. En otro aspecto adicional del procedimiento, el óxido de hierro es superparamagnético.
La invención también se refiere a un complejo de óxido de hierro polisacárido derivado reducido con propiedades de relajación T1 y T2, las cuales permiten mejorar la señal del agente de contraste con secuencias T1 y disminuir la señal con secuencias T2. Otro aspecto de la presente invención se refiere al hecho de que el óxido de hierro polisacárido derivado reducido puede ser administrado múltiples veces para la toma de imágenes secuenciales en un único examen. Incluso otro aspecto del agente es que puede ser usado para tomar imágenes de múltiples sistemas de órganos, incluidos el sistema vascular, el hígado, el bazo, la médula ósea y los ganglios linfáticos.
La invención también se refiere a un complejo de óxido de hierro polisacárido reducido para ser usado como suplemento de hierro intravenoso.
La invención también se refiere a un complejo de óxido de hierro polisacárido derivado reducido para ser usado como suplemento de hierro intravenoso.
Asimismo, la invención se refiere a un procedimiento mejorado para la administración a un mamífero de un complejo de óxido de hierro polisacárido reducido esterilizable en autoclave. El procedimiento de administración mejorado comprende la inyección de un complejo de óxido de hierro polisacárido reducido esterilizable en autoclave en un volumen de 15 ml o inferior. En otro aspecto el volumen inyectado es inyectado como un bolo. En otro aspecto adicional del procedimiento, el óxido de hierro es superparamagnético. En otro aspecto el volumen inyectado proporciona una calidad de imagen mejorada.
Asimismo, la invención se refiere a un procedimiento mejorado para la administración a un mamífero de un complejo de óxido de hierro polisacárido reducido derivado esterilizable en autoclave. El procedimiento de administración mejorado comprende: la inyección de un complejo de óxido de hierro polisacárido derivado reducido esterilizable en autoclave en un volumen de 15 ml o inferior. En otro aspecto el volumen inyectado es inyectado como un bolo. En otro aspecto adicional del procedimiento, el óxido de hierro es superparamagnético. En otro aspecto de éste, el volumen inyectado proporciona una calidad de imagen mejorada.
La invención también se refiere a un procedimiento mejorado para administración en mamíferos de un complejo de hierro polisacárido reducido de manera tal que la composición proporciona una toxicidad reducida, en el que la mejora comprende la utilización de un polisacárido reducido en la formulación de la composición. En otro aspecto adicional del procedimiento, el óxido de hierro es superparamagnético.
La invención también se refiere a un procedimiento mejorado para la administración a un mamífero de un complejo de hierro polisacárido derivado reducido de manera tal que la composición proporciona una toxicidad reducida, en el que la mejora comprende la utilización de un polisacárido derivado reducido en la formulación de la composición. En otro aspecto adicional del procedimiento, el óxido de hierro es superparamagnético.
La invención también se refiere a un complejo de óxido de hierro polisacárido reducido, en el que el polisacárido reducido es derivado, por ejemplo, el polisacárido derivado reducido es un polisacárido de carboxialquilo. El carboxialquilo se selecciona del grupo que consiste en carboximetilo, carboxietilo y carboxipropilo. Asimismo, el polisacárido reducido puede ser un dextrano reducido, por ejemplo, el dextrano reducido puede ser un dextrano reducido de carboximetilo. Otro aspecto del mismo es que el nivel de derivación del dextrano reducido es de al menos 750 \mumol pero inferior a 1500 \mumol de grupos carboxilos por gramo de polisacárido, en el que dicha composición tiene una toxicidad reducida con relación a la composición con respecto a niveles menores de derivación.
La invención también se refiere a un complejo de óxido de hierro polisacárido reducido, siendo dicho complejo estable a una temperatura de al menos 100ºC aproximadamente. Preferentemente, dicho complejo es estable a una temperatura de aproximadamente 121ºC. En un aspecto aun más preferente del complejo de óxido de hierro polisacárido reducido, dicho complejo es estable a una temperatura de al menos 121ºC aproximadamente durante un período suficiente como para esterilizar el complejo. En otro aspecto adicional del procedimiento, el óxido de hierro es superparamagnético.
La invención también se refiere a un complejo de óxido de hierro polisacárido derivado reducido, siendo dicho complejo estable a una temperatura de al menos 100ºC aproximadamente. Preferentemente, dicho complejo es estable a una temperatura de aproximadamente 121ºC. En un aspecto aun más preferente del complejo de óxido de hierro polisacárido reducido, dicho complejo es estable a una temperatura de al menos 121ºC durante un período suficiente como para esterilizar el complejo. En otro aspecto adicional del procedimiento, el óxido de hierro es superparamagnético.
La invención se refiere preferentemente a un procedimiento de formulación para uso farmacológico de un complejo de óxido de hierro polisacárido reducido habiendo aumentado la estabilidad del pH en comparación con el óxido de hierro dextrano nativo correspondiente, comprendiendo el procedimiento: la producción de dextrano; y la reacción de dextrano con una sal de borohidruro o hidrógeno en presencia de un catalizador de hidrogenación, haciendo reaccionar el dextrano reducido con sales de hierro para producir una formulación con pH estable.
La invención se refiere preferentemente a un procedimiento de formulación para uso farmacológico de un complejo de óxido de hierro polisacárido derivado reducido habiendo aumentado la estabilidad de pH en comparación con el óxido de hierro de dextrano nativo correspondiente, comprendiendo el procedimiento: la producción de dextrano; y la reacción de dextrano con una sal de borohidruro o hidrógeno en presencia de un catalizador de hidrogenación, haciendo reaccionar el dextrano reducido con sales de hierro para producir una formulación con pH estable.
La invención también se refiere a un procedimiento de formulación de una composición de dextrano derivado reducido para uso farmacológico en el que la composición tiene una toxicidad reducida en comparación con el dextrano nativo, comprendiendo: la producción de un polisacárido derivado reducido; y la esterilización del producto mediante autoclave. De acuerdo con este procedimiento, el polisacárido reducido es obtenido mediante la reacción de un polisacárido nativo con uno de los diversos agentes reductores que se seleccionan del grupo que consiste en una sal de borohidruro o hidrógeno en presencia de un catalizador de hidrogenación. En un aspecto preferido de esto, el polisacárido es dextrano.
La producción de la composición puede incluir la derivación de un polisacárido reducido mediante carboxialquilación, por ejemplo, cuando la carboxialquilación es una carboximetilación. Asimismo, de acuerdo con este procedimiento, el polisacárido reducido puede ser un dextrano reducido. El polisacárido reducido derivado puede ser aislado como sal de sodio y no contener pico de absorción infrarrojo en la región de 1650-1800 cm^{-1}. En un aspecto del procedimiento, la producción del polisacárido reducido derivado se logra a una temperatura de menos de aproximadamente 50ºC. En otro aspecto del procedimiento, la producción del polisacárido reducido derivado se logra a una temperatura de menos de aproximadamente 40ºC.
La invención también se refiere a un procedimiento mejorado para la administración a un mamífero de un polisacárido derivado reducido de manera tal que la composición proporciona una toxicidad reducida, en el que la mejora comprende la utilización de un polisacárido reducido en la formulación de la composición.
La invención también se refiere a un polisacárido reducido, en el que el polisacárido reducido es derivado, por ejemplo, el polisacárido derivado reducido es un polisacárido de carboxialquilo. El carboxialquilo se selecciona del grupo que consiste en carboximetilo, carboxietilo y carboxipropilo. Asimismo, el polisacárido reducido puede ser un dextrano reducido. Otro aspecto del mismo es que el nivel de derivación del dextrano reducido es de al menos 750 micromolar de grupos carboxilo por gramo de polisacárido, en el que dicha composición tiene una toxicidad reducida con respecto a la composición con niveles inferiores de derivación.
La invención también se refiere a un procedimiento de formulación de una composición de dextrano para uso farmacológico, presentando una toxicidad reducida en comparación con el dextrano nativo, comprendiendo el procedimiento la obtención de dextrano; y la reacción del dextrano obtenido con una sal de borohidruro o hidrógeno en presencia de un catalizador de hidrogenación seguido por carboximetilación, reduciendo la toxicidad de dextrano carboximetilado reducido.
La invención también se refiere a un procedimiento mejorado de administración a un mamífero de una composición de polisacáridos del tipo en el que la composición incluye dextrano de manera tal que la composición proporciona una toxicidad reducida, en el que la mejora comprende la utilización de dextrano carboximetilado reducido en lugar de dextrano en la formulación. La invención también se refiere a un procedimiento mejorado para la administración a un mamífero de un polisacárido de manera tal que la composición proporciona una toxicidad reducida, en el que la mejora comprende la utilización de un polisacárido carboximetilado reducido en la formulación de la composición.
La invención también se refiere a un procedimiento de uso de dextranos derivados reducidos como expansores de sangre.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra un análisis espectrográfico infrarrojo por transformada de Fourier (FTIR) de sal de sodio de dextrano reducido de carboximetilo (CMRD) obtenida con el Ejemplo 5.
La Figura 2 muestra un análisis espectrográfico FTIR de óxido de hierro superparamagnético ultra pequeño recubierto con sal de sodio de CMRD (USPIO; ver Patente de los EE.UU. 5.055.288) obtenido en el Ejemplo 31.
La Figura 3 es un gráfico que muestra la cantidad de grupos carboximetilo (micromoles) por gramo de producto, en la ordenada, como una función de la cantidad de ácido bromoacético en mg/gramo usado en las reacciones con dextrano reducido como material de partida, en la abscisa. El gráfico se realizó con datos obtenidos de la Tabla 2.
La Figura 4 muestra farmacocinética de USPIO recubierto con CMRD en la sangre de tres ratas macho luego de la administración intravenosa de 2,2 mg de hierro por kg de peso corporal. Las muestras (0,25 ml) de sangre se tomaron en los tiempos indicados en la abscisa, y los tiempos de relajación se midieron con un espectrómetro Brucker Minispec.
La Figura 5 muestra el gráfico usado para determinar la semivida (67 minutos) de USPIO recubierto con CMRD en la sangre de ratas. Los datos de la Figura 4 se usaron para generar el gráfico de la Figura 5. El rango de semivida de 61 a 75 minutos estuvo dentro del nivel de confianza del 95%.
La Figura 6 muestra IRM en ratas, previa administración (A) y post administración (B) de agentes de contraste, porción anterior arriba. Se administró USPIO recubierto con CMRD (5 mg de hierro por kg de peso corporal) en la vena femoral antes de la toma de imagen de contraste post administración. La figura ilustra una visualización mejorada del corazón y las arterias y venas circundantes como consecuencia de la administración de USPIO recubierto con CMRD. La toma de imágenes se realizó con un reproductor de imágenes de resonancia magnética General Electric 2 Tesla.
La Figura 7 muestra imágenes IRM de un cerdo, previa administración (B) de un agente de contraste, porción anterior arriba. Se administró USPIO recubierto con CMRD (Ejemplo 31; 4 mg de hierro por kg de peso corporal) en la vena femoral antes de la toma de imagen de contraste post administración. La figura presenta una visualización mejorada del corazón y las arterias y venas circundantes como consecuencia de la administración de USPIO recubierto con CMRD. La toma de imágenes se realizó con un reproductor de imágenes de resonancia magnética Siemans 1.5T Magnatom Vision.
La Figura 8 muestra imágenes IRM de la porción anterior de un ser humano normal previa administración (A) y post administración (B) de un agente de contraste de imagen. Se administró USPIO recubierto con CMRD (4 mg de hierro por kg de peso corporal) como un bolo en la vena del brazo antes de la toma de imagen de contraste post administración. La reproducción de imágenes se realizó 15 a 30 minutos después de la administración del agente de contraste. La imagen presenta una visualización mejorada del corazón y las arterias y venas circundantes.
La Figura 9 muestra la cinética de depuración de sangre del agente de imagen en humanos. Se administró USPIO recubierto con CMRD (4 mg de hierro por kg de peso corporal) como un bolo en la vena del brazo antes de la toma de muestras de sangre. Las muestras se analizaron para una relajación de 1/T2 para determinar la concentración en sangre de USPIO recubierto con CMRD. El gráfico muestra la concentración de USPIO recubierto con CMRD (ordenada) como una función de tiempo (abscisa).
Descripción detallada de realizaciones específicas
La Tabla 1 resume las características de dos clases de agentes de contraste de IRM que han sido anteriormente descritos y muestra una comparación de sus características con las de un agente de contraste ideal. Los agentes de la invención representan las características ideales, como se demuestra en la presente.
Sorprendentemente, el desarrollo y la síntesis de preparaciones de óxido de hierro superparamagnético ultra pequeño (USPIO) recubierto con dextranos reducidos polisacáridos y derivados de dextranos reducidos, tales como los agentes con las propiedades deseadas aquí descritas, derivan de un cambio en la naturaleza química de un componente, el dextrano T10. Este cambio supuso la reducción de un grupo aldehído terminal a un alcohol del polisacárido empleado en su síntesis al alcohol (Esquema 1). El Esquema 1 muestra el cambio químico de un polisacárido tal como dextrano al ser tratado con borohidruro de sodio. La forma hemiacetal del polisacárido (estructura 1) está en equilibrio con la forma del aldehído del polisacárido (estructura 2). La estructura 2 representa menos del 0,01% de la mezcla de equilibrio (Brucker, G. (1974) Organic Chemistry: Amino Acids, Peptides and Carbohydrates, Tankonykiado Press, Budapest, p. 991). El tratamiento de la estructura 2 con borohidruro de sodio da como resultado una conversión irreversible a la forma poliol lineal del polisacárido (estructura 3). El equilibrio dinámico entre las estructuras 1 y 2 permite la completa conversión, cuando es tratado con borohidruro de sodio, en poliol lineal (estructura 3).
Esquema 1
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2
Las partículas de óxido de hierro superparamagnéticas recubiertas con dextrano presentan un interés particular como agentes de contraste en imágenes por resonancia magnética (MRI) debido a su capacidad para mejorar las imágenes del hígado y la linfa. Feridex LV® (Advanced Magnetics, Inc., Cambridge MA) es un agente de contraste MRI de óxido de hierro superparamagnético recubierto con dextrano, y está aprobado para su uso en humanos. Combidex® (Advanced Magnetics, Inc.) es un óxido de hierro superparamagnético ultra pequeño (USPIO) recubierto con dextrano que ha completado la Fase III de ensayos clínicos para la reproducción de imágenes del hígado y la Fase III de ensayos para la reproducción de imágenes de la linfa. Combidex® tiene un diámetro medio más pequeño (20 nm) que Feridex LV® (60 nm), lo cual le otorga una biodistribución diferente en humanos. Combidex® está fabricado mediante la adición de una base a una solución compuesta por dextrano, cloruro férrico y cloruro ferroso. El proceso de síntesis comprende la combinación de ingredientes, el calentamiento y la purificación mediante ultrafiltración. Sin embargo, el producto de dextrano agregado a las partículas en la reacción no es eficiente. El dextrano de grado farmacéutico es el componente más costoso de la síntesis de Combidex®. Es deseable un uso más eficiente del dextrano en la síntesis de Combidex® para poder disminuir los costos de producción.
La esterilización terminal (autoclave) es un procedimiento preferente para la esterilización de fármacos inyectables. Sin embargo, muchos de los coloides de óxido de hierro superparamagnético empleados como agentes de contraste en IRM son sintetizados con revestimientos y recubrimientos de polímeros que modifican la biodistribución y eliminación de estos coloides. Al exponerse al calor durante todo el proceso de autoclave, el revestimiento polimérico puede disociarse de los núcleos de óxido de hierro. Las consecuencias funcionales de la disociación del polímero del óxido de hierro son cambios físicos en el material, tales como aglutinación, cambios de biodistribución (cambios en la semivida en plasma) y cambios en el perfil de toxicidad (aumentos potenciales frente a eventos adversos). Por ejemplo, una disminución sustancial en el pH de la solución puede ser detectada luego de la esterilización por autoclave de las partículas de dextrano de hierro y el pH continúa disminuyendo al dejar en reposo.
Diversas soluciones han sido descritas respecto al problema de la resistencia frente al estrés por calor. Palmaci et al., Patente de los EE.UU. 5.262.176, empleó dextrano entrecruzado para estabilizar el recubrimiento de las partículas de óxido de hierro previo al autoclave. El proceso de entrecruzado utiliza agentes nocivos tales como epiclorohidrina y epibromohidrina, los cuales deben ser eliminados del coloide luego de la reacción de entrecruzado.
También se han descrito procedimientos para prevenir el aglutamiento del coloide inducido por el estrés por calor que no tienen efecto sobre la disociación del recubrimiento. Estos procedimientos generalmente incluyen el uso de excipientes durante el proceso de autoclave. Groman et al., Patente de los EE.UU. 4.827.945, y Lewis et al., Patente de los EE.UU. 5.055.288, emplean citrato para evitar el aglutamiento de las partículas al disociarse el recubrimiento. Groman et al., Patente de los EE.UU. 5.102.652, emplea carbohidratos de bajo peso molecular tal como manitol para evitar el aglutamiento durante el proceso de autoclave. Estos excipientes aumentan el costo y la complejidad de la fabricación del producto y no resuelven el problema de disociación del polímero de la partícula de hierro.
Josephson et al., Patente de los EE.UU. 5.160.726, evita el estrés por calor en el recubrimiento mediante el uso de esterilización por filtro en lugar de calentamiento para esterilizar el coloide. La esterilización de filtro es costosa ya que tanto el proceso de esterilización como el cierre del recipiente deben llevarse a cabo en un ambiente libre de gérmenes. Además, la esterilización de filtro tiene un grado mayor de fracaso que el proceso de autoclave, lo cual refleja la incapacidad para obtener un ambiente para el paso de la filtración que esté totalmente libre de gérmenes.
Maruno et al., Patente de los EE.UU. 5.204.457, describe una partícula recubierta con dextrano de carboximetilo con una estabilidad mejorada hasta los 80ºC por un período extendido de tiempo pero no enseña el uso de esterilización terminal mediante autoclave. Hasegawa et al. (Japan J. Appl. Phys., Parte 1, 37(3A):1029-1032, 1998) describe partículas de hierro recubiertas con dextrano de carboximetilo con estabilidad térmica a 80ºC, pero no enseña el uso de una partícula recubierta con dextrano reducido de carboximetilo y tampoco enseña el uso de esterilización terminal mediante autoclave.
Los agentes para imágenes por resonancia magnética actúan mediante la afectación de los tiempos de relajación normales, principalmente en los protones del agua. Hay dos tipos de relajación: una conocida como longitudinal o relajación T1 y la otra conocida como transversal o relajación T2. La relajación T1 en general provoca una mayor luminosidad de la imagen producto de un aumento en la señal. Los procesos T1 son más útiles en la reproducción de imágenes del sistema vascular. La relajación T2 en general provoca un oscurecimiento de la imagen producto de una disminución en la señal. Los procesos T2 son más útiles para la reproducción de imágenes de órganos como el hígado, el bazo o ganglios linfáticos que contengan lesiones tales como tumores. Todos los agentes de contraste tienen propiedades T1 y T2; sin embargo tanto la relajación T1 como T2 pueden caracterizar la propiedad de relajación dominante de un agente de contraste particular. Los agentes de contraste basados en gadolinio de bajo peso molecular son agentes T1 y tienen su aplicación principal en la reproducción de imágenes de problemas médicos vasculares como accidentes cerebro vasculares y aneurismas y del cerebro. Los agentes de contraste coloidal basados en óxido de hierro son agentes T2 y tienen su aplicación principal en la reproducción de imágenes de tumores del hígado y de los ganglios linfáticos (próstata y cáncer de mama). Es deseable un agente que contenga los dos tipos de propiedades: T1 y T2. La utilización de dicho agente (i) ofrecería un único fármaco para todas las aplicaciones y simplificaría el inventario de la farmacia, (ii) simplificaría la toma de imágenes en la habitación de IRM, y (iii) mejoraría el cuidado del paciente permitiendo el estudio simultáneo de diversos problemas médicos en un único paciente mediante un único estudio, en lugar de requerir el uso de uno de los dos agentes de contraste T1 o T2.
Un dextrano puede suscitar una respuesta anafiláctica, en ocasiones fatal, al ser administrado por vía intravenosa (i.v.) en hombres (Briseid, G. et al., Acta Pharmcol. et Toxicol., 1980, 47:119-126; Hedin, H. et al., Int. Arch. Allergy and Immunol., 1997: 113:358-359). También se han observado reacciones adversas relacionadas con la administración de coloides de óxido de hierro recubiertos con dextrano magnético. Estos coloides de óxido de hierro recubiertos con dextrano no magnético que tienen utilidad como hematínicos, en particular como un complemento al tratamiento con eritropoyetina para pacientes de diálisis renal en etapa final, pueden tener efectos secundarios.
Se puede obtener información relacionada con las propiedades anatómicas del sistema vascular mediante el uso de agentes de contraste de dos maneras distintas. Cuando se administra por primera vez el agente de contraste en forma de bolo, pasa inicialmente a través del árbol vascular como una masa relativamente coherente. La coordinación del momento de captura de imagen de la propiedad anatómica deseada con el momento en que el bolo pasa por ese lugar puede producir información útil. Esta técnica basada en el uso de agente de contraste es llamada imagen del primer paso. Más tarde, el bolo se diluye y se mezcla, logrando una concentración equilibrada en el sistema vascular. Bajo determinadas circunstancias, este equilibrio o estado estable puede ofrecer información útil. La reproducción de imágenes puede realizarse en una fase temprana, a pocos minutos de la inyección del agente de contraste ("primer paso"), y en una fase tardía, luego de diez minutos de la inyección del agente de contraste (fase de equilibrio). Los agentes gadolinios son adecuados solamente para la reproducción de imagen de primer paso debido a su pronta difusión desde el sistema vascular hacia los espacios intersticiales de los tejidos. Los óxidos de hierro coloidal anteriormente descritos son útiles para el equilibrio ya que requieren una administración diluida a lo largo de un período de tiempo prolongado. Los óxidos de hierro coloidal no se pasan al espacio intersticial pero pueden permanecer en el sistema vascular durante horas. Es deseable un agente que ofrezca la posibilidad de realizar tanto la imagen de primer paso como la imagen de equilibrio.
Durante la administración en un entorno médico de un agente de contraste para imagen de "primer paso", el tiempo de reproducción de imagen y el pasaje del "primer paso" del agente de contraste puede no ser coincidente. Si no se obtiene una imagen útil, es deseable la administración de una segunda dosis de agente de contraste para obtener otra imagen de "primer paso". En otras ocasiones, los radiólogos encuentran útil estudiar varios volúmenes para el paciente que requiera un régimen de dosificación múltiple de agente de contraste con el fin de obtener imágenes de "primer paso" en cada uno de los múltiples lugares de interés. Con agentes de contraste gadolinios, esta aplicación de "primer paso" de administración múltiple no es posible debido a que el gadolinio se escapa del espacio vascular produciendo un fondo confuso alrededor de los vasos sanguíneos de interés. Los agentes de contraste coloidal de óxido de hierro comunes no son adecuados ya que no son administrados como un bolo sino como una solución diluida a lo largo de un período de tiempo largo, obviando las aplicaciones de "primer paso".
El diagnóstico del progreso del tumor en pacientes con cáncer es importante para caracterizar la etapa de la enfermedad y para evaluar el tratamiento. Para minimizar el costo y la incomodidad del paciente, es deseable que en un estudio IRM se administre una única dosis de agente de contraste que permita la evaluación de sistemas de órganos múltiples que estén afectados por la enfermedad. Por ejemplo, en un cáncer de mama primario, es deseable evaluar el estado del tumor en las mamas y en sitios metastáticos múltiples incluyendo el hígado, bazo, médula ósea y ganglios linfáticos. La administración de agentes de contraste a base de gadolinio puede no satisfacer este requerimiento debido a su corta semivida en el cuerpo, su filtración al sistema vascular y su incapacidad para concentrarse en los órganos de interés. Los agentes de contraste a base de coloide de óxido de hierro tal como Combidex® pueden servir en esta capacidad múltiple mientras que Feridex I.V.®, otro agente de contraste de coloide de óxido de hierro, está limitado a la reproducción de imagen del hígado y bazo.
La administración de un agente de contraste en un volumen pequeño (inferior a 5 ml) es deseable ya que, la administración de un volumen pequeño mejora la resolución obtenida en la imagen de primer paso y minimiza el tiempo de inyección e incomodidad al paciente. Los agentes de contraste a base de gadolinio se administran en volúmenes de aproximadamente 30 ml debido a limitaciones causadas por la solubilidad y potencia de estos agentes. Actualmente, los agentes de contraste basados en óxido de hierro se administran como una solución diluida en gran volumen (50-100 ml) a lo largo de un período de tiempo prolongado (30 minutos). Estas limitaciones surgen a partir de temas de seguridad asociados con la administración rápida y concentrada de agentes a base de óxido de hierro. La inyección de bolos es deseable ya que permite imágenes de primer paso y acorta el tiempo de contacto entre el paciente y el prestador de servicios médicos. Asimismo, la inyección de bolos permite al profesional administrar el agente de contraste mientras la persona está en el aparato de IRM durante el estudio, optimizando así el uso eficiente del instrumento de imagen. Los agentes a base de gadolinio pueden ser administrados como un bolo.
Los agentes de contraste a base de gadolinio comprenden una molécula quelante y un catión de gadolinio. El gadolinio es un elemento tóxico y debe ser expulsado del cuerpo para evitar toxicidad. Los óxidos de hierro coloidal no son expulsados del cuerpo pero son procesados en el hígado y otros órganos hasta convertirse en hierro metabólico, tal como el hierro en la hemoglobina. De esta forma, las composiciones de la invención pueden servir como un complemento de hierro para pacientes que sufren de anemia y son especialmente útiles para pacientes bajo tratamiento con eritropoyetina.
Una realización de la invención proporciona un procedimiento para la síntesis de un coloide de un óxido de hierro asociado con un recubrimiento polisacárido soluble en agua de manera que mitigue la disociación del recubrimiento del óxido de hierro cuando el material esté sujeto a estrés por calor.
De la forma que se utiliza en la presente y en las reivindicaciones adjuntas, el "estrés por calor" se define como el calentamiento del coloide hasta aproximadamente 121ºC o más durante aproximadamente 30 minutos con pH neutro, u otras combinaciones de tiempo, temperatura y pH que son bien conocidas en la técnica para esterilizar en autoclave (o esterilización terminal) un fármaco inyectable.
Un procedimiento que es una realización de la invención incluye los pasos de tratamiento de un polisacárido con un agente de reducción tal como una sal de borohidruro o hidrógeno en presencia de un catalizador de hidrogenación como Pt o Pd para obtener el polisacárido reducido, de forma tal que el azúcar de reducción terminal haya sido reducida para producir una estructura polihídrica. El polisacárido reducido puede ser una arabinogalactana, un almidón, una celulosa, un hidroxietil almidón (HES), una inulina o un dextrano. Además, el polisacárido puede funcionalizarse adicionalmente antes de la formación de partículas. El procedimiento comprende además la mezcla del polisacárido reducido con sales de hierro en una solución ácida seleccionada entre el grupo compuesto por sales férricas, sales ferrosas o una mezcla de sales férricas y ferrosas, el enfriamiento de la solución y la neutralización de la solución con una base y la recuperación del coloide de óxido de hierro recubierto.
De acuerdo con otra realización de la invención, las bases que pueden emplearse para la etapa de neutralización del coloide son: hidróxido de sodio, carbonato de sodio y más preferentemente hidróxido de amonio. En otra realización de la invención, el derivado polisacárido es dextrano reducido y las sales de hierro pueden ser sales ferrosas y férricas, lo cual produce un coloide de óxido de hierro superparamagnético con un recubrimiento soluble al agua que no se disocia del núcleo del óxido de hierro frente al estrés por calor durante la esterilización terminal.
En otra realización de la invención, únicamente las sales férricas son utilizadas, produciendo una partícula no superparamagnética.
En otra realización, se puede preparar un coloide recubierto mediante la adición de un polisacárido a un sol de óxido de hierro (una dispersión coloidal en un líquido) ajustando el pH entre 6-8 y recuperando el coloide de óxido de hierro recubierto.
El término "coloide" de la forma que se utiliza en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas incluirá cualquier macromolécula o partícula de tamaño menor a aproximadamente 250 nm. Los coloides polisacáridos de óxido de hierro de la invención han mejorado sustancialmente las características físicas y el proceso de fabricación en comparación con los materiales anteriormente descritos. Las características físicas mejoradas se evidencian en la capacidad del coloide de soportar el estrés por calor, como se demostró al someter el coloide a una temperatura de 121ºC durante 30 minutos. Las partículas de coloide realizadas de acuerdo con la invención muestran menor evidencia de disociación del polisacárido frente al estrés, permaneciendo coloidal y sin exhibir cambios apreciables de tamaño.
Durante la fabricación, el proceso que constituye una realización de la invención emplea típicamente una décima parte o menos de la cantidad de polisacáridos requeridos en las preparaciones previas a base de polisacáridos no reducidos, lo cual implica un ahorro sustancial en el costo de materias primas gracias a la mejor eficiencia del proceso de invención.
La variación en factores tales como la concentración de derivados polisacáridos, concentración de bases y/o concentración de Fe(III)/Fe(II) puede producir coloides con diferentes susceptibilidades magnéticas y tamaños. El cambio de los índices Fe(III)/Fe(II) modifica el tamaño de partícula y altera la susceptibilidad magnética. Los índices superiores (por ejemplo, 2,0 mol/mol) tienden a disminuir la susceptibilidad mientras que los índices inferiores (por ejemplo, menor a 1,5 mol/mol) tienden a aumentar el tamaño de la partícula.
El proceso puede ser ajustado para producir coloides con diferentes propiedades biológicas mediante el cambio de tipo de polisacárido y continuando la derivación de la partícula luego de la síntesis.
Los coloides que constituyen una realización de la invención pueden ser usados como agentes de contraste para las imágenes por resonancia magnética (IRM) o en otras aplicaciones tal como fraccionamiento magnético de células, inmuno ensayos, administración de fármacos de alcance magnético y como complemento terapéutico de hierro inyectable. Estos coloides son especialmente adecuados para administración parenteral ya que la esterilización final es típicamente por autoclave, un procedimiento preferente porque elimina la viabilidad de todas las formas de vida celular incluyendo las esporas bacterianas y los virus. Los procedimientos anteriores de realización de coloides requerían la adición de excipientes como citrato o polisacáridos de bajo peso molecular como estabilizadores durante el proceso de autoclave (ver Patente de los EE.UU. 4.827.945 y Patente de los EE.UU. 5.102.652) o evitaban por completo el estrés por calor mediante la esterilización de filtro (ver Patente de los EE.UU. 5.150.726). De esta forma, las realizaciones de la presente invención que son los procedimientos para la síntesis de coloides y las realizaciones de la presente invención que comprenden las composiciones de coloides, presentan utilidades significativamente mejoradas como agentes de contraste IRM y agentes hematínicos que son complementos de hierro. Las mejoras presentadas por estos agentes en relación a la técnica anterior, quedan demostradas en los siguientes ejemplos: los agentes que son realizaciones de la presente invención se pueden esterilizar mediante autoclave y por lo tanto son óptimos para la conservación a largo plazo a temperatura ambiente; estos agentes no requieren la adición de excipientes para el mantenimiento de la estabilidad durante el proceso de esterilización o conservación; los agentes no son tóxicos para los mamíferos, incluyendo los humanos; una dosis efectiva de los agentes usada para la reproducción de imagen supone una cantidad más pequeña de material que los agentes descritos en la técnica; y la farmacocinética posterior a la administración es tal que las dosis sucesivas reiteradas administradas luego de un breve intervalo posterior a la administración de una primera dosis, pueden ser usadas para obtener imágenes adicionales durante una única visita clínica y un único uso del aparato de imagen.
En el caso del dextrano y los derivados del mismo, las formulaciones preparadas siguiendo este procedimiento son menos inmuno receptivas en mamíferos, como se demuestra en los datos obtenidos usando un modelo de rata y en ensayos clínicos realizados en seres humanos. Las partículas de hierro recubiertas de dextrano y de derivados de dextrano, mejoraron las imágenes del corazón, pulmones, riñones y otros órganos y sistemas en tres especies de mamíferos: ratas, cerdos y humanos. Las partículas de hierro recubiertas de dextrano o derivados de dextrano también pueden utilizarse como agentes hematínicos para producir hierro en un formato de absorción más eficiente que el real en complementos de hierro a grupos de pacientes con carencias crónicas de hierro como por ejemplo los pacientes de diálisis, pacientes con cáncer, pacientes con gastroenteritis y receptores de eritropoyetina. Los dextranos reducidos derivados también pueden ser usados como extensores de plasma que, a diferencia de la sangre y de las fracciones sanguíneas, no tienen que ser inmunológicamente reticulados, y a diferencia de la preparación de la albúmina de suero humano, pueden ser esterilizados de manera tal que los virus, incluyendo las cepas de hepatitis, CMV y VIH, encefalitis espongiformes y otros agentes infecciosos, son destruidos. Los extensores de plasma de la invención no tienen que ser refrigerados o almacenados fuera de la luz y el calor y por lo tanto son ventajosos en situaciones de emergencias médicas, como tratamientos de shock causado por pérdida de sangre como traumatismo, incluso en climas tropicales.
Los Ejemplos 1, 2 y 3 muestran los procedimientos para la realización de dextranos reducidos del tipo T1, T5 y T10 respectivamente. El Ejemplo 4 describe la preparación de pululano reducido.
Los Ejemplos 5-9 describen la síntesis de dextrano reducido de carboximetilo T10 con diferentes grados de carboximetilación, a partir del dextrano nativo T10 (Tabla 2).
Los Ejemplos 10-15 describen la síntesis de dextrano reducido de carboximetilo T10 con diferentes grados de carboximetilación, partiendo de dextrano reducido T10 (Tabla 3).
Los Ejemplos 16-18 describen la síntesis de dextrano de carboximetilo T10, T40 y T70 a partir de dextrano
nativo.
Los Ejemplos de comparación 19-26 describen la preparación de óxidos de hierro recubiertos con dextrano nativo y reducido. Las condiciones para las reacciones de estos ejemplos fueron elegidas para producir USPIO recubiertos con polisacáridos reducidos o no reducidos. Las condiciones de reacción para las preparaciones de óxido de hierro dextrano nativo fueron las mismas que para las preparaciones de dextrano reducido de igual peso molecular, permitiendo así, la comparación de la efectividad de los dextranos respectivos en el recubrimiento de partículas. El diámetro de volumen medio (DVM) y la susceptibilidad magnética de las preparaciones de óxido de hierro obtenidas mediante el uso de polisacáridos reducidos en comparación con polisacáridos nativos (preparados en estos ejemplos) están resumidos en la Tabla 4.
Los Ejemplos de comparación 27-29 describen un procedimiento para la preparación de USPIO con dextranos nativos T1, T5 y T10, para obtener coloides de óxido de hierro con un diámetro de partícula menor a 30 nm. En la Tabla 5 se muestra una comparación de los efectos de los dextranos nativos (Ejemplos 27-29) y sus respectivos dextranos reducidos (Ejemplos 19, 21 y 23) en la síntesis y las propiedades de los coloides de óxido de hierro.
Los Ejemplos 30-31 describen la preparación de USPIO recubierto con dextrano nativo de carboximetilo T10 y dextrano reducido de carboximetilo T10.
Los ejemplos 32-41 describen la preparación de USPIO recubierto con preparaciones de dextrano reducido de carboximetilo T10 con distintos alcances de carboximetilación. La Tabla 6 muestra el efecto del alcance de la carboximetilación de CMRD sobre el tamaño de USPIO. La Tabla 7 muestra el efecto del alcance de la carboximetilación de CMRD sobre la solubilidad de una solución de cloruro férrico/ferroso.
Los Ejemplos 42-48 describen la síntesis de soles de óxido de hierro y su estabilización con dextranos nativos y reducidos y CMRD. El Ejemplo 49 describe la preparación de coloide de óxido de hierro no magnético cubierto con CMRD empleando una precipitación base de cloruro férrico y CMRD.
El Ejemplo 50 estudia el efecto del proceso de esterilización mediante autoclave de diversas preparaciones de USPIO recubierto con dextranos nativos o reducidos sobre las propiedades de estas partículas. Los resultados se muestran en las Tablas 8 y 9.
El Ejemplo 51 presenta las propiedades de relajación de diversos agentes de contraste comparando estas propiedades para agentes de contraste a base de gadolinio y USPIO preparados con dextrano nativo y dextrano reducido de carboximetilo T10 (Tabla 10).
En los Ejemplos 52-53 se determinó la presencia de síntomas de toxicidad en ratas de USPIO recubierto con dextrano reducido y no reducido (nativo) con respuesta a una reacción anafiláctica. El alcance de la reacción de tipo anafiláctica se determinó mediante el volumen de edema de patas. Se realizaron estudios similares utilizando dextranos nativos, reducidos y reducidos carboximetilados. Los resultados están resumidos en las Tablas 11-14.
El Ejemplo 54 y las Figuras 4 y 5 muestran la cinética de depuración de un USPIO recubierto con CMRD en la circulación de una rata. Se determinó la semivida del agente.
En el Ejemplo 55 y la Figura 6 se muestra un escaneo de IRM mejorado posterior a la administración de USPIO recubierto con CMRD, el escaneo muestra imágenes del corazón, la aorta y otras arterias cardíacas de una rata. El Ejemplo 56 y la Figura 7 muestran un escaneo mejorado con USPIO recubierto con CMRD de la porción anterior de un cerdo. El Ejemplo 57 muestra que la inyección de USPIO recubierto con CMRD en seres humanos como parte de un ensayo clínico, no produjo efectos adversos. El Ejemplo 57 describe la biodistribución (Figura 8), la cinética de imagen (Figura 9 y Tabla 15) y la ausencia de fondo en el uso de IRM de este material en humanos. Los datos de este ejemplo muestran la capacidad del profesional de la invención para realizar administraciones múltiples y obtener imágenes posteriores dentro de un tiempo real de visita al consultorio o a una instalación de IRM.
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Ejemplos Procedimientos Generales para la síntesis de polisacáridos reducidos
Los polisacáridos reducidos fueron preparados mediante tratamiento con exceso de borohidruro de sodio y generalmente purificados mediante cinco ciclos de ultrafiltración. En todos los ejemplos se utilizó agua destilada. En el caso de polisacárido pululano, la mezcla de reducción se utilizó sin purificación adicional. En todos los casos, los productos mostraron menos de 5% de contenido aldehído residual. La concentración de aldehído residual fue determinada mediante la aplicación de un ensayo azul de tetrazolio modificado (Jue, C. K. et al., J. Biochem. Biophys. Methods, 1985, 11:109-15). La concentración de dextrano se determinó mediante un ensayo de ácido fenólico/sulfúrico (Kitchen, R., Proc. Sugar Process. Res. Conf., 1983, 232-47). En aquellos casos en los que la ultrafiltración fue omitida, quedó demostrado que, salvo el dextrano T1, las sales de borato residuales no afectaron la formación de partículas. Los Ejemplos 1 al 4 presentan procedimientos de síntesis de dextranos T1, T5 y T10 polisacáridos reducidos y pululano, respectivamente. Los tiempos de retención se determinaron con una columna Ultrahydrogel 250 de Waters, SN T52262A33, con solución salina tamponada con fosfato 20 mM, con una velocidad de flujo de 0,4 ml/min.
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Ejemplo 1 Dextrano T1 reducido
Se disolvió dextrano T1 (10 g) en 100 ml de agua a 25ºC, se agregó 1,0 g de borohidruro de sodio y la mezcla se agitó durante 12 h. El pH se llevó a 5,0 con HCl 6M y se agregaron 200 ml de etanol (anhidro). El precipitado se obtuvo mediante centrifugación. Se decantó la capa etanol/agua y el residuo se disolvió en 100 ml de agua. Se utilizó la adición de 200 ml de etanol absoluto para lograr una segunda precipitación y el etanol/agua fue nuevamente decantado. El producto precipitado se disolvió en agua y fue sometido a liofilización para producir un sólido blanco con un rendimiento de 60%. Los tiempos de retención (min) de HPLC observados fueron: para el dextrano reducido, 24,4; y para el dextrano nativo, 24,4.
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Ejemplo 2 Dextrano T5 reducido
Se disolvió dextrano T5 (4 g) en 25 ml de agua a 25ºC, se agregaron 83 mg de borohidruro de sodio y la mezcla se agitó durante 12 h. El pH se llevó a 5,0 con HCl 6M. Se ultrafiltró la mezcla con un filtro de membrana de corte de peso molecular (MWCO) de 1 kDa. El producto fue liofilizado para producir un sólido blanco y se obtuvo un rendimiento del 70%. Los tiempos de retención (min) de HPLC observados fueron: para el dextrano reducido, 22,9; y para el dextrano nativo, 21,9.
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Ejemplo 3 Dextrano reducido T10
Se disolvió dextrano T10 (5,003 g) en 26,011 g de agua. Se agregó borohidruro de sodio (52,5 g) y la mezcla se agitó durante 24 horas. El pH se ajustó a 7,1 con HCl 6N. El producto se purificó mediante ultrafiltración repetida con una membrana de ultrafiltración de 3 kDa y se liofilizó para producir un sólido blanco. Rendimiento: 3.129 g. Los tiempos de retención (min) de HPLC observados fueron: para el dextrano reducido, 21,6; y para el dextrano nativo, 21,1.
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Ejemplo 4 Pululano reducido
Se disolvió pululano (90 g) en 0,8 ml de agua a 25ºC y se agregó 1 mg de borohidruro de sodio. La mezcla se agitó durante 12 h y se utilizó directamente en la preparación de USPIO.
Procedimientos generales para la síntesis de un dextrano reducido de carboximetilo usando dextrano nativo T10 como sustrato.
Los Ejemplos 5-9 describen la síntesis de dextranos reducidos de carboximetilo a partir de dextrano nativo. Se presentan dos procedimientos generales de síntesis, un procedimiento con baja concentración de dextrano (Ejemplo 5), en el cual la concentración de partida del dextrano nativo fue de 70 mg/g y un procedimiento con una concentración de dextrano (Ejemplos 6-9) en el cual la concentración de partida del dextrano nativo fue de 240 mg/g.
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Ejemplo 5 Dextrano reducido de carboximetilo T10 preparado mediante el procedimiento de concentración baja de dextrano
Se prepararon y enfriaron a 5ºC las siguientes soluciones: La solución A conteniendo 4.200 g de hidróxido de sodio en 10,5 litros de agua; y la solución B conteniendo 2.310 g de ácido bromoacético en 5.700 ml de agua. La solución C que contenía 3.000 g de dextrano T10 en 7.500 ml de agua se calentó a 38ºC.
Se disolvió hidróxido de sodio (600 g) en 7,5 litros de agua y se calentó a 38ºC. Se agregó borohidruro de sodio (60 g) y la mezcla se agitó durante 2 min antes de agregar la Solución C e inmediatamente después, se agregó una segunda porción de borohidruro de sodio (60 g). La mezcla se agitó a 38ºC durante 30 min y luego se dejó enfriar a 15ºC. Se agregó la Solución A manteniendo la temperatura de la solución por debajo de los 25ºC. Se agregó la Solución B y la temperatura de la solución se mantuvo por debajo de los 25ºC. La mezcla se agitó durante 2 horas a temperatura ambiente y se neutralizó a pH 7,5 con HCl 6M enfriado a 5ºC manteniendo la temperatura de la solución por debajo de los 35ºC. La mezcla se filtró a través de un filtro de 0,2 \mum y se diluyó en 80 litros. El producto se purificó mediante ultrafiltración reiterada a través de una membrana de ultrafiltrado MWCO de 3 kDa, se filtró nuevamente a través de un filtro de 0,2 \mum y se sometió a liofilización.
El sólido recuperado, 2.560 g de dextrano reducido de carboximetilo T10 (sal de sodio) presentó un contenido de carboxilo fue de aproximadamente 1.265 micromoles de carboxilos por gramos de producto, como se determinó mediante valoración. El uso de ácido bromoacético permitió a la reacción proceder a una temperatura menor en comparación con el uso de ácido cloroacético y produjo un producto más limpio como se demuestra en el espectro FTIR (Figura 1). La Figura 1 muestra que no hay absorción de carbonilo aparte de la del carboxilato a 1.600 cm^{-1} a diferencia del FTIR del producto de la Patente de los EE.UU. 5.204.457 que se preparó con ácido cloroacético.
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Ejemplo 6 Dextrano CMRD reducido con carboximetilo T10 preparado mediante el procedimiento de concentración alta de dextrano
Se agregó borohidruro de sodio (0,4 g) y 0,5 g de una solución al 50% peso/peso de hidróxido de sodio en agua, a una solución de 25 g de dextrano en 50 g de agua. La mezcla se agitó durante 4 horas a temperatura ambiente, se agregó 19,5 g de una solución de hidróxido de sodio 1:1 y 6,2 g de ácido bromoacético y se mantuvo la temperatura por debajo de los 25ºC utilizando un baño helado. Luego, la mezcla se agitó durante 16 horas a temperatura ambiente.
Para purificar el producto, el pH de la mezcla se ajustó a pH 6,2 con HCl 6M y se agregaron 120 ml de etanol. Se formó un precipitado y se dejó reposar, y el sobrenadante se eliminó mediante decantación. El residuo se disolvió en 60 ml de agua y se agregaron 200 mg de cloruro de sodio y luego 30 ml de etanol y el dextrano reducido de carboximetilo se dejó reposar. La secuencia de adición de agua y cloruro de sodio seguida por la disolución del precipitado y la precipitación del etanol, se repitió dos veces más. El residuo se disolvió en 60 ml de agua y se agregó 1 litro de etanol. El dextrano reducido de carboximetilo se dejó reposar nuevamente y el sólido se recuperó en un filtro de vidrio poroso medio. El sólido blanco se secó 24 horas a 50ºC. El rendimiento fue de 27 g de producto con 1108 micromoles de carboxilo por gramo como se determinó mediante valoración (Tabla 2).
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Ejemplo 7 Dextrano reducido de carboximetilo T10 preparado mediante el procedimiento de concentración alta de dextrano
Se agregó borohidruro de sodio (0,4) g y 0,5 g de hidróxido de sodio al 50% a una solución de 25 g de dextrano en 50 g de agua. La mezcla se agitó durante 4 horas a temperatura ambiente, se agregó 20,0 g de hidróxido de sodio al 50% y 6,95 g de ácido bromoacético mientras la temperatura se mantenía por debajo de los 25ºC utilizando un baño helado mientras que la mezcla se agitó durante 16 horas a temperatura ambiente. El producto se purificó de la forma descrita en el Ejemplo 6. El rendimiento fue de 23,9 g de producto con 1262 micromoles de carboxilo por gramo como se determinó mediante valoración (Tabla 2).
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Ejemplo 8 Dextrano reducido de carboximetilo T10 preparado mediante el procedimiento de concentración alta de dextrano
Se agregó borohidruro de sodio (0,4) g y 0,5 g de hidróxido de sodio al 50% a una solución de 25 g de dextrano en 50 g de agua. La mezcla se agitó durante 4 horas a temperatura ambiente, se agregó 20,67 g de hidróxido de sodio al 50% y 7,65 g de ácido bromoacético mientras la temperatura se mantenía por debajo de los 25ºC utilizando un baño helado. La mezcla se agitó durante 16 horas a temperatura ambiente. El producto se purificó de la forma descrita en el Ejemplo 6. El rendimiento fue de 24,5 g de producto con 1404 micromoles de carboxilo por gramo, como se determinó mediante valoración (Tabla 2).
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Ejemplo 9 Dextrano CMRD reducido con carboximetilo T10 preparado mediante el procedimiento de concentración alta de dextrano
Se agregó borohidruro de sodio (0,4 g) y 0,5 g de una solución al 50% de hidróxido de sodio, a una solución de 25 g de dextrano en 50 g de agua. La mezcla se agitó durante 4 horas a temperatura ambiente, se agregaron 20,67 g de hidróxido de sodio al 50% y 7,65 g de ácido bromoacético mientras se mantuvo la temperatura por debajo de los 25ºC utilizando un baño helado. La mezcla se agitó durante 16 horas a temperatura ambiente y el producto se purificó de la forma descrita en el Ejemplo 6. El rendimiento fue de 23,4 g de producto con 1528 micromoles de carboxilo por gramo de producto como se determinó mediante valoración (Tabla 2).
La relación entre la cantidad de ácido bromoacético utilizado en la síntesis y la incorporación resultante de micromoles de grupos carboxilos en el dextrano fue estudiada mediante la aplicación del procedimiento de concentración alta de dextrano. La relación resultó ser lineal (ver Tabla 2 y Figura 3). Las masas de los reactivos y los rendimientos de carboximetilo de los Ejemplos 6 al 9 se muestran en la Tabla 2.
Síntesis de preparaciones de dextrano reducido con carboxietilo utilizando dextrano reducido T10 mediante el procedimiento de base alta de dextrano bajo.
Los Ejemplos 10-14 describen la síntesis de dextranos reducidos de carboximetilo con grados variables de sustitución comenzando con una baja concentración de dextrano reducido. En el presente procedimiento, la concentración de partida de dextrano reducido fue de 70 mg/g y el NaOH fue de al menos aproximadamente 107 mg/g. La Tabla 3 muestra que el alcance de la sustitución del carboximetilo aumentó al aumentar la cantidad de ácido bromoacético usado en la reacción.
TABLA 2 Condiciones para el alcance y grado de síntesis de CMRD de la carboximetilación del producto
3
Ejemplo 10 Dextrano CMRD reducido con carboximetilo T10 aplicando el procedimiento de base alta dextrano bajo
Se disolvió dextrano reducido T10 (15 g) en 72 ml de agua y se agregaron 72 ml de hidróxido de sodio 8M. La mezcla se llevó a 25ºC y se agregó una solución de 1,15 g de ácido bromoacético en 3 ml de agua. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora y luego se agregó a un volumen de 75 ml de hielo molido. El pH de la solución se llevó a pH 6,0 con HCl 6M. Luego de ultrafiltración reiterada con una membrana de ultrafiltrado de 3 kDa, el producto se liofilizó. El rendimiento fue de 13,25 g de producto. El sólido recuperado, dextrano reducido de carboximetilo T10 (sal de sodio) presentó un contenido de carboxilo fue de aproximadamente 110 micromoles de carboxilos por gramo como se determinó mediante valoración (Tabla 3).
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Ejemplo 11 Dextrano reducido de carboximetilo T10 aplicando el procedimiento de base alta dextrano bajo
Se disolvió dextrano reducido T10 (150 g) en 720 ml de agua y se agregaron 720 ml de hidróxido de sodio 8M. La mezcla se llevó a 25ºC y se agregó una solución de 11,5 g de ácido bromoacético en 140 ml de agua. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora, y luego se agregó a un volumen de 750 ml de hielo molido y el pH de la solución se llevó a pH 6,0 con HCl 6M. Luego de ultrafiltración reiterada sobre una membrana de ultrafiltrado MWCO de 3 kDa, el producto se liofilizó. El rendimiento fue de 126,21 g de dextrano reducido de carboximetilo T10 (sal de sodio) sólido recuperado, presentando un contenido de carboxilo fue de aproximadamente 130 micromoles de carboxilos por gramo de producto como se determinó mediante valoración (Tabla 3).
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Ejemplo 12 Dextrano CMRD reducido con carboximetilo T10 aplicando el procedimiento de base alta dextrano bajo
Se disolvió dextrano reducido T10 (150 g) en 720 ml de agua y se agregaron 720 ml de hidróxido de sodio 8M. La mezcla se llevó a 25ºC, se agregó una solución de 26,6 g de ácido bromoacético en 140 ml de agua y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora y se agregó a un volumen de 750 ml de hielo molido. El pH de la solución se llevó a pH 6,0 con HCl 6M. Luego de ultrafiltración reiterada sobre una membrana de ultrafiltrado MWCO de 3 kDa, el producto se liofilizó. El rendimiento no fue determinado. El sólido recuperado, dextrano reducido de carboximetilo T10 (sal de sodio) presentó un contenido de carboxilo fue de aproximadamente 280 micromoles de carboxilos por gramo de producto como se determinó mediante valoración (Tabla 3).
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Ejemplo 13 Dextrano CMRD reducido con carboximetilo T10 aplicando el procedimiento de base alta dextrano bajo
Se disolvió dextrano reducido T10 (15 g) en 72 ml de agua y se agregaron 72 ml de hidróxido de sodio 8M. La mezcla se llevó a 25ºC y se agregó una solución de 3,45 g de ácido bromoacético en 8 ml de agua. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora y luego se agregó a un volumen de 75 ml de hielo molido. El pH de la solución se llevó a pH 6,0 con HCl 6M. Luego de ultrafiltración reiterada sobre membranas de ultrafiltrado de 3 kDa, el producto se liofilizó. El rendimiento fue de 9,4 g de dextrano reducido de carboximetilo T10 (sal de sodio) sólido recuperado, presentando un contenido de carboxilo fue de aproximadamente 450 micromoles de carboxilos por gramo de producto como se determinó mediante valoración (Tabla 3).
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Ejemplo 14 Dextrano CMRD reducido con carboximetilo T10 aplicando el procedimiento de base alta dextrano bajo
Se disolvió dextrano reducido T10 (150 g) en 720 ml de agua y se agregaron 720 ml de hidróxido de sodio 8M. La mezcla se llevó a 25ºC y se agregó una solución de 58,8 g de ácido bromoacético en 140 ml de agua. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora y luego se agregó a un volumen de 750 ml de hielo molido. El pH de la solución se llevó a pH 6,0 con HCl 6M. Luego de ultrafiltración reiterada sobre una membrana de ultrafiltrado MWCO de 3 kDa, el producto se liofilizó. El rendimiento fue de 127,88 g de dextrano reducido de carboximetilo T10 (sal de sodio) sólido recuperado, presentando un contenido de carboxilo fue de aproximadamente 580 micromoles de carboxilos por gramo de producto como se determinó mediante valoración (Tabla 3).
La Tabla 3 muestra que el alcance de la sustitución de carboximetilo observada estuvo en función de la cantidad de ácido bromoacético usado en la reacción. Los datos muestran que, en general, el aumento de la cantidad de ácido bromoacético presente en la reacción, produce un aumento en los niveles de COOH del producto. El rendimiento de la incorporación de carboximetilo también estuvo afectado por condiciones tales como, por ejemplo, la escala de la reacción, como se indica en los Ejemplos 13 y 14.
TABLA 3 Preparación de CMRD con alcances variables de carboximetilación
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Ejemplo 15 Dextrano reducido de carboximetilo T10 de procedencia comercial
El dextrano reducido de carboximetilo fue adquirido en Amersham- Pharmacia. El sólido presentó un contenido de carboxilo fue de aproximadamente 1887 micromoles de carboxilo por gramo de producto como se determinó mediante valoración.
Los Ejemplos 16-18 describen la síntesis de dextrano de carboximetilo a partir de dextrano nativo no reducido T-10, T-40 y T-70 respectivamente.
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Ejemplo 16 Dextrano de carboximetilo T10
Se prepararon y enfriaron a 5ºC las siguientes soluciones: Solución A: 105,2 g de hidróxido de sodio en 250 ml de agua; Solución B: 58,0 g de ácido bromoacético en 142,5 ml de agua; y Solución C: 75,7 g de dextrano T10 en 187,5 ml de agua.
Se agregó hidróxido de sodio (14,4 g) disuelto en 187,5 ml de agua en la Solución C y en la Solución A manteniendo la temperatura de la solución por debajo de los 25ºC. Se agregó la Solución B, manteniendo la temperatura por debajo de los 25ºC y la solución resultante se agitó durante 2 horas a temperatura ambiente, luego se neutralizó en pH 7,5 con HCl 6M (enfriado a 5ºC) manteniendo la temperatura de la solución por debajo de los 35ºC. La mezcla se pasó a través de un filtro con tamaño de poro de 0,2 \mum y se diluyó en 2 litros. El producto se purificó mediante ultrafiltración reiterada a través de una membrana de ultrafiltrado MWCO de 3 kDa, se filtró nuevamente a través de un filtro de 0,2 \mum y se sometió a liofilización. El rendimiento fue de 53,17 g y el dextrano de carboximetilo T10 sólido recuperado (sal de sodio), presentó un contenido de carboxilo fue de aproximadamente 1220 micromoles de carboxilo por gramo de producto como se determinó mediante valoración.
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Ejemplo 17 Dextrano de carboximetilo T40
Se prepararon y enfriaron a 5ºC las siguientes soluciones: Solución A: 154 g de hidróxido de sodio en 480 ml de agua; Solución B: 77 g de ácido bromoacético en 260 ml de agua; y Solución C: 100 g de dextrano T40 en 400 ml de agua.
La Solución A se incorporó en la Solución C de una sola vez. Luego de 5 minutos, se agregó la Solución B y la solución combinada se agitó durante 120 min manteniendo la temperatura entre 20ºC y 25ºC. La mezcla se neutralizó con HCl 6M, se filtró a través de un filtro de 0,2 \mum y se diluyó en 2 litros. El producto se purificó mediante ultrafiltración reiterada a través de una membrana de ultrafiltrado MWCO de 3 kDa, se filtró nuevamente a través de un filtro de 0,2 \mum y se sometió a liofilización. El rendimiento fue de 105,1 g de dextrano de carboximetilo T40 sólido recuperado (sal de sodio), presentando un contenido de carboxilo fue de alrededor de 1390 micromoles de carboxilo por gramo de producto como se determinó mediante valoración.
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Ejemplo 18 Dextrano de carboximetilo T70
Se prepararon y enfriaron a 5ºC las siguientes soluciones: Solución A: 154 g de hidróxido de sodio en 480 ml de agua; Solución B: 77 g de ácido bromoacético en 260 ml de agua; y Solución C: 100 g de dextrano T70 en 400 ml de agua.
La Solución A se incorporó a la Solución C de una sola vez. Luego de 5 minutos, se agregó la Solución B y la solución combinada se agitó manteniendo la temperatura entre 20ºC y 25ºC utilizando un baño helado. Luego de 120 minutos, la solución se neutralizó con HCl 6M. La solución se filtró a través de un filtro de 0,2 \mum y se diluyó en 2 litros. El producto se purificó mediante ultrafiltración reiterada a través de una membrana de ultrafiltrado MWCO de 3 kDa, se filtró nuevamente a través de un filtro de 0,2 \mum y se sometió a liofilización. El rendimiento fue de 106,9 g de dextrano de carboximetilo T70 sólido recuperado (sal de sodio), presentando un contenido de carboxilo fue de alrededor de 1380 micromoles de carboxilo por gramo de producto como se determinó mediante valoración.
Procedimiento general para la preparación de coloides superparamagnéticos para comparación de las propiedades de las preparaciones de USPIO recubiertas con polisacáridos reducidos o no reducidos.
Los Ejemplos 19-26 se llevaron a cabo para comparar los productos de óxido de hierro recubiertos con polisacáridos obtenidos a partir de pares de polisacáridos nativos y reducidos de idéntico peso molecular. Se utilizaron procedimientos idénticos para la preparación de coloides de USPIO para cada par de polisacáridos nativos y reducidos de idéntico peso molecular. En particular, se utilizó el mismo polisacárido de la relación de hierro y concentración de hierro para cada par de peso molecular. La relación entre el polisacárido y el hierro y la concentración de hierro utilizadas para cada par de polisacárido nativo y reducido fue elegido para obtener un USPIO filtrable a través de 0,2 \mum con un diámetro menor a 30 nm y una susceptibilidad magnética mayor a 20.000 x 10^{-6} cgs con el polisacárido reducido.
El procedimiento general involucró la adición de hidróxido de amonio excedente a una solución de sales de hierro (Fe^{+3}/Fe^{+2}) y polisacárido, luego se calentó realizando 6 ciclos de ultrafiltración sobre agua empleando un filtro de membrana MWCO de 100 kDa. Luego de la ultrafiltración, las preparaciones de USPIO formadas con polisacárido reducido, se filtraron a través de un filtro de 0,2 \mum y se conservaron a 4ºC.
Se observó que en los óxidos de hierro preparados con un polisacárido nativo, únicamente el óxido de hierro recubierto con dextrano nativo T10 pudo filtrarse a través de un filtro de 0,2 \mum. Luego se midió el tamaño y la susceptibilidad magnética de las muestras, excepto por las muestras que contenían materiales particulados. Los tamaños de partículas se determinaron mediante la medición de dispersión liviana dinámica en un instrumento Microtrac® UPA (Honeywell IAC Microtrac, Fort Washington, PA) y se presentan como el diámetro de volumen medio (DVM). La susceptibilidad magnética se determinó con una balanza de susceptibilidad magnética de Matthey Johnson. Las concentraciones de hierro se determinaron con un ensayo bipiridilo (Kumar K., J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol., 1997, 20, 3351-3364).
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Ejemplo 19 Preparación de USPIO recubierto con dextrano T1 reducido
Se disolvió dextrano T1 reducido (1,7 g) en 20 ml de agua y se agregó una solución de 3 g de cloruro férrico hexahidratado y 1,5 g de cloruro ferroso tetrahidratado en 32 g de agua. La mezcla se purgó con nitrógeno durante 30 minutos, se dejó enfriar a 5ºC y se agregaron 12,7 g de hidróxido de amonio al 28% con agitación durante un período de 2 minutos. La mezcla se calentó a 60ºC manteniendo la temperatura durante 40 min., luego se incubó a 80ºC durante 2 h. El producto fue sometido a seis ciclos de ultrafiltración sobre agua empleando un filtro de membrana MWCO de 100 kDa. Luego de la ultrafiltración, el producto se filtró a través de un filtro de 0,2 \mum y se conservó a 4ºC. Se observaron las siguientes propiedades en el producto: el diámetro de volumen medio (determinado con el Analizador de Tamaño de Partícula Microtrac) fue de 18 nm; la susceptibilidad magnética fue de 13.323 x
10^{-6} cgs/g Fe.
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Ejemplo 20 Preparación de óxido de hierro recubierto con dextrano T1 nativo
Se preparó óxido de hierro de dextrano T1 nativo mediante el procedimiento anteriormente descrito para el dextrano reducido en el Ejemplo 19, excepto que se usó dextrano T1 nativo en lugar de dextrano T1 reducido. Se observaron las siguientes propiedades en el producto: el diámetro de volumen medio (determinado con el Analizador de Tamaño de Partícula Microtrac) fue de 2764 nm; la susceptibilidad magnética fue de 1.953 x 10^{-6} cgs/g Fe.
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Ejemplo 21 Preparación de USPIO recubierto con dextrano T5 reducido
Se disolvió dextrano T5 reducido (0,45 g) en 13 ml de agua y se agregó una solución de 0,5 g de cloruro ferroso hexahidratado y 0,25 g de cloruro ferroso tetrahidratado en 4,5 g de agua. La mezcla se purgó con nitrógeno durante 30 min, se dejó enfriar a 5ºC y se agregó 1,42 g de hidróxido de amonio al 28% con agitación durante un período de 2 min. La mezcla se calentó a 80ºC durante 2 h y se purificó de la manera descrita en el Ejemplo 19. Se observaron las siguientes características en el producto: el diámetro de volumen medio (determinado con el Analizador de Tamaño de Partícula Microtrac) fue de 16 nm; la susceptibilidad magnética fue de 33.943 x 10^{-6} cgs/g Fe.
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Ejemplo 22 Preparación de óxido de hierro recubierto con dextrano T5 nativo
El óxido de hierro de dextrano T5 nativo se preparó mediante el procedimiento anteriormente descrito para el dextrano reducido en el Ejemplo 21, excepto que se usó dextrano T5 nativo en lugar de dextrano T5 reducido. Se observaron las siguientes propiedades en el producto: El diámetro de volumen medio (determinado con el Analizador de Tamaño de Partícula Mircrotrac) fue de 1.916 nm.
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Ejemplo 23 Preparación de USPIO recubierto con dextrano reducido T10
Se disolvió dextrano reducido T10 (2,7 g) en 70 ml de agua y se agregó una solución de 2,0 g de cloruro férrico hexahidratado y 1,0 g de cloruro ferroso tetrahidratado en 27 g de agua. La mezcla se purgó con nitrógeno durante 30 min, se dejó enfriar a 5ºC y se agregaron 8,5 g de hidróxido de amonio al 28% con agitación durante un período de 2 min. La mezcla se calentó a 80ºC durante 2 h y se purificó de la manera descrita en el Ejemplo 19. Se observaron las siguientes características en el producto: el diámetro de volumen medio (determinado con el Analizador de Tamaño de Partícula Microtrac) fue de 12 nm; la susceptibilidad magnética fue de 31.743 x 10^{-6} cgs/g Fe.
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Ejemplo 24 Preparación de óxido de hierro recubierto con dextrano nativo T10
El óxido de hierro de dextrano nativo T10 se preparó mediante el procedimiento anteriormente descrito para el dextrano reducido en el Ejemplo 23, excepto que se usó dextrano nativo T10 en lugar de dextrano reducido T10. Se observaron las siguientes propiedades en el producto: el diámetro de volumen medio (determinado con el Analizador de Tamaño de Partícula Microtrac) fue de 757 nm; la susceptibilidad magnética fue de 31.252 x 10^{-6} cgs/g Fe.
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Ejemplo 25 Preparación de USPIO recubierto con pululano reducido
Se disolvió pululano reducido (0,045 g) en 0,4 ml de agua y se agregó una solución de 0,106 g de cloruro férrico hexahidratado y 0,05 g de cloruro ferroso tetrahidratado en 1,3 g de agua. La mezcla se purgó con nitrógeno durante 30 min, se dejó enfriar a 5ºC y se agregaron 0,044 g de hidróxido de amonio al 28% mediante agitación durante un período de 2 min. La mezcla se calentó a 80ºC durante 0,67 h y se purificó de la manera descrita en el Ejemplo 19. Se observaron las siguientes características en el producto: el diámetro de volumen medio (determinado con el Analizador de Tamaño de Partícula Microtrac) fue de 20 nm; la susceptibilidad magnética fue de 27.066 x 10^{-6} cgs/g Fe.
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Ejemplo 26 Preparación de óxido de hierro recubierto con pululano nativo
El óxido de hierro de pululano nativo se preparó mediante el procedimiento anteriormente descrito para el dextrano reducido en el Ejemplo 25, excepto que se usó pululano nativo en lugar de pululano reducido. Se observaron las siguientes propiedades en el producto: el diámetro de volumen medio (determinado con el Analizador de Tamaño de Partícula Mircrotrac) fue de 1.184 nm.
Propiedades de preparaciones de óxido de hierro obtenido empleando polisacáridos reducidos en oposición a nativos (comparación de datos obtenidos en los Ejemplos 19-26).
En general, para los agentes de contraste IRM, se prefiere un agente de contraste de óxido de hierro de partícula pequeña, por ejemplo, una partícula con un diámetro en el rango de 10 a 50 nm. Asimismo, se prefiere un óxido de hierro de mayor susceptibilidad magnética y de mayor homogeneidad.
A partir de los datos de los Ejemplos 19-26 se observa que la presencia de un azúcar terminal reducido de un polisacárido (polisacárido reducido) usado para recubrir un óxido de hierro, tuvo un efecto inesperado y sustancial en el diámetro de las partículas de cada uno de los coloides resultantes, en comparación con óxidos de hierro producidos de forma similar hechos con polisacárido no reducido nativo. La Tabla 4 muestra el tamaño de las partículas formadas para cada par de polisacáridos nativos y reducidos, como se indica mediante los diámetros de volumen medio (DVM). La concentración de polisacáridos reducidos y nativos se mantuvo constante dentro de cada grupo de peso molecular. Las concentraciones se seleccionaron para optimizar la síntesis de USPIO con polisacárido reducido. En todos los polisacáridos, el uso de polisacárido no reducido nativo produjo una partícula consistentemente más grande que el uso de dextrano reducido, de forma tal, que el polisacárido reducido produjo consistentemente la partícula más pequeña preferida.
Asimismo, para cada par de polisacáridos de un peso molecular dado, sintetizado y probado, la preparación de USPIO recubierto con polisacáridos reducidos demostró un valor de susceptibilidad magnética superior que la preparación de óxido de hierro correspondiente sintetizada con polisacárido nativo, salvo los coloides obtenidos con dextrano T10 para los cuales las susceptibilidades magnéticas de los recubrimientos reducidos y nativos fue equivalente.
Estos datos indican que el uso de un polisacárido reducido en la preparación de coloides de USPIO recubiertos, produce partículas preferentes de menor tamaño sin sufrir pérdida de susceptibilidad magnética. La información indica el efecto sorprendente que tiene la reducción del aldehído de un polisacárido sobre la síntesis de un USPIO recubierto con polisacárido.
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TABLA 4 Comparación de propiedades de óxidos de hierro realizada con polisacáridos nativos o reducidos en condiciones que forman un USPIO con polisacáridos reducidos
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Propiedades de óxidos de hierro preparados con dextranos T1, T5 y T10 nativos no reducidos de diámetro de volumen medio menor a 30 nm.
Los Ejemplos 27 al 29 muestran la preparación de óxidos de hierro obtenida a partir de dextranos T1, T5 y T10 nativos. Los coloides se prepararon con dextranos (nativos) no reducidos, de la forma descrita para los dextranos reducidos (Ejemplos 19, 21 y 23) excepto que la preparación de estas partículas de dextrano nativo no reducido involucró de 10 a 34 veces más dextrano que su correspondiente contraparte de dextrano reducido, para producir óxidos de hierro de tamaño correspondiente. El requerimiento del uso incrementado de dextrano se muestra mediante la comparación de dextrano con la proporción de hierro de los productos para los correspondientes pares de peso molecular de óxidos de hierro mostrados (Tabla 5).
Los datos indican que las propiedades magnéticas y la eficiencia del uso de dextrano durante la síntesis de las partículas de hierro preparadas con cada uno de los dextranos nativos T1, T5 y T10 fue inferior en relación a las propiedades correspondientes a las partículas preparadas con cada dextrano reducido de la contraparte.
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Ejemplo 27 Preparación de óxido de hierro recubierto con dextrano T1 nativo
Se filtró una mezcla de 0,42 g de cloruro férrico hexahidratado, 0,21 g de cloruro ferroso tetrahidratado y 7,27 g de agua a través de un filtro de 0,2 \mum. Se agregó una porción de 1,0 g de esta mezcla a 10 ml de una solución acuosa de 0,1 g de dextrano T1/g agua. La mezcla se purgó con nitrógeno antes de incorporar 0,22 ml de una solución de hidróxido de amonio al 28%. La mezcla se calentó a 80ºC durante 1 hora, se dejó enfriar a temperatura ambiente y se filtró a través de un filtro de 0,2 \mum. Se observaron las siguientes propiedades en el producto: el diámetro de volumen medio (determinado con el Analizador de Tamaño de Partícula Microtrac) fue de 27 nm; la susceptibilidad magnética fue de 2325 x 10^{-6} cgs/g Fe.
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Ejemplo 28 Preparación de óxido de hierro recubierto con dextrano T5 nativo
Se disolvió dextrano T5 (0,8 g) en 9 ml de agua y se agregaron 0,63 ml de una solución de 51,8 mg de cloruro férrico hexahidratado y 25,9 mg de cloruro ferroso tetrahidratado filtrada a través de un filtro de 0,2 \mum, en 9,2 ml de agua. La mezcla se purgó con nitrógeno antes de incorporar 1,4 ml de una solución de hidróxido de amonio al 28%. La mezcla se calentó a 80ºC durante 1 hora, se dejó enfriar a temperatura ambiente y se filtró a través de un filtro de 0,2 \mum. Se observaron las siguientes propiedades en el producto: el diámetro de volumen medio (determinado con el Analizador de Tamaño de Partícula Microtrac) fue de 20 nm; la susceptibilidad magnética fue de 1285 x
10^{-6} cgs/g Fe.
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Ejemplo 29 Preparación de óxido de hierro recubierto con dextrano T10 nativo
Se disolvió dextrano T10 (9420 g) en 14915 g de agua. Se filtró una porción de 14915 g de esta mezcla a través de un filtro de 0,2 \mum y se incorporó al recipiente de reacción. Se disolvió cloruro férrico hexahidratado (891 g) en 713 g de agua. Se filtró una porción de 1129 g a través de un filtro de 0,2 \mum y se incorporó al recipiente de reacción que contenía el dextrano. La mezcla se enfrió a 5ºC mediante agitación durante la noche y burbujeando nitrógeno en su interior. Antes de los 30 min finales del purgado con nitrógeno, se incorporó una porción de 580 g de una solución de 359 g de cloruro ferroso tetrahidratado filtrado en filtro de 0,2 \mum, a 477 g de agua. A esta mezcla se le agregaron 786 g de una solución de hidróxido de amonio al 28%, enfriado a 5ºC. La mezcla se calentó a 80ºC, se incubó a 80ºC durante 2 horas y luego se volcó sobre 80 litros de agua calentada a 80ºC. La mezcla se dejó entibiar durante la noche, se filtró a través de un filtro de 0,2 \mum y se purificó mediante ultrafiltración utilizando una membrana de ultrafiltración de 100 kDa. El producto se filtró a través de un filtro de 0,2 \mum. Se observaron las siguientes propiedades en el producto: el diámetro de volumen medio (determinado con el Analizador de Tamaño de Partícula Microtrac) fue de 21 nm; la susceptibilidad magnética fue de 32.712 x 10^{-6} cgs/g Fe.
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TABLA 5 Susceptibilidad magnética y propiedades del tamaño de partícula de óxidos de hierro recubiertos con polisacáridos: una comparación de dextranos nativos (Ejemplos 27-29) con los dextranos reducidos respectivos (Ejemplos 19, 21 y 23) bajo determinadas condiciones para producir partículas de DVM inferior a 30 nm con máxima susceptibilidad magnética
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Preparación de USPIO recubierto con dextrano de carboximetilo T10 nativo y dextrano de carboximetilo T10 reducido con grados variables de carboximetilación.
Los Ejemplos 30 y 31 describen la preparación de USPIO recubierto con dextrano de carboximetilo T10 nativo y reducido, respectivamente. Los ejemplos 32-36 describen la síntesis de composiciones de USPIO recubiertas con preparaciones de dextrano de carboximetilo T10 reducido conteniendo grados variables de carboximetilación. Los Ejemplos 37-41 describen la solubilidad de las preparaciones que contienen cloruro férrico y dextrano de carboximetilo T10 reducido con diferentes grados de carboximetilación.
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Ejemplo 30 Preparación de USPIO recubierto con dextrano de carboximetilo T10
Se disolvió dextrano de carboximetilo T10 (60 g preparado según el procedimiento del Ejemplo 16) en 532 g de agua. Se filtró una solución de 14,7 g de cloruro férrico hexahidratado, 7,2 g de cloruro ferroso tetrahidratado y 100 ml de agua a través de un filtro de 0,2 \mum y se incorporó. La mezcla se enfrió a 10ºC, se purgó con nitrógeno y se le agregaron 52,2 ml de una solución de hidróxido de amonio al 28% mediante agitación. La mezcla se calentó a 75ºC, se mantuvo a 75ºC durante 30 min, si diluyó con 2,5 litros de agua y se filtró a través de un filtro de 0,2 \mum. El producto se purificó mediante ultrafiltración reiterada sobre membrana MWCO de 100 kDa, se concentró a 20 mg Fe/ml y filtró nuevamente a través de un filtro de 0,2 \mum. Se observaron las siguientes propiedades en el producto: el DVM (determinado con el uso de un Analizador de Tamaño de Partícula Microtrac) fue de 19 nm; la susceptibilidad magnética fue de 27.835 x 10^{-6} cgs/g Fe; y el contenido de carboxilo fue de 1.220 micromoles por gramo de CMRD. Para determinar la estabilidad en respuesta a la esterilización por autoclave, se colocó una muestra del producto en una ampolla de vidrio de 5 ml y se calentó a 121ºC durante 30 min (ver Tabla 9).
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Ejemplo 31 Preparación de USPIO recubierto con dextrano reducido de carboximetilo
Se disolvió dextrano de carboximetilo T10 reducido (40 g preparado en el Ejemplo 5) en 1.038 ml de agua y se filtró a través de un filtro con un tamaño de poro de 0,2 \mum. Una solución filtrada en filtro de 0,2 \mum de 30 g de cloruro férrico hexahidratado y 15 g de cloruro ferroso tetrahidratado en 374 ml de agua se incorporó al dextrano mediante un lavado con agua de 31 ml. La solución se enfrió a 10ºC y se agregaron 114 g de hidróxido de amonio al 28%. La mezcla coloidal se calentó a 78ºC y se mantuvo en esa temperatura durante una hora. Luego, la solución se diluyó hasta 3 litros con agua, se enfrió a 10ºC y se ultrafiltró 6 veces con una membrana de filtro YM-100 (MWCO de 100 kDa). Se obtuvo una concentración final de 21,1 mg Fe/g. Se observaron las siguientes propiedades en el producto: el diámetro de volumen medio (Analizador de Tamaño de Partícula Microtrac) fue de 21 nm; la susceptibilidad magnética fue de 32.732 x 10^{-6} cgs/g Fe; y el contenido de carboxilo fue de 1.265 micromoles por gramo de CMRD. Se determinó que el contenido de la partícula era de alrededor de 50% Fe y 50% dextrano. Para determinar la estabilidad en respuesta a la esterilización por autoclave, se colocó una muestra del producto en una ampolla de vidrio de 5 ml y se calentó a 121ºC durante 30 min (ver Tabla 9).
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Ejemplo 32 Preparación de USPIO recubierto con dextrano de carboximetilo T10 reducido conteniendo 110 micromoles de carboxilo por gramo
Se disolvió dextrano de carboximetilo T10 reducido (4 g, preparado en el Ejemplo 10) en 85 ml de agua. A esto, se le agregó una mezcla filtrada con un filtro de 0,2 \mum de 2,99 g de cloruro férrico hexahidratado, 1,49 g de cloruro ferroso tetrahidratado y 37,3 ml de agua. La mezcla se enfrió a 10ºC, se purgó con nitrógeno y se le incorporaron 11,4 g de una solución de hidróxido de amonio al 28% con agitación. La mezcla se calentó a 90ºC, se mantuvo a 78ºC durante 60 minutos y luego se mantuvo a 78ºC mientras se burbujeó aire en su interior. La mezcla se diluyó en 1,5 litros de agua y se filtró a través de un filtro de 0,2 \mum. El producto se purificó mediante ultrafiltración reiterada a través de una membrana MWCO de 100 kDa y se filtró nuevamente a través de un filtro de 0,2 \mum.
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Ejemplo 33 Preparación de USPIO recubierto con dextrano de carboximetilo T10 reducido conteniendo 130 micromoles de carboxilo por gramo
Se disolvió dextrano de carboximetilo T10 reducido (40 g, preparado en el Ejemplo 11) en 850 ml de agua. A esto, se le agregó una mezcla filtrada con un filtro de 0,2 \mum de 29,9 g de cloruro férrico hexahidratado, 14,9 g de cloruro ferroso tetrahidratado y 373 ml de agua. La mezcla se enfrió a 10ºC, se purgó con nitrógeno y se le incorporaron 114 ml de una solución de hidróxido de amonio al 28% con agitación. La mezcla se calentó a 90ºC, se mantuvo a 78ºC durante 60 min y luego se mantuvo a 78ºC mientras se burbujeó aire en su interior. La mezcla se diluyó en 1,5 litros de agua y se filtró a través de un filtro de 0,2 \mum. El producto se purificó mediante ultrafiltración reiterada a través de una membrana MWCO de 100 kDa, se concentró a 20 mg Fe/ml y se filtró nuevamente a través de un filtro de 0,2 \mum.
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Ejemplo 34 Preparación de USPIO recubierto con dextrano de carboximetilo T10 reducido conteniendo 280 micromoles de carboxilo por gramo
Se disolvió dextrano de carboximetilo T10 reducido (4 g, preparado en el Ejemplo 12) en 85 ml de agua. A esto, se le agregó una mezcla filtrada con un filtro de 0,2 \mum de 2,99 g de cloruro férrico hexahidratado, 1,49 g de cloruro ferroso tetrahidratado y 37,3 ml de agua. La mezcla se enfrió a 10ºC y se purgó con nitrógeno. A la mezcla se le incorporaron, con agitación, 11,4 g de una solución de hidróxido de amonio al 28%. La mezcla se calentó a 90ºC y se mantuvo a 78ºC durante 60 min, y luego se mantuvo a 78ºC mientras se burbujeaba aire a través de la mezcla. La mezcla se diluyó en 1,5 litros de agua y se filtró a través de un filtro de 0,2 \mum. El producto se purificó mediante ultrafiltración reiterada a través de una membrana MWCO de 100 kDa y se volvió a filtrar con un filtro de 0,2 \mum.
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Ejemplo 35 Preparación de USPIO recubierto con dextrano de carboximetilo T10 reducido conteniendo 450 micromoles de carboxilo por gramo
Se disolvió dextrano de carboximetilo T10 reducido (4 g, preparado en el Ejemplo 13) en 85 ml de agua. A esto, se le agregó una mezcla filtrada con un filtro de 0,2 \mum formada por 2,99 g de cloruro férrico hexahidratado, 1,49 g de cloruro ferroso tetrahidratado y 37,3 ml de agua. La mezcla se enfrió a 10ºC, se purgó con nitrógeno y se le agregaron 11,4 g de una solución de hidróxido de amonio al 28% con agitación. La mezcla se calentó a 90ºC, se mantuvo a 78ºC durante 60 min y luego se mantuvo a 78ºC mientras se burbujeaba aire a través de la mezcla. La mezcla se diluyó con 1,5 litros de agua, se filtró sobre filtro de 0,2 \mum y se purificó mediante ultrafiltración reiterada sobre una membrana MWCO de 100 kDa y se volvió a filtrar con un filtro de 0,2 \mum.
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Ejemplo 36 Preparación de USPIO recubierto con dextrano de carboximetilo T10 reducido conteniendo 580 micromoles de carboxilo por gramo
Se disolvió dextrano de carboximetilo T10 reducido (40 g, preparado en el Ejemplo 14) en 85 ml de agua. A esto se le agregó una solución filtrada con un filtro de 0,2 \mum compuesta por 29,9 g de cloruro férrico hexahidratado, 14,9 g de cloruro ferroso tetrahidratado y 373 ml de agua. La mezcla se enfrió a 10ºC, se purgó con nitrógeno y se le agregaron 11,4 g de una solución de hidróxido de amonio al 28% con agitación. La mezcla se calentó a 90ºC, se mantuvo a 78ºC durante 60 min y luego se mantuvo a 78ºC mientras se burbujeaba aire a través de la mezcla. La mezcla se diluyó con 1,5 litros de agua, se filtró sobre filtro de 0,2 \mum y se purificó mediante ultrafiltración reiterada sobre membrana MWCO de 100 kDa y se volvió a filtrar con un filtro de 0,2 \mum.
Se comparó el efecto del grado de carboximetilación de USPIO recubierto con CMRD sobre el tamaño de coloide. Ejemplos 31-36, Tabla 6. Los valores de DVM de los coloides resultantes fueron razonablemente uniformes entre las preparaciones de CMRD compuestas por 110 a 1265 micromoles de carboxilo por gramo de producto.
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Ejemplo 37 Mezcla de dextrano de carboximetilo T10 reducido conteniendo 1.108 micromoles de carboxilo por gramo con solución de cloruro férrico
Como un paso en la síntesis de partículas, se disolvió cloruro férrico (0,3 g) en 15 ml de agua y se filtró a través de un filtro con un tamaño de poro de 0,2 \mum. Se incorporó dextrano reducido de carboximetilo (preparado en el Ejemplo 6), la mezcla se agitó y enfrió a 10ºC. No se observó precipitado.
TABLA 6 Tamaños de partículas de coloides de USPIO preparados conteniendo dextrano T10 CMRD con grados variables de carboximetilación
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Ejemplo 38 Mezcla de dextrano de carboximetilo T10 reducido conteniendo 1.262 micromoles de carboxilo por gramo con solución de cloruro férrico
Se disolvió cloruro férrico (0,3 g) en 15 ml de agua y se filtró a través de un filtro con un tamaño de poro de 0,2 \mum. Se incorporó dextrano reducido de carboximetilo (preparado en el Ejemplo 7), la mezcla se agitó y enfrió a 10ºC. No se observó precipitado.
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Ejemplo 39 Mezcla de dextrano de carboximetilo T10 reducido conteniendo 1.404 micromoles de carboxilo por gramo con solución de cloruro férrico
Se disolvió cloruro férrico (0,3 g) en 15 ml de agua y se filtró a través de un filtro con un tamaño de poro de 0,2 \mum. Se incorporó dextrano reducido de carboximetilo (preparado en el Ejemplo 8), la mezcla se agitó y enfrió a 10ºC. No se observó precipitado.
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Ejemplo 40 Mezcla de dextrano de carboximetilo T10 reducido conteniendo 1.528 micromoles de carboxilo por gramo con solución de cloruro férrico
Se disolvió cloruro férrico (0,3 g) en 15 ml de agua y se filtró a través de un filtro con un tamaño de poro de 0,2 \mum. Se incorporó dextrano reducido de carboximetilo (preparado en el Ejemplo 9), la mezcla se agitó y enfrió a 5ºC. Se observó un precipitado blanco anaranjado.
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Ejemplo 41 Mezcla de dextrano de carboximetilo T10 reducido conteniendo 1.887 micromoles de carboxilo por gramo con cloruro férrico
Se disolvió cloruro férrico hexahidratado (30,3 g) y cloruro ferroso (14,8 g) en 402,9 ml de agua y se filtró a través de un filtro con tamaño de poro de 0,2 \mum. Se incorporó dextrano de carboximetilo T10 reducido (40,3 g en 1.033 ml, preparado en el Ejemplo 15), la mezcla se agitó y enfrió a 5ºC. Se observó un precipitado blanco anaranjado.
Se analizó el efecto de los grados variables de carboximetilación de CMRD sobre el primer paso de las síntesis de USPIO-CMRD, es decir, combinando las mezclas acuosas de CMRD con las soluciones de cloruro de hierro. Se mezclaron las distintas preparaciones de CMRD con sales de hierro con una concentración de hierro fija, difiriendo las preparaciones de CMRD únicamente en el grado de carboximetilación, como se describe en los Ejemplos 37-41. De 1.108 hasta 1.404 micromoles de carboxilo por gramo de dextrano, el CMRD formó una mezcla homogénea en presencia de cloruro férrico (Tabla 7).
TABLA 7 Precipitación de CMRD con niveles variables de grupos carboxilos luego de la incorporación de sales de hierro de las mezclas de CMRD (25 mg/g de solución) y cloruro férrico (19 mg/g de solución)
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Por encima de los 1.404 micromoles de carboxilo por gramo de dextrano, la incorporación de cloruro férrico, en iguales condiciones y grado de concentración que la síntesis de USPIO, a la solución CMRD produjo un precipitado blanco anaranjado. Incluso a temperaturas superiores, cuando muchos compuestos pueden ser solubles, los precipitados persistieron. Los datos de la Tabla 7 indican que hay un nivel superior en la modificación de CMRD que puede ser usado en el procedimiento preferido de la síntesis de USPIO-CMRD.
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Ejemplo 42 Síntesis de soles de óxido de hierro y su estabilización con dextranos nativos y reducidos y CMRD: preparación de un sol magnético
Para preparar un sol magnético, se agregaron 60 g de hidróxido de amonio al 28% a 25ºC a una solución compuesta por 30,0 g de cloruro férrico hexahidratado y 15,1 g de cloruro ferroso tetrahidratado en 321 g de agua. Después de mezclar 5 minutos, se agregó HCl concentrado suficiente para obtener un pH de 1,6. El sol se ultrafiltró con un filtro de membrana MWCO de 100 kDa para obtener un pH de 3,25 utilizando agua como diluyente. El sol magnético se pasó a través de un filtro con tamaño de poro de 0,2 \mum, luego se concentró a 50 mg Fe/g y se conservó a 5ºC. El rendimiento de hierro fue de 55% y se observó que el producto tenía un DVM de 16 nm.
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Ejemplo 43 Síntesis de soles de óxido de hierro y su estabilización con dextranos nativos y reducidos y CMRD: preparación de un sol no magnético
Se agregaron 10 ml de NaOH 10M a una solución de 2,9 g de cloruro férrico hexahidratado en 30 ml de agua. La mezcla se agitó durante 5 min, se diluyó hasta 200 ml con agua y el producto se recuperó mediante filtración. El residuo se mezcló nuevamente con agua y se filtró. El residuo se incorporó a 40 ml de agua y el pH se ajustó a 2,0. Se observó que el producto tenía un DVM de 10 nm.
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Ejemplo 44 Síntesis de soles de óxido de hierro y su estabilización con dextranos nativos y reducidos y CMRD: recubrimiento de un sol magnético con dextrano reducido T10
Se disolvió dextrano reducido T10 (60 mg; Ejemplo 3) en 1,74 ml de agua y se combinó con 0,24 ml de sol magnético (13 mg Fe) preparado de acuerdo con el Ejemplo 42. La mezcla se incubó durante 15 min y el pH se ajustó a 7,4 con hidróxido de sodio. Se determinó el tamaño de partícula (DVM) de 85 nm.
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Ejemplo 45 Síntesis de soles de óxido de hierro y su estabilización con dextranos nativos y reducidos y CMRD: recubrimiento de un sol magnético con dextrano nativo T10
Se disolvió dextrano nativo T10 (60,8 mg) en 1,74 ml de agua y se combinó con 0,24 ml de sol magnético (13 mg Fe) preparado de acuerdo con el Ejemplo 42. La mezcla se incubó durante 15 min y el pH se ajustó a 7,4 con hidróxido de sodio. Se determinó el tamaño de partícula (DVM) en 1.973 nm.
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Ejemplo 46 Síntesis de soles de óxido de hierro y su estabilización con dextranos nativos y reducidos y CMRD: recubrimiento de un sol magnético con CMRD T10
Se agregaron 75 mg de CMRD T10 (Ejemplo 5) disuelto en 1,34 ml de agua a 0,66 ml de sol magnético (33 mg Fe) preparado de acuerdo con el Ejemplo 42. La mezcla se incubó durante 15 min a 37ºC y el pH se ajustó a 7,95 (más/menos 0,4) con hidróxido de sodio. La mezcla se concentró usando un filtro de ultrafiltración de 300 kDa. Se observó que el producto tenía un DVM de 41 nm.
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Ejemplo 47 Síntesis de soles de óxido de hierro y su estabilización con dextranos nativos y reducidos y CMRD: Ajuste del pH del sol magnético a 7,4
El pH de un sol magnético preparado en el Ejemplo 42 se ajustó a 7,4. Se observó un precipitado.
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Ejemplo 48 Síntesis de soles de óxido de hierro y su estabilización con dextranos nativos y reducidos y CMRD: recubrimiento de un sol no magnético con CMRD T10
Un sol no magnético preparado de acuerdo con el Ejemplo 43 (35 ml) se agregó por goteo a 35 ml de una solución acuosa 50 mg/g de CMRD T10 preparada de acuerdo con el Ejemplo 5. El pH se ajustó a 7,0 con NaOH 1N, la solución se calentó hasta ebullición, se llevó a temperatura ambiente y se centrifugó a 6.000 rpm durante 20 min. El sobrenadante se pasó a través de un filtro con un tamaño de poro de 0,2 \mum y se esterilizó mediante autoclave a 121ºC durante 30 min. Se observó que el producto tenía un DVM de 86 nm.
Los Ejemplos 42-48 muestran que frente a la ausencia de dextrano o en presencia de un dextrano nativo, se forma un precipitado de hierro bruto. Únicamente el dextrano reducido y CMRD produjeron un sol magnético como un coloide estable.
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Ejemplo 49 Preparación de coloide de óxido de hierro no magnético recubierto con CMRD empleando una precipitación base conjunta de cloruro férrico y CMRD
Se disolvió dextrano de carboximetilo T10 reducido (19,2 g) (Ejemplo 5) en 300 g de agua, se filtró a través de un filtro de 0,2 \mum y se incorporaron 160,8 g adicionales de agua. Esta solución se agregó a 120 ml de cloruro férrico hexahidratado 0,3M acuoso filtrado con un filtro de 0,2 \mum. A esta mezcla se agregaron 32 ml de hidróxido de sodio 6N acuoso. La mezcla se calentó a 100ºC durante 3 horas, se enfrió a temperatura ambiente y se ultrafiltró hasta un volumen final de 50 ml. Se observó que el producto tenía un DVM de 30 nm. Se colocó una porción de este material en una botella bajo nitrógeno durante 30 min a 121ºC. El producto esterilizado por autoclave presentó un DVM de 69 nm.
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Ejemplo 50 Efecto del autoclave sobre coloides de dextrano nativo y reducido: estabilidad para esterilización por autoclave de USPIO recubierto con dextrano nativo y dextrano reducido y CMRD
Las preparaciones de coloide, cada una con una concentración de 20 mg Fe/g, se esterilizaron por autoclave durante 30 min a 121ºC. Luego del autoclave, se realizaron mediciones del dextrano combinado, calculado como la diferencia entre el dextrano total y el dextrano libre, empleando un ensayo de ácido fenol/sulfúrico. El dextrano libre se separó del coloide mediante ultrafiltración. La Tabla 8 muestra que las preparaciones de coloide con USPIO cubiertos con un dextrano reducido poseen mayor estabilidad que los USPIO cubiertos con dextrano nativo. El USPIO recubierto con dextrano reducido mantuvo su tamaño pequeño luego del autoclave y el DVM del material luego del autoclave aumentó únicamente 1,3 veces en relación a el DVM del material antes de la esterilización por autoclave. En oposición, el USPIO recubierto con dextrano nativo aumentó su tamaño 28 veces luego del autoclave. Los datos muestran que luego del autoclave, el dextrano reducido permanece más firmemente unido a la partícula de hierro que el
dextrano nativo.
Un segundo tipo de aumento de estabilidad logrado en la presente invención mediante el uso de dextrano reducido para recubrir USPIO es la propiedad del pH del disolvente a granel. El pH de USPIO recubierto con dextrano reducido cayó 0,9 unidades de pH luego de la esterilización por autoclave mientras que el USPIO recubierto con dextrano nativo cayó 1,6 unidades de pH.
Incluso, se observó una mayor estabilidad en el proceso de esterilización por autoclave en las partículas recubiertas con dextrano reducido de carboximetilo en relación al dextrano de carboximetilo nativo. La información de la Tabla 9 indica que el USPIO cubierto con dextrano de carboximetilo nativo no reducido mostró un aumento de 10-50 veces en la cantidad de materia particulada luego del autoclave. En contraste, el USPIO recubierto con dextrano reducido de carboximetilo no presentó cambios en el tamaño o en la cantidad de materia particulada al ser sometido al autoclave. Otra indicación del efecto de estabilización que confieren los recubrimientos polisacáridos reducidos con carboximetilo sobre la suspensión coloide y el disolvente a granel fue la estabilidad del pH del disolvente. La información de las Tablas 8 y 9 muestra que las partículas recubiertas con dextrano reducido tienen una estabilidad de pH significativamente mayor en el autoclave en relación a las que están recubiertas con dextrano nativo.
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Ejemplo 51 Procedimientos para determinar las propiedades de relajación de diversos agentes de contraste
Las mediciones magnéticas nucleares (MN) (0,47 T) se obtuvieron con un analizador de muestras NM de mesa pc 120 Bruker Instruments operando a 20 MHZ (Protón). Se colocó medio milímetro de cada muestra en los tubos NM de 10 mm para mediciones de relajación en el minispec. Se optimizó la colocación de las muestras en la cámara de muestras. Se corrieron los estándares y se anotaron sus valores en el registro.
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TABLA 8 Efecto del autoclave en el pH, tamaño y combinación de polisacáridos de los coloides recubiertos con dextrano nativo y reducido
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TABLA 9 Efecto del autoclave en el pH, tamaño y particulado de coloides recubiertos con dextrano no reducido nativo carboximetilado y reducido carboximetilado
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Se utilizaron procedimientos estándares para las determinaciones T1 y T2 y se registraron los valores. El T1 se midió con una técnica de recuperación por inversión (RI). De acuerdo con la técnica de RI, la muestra es expuesta a un pulso de 180º y luego a un pulso de 90º para colocar la magnetización en el plano de detección. Luego del muestreo, el tiempo entre los pulsos de 180 y 90 grados es modificado y muestreado una vez más. Esto se realiza para varias duraciones. Las señales resultantes se rigen por la ecuación [M_{\infty}-M(t)]/M_{\infty} = (1-cos\Theta) exp (-t/T1). Cuando se realiza un ajuste de información de 3 parámetros, se calcula M_{\infty}, \Theta y T1. El T2 se midió mediante una técnica de CPMG, mediante la cual se otorga a la muestra un tren lineal de pulsos de 180º de longitud variable. Se midió la amplitud de cada segundo eco. Se realizó un ajuste en la información recabada mediante un ajuste de dos parámetros (M_{0} y T2). Cuando M(t) = M_{0}exp(-t/T2), la gráfica de In (M(t)) versus t es lineal con una pendiente de -1/T2. Se graficó la inversa de T1 y T2 con respecto a la concentración de hierro de la muestra. Se determinó la relajación a partir de la pendiente de la línea con mejor ajuste.
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TABLA 10 Relajación
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Ejemplo 52 Estudios de toxicidad en ratas. Toxicidad de dextrano reducido, dextrano no reducido y coloides recubiertos con CMRD en ratas
Las ratas y una fracción pequeña pero significativa de población humana, pueden mostrar una reacción de tipo choque anafiláctico frente al dextrano (Squire, J.R et al., "Dextran, Its Properties and Use in Medicine", Charles C. Thomas, Springfield, IL, 1955). La reacción se parece a un choque anafiláctico pero no requiere sensibilización previa y en las ratas se caracteriza por el rápido desarrollo de postración, vasodilatación periférica difusa y edema de patas, hocico y lengua (Voorhees, A.B. et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1951, 76:254). Cuando es acompañada de anestesia barbitúrica, produce marcada hipotensión y cianosis (Hanna, C.H. et al., Am, J. Physiol. 1957, 191:615).
Se utilizó un procedimiento para medir el alcance de la respuesta del edema de patas en ratas para determinar si la presencia de dextranos reducidos o sus derivados, a diferencia de los dextranos nativos no reducidos, presentes en el recubrimiento de coloides de óxido de hierro podían disminuir o eliminar las potenciales reacciones humanas adversas frente a la inyección intravenosa. Se midió el edema de patas en ratas como el volumen de la pata antes y luego de la inyección del material de prueba, usando un pletismómetro, un dispositivo de medición de volumen diferencial. Se inyectó la dosis del material de prueba y se realizó una segunda lectura luego del intervalo designado y se calculó el porcentaje de cambio en el volumen de patas. La dosis administrada en estos estudios fue de 100 mg Fe/kg de peso corporal, una dosis mucho mayor a la usada como agente de imagen en ratas, cerdos y humanos (ver
Ejemplos 53-56).
Los resultados observados luego de la administración de óxidos de hierro cubiertos con cada uno de los dextranos T10 reducidos y no reducidos, se muestran en la Tabla 11. Se observó una marcada disminución en la respuesta anafiláctica edematosa en aquellas ratas en que se administró una preparación de USPIO con recubrimiento de dextranos reducidos o derivados de dextranos reducidos, en oposición a las ratas en las que se administró una preparación de USPIO con recubrimiento de dextrano nativo no reducidos.
TABLA 11 Efecto de las partículas recubiertas con polisacárido reducido y nativo sobre el edema de ratas
14
La Tabla 12 muestra el efecto de las preparaciones de USPIO-CMRD con niveles mejorados de sustitución de carboximetilo sobre el alcance de la respuesta anafiláctica, medido como edema porcentual. La información indica que el nivel de umbral de sustitución fue necesario para reducir la respuesta edematosa y que, una vez que este umbral de sustitución es alcanzado, la disminución en la respuesta de las ratas al dextrano supuso una eliminación sorprendente de la respuesta edematosa. Esto es, no se observó ningún edema a 1.265 micromoles de carboxilo por gramo.
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Ejemplo 53 Estudios de toxicidad en ratas de dextranos reducidos y no reducidos
Se aplicó el procedimiento usado en el Ejemplo 52 para determinar si el recubrimiento por si solo, esto es, dextranos reducidos o sus derivados y no los dextranos nativos no reducidos, podía eliminar las potenciales reacciones humanas adversas al ser inyectado por vía intravenosa. Se midió el edema de patas en ratas como el volumen de las patas antes y después de la inyección, como en el Ejemplo 52. La dosis administrada en estos estudios fue, como se indicó anteriormente, 100 mg de sustancia de prueba/kg de peso corporal.
TABLA 12 Alcance del edema de patas en ratas como una función de la cantidad de carboximetilación del recubrimiento de dextrano de USPIO
15
Los resultados observados luego de la administración de dextrano reducido T10 y no reducido fueron similares para cada material (Tabla 13). El dextrano reducido T10 suscitó el mismo alcance de edema que el dextrano nativo T10. La eliminación o disminución del edema no puede ser meramente atribuida a la reducción de dextrano.
TABLA 13 El efecto de polisacáridos de 10 kDa nativos y reducidos en el edema de rata que indican una mera reducción no tiene un efecto significativo
16
La Tabla 14 muestra el efecto de los niveles mayores de sustitución de carboximetilo de dextrano reducido sobre el alcance de la respuesta anafilactoide medida como edema porcentual. La información indica que por encima del nivel de umbral de sustitución de carboximetilo, el edema disminuye o se elimina. En el caso de los dextranos que están por encima de este nivel de umbral de sustitución, la disminución en la respuesta tóxica de las ratas al dextrano fue una eliminación sorprendente de respuesta, esto es, no se observó edema.
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TABLA 14 Relación entre el edema de patas de rata y el grado de carboximetilación de preparaciones de dextrano T10
17
Ejemplo 54 Farmacocinética de USPIO recubierto con CMRD en la rata: depuración de la sangre
Se anestesiaron tres ratas macho CD® (Charles River Laboratories, Wilmington, MA: rango de peso de 272 a 290 g) via intraperitoneal con una anestesia de largo efecto, Inactin (100 mg por kg de peso corporal). La vena y arteria femoral se expusieron mediante una pequeña incisión en la articulación del fémur de cadera y se introdujo una cánula en la arteria con un tubo PE50 conectado a una jeringa de 1 ml con solución salina heparinizada (10 unidades por ml). Para servir como una línea base, se recolectó 0,25 ml de sangre arterial a la hora cero y se inyectó USPIO cubierto con CMRD (Ejemplo 31) en la arteria femoral. Se tomaron muestras de sangre de 0,25 ml en los tiempos indicados en las Figuras 4 y 5.
Se midieron los tiempos de relajación magnética T2 en cada muestra y se calculó la relajación (1/T2). La cinética de reacción de primer orden se utilizaron para determinar la semivida de la muestra en la sangre (t_{1/2}). La ecuación usada para fijar la información fue:
1/T2 - 1/T_{l\text{í}nea \ base} = A \ e^{-kt}
donde 1/T2 es la relajación de la sangre en el momento t posterior a la inyección; 1/T_{l\text{í}nea \ base} es la relajación de la línea base y A e^{-kt} representa la disminución de primer orden del material de prueba de la sangre. Considerando el logaritmo natural de cada lado de esta ecuación, produce:
In \ (1/T2 - 1/T_{l\text{í}nea \ base}) = -kt + InA_{0}
\newpage
De acuerdo con esta segunda ecuación, la gráfica de In (1/T2-1/T_{l\text{í}nea \ base}) versus tiempo, t, da una línea recta con una pendiente -k (constante de tasa de primer orden) e intercepta InA_{0} (que es igual a In (1/T2-1/T_{l\text{í}nea \ base} en el momento cero) si la tasa de eliminación de USPIO de la sangre sigue a la cinética de primer orden. La Figura 5 muestra que se obtuvo una línea recta. La semivida (t_{1/2}) que es el período de tiempo en que la cantidad de USPIO cubierto con CMRD disminuyó a la mitad de su cantidad de concentración en la sangre, se determinó en 67 min, con un rango de 61 a 75 min con un nivel de confianza del 95%.
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Ejemplo 55 Imagen por resonancia magnética utilizando USPIO recubierto con CMRD en la rata
Un escaneo IRM de una rata realizado poco después de la administración de 5 mg de USPIO cubierto con CMRD (Ejemplo 31) por kg de peso corporal se muestra en la Figura 6B. Se determinó que el corazón, la aorta y la arteria coronaria eran fácilmente reproducidas utilizando este agente. Se incluye una imagen de la rata, tomada antes de la administración del agente (Figura 6A) para ilustrar el aumento sustancial del contraste producido por la administración de la sustancia de prueba.
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Ejemplo 56 IRM de USPIO recubierto con CMRD en el cerdo
La Figura 7 ilustra una visualización mejorada de IRM del corazón y arterias circundantes, así como también de los pulmones y riñones del cerdo. Se administró cada una de las cuatro dosis de 0,4, 0,8, 1,6 y 2,2 mg de hierro/kg de peso corporal de muestra (Ejemplo 31) a un cerdo en orden secuencial. Cada dosis fue seguida por la administración de 20 ml de solución salina fisiológica y luego de cada dosis se obtuvo una imagen IRM. La imagen mostrada en la Figura 7B es representativa de las imágenes obtenidas luego de cada administración. Se incluye una imagen previa del cerdo (Fig. 7A) para ilustrar el aumento sustancial en el contraste provocado por el agente.
Un problema asociado con los agentes de contaste a base de gadolinio de bajo peso molecular es que se filtran del espacio vascular hacia el espacio intersticial creando un fondo borroso. Este fondo borroso interfiere con el uso efectivo de la segunda y tercera inyección de agente de contraste administrado durante un único examen. Esta pérdida extravascular, no tiene lugar con el uso de USPIO recubierto con dextrano reducido de carboximetilo debido al tamaño relativamente grande de la partícula en comparación con el tamaño de partículas del agente de contraste de gadolinio.
Esta expectativa se confirmó mediante la toma de imágenes en ratas (Ejemplo 55) y los datos obtenidos por las imágenes del cerdo (Figura 7B). No se observó ningún fondo borroso luego del uso de composiciones de USPIO-CMRD de la presente invención. Esta observación permitió la realización de pruebas de imágenes vasculares adicionales luego de la administración secuencial de dosis adicionales. Al administrarse por vía intravenosa, el USPIO recubierto con CMRD, el cual constituye una realización de la invención, se movió rápidamente como un bolo en las arterias, órganos y venas y obtuvo una distribución uniforme en la sangre luego de 20 minutos. Al administrarse un segundo bolo del agente, se obtuvieron buenas imágenes adicionales. Se administraron una tercera y cuarta inyección con resultados similares, esto es, se obtuvieron buenas imágenes. Por lo tanto, se demostró el proceso de inyección de un bolo y la aplicación de primer paso de USPIO recubierto con CMRD. Asimismo, también se demostró la aplicación de un protocolo de inyección múltiple dentro de un período de tiempo razonable después de la primera administración, cumpliendo la totalidad del protocolo en un período de tiempo equivalente a la visita de un ser humano a las instalaciones de imagenología.
Las ventajas principales de la posibilidad de realizar inyecciones múltiples de bolos en un único estudio, son las oportunidades de corregir deficiencias en la toma de imágenes que puedan surgir luego de la inyección y de capturar imágenes de múltiples partes del cuerpo durante un único examen. De esta manera, se pueden tomar imágenes de sitios adicionales del cuerpo humano dentro de un período corto de tiempo después del escaneo y del análisis de imágenes anteriores y se pueden utilizar inyecciones posteriores de agente de contraste para obtener distintas vistas o para extender la vista en una o más dimensiones físicas. Por ejemplo, se puede realizar un análisis detallado de la ubicación y el tamaño de un coágulo ubicado en un miembro como la pierna, utilizando una serie de vistas tomadas en el primer y segundo paso así como en los pasos posteriores.
La capacidad de lograr pasos múltiples adicionales de administración de una composición de la invención y obtener rondas adicionales de información de IRM mas allá de una primera dosis, presenta importantes ventajas de las composiciones que constituyen realizaciones de la presente invención. En el pasado, los análisis de IRM han estado limitados por la duración física de la función anatómica que requería la toma de imagen y por los números de estructuras que pueden ser captadas utilizando una unidad de instrumento de detección en un determinado período de tiempo.
Los resultados obtenidos en los cerdos, fueron observados también en seres humanos (Ejemplos 57 y 58).
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Ejemplo 57 Inyección intravenosa de USPIO cubierto con CMRD en seres humanos normales
El diseño de prueba empleó treinta y cinco seres humanos, a cada uno de los cuales se le administró una dosis de USPIO recubierto con CMRD T10 preparado conforme al Ejemplo 31 (i.v.; 1-4 mg de hierro/kg de peso corporal). Los objetivos de los Ejemplos 57 y 58 fueron examinar humanos ante cualquier efecto secundario potencial del tratamiento, para obtener información sobre la composición como un agente de contraste para IRM y determinar la semivida de la composición en la sangre.
No se observó ninguna reacción adversa atribuible a la administración de la composición con ninguna dosis entre los humanos tratados, incluyendo la dosis más alta (4 mg/kg).
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Ejemplo 58 Cinética de imagen rápida y biodistribución en seres humanos
Una inyección de bolo vía intravenosa inicial en seres humanos de USPIO recubierto con CMRD, preparada conforme al Ejemplo 31, produjo una IRM brillante de la porción arterial del sistema circulatorio dentro de los 12 segundos posteriores a la administración (Figura 8B). En los 15 segundos siguientes, las exposiciones de IRM produjeron imágenes brillantes de órganos y venas. Se logró el equilibrio del agente a través del sistema vascular en menos de 20 minutos.
Los órganos capaces de ser capturados mediante imagen en la primera fase luego de la administración de USPIO cubierto con CMRD de la presente invención incluye el corazón, las arterias y venas. Asimismo, además de los grandes elementos del sistema circulatorio, se puedo observar arteriolas y vénulas de las extremidades (dedos de manos y pies). Este nivel de resolución permite aplicaciones a diagnósticos de problemas circulatorios en las extremidades, incluyendo la detección y localización de un área de flebitis. Otros órganos que pueden ser fácilmente reproducibles incluyen el cerebro, riñones, hígado, bazo y médula ósea. Los ganglios linfáticos pudieron ser reproducidos hasta varias horas más tarde de la administración de una dosis efectiva. Se observó que la semivida del agente en la sangre fue de alrededor de 10-14 horas (ver Tabla 15 y Figura 9).
Finalmente las partículas se eliminaron de la circulación mediante la absorción por el sistema reticuloendotelial. Durante la presencia de la composición en la fase temprana en el sistema vascular y también en la fase vascular tardía y posterior en el sistema reticuloendotelial (RES), no se observó que esta composición entrara en los espacios intersticiales entre las células. Por lo tanto, un fondo confuso, recurrente en el uso de otras composiciones, por ejemplo, agentes de contraste MR a base de gadolinio tal como Magnevist® y DOTOREM®, es evitable mediante el uso de composiciones de USPIO-CMRD, de la manera que se sintetizó de acuerdo con los procedimientos de los Ejemplos aquí descritos.
TABLA 15 Semivida promedio de USPIO-CMRD en seres humanos como una función de dosis
18

Claims (9)

1. Un complejo de óxido de hierro polisacárido reducido derivado esterilizable en autoclave concebido para su administración a un sujeto mamífero, caracterizado porque puede obtenerse:
haciendo reaccionar un polisacárido con una sal de borohidruro o hidrógeno en presencia de un catalizador de hidrogenación para producir un polisacárido reducido;
derivando el polisacárido reducido;
el polisacárido reducido derivado estando producido a una temperatura inferior a 50ºC; formando un complejo con el polisacárido reducido derivado y una sal de hierro para producir un complejo de óxido de hierro polisacárido reducido derivado; comprendiendo el complejo la adición de una mezcla de sales férricas y ferrosas, el enfriamiento de la solución resultante y la incorporación de hidróxido de amonio para neutralizar la solución;
y
esterilizando el complejo mediante autoclave;
siendo dicho complejo estable a una temperatura de al menos 100ºC.
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2. Un complejo de acuerdo con la reivindicación 1 de forma que es estable a una temperatura de al menos 121ºC durante un período efectivo para esterilizar el complejo.
3. Un complejo de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2 en el que el complejo es superparamagnético.
4. Un complejo de acuerdo con la reivindicación 1 en el que la derivación comprende la carboalquilación de un polisacárido reducido.
5. Un complejo de acuerdo con la reivinidicación 4 en el que el grupo carboxialquilo se selecciona de carboximetilo, carboxietilo y carboxipropilo, y preferentemente es carboximetilo.
6. Un complejo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en el que el polisacárido es dextrano.
7. Un procedimiento para producir un complejo de óxido de hierro polisacárido reducido derivado esterilizable en autoclave para su administración a un sujeto mamífero, caracterizado porque el procedimiento comprende:
hacer reaccionar un polisacárido con una sal de borohidruro o hidrógeno en presencia de un catalizador de hidrogenación para producir un polisacárido reducido;
derivar el polisacárido reducido;
el polisacárido reducido derivado siendo producido a una temperatura inferior a 50ºC; formar un complejo con el polisacárido reducido derivado y una sal de hierro para producir un complejo de óxido de hierro polisacárido reducido derivado; comprendiendo el complejo la adición de una mezcla de sales férricas y ferrosas, el enfriamiento de la solución resultante y la incorporación de hidróxido de amonio para neutralizar la solución;
y
esterilizar el complejo mediante autoclave;
siendo dicho complejo estable a una temperatura de al menos 100ºC.
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8. Un complejo esterilizable mediante autoclave de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o proporcionado por un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7 en la forma de agente de contraste destinado para IRM in vivo de un sujeto mamífero.
9. Un complejo esterilizable mediante autoclave de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o proporcionado por un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7 en la forma de agente hematínico concebido para tratar un sujeto mamífero con deficiencia de hierro.
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