ES2864829T3

ES2864829T3 - Conjugados de tetrapirrol como agentes de contraste IRM

Info

Publication number: ES2864829T3
Application number: ES16189057T
Authority: ES
Inventors: Fabian Kiessling; Paul Borm; Jozef Cremers; Nihan Güvener
Original assignee: NANO4IMAGING GmbH
Current assignee: NANO4IMAGING GmbH
Priority date: 2016-09-15
Filing date: 2016-09-15
Publication date: 2021-10-14
Anticipated expiration: 2036-09-15
Also published as: EP3295962A1; JP2019529449A; CN109843337A; US20190209714A1; WO2018050450A1; US10894094B2; EP3295962B1

Abstract

Compuestos conjugados de tetrapirrol con la fórmula (3) y sus sales, solvatos y los solvatos de estas sales; **(Ver fórmula)** en donde n = de 1 a 20 y en donde R1 consiste en OH, SH, NH2, HisGlyOMe, poliuretanos, poliacrilatos, poliestirenos, polivinil-lactamas, PGLA, ácido poliacrílico, PVP, ácido hialurónico, arginina, lisina, histidina, PEG, poliéter aminas, polilisina, poliarginina, polihistidina.

Description

DESCRIPCIÓN

Conjugados de tetrapirrol como agentes de contraste IRM

La invención se refiere a compuestos conjugados de tetrapirrol, a un método para producirlos y al uso de dichos conjugados, que comprenden una molécula de al menos un compuesto de tetrapirrol con un conector, al menos un compuesto parcialmente soluble en agua y sus sales, solvatos y los solvatos de estas sales.

El mercado mundial de los medios de contraste, que son las sustancias usadas en la obtención de imágenes médicas que mejoran la visibilidad de las estructuras o de los fluidos del cuerpo, está previsto que aumente desde poco más de 4.300 millones de dólares en 2015 hasta más de 6.000 millones en 2022, lo que representa una tasa de crecimiento anual compuesta del 4,9 %, según la consultora GlobalData. Hay que decir que este crecimiento, que se producirá en los 10 principales mercados (10MM) de Estados Unidos, Francia, Alemania, Italia, España, el R.U., Japón, Brasil, China y la India, será impulsado por varios factores, que incluyen el aumento del número de TAC anuales, procedimientos de obtención de imágenes por resonancia magnética (RM) y ecocardiograma, así como una creciente carga de enfermedad en los 10MM.

Cada año se realizan en todo el mundo más de 20.000.000 de procedimientos de obtención de imágenes por resonancia magnética (RM) para diversas indicaciones clínicas. A la luz de la creciente importancia del uso de la radiación ionizante en terapia y del creciente interés por las terapias mínimamente invasivas, no es de extrañar que la tomografía por resonancia magnética se haya ido imponiendo lentamente en el área de la radiología desde aproximadamente 1995. Mientras que la tomografía por resonancia magnética se desarrolló originalmente para imágenes diagnósticas, ahora se usa como herramienta para realizar y evaluar las intervenciones terapéuticas mínimamente invasivas. El campo de uso relativamente nuevo se refiere a áreas tales como los procedimientos de obtención de imágenes por RM intraoperatorios y endovasculares. Los procedimientos endovasculares mínimamente invasivos desempeñan un papel cada vez más importante en el tratamiento de los pacientes. Por muchas razones, los procedimientos radiológicos son alternativas atractivas a las intervenciones quirúrgicas y los tratamientos correspondientes. Desde ese punto de vista, los agentes de contraste desempeñan un papel importante en los procedimientos médicos cotidianos, ya que ayudan a construir imágenes de RM. Los agentes de contraste utilizados actualmente son los complejos de gadolinio de bajo peso molecular, como Magnavist®, que reducen principalmente el T1, o los complejos de hierro coloidal, tales como Combidex®, que disminuyen el T2 o el T2* (susceptibilidad).

Por sí mismo, el gadolinio puede ser tóxico. Cuando se usa en agentes de contraste, el gadolinio se une a una molécula denominada agente quelante, que controla la distribución del gadolinio en el cuerpo. La preocupación por la seguridad del gadolinio surgió en 2006, cuando el uso de GBCA se relacionó con el desarrollo de fibrosis sistémica nefrógena (FSN), una afección en ocasiones mortal. Estudios recientes han suscitado nuevas preocupaciones sobre la seguridad del gadolinio, especialmente en lo que se refiere a si quedan restos del elemento en los cerebros de los individuos que recibieron el contraste. En un reciente estudio de casos y controles con base en un hospital, Kanda y sus colegas empezaron con un conjunto de 190 sujetos a los que se les realizó una autopsia entre 2010 y 2013 en el centro. El conjunto de sujetos se dividió en varios grupos; un grupo contenía 5 pacientes seleccionados aleatoriamente a los que se les administró contraste de gadolinio más de dos veces (el grupo con GBCA). Estos sujetos recibieron gadopentetato de dimeglumina (Magnevist®, Bracco Imaging), gadodiamida (Omniscan®, GE Healthcare); o gadoteridol (ProHance®, Bracco). Recibieron una dosis de 0,1 mmol/kg de peso corporal para cada análisis. El estudio también incluyó a cinco personas como grupo de control que nunca habían recibido ningún material de contraste (grupo sin GBCA).

Ninguno de los sujetos de cualquiera de los grupos tenía antecedentes de disfunción renal grave o insuficiencia renal aguda. Los investigadores utilizaron la espectroscopia de masas con plasma acoplado inductivamente (ICP-MS) para evaluar la acumulación de gadolinio en los tejidos cerebrales, incluyendo el núcleo dentado y el globo pálido. Tanto el núcleo dentado como el globo pálido controlan los movimientos voluntarios del cuerpo. Tras un análisis, los investigadores encontraron rastros de gadolinio en las muestras de las cinco personas del grupo con GBCA (media, 0,25 |jg/g de tejido cerebral), con concentraciones significativamente mayores en cada región, en comparación con los que nunca recibieron contraste de gadolinio. Además, en el grupo con GBCA, el núcleo dentado y el globo pálido mostraron concentraciones de gadolinio significativamente mayores que otras regiones del cerebro. De manera más destacable, se descubrió la presencia de una acumulación de gadolinio en sujetos sin antecedentes de disfunción renal grave. Estos hallazgos se sumarán al debate sobre la seguridad de los agentes de contraste T1 derivados de gadolinio. Los agentes de contraste T2 también están desapareciendo gradualmente del mercado. Por lo tanto, hay una gran necesidad de nuevos agentes de contraste no tóxicos que puedan utilizarse en T1, en T2 o en ambos tipos de obtención de imágenes.

De ahí que el objetivo de las investigaciones fuera conseguir un agente de contraste para la obtención de imágenes por RM no tóxico, mediante el cual los resultados de la obtención de imágenes sean comparables a los de los agentes de contraste de Gd.

La hemina es un pigmento rojo natural de la sangre que contiene Fe 3+ que está disponible comercialmente en varias empresas en forma de una sustancia pura. Es particularmente adecuado para las mediciones de la obtención de imágenes por RM por la configuración de los electrones de los orbitales 3d. El ion de hierro Fe3+ de la hemina está en un estado de alto espín, lo que significa que hay presentes orbitales con electrones desapareados, lo que significa que es más probable que se produzcan ambas interacciones de espín-espín. Usando un ligando débil como el cloro, se sabe que los isotiocianatos y los anillos de imidazol cambian el estado de alto espín. Por ejemplo, se ha reivindicado un complejo de porfirina con soporte de nitroimidazol para la terapia dirigida en la que se puede combinar la visibilidad de la obtención de imágenes por RM y la radioterapia (documento EP 1148057). Otras patentes han incorporado otros iones metálicos tales como manganeso (Mn) en porfirinas naturales y nuevas para demostrar que ciertos quelatos tienen una alta relaxividad más allá de 1,5Tesla (documento US 20 060 137 74), y pueden usarse con fines diagnósticos y terapéuticos.

Sin embargo, la hemina es prácticamente insoluble en condiciones fisiológicas y sería inmediatamente interceptada por la intervención del hígado. Solo a través de la unión de proteínas se pueden hacer conjugados de hemina que pueden ser útiles como agentes de contraste de RM. En este asunto, el documento EP 0470 086 B1 describe la síntesis de un compuesto soluble en agua con aminoácidos básicos, por ejemplo, L-arginina. El compuesto resultante se reivindica para el tratamiento de varios tipos de anemia y porfiria. Los conjugados de hemina-proteína se han reivindicado para su uso en la obtención de imágenes por RM como agentes de contraste, pero particularmente usando proteínas tales como la albúmina para evitar que el sistema inmunitario las reconozca como proteínas extrañas (documento DE 100 06 570), y facilitando la acumulación intracelular para permitir la obtención de imágenes de tumores y focos inflamatorios.

Más estado de la técnica como Suree M Spaltro et al. "synthesis and characterization of conjugates of poly (amino acids) and manganese (III) IX as relaxation enhancement agents for mri" en Journal of applied polymer science, 1 de enero de 1990, divulga aductos de porfirina que contienen Mn con polilisina o ácido poliglutamático, en donde la reacción se lleva a cabo en una mezcla de DMF y agua.

Otra divulgación como la de Raffaella Roncone et al. "catalytic activity, stability, unfolding an degradation pathways of properties and reactivity of myoglobin reconstituted with chemically modified protohemin complexes" en Biochemistry, vol. 39, n° 31, 1 de agosto de 2000, páginas 11-24, describe la reacción del cloruro de protohemina con el éster metílico de la histamina en DMF.

Enrico Monzani et al. "Properties and reactivity of myoglobin reconstituted with chemically modified protohemin complexes", Biochemistry, vol. 39, n° 31, 1 de agosto de 2000, páginas 9571-9582 divulga la reacción del cloruro de protohemina con Fmoc-Arg(Pmc)-ala-O-tBu en DMF. El documento RU 2238950 C2 describe derivados de la hemina, en donde R1 y R2 pueden ser aminoácidos, péptidos o derivados de los mismos, y el átomo central puede ser Fe y un ligando puede ser Cl.

En el documento WO 2014/144633 A1 se divulga un catéter para proporcionar contraste en la obtención de imágenes por RM, en donde el catéter contiene un agente de contraste.

El inconveniente de dichas patentes es que en la mayoría de ellas se usan nanopartículas que, en algunos casos, podrían entrar en el torrente sanguíneo y suponer una importante preocupación toxicológica. Sobre la base de los ejemplos mencionados anteriormente, que divulgan el uso de derivados de hemina como agentes de contraste inyectables para la obtención de imágenes por RM para fines biomédicos específicos, así como para superar todos los problemas relacionados con las nanopartículas, el objetivo de la presente invención es hacer que la hemina o los derivados de la hemina estén disponibles como agentes de contraste para permitir una visualización de alta calidad en la RM. En el contexto de la presente invención, los agentes de contraste para la obtención de imágenes por RM se basan en la hemina como un tetrapirrol que contiene hierro. Más específicamente, es la protoporfirina IX que contiene un ion férrico de hierro (hemo b) con un ligando de cloruro, y es un producto de degradación de la hemoglobina que transporta el oxígeno.

El problema que se va a resolver mediante la invención es, por tanto, encontrar conjugados de tetrapirrol similares a la hemina como agente de contraste no tóxico con buenos resultados en la obtención de imágenes, que puedan usarse para obtener imágenes de implantes, geles portadores e incluso como agentes de contraste con objeto de proporcionar alternativas a la vista del estado de la técnica.

La solución del problema viene dada por la formulación de las reivindicaciones independientes 1 y 3. En el contexto de la presente invención, se prefiere una condición en la que los agentes de contraste conjugados de tetrapirrol de Fe II/Fe III sean biocompatibles. En particular, se prefieren los compuestos que se caracterizan porque los agentes de contraste de tetrapirrol de Fe II/Fe III son porfirinas. En el presente documento se describen cofactores que son derivados de las proteínas hemo (es decir, hemo a, hemo b, hemo c y hemo o).

En el presente documento se divulgan agentes de contraste de tetrapirrol de Fe II/Fe III conjugados con polímeros solubles en agua o tratados con aminoácidos básicos tales como ARG, LYS.

Una realización particular de la presente invención se caracteriza porque los tetrapirroles de Fe II/Fe III o el agente de contraste conjugado con porfirina como se define en las reivindicaciones, están funcionalizados o unidos covalentemente a, por ejemplo, poliacrilatos, colágeno, hidrogeles, lactamas de polivinilo, PEG, PGLA, ácido poliacrílico, PVP, polímeros y copolímeros multivalentes y mezclas de estos componentes.

En el presente documento también se divulgan tetrapirroles de Fe II/Fe III o agentes de contraste conjugados con porfirina que contienen un separador entre los tetrapirroles o el anillo de porfirina y una cadena polimérica.

Un conjugado divulgado en el presente documento se caracteriza porque se pueden unir a la cadena polimérica múltiples tetrapirroles de Fe II/Fe III o agentes de contraste conjugados con porfirina.

En el presente documento también se divulgan tetrapirroles de Fe II/Fe III o agentes de contraste conjugados con porfirina disueltos en líquidos portadores polares o hidrogeles, que son capaces de intercambiar átomos de hidrógeno.

También se divulgan tetrapirroles de Fe II/Fe III o agentes de contraste conjugados con porfirina de acuerdo con la presente invención, que se caracterizan porque los tetrapirroles de Fe II/Fe III o los agentes de contraste conjugados con porfirina se solubilizan parcialmente y se suspenden en un líquido portador.

Ejemplos:

Ejemplo 1

Un ejemplo de reacción de PEGilación de un compuesto de tetrapirrol como la hemina se describe en la siguiente instrucción. Se disuelve hemina (29 mg, 0,0445 mmol) en tetrahidrofurano THF (10 ml) y se añade trietilamina (0,6 ml). Posteriormente, la suspensión se enfría hasta 0 °C y se deja en agitación durante 1 hora. A continuación, se añade cloroformiato de etilo (0,425 ml, 4,46 mmol) y se continúa la agitación a 0 °C durante otras 2 horas. La mezcla se filtró y el filtrado se trató con etilendiamina (0,3 ml 4,48 mmol) y se agitó a la temperatura ambiente hasta el día siguiente. La mezcla se concentró a vacío y se utilizó como tal en la siguiente reacción (I).

El derivado de hemina (3) se produjo en una cantidad de (15 mg, 50 %).El derivado de hemina se disolvió en cloroformo y se trató con succinimidil PEG con diferentes pesos moleculares, lo que dio, tras la diálisis, el derivado de hemina PEGilado deseado (4).

Ejemplo 2

A continuación se describe un ejemplo de una reacción de PEGilación adicional en (II). Se añaden 0,15 ml de trietilamina a una suspensión de 32,6 g de hemina (1) en 100 ml de tetrahidrofurano (THF) y la suspensión se enfría a 0 °C durante 1 hora. Después se añaden 19,2 mg de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) a una suspensión de hemina para activar los grupos carboxilo (2) de la misma.

Se añade un compuesto de amina-PEG directamente después de la reacción para que continúe a la temperatura ambiente hasta el día siguiente con agitación. El tratamiento con amina-PEG con diferentes pesos moleculares dio, después de la diálisis, el derivado de hemina pegilado deseado (3).

Ejemplo 3

A continuación se describe un ejemplo del proceso para solubilizar la hemina tratándola con aminoácidos como base, similar al procedimiento descrito por Ingberg et al. en el documento US5008388 A. Se agitaron vigorosamente 6,52 g de hemina cristalina (0,01 M) y 3,48 g de L-arginina cristalina (0,02 M) durante 10 a 15 horas en un vaso de precipitados provisto de un agitador mecánico y que contenía una mezcla disolvente de 300 ml de acetona y 20 ml de agua. El producto formado se retiró por filtración, se lavó con acetona y se secó. Rendimiento del arginato de hemina: 9,5 g (95 %). Residuo insoluble, determinado por el método mencionado anteriormente: 0,14 g (1,4 %).

Ejemplo 4

A continuación se describe un ejemplo del proceso para solubilizar la hemina tratándola con aminoácidos como base, similar al procedimiento descrito por Ingberg et al. en el documento US5008388 A. Se trataron 6,52 g de hemina cristalina (0,01 M) y 4,39 g de 30 L-lisina cristalina (0,03 M) como se describe en el ejemplo 2. Rendimiento del lisinato de hemina: 10,8 g (99 %). Residuo insoluble: 0,020 g (0,20 %). Parece que la proporción molar óptima de hemina 35 con respecto a arginato es de 1:3, porque esto dio el mayor rendimiento de arginato de hemina, mientras que la cantidad de residuo insoluble era mínima.

Ejemplo 5

A continuación se detalla un ejemplo de incorporación de derivados de hemina en un hidrogel: se disolvieron hidrogeles a base de ácido hialurónico (1 g) en tampón de PBS (20 ml) y se enfriaron hasta 0 °C. Posteriormente, se añadió EDC (2,5 g, 16,5 mmol) y NHS (0,345 g, 3,0 mmol) y se dejó en agitación durante 15 minutos. Se añadió la hemina 2 (9,7 g, 15 mmol) y la reacción se continuó durante 24 h a la temperatura ambiente. Tras la diálisis (MCOW 2k), se obtuvo el producto y se confirmó con UV-VIS.

Ejemplo 6

Los derivados de la estructura del complejo de hemina con/sin matriz de gel como se describe vide supra se están usando como CEST o agente de transferencia de saturación de intercambio químico para la obtención de imágenes por RM. El complejo derivado de la hemina con el gel de ácido hialurónico en diferentes relaciones de acoplamiento han dado lugar a un novedoso contraste in vitro para la obtención de imágenes por RM, y las formulaciones se están aplicando en diferentes líneas celulares para ser visualizadas a través de la obtención de imágenes por RM para detectar la presencia del agente de contraste que presenta viabilidad celular en el sujeto en el sitio, visualizando así la activación de las células que presentan el agente de contraste en el sujeto, por ejemplo, los fibroblastos, las células de músculo liso, etc.

Estudios de toxicidad (in vitro)

La toxicidad de los derivados hidrosolubles de la hemina (arginato-HA, lisinato-HL) y de la hemina PEGilada (HP) se evaluó en la línea celular HCT 116 en concentraciones de hasta 250 ug/ml hasta 24 horas de incubación. Se eligió esta concentración porque sería equivalente a la concentración plasmática máxima tras la inyección de 1 mmol/kg en un paciente, la dosis común de contraste de Gd cíclico, tal como Omniscan.

En la fig. 1 se muestra el número total de células HCT 116 (muertas/vivas) tras 24 horas de incubación con diferentes concentraciones de derivados de hemina. El cisplatino (CDDP) se utilizó como control positivo a una concentración de 50 ^mol/l.

En la fig. 2, el panel superior muestra la cantidad de células apoptóticas tempranas tras la incubación de las células HCT 116 durante 24 horas con diferentes concentraciones de derivados de hemina. Se utilizó el CDDP como control positivo a una concentración de 50 ^mol/l. El panel inferior muestra la cantidad de células con condensación nuclear (apoptosis significativa) y con daños en la membrana.

Obtención de imágenes del armazón

Se ha seleccionado un conjunto, colágeno al 0,5 % (p/v) en una solución de ácido acético 0,25 M debido a su fácil manipulación. Se mezclaron soluciones de lisinato de hemina (HL) en 1,5 ml de tampón de PBS con 1,5 ml de solución de colágeno con una concentración final de 0,1 mM a 1 mM de HL y se mezclaron a la temperatura ambiente hasta el día siguiente. En la composición final se produjeron dos fases diferentes, por lo que la homogeneidad de las muestras no era suficiente. El estudio se interrumpió.

En un segundo conjunto de experimentos, se seleccionaron armazones tubulares de colágeno al 0,5 % (p/v) sin soporte en espiral. La forma tubular se consiguió tras el procedimiento de liofilización. Los armazones tubulares de colágeno de 1,5 cm se han introducido en soluciones de HL en 1,5 ml de tampón de PBS con una concentración final de 0,1 mM a 1 mM de HL y se han mezclado a la temperatura ambiente. El armazón comenzó a encogerse y a perder su estructura tridimensional inmediatamente después de la introducción del HL. El estudio se interrumpió.

Para el tercer conjunto de estudios, se seleccionaron armazones tubulares de colágeno al 0,5 % (p/v) con soporte en espiral. El procedimiento de reticulación se completó y las estructuras finales eran estables en el tampón de PBS y se humedecieron previamente durante 30 minutos antes de su uso. Los armazones tubulares de colágeno de 1,5 cm se han introducido en soluciones de HL en 1,5 ml de tampón de PBS con una concentración final de 0,1 mM a 1 mM de HL y se han mezclado a la temperatura ambiente hasta el día siguiente. Se han recogido soluciones sobrenadantes de cada muestra para determinar la concentración no integrada de HL y se han marcado como soluciones HL-Día0. Después se realizó un procedimiento de lavado con 1,5 ml de PBS en soluciones de PBS durante las siguientes 12 h y 24 h. Se han recogido soluciones de lavado de cada muestra y se han marcado como HL-Día1 y HL-Día2.

Para el cuarto conjunto de estudios, se ha seguido el procedimiento descrito para el tercer conjunto con arginato de hemina (HA) y armazones tubulares de colágeno al 0,5 % (p/v) con espiral. Los armazones tubulares de colágeno reticulados de 1,5 cm se han introducido en soluciones de HA en 1,5 ml de tampón de PBS con una concentración final de 0,1 mM a 1 mM de HA y se han mezclado a la temperatura ambiente hasta el día siguiente. Se han recogido soluciones sobrenadantes de cada muestra para determinar la concentración no integrada de HA y se han marcado como soluciones HA-Día0. Después se realizó un procedimiento de lavado con 1,5 ml de PBS en soluciones de PBS durante las siguientes 12 h y 24 h. Se han recogido soluciones de lavado de cada muestra y se han marcado como HA-Día1 y HA-Día2.

Para el quinto conjunto de estudios, se ha seguido el procedimiento descrito para el tercer conjunto con hemina-PEG (HPEG) y armazones tubulares de colágeno al 0,7 % (p/v) con espiral debido a la disponibilidad de la muestra. Las muestras de HPEG se modificaron con diferentes longitudes de PEG de 1 KDa, 5 KDa y 10 KDa. Los armazones tubulares de colágeno reticulados en 1,5 ml de tampón de PBS se han introducido en las tres soluciones de HPEG en 1,5 ml de tampón de PBS con la máxima concentración disponible de cada una de las soluciones madre de HPEG, y se han mezclado a la temperatura ambiente hasta el día siguiente. Se han recogido soluciones sobrenadantes de cada muestra para determinar la concentración no integrada de HPEG y se han marcado como soluciones HPEG-Día0. Después se realizó un procedimiento de lavado con 1,5 ml de PBS en soluciones de PBS durante las siguientes 12 h y 24 h. Se han recogido soluciones de lavado de cada muestra y se han marcado como HPEG-Día1 y HPEG-Día2.

Interacción química: para el sexto conjunto de estudios, se seleccionó el lisinato de hemina (HL), la activación de los grupos carboxilo del HL se realizó a través de un acoplamiento con EDC/NHS en solución de MES (tabla 1) y se disolvió cada uno en 3 ml de solución de EDC/NHS* con un contenido de 3,3 mM de EDC. (*La relación EDC:NHS se tomó de un estudio anterior con armazones tubulares de colágeno al 5 % (p/v) como 0,5:2, lo que se tradujo en unos ^{pesos de 15,625 mg de EDC por 17,25 mg de NHS para 25 ml de tampón de}Mes)

Tabla 1: Aco lamiento con EDC/NHS del lisinato de hemina HL en un intervalo de concentración

Mientras tanto, se incubaron los armazones de colágeno tubulares no reticulados al 0,5 % (p/v) con espirales en tampón de MES durante 30 minutos para la transición al estado húmedo, y el tampón de MES se ha eliminado antes de la aplicación. Tras la activación de los grupos carboxilo del HL, las muestras se han introducido en los armazones de colágeno y se han mezclado con rodillos durante 4 h para conseguir un marcaje homogéneo.

Las muestras finales eran de color marrón oscuro y homogéneas (excepto la muestra al 0,25 %). Se ha recogido una pequeña cantidad de las muestras para la histología. A continuación, las muestras se fijan en agarosa al 1 % para la medición por RM. Las muestras se investigaron además con la obtención de imágenes por RM clínica de 3T (Philips) y la obtención de imágenes por RM preclínica de 11,7T (Bruker). Las imágenes se proporcionan en la figura 1, y los tiempos de relajación de cada muestra se proporcionan en la tabla 2. En cada escaneo se han seleccionado dos regiones de interés (ROI), y se indican los valores medios de múltiples cortes. Las ROI se eligieron como una en la región del armazón y otra en agarosa como control en la que se incrustaron los armazones.

Tabla 2: tiem os de relaación de los armazones^ de colá eno con/sin lisinato de^ hemina en una RM de 11,7T

Condiciones de la obtención de imágenes por RM

Obtención de imágenes por resonancia magnética: La relaxometría por RM nuclear de los armazones marcados se realizó con un escáner clínico de RM de cuerpo entero de 3T (Philips Achieva, Best, Países Bajos) utilizando una espiral de rodilla (SENSE-flex-M; Philips, Best, Países Bajos) a la temperatura ambiente. Los tiempos de relajación longitudinal (T1) se midieron en el modo de escaneo bidimensional de las secuencias de eco de campo turbo con pulsos de reenfoque a un ángulo de cambio de orientación de 10° [TR = 52 ms, TE = 3-48 ms, número de ecos = 10]. Los tiempos de relajación transversal (T2) se midieron en modo de escaneo bidimensional usando secuencias de espín-eco multicorte y multidisparo con un pulso de excitación de 90° seguido de un tren de pulsos de reenfoque de 180° separados equitativamente [TR = 1.500 ms, TE = 8-168 ms, número de ecos = 20]. Para la relaxometría T2*, se adquirieron imágenes a 32 tiempos de eco (intervalo de TE = 3-99 ms) usando una secuencia de eco en gradiente de campo rápido multidisparo y multicorte [TR = 196 ms, intervalo de 3 ms entre dos ecos, espesor del corte = 2 mm, ángulo de cambio de orientación de 30°]. Los tiempos de relajación T2 y T2* (R2 y R2*) se calcularon ajustando una curva exponencial a las amplitudes de la señal en función del tiempo de eco (TE) para cada región segmentada del armazón usando el programa informático Imalytics Preclinical. La curva exponencial incluye una compensación para tener en cuenta una meseta de la señal creada por el ruido o un componente con un decaimiento lento de la señal. Adicionalmente, las imágenes ponderadas en T1 y T2 se adquirieron usando una secuencia de eco turboespín (TSE) ^{ponderada en T1 [TR = 9 ms,}Te ^{= 700 ms, espesor del corte = 2 mm] y una secuencia TSE ponderada en T2 [TR =}1.200 ms, TE = 100 ms, espesor del corte = 2 mm]. El tamaño y el volumen de los hidrogeles se evaluaron tomando como base las imágenes de TSE ponderadas en T1 y T2 usando el programa informático Imalytics Preclinical.Al menos se puede ver en la imagen 1 las imágenes de RM de los armazones de colágeno con/sin HL en una RM de 3T. Imágenes ponderadas en T1-(a) y T2-(b). Las etiquetas numéricas de 1 a 5 se refieren a las muestras marcadas HL CxL 0,1, CxL 0,2, CxL 0,25, CxL 0,5 y el armazón CxL de control sin HL, respectivamente.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Compuestos conjugados de tetrapirrol con la fórmula (3) y sus sales, solvatos y los solvatos de estas sales;

en donde n = de 1 a 20

y en donde R1 consiste en OH, SH, NH2, HisGlyOMe, poliuretanos, poliacrilatos, poliestirenos, polivinil-lactamas, PGLA, ácido poliacrílico, PVP, ácido hialurónico, arginina, lisina, histidina, PEG, poliéter aminas, polilisina, poliarginina, polihistidina.

2. Compuestos conjugados de tetrapirrol de acuerdo con la reivindicación 1 con la fórmula (4).

3. Método para producir compuestos conjugados de tetrapirrol, que contienen dentro de una molécula al menos un compuesto de tetrapirrol, y al menos un compuesto parcialmente soluble en agua o sus sales, solvatos y los solvatos de estas sales, dicho método se caracteriza por que los compuestos conjugados de tetrapirrol con la fórmula (3)

en la que n = de 1 a 20

en la que R1, R2 consiste en OH, SH, NH2, HisGlyOMe, poliuretanos, poliacrilatos, poliestirenos, polivinil-lactamas, PGLA, ácido poliacrílico, PVP, ácido hialurónico, arginina, lisina, PEG, poliéter aminas, polilisina, poliarginina y sus sales, solvatos y los solvatos de estas, se forman con un método

en donde se usan cabodiimidas como agente activador para una reacción de acoplamiento de compuestos de tetrapirrol con la fórmula (1)

en la que,

M consiste en Fe, Ru, Os, Mn, Ni, Co

Y consiste en Cl,

con un conector que consiste en etilendiamina

en donde los compuestos de tetrapirrol (1) se disuelven en un disolvente orgánico y el acoplamiento con un compuesto al menos parcialmente soluble en agua se lleva a cabo en acetona, PBS, MES, DMSO, DMF, DMAc, acetonitrilo o mezclas de acetona, PBS, MES, DMSO, DMF, DMAc, acetonitrilo.

4. Método para producir compuestos conjugados de tetrapirrol de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el agente activador se selecciona del grupo que consiste en 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC), N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC), 1-ciclohexil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (CDC), 1 isopropil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (IDC), 1-ciclohexil-3-(2-morfolinoetil)carbodiimida (CMC).

5. Método para producir compuestos conjugados de tetrapirrol de acuerdo con las reivindicaciones 3 o 4, en donde los conjugados de tetrapirrol se disuelven en líquidos portadores apróticos polares.

6. Método para producir compuestos conjugados de tetrapirrol de acuerdo con una de las reivindicaciones 3 a 5, en donde los líquidos portadores apróticos polares son PEG, PGLA o derivados.

7. Uso de compuestos conjugados de tetrapirrol y sus sales, solvatos y los solvatos de estas sales, de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 o 2, que contienen dentro de una molécula al menos un compuesto de tetrapirrol y al menos un compuesto al menos parcialmente soluble en agua como agente de contraste para la obtención de imágenes por RM.

8. Uso de los compuestos conjugados de tetrapirrol de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 o 2 para la obtención de imágenes por RM, en donde los compuestos de tetrapirroles están dentro de un injerto de un implante, especialmente una endoprótesis vascular, una aguja guía o un catéter.