ES2199226T3 - Polimeros biocompatibles que contienen mitades diagnosticas o terapeuticas. - Google Patents

Polimeros biocompatibles que contienen mitades diagnosticas o terapeuticas.

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Abstract

SE PRESENTA UNA COMPOSICION MEDICA BIOCOMPATIBLE QUE INCLUYE UN PORTADOR POLIMERICO, UNA CADENA PROTECTORA UNIDA AL PORTADOR POLIMERICO Y UN GRUPO INFORMADOR UNIDO AL PORTADOR O AL PORTADOR Y A LA CADENA PROTECTORA. LA INVENCION TAMBIEN SE REFIERE A UNA COMPOSICION PARA TRATAR UNA ENFERMEDAD EN UN PACIENTE UTILIZANDO UNA TECNICA DE FORMACION DE IMAGENES QUE PUEDE DETECTAR EL GRUPO INFORMADOR PARA OBTENER UNA IMAGEN VISIBLE DE LA DISTRIBUCION DE LA COMPOSICION.

Description

Polímeros biocompatibles que contienen mitades diagnósticas o terapéuticas.
La presente invención trata de una composición médica biocompatible.
Ejemplos de nuestras composiciones descritas en detalle más adelante pueden incluir agentes terapéuticos o diagnósticos y tienen una vida media en sangre prolongada, baja toxicidad y baja inmunogenicidad, y se pueden detectar mediante técnicas de formación de imágenes médicas, por ejemplo, imágenes de resonancia magnética para angiografía y como marcadores para la entrega diana.
Agentes de contraste para las imágenes de resonancia magnética
La detección precisa de anomalías en el cuerpo de un paciente es un requisito esencial para el diagnóstico y el tratamiento adecuado de la enfermedad. Los procedimientos de visualización, como por ejemplo las imágenes de resonancia magnética (MRI), son cada vez más importantes para lograr esa detección precisa. MRI es no invasivo y no requiere la exposición de los humanos a radiaciones potencialmente dañinas. En MRI, los tejidos de diferente origen, como los tejidos normales y los alterados, por ejemplo, los tejidos cancerígenos, se pueden distinguir por diferencias en los tiempos de relajación T1, el tiempo de relajación del retículo del espín o el tiempo de relajación longitudinal o T2, el tiempo de relajación del espín o el tiempo de relajación transversal. Debido a estas diferencias, se produce la intensidad de la señal diferencial, que da lugar a varios grados de contraste en las imágenes de MR. Cuanto mayor sea la diferencia en T1 o T2, más pronunciado será el contraste. Sin embargo, en muchos casos el tejido enfermo o alterado es isointensivo, es decir, el tejido enfermo o alterado tiene la misma intensidad de señal diferencial que el tejido normal y, por tanto, no se distingue del tejido normal si no se usan agentes de contraste especiales.
En esos casos, las técnicas de formación de imágenes de MR empleadas para elucidar los defectos en la perfusión de la sangre se basan en la diferenciación de la sangre que fluye de los tejidos estacionarios que están alrededor, como por ejemplo, angiografía por MR (MRA). Tres técnicas angiográficas dimensionales, como por ejemplo las técnicas "tiempo de vuelo" (TOF) y "contraste de fases" (PC), ofrecen imágenes detalladas de vasos intracraneales. Sin embargo, la MRA tradicional, es decir, la MRA de tiempo de vuelo, depende de la velocidad de flujo y de la forma de flujo y, por lo tanto, la angiografía de alta calidad de vasos periféricos con alta resistencia de flujo generalmente resulta imposible debido a un efecto denominado saturación de los vasos. Para solucionar este problema, se han usado los agentes de contraste para reducir selectivamente los tiempos de relajación de la sangre.
El ácido dietilenotriamino-pentaacético de gadolinio (III) (Gd-DTPA) dimeglumina es un agente de contraste muy usado que es relativamente pequeño (MW 538) y se extravasa en el primer paso a través de los capilares. Sin embargo, el uso de Gd-DTPA para la angiografía por MR en todos los organismos, excepto el cerebro, es limitado, debido a que la vida media en sangre del Gd-DTPA es inferior a 20 minutos y la vida biológica en las personas del Gd-DTPA es de, aproximadamente, 90 minutos. La extravasación da como resultado una rápida reducción en la proporción de señales de vaso/músculo, lo cual dificulta la detección precisa de anomalías y de enfermedades. Además, la dimeglumina de Gd-DTPA, que se usa en la práctica clínica, es inmunogenética, lo cual no favorece que se administre de forma repetida al mismo paciente.
Se producen problemas parecidos si se usa ferrioxamina-B como agente de contraste. Además, la ferrioxamina-B causa una precipitada bajada de la presión sanguínea después de su administración intravenosa.
Los agentes de contraste de MRI que se han creado usando macromoléculas naturales y sintéticas ofrecen la ventaja de una elevada relaxividad molecular, debido a los múltiples grupos quelantes acoplados a un espinazo de polímeros simple. Estos grupos pueden quelar cationes paramagnéticos, como por ejemplo en Gd-DTPA-poli-l-lisina, o producir alta relaxividad debido a la presencia de óxido de hierro, por ejemplo en coloides que contienen hierro. Sin embargo, los coloides basados en óxido de hierro tienen su propio sitio específico independiente de ligandos de acumulación en el cuerpo, como por ejemplo, el hígado, el bazo y los tejidos linfoides.
Los grupos quelantes pueden unirse a diversos polímeros naturales, como por ejemplo, proteínas y polisacáridos, y a polímeros sintéticos. La unión química, por ejemplo por conjugación, de DTPA con albúmina de suero bovino dará como resultado un agente de contraste macromolecular, que es conveniente para algunas aplicaciones, como por ejemplo, angiografía de NMR, pero debido a la eficaz identificación de la albúmina modificada por macrófagos y de receptores de albúmina en células endoteliales, este agente de contraste tiene una vida media en sangre corta. También es inmunogenético y tóxico para los órganos del sistema reticuloendotelial. Por lo tanto, el uso de imágenes de MR es limitado.
Una forma de reducir la antigenicidad de la albúmina consiste en enmascararla con polímeros naturales y sintéticos, como por ejemplo, brazos separadores, mediante enlace covalente, pero esto deja pocos grupos reactivos en el glóbulo proteico que son necesarios para unir los quelatos y cationes paramagnéticos. Por lo tanto, el uso de tales compuestos en la formación de imágenes de MR es limitado.
Los polímeros sintéticos de 1-aminoácidos, tales como poli-l-lisina (PL), constituyen una alternativa a las proteínas naturales modificadas como columnas vertebrales para agentes de contraste. PL modificado con DTPA se puede usar como vehículo radionucleido para los objetivos mediados por anticuerpos diana en medicina nuclear. Se ha sugerido poli-l-lisina DTPA, es decir, poli-l-lisina con grupos de DTPA ligados a grupos amino épsilon de residuos de lisina como complexona de Gd, es decir, un compuesto que forma un complejo con Gd, para su uso en angiografía por MR. También se sabe que la toxicidad de DTPA-poli-l-lisina es menor que la de la DTPA-albúmina. Sin embargo, las mitades de DTPA en DTPA-poli-l-lisina son reconocidas por las células Kupffer del hígado y algunas células de los riñones, probablemente fagocitos glomérulonefrales, lo cual produce una elevada y relativamente rápida eliminación del agente de contraste de la sangre. Por ejemplo, 90% del agente inyectado de forma intravenosa, como por ejemplo poli-l-lisina-DPTA(Gd) (MW 48,7 kD), se elimina de la circulación en 1 hora (t_{1/2}=0,134 h) y se acumula en los riñones, el hígado y los huesos. Además, la síntesis de DTPA-poli-l-lisina se puede realizar con un reactivo de enlaces cruzados, como por ejemplo anhídrido cíclico de DTPA. En consecuencia, resulta difícil evitar la formación de productos de enlaces cruzados de peso molecular relativamente alto y la preparación obtenida es heterogénea.
Los polímeros que contienen nitrógeno, como por ejemplo polietilenamina, se han modificado con derivados monofuncionales del ácido acético para formar una molécula en la que los residuos de nitrógeno y de ácido acético del espinazo participan en la formación de compuestos con cationes trivalentes. Sin embargo, debido a la extensiva acumulación no deseable en el hígado, el uso de compuestos paramagnéticos de ácido polietilenaminoacético no está muy extendido en MRI.
Los agentes de contraste poliméricos, como por ejemplo los dendrímeros, constituyen una familia diferente de macromoléculas con valor potencial limitado como agentes de contraste. No se ha demostrado que esta familia de agentes sea biocompatible y, por tanto, su valor para la formación de imágenes in vivo es limitado.
Se han descrito anteriormente varios agentes quelantes basados en polisacáridos; sin embargo se ha demostrado que su complemento de activación, que es una característica de los polisacáridos, impide su uso extensivo en la formación de imágenes de MR.
Agentes con vida media en sangre prolongada
La vida media en sangre y la inmunogenicidad son características cruciales de cualquier agente de contraste designado para la terapia o el diagnóstico médico. En algunos casos, como la terapia de sustitución de enzimas, la rápida eliminación de los agentes terapéuticos de la circulación y la acumulación en células que presentan antígenos limitan su uso potencial en el tratamiento de la enfermedad. Para solucionar este problema, se ha sugerido que se modifiquen químicamente los agentes macromoleculares, como por ejemplo las enzimas, con varios polímeros naturales y sintéticos. Los dextranos, poliaminoácidos sintéticos, y los polietilen glicoles se usan muy frecuentemente. Sin embargo, sólo el polietilen glicol (PEG) y su monometil éster (MPEG) son adecuados para prolongar la vida media en sangre y simultáneamente reducir la inmunogenicidad del agente terapéutico. El motivo para modificar determinantes antigénicos mediante MPEG se puede explicar por medio de la selección de la carga electrostática de la micromolécula protegida, como por ejemplo, las proteínas, y mediante la capacidad de formar numerosos enlaces con agua en soluciones.
Se asocian aproximadamente tres moléculas de agua con cada unidad de óxido de etileno y forman la microatmósfera de agua inmediatamente adyacente para el polímero. Esto evita, en gran medida, las interacciones adsortivas de proteínas y células con cadenas de PEG. El uso de PEG en sus formas activadas, como por ejemplo PEG o MPEG activado por 4,6-dicloro-s-triazina, no es deseable para la modificación de proteínas, porque el producto activado está contaminado con subproductos y es altamente humidosensible. Se han formado enlaces estables y virtualmente no biodegradables mediante la conjugación de MPEG, por ejemplo reaccionando 4,6-dicloro-s-triazina y 1,1-carbonildilmidazol con grupos aminos.
Se usan PEG y MPEG en agentes de contraste para la formación de imágenes médicas. Las modificaciones covalentes de desferroxamina-B con MPEG mejoran la tolerancia del cuerpo de dichos agentes de contraste in vivo, pero no dan como resultado cambios significativos en la eficacia de la formación de imágenes. También se han usado agentes de contraste que contienen MPEG o PEG como componente de mezclas paramagnéticas o en polímeros paramagnéticos de enlaces cruzados.
Agentes de contraste diana
Los agentes de contraste diana de los sitios de interés ayudan a incrementar la eficacia de los procedimientos de formación de imágenes de MR. Agentes de diagnóstico de este tipo pueden incluir combinaciones de un ligando y un agente de contraste paramagnético acoplados mediante una fuerte interacción, como por ejemplo un enlace químico covalente.
Después de la aplicación sistemática, un agente de contraste de este tipo se acumula en el sitio diana que está determinado por la especificidad de los ligandos. En consecuencia, el sitio de acumulación se diferencia fácilmente del tejido que lo rodea debido a que aparece hiper- (o hipo-) intensivo en imágenes de MR. El ligando que dirige al agente de contraste al sitio diana puede ser específico de los receptores en las células normales o en las células alteradas de un determinado órgano o tejido. En el primer caso, el agente de contraste se acumulará en un tejido normal; en el segundo caso, se acumulará en un tejido alterado.
El éxito a la hora de diseñar un agente de contraste diana está determinado principalmente por las siguientes propiedades: 1. afinidad al sitio diana; 2. antigenicidad, es decir, la capacidad de pasar a través del endotelio capilar y 3. vida media en sangre del ligando o molécula (vector) diana. El enlace de un agente de contraste con una molécula de ligando diana, como por ejemplo un anticuerpo o sus fragmentos, que crea un agente de contraste diana, como por ejemplo un catión paramagnético quelado, un coloide paramagnético o una combinación de un quelato y un coloide paramagnético conjugados en una molécula diana, normalmente reduce su valor potencial por diversos motivos, como por ejemplo, una afinidad reducida a un sitio diana, una antigenicidad aumentada o una vida media reducida. Por ejemplo, el enlace de un fragmento de un anticuerpo pequeño, como por ejemplo una molécula quimérica Fab o Fv, con una molécula paramagnética grande, como por ejemplo un polímero-DTPA o un coloide superparamagnético, como por ejemplo óxido de hierro, para formar un agente de contraste objetivo aumentará la respuesta inmune del organismo recipiente al agente debido a las propiedades coadyuvantes del propio agente. La molécula paramagnética o el propio coloide pueden ser reconocidos por las proteínas opsónicas del organismo recipiente y el agente de contraste puede resultar retenido en órganos del sistema reticuloendotelial. Como resultado, el hígado y el bazo eliminan el agente de contraste de la circulación antes de que se logre una concentración sustancial en el sitio diana. Además, un agente de contraste de este tipo puede ser reconocido como un antígeno extraño que puede dar lugar a anticuerpos huésped no deseables.
El documento EP-A-397307 describe una preparación de medicamento de copolímeros de bloque soluble en agua que incluye un segmento hidrófilo, como por ejemplo polietilen glicol, y un segmento hidrófobo, como por ejemplo el ácido poliaspártico, con un medicamento como adriamicina ligado al segmento hidrófobo.
Según la invención se proporciona una composición médica biocompatible que incluye un vehículo polimérico y que se caracteriza porque comprende además una pluralidad de cadenas protectoras unidas al protector polimérico y uno o más grupos de referencia unidos al vehículo polimérico y porque dicho grupo de referencia es una complexona o un grupo terapéutico; las cadenas protectoras protegen al vehículo polimérico y al grupo de referencia del contacto con otras macromoléculas uniendo de forma extensiva el agua a las cadenas protectoras.
El vehículo polimérico se puede elegir entre los poliaminoácidos, polietilenaminas, sacáridos naturales, polisacáridos aminados, oligosacáridos aminados, poliamidoaminas, ácidos poliacrílicos o polialcoholes.
El vehículo polimérico se puede elegir entre los poliaminoácidos, polietilenaminas, sacáridos naturales, polisacáridos aminados, oligosacáridos aminados, poliamidoaminas, ácidos poliacrílicos o polialcoholes.
La invención también muestra una composición que tiene la siguiente fórmula:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \+ O \+ \+ O\+\cr  \+ \hskip0.5mm || \+  \+ ||\+\cr 
[[-- \hskip-2mm \+C--NH-- \hskip-2mm \+CH--][-- \hskip-2mm \+
C--NH-- \hskip-2mm \+CH--]] _{k} \cr  \+
\+ \hskip1mm | \+ \+ \hskip1mm |\cr  \+ \+ R _{1} 
\+ \+
R _{2} \cr}
donde los grupos
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \+ O \+ \+ \+ \+ O\+\cr  \+ \hskip0.5mm || \+ \+ \+
\+ \hskip0.5mm ||\+\cr 
[-- \hskip-2mm \+C--NH-- \hskip-2mm \+CH--]
\+  \hskip0.5cm  y   \hskip0.5cm  \+
[-- \hskip-2mm \+C \hskip-0.3mm --NH-- \hskip-2mm \+CH--]\cr
 \+ \+ \hskip0.5mm | \+ \+ \+ \+ \hskip0.5mm |\cr 
\+ \+ R _{1}  \+ \+ \+ \+
R _{2} \cr}
se pueden unir en cualquier orden, como por ejemplo, la unidad R_{1} se puede repetir varias veces en la cadena antes de que se produzca la unidad R_{2} y viceversa; donde k es 100-560; R_{1} es (CH_{2})_{4}NHCO(CH_{2})_{n}COOCH_{2}CH_{2}A-B-OR_{3}, donde n es 2-6; A es [OCH_{2}CH_{2}]_{x} donde x es 15-220; B es [OCH_{2}CH_{2}]_{x} o [OCH(CH_{3})CH_{2}]_{y}, donde y + x es 17-220; R_{2} es un grupo quelante; y R_{3} es H, (CH_{2})_{y}CH_{3} o (CH_{2})_{y}COOH y p es 0-7.
En esta composición, el grupo quelante puede ser, por ejemplo, ácido dietilenotriamino-pentaacético, 1,4,7,10-tetraazociclododecano-N,N',N'', N'''-ácido tetraacético, ácido 1,4,7,10-tetraazociclododecano-N,N',N'', -triacético, ácido etileno-bis (oxietilenonitrilo) tetraacético o ácido etilenodiaminotetraacético.
El poliaminoácido de la composición preferiblemente tiene 20-560 unidades aminoácidas, un peso molecular de 1.000-100.000 daltons y preferiblemente es no-proteico. El poliaminoácido puede ser un polímero de una sola especie o de, al menos, dos especies diferentes de aminoácidos, o puede ser un copolímero de bloque.
El poliaminoácido puede incluir fragmentos de poliaminoácidos unidos por enlaces divisibles, como por ejemplo, enlaces S-S. En concreto, el poliaminoácido puede ser, por ejemplo, poli-l-lisina, poli-d-lisina, poli-alfa,beta-(2-aminoetil)-D, L aspartamida o ácido-l-poliaspártico.
Las cadenas protectoras de la composición pueden ser, por ejemplo, polietilen glicol, metoxipolietilen glicol, metoxipolipropilen glicol, un copolímero de polietilen glicol, metoxipolietilen glicol o metoxipolipropilen glicol o derivados de los mismos. Además, las cadenas protectoras pueden ser copolímeros de bloque de polietilen glicol y uno del grupo de poliaminoácidos, polisacáridos, poliamidoaminas, polietilenaminas o polinucleidos. Las cadenas protectoras pueden ser también copolímeros de polietilen glicol que incluyen un monoéster de un ácido dicarboxílico. Las cadenas protectoras preferiblemente tienen un peso molecular de 500-10.000 daltons.
El grupo de referencia puede ser una complexona, como por ejemplo un grupo quelante. El grupo quelante puede ser, por ejemplo, ácido dietilenotriamino-pentaacético, ácido trietilenotetramino-hexaacético, ácido etilenodiaminotetraacético, 1-2-diaminociclohexano-N,N',N'',N'''-ácido tetraacético, N,N'-Di (2-hidroxibencil) etilenodiamina, ácido N-(2-hidroxietil)etilenodiaminotriacético, ácido nitrilotriacético, ácido etileno-bis(oxietileno-nitrilo) tetraacético, 1,4,7,10-tetraazociclododecano-N, N',N'',N'''-ácido tetraacético, ácido 1,4,7,10-tetraazociclododecano-N,N', N''-triacético, 1,4,7-tris(carboximetil)-10-(2'-hidroxipropil)-1,4,7,10-tetraazociclodecano, 1,4,7-triazociclonano-N,N',N''-á-
cido triacético o 1,4,8,11-tetraazociclotetradecano-N, N', N'', N'''-ácido tetraacético.
La composición puede incluir también un radionucleido que emita rayos alfa, beta o gamma unido a la complexona. El radionucleido puede ser galio 67, indio 111, tecnecio 99m, cromo 51, cobalto 57, molibdeno 99 o una molécula unida a un isótopo de yodo.
El grupo de referencia puede incluir también un agente de diagnóstico, como por ejemplo un agente de contraste, que puede incluir un elemento paramagnético o superparamagnético o una combinación de un elemento paramagnético y un radionucleido. El elemento paramagnético se puede elegir del grupo de metales de transición o lantánidos con números atómicos 21-29, 42, 44 ó 57-71. El elemento paramagnético puede ser, por ejemplo, gadolinio (III), disprosio (III), holmio (III), europio (III), hierro (III) o manganeso (II).
El grupo de referencia puede incluir un agente terapéutico, como un medicamento citostático, antibiótico, hormonal, analgésico, psicotrópico, antiinflamatorio, antivírico o antifúngico o una linfocina.
La composición puede incluir además un grupo diana unido al vehículo polimérico o a una de las cadenas protectoras o a ambos. El grupo diana puede ser un anticuerpo, un fragmento de un anticuerpo, un anticuerpo quimérico, una enzima, lectina o un ligando sacárido.
La composición puede incluir también un grupo de referencia que sea una partícula, una partícula coloidal o un precipitado coloidal. El precipitado coloidal puede incluir un óxido, un sulfuro o un hidróxido de un elemento de transición o lantánido con números atómicos 21-29, 42, 44 ó 57-71. El grupo de referencia puede ser también un coloide de óxido de silicio o un polímero que contenga silicio, azufre o carbono o una molécula que contenga flúor, como por ejemplo un fluorocarburo.
El grupo de referencia puede ser también un grupo de piridilditioacil, como por ejemplo, un grupo N-(2-pyridilditio)propionil, N-hidroxisuccinimidil, N-hidroxisulfosuccinimidil, imidazolil, benzotriazolil, aminoalquilo, aldehído, tioaiquil, tiolano, acilo haloideo, alquilo haloideo o fenilo haloideo o un grupo diazo- o hidrazo-, como por ejemplo un grupo 4-hidrazionoxietil, 4-hidrazinobencil, diasirinil, azidofenilo o azidoalquilo.
Además, la invención presenta un procedimiento para preparar la composición uniendo el vehículo polimérico con la pluralidad de cadenas protectoras para crear un vehículo protegido y, después, unir el vehículo protegido con el grupo de referencia. Si las cadenas protectoras incluyen un análogo del metoxipolietilen glicol, la unión del vehículo polimérico con el análogo produce un gel semiestable. El procedimiento puede incluir además la unión de un grupo diana al vehículo, a uno de los grupos protectores o a ambos.
La invención también muestra una composición para su uso en el tratamiento de una enfermedad de un paciente o el uso de la composición para fabricar un medicamento para el tratamiento de una enfermedad, administrándolo al paciente en una cantidad efectiva terapéutica o diagnósticamente de la composición o del medicamento de la invención. El procedimiento puede incluir además una exploración del paciente mediante una técnica de formación de imágenes que puede detectar al grupo de referencia para obtener una imagen visible de la distribución de la composición.
La administración puede realizarse mediante una inyección intravascular o intraperitoneal y la técnica de formación de imágenes puede ser, por ejemplo, imágenes de resonancia magnética, imágenes de medicina nuclear, tomografía de emisión positrónica o tomografía computerizada de emisión simple de fotones.
Los ejemplos de nuestra composición permiten que se administren dosis muy pequeñas de un elemento paramagnético, por ejemplo gadolinio, a un paciente y aún así se obtienen imágenes excelentes, como por ejemplo imágenes de MR. Por ejemplo, el grupo de referencia puede incluir gadolinio suministrado en una dosis inferior a 0,05 mmol Gd/Kg de peso corporal del paciente. Preferentemente, la dosis es de aproximadamente 0,02 a 0,04 mmol Gd/kg de peso corporal.
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Los ejemplos de nuestra composición se pueden usar como agente de contraste o para fabricar un agente de contraste para el tratamiento de un paciente mediante la exploración de un vaso submilimétrico del paciente para obtener una imagen visible del vaso submilimétrico. Un vaso submilimétrico es aquél que tiene un diámetro interior inferior a un milímetro.
Según se usa en la presente invención, el término "unido" significa que tiene enlaces covalentes y no covalentes, por ejemplo, enlaces hidrogénicos, iónicos o Van-der-Waals. Estos enlaces pueden estar formados entre al menos dos átomos o iones iguales o diferentes como resultado de la redistribución de las densidades electrónicas de dichos átomos o iones.
Un "vehículo polimérico" es una molécula que comprende varias mitades químicas unidas que pueden ser iguales o diferentes y sirve como sitio donde se une un grupo de referencia y es protegido por las cadenas protectoras.
Una "cadena protectora" es una molécula que protege a una molécula portadora y a un grupo de referencia del contacto con otras macromoléculas mediante la unión extensiva del agua con las cadenas.
Una "complexona" es una molécula o varias moléculas o radicales químicos o mitades que constituyen un medio favorable para la unión de un ion (un catión o un anión). La disociación del ion del medio se interrumpe debido a la estabilidad cinética y/o termodinámica de la unión.
Una "molécula quelante", "grupo quelante" o "quelato" es una complexona que une cationes.
Un "grupo de referencia" es un átomo, ion, molécula o complexona que se puede unir a un vehículo polimérico o cadena protectora para producir un efecto que se puede detectar mediante cualquier procedimiento de examen químico, físico o biológico de un paciente. Un grupo de referencia puede ser un agente terapéutico o de diagnóstico.
Los términos "derivado" o "análogo" según se usan en la presente invención quieren decir un compuesto cuya estructura central es igual o muy parecida a la de un compuesto padre, pero que tiene una modificación química o física, como un grupo lateral diferente o adicional; el término incluye a los copolímeros de compuestos padre que se pueden unir a otros átomos o moléculas.
Los términos "ligando", "grupo diana" o "molécula vector" quieren decir cualquier átomo, ion o molécula unida a un vehículo y/o a una cadena protectora y/o a un grupo de referencia para aumentar la acumulación de la composición en un sitio diana de un organismo en mayor medida que si el ligando, el grupo diana o la molécula vector estuvieran ausentes.
El término "fragmento de poliaminoácido" se refiere a radicales de un solo aminoácido o varios aminoácidos unidos que se pueden unir para formar un poliaminoácido.
Un "gel semiestable" es un gel que forma una fase líquida en estado constante o si varían la temperatura el pH u otras condiciones.
El término "representación de vasos" se refiere a la obtención de imágenes de un vaso o vasos donde se puede dilucidar la orientación y la localización espacial de los vasos.
El término "aminado" describe moléculas que incluyen grupos aminos unidos.
Una "cantidad diagnósticamente efectiva" de la composición es una cantidad que ofrezca una imagen de la composición en el paciente.
Una "cantidad terapéuticamente efectiva" de la composición es una cantidad que proporcione un beneficio terapéutico al paciente.
Algunas características importantes de los ejemplos de nuestras composiciones que las hacen ser sorprendentemente convenientes para las imágenes de MR incluyen: 1) la capacidad de quelar cationes paramagnéticos para conseguir una elevada relaxividad, lo cual es esencial para su uso como agente de contraste NMR, 2) un agente de contraste con una vida media en sangre extendida, 2) una vida media en sangre extendida, 3) baja toxicidad y 4) no-inmunogenicidad.
Esta invención también ofrece las ventajas de tener que administrar sólo una dosis del agente de contraste, junto con proporciones mejoradas de señales/ruidos en las imágenes de diagnóstico obtenidas.
Las siguientes propiedades son comunes a las composiciones de la invención: 1) relaxividad incrementada de cada catión paramagnético comparado con Gd-DTPA, 2) grandes cantidades de grupos quelantes en cada molécula, 3) concentración en sangre mejorada después de la inyección intravenosa, 4) sitios mejorados de permeabilidad endotelial anormal y 5) tiempo de circulación prolongado en comparación con Gd-DTPA.
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Otras características y ventajas de la invención se desprenderán de la siguiente descripción de las formas de realización preferidas y de las reivindicaciones.
Descripción detallada Dibujos
La figura 1 es un diagrama de tres esquemas para sintetizar las composiciones de la invención.
La figura 2 es un gráfico de la eliminación de la sangre de productos marcados de [^{111}ln] y MPEG saturados de Gd(MW 5 kD)-poli-l-lisina(MW 53,5 kD)-DTPA (cuadrados) y MPEG(MW 2 kD)-poli-l-lisina(MW 41 kD)-DTPA (rombos).
La figura 3 es un gráfico de la biodistribución de productos marcados [^{111}ln] y MPEG saturados de Gd(MW 5 kD)-poli-l-lisina(MW 53,5 kD)-DTPA 90 horas después de la inyección intravenosa.
La figura 4 es un gráfico de la respuesta a Gd-DTPA de ratones inyectados con Gd-DTPA-BSA (cuadrados) y MPEG(MW 5 kD)- poli-l-lisina(MW 53,5 kD)-DTPA(Gd) (rombos).
La figura 5 es un gráfico del efecto de MPEG marcado de Gd(MW 2 kD)-poli-l-lisina(MW 41 kD)-DTPA (cuadrados) o MPEG marcado de Gd(MW 5 kD)-poli-l-lisina(MW 25 kD)-DTPA (rombos) en valores T1 de sangre en diversas concentraciones.
La figura 6 es un gráfico de la mejora dependiente de dosis de los vasos, con la proporción vaso/músculo determinada por la digitalización de intensidades de las señales de diversas arterias grandes, como por ejemplo, la aorta, ilíaca y femoral y los tejidos musculares que los rodean.
La figura 7 es un gráfico del curso-tiempo de un agente de contraste en vasos grandes en un estudio comparativo.
Las figuras 8a y 8b son imágenes de resonancia magnética de la cabeza de una rata en reconstrucción de píxeles en brillo en 3 dimensiones que muestra la imagen antes (Fig. 8a) y después (8b) de una inyección intravenosa de MPEG(MW 5 kD)-poli-l-lisina(MW 25 kD)-DTPA(Gd).
La figura 9 es una imagen de MR de dos ratas en reconstrucción de píxeles en brillo en 3 dimensiones después de una inyección intravenosa de MPEG(MW 5 kD)-poli-l-lisina(MW 25 kD)-DTPA(Gd) (imagen izquierda) y dimeglumina de adopentato (imagen derecha).
Las figuras 10a y 10b son imágenes de MR de un conejo en reconstrucción de píxeles en brillo en 3 dimensiones de la proyección lateral (Fig. 10a) y cráneo caudal (ver Fig. 10b) después de una inyección intravenosa de MPEG(MW 5 kD)-poli-l-lisina(MW 25 kD)-DTPA(Gd).
Las figuras 11a y 11b son imágenes de MR de la ijada izquierda y el muslo de una rata en reconstrucción de píxeles en brillo en 3 dimensiones antes (Fig. 11a) y después (Fig. 11b) de una inyección intravenosa de MPEG(MW 5 kD)-poli-l-lisina(MW 25 kD)-DTPA(Gd). Las imágenes se tomaron dos semanas después de la inyección de células de adenocarcinoma mamario R3230 en la ijada izquierda de la rata.
Estructura de la composición
Las composiciones de esta invención incluyen una entidad química simple que incluye un vehículo polimérico, una cadena protectora unida al vehículo polimérico y un grupo de referencia. Por ejemplo, la composición puede tener la siguiente fórmula:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \+ O \+ \+ O\+\cr  \+ \hskip0.5mm || \+  \+ ||\+\cr 
[[-- \hskip-2mm \+C--NH-- \hskip-2mm \+CH--][-- \hskip-2mm \+
C--NH-- \hskip-2mm \+CH--]] _{k} \cr  \+
\+ \hskip1mm | \+ \+ \hskip1mm |\cr  \+ \+ R _{1} 
\+ \+
R _{2} \cr}
donde los grupos
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \+ O \+ \+ \+ \+ O\+\cr  \+ \hskip0.5mm || \+ \+ \+
\+ \hskip0.5mm ||\+\cr 
[-- \hskip-2mm \+C--NH-- \hskip-2mm \+CH--]
\+  \hskip0.5cm  y   \hskip0.5cm  \+
[-- \hskip-2mm \+C \hskip-0.3mm --NH-- \hskip-2mm \+CH--]\cr
 \+ \+ \hskip0.5mm | \+ \+ \+ \+ \hskip0.5mm |\cr 
\+ \+ R _{1}  \+ \+ \+ \+
R _{2} \cr}
se pueden unir en cualquier orden; donde k es 100-560; R_{1} es (CH_{2})_{4}NHCO(CH_{2})_{n}COOCH_{2}CH_{2}A-B-OR_{3}, donde n es 2-6; A es [OCH_{2}CH_{2}]_{x} donde x es 15-220; B es [OCH_{2}CH_{2}]_{x} o [OCH(CH_{3})CH_{2}]_{y}, donde y + x es 17-220; R_{2} es un grupo quelante; y R_{3} es H, (CH_{2})_{y}CH_{3} o (CH_{2})_{y}COOH y p es 0-7.
Vehículos poliméricos
El vehículo polimérico puede elegirse de poliaminoácidos, por ejemplo, polímeros lineales o ramificados de una sola especie de aminoácidos o de diferentes especies de aminoácidos, como por ejemplo copolímeros de bloque regulares o estáticos de poliaminoácidos, como por ejemplo poli-l-o poli-d-lisina preferiblemente lineales, poli-alfa, beta-(2-aminoetil)-d,l-aspartamida o ácido-l-poliaspártico.
El peso molecular del vehículo del poliaminoácido está preferiblemente entre 1.000 y 100.000 daltons. Se prefieren los poliaminoácidos con distribuciones de peso molecular (MW) reducido a los que tienen distribuciones de peso molecular amplio. Los poliaminoácidos se unen con enlaces peptídicos o, cuando se obtienen mediante la condensación de uno o más fragmentos de poliaminoácidos o aminoácidos individuales con enlaces divisibles, como por ejemplo, enlaces S-S que se pueden dividir in vivo. Los poliaminoácidos pueden ser naturales o sintéticos, son preferiblemente no-proteicos y están preparados mediante síntesis química o mediante técnicas de recombinación, tales como la ingeniería genética.
El vehículo polimérico también puede comprender polietilenaminas, como por ejemplo polímeros que contienen aminos ramificados o polietilenaminas carboxilatadas, es decir, que reaccionan con derivados de anhídrido carbónico; sacáridos naturales que contienen aminoácidos o ácidos carboxílicos, como por ejemplo ácido galacturónico, ácido glucurónico, ácido manurónico, ácido hialurónico, ácido péctico, ácido neuramínico, ácido algínico; carragenina, polisacáridos u oligosacáridos aminados (lineales o ramificados); o polisacáridos u oligosacáridos carboxílicos, por ejemplo, que reaccionan con derivados de anhídrido carbónico que dan como resultado la unión de grupos carboxílicos.
Los oligosacáridos de este tipo se pueden obtener mediante alteración química de, por ejemplo, dextrano, manano, xilano, pululano, celulosa, citosano, agarosa, fucoidano, galactano, arabinano, fructano, fucano, quitina, pustulano, levano o pectina. Además estos polisacáridos u oligosacáridos pueden ser heteropolímeros u homopolímeros de monosacáridos, como por ejemplo, glucosa, galactosa, manosa, galactosa, deoxiglucosa, ribosa, deoxirribosa, arabinosa, fucosa, xilosa, xilulosa o ribulosa.
El vehículo polimérico puede ser un poliamidoamino lineal, ramificado o dendrimérico; ácido poliacrílico; polialcoholes, como por ejemplo, alcohol polivinílico y polixilitol, a los que se unen químicamente grupos carboxílicos o de aminos; u oligonucleidos.
Cadenas protectoras
La cadena protectora puede ser PEG, preferiblemente esterificado por ácido dicarboxílico para formar un polietilen glicol monoéster; MPEG, metoxipolipropileno glicol o un copolímero de los mismos, preferiblemente a modo de éster con ácido dicarboxílico, polietilen glicol-diácido, polietilen glicol monoamino; MPEG monoamino; hidrácido de MPEG; MPEG imidazol y derivados de todos los anteriores.
Además, la cadena protectora puede ser un copolímero de bloque de PEG y un polímero, por ejemplo, de poliaminoácidos, polisacáridos, poliamidoaminas, polietilenaminas o polinucleidos (como se ha descrito previamente en el apartado de vehículos poliméricos) Los bloques se alternan preferiblemente para dar un copolímero de bloque. El peso molecular global de la cadena protectora es preferiblemente de 500 a 10.000 daltons. La cadena protectora se une preferiblemente al vehículo polimérico mediante un enlace sencillo.
Grupos de referencia
Los grupos de referencia de la invención se unen preferiblemente a un vehículo polimérico pero también se pueden unir a una cadena protectora. Los grupos de referencia incluyen complexonas, como por ejemplo moléculas quelantes como ácido dietilenotriamino-pentaacético (DTPA), ácido trietilenotetramino-hexaacético (TTHA), ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA), 1,2-diaminociclohexano-N,N,N',N'-ácido tetraacético, N,N'-Di(2-hidroxibencil)etilenodiamina (HBED), ácido N-(2-hidroxietil) etilenodiaminotriacético, ácido nitrilotriacético, ácido etileno-bis(oxietilenonitrilo) tetraacético (EGTA), 1,4,7,10-tetraazociclododecano-N,N',N'',N'''-ácido tetraacético (DOTA), ácido 1,4,7,10-tetraazociclododecano-N,N',N''-triacético (DO3A), 1,4,7-tris(carboximetil)-10-(2'-hidroxipropil)-1,4,7,10-tetraazociclodecano (HP-DO3A), 1,4,7-triazociclonano-N,N',N-ácido triacético (NOTA), 1,4,8,11-tetraazociclotetradecano-N,
N',N'',N'''-ácido tetraacético (TETA), preferiblemente DOTA y DTPA, donde estas moléculas quelantes preferiblemente incluyen un agente de contraste, como por ejemplo un catión paramagnético y/o radionucleido.
Los elementos paramagnéticos, por ejemplo los cationes, incluyen metales de transición o lantánidos, como por ejemplo elementos con números atómicos 21-29, 42, 44, 57-71, preferiblemente gadolinio (III), disprosio (III), holmio (III), europio (III), hierro (III) o manganeso (II).
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Los radionucleidos incluyen emisores de rayos alfa-, beta- y gamma-, preferiblemente galio 67, indio 111, tecnecio 99m, cromo 51, cobalto 57, molibdeno 99, moléculas, como por ejemplo tirosina y ácido p-oxibenzoico, unidas a isótopos de yodo, como por ejemplo yodo 131.
El grupo de referencia puede incluir también moléculas que contienen flúor, por ejemplo los fluorocarburos.
El grupo de referencia puede incluir también agentes terapéuticos, como por ejemplo citostáticos, antibióticos, hormonas, por ejemplo factor del crecimiento, medicamentos analgésicos, psicotrópicos, antiinflamatorios, antivíricos y antifúngicos o linfocinas, como por ejemplo interleucina 2. Los agentes terapéuticos se unen preferiblemente a un vehículo con enlaces separables o semiestables.
El grupo de referencia puede incluir también una partícula o partícula coloidal, o un precipitado coloidal de óxidos, sulfuros y/o hidróxidos de elementos de transición y lantánidos con números atómicos 21-29, 42, 44, 57-71 o coloides de óxido de silicio o polímeros que contienen silicio o polímeros de átomos de azufre, carbono o silicio. La partícula o partículas pueden contenerse como parte integral de una membrana semipermeable o estar rodeadas por dicha membrana.
Las composiciones pueden incluir también grupos de referencia adicionales que se pueden elegir de (CH2)_{p}COOH, donde p está entre 0 y 7; grupos de piridilditioacil, como por ejemplo grupos de N-(2-piridilditio)propionil; N-hidroxisuccinimidil, N-hidroxisulfosuccinimidil, imidazolil, benzotriazolil, aminoalquilo, aminoacilo, aldehído, tioaiquil, tiolano, acilo haloideo, alquilo haloideo o fenilo haloideo: diazo- e hidrazo-, como por ejemplo grupos de 4-hidrazionoxietil, 4-hidrazinobencil, diazirinil, azidofenil o acidoalquilo.
Los grupos anteriores se unen al vehículo polimérico y/o a las cadenas protectoras y se necesitan para conjugar o unir otros ligandos, como por ejemplo un grupo diana, capaz de interactuar con receptores de superficie de células, proteoglicanos, moléculas de adhesión, canales de iones o enzimas, a las composiciones de esta invención.
Grupo diana
El grupo diana puede incluir anticuerpos; fragmentos de anticuerpos; anticuerpos quiméricos, en los que los citados anticuerpos son policlonales o monoclonales; enzimas; cuasi sustratos de enzimas; lectinas o ligandos sacáridos de lectinas unidos de forma separable o no separable a la composición.
Síntesis de la composición
Las composiciones de esta invención se pueden sintetizar usando cualquiera de los siguientes procedimientos (Ver Fig.1). Se ofrece un ejemplo de síntesis que usa poli-l-lisina como vehículo polimérico, MPEG como cadena protectora y una complexona como grupo de referencia. Esta composición sintética resulta especialmente conveniente como agente de contraste macromolecular.
Esquema 1
Las composiciones pueden prepararse en dos fases, reaccionando primero el poliaminoácido con análogos de MPEG activados y reaccionando a continuación esta mezcla de reacción con un compuesto de quelatos activados. Se prefiere este procedimiento si se usa poli-l-lisina como vehículo polimérico (Ver Fig.1).
Los grupos de \varepsilon-aminos de poli-l-lisina se reaccionaron con derivados activados de MPEG carboxilatado, como por ejemplo ácido ciorados, anhídridos, anhídridos mixtos, nitrones, isotiocianatos e imidazol, y ésteres activados, como por ejemplo hidroxisuccinimida, hidroxisulfosuccinimida, p-nitrofenil, benzotriazolida.
La molécula quelante entra en reacción con los grupos aminos restantes, ya sea de forma activada, por ejemplo anhídrido, anhídrido mixto o isotiocianato, o de forma no activada. Si la molécula quelante está en forma no activada, se activa para obtener un éster activado en presencia de succinimida o sulfosuccinimida y carbodiimida y, a continuación, se hace que entre en reacción con los grupos aminos restantes. La reacción puede ir precedida de una modificación química adicional del espinazo del poliaminoácido o de las cadenas de MPEG que no estén limitadas a reacciones resultantes de la formación o eliminación de, al menos, un enlace químico.
La secuencia de la unión química de las cadenas protectoras y un grupo de referencia a un vehículo polimérico se puede invertir, es decir, la unión de un grupo de referencia precede a la unión de las cadenas protectoras al vehículo polimérico, pero preferiblemente el grupo de referencia se usa como análogo activado monofuncional, es decir, una molécula de grupo de referencia activado sólo forma una unión covalente con un vehículo polimérico.
Esquema 2
Las composiciones también se pueden sintetizar usando protocolos de síntesis de péptidos estándar con precursores de aminoácidos tales como aminoácido-MPEG y aminoácido-complexona. En este caso, se pueden alternar mitades de complexona y PEG de forma controlada.
Esquema 3
Los oligómeros de poliaminoácidos-MPEG se pueden conjugar con oligómeros de aminoácidos-complexona para formar un copolímero de bloque.
Los tres esquemas darán como resultado composiciones predecibles con distribuciones de peso molecular altamente predecibles.
Cuando se usan vehículos carboxilatados, tales como los sacáridos carboxilatados o poliaminoácidos con carboxilos en sus radicales, como el ácido poli-l-aspártico, el vehículo polimérico se activa preferiblemente en presencia de carbodiimida y sulfosuccinimida como se describe en el ejemplo 2 de DTPA y, a continuación, reacciona con las cadenas protectoras aminadas, como MPEG monoamina a pH 7-9. La unión de la complexona o el quelato se activa preferiblemente mediante la condensación de carbodiimida.
Cuando se usa para obtener imágenes médicas, las composiciones de esta invención preferiblemente tendrán una molécula de poliaminoácido no-proteico que sirva como vehículo de los análogos activados de moléculas quelantes lineales o ramificados unidos de forma covalente, al que se une un catión de referencia MR, es decir, quelado iónicamente. El vehículo forma una entidad química simple con cadenas protectoras de MPEG.
La ruta sintética de la preparación de las composiciones de esta invención incluye la modificación covalente del vehículo poliaminoácido. La conjugación de 1,1'-MPEG tratado con carbonildiimidazol con grupos aminos requiere altos excesos del modificador, como por ejemplo MPEG activado, lo cual conduce a la formación de geles semiestables debido a que se reduce la solubilidad de los poliaminoácidos en presencia de MPEG. El procedimiento para preparar N-hidroxisuccinimidil MPEG-succinato descrito en el esquema 1 da un producto con un contenido en éster altamente activo, por ejemplo mayor de 75%, lo cual resulta beneficioso para preparar las composiciones de esta invención. La purificación especial de los intermediarios permite la eliminación de peróxidos y produce una preparación para su uso in vivo.
La unión de MPEG al vehículo polimérico, por ejemplo un poliaminoácido, también evita la posible degradación del poliaminoácido con el anhídrido cíclico de DTPA. Las cadenas de MPEG evitan la formación de subproductos porque crean una barrera estérica para degradar al reactivo. Por lo tanto, la formación de productos de elevado peso molecular se puede controlar, lo cual hace que los pasos para la síntesis sean predecibles. En consecuencia, se obtiene una preparación homogénea con una distribución de peso molecular reducido.
Los vehículos poliméricos preferiblemente contienen enlaces peptídicos. Los mismos enlaces participan en la conjugación de una molécula quelante con grupos reactivos de radicales de aminoácidos. Por lo tanto, las composiciones son potencialmente biodegradables por diversos péptidos no específicos de animales. Para facilitar la eliminación in vivo del vehículo polimérico y de cadenas protectoras junto con un grupo de referencia o para mejorar la disociación de un grupo de referencia desde el vehículo hasta el medio ambiente biológico, si dicho grupo de referencia es un agente terapéutico, se pueden unir juntos elementos del vehículo polimérico o de las cadenas protectoras o de los grupos de referencia mediante una unión semiestable, como por ejemplo los enlaces S-S. Se puede eliminar pequeñas cantidades de composiciones retenidas del cuerpo mediante la degradación en pequeños fragmentos. Sin embargo, se pueden usar diversos derivados PEG activados para la preparación de las composiciones, convirtiéndolos así en virtualmente no degradables o, por el contrario, en lábiles. Sin embargo, las composiciones lábiles no son deseables, pues la separación de MPEG dará como resultado una acumulación más extensiva de las composiciones del agente de contraste en el sistema reticuloendotelial.
El uso de las composiciones de esta invención en la formación de imágenes de MR requiere la presencia de un grupo de referencia MR, como un catión paramagnético, por ejemplo gadolinio (III). La técnica de transquelación desarrollada en este experimento se basa en una forma de realización de Harris y col., J Polym. Sci., 22:341-52, que se incorpora en la presente invención mediante referencias. Los solicitantes usaron Gd-citrato para evitar el contacto del agente de contraste con el óxido de gadolinio, usado previamente por Griess y col., patente de Estados Unidos 4,647,447, o con el cloruro de gadolinio, usado previamente por Bardy y col., patente de Estados Unidos 4,804,529. El citrato de gadolinio forma fácilmente contaminantes, tales como hidróxidos coloidales a valores de pH superiores a 6,5, que están dentro del rango de valores de pH óptimos para los agentes de contraste de NMR de esta invención. La introducción de un paso de purificación especial, por ejemplo un paso de cromatografía de cambio aniónico, permite la separación de MPEG-PL-DTPA marcados de Gd(Gd) de posibles contaminantes aniónicos, como por ejemplo MPEG-PL-DTPA(Gd) con un bajo grado de sustitución de grupos aminos con MPEG o pequeñas cantidades de PL-DTPA(Gd).
Las cadenas protectoras, por ejemplo MPEG, de esta invención no reaccionan con el componente C3 de complemento, lo cual es una clara ventaja sobre agentes conocidos anteriormente, como por ejemplo dextrano-DTPA(Gd), que se sabe que reaccionan con el componente C3 de complemento.
MPEG evita la exposición de los grupos quelantes y los cationes paramagnéticos a células receptoras, como por ejemplo fagocitos glomerulonefrales, capaces de reconocerlos. MPEG también forma una barrera estérica que evita la requelación de cationes de Gd por seroproteínas tales como transferina. Las composiciones de esta invención también evitan los posibles efectos tóxicos retardados del gadolinio requelado.
La conjugación de MPEG reduce la toxicidad de la composición de esta invención evitando la acumulación significativa del polímero quelante en el hígado y el bazo. Los estudios de toxicidad aguda de las composiciones de esta invención no han mostrado ninguna aparente toxicidad en ratones en concentraciones que superan entre 10 y 35 veces la dosis óptima. El examen histológico de los tejidos de dichos ratones no ha mostrado ninguna desviación de los animales de control.
La vida media en sangre de las composiciones de esta invención se determinó en ratas. Los agentes de contraste radioactivos y paramagnéticos se incorporaron a la composición preparada según los ejemplos 1 y 3 para determinar de forma precisa sus características farmacocinéticas in vivo. Se observaron las ratas en distintos momentos usando una cámara gamma para controlar la distribución de la composición. Como muestran los datos presentados en la figura 2, la vida media en sangre del agente de contraste descrito era igual a 24 horas para MPEG(MW 5 kD)-poli-l-lisina(MW 53,5 kD)-DTPA marcado de [^{111}ln] y saturado con gadolinio, mientras que un agente de contraste más pequeño MPEG (MW 2 kD)-poli-l-lisina(MW 25 kD)-DTPA marcado de [^{111}ln] y saturado con gadolinio se eliminó de la sangre a una velocidad más rápida con t_{1/2} igual a 6 horas. Los dos únicos sitios del cuerpo en los que se detectó la acumulación de estas composiciones en cantidades significativamente mayores a 1% de la dosis inyectada por gramo de tejido fueron el bazo y los riñones. Sin embargo, la cantidad total de agente de contraste retenido en ambos riñones y en el bazo no excedió el 7% del agente de contraste en la composición.
La figura 3 muestra la distribución típica de 90 horas tras la inyección de MPEG(MW 5kD)-poli-l-lisina(MW 53,5 kD)DTPA, marcado de [^{111}ln] y saturado con gadolinio. La cantidad total de la composición retenida en el hígado, bazo y ambos riñones estaba entre 15 y 18% después de 90 horas en circulación. Los datos anteriores indican que los agentes de contraste de esta invención no se acumulan en el sistema reticuloendotelial de los animales después de la inyección intravenosa en cantidades significativas y se pueden eliminar de la circulación, presumiblemente mediante la degradación en la sangre, la excreción de bilis y la filtración renal.
Inmunogenicidad
La prevención de la interacción del grupo de referencia con proteínas plasmáticas mediante cadenas MPEG impide la unión de las composiciones con células capaces de reconocer la opsonina, como por ejemplo fagocitos que presentan antígenos, y con células sanguíneas inmunocompetentes., por ejemplo células B en reposo. En consecuencia, la formación de una respuesta inmune al propio grupo de referencia no es probable y se evita en gran medida la producción de anticuerpos huésped al grupo de referencia. Esto permite el uso repetido de la composición de esta invención si es preciso. La respuesta inmune de los animales a las inyecciones intravenosas de las composiciones de esta invención no ha detectado ninguna formación de anticuerpos a PEG y al poliaminoácido acetilado.
Los solicitantes detectaron la formación de baja afinidad, por ejemplo concentración de 800-1.000, de anticuerpos a DTPA(Gd) en animales inyectados con BSA-DTPA(Gd) por ensayo inmunoabsorbente unido a enzimas (ELISA) y demostraron que virtualmente no hay respuesta en animales inyectados con composiciones de esta invención (Ver Fig. 4). Sustancialmente, no se encontraron anticuerpos detectables frente a DTPA(Gd), polilisina acilada o MPEG en animales de forma intravenosa o intraperitoneal con composiciones de esta invención 20 días después de la inyección.
La combinación de una vida media en sangre prolongada y falta de inmunogenicidad es una característica importante de esta invención.
Las composiciones de esta invención han demostrado una capacidad sorprendentemente elevada, por ejemplo de hasta 13% por peso, para el gadolinio y un átomo R1/Gd excepcionalmente elevado, por ejemplo 20mM-1 seg-1. Los experimentos preliminares mostraron que se podían obtener angiogramas de alta calidad cuando se reducían los valores T1 de sangre al menos en 5 partes como resultado de la inyección del agente de contraste. Como se determina mediante la medición de los valores T1 en sangre, la concentración de Gd que permite una reducción en 5 partes en T1 corresponde a aproximadamente 300 nmol. Gd/ml de sangre (Ver Fig. 5). En un estudio humano típico, esto corresponde a una inyección de aproximadamente 20 \mumol Gd/kg del peso corporal total, que es cinco veces inferior para dimeglumina Gd-DTPA, que es un agente de contraste de MR frecuentemente usado.
La dependencia de dosis de la proporción de señales de vaso/músculo revela una meseta en la dosis de saturación de 20 \mumoles de Gd/kg de peso corporal total (Ver Fig. 6). En esta concentración, una imagen contrastada de vasos tenía una proporción vaso/músculo de 5,5-6, que supone un aumento de 4 veces sobre las preparaciones conocidas con anterioridad administradas en una concentración de 50 \mumoles Gd/Kg del peso corporal total. Las composiciones de esta invención eran muy superiores, es decir, mayores de 200%, a poli-l-lisina (MW 25 kD)-DTPA(Gd) a la hora de aumentar la proporción sangre/músculo (Ver Fig. 7). En este estudio comparativo, se inyectó a ratas con 20 \mumoles Gd/kg de MPEG(MW 5 kD)-poli-l-lisina(MW 25 kD)-DTPA(Gd) (cuadrados MPEG) o con 50 \mumoles Gd/Kg de polilisina(MW 25 kD)-DTPA(Gd) (PL-Gd-DTPA, rombos (Ver Fig. 7)). El aumento en la proporción vaso/músculo se niveló en 30 minutos y permaneció constante durante el tiempo de observación, que era de 100 minutos. Debido a que MPEG(MW 5 kD)-poli-l-lisina(MW 25 kD)-DTPA(Gd) tenía una proporción vaso/músculo superior, las imágenes de la anatomía vascular resultaron considerablemente mejores tras la administración de las composiciones de esta invención que tras la administración de PL-Gd-DTPA.
Esto permitió una reducción drástica de la dosis de Gd necesaria para producir imágenes angiográficas de alta calidad en ratas (Ver Fig. 8a y 8b). En un estudio, las imágenes de MR de la cabeza de un gato se compararon antes (Ver Fig. 8a) y después (Ver Fig. 8b) de la inyección intravenosa de MPEG(MW 5 kD)-poli-l-lisina(MW 25 kD)-DTPA (Gd) a 30 \mumol Gd/ml. Las imágenes se tomaron 20 minutos después de la inyección en una Signa (instrumentos GE, 1,5 T, 3-TOF SPGR/90 SE 60/6,5 256x192 2 NEX) usando un pliegue de superficie de 3 pulgadas. Las reconstrucciones de píxeles en brillo en 3 dimensiones de mapas de vasos ofrecieron una proporción de señales de vaso/músculo muy elevada, eliminando la necesidad de sustracción de fondo. Contrariamente a los agentes de contraste conocidos, las composiciones de esta invención inyectadas a 30 \mumoles Gd/Kg de peso corporal total sorprendentemente dieron como resultado que los vasos submilimétricos tenían un diámetro interior inferior a 1 mm.
Un estudio comparativo entre MPEG(MW 5 kD)-poli-l-lisina(MW 25 kD)-DTPA(Gd) y dimeglumina de gadopentato dieron resultados significativamente mejores para PEG-poli-l-lisina(MW 25 kD)-DTPA(Gd). En un estudio, se inyectó a una rata de forma intravenosa MPEG-poli-l-lisina-DTPA(Gd) (20 \mumol Gd/kg de peso corporal total) (imagen izquierda) y a una rata se le inyectó de forma intravenosa dimeglumina de gadopentato (100 \mumol Gd/kg de Magnevist®, laboratorios Berlex) (imagen derecha). Inmediatamente, es decir, 10 minutos después de la administración intravenosa de Gd-DTPA o del derivado de MPEG, las proporciones vaso/músculo habían aumentado de 1,4 a 2,7 y de 1,4 a 4,5 respectivamente. Treinta minutos después de la administración, las proporciones eran 2,0 para Gd-DTPA y 5,8 para MPEG(MW 5kD)-poli-l-lisina(MW 25 kD)-DTPA(Gd) en un valor p inferior a 0,001 (Ver Fig. 9). Gd-DTPA inicialmente produjo un pequeño aumento en el contraste de los vasos. Sin embargo, como Gd-DTPA se distribuyó por el espacio extravascular, se perdió el contraste. Las composiciones de derivados de MPEG de la invención, debido a su distribución vascular exclusiva, dieron como resultado proporciones elevadas. Las imágenes se tomaron en una Signa usando una pliegue de superficie de 5 pulgadas (Ver Fig. 9).
Se realizaron experimentos de imágenes con el tórax de conejos y cerdos minipig (peso corporal 40 kg) que demostraban la viabilidad de visualizar las arterias pulmonares y coronarias usando las composiciones de esta invención (Ver Fig. 10a y 10b). En un estudio, se inyectó de forma intravenosa a un conejo MPEG(MW 2 kD)-poli-l-lisina(MW 41 kD)-DTPA(Gd) (20 \mumol Gd/ml). Las imágenes se tomaron 20 minutos después de la inyección en una Signa usando un pliegue de superficie de 5 pulgadas.
La utilidad de las composiciones de esta invención para revelar anomalías de vasos en condiciones patológicas inducidas de forma experimental se probó en conejos y ratas. Mediante la angiografía MR TOF (tiempo de vuelo) en 3D podía visualizarse de forma fiable el estrechamiento de la arteria femoral en el sitio de estenosis experimental. Para la visualización de anomalías en los vasos en progresión de tumores, se usaron ratas con adeno carcinoma mamario R3230. En un estudio, se muestran las imágenes de MR de la ijada izquierda y el muslo de una rata antes (Ver Fig. 11a) y 20 minutos después (Ver Fig. 11b) de una inyección intravenosa de MPEG (MW 5 kD)-poli-l-lisina(MW 25 kD)-DTPA(Gd) a 20 \mumol Gd/ml. Las imágenes se tomaron en una Signa (instrumentos GE, 1,5 T, 3 TOF SPGR/60 SE 60/6,5 256x192 2 NEX) usando un pliegue de superficie de 3 pulgadas.
Los experimentos con neoplasia en ratas usando 20 \mumol Gd/kg ofrecieron angiogramas de contraste mejorado meramente informativos. La localización, tamaño y límites del tumor y venas de descenso podía reconocerse fácilmente en imágenes de MR en 3D. Por lo tanto, las composiciones de esta invención pueden usarse para detectar neoplasia y neovascularidad tumoral, lo cual es muy importante en la práctica clínica para la organización y la planificación quirúrgicas.
Se realizaron estudios adicionales con animales usando las composiciones de la invención para investigar in vivo la formación de imágenes gamma, la biocinética, la respuesta inmune y la formación de imágenes de resonancia magnética.
Obtención de imágenes con cámara gamma in vivo
Ratas Sprague-Dawley (200-250 g) fueron inyectadas en la vena de la cola usando una aguja de sonda 26 con 1-10 mg/0,5 ml de producto I ó III, marcado de [^{111}ln] y Gd, como se describe en el ejemplo 6. Se obtuvieron imágenes en una cámara gamma (de Ohio Nuclear) usando un colimador de energía media paralelo 30, 60 y 120 minutos y 24 y 70 horas después de la inyección.
Biocinética del agente de contraste
Se estudió la biocinética de Gd y productos (III o I) marcados [^{111}ln] usando ratas Sprague-Dawley de 230 a 250 g. Se inyectó a los animales en la vena de la cola 1-10 mg de polímero (60-70 \muCi/kg, 2 \mum/kg Gd) usando una aguja de sonda 26, anestesiándolos con éter. Se detectó una ligera variación en la cinética dentro de estos límites de dosis. La biodistribución del producto marcado se determinó en 16 órganos, es decir, tejidos de órganos, midiendo la radioactividad en cada momento indicado en los gráficos. Se usaron dos ratas por cada punto (Ver Fig. 3).
Prueba de la respuesta inmune en ratones
Una muestra de 0,2 ml de producto (0,5 mmol Gd/kg, es decir, una dosis de formación de imágenes de 20 veces) se inyectó por vía intravenosa o intraperitoneal en ratones (n=2) C_{3}H/He. Los animales de control recibieron BSA-DTPA(Gd) una cantidad igual de Gd-DTPA, preparada como se describe en Hnatowich D.J y col. Science 1979, en el mismo volumen de solución salina. Se observó a los animales durante dos semanas por si mostraban signos de toxicidad. No se detectaron signos de toxicidad. Después del periodo de 2 semanas, se recogió sangre de la vena de la cola de los animales y se detectó una concentración de anticuerpos mediante un ensayo inmunoabsorbente unido por enzimas (ELISA). Las placas ELISA fueron recubiertas con ovalbúmina-DTPA(Gd), ovalbúmina-MPEG, BSA o poli-l-lisina acetilada (MW 70.000). Sólo partes de la placa recubierta con ovalbúmina-DTPA(Gd) mostraron un enlace específico de inmunoglobalinas de ratón.
Obtención de imágenes de MR
Para visualizar vasos sanguíneos en animales de experimentos, se inyectó 0,005-0,05 mmol Gd/kg de producto II en ratas Sprague-Dawley macho (260-360) usando una aguja de mariposa de sonda 26 en 0,3 ml de solución salina estéril bajo anestesia inducida por barbitúricos. Se aplicaron pliegues de superficie de 5 pulgadas para dos animales y de 3 pulgadas para un animal (Ver Fig. 8a y 8b y Fig. 9).
En experimentos con conejos y cerdos minipig, se intubó a los animales. La anestesia se realizó mediante el uso de un isoflurano inhalado. La electrocardiografía se monitorizó constantemente. Se inyectó 0,03 mmol Gd/kg del producto II mediante un catéter insertado en la arteria femoral izquierda. Se usó un pliegue de superficie de extremidades para los estudios con conejos; se aplicó un pliegue de cabeza en los estudios con cerdos minipig (Ver Fig. 10a y 10b).
En estudios con ratas se obtuvieron 48 imágenes de cortes sagitales de General Electric CSI (grosor = 0,7 mm) usando una secuencia de pulso SPGR TOF en 3D T1-ponderado (1,5 T, SE 50/6,5, ángulo de giro 60). En estudios con conejos y cerdos minipig se retrataron hasta 80 cortes (Ver Fig. 10a y 10b).
Uso de las composiciones como agentes de contraste
Las composiciones de esta invención se pueden usar en la obtención de imágenes médicas y administrar de forma intravenosa o mediante inyección de bolus. Las imágenes vasculares son mejoradas debido a cambios en la relaxividad o radioactividad de la sangre. Los agentes de contraste se pueden usar para la mejora de imágenes vasculares de grandes vasos, como por ejemplo arterias y venas, o para visualizar vasos pequeños, como por ejemplo capilares submilimétricos. La resolución de las imágenes se aumenta proporcionando información más detallada. Los agentes de contraste pueden usarse para la representación de la anatomía vascular, la determinación de estenosis de vasos, la vascularidad anormal, por ejemplo neovascularidad, perfusión normal, defectos de perfusión u obtención de imágenes funcionales del cerebro.
Uso de la composición como agente terapéutico
Las composiciones de esta invención pueden comprender también un agente terapéutico, como por ejemplo una o más especies de medicamentos citostáticos, analgésicos, antiinflamatorios, antivíricos, antifúngicos o psicotrópicos. Las composiciones de esta invención que incluyen agentes terapéuticos son beneficiosas porque la prolongada circulación de la composición en la sangre prolonga considerablemente el efecto terapéutico del agente terapéutico. Para lograr un efecto terapéutico, el agente terapéutico debe separarse lentamente o dejar al vehículo polimérico. Esto se puede conseguir mediante la unión o colocación separada de una membrana semipermeable alrededor del vehículo para formar una vesícula, permitiendo que el medicamento concentrado en las zonas próximas al vehículo polimérico se difunda lentamente a través de la membrana y dentro del espacio intravascular. Las composiciones de esta invención que incluyen agentes terapéuticos se pueden administrar de forma intravascular o por inyección de bolus.
Las composiciones de esta invención se describen en los siguientes ejemplos y en el apartado de experimentos que componen la forma de realización de la presente invención y no se debe pensar que limitan el alcance de la invención.
Ejemplos y resultados de los experimentos Ejemplo 1 Síntesis de PEG-poli-l-lisina (300)-DTPA, producto I Síntesis de succinato de MPEG
Disolver 6,5 g de MPEG (MW 2000) en 25 ml de dioxano libre de peróxido a 60ºC y mezclar con una solución precalentada de 1,6 g de anhídrido succínico en un exceso molar de 5 partes en 25 ml de dioxano. Disolver 300 mg de N,N'-dimetilaminopiridina como catalizador en 10 ml de dioxano y añadir a la mezcla de la reacción. Incubar la mezcla hasta 90ºC durante 5 horas.
Eliminar el dioxano mediante evaporación giratoria a 40ºC y disolver el sólido en una cantidad mínima, por ejemplo 7-10 ml, de cloruro de metileno, enfriar a -10ºC y filtrar con un filtro de vidrio poroso para eliminar el precipitado de ácido succínico. Añadir 300 ml de éter etílico por cada 5 ml de filtrado y mantener la solución turbia a -20ºC para precipitar el succinato de MPEG. Filtrar el precipitado con un filtro de vidrio poroso y lavar con éter etílico.
Disolver 5,6 g del precipitado seco con 40 ml de agua y pasar por una resina AG 50W X8 (15 g de resina húmeda tratada con 50% de etanol y agua desionizada) en un filtro de vidrio poroso de 30 micrómetros para eliminar el catalizador restante.
Se obtuvo una muestra de 5 g de succinato de MPEG2000 (86% de producto) como sólido amorfo blanco. El Rf era de 0,8 en placas 60 TLC de gel de sílice (de EM Sciences) (desarrollado mediante una solución de cloroformo:metanol:15mM CaC12 en una proporción de 65:35:2). El Rf era de 0,5 en placas RP-18 TLC (de EM Sciences) en el mismo sistema después de teñirlo con vapor de yodo.
Síntesis de MPEG éster de succinil-N-hidroxisuccinimidil
Disolver el producto MPEG de succinato liofilizado (2 g, 0,5 mmol) en 10 ml de dioxano libre de peróxidos, que haya pasado la prueba de sensibilidad a los peróxidos. Secuencialmente, añadir 0,11 g N-hidroxisuccinimida (Fluka Chemie AG, Buchs, Suiza) y 0,15 g (0,55 mmol, 1,1 de exceso molar) de diciclohexilcarbodiimida (Fluka Chemie AG, Buchs, Suiza) a la mezcla. Agitar la mezcla de reacción durante 6 horas a temperatura ambiente y enfriar en hielo. Eliminar la diciclohexilurea mediante filtrado con un filtro de vidrio poroso o un filtro de fibra de vidrio GF-C. Eliminar el dioxano mediante un evaporador giratorio y añadir 10 ml de cloruro de metileno y mezclar con 100 ml de éter agitándolo continuamente. Almacenar el precipitado a -20ºC por la noche. Separar el producto mediante filtrado y recristalizar a partir de una mezcla de dicloroetano:éter en una proporción de 1:9.
Prueba para un éster activado de succinato de MPEG
El porcentaje del éster activado en sólido se determinó mediante la solubilización de 1,5 mg de producto en DMSO anhidro (100 \mul). Añadir 10 \mul de la solución a 800 \mul de fosfato sódico 0,05 M (pH 8,5). Registrar la absorbencia a 260 nm durante 30 minutos. Se produjo un aumento en la absorbencia debido a la hidrólisis del éster activado (e260=8260 [mol cm]-1 para N-hidroxisuccinimida a pH 8,5). Se observó que aproximadamente 75% de la composición obtenida era un éster activado. El Rf era de 0,95 en el gel de sílice 60 (desarrollado mediante una solución de cloroformo:metanol:15mM CaC12 en una proporción de 65:35:2) después de la visualización UV con vapores de amoniaco.
Síntesis de MPEG-poli-l-lisina-DTPA
Disolver 816 mg de poli-l-lisina (PL hidrobromuro, MW 67.700 (Sigma Chemical Co), DP:324 residuos de 
\hbox{l-lisina,}
grupos aminos épsilon 25 mM de l- lisina, hidrobromuro) en 38 ml de 0,1 M de carbonato (pH 8,7). Disolver 3,1 g de MPEG éster succinilhidroxisuccimidil (MPEGOSu, MW 2,200) en 15 ml de DMSO seco. Añadir la solución de MPEGOSu gota a gota a la solución de PL agitándolo e incubar la mezcla durante 2 horas agitándolo.
El grado de modificación se comprobó mediante la dosificación de ácido trinitrobenzenosulfónico, como se usó en Spadaro, A.C.C. y col. Anal. Biochem. 96:317 (1979). Mezclar 10 \mul de la muestra, 100 \mul de agua, 100 \mul de 10% tritón X-100, 100 \mul de 1M de tetraborato de sodio y 0,35 ml de 2 mg/ml de TNBS en un tubo. Incubar durante 45 minutos. Detener la incubación añadiendo 2,3 mg/ml de sulfato sódico en 5M NaH_{2}PO_{4}. La absorbencia se determinó a 420 nm y se comparó con la de PL. Se determinó que la cantidad de grupos modificados era igual al 30%.
Se preparó una suspensión de un anhídrido cíclico de DTPA (0,5g/ml en DMSO) añadiendo porciones de 200 \mul (1,5 g de cDTPA total) a la solución de PL y MPEG y se ajustó el pH a 8 con 5 N NaOH después de cada adición. Se volvió a comprobar la cantidad de grupos aminos dosificables y no se detectó ningún grupo libre de aminos.
Purificación de MPEG-poli-l-lisina-DTPA
Diluir la mezcla de reacción de MPEG-poli-l-lisina-DTPA (MPEG-PL-DTPA) a 300 ml con 0,2 M de citrato sódico (pH 6), filtrar con un filtro de nilón de 45\mu y dializar una célula transparente usando una membrana con corte de 100 kD (para proteínas globulares). Concentrar hasta 30-50 ml y diluir a 300 ml con citrato. Repetir el procedimiento 2 veces usando agua en lugar de citrato en la última fase. Concentrar la solución hasta 15 ml y liofilizar. Alternativamente, se puede filtrar la muestra a través de una membrana estéril de 0,2 \mum y almacenar a 4ºC. A continuación se muestra una tabla del análisis químico teórico y real:
Análisis químico
Teórico %C 46,7 %H 7,0 %N 8,0
Real %C 41,2 %H 6,4 %N 9,7
Ejemplo 2 Síntesis de MPEG(MW 5 kD)-poli-l-lisina (MW 25 kD)-DTPA, producto II Síntesis de succinato de MPEG
Disolver 40 g de MPEG (MW 5000) en 250 ml de dioxano libre de peróxidos a 60ºC y mezclar con una solución precalentada de 8 g de anhídrido succínico (exceso molar de 10 veces) en 50 ml de dioxano. Disolver 900 mg de N,N'-dimetilaminopiridina como catalizador en 10 ml de dioxano y añadir a la mezcla de reacción. Incubar la mezcla a 90ºC durante 8 horas.
Eliminar el dioxano mediante evaporación giratoria a 40ºC y disolver el sólido en 20 ml de cloruro de metileno, enfriar hasta -10ºC y filtrar con un filtro de vidrio poroso para eliminar el precipitado de ácido succínico. Añadir 300 ml de éter etílico por cada 10 ml de filtrado y precipitar la solución turbia de succinato de MPEG a -20ºC. Filtrar el precipitado con un filtro de vidrio poroso (10-20 \mu, Corning) y lavar con éter etílico frío.
Diluir 35 g del precipitado seco con 100 ml de agua y pasar por una resina AG 50W X8 (25 g de resina húmeda tratada con 50% de etanol y agua desionizada) en un filtro de vidrio de 100 micrómetros para eliminar el catalizador restante. Para reducir la cantidad que contamina los peróxidos, tratar la solución de succinato de MPEG2000 en agua con 10 nM de borohidruro de sodio durante 4 horas a temperatura ambiente. Liofilizar la solución, volver a disolver la solución en cloruro de metileno (0,1g/ml) y sedimentar de nuevo la solución añadiendo éter dietílico. Se obtuvo una muestra de 30 g de succinato de MPEG5000 (un 83% de producto) como sólido amorfo blanco. El Rf era de 0,5 en RP-18 TLC en placas (de EM Sciences) (desarrollado en una solución de cloroformo:etanol:agua en una proporción de 65:25:4) después de teñirlo con vapor de yodo.
Síntesis de MPEG éster de succinil-N-hidroxisuccinimidil
Disolver 5,29 g (1 mmol) del producto de succinato de MPEG liofilizado en 40 ml de tetrahidrofurano libre de peróxidos, que haya pasado la prueba de sensibilidad a los peróxidos, y añadir 0,17 g de N-hidroxisuccinimida (1,5 mmol, Fluka Chemia AG, Buchs, Suiza) y 0,3 g (1,1 mmol) de diciclohexilcarbodiimida (Fluka). Agitar la mezcla de reacción durante 6 horas a temperatura ambiente y, a continuación, enfriar en hielo. Eliminar la diciclohexilurea mediante filtrado con un filtro de vidrio poroso (20-30 \mu, Corning). Eliminar el tetrahidrofurano en un evaporador giratorio, añadir 10 ml de cloruro de metileno y mezclar con 100 ml de éter agitándolo continuamente. Precipitar a -20ºC durante la noche. Separar el producto mediante filtrado y recristalizar a partir de una mezcla de dicloroetano:éter en una proporción de 1:9.
Prueba para un éster activado de succinato de MPEG
El porcentaje del éster activado en sólido obtenido se determinó como se describe en el ejemplo 1.
Síntesis de PEG-poli-l-lisina-DTPA
Disolver 620 mg de poli-l-lisina (PL hidrobromuro, MW 41.100, (Sigma Chemical Co.) DP: 196 residuos de l-lisina, 25 mM grupos de aminos épsilon de l-lisina, hidrobromuro) en 112 ml de 0,1 M de carbonato (pH 8.7) Disolver 2,9 g de éster de metoxipolietilen glicolsuccinil-hidroxisuccimidil (MPEGOSu, MW 5.200) en 5 ml de DMSO seco. Añadir la solución de PEGOSu gota a gota a la solución de PL agitándolo e incubar la mezcla durante 2 horas sin dejar de agitar. Comprobar el grado de modificación mediante dosificación de ácido trinitrobenzenosulfónico como se describe en el ejemplo 1.
Preparar una suspensión de un anhídrido cíclico de DTPA (0,5g/ml en DMSO) añadiendo porciones de 200 \mul (1,5 g de cDTPA total) a la solución de MPEG-PL y ajustar el pH a 8 con 5 N NaOH después de cada adición. Alternativamente se puede preparar la solución mezclando 2,5 mmol de DTPA, 0,5 mmol de N-hidroxisulfosuccinimida (pH 4) y 0,5 mmol de etil diaminopropilcarbodiimida en 50 ml de agua. A continuación se mezcla la solución durante 3 minutos y se añade a la mezcla la solución de MPEG-PL (pH 8). Comprobar la cantidad de grupos aminos dosificables. (No se detectó ningún grupo amino dosificable).
Purificación de MPEG-PL-DTPA
Diluir la mezcla de reacción a 300 ml con 0,2 M de citrato sódico (pH 6), filtrar con un filtro de nilón de 45\mu y dializar una célula transparente usando una membrana con corte de 50 kD (para proteínas globulares). Concentrar hasta 30-50 ml y diluir a 300 ml con citrato. Repetir el procedimiento 2 veces usando agua en lugar de citrato en la última fase. Concentrar la solución hasta 15 ml y liofilizar. Alternativamente, filtrar la muestra a través de una membrana estéril de 0,2 \mum y almacenar a 4ºC. A continuación se muestra una tabla del análisis químico teórico y real:
Análisis químico
Teórico %C 51,2 %H 8,2 %N 2,7
Real %C 46,4 %H 7,8 %N 3,7
Ejemplo 3 Síntesis de MPEG-poli-l-lisina (MW 67 kD)-DTPA, producto III
Realizar la preparación según los procedimientos del ejemplo 1, usando poli-l-lisina con un MW medio de 110.000.
Ejemplo 4 Síntesis de MPEG-poli-l-lisina (MW 53,5 kD)-DTPA, producto IV
Realizar la preparación según los procedimientos de los ejemplos 1 y 2, usando poli-l-lisina con un MW medio de 87.400 y MPEG (MW 5000) succinil succinato.
Ejemplo 5 Síntesis de MPEG-poli-l-lisina (69)-(ditio)propionilpolil-l-lisina-DTPA, producto V
Disolver 50 mg de N-\varepsilon-benzoloxicarbonil-poli-l-lisina en 3 ml de dimetilformamida y trátelo con 10 mg de N-succinimidil 3-(2-piridilditio) propionato en presencia de 20 \mul de trietilamina. Incubar el producto durante la noche y precipitar añadiendo 20 ml de agua. Secar por congelación el producto precipitado y dividir en dos partes iguales. Volver a disolver la primera parte en dimetilformamida (0,5 ml) y tratar durante 20 minutos con 10 mM beta-mercaptoetanol y precipitar añadiendo 10 ml de agua saturada con nitrógeno y secar por congelación. Disolver de nuevo este producto junto con la segunda parte del compuesto en 2 ml de dimetilformamida y añadir 5 \mul de trietilamina. Agitar la mezcla a temperatura ambiente durante la noche. Precipitar el producto y lavar con agua, a continuación disolver de nuevo el producto en 1 ml de un HBr en una solución de ácido acético cristalizado, incubar durante 1 hora y mezclar con 20 ml de éter etílico destilado. Lavar el precipitado con éter y convertirlo en un derivado de MPEG y, después, en un derivado de MPEG-DTPA como se describe en el ejemplo 1, usando DMFA en lugar de DMSO para solubilizar MPEG-succinil succinato y DTPA anhídrido cíclico.
Ejemplo 6 Preparación de productos marcados [^{111}ln] I, II, III o IV
Preparar 100-500 \mul de solución de citrato [^{111}ln] (pH 4,5) con actividad total de 30-500 \muCi. Disuelva 1 mg de productos I, II, III o IV como se ha preparado anteriormente en solución salina de equilibrio de citrato (CBS) de 10 mM de citrato, 0,15 M NaCl (pH 6,6). Mezclar las soluciones e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Purificar mediante diálisis con 4 cambios de 100 ml de CBS. Se halló que el producto dializado incorporaba 98-100% de la radioactividad.
Ejemplo 7 Preparación de productos marcados de gadolinio I, II, III o IV
Preparar 100 ml de 20 mM de solución GdCl_{3} en 0,2 M de citrato (pH 5,5). Disolver 0,1-100 mg de productos I, II, III o IV en 1,5 ml de agua y poner en bolsas de diálisis con poros lo suficientemente pequeños para retener moléculas mayores de 10 kD. Poner las bolsas de diálisis en la solución de citrato-Gd durante 8-10 horas. A continuación, sustituir la solución de citrato-Gd por 0,2M de citrato y, por último, con 100 mM de solución salina (la osmolaridad es 300 mOsm). Esterilizar mediante filtrado y liofilizar los productos marcados de gadolinio.
Ejemplo 8 Preparación de productos marcados de [^{111}ln] y de gadolinio I,II,III o IV
Preparar según los procedimientos del ejemplo 4 y, a continuación, transferir las bolsas de diálisis a la solución de citrato-Gd como se describe en el ejemplo 7.
Ejemplo 9 Purificación de productos marcados I, II, III o IV
Se preparó una solución de productos marcados de gadolinio o [^{111}ln] y de gadolinio en 50-100 mg de polímero/ml de 5 mM de citrato sódico (pH 6). Cargar la solución en una columna de Sephadex A-25 (1 x 40 ml, 5 mM de citrato, pH 6) y eluir material no enlazado con el mismo reactivo que se ha recogido, dializado con agua y liofilizado.
Aunque los ejemplos anteriores presentan pautas generales y específicas para la preparación y uso de los agentes de contraste de esta invención, un experto en la materia puede reunir moléculas candidatas adicionales y comparar sus características con las que reivindica esta invención.
Caracterización experimental de productos Determinación del tamaño
Los radios hidrodinámicos aparentes se determinaron usando filtración en gel en una columna de Ultragel AcA-34 (de LKB-IBF, Francia) (1x40 ml) y LALLS (analizador de partículas submicrónicas N-4MD de Coulter, Hialeah, FL).
Se prepararon soluciones de productos I-IV en fórmulas marcadas de Gd en 1 mg de polímero/ml y se determinaron los tamaños mediante el análisis de peso del procesador de distribución de tamaño (SDP) en un ángulo de 90º dispersando antes y después de la formación de los complejos Gd (Ver Tabla 1). El cálculo de los pesos moleculares se basó en la determinación del grado de modificación de PL con MPEG, como se describe en el ejemplo 1, asumiendo que en la segunda fase de la modificación se sustituyeron todos los grupos aminos por DTPA.
TABLA 1
Determinación del tamaño y el peso molecular
Producto Diámetro MW (LALLS) MW aparente MW calculado
(LALLS) (AcA34)
I 15,5\pm1 nm 171 kD 200 kD 417 kD
II 16,4\pm4 nm 150 kD 280 kD 412 kD
III 38,1\pm10,5 nm ND >380 kD 860 kD
IV 53\pm12 nm ND >380 kD 960 kD
Nota: La columna AcA 34 se precalibró con marcadores de peso molecular de
proteínas globulares; ND: no hay datos disponibles
Determinación del contenido de Gd
El contenido de Gd se determinó de forma dosificada, (como en Korbl, J. Pribil, R., análisis químico 45:101-103 (1956)) o mediante espectroscopia de emisión de plasma (de Gallbraith Labs, Knoxville TN). El contenido de Gd no excedió el 13,18% por peso (0,8 mmol Gd/g polímero, producto I). Normalmente, los productos II, III y IV contenían aproximadamente 5% Gd por peso (0,32 mmol Gd/g polímero).
Medición de los valores de relaxividad (R1 y R2)
La determinación de los tiempos de relajación de los protones H_{2}O se llevó a cabo usando un espectrómetro NMR pulsado Minispec (IBM PC/20) a 20 MHz, 38ºC. Se diluyeron, como convenía, productos marcados de Gd con CBS y se midieron los parámetros de T1 y T2. Se usaron las secuencias de recuperación de la inversión y de pulso CPMG para determinar los valores T1 y T2 respectivamente. Se registraron las dependencias de concentración de los índices de relajación 1/T1 y 1/T2 y se ajustaron usando regresión lineal (r=0,99). Los valores R1 y R2 se determinaron como valores de pendiente (Ver Tabla 2).
TABLA 2
Relaxividades molecular y atómica
Producto R1 R2 R1/Gd R2/Gd (mMol-1 s-1)
I 5061 5053 18,1 16,9
II 2076 2035 17,6 17,1
IV 4565 6547 18,5 19,0
Se usaron valores calculados de pesos moleculares de productos marcados de Gd para determinar la relaxividad molecular.
En las siguientes reivindicaciones se incluyen otras formas de realización.

Claims (33)

1. Una composición médica biocompatible que incluye un vehículo polimérico caracterizada porque además comprende una pluralidad de cadenas protectoras unidas al vehículo polimérico y uno o más grupos de referencia unidos al vehículo polimérico y porque el citado grupo de referencia es una complexona o un grupo terapéutico, protegiendo las cadenas protectoras al vehículo polimérico y al grupo de referencia del contacto con otras macromoléculas mediante la unión extensiva de agua con las cadenas protectoras.
2. Una composición según la reivindicación 1, caracterizada además porque tiene la fórmula:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \+ O \+ \+ O\+\cr  \+ \hskip0.5mm || \+  \+ ||\+\cr 
[[-- \hskip-2mm \+C--NH-- \hskip-2mm \+CH--][-- \hskip-2mm \+
C--NH-- \hskip-2mm \+CH--]] _{k} \cr  \+
\+ \hskip1mm | \+ \+ \hskip1mm |\cr  \+ \+ R _{1} 
\+ \+
R _{2} \cr}
donde los grupos
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \+ O \+ \+ \+ \+ O\+\cr  \+ \hskip0.5mm || \+ \+ \+
\+ \hskip0.5mm ||\+\cr 
[-- \hskip-2mm \+C--NH-- \hskip-2mm \+CH--]
\+  \hskip0.5cm  y   \hskip0.5cm  \+
[-- \hskip-2mm \+C \hskip-0.3mm --NH-- \hskip-2mm \+CH--]\cr
 \+ \+ \hskip0.5mm | \+ \+ \+ \+ \hskip0.5mm |\cr 
\+ \+ R _{1}  \+ \+ \+ \+
R _{2} \cr}
se pueden unir en cualquier orden, donde K es 100-560;
R_{1} es (CH_{2})_{4}NHCO(CH_{2})_{n}COOCH_{2}CH_{2}A-B-OR_{3}, donde n es 2-6;
A es [OCH_{2}CH_{2}]_{x} donde x es 15-220;
B es [OCH_{2}CH_{2}]_{x} o [OCH(CH_{3})CH_{2}]_{y}, donde y + x es 17-220;
R_{2} es un grupo quelante y
R_{3} es H, (CH_{2})_{y}CH_{3} o (CH_{2})_{y}COOH e y es 0-7.
3. Una composición según la reivindicación 1, caracterizada además porque el vehículo polimérico es un poliaminoácido, polietileneiaminas, sacáridos naturales, polisacáridos aminados, oligosacáridos aminados, poliamidoamino, ácidos poliacrílicos o polialcoholes.
4. Una composición según la reivindicación 3, caracterizada además porque el vehículo polimérico es un poliaminoácido que tiene 20-560 unidades de aminoácidos.
5. Una composición según la reivindicación 3, caracterizada además porque el vehículo polimérico es un poliaminoácido que es un polímero de una sola especie de aminoácidos.
6. Una composición según la reivindicación 3, caracterizada además porque el vehículo polimérico es un poliaminoácido que es un polímero de, al menos, dos especies diferentes de aminoácidos.
7. Una composición según la reivindicación 3, caracterizada además porque el vehículo polimérico es un poliaminoácido que es un copolímero de bloque.
8. Una composición según la reivindicación 3, caracterizada además porque el vehículo polimérico es un poliaminoácido que comprende fragmentos de poliaminoácidos unidos por enlaces divisibles, preferiblemente enlaces 
\hbox{S-S.}
9. Una composición según la reivindicación 3, caracterizada además porque el vehículo polimérico es un poliaminoácido que es poli-l-lisina, poli-d-lisina, poli-alfa, beta-(2-aminoetil)-D, L aspartamida o ácido poli-l-aspártico.
10. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque al menos una de las cadenas protectoras es polietilen glicol, metoxipolietilen glicol, metoxipolipropileno glicol, un copolímero de polietilen glicol, metoxipolietilen glicol o metoxipolipropileno glicol o un derivado de cualquiera de ellos.
11. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada además porque al menos una de las mencionadas cadenas protectoras es un copolímero de bloque de polietilen glicol y uno de poliaminoácidos, polisacáridos, poliamidoaminas, polietilenaminas o polinucleidos.
12. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada además porque al menos una de las cadenas protectoras es un copolímero de polietilen glicol que comprende un monoéster de un ácido dicarboxílico.
13. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque al menos una de las cadenas protectoras tiene un peso molecular de 500-10.000 daltons.
14. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque el grupo de referencia es una complexona que une cationes.
15. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizada además porque el grupo de referencia es un grupo piridilditioacil o un grupo diazo- o hidrazo-.
16. Una composición según la reivindicación 15, caracterizada además porque el grupo de referencia es un grupo piridilditioacil que es un grupo N-(2-piridilditio)propionil, N-hidroxisuccinimidil, N-hidroxisulfosuccinimidil, imidazolil, benzotriazolil, aminoalquilo, aldehído, tioaiquil, tiolano, acilo haloideo, alquilo haloideo o fenilo haloideo.
17. Una composición según la reivindicación 15, caracterizada además porque el grupo de referencia es un grupo diazo- o hidrazo- que es un grupo 4-hidrazionoxietil, 4-hidrazinobencil, diasirinil, azidofenil o acidoalquilo.
18. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizada además porque el mencionado grupo de referencia es una molécula que contiene flúor.
19. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizada además porque el mencionado grupo de referencia comprende un agente de contraste, preferiblemente un elemento paramagnético o superparamagnético.
20. Una composición según la reivindicación 14, caracterizada además porque comprende un radionucleido de emisión de rayos alfa-, beta- o gamma- unido al mencionado grupo quelante.
21. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizada además porque el mencionado grupo de referencia comprende un agente terapéutico, preferiblemente un medicamento citostático, antibiótico, hormonal, analgésico, psicotrópico, antiinflamatorio, antivírico o antifúngico o una linfocina.
22. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizada además porque el grupo de referencia es un polímero que contiene silicio, azufre o carbono, un coloide de óxido de silicio, una partícula coloidal o un precipitado.
23. Una composición según la reivindicación 22, caracterizada además porque el grupo de referencia es un precipitado coloidal que incluye un óxido, sulfuro o hidróxido de un elemento de transición o lantánido con números atómicos 21-29, 42, 44 ó 57-71.
24. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque comprende un grupo diana, preferiblemente un anticuerpo, fragmento de un anticuerpo, anticuerpo quimérico, enzima, lectina o un ligando sacárido; estando unido el grupo diana al mencionado vehículo polimérico, a una de las cadenas protectoras o a ambos.
25. Un procedimiento para preparar una composición según la reivindicación 1, que comprende la unión del mencionado vehículo polimérico con la mencionada pluralidad de cadenas protectoras para producir un vehículo protegido y la unión del mencionado vehículo polimérico protegido con el mencionado grupo de referencia.
26. Un procedimiento según la reivindicación 25 en el que al menos una de las mencionadas cadenas protectoras comprende un análogo de metoxipolietilen glicol y la unión del mencionado vehículo polimérico con el mencionado análogo produce un gel semiestable.
27. Un procedimiento según la reivindicación 26 que comprende además la unión de un grupo diana al mencionado vehículo, a la pluralidad de cadenas protectoras o a ambos de la mencionada composición.
28. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 para su uso en el tratamiento de una enfermedad mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de la mencionada composición a un paciente y la exploración del paciente usando una técnica de formación de imágenes que puede detectar al mencionado grupo de referencia para obtener una imagen visible de la distribución de la mencionada composición.
\newpage
29. Uso de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 para la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz del mencionado medicamento a un paciente y la exploración del paciente usando una técnica de formación de imágenes que puede detectar al mencionado grupo de referencia para obtener una imagen visible de la distribución del mencionado medicamento.
30. Una composición según la reivindicación 28 o uso de una composición según la reivindicación 29, en la que la mencionada administración es por inyección intravascular o intraperitoneal.
31. Una composición según la reivindicación 28 o uso de una composición según la reivindicación 29, en la que la mencionada técnica de formación de imágenes es imágenes por resonancia magnética, imágenes de medicina nuclear, tomografía de emisión positrónica o tomografía computerizada de emisión simple de fotones.
32. Una composición según la reivindicación 28 o uso de una composición según la reivindicación 29, en la que el tratamiento de una mencionada enfermedad comprende la exploración de un vaso submilimétrico del paciente para obtener una imagen visible del vaso submilimétrico.
33. Una composición según la reivindicación 28 o uso de una composición según la reivindicación 29, en la que el mencionado grupo de referencia comprende gadolinio suministrado en una dosis inferior a 0,05 mmol Gd/kg de peso corporal del paciente.
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