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Die Erfindung betrifft eine biokompatible
medizinische Zusammensetzung.
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Beispiele von erfindungsgemäßen Zusammensetzungen,
die im Folgenden in Einzelheiten beschrieben werden, umfassen therapeutische
oder diagnostische Mittel mit verlängerter Blut-Halbwertszeit,
niedriger Toxizität
und niedriger Immunogenität,
und sie können
detektiert werden durch medizinische Abbildungsverfahren, beispielsweise
Kernspintomographie für
die Angiographie und Markierungen für die gezielte Abgabe.
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Kontrastmittel
für die
Kernspintomographie
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Die genaue Detektion von Abnormalitäten in einem
Patientenkörper
ist eine wesentliche Voraussetzung für die Diagnose und die geeignete
Behandlung einer Krankheit. Visualisierungsverfahren, beispielsweise
Kernspintomographie (MRI), werden für die akurate Detektion immer
wichtiger. MRI ist nicht-invasiv und es fordert kein Aussetzen der
Menschen gegenüber
potentiell schädlicher
Strahlung. Bei der MRI können
Gewebe unterschiedlichen Ursprungs, wie normales und abweichendes
Gewebe, beispielsweise kanzerogene Gewebe, auf der Basis der Unterschiede
in den Relaxationszeiten T1, dem Spin-Gitter oder der longitudinalen Relaxationszeit,
oder T2, dem Spin-Spin oder der transversalen Relaxationszeit, differenziert
werden. Wegen dieser Unterschiede wird eine Differential-Signal-Intensität gebildet,
die verschiedene Kontrastgrade bei MR-Bilder ergibt. Je größer der
Unterschied in T1 oder T2 ist, umso ausgeprägter ist der Kontrast. Jedoch
ist in vielen Fällen
abgestorbenes oder abweichendes Gewebe isointensiv, d.h. das abgestorbene
oder abweichende Gewebe besitzt die gleiche Signalintensität wie normales
Gewebe und ist daher von normalem Gewebe ohne die Verwendung spezieller
Kontrastmittel nicht unterscheidbar.
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Wenn MR-Abbildungsverfahren verwendet
werden um Blutperfusionsdefekte aufzuklären, so basieren sie auf der
Differenzierung des strömenden
Bluts von den stationären
Umgebungsgeweben (beispielsweise MR-Angiographie (MRA)). Diese dreidimensionalen
Angiographie-Verfahren, beispielsweise "Time of Flight" (TOF) (Zeitpunkt
der Flucht) und "Phasenkontrast"(PC)-Verfahren ergeben genaue Bilder
der intracranialen Gefäße. Jedoch
hängt die
traditionelle MRA, d. h. Time of Flight MRA, von der Strömungsgeschwindigkeit
und der Strömungsform
ab und daher ist es im Allgemeinen unmöglich, Hochqualitäts-Angiographie
von peripheren Gefäßen mit
hohem Strömungswiderstand
zu erhalten, bedingt durch eine Wirkung, die als Gefäßsättigung bekannt
ist. Zur Beseitigung dieser Schwierigkeit wurden Kontrastmittel
verwendet um die Relaxationszeit des Bluts selektiv zu erniedrigen.
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Gadolinium(III)-diethylentriaminpentaessigsäure (Gd-DTPA)dimeglumin
ist ein vielfach verwendetes Kontrastmittel, welches relativ klein
(MW 538) ist und tritt aus dem Gefäß beim ersten Durchgang durch
die Kapillaren aus. Jedoch ist die Verwendung von Gd-DTPA für die MR-Angiographie
in allen Organen, ausgenommen im Gehirn, beschränkt, da die Blut-Halbwertszeit
von Gd-DTPA geringer ist als 20 Minuten und die biologische Halbwertszeit
im Menschen von Gd-DTPA etwa 90 Minuten beträgt. Die Extravasation ergibt
eine schnelle Abnahme im Gefäß-Muskelsignal-Verhältnis, wodurch
die genaue Detektion von Abnormalitäten und von Krankheit schwierig
wird. Weiterhin ist Gd-DTPA-Dimeglumin, welches in der klinischen
Praxis verwendet wird, immunogen, wodurch eine wiederholte Verabreichung
an den gleichen Patienten nicht begünstigt wird.
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Ähnliche
Probleme treten bei der Verwendung von Ferrioxamin-B als Kontrastmittel
auf. Weiterhin verursacht Ferrioxamin-B einen steilen Abfall im
Blutdruck nach seiner intravenösen
Verabreichung.
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MRI-Kontrastmittel, die unter Verwendung
natürlicher
oder synthetischer Makromoleküle
erzeugt wurden, besitzen den Vorteil der hohen molekularen Relaxivität, bedingt
durch mehrere Chelatbildungsgruppen, gekuppelt an ein einziges Polymer-Grundgerüst. Diese
Gruppen können
paramagnetische Kationen, beispielsweise in Gd-DTPA-Poly-1-lysin
in Chelatform überführen oder
sie können
eine hohe Relaxivität,
bedingt durch die Anwesenheit von Eisenoxid, beispielsweise in Eisen-enthaltenden
Kolloiden, ergeben. Jedoch besitzen Kolloide auf Eisenoxidgrundlage
ihre eigene Ligandenunabhängige
spezifische Stelle der Akkumulation im Körper, d. h. in der Leber, in
der Milz und in lymphoiden Geweben.
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Chelatbildende Gruppen können an
einer Vielzahl von natürlichen
Polymeren, beispielsweise Proteinen und Polysacchariden, und synthetischen
Polymeren, angelagert sein. Die chemische Anheftung, beispielsweise
durch Konjugation von DTPA an Rinderserumalbumin, ergibt ein makromolekulares
Kontrastmittel, das für
einige Anwendungen, beispielsweise NMR-Angiographie, geeignet ist,
aber wegen der effizienten Erkennung des modifizierten Albumins
durch Makrophagen und wegen der Albuminrezeptoren an Endothelzellen
besitzt dieses Kontrastmittel eine kurze Blut-Halbwertszeit. Es
ist weiterhin immunogen und toxisch für Retikuloendothelial-Systemorgane. Daher
ist die Verwendung für
die MR-Abbildung
beschränkt.
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Ein Weg, um die Antigenität von Albumin
zu verringern, besteht in der Maskierung mit natürlichen und synthetischen Polymeren,
beispielsweise Spacer-Armen, durch kovalente Anheftung, aber es
bleiben nur wenige reaktive Gruppen in dem Proteinkügelchen
zurück,
die für
die Bindung der Che late und der paramagnetischen Kationen erforderlich
sind. Daher ist die Verwendung solcher Komplexe bei der MR-Abbildung beschränkt.
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Synthetische Polymere von 1-Aminosäuren, wie
Poly-1-Lysin (PL), sind eine Alternative für modifizierte natürliche Proteine
als Grundgerüste
für Kontrastmittel.
PL, modifiziert mit DTPA, kann als Radionuklidträger für Antikörpervermitteltes Targeting
in der Nuklearmedizin verwendet werden. Poly-1-lysin-DTPA, d. h.
Poly-1-lysin mit DTPA-Gruppen,
gebunden an die ε-Aminogruppen
von Lysinresten, wurde als Gd-Komplexon vorgeschlagen, d. h. eine
Verbindung, die einen Komplex mit Gd bildet, für die Verwendung in der MR-Angiographie.
Es ist ebenfalls bekannt, dass die Toxizität von DTPA-Poly-1-lysin geringer
ist als die von DTPA-Albumin. Jedoch werden DTPA-Gruppierungen an
DTPA-Polylysin durch
Leber-Kupfer-Zellen und einige Nierenzellen erkannt, vermutliche
glomerulonephrale Phagozyten, wodurch eine beschleunigte und relativ
schnelle Entfernung des Kontrastmittels aus dem Blut verursacht
wird. Beispielsweise werden 90% des intravenös injizierten Mittels, beispielsweise
Poly-1-lysin-DTPA-(Gd) (MW 48,7 kD) aus dem Kreislauf in 1 Stunde
entfernt (t1/2 = 0,134 h) und in den Nieren,
der Leber und den Knochen akkumuliert. Weiterhin kann die Synthese
von DTPA-Poly-1-lysin mit einem Vernetzungsmittel, beispielsweise
cyclischem Anhydrid von DTPA, durchgeführt werden. Als Ergebnis ist
es schwierig, die Bildung von vernetzten Produkten mit relativ hohem
Molekulargewicht zu vermeiden und das erhaltene Präparat ist
heterogen.
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Stickstoff-enthaltende Polymere,
beispielsweise Polyethylenimin, wurden mit monofunktionellen Derivaten
der Essigsäure
unter Bildung eines Moleküls
modifiziert, bei dem der Grundgerüst-Stickstoff und die Essigsäurereste
bei der Komplexbildung mit dreiwertigen Kationen teilnehmen. Wegen
der extensiven unerwünschten
Akkumulation in der Leber werden paramagnetische Komplexe von Polyethyleniminoessigsäure nicht
vielfach bei der MRI verwendet.
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Polymere Kontrastmittel, beispielsweise
sterngespaltene Dendrimere, sind eine getrennte Familie von Makromolekülen mit
beschränkten
potentiellem Wert als Kontrastmittel. Es wurde nicht gezeigt, dass
diese Familie von Mitteln biokompatibel ist, und daher ist der Wert
bei der in vivo Abbildung beschränkt.
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Verschiedene Chelatbildner auf Polysaccharidbasis
wurden kürzlich
vorgeschlagen. Jedoch schließt ihr
Aktivierungskomplement, von dem gezeigt wurde, dass es ein Merkmal
der Polysaccharide ist, ihre ausgedehnte Verwendung bei der MR-Abbildung
aus.
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Mittel mit verlängerter
Blut-Halbwertszeit
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Die Blut-Halbwertszeit und die Immunogenität sind wesentliche
Charakteristika von irgendwelchen Kontrastmitteln, die für die Therapie
oder medizinische Diagnose bestimmt sind. In einigen Fällen, wie
bei der Enzym-Ersatztherapie, beschränken die schnelle Eliminierung
der therapeutischen Mittel aus dem Kreislauf und die Akkumulation
in Antigen enthaltenden Zellen ihre potentielle Verwendung bei der
Behandlung von Krankheiten. Zur Beseitigung dieser Schwierigkeit
wurde vorgeschlagen, die makromolekularen Mittel, beispielsweise
die Enzyme, mit verschiedenen natürlichen und synthetischen Polymeren
chemisch zu modifizieren. Dextrane, synthetische Polyaminosäuren und
Polyethylenglykole werden am häufigsten
verwendet. Jedoch sind nur Polyethylenglykol (PEG) und sein Monomethylester
(MPEG) geeignet, die Blut-Halbwertszeit zu verlängern und gleichzeitig die
Immunogenität
des therapeutischen Mittels zu erniedrigen. Der Grund für die Modifizierung
der antigenen Determinanten durch MPEG kann durch Screenen der elektrostatischen
Ladung des geschützten
Mikromoleküls,
beispielsweise des Proteins, und durch die Fähigkeit, zahlreiche Bindungen mit
Wasser in Lösungen
zu bilden, erklärt
werden.
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Ungefähr drei Wassermoleküle sind
mit jeder Ethylenoxideinheit assoziiert und bilden eine unmittelbar benachbarte
Wasser-Mikroumgebung für
das Polymer. Dadurch werden in großem Ausmaß die absorptiven Zwischenwirkungen
der Proteine und Zellen mit PEG-Ketten verhindert. Die Verwendung
von PEG in aktiverten Formen, beispielsweise als 4,6-Dichlor-s-triazin-aktiviertes
PEG oder MPEG, ist für
die Proteinmodifizierung unerwünscht,
da das aktivierte Produkt mit Nebenprodukten kontaminiert ist, und
stark feuchtigkeitsempfindlich ist. Stabile und praktisch nichtbioabbaubare
Bindungen wurden durch Konjugation von MPEG, beispielsweise durch
Umsetzung von 4,6-Dichlor-s-triazin und 1,1'-Carbonyldiimidazol
mit Aminogruppen, gebildet.
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PEG und MPEG werden in Kontrastmitteln
für die
medizinische Abbildung verwendet. Kovalente Modifizierungen von
Desferroxamin-B mit MPEG verbessern die Körpertoleranz von solchen Kontrastmitteln
in vivo, aber ergeben keine nennenswerte Änderung in der Abbildungs-Effizienz.
Kontrastmittel, die MPEG oder PEG als Komponente paramagnetischer
Gemische oder in vernetzten paramagnetischen Polymeren enthalten,
wurden ebenfalls verwendet.
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Ziel-Kontrastmittel
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Kontrastmittel, die auf die Stellen
des Interesses gerichtet sind, helfen, die Wirksamkeit von MR-Abbildungsverfahren
zu erhöhen.
Solche diagnostische Mittel können
Kombinationen aus einem Liganden und einem paramagnetischen Kontrastmittel,
gekuppelt durch starke Wechselwirkung, beispielsweise durch eine kovalente
chemische Bindung, enthalten. Nach der systemischen Anwendung akkumulieren
solche Kontrastmittel an der Zielstelle, die durch die Ligandenspezifität bestimmt
wird. Als Ergebnis unterscheidet sich die Akkumulationsstelle leicht
von dem Umgebungsgewebe, da sie hyper- oder hypointensiv auf MR-Bildern
erscheint. Der Ligand, welcher das Kontrastmittel an die Zielstelle
dirigiert, kann für
Rezeptoren an entweder normalen oder transformierten Zellen eines
gegebenen Organs oder Gewebes spezifisch sein. Im ersten Fall wird das
Kontrastmittel in normalem Gewebe akkumuliert, im zweiten Fall wird
es in dem veränderten
Gewebe akkumuliert.
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Der Erfolg bei der Entwicklung von
Ziel-Kontrastmitteln ist hauptsächlich
durch die folgenden Eigenschaften bestimmt: 1. die betonte starke
Affinität
an die Zielstelle; 2. Antigenität,
d. h. die Fähigkeit,
durch das Kapillar-Endothelium
hindurchzugehen; und 3. die Blut-Halbwertszeit des Liganden oder
des Ziel("Vektor")-Moleküls.
Die Kupplung eines Kontrastmittels an das Ziel-Ligandenmolekül, d. h.
ein Antikörper
oder seine Fragmente, wodurch ein Ziel-Kontrastmittel erzeugt wird,
beispielsweise ein paramagnetisches chelatiertes Kation, ein paramagnetisches
Kolloid oder eine Kombination aus Chelat, paramagnetischem Kolloid,
konjugiert an das Zielmolekül,
erniedrigt typischerweise den potentiellen Wert aus irgendeiner
Reihe von Gründen, beispielsweise
der erniedrigten betonten Affinität gegenüber der Zielstelle, einer erhöhten Antigenität oder einer
erniedrigten Halbwertszeit. Beispielsweise wird das Kuppeln eines
kleinen Antikörperfragments,
beispielsweise eines chimären
Fab- oder Fv Moleküls
an ein großes
paramagnetisches Molekül,
beispielsweise ein DTPA-Polymer, oder ein superparamagnetisches
Kolloid, beispielsweise Eisenoxid, unter Bildung eines Ziel-Kontrastmittels
die Immunantwort des Rezipienten-Organismus wegen der Adjuvanseigenschaften
des Mittels selbst gegenüber
dem Mittel erhöhen.
Das paramagnetische Molekül
oder Kolloid selbst kann durch die opsonierenden Proteine des Rezipienten-Organismus erkannt
werden und das Kontrastmittel kann in Retikuloendothial-Systemorganen
eingeschlossen werden. Als Folge wird das Kontrastmittel aus dem
Kreislauf durch die Leber und die Milz entfernt, bevor irgendeine
wesentliche Konzentration an der Zielstelle erreicht wird. Weiterhin
kann ein solches Kontrastmittel als fremdes Antigen erkannt werden,
welches die Erzeugung unerwünschter
Wirts-Antikörper verursachen
kann.
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In der EP-A-397307 wird ein wassserlösliches
Blockcopolymer-Arzneimittelpräparat
beschrieben, umfassend ein hydrophiles Segment, beispielsweise Polyethylenglykol,
und ein hydrophobes Segment, beispielsweise Polyasparaginsäure, mit
einem Arzneimittel, wie Adriamycin, gebunden an das hydrophobe Segment.
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Erfindungsgemäß wird eine biokompatible medizinische
Zusammensetzung einschließlich
eines polymeren Trägers
zur Verfügung
gestellt und weiter dadurch charakterisiert, dass sie eine Vielzahl
von Schutzketten, gebunden an den polymeren Träger, und eine oder mehrere
Reportergruppen, gebunden an den polymeren Träger, enthält und dass die Reportergruppe
ein Komplexon oder eine therapeutische Gruppe ist, wobei die Schutzketten
den polymeren Träger
und die Reportergruppe vor Kontakt mit anderen Makromolekülen durch
extensive Bindung von Wasser an die Schutzketten schützen.
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Der polymere Träger kann ausgewählt werden
aus Polyaminosäuren,
Polyethyleniminen, natürlichen Sacchariden,
aminierten Polysacchariden, aminierten Oligosacchariden, Polyamidoamin,
Polyacrylsäuren oder
Polyalkoholen.
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Der polymere Träger kann aus Polyaminosäuren, Polyethyleniminen,
natürlichen
Sacchariden, aminierten Polysacchariden, aminierten Oligosacchariden,
Polyamidoamin, Polyacrylsäuren
oder Polyalkoholen ausgewählt
werden.
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Gegenstand der Erfindung ist weiterhin
eine Zusammensetzung der Formel:
Gruppen in jeder beliebigen
Reihenfolge verknüpft
sein können,
beispielsweise die R
1-Einheit kann mehrere Male
in der Kette wiederholt werden, bevor eine R
2-Einheit
auftritt und vice versa; worin k 100 bis 560 bedeutet; R
1 (CH
2)
4NHCO(CH
2)
nCOOCH
2-CH
2-A-B-OR
3 bedeutet,
worin n 2 bis 6 bedeutet; A [OCH
2CH
2]
x ist, worin x
15 bis 220 bedeutet; B [OCH
2CH
2]
x oder [OCH(CH
3)CH
2]
y bedeutet, worin
y + x 17 bis 220 bedeuten; R
2 eine Chelatgruppe
bedeutet; und R
3H, (CH
2)
yCH
3 oder (CH
2)
yCOOH bedeutet
und p 0 bis 7 bedeutet.
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In dieser Zusammensetzung kann die
Chelatgruppe (bzw. chelatbildende Gruppe) beispielsweise Diethylentriaminpentaessigsäure, 1,4,7,10-Tetraazacyclodo-decan-N,N',N'',N'''-tetraessigsäure, 1,4,7,10-Tetraazacy-clododecan-N,N',N''-triessigsäure, Ethylenbis(oxyethylennitrilo)tetraessigsäure oder
Ethylendiamintetraessigsäure
sein.
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Die Polyaminosäure der Zusammensetzung enthält bevorzugt
20 bis 560 Aminosäureeinheiten,
besitzt ein Molekulargewicht von 1000, bis 100.000 Dalton und ist
bevorzugt nichtproteinartig. Die Polyaminosäure kann ein Polymer aus einer
einzigen Spezies oder aus mindestens zwei unterschiedlichen Spezies
von Aminosäuren
oder ein Blockcopolymer sein.
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Die Polyaminosäure kann umfassen Polyaminosäurefragmente,
gebunden durch spaltbare Bindungen, beispielsweise S-S-Bindungen. Insbesondere
kann die Polyaminosäure
beispielsweise sein Poly-1-lysin, Poly-d-lysin, Poly-alpha, beta-(2-aminoethyl)-D,L-aspartamid
oder Poly-1-asparaginsäure.
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Die Schutzketten der Zusammensetzung
können
sein beispielsweise Polyethylenglykol, Methoxypolyethylenglykol,
Methoxypolypropylenglykol, ein Copolymer von Polyethylenglykol,
Methoxypolyethylenglykol oder Methoxypolypropylenglykol oder Derivate
davon. Zusätzlich
können
die Schutzketten sein Blockcopolymere aus Polyethylenglykol und
einem aus der Gruppe von Polyaminosäuren, Polysacchariden, Polyamidoaminen,
Polyethylenaminen oder Polynukleotiden. Die Schutzketten können ebenfalls
Copolymere aus Polyethylenglykol einschließlich eines Monoesters einer
Dicarbonsäure
sein. Die Schutzketten besitzen bevorzugt ein Molekulargewicht von
500 bis 10.000 Dalton.
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Die Reportergruppe kann ein Komplexon,
beispielsweise eine Chelatgruppe, sein. Die Chelatgruppe kann beispielsweise
sein Diethylentriaminpentaessigsäure,
Triethylentetraminhexa-essigsäure,
Ethylendiamintetraessigsäure,
1,2-Diaminocy-clohexan-N,N,N',N'-tetraessigsäure, N,N'-Di-(2-hydroxy-benzyl)ethylendiamin,
N-(2-Hydroxyethyl)ethylendiamintri-essigsäure, Nitrilotriessigsäure, Ethylenbis(oxyethylen-nitrilo)tetraessigsäure, 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-N,N',N'',N'''-tetraessigsäure, 1,4,7,10-Tetraazacyclodode-can-N,N',N''
-triessigsäure,
1,4,7-Tris(carboxymethyl)-10-(2'-hydroxy)propyl)-1,4,7,10-tetraazacyclodecan, 1,4,7-Triazacyclononan-N,N'-N''
-triessigsäure
oder 1,4,8,11-Tetraazacyclotetradecan-N,N',N'',N'''-tetraessigsäure.
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Die Zusammensetzung kann weiterhin
umfassen ein alpha-, Beta- oder gamma-emittierendes Radionuklid,
gebunden an das Komplexon. Das Radionuklid kann sein Gallium 67,
Indium 111, Technetium 99m, Chrom 51, Kobalt 57, Molybdän 99 oder
ein Molekül,
gebunden an ein Iodisotop.
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Die Reportergruppe kann ebenfalls
umfassen ein diagnostisches Mittel, beispielsweise ein Kontrastmittel,
welches ein paramagnetisches oder superparamagnetisches Element
oder eine Kombination aus einem paramagnetischen Element und einem
Radionuklid umfassen kann. Das paramagnetische Element kann ausgewählt werden
aus der Gruppe von Übergangsmetallen
oder Lanthaniden mit Atomnummern von 21–29, 42, 44 oder 57–71. Das
paramagnetische Element kann beispielsweise sein Gadolinium (III),
Dysprosium (III), Holmium (III), Europium (III), Eisen (III) oder
Mangan (II).
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Die Reportergruppe kann umfassen
ein therapeutisches Mittel, wie ein cytostatisches, antibiotisches, hormonelles,
analgetisches, cytostatisches, antibiotisches, hormonelles, analgetisches,
psychotropes, antiinflammatorisches, antivirales oder antifungales
Arzneimittel oder ein Lymphokin.
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Die Zusammensetzung kann weiter umfassen
eine Zielgruppe, gebunden an den polymeren Träger oder an eine der Schutzketten
oder an beide. Die Zielgruppe kann ein Antikörper, ein Fragment eines Antikörpers, ein
chimärer
Antikörper,
ein Enzym, ein Lectin oder ein Saccharid-Ligand sein.
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Die Zusammensetzung kann ebenfalls
umfassen eine Reportergruppe, die ein Teilchen, ein kolloidales Teilchen
oder ein kolloidales Präzipitat
ist. Das kolloidale Präzipitat
kann umfassen ein Oxid, Sulfid oder Hydroxid eines Übergangselementes
oder Lanthanid mit Atomnummern von 21–29, 42, 44 oder 57–71. Die
Reportergruppe kann ebenfalls sein ein Siliciumoxidkolloid oder
ein Polymer, enthaltend Silicium, Schwefel oder Kohlenstoff oder
ein Fluorenthaltendes Molekül,
beispielsweise ein Fluorkohlenstoff bzw. Fluorkohlenwassertstoff.
Die Reportergruppe kann ebenfalls sein eine Pyridiyldithioacylgruppe,
beispielsweise eine N-(2-Pyri-dyldithio)propionylgruppe, N-Hydroxysuccinimidyl,
N-Hydroxysulfosuccinimidyl, Imidazolyl, Benzotriazolyl, Aminoalkyl,
Aldehyd, Thioalkyle, Thiolan, Haloidacyl, Haloid-alkyl oder Haloidphenyl
oder eine Diazo- oder Hydrazogruppe, beispielsweise eine 4-Hydrazinoxyethyl-,
4-Hydrazinn-benzyl-, Diasirinyl-, Azidophenyl- oder Azidoalkylgruppe.
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Zusätzlich betrifft die Erfindung
ein Verfahren zur Herstellung der Zusammensetzung durch Verbindung
des polymeren Trägers
mit einer Vielzahl von Schutzketten unter Bildung eines geschützten Trägers und dann
Verbinden des geschützten
Trägers
mit der Reportergruppe. Wenn die Schutzketten ein Methoxypolyethylenglykol-Analoges
umfassen, ergibt die Verbindung des polymeren Trägers mit dem Analogen ein semistabiles
Gel. Das Verfahren kann weiter umfassen eine Bindung einer Zielgruppe
an den Träger,
eine der Schutzgruppen oder beide.
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Die Erfindung betrifft ebenfalls
eine Zusammensetzung für
die Verwendung bei der Behandlung einer Krankheit bei einem Patienten
oder die Verwendung der Zusammensetzung für die Herstellung eines Arzneimittels
für die
Behandlung einer Krankheit durch Verabreichung einer therapeutisch
oder diagnostisch wirksamen Menge der Zusammensetzung oder des Arzneimittels
gemäß der Erfindung
an einen Patienten. Das Verfahren kann weiter umfassen das Scannen
des Patienten unter Verwendung eines Abbildungsverfahrens, welches
die Reportergruppe detektieren kann, wobei ein sichtbares Bild der
Verteilung der Zusammensetzung erhalten wird. Die Verabreichung
kann eine intravaskuläre
oder intraperitoneale Injektion sein und das Abbildungsverfahren
kann beispielsweise Kernspintomographie, ein nuklear-medizinisches
Abbilden, eine Positron-Emissions-Tomographie oder eine Single-Photon-Emissions-Computertomographie
sein.
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Beispiele der erfindungsgemäßen Zusammensetzung
erlauben sehr geringe Dosen an paramagnetischem Element, beispielsweise
Gadolinium, die dem Patienten verabreicht werden, und trotzdem werden
ausgezeichnete Bilder, beispielsweise MR-Bilder erhalten. Beispielsweise
kann die Reportergruppe Gadolinium, zugeführt in einer Dosis von weniger
als 0,05 mmol Gd/kg Körpergewicht
des Patienten, umfassen. Bevorzugt beträgt die Dosis etwa 0,02 bis
0,04 mmol Gd/kg Körpergewicht.
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Beispiele der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
können
als Kontrastmittel oder für
die Herstellung eines Kontrastmittels, für die Behandlung eines Patienten
durch Scannen eines Submillimeter-Gefäßes des Patienten zur Herstellung
eines sichtbaren Bildes des Submillimeter-Gefäßes, verwendet
werden. Ein Submillimeter-Gefäß ist eines,
das einen inneren Durchmesser von weniger als einen Millimeter besitzt.
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Der Ausdruck "gebunden", wie er hier
verwendet wird, bedeutet eine kovalente und nicht-kovalente Bindung,
beispielsweise durch Wasserstoff-, ionische oder Van-der-Waals-Bindungen.
Solche Bindungen können
zwischen mindestens zwei der gleichen oder unterschiedlichen Atome
oder Ionen als Ergebnis der Wiederverteilung der Elektronendichten
solcher Atome oder Tonen gebildet werden.
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Ein "polymerer Träger" ist ein Molekül, das aus
mehreren verbundenen chemischen Gruppierungen, die gleich oder unterschiedlich
sein können,
zusammengesetzt ist und das als Stelle dient, an der einer Reportergruppe
gebunden wird, und durch Schutzketten abgeschirmt ist.
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Eine "Schutzkette" ist eines oder
mehrere Moleküle,
welches ein Trägermolekül und eine
Reportergruppe vom Kontakt mit den anderen Makromolekülen durch
extensive Bindung von Wasser an die Ketten schützt.
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Ein "Komplexon" ist aus einem Molekül oder mehreren
Molekülen
oder chemischen Gruppen oder Gruppierungen zusammengesetzt und bildet
eine günstige
Umgebung für
die Bindung eines Ions (eines Kations oder eines Anions). Die Dissoziation
des Ions von der Umgebung wird, bedingt durch die kinetische und/oder
thermodynamische Stabilität
der Bindung, gehindert.
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Ein "Chelatmolekül", eine "Chelatgruppe" oder
ein "Chelat" ist ein Komplexon, welches Kationen bindet.
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Eine "Reportergruppe" ist ein Atom,
ein Ion, ein Molekül
oder ein Komplexon, das an einen polymeren Träger oder eine Schutzkette gebunden
sein kann, unter Erzeugung eines Effekts, der durch irgendwelche
Verfahren der chemischen, physikalischen oder biologischen Untersuchung
eines Patienten detektierbar ist. Eine Reportergruppe kann ein therapeutisches
oder diagnostisches Mittel sein.
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Die Ausdrücke "Derivate" oder "Analoge",
wie sie hier verwendet werden, bedeuten eine Verbindung, deren Kernstruktur
gleich ist wie die der Stammverbindung oder dieser stark ähnelt, die
aber eine chemische oder physikalische Modifizierung besitzt, wie
eine unterschiedliche oder zusätzliche
Seitengruppe; der Ausdruck umfasst Copolymere der Stammverbindungen,
die an andere Atome oder Moleküle
gebunden sein können.
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Die Ausdrücke "Ligand" oder "Zielgruppe"
bzw. "Targetgruppe" (diese Ausdrücke
werden synonym verwendet) oder "Vektormolekül" bedeuten irgendein Atom,
Ion oder Molekül,
gebunden an einen Träger und/oder
eine Schutzkette und/oder eine Reportergruppe zur Erhöhung der
Akkumulation der Zusammensetzung an der Target-Stelle des Organismus
in grö ßerem Ausmaß als wenn
der Ligand die Targetgruppe oder das Vektormolekül abwesend wären.
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Der Ausdruck "Polyaminosäurefragment"
bedeutet individuelle Aminosäuregruppen
oder mehrere verbundene Aminosäuren,
die unter Bildung einer Polyaminosäure verbunden sein können.
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Ein semistabiles Gel ist ein Gel,
welches eine flüssige
Phase beim Stehen oder wenn die Temperatur, der pH oder andere Bedingungen
variiert werden bildet.
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Der Ausdruck "Gefäß-Mapping" bedeutet die Erzeugung
eines Bildes eines Gefäßes oder
von Gefäßen, bei
dem die räumliche
Orientierung und die Delineation der Gefäße bewertet werden können.
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Der Ausdruck "aminiert" beschreibt
Moleküle,
die gebundene Aminogruppen umfassen.
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Eine "diagnostisch wirksame Menge"
der Zusammensetzung ist eine Menge, die ein Bild der Zusammensetzung
bei dem Patienten ergibt.
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Eine "therapeutisch wirksame Menge
der Zusammensetzung" ist eine Menge, die einen therapeutischen Vorteil
für den
Patienten ergibt.
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Einige wichtige Merkmale der Beispiele
der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen,
die bewirken, dass sie überraschenderweise
für die
MR-Abbildung geeignet sind, umfassen: 1) die Fähigkeit, paramagnetische Kationen
in Chelatform zu überführen um
eine hohe molekulare Relaxivität
zu erhalten, die zu ihrer Verwendung als MR-Kontrastmittel wesentlich
ist; 2) eine verlängerte
Blut-Halbwertszeit; 3) niedrige Toxizität; und 4) Nicht-Immunogenität.
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Die Erfindung besitzt weiterhin den
Vorteil, dass nur eine Dosis an Kontrastmittel verabreicht werden muss,
wobei verstärkte
Signal-Geräusch-Verhältnisse
in den diagnostischen Bildern erhalten werden.
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Die folgenden Eigenschaften sind
für die
erfindungsgemäßen Zusammensetzungen üblich: 1)
erhöhte Relaxivität für jedes
paramagnetische Kation, verglichen mit Gd-DTPA, 2) eine große Zahl
von Chelatgruppen an jedem Molekül,
3) eine verstärkte
Blutpool-Konzentration nach intravenöser Injektion, 4) verstärkte Stellen für abnormale
Endothel-Permeabilität und 5)
eine verlängerte
Zirkulationszeit, verglichen mit Gd-DTPA.
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Andere Merkmale und Vorteile der
Erfindung gehen aus der folgenden Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen
und aus den Ansprüchen
hervor.
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Genaue Beschreibung
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Zeichunaen
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1 ist
ein Diagramm von drei Schemata für
die Synthese der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen.
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2 ist
eine graphische Darstellung der Blutclearance von [111In]-markiertem
und Gd-gesättigtem MPEG
(MG 5 kD)-Poly-1-lysin
(MG 53,5 kD)-DTPA (Quadrate) und MPEG (MG 2 kD)-Poly-1-lysin (MG
41 kD)-DTPA (Rauten).
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3 ist
eine graphische Darstellung der Bioverteilung von [111In]-markiertem
und Gd-gesättigtem MPEG
(MG 5 kD)-Poly-1-lysin
(MG 53,5 kD)-DTPA 90 Stunden nach intravenöser Injektion.
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4 ist
eine graphische Darstellung des Ansprechens auf Gd-DTPA von Mäusen, denen
Gd-DTPA-BSA (Quadrate) und MPEG (MG 50 kD)-Poly-1-lysin (MG 53,5
kD)-DTPA (Gd) (Rauten) injiziert worden war.
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5 ist
eine graphische Darstellung der Wirkung von Gd-markiertem MPEG (MG
2 kD)-Poly-1-lysin (MG 41 kD)-DTPA (Quadrate) oder Gd-markiertem
MPEG (MG 5 kD)-Poly-1-lysin (MG 25 kD)-DTPA (Rauten) für die T1-Werte
von Blut bei verschiedenen Konzentrationen.
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6 ist
eine graphische Darstellung der dosisabhängigen Verstärkung der
Gefäße, wobei
das Gefäß/Muskel-Verhältnis durch
Digitalisierung der Signalintensitäten von mehreren großen Arterien,
beispielsweise Aorta, iliakaler und femoraler Arterie und des nahen
Muskelgewebes dargestellt ist.
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7 ist
eine graphische Darstellung des Zeitverlaufs des Kontrastmittels
in den großen
Gefäßen bei einer
Vergleichsuntersuchung.
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Die 8a und 8b sind MR-Bilder des Kopfes
einer Ratte in einer 3-D-Helligkeits-Pixel-Rekonstruktion, wobei
das Bild vor (8a) und
nach (8b) intravenöser Injektion
von MPEG (MG 5 kD)-Poly-1-lysin (MG 25 kD)-DTPA (Gd) dargestellt
ist.
-
9 ist
ein MR-Bild von zwei Ratten in 3-D-Helligkeits-Pixel-Rekonstruktion nach
intravenöser
Injektion von MPEG (MG 5 kD)-Poly-1-lysin (MG 25 kD)-DTPA (Gd) (linkes
Bild) und Gadopentatdimeglumin (rechtes Bild).
-
10a und 10b sind MR-Bilder eines
Kaninchens in einer 3-D-Helligkeits-Pixel-Rekonstruktion der lateralen
(10a) und kraniokaudalen
Projektion (vergleiche 10b)
nach intravenöser
Injektion von MPEG (MG 5 kD)-Poly-1-lysin
(MG 25 kD)-DTPA (Gd).
-
11a und 11b sind MR-Bilder der linken
Lende und des Femus einer Ratte in einer 3-D-Helligkeits-Pixel-Rekonstruktion vor
(11a) und nach (11b) intravenöser Injektion
von MPEG (MG 5 kD)-Poly-1-lysin (MG 25 kD)-DTPA (Gd). Die Bilder
wurden zwei Wochen nach der Injektion von R3230 Brustdrüsen-Adenokarzinom-Zellen
in die linke Lende der Ratte aufgenommen.
-
Struktur der
Zusammensetzung
-
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen umfassen
ein einziges chemisches Gebilde, umfassend einen polymeren Träger, eine
Schutzkette, gebunden an den polymeren Träger, und eine Reportergruppe.
Beispielsweise kann die Zusammensetzung die folgende Formel besitzen:
Gruppen in jeder beliebigen
Reihenfolge verknüpft
sein können,
worin k 100–560
bedeutet; R
1 (CH
2)
4NHCO(CH
2)
nCOOCH
2CH
2A-B-OR
3 bedeutet,
worin n 2–6
bedeutet; A [OCH
2CH
2]
x bedeutet, worin x 15–200 bedeuet; B (OCH
2CH
2]
x oder
[OCH(CH
3)CH
2]
y bedeutet, worin y + x 17–220 bedeutet;
R
2 eine Chelatgruppe ist; und R
3 H,
(CH
2)
yCH
3 oder (CH
2)
yCOOH bedeutet und p 0–7 ist .
-
Polymere Träger
-
Die polymeren Träger können aus Polyaminosäuren, beispielsweise
linearen oder verzweigten Polymeren, aus einer einzigen Aminosäurespezies
oder aus unterschiedlichen Aminosäurespezies ausgewählt werden,
beispielsweise regelmäßige oder
statistische Blockcopolymere aus Polyaminosäuren, beispielsweise bevorzugt
lineares Poly-1- oder Polyd-lysin, Poly-alpha, Beta-(2-Aminoethyl)-d,l-aspartamid
oder Poly-1-asparaginsäure.
-
Das Molekulargewicht des Polyaminosäureträgers liegt
bevorzugt zwischen 1000 und 100.000 Dalton. Polyaminosäuren mit
engen Molekulargewichts(MG)-Verteilungen sind gegenüber solchen
mit breiten MG-Verteilungen bevorzugt. Die Polyaminosäuren sind über Peptidbindungen
verbunden oder sie werden durch Kondensation von zwei oder mehreren
Polyaminosäurefragmenten
oder individuellen Aminosäuren
mit spaltbaren Bindungen, beispielsweise S-S-Bindungen, die in vivo
gespalten werden können,
erhalten. Polyaminosäuren
können
natürlich
oder synthetisch sein, sie sind bevorzugt nicht-proteinhaltig und
sie werden durch chemische Synthese oder durch rekombinante Verfahren,
wie Gentechnologie, hergestellt.
-
Der polymere Träger kann ebenfalls zusammengesetzt
sein aus Polyethyleniminen, beispielsweise verzweigten Aminoenthaltenden
Polymeren oder carboxylirten Polyethyleniminen, d. h. umgesetzt
mit Derivaten von Kohlensäuren,
natürlichen
Sacchariden, enthaltend Aminosäuren
oder Carbonsäuren,
beispielsweise Galacturonsäure,
Glucuronsäure,
Mannuronsäure,
Hyaluronsäure,
Pectinsäure,
Neuraminsäure,
Alginsäure, Carrageenan;
aminierte Polysaccharide oder Oligosaccharide (linear oder verzweigt);
oder carboxylierte Polysaccharide oder Oligosaccharide, beispielsweise
umgesetzt mit Derivaten von Kohlensäuren mit resultierender Verknüpfung der
Carboxylgruppen.
-
Solche Oligosaccharide können durch
chemische Änderung
erhalten werden von beispielsweise Dextran, Mannan, Xylan, Pullulan,
Cellulose, Chytosan, Agarose, Fucoidan, Galactan, Arabinan, Fructan,
Fucan, Chitin, Pustulan, Levan oder Pectin. Zusätzlich können diese Polysaccharide oder
Oligosaccharide Heteropolymere oder Homopolymere von Monosacchariden
sein, beispielsweise Glucose, Galactose, Mannose, Galactose, Desoxyglucose,
Ribose, Desoxyribose, Arabinose, Fucose, Xylose, Xylulose oder Ribulose.
-
Der polymere Träger kann sein: ein lineares,
verzweigtes oder dendrimeres Polyamidoamin; Polyacrylsäure; Polyalkohole,
beispielsweise Polyvinylalkohol, und Polyxylit, an das Carboxylgruppen
oder Aminogruppen chemisch gebunden sind; oder Oligonukleotide.
-
Schutzketten
-
Die Schutzketten können sein:
PEG, bevorzugt verestert mit einer Dicarbonsäure unter Bildung eines Polyethylenglykolmonoesters;
MPEG, Methoxypolypropylenglykol oder ein Copolymer davon, bevorzugt
in Form eines Esters mit einer Dicarbonsäure, Polyethylenglykol-disäure, Polyethylenglykolmonoamin; MPEG-Monoamin;
MPEG-Hydrazid; MPEG-Imidazolid; und Derivate von allen den Obigen.
-
Zusätzlich kann die Schutzgruppe
sein: ein Blockcopolymer vom PEG und einem Polymer, beispielsweise
von Polyaminosäuren,
Polysacchariden, Polyamidoaminen, Polyethylenaminen oder Polynukleotiden (wie
oben bei den polymeren Trägern
beschrieben). Die Blöcke
sind bevorzugt alterniert, wobei lineare Blockcopolymere erhalten
werden. Das Gesamt-Molekulargewicht
der Schutzkette beträgt
bevorzugt 500 bis 10.000 Dalton. Die Schutzkette ist bevorzugt an
den polymeren Trägern
durch eine einzige Bindung gebunden.
-
Reportergruppen
-
Die erfindungsgemäßen Reportergruppen sind bevorzugt
an den polymeren Träger
gebunden, sie können
jedoch auch an eine Schutzkette gebunden sein. Die Reportergruppen
umfassen Komplexone, beispielsweise Chelatmoleküle (bzw. chelatbildende Moleküle), wie
Diethylentriaminpentaessigsäure
(DTPA), Triethylentetraminhexaessigsäure (TTHA), Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA),
1,2-Diaminocyclohexan-N,N,N',N'-tetraessigsäure, N,N'-Di-(2-hydroxybenzyl)ethylendiamin
(HBED), N-(2-Hydroxyethyl)ethylendiamintriessigsäure, Nitrilotriessigsäure, Ethylenbis(oxyethylennitrilo)tetraessigsäure (EGTA),
1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-N,N',N'',N'''-tetraessigsäure (DOTA),
1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-N,N',N'' -triessigsäure (DO3A),
1,4,7-Tris(carboxymethyl)-10-(2'-hydroxypropyl)-1,4,7,10-tetraazocyclododecan (HP-DO3A), 1,4,7-Triazacyclononan-N,N',N-triessigsäure (NOTA),
1,4,8,11-Tetraazacyclotetradecan-N,N',N'',N'''-tetraessigsäure (TETA),
bevorzugt DOTA und DTPA, wobei diese Chelatmoleküle bevorzugt ein Kontrastmittel,
beispielsweise ein paramagnetisches Kation und/oder ein Radionuklid,
umfassen.
-
Die paramagnetischen Elemente, beispielsweise
Kationen, umfassen Übergangsmetalle
oder Lanthanide, beispielsweise Elemente mit Atomnummern 21–29, 42,
44, 57–71,
bevorzugt Gadolinium (III), Dysprosium (III), Holmium (III), Europium
(III), Eisen (III) oder Mangan (II).
-
Die Radionuklide umfassen alpha-,
beta- und gamma-Emitter, bevorzugt Gallium 67, Indium 111, Technetium
99m, Chrom 51, Kobalt 57, Molybdän
99, Moleküle,
beispielsweise Tyrosin und p-Oxybenzoesäure, gebunden an Isotope von
Iod, beispielsweise Iod 131.
-
Die Reportergruppe kann umfassen
fluorenthaltende Moleküle,
beispielsweise Fluorkohlenstoffe.
-
Die Reportergruppe kann ebenfalls
umfassen therapeutische Mittel, beispielsweise Cytostatika, antibiotische
Mittel, Hormone, beispielsweise Wachstumsfaktor, analgetische Mittel,
psychotropische Mittel, antiinflammatorische Mittel, antivirale
Mittel, antifungale Arzneimittel oder Lymphokine, beispielsweise
Interleukin 2. Die therapeutischen Mittel sind bevorzugt an einen
Träger
mit entfernbaren oder semistabilen Bindungen gebunden.
-
Die Reportergruppe kann ebenfalls
ein Teilchen oder ein kolloides Teilchen oder ein kolloides Präzipitat
von Oxiden, Sulfiden und/oder Hydroxiden von Übergangselementen und Lanthaniden
mit Atomnummern von 21–29,
42, 44, 57–71
oder Siliciumoxid-Kolloiden oder Polymeren, die Silicium enthalten,
oder Polymeren mit Atomen von Schwefel, Kohlenstoff oder Silicium,
umfassen. Das Teilchen oder die Teilchen können als integraler Teil vorhanden
sein oder sie können
von einer semipermeablen Membran umgeben sein.
-
Die Zusammensetzungen können ebenfalls
umfassen zusätzliche
Reportergruppen, die ausgewählt werden
können
aus (CH2)pCOOH,
worin p zwischen 0 und 7 liegt; Pyridyldithioacylgruppen, beispielsweise N-(2-Pyridyldithio)propionylgruppen;
N-Hydroxysuccinimidyl-, N-Hydroxysulfosuccinimidyl-, Imidazolyl-,
Benzotriazolyl-, Aminoalkyl-, Aminoacyl-, Aldehyd-, Thioalkyl-,
Thiolan-, Haloidacyl-, Haloidalkyl- oder Haloidphenyl-; Diazo- oder
Hydrazo-, beispielsweise 4-Hydrazinoxyethyl-, 4-Hydrazinobenzyl-,
Diazirinyl-,- Azidophenyl- oder Azidoalkylgruppen.
-
Die obigen Gruppen sind an den polymeren
Träger
und/oder die Schutzketten gebunden und sie sind erforderlich für die Konjugation
oder Bindung anderer Liganden, beispielsweise eine Zielgruppe, die
fähig ist, mit
Zelloberflächen-Rezeptoren, Proteoglykanen,
Adhäsionsmolekülen, Ionenkanä len oder
Enzymen in Wechselwirkung zu treten, mit der erfindungsgemäßen Zusammensetzung.
-
Targetgruppe
-
Die Targetgruppe kann umfassen: Antikörper; Fragmente
von Antikörpern;
chimäre
Antikörper,
wobei die Antikörper
polyclonal oder monoclonal sein können; Enzyme; Quasi-Substrate von Enzymen;
Lectine; oder Saccharidliganden von Lectinen, entfernbar oder nicht-entfernbar,
gebunden an die Zusammensetzung.
-
Synthese der
Zusammensetzung
-
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können nach
irgendeinem der folgenden Verfahren (vergleiche 1) synthetisiert werden. Ein Beispiel
der Synthese unter Verwendung von Poly-1-lysin als polymerer Träger, MPEG
als Schutzkette und ein Komplexon als Reportergruppe wird dargestellt.
Diese synthetische Zusammensetzung ist besonders geeignet als makromolekulares
Kontrastmittel.
-
Schema 1
-
Die Zusammensetzungen können in
zwei Stufen hergestellt werden, indem zuerst die Polyaminosäure mit
aktivierten MPEG-Analoga umgesetzt wird, und dann dieses Reaktionsgemisch
mit einer aktivierten Chelatverbindung umgesetzt wird. Dieses Verfahren
ist bevorzugt, wenn Poly-1-lysin als polymerer Träger verwendet
wird (vergleiche 1).
-
ε-Aminogruppen
von Poly-1-lysin werden mit aktivierten Derivaten von carboxiliertem
MPEG, beispielsweise den Säurechloriden,
Anhydriden, gemischten Anhydriden, Nitrenen, Isothiocyanaten und
Imidazoliden, und aktivierten Estern, beispielsweise Hydroxysuccinimid,
Hydroxysulfosuccinimid, p-Nitrophenyl, Benzotriazolid, umgesetzt.
-
Das Chelatmolekül wird zur Reaktion mit den
verbleibenden Aminogruppen gebracht, entweder in aktivierter Form
beispielsweise als Anhydrid, gemischtes Anhydrid oder Isothiocyanat,
oder in nicht-aktivierter Form. Wenn das Chelatmolekül in nicht-aktivierter
Form vorliegt, wird es aktiviert unter Herstellung eines aktivierten
Esters in Anwesenheit von Succinimid oder Sulfosuccinimid und Carbodiimid
und wird dann mit den verbleibenden Aminogruppen zur Reaktion gebracht.
Eine zusätzliche
chemische Modifizierung des Polyaminosäure-Grundgerüsts oder
der MPEG-Ketten
kann der Reaktion vorhergehen, nicht beschränkt auf Reaktionen, die die
Bildung oder Eliminierung von mindestens einer chemischen Bindung
ergeben.
-
Die Sequenz der chemischen Bindung
der Schutzgruppen und einer Reportergruppe an den polymeren Träger kann
umgekehrt werden, d. h. die Bindung einer Reportergruppe geht der
Bindung einer Schutzkette oder von Schutzketten an den polymeren
Träger
voran, aber bevorzugt wird die Reportergruppe als monofunktionelles
aktiviertes Analoges verwendet, d. h. ein Molekül aktiverter Reportergruppe
bildet nur eine covalente Bindung mit einem polymeren Träger.
-
Schema 2
-
Die Zusammensetzungen können ebenfalls
synthetisiert werden unter Verwendung von Standard-Peptidsynthese-Protokollen mit modifizierten
Aminosäure-Vorstufen,
wie MPEG-Amino-säure
und Komplexon-Aminosäure.
In diesem Fall können
die Gruppierungen aus Komplexon und PEG in kontrollierter Weise alterniert
werden.
-
Schema 3
-
Oligomere aus PEG-Polyaminosäuren können mit
Oligomeren aus Komplexon-Aminosäuren
unter Bildug von Blockcopolymeren konjugiert werden.
-
Alle drei Schemata ergeben vorhersehbare
Zusammensetzungen und hoch-vorhersehbare Molekulargewichtsverteilungen.
-
Wenn carboxylierte Träger verwendet
werden, wie carboxylierte Saccharide oder Polyaminosäuren mit
Carboxygruppen in ihren Resten, wie Poly-1-asparaginsäure, wird
der polymere Träger
bevorzugt in Anwesenheit von Carbodiimid und Sulfosuccinimid, wie
in Beispiel 2 für
DTPA beschrieben, aktiviert und dann mit aminierten Schutzketten,
wie MPEG-Monoamin,
bei pH 7–9
umgesetzt. Die Verknüpfung
von Komplexon oder Chelat wird dann bevorzugt durch Carbodiimid-Kondensation erreicht.
-
Bei der Verwendung für die medizinische
Abbildung besitzen die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen bevorzugt
ein nicht-proteinartiges Polyaminosäuremolekül, das als Träger für covalent
angebrachte aktivierte Analoga von linearen oder verzweigten Chelatmolekülen dient,
an die ein MR-Reporterkation
gebunden ist, d. h. ionisch chelatiert ist. Der Träger bildet
ein einziges chemisches Gebilde mit Schutzketten aus MPEG.
-
Der Syntheseweg für die Herstellung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
umfasst die covalente Modifizierung des Polyaminosäureträgers. Konjugation
von 1,1'-Carbonyldiimidazol-behandeltem MPEG an Aminogruppen erfordert
einen hohen Überschuss
an Modifizierungsmittel, beispielsweise aktiviertem MPEG, was zur
Bildung von semistabilen Gelen führt,
da die Löslichkeit
von Polyaminosäuren
in Anwesenheit von MPEG verringert ist. Das Verfahren zur Herstellung
von N-Hydroxysuccinimidyl-MPEG-succinat, das in Schema 1 beschrieben
wird, ergibt ein Produkt mit hochaktiviertem Estergehalt, beispielsweise
größer als
75%, was vorteilhaft ist für
die Herstellung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen. Die
spezielle Reinigung der Zwischenprodukte ermöglicht die Eliminierung von
Peroxiden und ergibt ein Präparat
für die
in vivo-Verwendung.
-
Die Verknüpfung von MPEG mit dem polymeren
Träger,
beispielsweise mit der Polyaminosäure, verhindert ebenfalls die
mögliche
Vernetzung der Polyaminosäure
mit dem cyclischen Anhydrid von DTPA. MPEG-Ketten verhindern die
Bildung von Nebenprodukten, da sie eine sterische Barriere für die Vernetzung des
Reagenses erzeugen. Daher kann die Bildung von Produkten mit hohem
Molekulargewicht kontrolliert werden, was die Synthesestufen vorhersagbar
macht. Als Ergebnis wird ein homogenes Präparat erhalten mit enger Molekulargewichtverteilung.
-
Die polymeren Träger enthalten bevorzugt Peptidbindungen.
Die gleichen Bindungen treten bei der Konjugation eines Chelatmoleküls mit reaktiven
Gruppen der Aminosäurereste
auf. Diese Zusammensetzungen sind daher potentiell durch verschiedene
tierische nicht-spezifische Peptidasen biozersetzbar. Zur Erleichterung
der in vivo-Eliminierung der polymeren Träger und der Schutzketten zusammen
mit einer Reportergruppe oder zur Verbesserung der Dissoziation
der Reportergruppe von dem Träger
in das biologische Milieu, wenn eine Reportergruppe ein therapeutisches
Element ist, sollten die Elemente des polymeren Trägers oder der
Schutzketten oder der Reportergruppen durch eine semistabile Bindung,
wie eine S-S-Bindung, miteinander verknüpft sein. Geringe Mengen an
eingeschlossenen Zusammensetzungen können aus dem Körper durch
Abbau zu kleineren Fragmenten entfernt werden. Jedoch kann eine
Vielzahl aktivierter PEG-Derivate für die Herstellung der Zusammensetzungen
verwendet werden, wodurch sie entweder praktisch nichtabbaubar oder
im Gegenteil labil werden. Jedoch sind labi le Zusammensetzungen
unerwünscht,
da die Entfernung von MPEG eine stärkere Akkumulation der Kontrastmittel-Zusammensetzung in
dem Retikuloendothel-System ergibt.
-
Die Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
bei der MR-Abbildung erfordert die Anwesenheit einer MR-Reporter-gruppe,
wie eines paramagnetischen Kations, beispielsweise Gadolinium (III).
Das Transchelations-Verfahren,
das für
dieses Experiment entwickelt wurde, beruht auf einer Ausführungsform
von Harris et al., J. Polym. Sci., 22: 341–52, wobei auf diese Literaturstelle
expressis verbis Bezug genommen wird. Die Anmelderin verwendet Gd-Citrat
zur Verhinderung des Kontakts des Kontrastmittels mit Gadoliniumoxiden,
die zuvor von Griess et al., U. S. Patent 4 647 447 verwendet wurden,
oder Gadoliniumchlorid, das zuvor von Bardy et al., U. S. Patent
4 804 529 verwendet wurde. Das Gadoliniumcitrat bildet leicht Kontaminanten,
wie kolloidale Hydroxide bei pH-Werten über 6,5, die innerhalb des
Bereichs der optimalen pH-Werte für die erfindungsgemäßen NMR-Kontrastmittel
liegen. Die Zufügung
einer speziellen Reinigungsstufe, beispielsweise einer Anionenaustauschchromatographiestufe,
erlaubt die Trennung von Gd-markiertem MPEG-PL-DTPA (Gd) von üblichen
anionischen Kontaminanten, beispielsweise MPEG-PL-DTPA (Gd) mit niedrigem
Substitutionsgrad der Aminogruppen mit MPEG oder geringen Mengen
an PL-DTPA (Gd).
-
Die erfindungsgemäßen Schutzketten, beispielsweise
MPEG, reagieren nicht mit der C3-Komponente des Komplements, was
ein ausgeprägter
Vorteil gegenüber
den bekannten Mitteln, beispielsweise Dextran-DTPA (Gd), ist, von
denen bekannt ist, dass sie mit der C3-Komponente des Komplements
reagieren.
-
MPEG verhindert die Aussetzung der
Chelatgruppen und der paramagnetischen Kationen gegenüber den
Rezeptorzellen, beispielsweise Glomerulonephral-Phagozyten, die
fähig sind,
sie zu erkennen. MPEG bildet ebenfalls eine sterische Barriere,
wodurch die Rechelatbildung von Gd-Kationen durch Serumproteine,
wie Transferrin, verhindert wird. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
verhindern ebenfalls mögliche
verzögerte
toxische Effekte von re-chelatiertem Gadolinium.
-
Die MPEG-Konjugation erniedrigt die
Toxizität
der erfindungsgemäßen Zusammensetzung,
indem sie eine signifikante Akkumulation des Chelatpolymeren in
der Leber und der Milz verhindert. Akute Toxizitätsuntersuchungen der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
haben keine offensichtliche Toxizität in Mäusen bei Konzentrationen, die
das 10- bis 35-Fache
der optimalen Dosis überschreiten,
gezeigt. Die histologische Prüfung
von Geweben dieser Mäuse
haben keine Abweichungen von den Kontrolltieren gezeigt.
-
Die Blut-Halbwertszeit der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
wurden bei Ratten bestimmt. Die radioaktiven und paramagnetischen
Kontrastmittel wurden in die Zusammensetzungen, hergestellt gemäß der Beispiele
1 und 3, eingearbeitet um ihre pharmakokinetischen Eigenschaften
in vivo genau zu bestimmen. Die Ratten wurden zu unterschiedlichen
Zeitpunkten visualisiert, unter Verwendung einer gamma-Kamera um die Verteilung
der Zusammensetzung zu verfolgen. Wie in den in 2 dargestellten Daten angegeben, war die
Blut-Halbwertszeit des beschriebenen Kontrastmittels gleich 24 Stunden
für MPEG
(MG 5 kD)-Poly-1-lysin (MG 53,5 kD)-DTPA, markiert mit [111In] und gesättigt mit dem Gadolinium, während ein
kleineres Kontrastmittel MPEG (MG 2 kD)-Poly-1-lysin (MG 25 kD)-DTPA, markiert
mit [111In] und gesättigt mit Gadolinium, aus dem Blut
mit schnellerer Rate, wobei t1/2 6 h betrug,
entfernt wurde. Die einzigen zwei Stellen im Körper, wo eine Akkumulation
dieser Zusammensetzungen in Mengen detektiert wurde, die signifikant
größer sind
als 1% der injizierten Dosis pro Gramm Gewebe, waren die Milz und
die Nieren. Weiterhin überschritt
die Gesamtmenge an Kontrastmittel, die in den Nieren und der Milz
eingeschlossen waren, nicht etwa 7% des Kontrastmittels in der Zusammensetzung.
-
Die typische Bioverteilung 90 Stunden
nach der Injektion von MPEG (MG 5 kD)-Poly-1-lysin (MG 53,5 kD)
DTPA, markiert mit [111In] und gesättigt mit
Gadolinium, ist in 3 dargestellt.
Die Gesamtmenge an Zusammensetzung, die in der Leber, der Milz und
beiden Nieren zurückgehalten
wurde, betrug insgesamt 15–18%
nach 90 Stunden in Zirkulation. Die obigen Werte zeigen, dass die
erfindungsgemäßen Kontrastmittel nicht
in dem Retikuloendothelsystem der Tiere nach intravenöser Injektion
in signifikanten Mengen akkumulieren und sie können aus der Zirkulation, vermutlich
durch Abbau im Blut, durch Exkretion in der Galle und durch Nierenfiltration
entfernt werden.
-
Immunogenität
-
Die Verhinderung der Wechselwirkung
der Reportergruppe mit Plasmaproteinen durch MPEG-Ketten stört die Bindung
der Zusammensetzungen an Zellen, die Opsonin erkennen können, d.
h. Antigen-liefernde Phagozyten, und an immunokompetente Blutzellen,
beispielsweise ruhenden B-Zellen. Als Ergebnis ist die Bildung einer
Immunantwort auf die Reportergruppe selbst sehr unwahrscheinlich
und die Bildung von Wirts-Antikörpern auf
die Reportergruppe wird hauptsächlich
vermieden. Dies ermöglicht
die wiederholte Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, sofern
erforderlich. Die Immunantwort der Tiere auf intravenöse Injektionen
der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
kann keine Antikörperbildung
für PEG
und acetylierte Polyaminosäure
detektieren.
-
Die Anmelderin detektierte die Bildung
von Niedrig-Avidität, beispielsweise
Titer von 800–1000,
von Antikörpern
gegen DTPA(Gd) in Tieren, denen BSA-DTPA(Gd) inji ziert worden war,
durch Enzym-gebundenen Immunoadsorbens-Assay (ELISA) und zeigt praktisch kein
Ansprechen in Tieren, denen erfindungsgemäße Zusammensetzungen injiziert
worden waren, (vergleiche 4).
Im Wesentlichen wurden keine detektierbaren Antikörper gegen
DTPA(Gd), acyliertes Polylysin oder MPEG in Tieren, denen intravenös oder intraperitoneal
die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
injiziert wurden, 20 Tage nach der Injektion gefunden.
-
Die Kombination von langer Blut-Halbwertszeit
und dem Fehlen der Immunogenität
ist ein wesentliches Merkmal der Erfindung.
-
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen besitzen
eine überraschend
hohe Kapazität,
beispielsweise bis zu 13 Gew.-% für Gadolinium und außergewöhnlich hohes
R1/Dg-Atom, beispielsweise
20 mM–1 s–1. Vorexperimente
zeigen, dass Hochqualitäts-Angiogramme
erhalten werden können,
wenn die T1-Werte von Blut um das mindestens 5-Fache erniedrigt
werden können,
als Ergebnis der Injektion des Kontrastmittels. Wie durch Messung
der T1-Werte im Blut bestimmt wird, entspricht die Gd-Konzentration,
die eine 5-fache Abnahme in T1 erlaubt, ca. 300 nmol Gd/ml Blut
(vergleiche 5). In einer
typischen menschlichen Untersuchung entspricht dies einer Injektion
von ca. 20 μmol
Gd/kg Gesamtkörpergewicht,
die 5-mal niedriger ist als die für Gd-DTPA-Dimeglumin, welches
ein häufig
verwendetes Kontrastmittel ist.
-
Die Dosisabhängigkeit des Gefäß/Muskel-Signalverhältnisses
zeigt ein Plateau bei der Sättigungsdosis
von 20 μmol
Gd/kg Gesamtkörpergewicht
(vergleiche 6). Bei
dieser Konzentration besitzt ein Kontrastgefäßbild ein Gefäß/Muskel-Verhältnis von
5,5–6,
was eine 4-fache Erhöhung
ist gegenüber
den in der Vergangenheit bekannten Präparaten, die in einer Konzentration
von 50 μmol
Gd/kg Gesamt-Körpergewicht
verabreicht wurden. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen sind
wesentlich besser, d. h. um mehr als 200% gegenüber Poly-1-lysin (MG 25 kD)-DTPA(Gd)
bei der Erhöhung
des Blut/Muskel-Verhältnisses
(vergleiche 7). Bei
dieser Vergleichsuntersuchung wurden Ratten 20 μmol Gd/kg MPEG (MG 5 kD)-Poly-1-lysin (MG
25 kD)-DTPA(Gd) (MPEG Quadrate) oder 50 μmol Gd/kg Polylysin (MG 25 kD)-DTPA(Gd) (PL-Gd-DTPA, Rauten
(vergleiche 7)) injiziert.
Die Erhöhung
im Gefäß/Muskel-Verhältnis egalisierte
sich innerhalb von 30 Minuten aus und verblieb während der Beobachtungszeit,
die 100 Minuten betrug, konstant. Da MPEG (MG 5 kD)-Poly-1-lysin
(MG 25 kD)-DTPA(Gd) ein höheres
Gefäß/Muskel-Verhältnis besitzt,
waren die Bilder der vaskulären
Anatomie wesentlich besser nach der Verabreichung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
als nach der Verabreichung von PL-Gd-DTPA.
-
Dies ermöglicht eine dramatische Abnahme
der Dosis an Gd, die erforderlich ist um angiographische Hochqualitätsbilder
in Ratten herzustellen (vergleiche 8a und 8b). Gemäß einer Untersuchung wurden
die MR-Bilder des Kopfes einer Katze vor (vergleiche 8a) und nach (vergleiche 8b) der intravenösen Injektion
von MPEG (MG 5 kD)-Poly-1-lysin
(MG 25 kD)-DTPA (Gd) bei 30 μmol
Gd/ml verglichen. Die Bilder wurden 20 Minuten nach der Injektion
auf einem Sigma (GE Instruments, 1,5 T, 3-TOF SPGR/90 SE 60/6,5 256 × 192 2
NEX) unter Verwendung der 3 inch-Oberflächenspirale
aufgenommen. Die 3-D-Helligkeits-Pixel-Rekonstruktionen des Gefäß-Mappings
ergaben ein sehr hohes Gefäß/Hintergrundsignal-Verhältnis, wodurch
die Notwendigkeit für
eine Hintergrund-Subtraktion eliminiert wurde. Im Gegensatz zu den
bekannten Kontrastmitteln resultierten die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen,
injiziert mit 30 μmol
Gd/kg Gesamt-Körpergewicht, überraschenderweise
in einer Auflösung
der Submillimeter-Gefäße mit einem
Innendurchmesser von weniger als 1 mm.
-
Eine Vergleichsuntersuchung zwischen
MPEG (MG 5 kD)-Poly-1-lysin
(MG 25 kD)-DTPA (Gd) und Gadopentatdimeglumin zeigte wesentlich
bessere Ergebnisse für
PEG-Poly-1-lysin (MG 25 kD)-DTPA(Gd). Bei einer Untersuchung wurde
einer Ratte intravenös
MPEG-Poly-1-lysin-DTPA(Gd) (20 μmol
Gd/kg Gesamt-Körpergewicht)
(linkes Bild) injiziert und einer Ratte wurde intravenös Gadopentatdimeglumin
(100 μmol, Gd/kg,
von Magnevist®,
Berlex Labs) (rechtes Bild) injiziert. Unmittelbar, d. h. 10 Minuten,
nach der intravenösen
Verabreichung von Gd-DTPA oder dem MPEG-Derivat, hat das Gefäß/Muskel-Verhältnis von
1,4 auf 2,7 bzw. 1,4 auf 4,5 zugenommen. 30 Minuten nach der Verabreichung
betrugen die Verhältnisse
2,0 für
Gd-DTPA und 5,8 für
MPEG (MG 5 kD)-Poly-1-lysin
(MG 25 kD)-DTPA(Gd) bei einem p-Wert unter 0,001 (vergleiche 9). Gd-DTPA ergab zu Beginn
eine geringe Erhöhung
im Gefäßkontrast.
Jedoch, wenn Gd-DTPA durch den extravaskularen Raum verteilt wird,
geht der Kontrast verloren. Die erfindungsgemäßen MPEG-Derivat-Zusammensetzungen
ergaben wegen ihrer einzigartigen vaskulären Verteilung konstant höhere Verhältnisse.
Die Bilder wurden auf einem Sigma unter Verwendung einer 5 inch-Oberflächenspirale
aufgenommen (vergleiche 9).
-
Abbildungsversuche mit Kaninchen
und Minischwein(Körpergewicht
40 kg)-Thorax wurden durchgeführt
und zeigten die Möglichkeiten
der Visualisierung der Lungen- und Coronararterien unter Verwendung
der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
(vergleiche 10a und 10b). Gemäß einer Untersuchung wurde einem
Kaninchen MPEG(MG 2 kD)-Poly-1-lysin(MG 41 kD)-DTPA(Gd) (20 μmol Gd/ml)
injiziert. Die Bilder wurden 20 Minuten nach der Injektion auf einem
Sigma unter Verwendung einer 5 inch-Oberflächenspirale aufgenommen.
-
Die Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
zur Enthüllung
von Abnormalitäten der
Gefäße in einem
experimentell induzierten pathologischen Zustand wurde in Kanin chen
und Ratten getestet. Gemäß 3-D TOF
(Time of Flight)-MR-Angiographie
konnte die Verengung der Femoral-Arterie an der Stelle einer Versuchs-Stenose
zuverlässig
visualisiert werden. Für
die Visualisierung von Gefäßabnormalitäten bei der
Tumorprogression wurden Ratten mit R3230-Brustdrüsen-Adenokarzinom verwendet.
Gemäß einer
Untersuchung wurden die MR-Bilder der linken Flanke und des Femors
einer Ratte vor (vergleiche 11a)
und 20 Minuten nach (vergleiche 11b)
der intravenösen
Injektion von MPEG (MG 5 kD)-Poly-1-lysin(MG 25 kD)-DTPA (Gd) bei
20 μmol
Gd/ml gezeigt. Die Bilder wurden auf einem Sigma (GE Instruments,
1,5 T, 3-TOF SPGR/60 SE 60/6,5 256 × 192 2 NEX) unter Verwendung
einer 3-inch-Oberflächenspirale
aufgenommen.
-
Versuche mit Neoplasie in Ratten
unter Verwendung von 20 μmol
Gd/kg ergaben exklusiv informative kontrastverstärkte Angiogramme. Die Lokalisierung,
Größe und Grenzen
des Tumors und der absteigenden Venen konnten leicht an kollabierten
3-D-MR-Bildern erkannt werden. Daher können die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
für die
Detektion sowohl von Neoplasie und Tumor-Neovaskularität, die in
der klinischen Praxis für
das Staging und chirurgische Planen wichtig sind, verwendet werden.
-
Zusätzliche Tieruntersuchungen
unter Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen wurden
durchgeführt
um die in vivo-gamma-Abbildung; die Biokinetiken; die Immunantwort;
und die Kernspintomographie zu untersuchen.
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In vivo-gamma-Kameraabbildung
-
Sprague-Dawley-Ratten (200–250 g)
wurden in die Schwanzvene unter Verwendung einer 26 Gauge-Nadel
mit 1–10
mg/0,5 ml Produkt I oder III, markiert mit [111In]
und Gd, wie in Beispiel 6 beschrieben, injiziert. Bilder mit einer
gamma-Kamera (von
Ohio Nuclear) unter Verwendung eines Parallel- Medium-Energie-Kollimators wurden 30,
60, 120 Minuten und 24 und 70 Stunden nach der Injektion erhalten.
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Biokinetik des
Kontrastmittels
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Die Biokinetik von Gd- und (111In]-markiertem Produkt (III oder I) wurden
unter Verwendung von Sprague-Dawley-Ratten im Bereich von 230–250 g untersucht.
Den Tieren wurden in die Schwanzvene 1 bis 10 mg Polymeres (60–70 μCi/kg, 2 μm/kg Gd)
unter Verwendung einer 26 Gauge-Nadel unter Ether-Anästhesie
injiziert. Innerhalb dieser Dosisgrenzen wurde geringe Variation
in der Kinetik detektiert. Die Bioverteilung des markierten Produkts
wurde in 16 Organen, d. h. Organgeweben, durch Messung der Radioaktivität zu jedem
Zeitpunkt, der in der graphischen Darstellung angegeben ist, bestimmt.
Zwei Ratten wurden für
jeden Punkt verwendet (vergleiche 3).
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Testen der Immunantwort
in Mäusen
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Eine 0,2 ml-Probe des Produkts I
(0,5 mmol Gd/kg, d. h. eine 20-fache Abbildungsdosis) wurde intravenös oder intraperitoneal
C3H/He-Mäusen
(n = 2) injiziert. Die Vergleichstiere erhielten BSA-DTPA(Gd) mit der
gleichen Menge an Gd-DTPA, hergestellt wie von Hnatowich D. J. et
al., Science 1979, beschrieben, im gleichen Volumen an Salzlösung. Die
Tiere wurden 2 Wochen auf Anzeichen von Toxizität beobachtet. Es wurden keine
Anzeichen von Toxizität
detektiert. Nach der Zeit von 2 Wochen wurde Blut aus der Schwanzvene der
Tiere entnommen und der Titer der Antikörper wurde durch einen enzymgebundenen
Immunoadsorbensassay (ELISA) detektiert. Die ELISA-Platten wurden
mit Ovalbumin-DTPA(Gd), Ovalbumin-MPEG, BSA oder acetyliertem Poy-1-lysin (MG 70000)
beschichtet. Nur Vertiefungen der Platte, beschichtet mit Ovalbumin-DTPA(Gd)
zeigten eine spezifische Bindung von Maus-Immunglobulinen.
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MR-Abbildung
-
Zur Visualisierung der Blutgefäße in Versuchstieren
wurden 0,005–0,05
mmol Gd/kg Produkt II männlichen
Sprague-Dawley-Ratten
(260–360
g) unter Verwendung einer 26 Gauge-Butterfly-Nadel in 0,3 ml steriler Salzlösung unter
einer Barbiturat-induzierten Anästhesie
injiziert. Geeignete Oberflächenspiralen,
5 inch für zwei
Tiere und 3 Inch für
ein Tier, wurden angewendet (vergleiche 8a und 8b und 9).
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Bei Versuchen mit Kaninchen und Minischweinen
wurden die Tiere intubiert. Die Anästhesie erfolgte unter Verwendung
von Inhalations-Isofluran. Die Elektrokardiographie wurde konstant überwacht.
Das Produkt II wurde bei 0,03 mmol Gd/kg über einen Katheter, eingesetzt
an der linken femoralen Arterie, injiziert. Eine Extremitäten-Oberflächenspirale
wurde für
die Kaninchen-Untersuchungen verwendet; eine Kopfspirale wurde bei
den Minischwein-Untersuchungen angewendet (vergleiche 10a und 10b).
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Bei Ratten-Untersuchungen wurden
48 Sagittal-Objektträger
auf General Electric CSI (Dicke = 0,7 mm) unter Verwendung einer
T1-gewogenen 3D – Time
of Flight SPGR-Pulsesequenz (1,5 T, SE 50/6,5, Flip-Winkel 60) abgebildet.
Bei Kaninchen- und Minischwein-Untersuchungen wurden bis zu 80 Objektträger abgebildet
(vergleiche 10a und 10b).
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Verwendung der
Zusammensetzungen als Kontrastmittel
-
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können bei
der medizinischen Abbildung verwendet werden und intravaskulär oder durch
Bolus-Injektion verabreicht werden. Die vaskulären Bilder sind, bedingt durch
die Änderungen
der Blutrelaxivität
oder der Radioaktivität,
verstärkt.
Die Kontrastmittel können
für die Verbesserung
vaskulärer
Bilder großer
Gefäße, beispielsweise
der Arterien und der Ve nen oder zur Visualisierung kleiner Gefäße, beispielsweise
Submillimeter-Kapillaren, verwendet werden. Die Auflösung der
Bilder erhöht
sich, wodurch bessere Informationen in Einzelheiten erhalten werden.
Die Kontrastmittel können
für vaskuläres Anatomie-Mapping,
die Bestimmung der Gefäß-Stenose, der abnormalen
Vaskularität,
beispielsweise der Neovaskularität,
der normalen Perfusion, der Perfusions-Fehler oder für die funktionelle Abbildung
des Gehirns verwendet werden.
-
Verwendung der
Zusammensetzung als therapeutisches Mittel
-
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können ebenfalls
ein therapeutisches Mittel enthalten, beispielsweise eine oder mehrere
Spezies von Cytostatika, Analgetika, antiinflammatorischen, antiviralen,
antifungalen oder psychotropen Arzneimitteln. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen,
die therapeutische Mittel enthalten, sind günstig, da die verlängerte Zirkulation
der Zusammensetzung im Blut im Wesentlichen die therapeutische Wirkung
des therapeutischen Mittels verlängert.
Damit eine therapeutische Wirkung erhalten wird, sollte das therapeutische
Mittel langsam den polymeren Träger
verlassen oder sich abkuppeln. Dies kann durch eine abkuppelbare
Verbindung oder durch Positionierung einer semipermeablen Membran um
den Träger
unter Bildung eines Vesikels erfolgen, wodurch das Arzneimittel
in der Nachbarschaft des polymeren Trägers konzentriert werden kann
und langsam durch die Membran in den intravaskulären Raum diffundiert. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen,
die therapeutische Mittel enthalten, können intravaskulär oder durch
Bolus-Injektion verabreicht werden.
-
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen werden
in den folgenden Beispielen und Versuchsteilen, die Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung sind, beschrieben und dies soll keine
Beschränkung des
Rahmens der Erfindung sein.
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Beispiele und
Versuchsergebnisse
-
Beispiel 1: Synthese von
PEG-Poly-1-lysin (300)-DTPA Produkt I
-
Synthese von
MPEG-Succinat
-
6,5 g MPEG (MG 2000) werden in 25
ml peroxidfreiem Dioxan bei 60°C
gelöst
und mit einer vorerhitzten Lösung
von 1,6 g Bernsteinsäureanhydrid
in einem 5-fachen molaren Überschuss
in 25 ml Dioxan vermischt. 300 mg N,N'-Dimethylaminopyridin werden als Katalysator
in 10 ml Dioxan gelöst
und zu dem Reaktionsgemisch zugegeben. Das Gemisch wird bei 90°C 5 Stunden
inkubiert. Das Dioxan wird durch Rotationsverdampfung bei 40°C entfernt
und der Feststoff wird in einer minimalen Menge, beispielsweise
7–10 ml,
Methylenchlorid gelöst,
auf –10°C gekühlt und
auf einer Glasfilterfritte zur Entfernung des Präzipitats der Bernsteinsäure filtriert.
Es werden 300 ml Ethylether pro je 5 ml Filtrat zugegeben und dann
wird die trübe
Lösung bei –20°C zur Präzipitation
des MPEG-Succinats erhalten. Das Präzipitat wird auf einer Glasfilterfritte
filtriert und mit Ethylether gewaschen.
-
5,6 g des trockenen Präzipitats
werden in 40 ml Wasser gelöst
und durch ein AG 50W X8-Harz (15 g nasses Harz, behandelt mit 50%
Ethanol und entionisiertem Wasser) auf einer 30 μm Glasfilterfritte zur Entfernung
des verbleibenden Katalysators behandelt.
-
Eine 5 g Probe von MPEG2000-Succinat
wurde als farbloser amorpher Feststoff erhalten (86% Ausbeute).
Der Rf betrug 0,8 auf Silicagel-60-TLC-Platten (von EM Sciences)
(entwickelt mit einer Lösung
von Chloroform : Methanol : 15 mM CaCl2 in
einem Verhältnis
von 65 : 35 : 2). Der Rf betrug 0,5 an RP-18-TLC-Platten (von EM Sciences) am
gleichen System nach der Anfärbung
mit Ioddampf.
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Synthese von
MPEG-Succinyl-N-hydroxysuccinimidylester
-
Das lyophilisierte MPEG-Succinatprodukt
(2 g, 0,5 mmol) wurde in 10 ml peroxidfreiem Dioxan, welches einen
Peroxid-Empfindlichkeitstest bestanden hatte, gelöst. Nacheinander
wurden zu dem Gemisch zugegeben: 0,11 g N-Hydroxysuccinimid (Fluka Chemie AG,
Buchs, Schweiz) und 0,15 g (0,55 mmol, 1,1 molarer Überschuss)
Dicyclohexylcarbodiimid (Fluka Chemie AG, Buchs, Schweiz). Das Reaktionsgemisch
wurde 6 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und auf Eis gekühlt. Der
Dicyclohexylharnstoff wurde durch Filtration durch eine Glasfilterfritte
oder durch ein GF-C-Glaswollefilter
entfernt. Das Dioxan wurde an einem Rotationsverdampfer entfernt
und 10 ml Methylenchlorid wurden zugegeben und dann wurde mit 100
ml Ether unter kontinuierlichem Rühren vermischt. Das Präzipitat
wurde b20°C über Nacht
gelagert. Das Produkt wurde abfiltriert und aus einem Dichlorethan-Ethan-Gemisch
bei einem Verhältnis
von 1 : 9 umkristallisiert.
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Test für einen
aktivierten Ester von MPEG-Succinat
-
Der Prozentgehalt des aktivierten
Esters im Feststoff wurde bestimmt durch Solubilisierung von 1,5
mg Produkt in wasserfreiem DMSO (100 μl). Es wurden 10 μl der Lösung zu
800 μl 0,05
M Natriumphosphat (pH 8,5) zugegeben. Die Extinction bei 260 nm
während
30 Minuten wurde aufgezeichnet. Eine Erhöhung in der Extinction war
durch Hydrolyse des aktivierten Esters (e260 = 8260 [mol cm]–1 für N-Hydroxysuccinimid
bei pH 8,5) bedingt. Es wurde gefunden, dass ungefähr 75% der
erhaltenen Zusammensetzung aktivierter Ester waren. Der Rf betrug
0,95 auf Silicagel 60 (entwickelt mit einer Lösung von Chloroform : Methanol
: 15 mM CaCl2 bei einem Verhältnis von
65 : 35 : 2) nach UV-Visualisierung
mit Ammoniakdämpfen.
-
Synthese von MPEG-Poly-1-lysin-DTPA
-
816 mg Poly-1-lysin (PL-Hydrobromid,
MG 67000 (Sigma Chemical Co.), DP: 324 1-Lysinreste, 25 mM ε-Aminogruppen
von 1-Lysin, Hydrobromid) in 38 ml 0,1 M Carbonatpuffer (pH 8,7)
wurden gelöst.
3,1 g MPEG Succinylhydroxysuccimidylester (MPEGOSu, MG 2200) wurden
in 15 ml trockenem DMSO gelöst.
Die MPEGOSu-Lösung
wurde tropfenweise zu der PL-Lösung unter
Rühren
gegeben und dann wurde das Gemisch für 2 Stunden unter Rühren inkubiert.
-
Der Grad der Modifizierung wurde
durch Trinitrobenzolsulfonsäuretitration,
wie sie von Spadaro, A. C. C. et al., Anal. Biochem. 96: 317 (1979)
verwendet wurde, geprüft.
10 μl der
Probe, 100 μl
Wasser, 100 μl 10%iges
Triton X-100, 100 μl
0,1 M Natriumtetraborat und 0,35 ml 2 mg/ml TNBS wurden in einem
Reagensglas vermischt. Es wurde während 45 Minuten inkubiert.
Die Inkubation wurde durch Zugabe von 2,3 mg/ml Natriumsulfit in
5M NaH2PO4 beendigt.
Die Extinction wurde bei 420 nm bestimmt und mit der von PL verglichen.
Die Menge an modifizierten Gruppen wurde bestimmt und sie war gleich
30%.
-
Eine Suspension des cyclischen Anhydrids
von DTPA (0,5 g/ml in DMSO) wurde durch Zugabe von 200 μl-Portionen
(1,5 g cDTPA insgesamt) zu der Lösung
von PL und MPEG hergestellt und der pH wurde auf 8 mit 5 N NaOH
nach jeder Zugabe eingestellt. Die Menge an titrierbaren Aminogruppen
wurde erneut geprüft und
es konnten keine freien Aminogruppen detektiert werden.
-
Reinigung von MPEG-Poly-1-lysin-DTPA
-
Das Reaktionsgemisch von MPEG-Poly-1-lysin-DTPA(MPEG-PL-DTPA) wurde auf 300
ml mit 0,2 M Natriumcitrat (pH 6,0) verdünnt, dann wurde es durch einen
0,45 μ-Nylonfilter
filtriert und in einer Durchströmungszelle
unter Verwen dung einer Membran mit einer Ausschlußgrenze
von 100 kD (für
globuläre
Proteine) dialysiert. Es wurde auf 30 bis 50 ml konzentriert und
mit Citrat auf 300 ml verdünnt.
Das Verfahren wurde 2mal unter Verwendung von Wasser anstelle von
Citrat bei der letzten Stufe wiederholt. Die Lösung wurde auf 15 ml konzentriert
und lyophilisiert. Alternativ kann die Probe durch eine sterile
0,2 μm-Membran
filtriert und bei 4°C
gelagert werden. Eine Tabelle der theoretischen und tatsächlichen
chemischen Analyse folgt:
-
Chemische Analyse:
-
Theoretisch % C 46,7, %H 7,0, %N
8,0
Tatsächlich
% C 41,2, %H 6,4, %N 9,7
-
Beispiel 2: Synthese von
MPEG(MG 5kD)-Poly-1-lysin (MG 25 kD)-DTPA, Produkt II
-
Synthese von
MPEG-Succinat
-
40 g MPEG (MG 5000) werden in 250
ml peroxidfreiem Dioxan bei 60°C
gelöst
und mit einer vorerhitzten Lösung
von 8 g Bernsteinsäureanhydrid
(10facher molarer Überschuss)
in 50 ml Dioxan vermischt. 900 mg N,N'-Dimethylaminopyridin werden
als Katalysator in 10 ml Dioxan gelöst und zu dem Reaktionsgemisch zugegeben.
Das Gemisch wird bei 90°C
8 Stunden inkubiert.
-
Das Dioxan wird durch Rotationsverdampfung
bei 40°C
entfernt und der Feststoff wird in 20 ml Methylenchlorid gelöst, auf –10°C gekühlt und
auf einer Glasfilterfritte zur Entfernung des Präzipitats aus Bernsteinsäure filtriert.
Es werden 300 ml Ethylether pro je 10 ml Filtrat zugegeben und aus
der trüben
Lösung
von MPEG wird bei –20°C das Succinat
präzipitiert.
Das Präzipitat
wird auf einer Glasfilterfritte (10–20 μ, Corning) filtriert und dann
wird mit kaltem Ether gewaschen.
-
35 g des trockenen Präzipitats
werden mit 100 ml Wasser verdünnt
und durch ein AG 50W X8-Harz (25 g nasses Harz, behandelt mit 50%
Ethanol und entionisiertem Wasser) auf einem 100 μm Glasfilter
zur Entfernung des verbleibenden Katalysators geleitet. Zur Verringerung
der Menge an kontaminierten Peroxiden wurde die Lösung aus
MPEG2000-Succinat
in Wasser mit 10 mM Natriumborhydrid während 4 Stunden bei Raumtemperatur
behandelt. Die Lösung
wurde lyophilisiert, die Lösung
wurde in Methylenchlorid (0,1 g/ml) wiedergelöst und die Lösung wurde
durch Zugabe von Diethylether wiedersedimentiert. Es wurde eine
30 g-Probe aus MPEG5000-Succinat (83% Ausbeute) als farbloser amorpher
Feststoff erhalten. Der Rf betrug 0,5 an RP-18-TLC-Platten (von EM Sciences)
(entwickelt mit einer Lösung
von Chloroform : Ethanol : Wasser bei einem Verhältnis von 65 : 25 : 4) nach
dem Anfärben
mit Ioddampf.
-
Synthese von
MPEG-Succinyl-N-hydroxysuccinimidylester
-
Zur Auflösung von 5,29 g (1 mmol) des
lyophilisierten MPEG-Succinatprodukts in 40 ml peroxidfreiem Tetrahydrofuran,
welches einen Peroxid-Empfindlichkeits-Test bestand, wurden 0,17
g N-Hydroxysuccinimid (1,5 mmol, Fluka Chemie AG, Buchs, Schweiz)
und 0,3 (1,1 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid (Fluka) zugegeben. Das
Reaktionsgemisch wurde 6 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und
dann auf Eis gekühlt.
Der Dicyclohexylharnstoff wurde durch Filtration durch eine Glasfilterfritte
(20–30 μ, Corning)
entfernt. Das Tetrahydrofuran wurde an einem Rotationsverdampfer
entfernt, es wurden 10 ml Methylenchlorid zugegeben und mit 100
ml Ether unter kontinuierlichem Rühren vermischt. Das Präzipitat
wurde –20°C über Nacht
erhalten. Das Produkt wurde abfiltriert und aus einem Dichlorethan-Ether-Gemisch in einem
Verhältnis
von 1 : 9 umkristallisiert.
-
Test für einen
aktivierten Ester von MPEG-Succinat
-
Der Prozentgehalt an aktiviertem
Ester in dem Feststoff, der erhalten wurde, wurde wie in Beispiel
1 beschrieben bestimmt.
-
Synthese von PEG-Poly-1-lysin-DTPA
-
Es wurden 620 mg Poly-1-lysin (PL-Hydrobromid,
MG 41100, (Sigma Chemical Co.) DP: 196 1-Lysinrest, 25 mM ε-Aminogruppen von
1-Lysinhydrobromid) in 112 ml 0,1 M Carbonatpuffer (pH 8,7) gelöst. 2,9
g Methoxypolyethylenglykolsuccinylhydroxysuccimidylester (MPEGOSu,
MG 5200) wurden in 5 ml trockenem DMSO gelöst. Die PEGOSu-Lösung wurde
tropfenweise zu der PL-Lösung
unter Rühren
gegeben und dann wurde das Gemisch 2 Stunden unter Rühren inkubiert.
Der Modifizierungsgrad wurde durch Trinitrobenzolsulfonsäuretitration
wie in Beispiel 1 beschrieben geprüft.
-
Es wurde eine Suspension aus cyclischem
Anhydrid von DTPA (0,5 g/ml in DMSO) durch Zugabe von 200 μl-Portionen
(1,5 g von cDTPA insgesamt) zu der Lösung von MPEG-PL und Einstellen
des pH auf 8 mit 5 N NaOH nach jeder Zugabe hergestellt. Alternativ
kann die Lösung
durch Mischen von 2,5 mmol DTPA, 0,5 mmol N-Hydroxysulfosuccinimid
(pH 4) und 0,5 mmol Ethyldiaminopropylcarbodiimid in 50 ml Wasser
hergestellt werden. Die Lösung
wird dann 3 min vermischt und zu dem Gemisch der Lösung von
MPEG-PL (pH 8) gegeben. Die Menge an titrierbaren Aminogruppen wird
geprüft.
(Es wurden keine titrierbaren Aminogruppen detektiert).
-
Reinigung von
MPEG-PL-DTPA
-
Das Reaktionsgemisch wird mit 0,2
M Natriumcitrat (pH 6) auf 300 ml verdünnt, durch ein 0,45 μ-Nylonfilter
filtriert und in einer Durchströmungszelle
unter Verwendung einer Membran mit einer Ausschlußgrenze von
50 kD (für globuläre Proteine)
dialysiert. Es wurde auf 30–50
ml konzentriert und mit Citrat auf 300 ml verdünnt. Das Verfahren wird 2mal
unter Verwendung von Wasser anstelle von Citrat bei der letzten
Stufe wiederholt. Die Lösung
wird auf 15 ml konzentriert und lyophilisiert. Alternativ wird die
Probe durch eine sterile 0,2 μm-Membran
filtriert und bei 4°C
gelagert. Eine Tabelle der theoretischen und chemischen Analyse
wird im Folgenden angegeben:
-
Chemische Analyse
-
Theoretisch %C 51,2, %H 8,2, %N 2,7
Tatsächlich %C
46,4, %H 7,8, %N 3,7
-
Beispiel 3: Synthese von
MPEG-Poly-1-lysin(MG 67 kD)-DTPA Produkt III
-
Das Verfahren von Beispiel 1 wird
wiederholt, wobei Poly-1-lysin
mit einem mittleren Molekulargewicht von 110000 verwendet wird.
-
Beispiel 4: Synthese von
MPEG-Poly-1-lysin (MG 53 5 kD)-DTPA,
Produkt IV
-
Das Verfahren der Beispiele 1 und
2 wird wiederholt, wobei Poly-1-lysin mit einem mittleren Molekulargewicht
von 87400 und MPEG (MG 5000)Succinylsuccinat verwendet werden.
-
Beispiel 5: Synthese von
MPEG-Poly-1-lysin(69)- (dithio)propionylpoly-1-lysin-DTPA Produkt
V
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50 mg N-ε-Benzoyloxycarbonyl-poly-1-lysin
werden in 3 ml Dimethylformamid gelöst und mit 10 mg N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat
in Anwesenheit von 20 μl
Triethylamin behandelt. Das Produkt wurde über Nacht inkubiert und durch
Zugabe von 20 ml Wasser präzipitiert.
Das präzipitierte
Produkt wird gefriergetrocknet und in zwei gleiche Teile geteilt.
Der erste Teil wird in Dimethylformamid (0,5 ml) wiedergelöst und 20
Minuten mit 10 mM beta-Mercaptoethanol
behandelt und durch Zugabe von 10 ml Stickstoff-gesättigtem Wasser
präzipitiert
und gefriergetrocknet. Das Produkt wird zusammen mit dem zweiten
Teil der Verbindung in 2 ml Dimethylformamid wiedergelöst und dann
werden 5 μl
Triethylamin zugegeben. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur über Nacht
gerührt.
Das Produkt wird präzipitiert
und mit Wasser gewaschen und dann wird das Produkt in 1 ml HBr in
Eisessiglösung
wiedergelöst,
1 Stunde inkubiert und mit 20 ml destilliertem Ethylether verdünnt. Das
Präzipitat
wird mit Ether gewaschen und in das MPEG-Derivat und dann in das
MPEG-DTPA-Derivat wie in Beispiel 1 beschrieben überführt, wobei DMFA anstelle von
DMSO für
die Solubilisierung von MPEG-Succinylsuccinat und DTPA-cyclischem
Anhydrid verwendet wird.
-
Beispiel 6: Herstellung
von [111In]-markierten Produkten I, II,
III oder IV
-
Es werden 100 bis 500 μl [111In]-Citratlösung (pH 4,5) mit Gesamtaktivität von 30
bis 500 μCi
hergestellt. 1 mg der Produkte I, II, III oder IV, wie oben hergestellt,
werden in Citrat-Balance-Salzlösung
(CBS) aus 10 mM Citrat, 0,15 M NaCl (pH 6,6) gelöst. Die Lösungen werden vermischt und
30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Es wird durch Dialyse gegenüber 4 Änderungen
von 100 ml CBS gereinigt. Es wurde gefunden, dass das dialysierte
Produkt 98 bis 100% der Radioaktivität enthielt.
-
Beispiel 7: Herstellung
von Gadolinium-markierten Produkten I, II, III oder IV
-
Es werden 100 ml einer 20 mM-Lösung von
GdCl, in 0,2 M Citrat (pH 5,5) hergestellt. 0,1 bis 100 mg der Produkte
I, II, III oder IV werden in 1 bis 5 ml Wasser gelöst und in
Dialysebeutel mit Poren, die klein genug sind um Moleküle, größer als
10 kD zurückzuhalten,
gegeben. Die Dialy sebeutel werden in eine Gd-Citrat-Lösung während 8
bis 10 Stunden gegeben. Die Gd-Citratlösung wird durch 0,2 mM Citrat
und schließlich
durch 10 mM Citrat-ausgeglichene Salzlösung (Osmolarität beträgt 300 mOsm)
ersetzt. Die Gadolinium-markierten Produkte werden steril filtriert
oder lyophilisiert.
-
Beispiel 8: Herstellung
von [111In]- und Gadoliniummarkierten Produkten
I, II, III oder IV
-
Gemäß den Verfahren von Beispiel
4 werden die Produkte hergestellt und dann werden die Dialysebeutel
in eine Gd-Citrat-Lösung, wie
in Beispiel 7 beschrieben, transferriert.
-
Beispiel 9: Reinigung von
markierten Produkten I, II, III oder IV
-
Eine Lösung von Gadolinium- oder [111In]- und Gadoliniummarkierten Produkten
wurde mit 50 bis 100 mg Polymer/ml und 5 mM Natriumcitrat (pH 6)
hergestellt. Die Lösung
wurde auf eine Säule
aus Sephadex A-25 (1 × 40
ml, 5 mM Citrat, pH 6) gegeben und das nicht-gebundene Material
wurde mit dem gleichen. Puffer eluiert, der gesammelt, gegen Wasser
dialysiert und lyophilisiert wurde.
-
Obgleich die obigen Beispiele allgemeine
und spezifische Richtlinien für
die Herstellung und Verwendung der erfindungsgemäßen Kontrastmittel sind, kann
der Fachmann zusätzliche
Kandidat-Moleküle
synthetisieren und ihre charakteristischen Eigenschaften mit solchen
Verbindungen vergleichen, die von der vorliegenden Erfindung beansprucht
werden.
-
Experimentelle Charakterisierung
der Produkte
-
Bestimmung der Größe
-
Die offensichtlichen hydrodynamischen
Radii wurden unter Verwendung der Gelfiltration an einer Ultragel
AcA-34-Säule (von
LKB-IBF, Frankreich) (1 × 40
ml) und mit einem LALLS (Submicron Particle Analyzer N-4MD von Coulter,
Hialeah, FL) bestimmt.
-
Die Lösungen der Produkte I bis IV
in Gd-markierter Form wurden mit 1 mg Polymer/ml hergestellt und die
Größen wurden
mit einer Größen-Verteilungs-Prozessor(SDP)-Gewichtsanalyse
bei einem 90° Streuwinkel
vor und nach der Bildung der Gd-Komplexe (vergleiche Tabelle 1)
bestimmt. Die Berechnung der Molekulargewichte beruhte auf der Bestimmung
des Grads der Modifizierung der PL mit MPEG, wie in Beispiel 1 beschrieben,
unter der Annahme, dass auf der zweiten Stufe der Modifizierung
alle Aminogruppen durch DTPA substituiert waren.
-
-
Bemerkung:
-
Die AcA-34-Säule wurde mit globulären Protein-Molekulargewichtsmarkern
vorkalibriert; ND: Keine Daten verfügbar
-
Bestimmung des
Gd-Gehalts
-
Der Gd-Gehalt wurde titrametrisch
(wie in Korbl, J. und Pribil, R., Chemist-Analyst 45: 101–103 (1956) beschrieben,
oder durch Plasma-Emissions-Spektroskopie (von Gallbraith Labs,
Knoxville, TN) bestimmt. Der Gd-Gehalt überschritt nicht 13,18 Gew.-%
(0,8 mmol Gd/g Polymer, Produkt I). Typischerweise enthielten die Produkte
II, III und IV ca. 5 Gew.-% Gd (0,32 mmol Gd/g Polymer).
-
Messung der Relaxivitätswerte
(R1 und R2)
-
Die Bestimmung der Relaxationszeiten
der H2O-Protonen erfolgte unter Verwendung
eines Minispec(IBM PC/20)pulsierten NMR-Spektrometers bei 20 MHz
bei 38°C.
Die Gd-markierten
Produkte wurden auf geeignete Weise mit CBS verdünnt und die T1- und T2-Parameter
wurden gemessen. Die Inversions-Wiederherstellung und die CPMG-Pulssequenzen
wurden zur Bestimmung der T1- bzw. T2-Werte verwendet. Die Konzentrationsabhängigkeiten
der Relaxationsraten 1/T1 und 1/T2 wurden graphisch aufgetragen
und unter Verwendung einer linearen Regression (r = 0,99) angepasst.
Die R1- und R2-Werte wurden als Steigungswerte bestimmt (vergleiche
Tabelle 2).
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Andere Ausführungsformen fallen ebenfalls
unter die Ansprüche.