JP5416970B2 - ニコチン酸及びピコリン酸誘導近赤外線蛍光団 - Google Patents

Description

（関連出願）
本出願は、米国仮特許出願第６０／７１４，０７４号（２００５年９月２日出願）の優先権を主張する。

上記出願の全教示は、本明細書中で参考として援用される。

（発明の背景）
光学イメージングは、画像の作成に透過光の光線を使用する革新的な臨床イメージング様式である。赤色及び近赤外（ＮＩＲ）範囲（６００〜１２００ｎｍ）のを使用することで、組織透過性を最大限にし、ヘモグロビン及び水等の天然の生物学的吸収物質からの吸収を最小限にすることができる（非特許文献１；Ｔｒｏｍｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ Ｂ ３５２：６６１−６６７，１９９７）。

光学イメージング法は、非侵襲性であるだけでなく、その他のイメージング法よりも優れた幾つかの利点がある；即ち、一般的には高感度であり、被験対象又は実験担当者を電離放射線に曝露する必要がなく、複数の区別可能プローブを同時に使用することができ（分子イメージングで重要）、時間的及び空間的に高解像度である（それぞれ機能イメージング及びｉｎ ｖｉｖｏ顕微鏡検査で重要）を与える。

蛍光イメージングでは、フィルタリングした光又は所定の帯域幅を有するレーザーを、励起光源として使用する。励起光は身体組織を通過する。励起光がレポーター分子（即ち、造影剤又はイメージング剤）と遭遇すると、これは励起光とは検出可能に異なる性質を有する。その結果得られた放射光線を画像の構築に使用することができる。

大部分の光学イメージング法は、レポーター分子としての有機及び無機の蛍光分子の使用に依存している。

蛍光色素は一般的に知られており、蛍光標識に、並びに蛍光顕微鏡検査、蛍光免疫学的検定試験及びフローサイトメトリー等の操作法による種々の生物学的及び非生物学的物質の検出に使用されている。蛍光色素を使用してこのような物質を標識する一般的な方法には、染料分子上の好適な基と標識する物質上の適合する基との結合によって蛍光錯体を形成する方法がある。この方法では、細胞、組織、アミノ酸、タンパク質、抗体、薬剤、ホルモン、ヌクレオチド、核酸、脂質及び多糖等の物質が化学的に標識され、検出又は定量される場合もあれば、標的物質に特異的に結合できる蛍光プローブとして使用され、蛍光検出法により検出される場合もある。高輝度の蛍光色素は、結合した物質を高感度で検出又は特定することができる。

特定のカルボシアニン又はポリメチン染料は、種々の生物学的用途における標識試薬としての有用性が明らかにされている（例えば、何れも参考として本明細書で援用される、特許文献１（Ｓｏｕｔｈｗｉｃｋ，ｅｔ ａｌ．；１９９１年）；米国特許第５，２６８，４８６号（Ｗａｇｇｏｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．；１９９３年）；米国特許第５，５６９，５８７号（Ｗａｇｇｏｎｅｒ；１９９６年）；米国特許第５，５６９，７６６号（Ｗａｇｇｏｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．；１９９６年）；米国特許第５，４８６，６１６号（Ｗａｇｇｏｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．；１９９６年）；米国特許第５，６２７，０２７号（Ｗａｇｇｏｎｅｒ；１９９７年）；米国特許第５，８０８，０４４号（Ｂｒｕｓｈ，ｅｔ ａｌ．；１９９８年）；米国特許第５，８７７，３１０号（Ｒｅｄｄｉｎｇｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．；１９９９年）；米国特許第６，００２，００３号（Ｓｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．；１９９９年）；米国特許第６，００４，５３６号（Ｌｅｕｎｇ，ｅｔ ａｌ．；１９９９年）；米国特許第６，００８，３７３号（Ｗａｇｇｏｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．；１９９９年）；米国特許第６，０４３，０２５号（Ｍｉｎｄｅｎ，ｅｔ ａｌ．；２０００年）；米国特許第６，１２７，１３４号（Ｍｉｎｄｅｎ，ｅｔ ａｌ．；２０００年）；米国特許第６，１３０，０９４号（Ｗａｇｇｏｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．；２０００年）；米国特許第６，１３３，４４５号（Ｗａｇｇｏｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．；２０００年）；並びに国際特許第ＷＯ ９７／４０１０４号、第ＷＯ ９９／５１７０２号、第ＷＯ ０１／２１６２４号；並びに欧州特許第ＥＰ １ ０６５ ２５０ Ａｌ号；並びにＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４１，９１８５−８８（２０００））。

ポリメチン染料に関する包括的な考察については、非特許文献２；Ｌ．Ｇ．Ｓ．Ｂｒｏｏｋｅｒ，“Ｔｈｅ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｈｏｔｏｇｒａｐｈｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓ” Ｍｅｅｓ Ｅｄ．，Ｍａｃｍｉｌｌａｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９６６），ｐ．１９８；Ｆｒａｎｃｅｓ Ｍ．Ｈａｍｅｒ，“Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ”，Ｖｏｌ １８，“Ｔｈｅ Ｃｙａｎｉｎｅ Ｄｙｅｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ”，Ｗｅｉｓｓｂｅｒｇｅｒ，Ｅｄ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９６４）；Ｇ．Ｅ．Ｆｉｃｋｅｎ，“Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｄｙｅｓ”，Ｖｏｌ ４，Ｋ．Ｖｅｎｋａｔａｒａｍａｎ Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９７１），ｐ．２１１；Ａ．Ｉ．Ｋｉｐｒｉａｎｏｖ，Ｕｓｐ．Ｋｈｉｍ．，２９，１３３６，（１９６０），３５，３６１（１９６６），４０，５９４（１９７１）；Ｄ．Ｗ．Ｈｅｓｅｌｔｉｎｅ，“Ｔｈｅ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｈｏｔｏｇｒａｐｈｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓ”，４^ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊａｍｅｓ Ｅｄ．，Ｍａｃｍｉｌｌａｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９７７），ｃｈａｐｔｅｒ ８，“Ｓｅｎｓｉｔｉｓｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｓｅｎｓｉｔｉｓｉｎｇ Ｄｙｅｓ”； Ｓ．Ｄａｅｈｎｅ，Ｐｈｏｔ．Ｓｃｉ．Ｅｎｇ．，１２，２１９（１９７９）；Ｄ．Ｊ．Ｆｒｙ，“Ｒｏｄｄ’ｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｃａｒｂｏｎ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ”，“Ｃｙａｎｉｎｅ Ｄｙｅｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ”，Ｖｏｌ．ＩＶｂ，ｃｈａｐｔｅｒ １５，ｐ．３６９ Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，（１９７７）；Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ｔｏ Ｖｏｌ．ＩＶｂ，２^ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８５），ｐ．２６７；Ｈ．Ｚｏｌｌｉｎｇｅｒ，“Ｃｏｌｏｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ（１９８７），ｃｈａｐｔｅｒｓ３ ａｎｄ １４；Ｄ．Ｍ．Ｓｔｕｒｍｅｒ，“Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ”，“Ｓｐｅｃｉａｌ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，ｃｈａｐｔｅｒ ＶＩＩＩ，“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｃｙａｎｉｎｅ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｄｙｅｓ”，Ｗｅｉｓｓｂｅｒｇｅｒ Ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９７７）；“Ｔｈｅ Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉａ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ” Ｖｏｌ ７，ｐ．７８２，“Ｃｙａｎｉｎｅ Ｄｙｅｓ”，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ−Ｙｏｒｋ，（１９９３）に記載されている。

標識として有用であるには、染料は官能基を含有する好適な側鎖を有する必要がある。別の分子とのコンジュゲーション又は結合のために官能基を含有する側鎖を構造内に導入するための方法及び部位は、標識試薬としての染料の使用に関する本発明の革新的な手順である。一般的には、架橋又は精製の問題を回避するために、このように官能化された側鎖が１つのみ使用される。ポリメチン標識試薬の設計における一態様は、以下の化学式（Ｉ）の通り、官能化された側鎖を染料の複素環核の１つに結合させる方法である：

（例えば、非特許文献３；Ｒ．Ｂ．Ｍｕｊｕｍｄａｒ，Ｌ．Ａ．Ｅｒｎｓｔ，Ｓ．Ｒ．Ｍｕｊｕｒｎｄａｒ，ａｎｄ Ａ．Ｓ．Ｗａｇｇｏｎｅｒ，“Ｃｙａｎｉｎｅ Ｄｙｅ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ Ｇｒｏｕｐｓ”，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，１０，１１（１９８９）；Ｌ．Ａ．Ｅｒｎｓｔ，Ｒ．Ｋ．Ｇｕｐｔａ，Ｒ．Ｂ．Ｍｕｊｕｍｄａｒ，ａｎｄ Ａ．Ｓ．Ｗａｇｇｏｎｅｒ，“Ｃｙａｎｉｎｅ Ｄｙｅ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ ｓｕｌｐｈｙｄｒｙｌ Ｇｒｏｕｐｓ”，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，１０，３，（１９８９）；Ｐ．Ｌ．Ｓｏｕｔｈｗｉｃｋ Ｐ．Ｌ．，Ｌ．Ａ．Ｅｒｎｓｔ，Ｅ．Ｗ．Ｔａｕｒｉｅｌｌｏ，Ｓ．Ｒ．Ｐａｒｋｅｒ，Ｒ．Ｂ．Ｍｕｊｕｍｄａｒ，Ｓ．Ｒ．Ｍｕｊｕｍｄａｒ，Ｈ．Ａ，Ｃｌｅｖｅｒ，ａｎｄ Ａ．Ｓ．Ｗａｇｇｏｎｅｒ，“Ｃｙａｎｉｎｅ Ｄｙｅ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔｓ−Ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｉｎｄｏｃｙａｎｉｎｅ Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ Ｅｓｔｅｒｓ”，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ １１，４１８（１９９０）；Ｒ．Ｂ．Ｍｕｊｕｍｄａｒ，Ｌ．Ａ．Ｅｒｎｓｔ，Ｓｗａｔｉ Ｒ．Ｍｕｊｕｍｄａｒ，Ｃ．Ｊ．Ｌｅｗｉｓ，ａｎｄ Ａ．Ｓ．Ｗａｇｇｏｎｅｒ，“Ｃｙａｎｉｎｅ Ｄｙｅ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔｓ：Ｓｕｌｆｏｉｎｄｏｃｙａｎｉｎｅ Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ Ｅｓｔｅｒｓ”，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４，１０５，（１９９３）；Ａ．Ｊ．Ｇ．Ｍａｎｋ，Ｅ．Ｊ．Ｍｏｌｅｎａａｒ，Ｈ．Ｌｉｎｇｅｍａｎ，Ｃ．Ｇｏｏｊｅｒ，Ｕ．Ａ．Ｔｈ．Ｂｒｉｎｋｍａｎ，ａｎｄ Ｎ．Ｈ．Ｖｅｌｔｈｏｒｓｔ，“Ｖｉｓｉｂｌｅ Ｄｉｏｄｅ Ｌａｓｅｒ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｆｔｅｒ Ｐｒｅｃｏｌｕｍｎ Ｄｅｒｉｖａｔｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈｉｏｌｓ”，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６５，２１９７，（１９９３）；Ｈ．Ｙｕ．，Ｊ．Ｃｈａｏ，Ｄ．Ｐａｔｅｋ，Ｓ．Ｒ．Ｍｕｊｕｍｄａｒ，ａｎｄ Ａ．Ｓ．Ｗａｇｇｏｎｅｒ，“Ｃｙａｎｉｎｅ ｄｙｅ ｄＵＴＰ ａｎａｌｏｇｓ ｆｏｒ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｏｆ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅｓ”，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２２，３２２６，（１９９４）；Ｚ．Ｚｈｏ，Ｊ．Ｃｈａｏ，Ｈ．Ｙｕ，ａｎｄ Ａ．Ｓ．Ｗａｇｇｏｎｅｒ，“Ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｌａｂｅｌｌｅｄ ＤＮＡ ｐｒｏｂｅｓ ｕｓｉｎｇ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｌｉｎｋｅｒｓ”，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ，Ｒｅｓ，２２，３２２６．Ａ．Ｊ．Ｇ．Ｍａｎｋ，Ｈ．Ｔ．Ｃ．ｖａｎ ｄｅｒ Ｌａａｎ，Ｈ．Ｌｉｎｇｅｍａｎ，Ｃｅｅｓ Ｇｏｏｊｅｒ，Ｕ．Ａ．Ｔｈ．Ｂｒｉｎｋｍａｎ，ａｎｄ Ｎ．Ｈ．Ｖｅｌｔｈｏｒｓｔ，“Ｖｉｓｉｂｌｅ Ｄｉｏｄｅ Ｌａｓｅｒ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｆｔｅｒ Ｐｒｅｃｏｌｕｍｎ Ｄｅｒｉｖａｔｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｍｉｎｅｓ”，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６７，１７４２，（１９９５）；Ｓ．Ｒ．Ｍｕｊｕｍｄａｒ，Ｒ．Ｂ．Ｍｕｊｕｍｄａｒ，Ｃ．Ｍ．Ｇｒａｎｔ，ａｎｄ Ａ．Ｓ．Ｗａｇｇｏｎｅｒ，“Ｃｙａｎｉｎｅ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔｓ：ｓｕｌｆｏｂｅｎｚｏｉｎｄｏｃｙａｎｉｎｅ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒｓ”，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７，３５６，（１９９６）．Ｐａｔｅｎｔ Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ：Ｐ．Ｌ．Ｓｏｕｔｈｗｉｃｋ，ａｎｄ Ａ．Ｓ．Ｗａｇｇｏｎｅｒ，“Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｆｏｒ ａｎｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｃｙａｎｉｎｅ Ｄｙｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ Ａｃｉｄ Ｇｒｏｕｐｓ”；特許文献１（１９９１年１月１日）；Ａ．Ｓ．Ｗａｇｇｏｎｅｒ，Ｌ．Ａ．Ｅｒｎｓｔ，ａｎｄ Ｍｕｊｕｍｄａｒ，Ｒ．Ｂ．，“Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ Ａｒｙｌｓｕｌｆｏｎａｔｅ Ｃｙａｎｉｎｅ Ｄｙｅｓ”；米国特許第５，２６８，４８６号（１９９３年１２月７日）；Ａ．Ｓ．Ｗａｇｇｏｎｅｒ，“Ｃｙａｎｉｎｅ Ｄｙｅｓ ａｓ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｂｙ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ”；米国特許第５，６２７，０２７号（１９９６年５月６日）；Ａ．Ｓ．Ｗａｇｇｏｎｅｒ，ａｎｄ Ｒ．Ｂ．Ｍｕｊｕｍｄａｒ，“Ｒｉｇｉｄｉｓｅｄ Ｔｒｉｍｅｔｈｉｎｅ Ｃｙａｎｉｎｅ Ｄｙｅｓ”；国際特許第ＷＯ９９／３１１１８１号；Ｇ．−Ｙ．Ｓｈｅｎ，Ｔ．Ｓ．Ｄｏｂａｓｈｉ，“Ｃｙａｎｉｎｅ Ｄｙｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ ｗｉｔｈ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ”；Ｔ．Ｓ．Ｇ．Ｍ．Ｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｒａｇｈａｖａｃｈａｒｉ；Ｎ．Ｎａｒａｙａｎａｎ；Ｈ．Ｌ．Ｏｓｔｅｒｍａｎ，“Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｃｙａｎｉｎｅ Ｄｙｅｓ”；米国特許第６，０２７，７０９号（２０００年２月２２日）を参照）。

これらの標識試薬の調製に必要となる一般的な合成法は、以下の通りである。まず、４級化窒素複素環Ｚ^１を調製した後、この複素環式塩基をＰｈＮＨ−（ＣＨ＝ＣＨ）_ｎ−ＣＨ＝ＮＨＰｈ．ＨＣｌ又は ＲＯ−（ＣＨ＝ＣＨ）_ｎ−ＣＨ（ＯＲ）_２（式中、Ｐｈはフェニル環であり、Ｒはメチル又はエチル基である）等の求電子試薬であるポリメチンリンカー（ＰＭＬ）と反応させて、いわゆるヘミシアニン染料であるＺ^１−（ＣＨ＝ＣＨ）_ｎＮＨＰｈ又はＺ^１−（ＣＨ＝ＣＨ）_ｎＮＡｃＰｈ（式中、Ａｃはアセチル基である）又はＺ^１−（ＣＨ＝ＣＨ）_ｎ−ＯＲを得る。次いで、これらの中間体を異なる４級化窒素複素環Ｚ^２と反応させる。このように官能化された側鎖は、第１又は第２の４級化窒素複素環の何れかに結合することができる。

しかしながら、これらのヘミシアニン中間体は、良好な収率及び／又は純粋な形態で得ることが難しい場合がある（例えば、非特許文献４；及びＲ．Ｂ．Ｍｕｊｕｍｄａｒ，Ｌ．Ａ．Ｅｒｎｓｔ，Ｓｗａｔｉ Ｒ．Ｍｕｊｕｍｄａｒ，Ｃ．Ｊ．Ｌｅｗｉｓ，ａｎｄ Ａ．Ｓ．Ｗａｇｇｏｎｅｒ，“Ｃｙａｎｉｎｅ Ｄｙｅ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔｓ：Ｓｕｌｆｏｉｎｄｏｃｙａｎｉｎｅ Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ Ｅｓｔｅｒｓ”，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４，１０５，（１９９３）を参照）。
米国特許第４，９８１，９７７号明細書 Ｗｙａｔｔ，Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ Ｂ ３５２：７０１−７０６，１９９７ Ｌ．Ｇ．Ｓ．Ｂｒｏｏｋｅｒ，"Ｔｈｅ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｈｏｔｏｇｒａｐｈｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓ" Ｍｅｅｓ Ｅｄ．，Ｍａｃｍｉｌｌａｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９４２），ｐ．９８７ Ｊ．Ｓ．Ｌｉｎｄｓｅｙ，Ｐ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ，ａｎｄ Ｄ．Ａ．Ｓｉｅｓｅｌ，"Ｖｉｓｉｂｌｅ Ｌｉｇｈｔ−Ｈａｒｖｅｓｔｉｎｇ ｉｎ Ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ−Ｃｙａｎｉｎｅ Ｄｙｅｓ"，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４５，４８４５，（１９８９） Ｆ．Ｍ．Ｈａｍｅｒ，"Ｓｏｍｅ Ｕｎｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌ Ｐｅｎｔａｍｅｔｈｉｎｃｙａｎｉｎｅ Ｄｙｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｉｎ Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ"，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，３２（１９４９）

従って、効率的且つ容易に産生することができ、並びに生体分子とのコンジュゲートを調製するのに好適であるポリメチン染料が望まれている。

（発明の要旨）
約４４０〜約１１００ｎｍで吸収及び発光する高輝度の高蛍光性染料である、ポリメチンリンカー架橋を有する蛍光色素化合物が今回発見された。

本発明は、カルボキシル含有ピリジン環で修飾されるポリメチンリンカー架橋を有する蛍光色素化合物であって、６００ｎｍ〜９００ｎｍのスペクトル範囲において強力な蛍光を生成することができ、且つ染料を共有結合標識に好適なものとする官能基及び／又は可溶化基を含有する、化合物を対象とし、特に生体分子及びその他の標的物質を対象とする。

一実施形態において、本発明は、以下の化学式（２）により表されるポリメチン蛍光色素化合物であって：

式中、
Ｘが、Ｃ（ＣＨ_２Ｙ_１）（ＣＨ_２Ｙ_２）、Ｏ、Ｓ及びＳｅからなる群から独立して選択され；
Ｙ_１及びＹ_２が、Ｈ、Ｃ_１−Ｃ_２０脂肪族基、並びに−ＯＲ^＊、Ｎ（Ｒ^＊）_２又は−ＳＲ^＊で置換されるＣ_１−Ｃ_２０脂肪族基からなる群から独立して選択され；
Ｗが、ベンゾ縮合、ナフト縮合又はピリド縮合環を表し；
Ｒ_１が、Ｈ、（ＣＨ_２）_ｘＣＨ_３、（ＣＨ_２）_ｎＳＯ_３ ⁻及び（ＣＨ_２）_ｎＳＯ_３Ｈ（式中、ｘは０〜６から選択される整数であり、ｎは２〜６から選択される整数である）からなる群から選択され；
Ｒ_４が、Ｈ、（ＣＨ_２）_ｘＣＨ_３、（ＣＨ_２）_ｎＳＯ_３ ⁻及び（ＣＨ_２）_ｎＳＯ_３Ｈ（式中、ｘは０〜６から選択される整数であり、ｎは２〜６から選択される整数である）からなる群から選択され；
Ｒ_２及びＲ_３が、Ｈ、カルボン酸塩、カルボン酸、カルボン酸エステル、アミン、アミド、スルホンアミド、ヒドロキシル、アルコキシル、スルホン酸部分及びスルホン酸塩部分からなる群から独立して選択され；
Ｑが、カルボキシル基で置換されるヘテロアリール環、又はカルボニル基で置換される６員ヘテロアリール環からなる群から選択される、
化合物；或いはその塩を対象とする。

別の実施形態において、本発明は、化学式（２）により表されるポリメチン蛍光色素化合物であって：
式中、
Ｘが、Ｃ（ＣＨ_２Ｙ_１）（ＣＨ_２Ｙ_２）、Ｏ、Ｓ及びＳｅからなる群から独立して選択され；
Ｙ_１及びＹ_２が、Ｈ、Ｃ_１−Ｃ_２０脂肪族基、並びに−ＯＲ^＊、Ｎ（Ｒ^＊）_２又は−ＳＲ^＊で置換されるＣ_１−Ｃ_２０脂肪族基からなる群から独立して選択され；
Ｗが、ベンゾ縮合、ナフト縮合又はピリド縮合環を表し；
Ｒ_１が、（ＣＨ_２）_ｘＣＨ_３、（ＣＨ_２）_ｎＳＯ_３ ⁻及び（ＣＨ_２）_ｎＳＯ_３Ｈ（式中、ｘは０〜６から選択される整数であり、ｎは２〜６から選択される整数である）からなる群から選択され；
Ｒ_４が、（ＣＨ_２）_ｘＣＨ_３、（ＣＨ_２）_ｎＳＯ_３ ⁻及び（ＣＨ_２）_ｎＳＯ_３Ｈ（式中、ｘは０〜６から選択される整数であり、ｎは２〜６から選択される整数である）からなる群から選択され；
Ｒ_２及びＲ_３が、Ｈ、カルボン酸塩、カルボン酸、カルボン酸エステル、アミン、アミド、スルホンアミド、ヒドロキシル、アルコキシル、スルホン酸部分及びスルホン酸塩部分からなる群から独立して選択され；
Ｑが、カルボキシル基で置換されるヘテロアリール環、又はカルボニル基で置換される６員ヘテロアリール環からなる群から選択される、
化合物；或いはその塩を対象とする。

別の実施形態において、本発明は、本発明の化合物に化学結合する１つ以上の生体分子を含む生体適合性蛍光分子を対象とする。

別の実施形態において、本発明は、本発明の化合物に化学結合する生体分子を含む生体適合性蛍光分子であって、該化合物が約５００ｎｍ〜約９００ｎｍの吸収及び発光最大値を有する、蛍光分子を対象とする。

別の実施形態において、本発明は、本発明の化合物に化学結合する生体分子を含む生体適合性蛍光分子であって、該生体適合性蛍光分子が標的相互作用後に活性化される、蛍光分子を対象とする。

別の実施形態において、本発明は、本発明の化合物に化学結合する生体分子を含む生体適合性蛍光分子であって、該生体適合性蛍光分子が標的への高い結合親和性を有する、蛍光分子を対象とする。

別の実施形態において、本発明は、
（ａ）本発明の化合物又は生体適合性蛍光分子を対象に投与する；
（ｂ）化合物又は生体適合性蛍光分子が対象内に拡散するか、生物学的標的と接触又は相互作用するための時間を設ける；
（ｃ）化合物又は生体適合性蛍光分子により吸収可能な波長の光を対象に照射する；及び
（ｄ）化合物又は生体適合性蛍光分子により発光される光学シグナルを検出する；
ことを含む、ｉｎ ｖｉｖｏ光学イメージング法を対象とする。

別の実施形態において、本発明は、本発明の化合物に化学結合する生体分子を含む生体適合性蛍光分子であって、該生体適合性蛍光分子が標識細胞である、蛍光分子を対象とする。

（発明の詳細な説明）
本発明の好ましい実施形態の説明を、以下に示す。

本発明は、約４４０〜約１１００ｎｍ、約５５０〜約８００ｎｍ、約５００〜約９００ｎｍ、又は約６００〜約９００ｎｍで吸収及び／又は発光する高輝度の高蛍光性化合物（染料）、並びにそれらのコンジュゲートを対象とする。可視光及び紫外線スペクトル等のその他のスペクトルの励起及び発光波長を有する化合物（蛍光色素）も本発明に包含されることが理解されるであろう。

本発明の化合物の構造は一般的に、高い蛍光量子収率をもたらすニコチン酸及びピコリン酸誘導体に基づいている。更に、本発明の特定の実施形態において、本化合物は、標的分子上の相補基と化学結合するために使用される場合がある官能又は反応基を含有する。

「化学結合する」とは、組み合わさった凝集物が１つの単位として機能するのに十分強力な原子間の引力により結合されることを意味する。これには、化学的結合（例えば、共有結合）、非共有結合（例えば、イオン結合、金属結合及び架橋結合）、疎水性相互作用、水素結合、及びファンデルワールス相互作用が含まれるが、これらに限定されない。これには、架橋又はケージングも含まれる。

本明細書で使用される「化合物」という用語は、本発明の「ポリメチン蛍光色素」、「蛍光色素」、「蛍光染料」、「シアニン染料」、「カルボシアニン染料」及び「染料」を指す。これらの用語は、本発明の化合物を指すものとして交換可能に使用される。

一実施形態において、本発明の化合物は、以下の化学式（１）に記載のような、ポリメチンリンカー（ＰＭＬ）により共に結合する２つの複素環式環系であって：

式中、Ｚ^１が、インドリニウム環等の複素環式環系であり、Ｚ^２が、インドリニウム環等の第２の複素環式環系であり、ＰＭＬが、ピリジン等の、複素環式環を含有するカルボキシルで置換されるポリメチンリンカーである、複素環式環系を含む。Ｚ^１及びＺ^２環系は、場合により種々の置換基で更に置換されるか、或いは場合により更に置換される追加の環に縮合する。

一態様において、本発明の化合物は、スルホ又はスルホアルキルにより１回以上更に置換される。「スルホ」とは、スルホン酸又はスルホン酸の塩（スルホン酸塩）を意味する。同様に「カルボキシル」とは、カルボン酸又はカルボン酸塩又はカルボン酸の塩を意味する。「リン酸塩」とはリン酸のエステルであり、リン酸塩の塩を包含する。「ホスホン酸塩」とは、ホスホン酸のエステルを意味し、ホスホン酸塩の塩を包含する。同様に「カルボニル」基については、ハロゲン化カルボニル（例えば、塩化カルボニル）及びカルボキサミドが含まれるが、これらに限定されない。本明細書において、特に記載がない限り、アルキル、アルコキシ、アリールアルキル、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニウム、又はペルフルオロアルキル等の置換基のアルキル部分は、場合により、飽和、不飽和、直鎖又は分枝鎖であり、全てのアルキル、アルコキシ、アルキルアミノ及びジアルキルアミノ置換基は、それら自体が場合によりカルボキシ、スルホ、アミノ又はヒドロキシで置換される。

一実施形態において、本発明は、以下の化学式（２）により表される化合物であって：

式中、Ｘが、Ｃ（ＣＨ_２Ｙ_１）（ＣＨ_２Ｙ_２）、Ｏ、Ｓ及びＳｅから独立して選択され；Ｙ_１及びＹ_２が、Ｈ、並びに場合により種々の形態でＮ、Ｓ、Ｏを含有する、直鎖又は分枝鎖、飽和又は不飽和のＣ_１−Ｃ_２０アルキルから独立して選択され；Ｗが、ベンゾ縮合、ナフト縮合又はピリド縮合環を形成するのに必要な非金属原子を表し；Ｒ_１が、Ｈ、（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３、（ＣＨ_２）_ｎＳＯ_３ ⁻及び（ＣＨ_２）_ｎＳＯ_３Ｈ（式中、ｎは、Ｒ_１が（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３である場合に、０〜６から選択される整数であり、ｎは、Ｒ_１が（ＣＨ_２）_ｎＳＯ_３ ⁻又は（ＣＨ_２）_ｎＳＯ_３Ｈである場合に、２〜６から選択される整数である）からなる群から選択され；Ｒ_４が、Ｈ、（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３、（ＣＨ_２）_ｎＳＯ_３ ⁻及び（ＣＨ_２）_ｎＳＯ_３Ｈ（式中、ｎは、Ｒ_４が（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３である場合に、０〜６から選択される整数であり、ｎは、Ｒ_４が（ＣＨ_２）_ｎＳＯ_３ ⁻又は（ＣＨ_２）_ｎＳＯ_３Ｈである場合に、２〜６から選択される整数である）からなる群から選択され；Ｒ_２及びＲ_３が、Ｈ、カルボン酸塩、カルボン酸、カルボン酸エステル、アミン、アミド、スルホンアミド、ヒドロキシル、アルコキシル、スルホン酸部分及びスルホン酸塩部分からなる群から独立して選択され；Ｑが、カルボキシル官能化窒素含有複素環式環からなる群から選択され；Ｑが、ピリジン等のカルボニル官能化窒素含有６員複素環式環からなる群から選択され；Ｑが、イソニコチン酸、ニコチン酸及びピコリン酸からなる群から選択され；Ｑが、以下に示す群から選択され：

この場合、カルボキシル基が又、エステル、活性化エステル、又は求核基と反応することができるハロゲン化カルボニルの形態でもあり；カルボキシル基が又、ＣＯ−Ｏベンゾトリアゾリル、ＣＯ−ＯＮ−スクシンイミジル、ＣＯ−Ｏテトラフルオロフェニル、ＣＯ−Ｏペンタフルオロフェニル、ＣＯ−Ｏイミダゾリル、ＣＯ−Ｏｐ−ニトロフェニルからなる群から選択される形態でもある、
化合物；或いはその塩を対象とする。化学式（２）のこのような分子は、ｉｎ ｖｉｖｏイメージングを含めた種々の用途のための生体適合性蛍光分子に化学結合する。

別の実施形態において、本発明は、以下の化学式（２）により表される化合物であって：

式中、Ｘが、Ｃ（ＣＨ_２Ｙ_１）（ＣＨ_２Ｙ_２）、Ｏ、Ｓ及びＳｅから独立して選択され；Ｙ_１及びＹ_２が、Ｈ、並びに場合により種々の形態でＮ、Ｓ、Ｏを含有する、直鎖又は分枝鎖、飽和又は不飽和のＣ_１−Ｃ_２０アルキルから独立して選択され；Ｗが、ベンゾ縮合、ナフト縮合又はピリド縮合環を形成するのに必要な非金属原子を表し；Ｒ_１が、Ｈ、（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３、（ＣＨ_２）_ｎＳＯ_３ ⁻及び（ＣＨ_２）_ｎＳＯ_３Ｈ（式中、ｎは、Ｒ_１が（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３である場合に、０〜６から選択される整数であり、ｎは、Ｒ_１が（ＣＨ_２）_ｎＳＯ_３ ⁻又は（ＣＨ_２）_ｎＳＯ_３Ｈである場合に、２〜６から選択される整数である）からなる群から選択され；Ｒ_４が、（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３、（ＣＨ_２）_ｎＳＯ_３ ⁻及び（ＣＨ_２）_ｎＳＯ_３Ｈ（式中、ｎは、Ｒ_４が（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３である場合に、０〜６から選択される整数であり、ｎは、Ｒ_４が（ＣＨ_２）_ｎＳＯ_３ ⁻又は（ＣＨ_２）_ｎＳＯ_３Ｈである場合に、２〜６から選択される整数である）からなる群から選択され；Ｒ_２及びＲ_３が、Ｈ、カルボン酸塩、カルボン酸、カルボン酸エステル、アミン、アミド、スルホンアミド、ヒドロキシル、アルコキシル、スルホン酸部分及びスルホン酸塩部分から独立して選択され；Ｑが、カルボキシル官能化窒素含有複素環式環からなる群から選択され；Ｑが、ピリジン等のカルボニル官能化窒素含有６員複素環式環からなる群から選択され；Ｑが、イソニコチン酸、ニコチン酸及びピコリン酸からなる群から選択され；Ｑが、以下に示す群から選択され：

この場合、カルボキシル基が又、エステル、活性化エステル、又は求核基と反応することができるハロゲン化カルボニルの形態でもあり、カルボキシル基が又、ＣＯ−Ｏベンゾトリアゾリル、ＣＯ−ＯＮ−スクシンイミジル、ＣＯ−Ｏテトラフルオロフェニル、ＣＯ−Ｏペンタフルオロフェニル、ＣＯ−Ｏイミダゾリル、ＣＯ−Ｏｐ−ニトロフェニルからなる群から選択される形態でもある、
化合物；或いはその塩を対象とする。化学式（２）のこのような分子は、ｉｎ ｖｉｖｏイメージングを含めた種々の用途のための生体適合性蛍光分子に化学結合する。

構造式（２）の一実施形態において、Ｑは、カルボキシルで置換されるヘテロアリール環、又はカルボニル基で置換される６員ヘテロアリール環からなる群から選択される。

特定の実施形態において、
ａ）Ｑ上のカルボキシル置換基は、エステル、活性化エステルからなる群から選択されるか；又は
ｂ）Ｑ上のカルボキシル置換基は、ＣＯ−Ｏベンゾトリアゾリル、ＣＯ−ＯＮ−スクシンイミジル、ＣＯ−Ｏテトラフルオロフェニル、ＣＯ−Ｏペンタフルオロフェニル、ＣＯ−Ｏイミダゾリル及びＣＯ−Ｏｐ−ニトロフェニルからなる群から選択され；且つ
ｃ）Ｑ上のカルボニル置換基は、ハロゲン化カルボニルの形態である。

別の実施形態において、Ｑはカルボキシル置換窒素含有複素環式環である。

別の実施形態において、Ｑは、カルボキシル置換ピリジン、ピリミドン、ピラジン及びピリダジンからなる群から選択される。

別の実施形態において、Ｑはカルボキシル置換ピリジンである。

別の実施形態において、Ｑは、イソニコチン酸、ニコチン酸及びピコリン酸からなる群から選択される。

別の実施形態において、Ｑは、以下からなる群から選択される構造式で表される：

。

別の実施形態において、Ｑはカルボニル置換窒素含有６員複素環式環である。

別の実施形態において、Ｑはカルボニル置換ピリジンである。

直前に記載した９つの実施形態において、複素環式環及びヘテロアリール環という用語は何れも、ピリジン等の本明細書に定義するヘテロアリール環を指す。

別の実施形態において、本発明は、以下の化学式（２）によりＺ^１−（ＰＭＬ）−Ｚ^２を表す化合物であって：

式中、Ｗが、ベンゾ縮合、ナフト縮合又はピリド縮合環を形成するのに必要な非金属原子を表す、化合物を提供する。

一態様において、Ｗは、各環に６個の原子を有する１〜２個の縮合芳香族環を形成するのに必要な原子を表し、これらの原子は、−ＣＨ、−Ｃ、−ＣＲ_７及び−ＮＲ_８（式中、Ｒ_８は０又は１であり（これにより各環の窒素は４級化されるか、４級化されない）、各Ｒ_７は独立してスルホ、トリフルオロメチル又はハロゲンを含有し；Ｒ_８は独立してＣ_１−Ｃ_８アルキルを含有し、それによって独立してＨ、アミノ又はスルホを含有する）から選択される。

縮合環上における１つ以上の非水素置換基の取込みは、結果として得られる染料の吸収及び発光スペクトルの調節に使用することができる。

Ｚ^１及びＺ^２の基本構造の選択例を、以下に示す。これらの基本構造（３〜６）は、場合により本項に記載の通り更に置換される。

一実施形態において、Ｘは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、−Ｃ（ＣＨ_２Ｙ_１）（ＣＨ_２Ｙ_２）（式中、Ｙ_１及びＹ_２は、Ｈ、並びに場合により種々の形態でＮ、Ｓ、Ｏを含有する、直鎖又は分枝鎖、飽和又は不飽和のＣ_１−Ｃ_２０アルキルから独立して選択される）から独立して選択される。

別の実施形態において、Ｙ_１及びＹ_２は一緒になって、環状環の一部となるか；又はＸは−ＣＲ_５Ｒ_６から独立して選択され、式中、Ｒ_５及びＲ_６は、同じである場合もあれば、異なる場合もあり、アルキル、シクロアルキル又はアリールアルキルであり、一緒になって環状系の一部となり、場合により更に置換される。

本発明の一態様において、Ｒ_２及びＲ_３は一緒になって、５員又は６員環を完成させる。

置換基Ｒ_１は一般的に、（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３、（ＣＨ_２）_ｎＳＯ_３ ⁻及び（ＣＨ_２）_ｎＳＯ_３Ｈ（式中、ｎは、Ｒ_１が（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３である場合に、０〜６から選択される整数であり、ｎは、Ｒ_１が（ＣＨ_２）_ｎＳＯ_３ ⁻又は（ＣＨ_２）_ｎＳＯ_３Ｈである場合に、２〜６から選択される整数である）からなる群から選択される。一態様において、Ｒ_１は、（ＣＨ_２）_３ＳＯ_３ ⁻又は（ＣＨ_２）_４ＳＯ_３ ⁻又はＣＨ_２ＣＨ_３である。本発明の一態様において、Ｒ_１は、スルホン酸アリール又はアミノ基又はフタルイミド基を含有する置換基である。

置換基Ｒ_１は一般的に、Ｈ、（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３、（ＣＨ_２）_ｎＳＯ_３ ⁻及び（ＣＨ_２）_ｎＳＯ_３Ｈ（式中、ｎは、Ｒ_１が（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３である場合に、０〜６から選択される整数であり、ｎは、Ｒ_１が（ＣＨ_２）_ｎＳＯ_３ ⁻又は（ＣＨ_２）_ｎＳＯ_３Ｈである場合に、２〜６から選択される整数である）からなる群から選択される。一態様において、Ｒ_１は、（ＣＨ_２）_３ＳＯ_３ ⁻又は（ＣＨ_２）_４ＳＯ_３ ⁻又はＣＨ_２ＣＨ_３である。本発明の一態様において、Ｒ_１は、スルホン酸アリール又はアミノ基又はフタルイミド基を含有する置換基である。

置換基Ｒ_４は一般的に、（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３、（ＣＨ_２）_ｎＳＯ_３ ⁻及び（ＣＨ_２）_ｎＳＯ_３Ｈ（式中、ｎは、Ｒ_４が（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３である場合に、０〜６から選択される整数であり、ｎは、Ｒ_４が（ＣＨ_２）_ｎＳＯ_３ ⁻又は（ＣＨ_２）_ｎＳＯ_３Ｈである場合に、２〜６から選択される整数である）からなる群から選択される。一態様において、Ｒ_４は、（ＣＨ_２）_３ＳＯ_３ ⁻又は（ＣＨ_２）_４ＳＯ_３ ⁻又はＣＨ_２ＣＨ_３である。本発明の一態様において、Ｒ_４は、スルホン酸アリール又はアミノ基又はフタルイミド基を含有する置換基である。

置換基Ｒ_４は一般的に、Ｈ、（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３、（ＣＨ_２）_ｎＳＯ_３ ⁻及び（ＣＨ_２）_ｎＳＯ_３Ｈ（式中、ｎは、Ｒ_４が（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３である場合に、０〜６から選択される整数であり、ｎは、Ｒ_４が（ＣＨ_２）_ｎＳＯ_３ ⁻又は（ＣＨ_２）_ｎＳＯ_３Ｈである場合に、２〜６から選択される整数である）からなる群から選択される。一態様において、Ｒ_４は、（ＣＨ_２）_３ＳＯ_３ ⁻又は（ＣＨ_２）_４ＳＯ_３ ⁻又はＣＨ_２ＣＨ_３である。本発明の一態様において、Ｒ_４は、スルホン酸アリール又はアミノ基又はフタルイミド基を含有する置換基である。

置換基Ｒ_２及びＲ_３は、Ｈ、ハロゲン、カルボン酸塩、カルボン酸、カルボン酸エステル、アミノ、アミド、アルキル又はアリールスルホンアミド、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、スルフェート、シアノ、ニトロ、アジド、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニウム、リン酸塩、リン酸エステル、ホスホン酸塩、スルホン酸及びスルホン酸塩部分からなる群から独立して選択される。特定の実施形態において、Ｒ_２及びＲ_３は独立してスルホン酸又はその塩である。

本発明の一態様において、Ｒ_２及びＲ_３は、過フッ素化Ｗの場合のように、過置換を包含する。過フッ素化又は多フッ素化は、蛍光量子収率の増大をもたらす可能性がある。

本明細書で使用される「増大」とは、蛍光量子収率が約５％、約１０％、約１５％、約２５％、約５０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％、約１００％増大することを意味する。

本発明の一態様において、化学式Ｚ^１−（ＰＭＬ）−Ｚ^２は、以下の化学式（７）に従って表示される：

。

本発明の一態様において、本発明の化合物は、１回以上スルホン化される。本発明の化合物がスルホで置換される場合、本化合物は一般的に、Ｒ_２又はＲ_３又はそれらの両方においてスルホン化される（即ち、例えばＲ_２及び／又はＲ_３がスルホン酸部分、スルホン酸塩部分又はスルホンアミドである）か、Ｒ_１又はＲ_４又はそれらの両方においてスルホアルキル化される（即ち、例えば、Ｒ_１及び／又はＲ_４が（ＣＨ_２）_ｎＳＯ_３ ⁻又は（ＣＨ_２）_ｎＳＯ_３Ｈである）か、或いはスルホン化とスルホアルキル化の両方が生じる。特定の実施形態において、本化合物は３回までスルホン化され（Ｒ_２及びＲ_３に対応する位置において、並びにＲ_１又はＲ_４の一方におけるスルホアルキルとして）、Ｒ_１又はＲ_４の一方を反応基の特定のために残しておく。

本明細書で使用される、スルホン酸及び（ＣＨ_２）_ｎＳＯ_３Ｈ又はスルホン酸塩基及び（ＣＨ_２）_ｎＳＯ_３ ⁻という用語は、交換可能に使用することができる。しかしながら、特定の実施形態において、スルホン酸部分、スルホン酸塩部分又はスルホンアミドという用語は、スルホン酸部分、スルホン酸塩部分又はスルホンアミド部分により分子の残余に結合する置換基、即ち−ＳＯ２ＮＲ’Ｒ”を指す。

特定の実施形態において、Ｒ_１〜Ｒ_３の少なくとも１つは、スルホン酸部分又はスルホン酸塩部分であるか、これらの何れかを含有する。特定の実施形態において、Ｒ_１〜Ｒ_３の少なくとも１つは、スルホン酸部分又はスルホン酸塩部分である。

特定の実施形態において、Ｒ_１及びＲ_４は独立して、（ＣＨ_２）_ｎＳＯ_３ ⁻又は（ＣＨ_２）_ｎＳＯ_３Ｈである。

本発明の特定の実施形態において、本化合物は、４回までスルホン化される（Ｒ_２及びＲ_３において、並びにＲ_１及びＲ_４におけるスルホアルキルとして）。本発明の別の実施形態において、本化合物は、少なくとも４回スルホン化される（Ｒ_２及びＲ_３において、並びにＲ_１及びＲ_４におけるスルホアルキルとして）。本発明の別の実施形態においては、何れかの反応基（又は化学結合する分子）がＱにおいて結合してもよく、更に、本発明の化合物が４回までスルホン化される（Ｒ_２及びＲ_３において、並びにＲ_１及びＲ_４におけるスルホアルキルとして）。本発明の別の実施形態においては、何れかの反応基（又は化学結合する分子）がＱにおいて結合してもよく、更に、本発明の化合物が少なくとも４回スルホン化される（Ｒ_２及びＲ_３において、並びにＲ_１及びＲ_４におけるスルホアルキルとして）。この追加のスルホン化、並びに結合部位の変化によって、より高輝度で、より水溶液に可溶であり、染料間のスタッキング相互作用から生じる蛍光消光に対してより抵抗性を有する、反応性染料及び染料コンジュゲートが得られる。

本発明の一態様において、化学式Ｚ^１−（ＰＭＬ）−Ｚ^２は、以下の化学式（８）により表される：

。

本発明の一態様において、１回以上スルホン化される本発明の化合物は一般的に、Ｒ_２又はＲ_３においてスルホンされるか、Ｒ_１又はＲ_４又はそれらの両方においてスルホアルキル化されるか、或いはスルホン化とスルホアルキル化の両方が生じる。特に、本発明の化合物は、４回までスルホン化され、Ｒ_１又はＲ_４の一方を反応基の特定のために残しておく。

本発明の一実施形態において、本化合物は、６回までスルホン化される（Ｒ_２及びＲ_３において、並びにＲ_１及びＲ_４におけるスルホアルキルとして）。本発明の別の実施形態において、本化合物は、少なくとも６回スルホン化される（Ｒ_２及びＲ_３において、並びにＲ_１及びＲ_４におけるスルホアルキルとして）。本発明の別の実施形態においては、何れかの反応基（又は化学結合する分子）がＱにおいて結合してもよく、更に、本発明の化合物が６回までスルホン化される（Ｒ_２及びＲ_３において、並びにＲ_１及びＲ_４におけるスルホアルキルとして）。本発明の別の実施形態においては、何れかの反応基（又は化学結合する分子）がＱにおいて結合してもよく、更に、本発明の化合物が少なくとも６回スルホン化される（Ｒ_２及びＲ_３において、並びにＲ_１及びＲ_４におけるスルホアルキルとして）。この追加のスルホン化、並びに結合部位の変化によって、より高輝度で、より水溶液に可溶であり、染料間のスタッキング相互作用から生じる蛍光消光に対してより抵抗性を有する、反応性染料及び染料コンジュゲートが得られる。

一実施形態において、ＰＭＬ部分は、以下の化学式（９）であって：

式中、Ｑが、カルボキシル官能化複素環式環（カルボキシ基で置換されるヘテロアリール）からなる群から選択される、化学式を有する。本実施形態において、複素環式環及びヘテロアリール環とは、本明細書に定義される通りのヘテロアリール環、例えばピリジンを指し、官能化（される）とは置換されることを指す。

本発明の化合物（カルボシアニン染料）に適切なＰＭＬ部分の好適な例については、非水素置換基、環構造及び剛性化要素を組み込むＰＭＬ部分を含め、文献に記載されている（何れも全体が参考として本明細書で援用される、米国特許第５，８３１，０９８号（Ｏｌｌｍａｎｎ，Ｊｒ．；１９９８年）；米国特許第６，０８６，７３７号（Ｐａｔｏｎａｙ，ｅｔ ａｌ．；２０００年）；米国特許第６，０４８，９８２号（Ｗａｇｇｏｎｅｒ；２０００年）；及び米国特許第５，４５３，５０５号（Ｌｅｅ，ｅｔ ａｌ．；１９９５年）；米国特許第５，６３９，８７４号（Ｍｉｄｄｅｎｄｏｒｆ，ｅｔ ａｌ．；１９９７年）；米国特許第３，８６４，６４４号（Ｌｉｎｃｏｌｎ，ｅｔ ａｌ．；１９７５年）；米国特許第４，０１１，０８６号（Ｓｉｍｓｏｎ；１９７７年）；米国特許第６，７４７，１５９号（Ｃａｐｕｔｏ；２００４年））。

一実施形態において、本発明は、化学式（９）のＰＭＬであって、式中、Ｑが官能化窒素含有複素環式環からなる群から選択される、化学式（９）のＰＭＬを対象とする。本発明の一態様は、化学式（９）のＰＭＬであって、式中、Ｑが置換窒素含有ヘテロアリール環からなる群から選択される、化学式（９）のＰＭＬである。これらの実施形態において、複素環式環及びヘテロアリール環とは、本明細書に定義される通りのヘテロアリール環、例えばピリジンを指し、官能化（される）とは置換されることを指す。

本発明の一実施形態において、Ｑは共有結合により複素環式（ヘテロアリール）環（Ｑ）に結合する反応基である、少なくとも１つの置換基を含有する。一実施形態において、反応基を含有する本発明の化合物は、好適な反応性を有する官能基を含有するか、含有するように修飾される広範な有機又は無機の物質を標識し、これにより本発明の化合物の化学結合をもたらし、コンジュゲートした物質を形成する。

本明細書で使用される「反応基」とは、異なる化合物上の官能基と化学的に反応して共有結合を形成することができる、本発明の化合物上の、又は本発明の化合物に付加することができる部分、或いは本発明の化合物上の官能基と化学的に反応して共有結合を形成することができる異なる化合物上の部分を意味する。一般的に、反応基とは、それぞれ求核基又は求電子試薬である対応する官能基への曝露を介して共有結合を形成できる求電子試薬又は求核基である。或いは、反応基とは光活性化可能な基であり、適切な波長の光の照射後にのみ化学的反応性を有するようになる。一般的には、本発明の化合物とコンジュゲートする物質とのコンジュゲーション反応によって、コンジュゲートされた物質に染料を結合させる新しい結合部に組み込まれる反応基の１つ以上の原子がもたらされる。

本発明の一態様は、化学式（９）のＰＭＬであって、Ｑがカルボキシル官能化窒素含有複素環式環（カルボキシルで置換されるヘテロアリール）からなる群から選択される、化学式（９）のＰＭＬである。本実施形態において、複素環式環及びヘテロアリール環とは、本明細書に定義される通りのヘテロアリール環、例えばピリジンを指し、官能化（される）とは置換されることを指す。

本発明の一態様において、ＰＭＬは、化学式（９）のものであって、式中、Ｑが、カルボキシル官能化窒素含有６員複素環式環（カルボキシルで置換されるヘテロアリール）、例えばピリジン、ピリミドン、ピラジン及びピリダジン（カルボキシルで置換されるヘテロアリール）からなる群から選択される、化学式（９）のものである。本実施形態において、複素環及びヘテロアリール環とは、本明細書に定義される通りのヘテロアリール環、例えばピリジンを指し、官能化（される）とは置換されることを指す。

本発明の別の態様は、化学式（９）のＰＭＬであって、式中、Ｑが、カルボキシル官能化窒素含有６員複素環式環（カルボキシルで置換されるヘテロアリール）、例えばピリジン（カルボキシルで置換されるヘテロアリール）からなる群から選択される、化学式（９）のＰＭＬである。本実施形態において、複素環及びヘテロアリール環とは、本明細書に定義される通りのヘテロアリール環、例えばピリジンを指し、官能化（される）とは置換されることを指す。

本発明の別の態様において、ＰＭＬは、化学式（９）のものであって、式中、Ｑが、ニコチン酸及びピコリン酸又はそれらの塩からなる群から選択される、化学式（９）のものである。

本発明の一態様は、化学式（９）のＰＭＬであって、式中、Ｑが以下に示す群から選択される：

化学式（９）のＰＭＬ；或いはその塩である。

本発明の別の態様は、化学式（９）のＰＭＬであって、式中、Ｑが以下に示す群から選択され：

この場合、カルボキシル基が又、求核基と反応することができる活性化エステル（Ｒ_１５）又はハロゲン化カルボニル（Ｒ_１６＝Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ）の形態でもあり；カルボキシル基ＣＯ−ＣＲ_１５が又、ＣＯ−Ｏベンゾトリアゾリル、ＣＯ−ＯＮ−ヒドロキシスクシンイミジル、ＣＯ−Ｏテトラフルオロフェニル、ＣＯ−Ｏペンタフルオロフェニル、ＣＯ−Ｏイミダゾリル及びＣＯ−Ｏｐ−ニトロフェニルからなる群から選択される形態でもある、
化学式（９）のＰＭＬである。

ＰＭＬ部分は一般的に、本発明の化合物の合成において使用されるカップリング剤を起源とする。例えば、Ｎ，Ｎ’−ジフェニルホルムアミジン及びオルトギ酸トリエチルは、ＰＭＬ部分を産生する。塩酸マロンアルデヒドビス（フェニルイミン）、１，１，３−トリメトキシプロパン、及び１，１，３，３−テトラメトキシプロパン及び一塩化グルタコンアルデヒドジアニルも又、ＰＭＬ部分（染料）を産生する。

本発明の一態様において、ＰＭＬ部分は、以下に示すマロノジアルデヒド部分を使用して染料中に導入される：

。

従って、本発明は、以下の化学式（２）によりＺ^１−（ＰＭＬ）−Ｚ^２を表す化合物であって：

式中、Ｒ_１が（ＣＨ_２）_ｎＳＯ_３ ⁻又は（ＣＨ_２）_ｎＳＯ_３Ｈである、化合物を提供する。

一態様において、本発明は、以下の化学式（１０〜１１）の何れかを有する化合物を対象とする：

。

別の態様において、本発明は、以下の化学式（１２〜１５）の何れかを有する化合物を対象とする：

。

本発明の一態様において、Ｑが活性化エステルであるか、これを含有する場合、本化合物は、アミノエチルマレイミド、アミノプロピルマレイミド、アミノプロピルアジド、アミノプロピルチオール、メルカプトエチルアミン、プロパルギルアミン３−アミノプロパノール、ジアミノプロパン及びジアミノブタン等の二官能性リンカーに化学結合することにより、中性又は塩基性の条件下で好適な溶媒中に追加の反応性官能基を産生することができる。

本発明の一態様において、ＱがＮＨ_２であるか、これを含有する場合、本発明の化合物は、プロパルギル酸、ジチオプロピオン酸スクシンイミジルピリジン、マレイミド−ＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル等の二官能性リンカーに化学結合することにより、中性又は塩基性の条件下で好適な溶媒中に追加の反応性官能基を産生することができる。

環及びポリメチンリンカー内の二重結合の位置を示す構造式により本発明の化合物を示す場合、構造式は、例えば以下の図に示すような何れかの共鳴構造も包含する：

。

一実施形態において、本発明は、以下の化学式（１６）によりＺ^１−（ＰＭＬ−ＢＭ）−Ｚ^２を表す化合物であって：

式中、ＢＭが、ＰＭＬ上に存在するＱを介して化学結合する生体分子である、化合物を提供する。

一態様において、ＢＭは、一般構造式Ｚ^１−（ＰＭＬ）−Ｚ^２の化合物（蛍光色素）の蓄積、生体分布、脱離、ターゲティング、結合及び／又は認識を変更又は改変又は増強する部分である。ＢＭには、抗体及びそれらのフラグメント、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、抗体（又は抗原結合抗体フラグメント、一本鎖抗体）、糖タンパク質、細胞受容体のリガンド、多糖、ヌクレオシド、アプタマー、細胞受容体自体、酵素基質、酵素補因子、ビオチン、ホルモン、神経ホルモン、神経伝達物質、成長因子、サイトカイン、リンホカイン、レクチン、セレクチン、毒素及び炭水化物が含まれるが、これらに限定されない。種々の生体分子を使用するその他のターゲティング及び送達法も使用することでき、これには、アシアロ糖タンパク質受容体、ソマトスタチン、神経成長因子、オキシトシン、ボンベシン、カルシトニン、アルギニンバソプレシン、アンジオテンシンＩＩ、心房性ナトリウム利尿ペプチド、インスリン、グルカゴン、プロラクチン、ゴナドトロピン、種々のオピオイド、及びウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化物質を含むがこれらに限定されない、内在化受容体をターゲティングする葉酸媒介ターゲティング（Ｌｅａｍｏｎ ＆ Ｌｏｗ，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ，６：４４−５１，２００１）、トランスフェリン、ビタミン、炭水化物及びリガンドが含まれる。又、ウイルス及び細菌を含むがこれらに限定されない幾つかの源に由来する、膜、膜貫通、及び核転座シグナル配列も含まれる。ＢＭは又、有機分子、ポリマー、デンドリマー、薬物、脂質、脂質集合体、治療薬分子、ポリマー微粒子、細胞又はナノ粒子であってもよい。特定の実施形態において、ＢＭには又、小分子薬剤、光治療薬分子、及びそれらの誘導体が含まれてもよい。

本発明の特定の実施形態において、ＢＭが本発明の化合物に化学的に結合する場合、本発明の化合物の蛍光は増大する。特定の実施形態において、蛍光は、未結合化合物に比べて約１０％、約２５％、約５０％、又は約５０％超増大する。

本発明の一態様において、ＢＭの幾つかのコピーは、多価リンカーを、又は幾つかの反応性官能基を含有するリンカーを介して、Ｑに化学結合することにより、構造式（Ｚ^１−（ＰＭＬ）−Ｚ^２）−（（Ｌ）_Ｗ−（ＢＭ）ｑ）ｔの生体適合性蛍光分子（式中、Ｌはリンカー又は多価リンカーであり；ｔ＝ｌ〜６、ｗ＝ｌ〜５００、及びｑ＝ｌ〜５００であり；（Ｌ）_Ｗは、同じリンカー又は異なるリンカーの組み合わせのコピーを表す）を形成することができる。好適なリンカーには、アミノカプロン酸、グルタミン酸、及びポリグルタミン酸が含まれるが、これらに限定されない。

本発明の別の態様において、構造式Ｚ^１−（ＰＭＬ）−Ｚ^２の１つ以上の化合物（蛍光色素）は、単一のＢＭに化学結合することにより、構造式［Ｚ^１−（ＰＭＬ）−Ｚ^２］_ｋ−ＢＭ（式中、ｋ＝１〜５００）の生体適合性蛍光分子を形成することができる。

一実施形態において、Ｚ^１−（ＰＭＬ−ＢＭ）−Ｚ^２は、化合物が約４４０〜約１１００ｎｍ、約５５０〜約８００ｎｍ、約５００〜約９００ｎｍ、又は約６００〜約９００ｎｍの吸収及び発光最大値を有する、生体適合性蛍光分子である。

一実施形態において、本発明の化合物（蛍光色素）及び生体適合性蛍光分子は、標的の相互作用の後に活性化される。「標的の相互作用の後に活性化される」とは、蛍光色素又は生体適合性蛍光分子の検出可能な特性（例えば、光学特性）を改変する変化を意味する。これには、蛍光色素又は生体適合性蛍光分子の特性（例えば、光学特性）の検出可能な相違、例えば、蛍光シグナル振幅の変化（例えば脱消光及び消光）、波長、蛍光寿命、スペクトル特性又は極性の変化をもたらす、修飾、改変又は結合（共有結合又は非共有結合）が含まれるが、これらに限定されない。別の実施形態においては、生体適合性蛍光分子の蛍光シグナルを消光するために、消光剤分子が使用される。これらの活性化及び非活性化状態を活用することで、蛍光色素又は生体適合性蛍光分子が対象において活性であるか、不活性であるかを、シグナル強度の変化を特定することによって判定することができる。更に、蛍光色素及び生体適合性蛍光分子は、これらが活性化されるまでシグナルを殆ど又は全く示さないように設計することもできる。活性化は、酵素開裂、酵素変換、ホスホリル化又は脱ホスホリル化、結合によるコンホーメーションの変化、酵素媒介スプライシング、酵素媒介転移、相補ＤＮＡ又はＲＮＡのハイブリダイゼーション、検体結合（例えば、Ｎａ^＋、Ｋ^＋、Ｃａ^２＋、Ｃｌ⁻等の検体又は別の検体との会合）、環境の疎水性の変化、及び化学修飾を含むがこれらに限定されない要因よって行われてもよい。

一実施形態において、本発明の化合物（蛍光色素）及び生体適合性蛍光分子は、標的に対して高い結合親和性を有する。

又、本明細書では、ｉｎ ｖｉｖｏ光学イメージングの方法であって、（ａ）本発明の化合物（蛍光色素）又は生体適合性蛍光分子を対象に投与する；（ｂ）化合物（蛍光色素）又は生体適合性蛍光分子が対象内に拡散するか、生物学的標的と接触又は相互作用するための時間を設ける；（ｃ）化合物（蛍光色素）又は生体適合性蛍光分子により吸収可能な波長の光を対象に照射する；及び（ｄ）化合物（蛍光色素）又は生体適合性蛍光分子により発光される光学シグナルを検出すること含む、方法も提供される。

本発明の化合物（蛍光色素）及び生体適合性蛍光分子により生成される光学シグナルは、断層撮影、リアクタンス、平面、内視鏡、顕微鏡、手術用ゴーグル、ビデオイメージング技術又はその他の方法（例えば、生体顕微鏡検査及び二光子顕微鏡検査を含めた顕微鏡検査）により収集されるか否か、並びに定量的使用されるか、定性的に使用されるかにかかわらず、本発明の態様と見なされる。

本発明の一態様は、本化合物（蛍光色素）及び生体適合性蛍光分子により発光される光学シグナルの有無、分布又はレベルが疾患状態を示す方法である。

本発明は又、患者又は対象における異常（例えば、癌、心臓血管疾患、後天性免疫不全症候群、神経変性疾患、炎症性疾患、呼吸器疾患、代謝疾患、骨疾患、又は免疫学的疾患等の疾患に関連する何れかの異常）を検出するために、本発明の化合物（蛍光色素）及び生体適合性蛍光分子を使用する方法も特徴とする。本発明は又、本発明の化合物（組成物）を使用することによって特定の分子標的に対する化合物又は療法の効果を評価する方法であって、対象が化合物又は療法による処置の前後にイメージングされ、対応する画像が比較される、方法も特徴とする。

本発明のイメージング方法の手順は又、所定の間隔で繰り返すことにより、対象又は試料におけるＺ^１−（ＰＭＬ）−Ｚ^２含有化合物の発光シグナルを経時的に評価することができる。発光シグナルは、画像の形態をとる場合がある。対象は、脊椎動物、例えばヒトを含めた哺乳動物である場合がある。動物は又、非脊椎動物（例えば、クンニングアメラ・エレガンス、ショウジョウバエ又はその他の研究用モデル生物等）である場合もある。試料には、細胞、細胞培養物、組織切片、臓器、臓器切片、サイトスピン試料等が含まれてもよいが、これらに限定されない。

本発明は更に、複数のＺ^１−（ＰＭＬ）−Ｚ^２含有化合物を選択的且つ同時に検出及びイメージングするｉｎ ｖｉｖｏ方法も特徴とする。本方法は、光学特性が区別可能な複数のＺ^１−（ＰＭＬ）−Ｚ^２含有化合物を同時又は逐次的に対象に投与することを含む。従って、本方法は、複数の事象又は標的を記録することができる。

本発明は又、ターゲティングされた又は活性化可能な１つ以上の光学イメージングプローブと同時に、或いは磁気共鳴イメージング、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、Ｘ線、超音波又は核医学的イメージング様式及びそれらの個々のイメージング剤を使用したデュアルイメージングプロトコルで、１つ以上のＺ^１−（ＰＭＬ）−Ｚ^２含有化合物を選択的に検出及びイメージングするｉｎ ｖｉｖｏ方法も特徴とする。本方法は、互いに特性を区別することができる少なくとも１つのイメージングプローブを、少なくとも１つのＺ^１−（ＰＭＬ）−Ｚ^２含有化合物を含め、同時又は逐次的に対象に投与することを含む。一態様において、デュアルイメージングプロトコルは、磁気共鳴イメージング剤（例えば、酸化物系薬剤、又はガドペンテト酸塩等のガドリニウム系薬剤）と同時又はほぼ逐次的に、Ｚ^１−（ＰＭＬ）−Ｚ^２含有化合物を使用する、光学及び磁気共鳴イメージングである。従って、本発明は、複数のイメージング様式又はイメージング剤を使用して複数の事象又は標的を記録することができる。

別の態様において、本発明は、試料をＺ^１−（ＰＭＬ）−Ｚ^２含有化合物と接触させる；プローブが活性化するか、又は試料中の対象標的に結合する時間を設ける；場合により未結合のプローブを除去する；Ｚ^１−（ＰＭＬ）−Ｚ^２含有化合物により吸収可能な波長の光を標的に照射する；及びＺ^１−（ＰＭＬ）−Ｚ^２含有化合物により発光される光学シグナルを検出することを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏ光学イメージング方法を特徴とする。

投与後、検出は、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ方法（即ち、フローサイトメトリー）により、或いはｉｎ ｖｉｖｏイメージング法（即ち、断層撮影、カテーテル、ブレーナ／リアクタンスシステム又は内視鏡システムにより行うことができる。

一実施形態においては、ｅｘ ｖｉｖｏで使用を標識するために、誘導されたＺ^１−（ＰＭＬ）−Ｚ^２含有化合物を使用することができる。試料（例えば、細胞）は、対象から直接得ることもできれば、別の供給源（例えば、別の対象、細胞培養物等から）得ることもできる。Ｚ^１−（ＰＭＬ）−Ｚ^２含有化合物は、細胞と混合することで、細胞を効果的に（共有結合又は非共有結合により）標識することができ、得られた標識細胞を対象に注入することができる。本方法は、特定の細胞型（Ｔ細胞、腫瘍細胞、免疫細胞、幹細胞及びその他の細胞型）の出入及び局在化を監視するために使用することができる。特に、本方法は、細胞系療法を監視するために使用される場合がある。試料は又、非哺乳動物の供給源（植物、昆虫、ウイルス、細菌及びバクテリオファージを含むがこれらに限定されない）から得ることもできる。

本発明の別の態様は、生体対象又は試料に対して一般的に毒性を有するジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）又はその他の有機溶媒（即ち、生理学的緩衝剤又は溶液）を使用することなく、細胞を含めた試料をｉｎ ｖｉｖｏでイメージングし、ｅｘ ｖｉｖｏで標識するために使用することができる、Ｚ^１−（ＰＭＬ）−Ｚ^２含有化合物を特徴とする。

ＢＭ又は細胞を標識する場合は、本発明の化合物（蛍光色素）を、約４〜３７℃にて約５分〜２４時間以上種々の濃度のＢＭと共にインキュベートすることができる。インキュベートの後、遊離基又はＢＭに化学的に結合していない蛍光色素を、例えば当該技術分野で周知のクロマトグラフィー又は限外濾過法により除去することができる。細胞の場合には、インキュベートの後、細胞を遠心分離して、細胞ペレットを作成し、このペレットから上澄みを除去することができる。細胞は、培地又は生理食塩水に再懸濁することにより、残余の、未結合の又は遊離の蛍光色素を洗浄除去することができ、これを数回繰り返すことができる。この方法で、細胞は、内部又は外部の細胞分子への直接コンジュゲーションによるか、或いはシトゾル、エンドソーム、核、ゴルジ装置及びその他の細胞小器官を含むがこれらに限定されない種々の細胞内コンパートメント内への非特異的な細胞取込みにより、標識することができる。

本発明の別の態様は、ヒトを含めた動物対象への投与に好適な薬学的組成物中に配合されるイメージングプローブを含有するＺ^１−（ＰＭＬ）−Ｚ^２含有化合物を特徴とする。薬学的組成物には、生理学的に許容される（関連する）担体中のナノ粒子及び１つ以上の安定化剤が含まれてもよい。

本発明の別の態様は、ヒトを含めた動物対象及び細胞への投与に好適な薬学的組成物中に配合される生体適合性蛍光Ｚ^１−（ＰＭＬ）−Ｚ^２含有化合物を特徴とする。薬学的組成物には、生理学的に許容される（関連する）担体中の１つ以上の安定化剤が含まれてもよい。

本発明の方法で使用する安定化剤の好適な例には、低分子量炭水化物（一態様において、これは直鎖ポリアルコール（例えば、ソルビトール）及びグリセロール；又はマンニトールである）が含まれるが、これに限定されない。その他の低分子量炭水化物（例えば、イノシトール）も使用される場合がある。生理学的に関連する担体には、水、生理食塩水が含まれてもよく、更には、緩衝剤等の物質、並びに医薬品製剤中での使用に適合する保存剤等のその他の物質が含まれてもよい。

本発明は又、蛍光Ｚ^１−（ＰＭＬ）−Ｚ^２含有化合物、標識核酸認識分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾核酸、ＰＮＡ、分子ビーコン、アプタマーを含む）、又はその他の核酸結合分子（例えば、短鎖干渉ＲＮＡ、即ちｓｉＲＮＡ）を使用した遺伝子配列認識の方法も特徴とする。本方法には、ハイブリダイゼーション、ライゲーション、開裂、組換え、合成、配列決定、突然変異検出、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、及びマイクロアレイ使用等の技法と共に、１つ以上の蛍光Ｚ^１−（ＰＭＬ）−Ｚ^２含有化合物を使用する方法が含まれる。例えば、核酸ハイブリダイゼーションの原理により試料中の一本鎖核酸（即ち、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ又は変性二本鎖ＤＮＡ）を検出するには、一本鎖核酸に化学結合する蛍光Ｚ^１−（ＰＭＬ）−Ｚ^２含有化合物を、１つ以上の一本鎖核酸を含有する試料に接触させて、蛍光Ｚ^１−（ＰＭＬ）−Ｚ^２含有化合物の蛍光を検出し、ここで蛍光Ｚ^１−（ＰＭＬ）−Ｚ^２含有化合物により発光される蛍光シグナルの存在又はレベルは、試料中の核酸の存在又は量を示す。

Ｚ^１−（ＰＭＬ）−Ｚ^２含有化合物又はその誘導体から発生した光学シグナルは、断層撮影、リアクタンス、平面、内視鏡、顕微鏡、手術用ゴーグル又は画像、ビデオイメージング技術又はその他の方法（例えば、生体顕微鏡検査及び二光子顕微鏡検査等を含めた顕微鏡検査）により収集されるか否か、並びに定量的に使用されるか、定性的に使用されるかにかかわらず、本発明の態様と見なされる。

本発明の別の態様は、Ｚ^１−（ＰＭＬ）−Ｚ^２含有化合物及び場合によりｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏのイメージング方法に蛍光色素又はイメージングプローブを使用するための説明書を含んだキットを特徴とする。本キットは場合により、開示方法に蛍光色素又はイメージングプローブを使用するのに役立つ構成部品（例えば、緩衝剤及びその他の配合剤）を含む場合もあれば；或いは、本キットは、対象へのイメージングプローブの投与に役立つ医療機器を含む場合もある。

本発明のＺ^１−（ＰＭＬ）−Ｚ^２含有化合物及び薬学的組成物は、経口的に、非経口的に、吸入により、局所的に、直腸内に、経鼻的に、口内に、膣内に、又は移植したリザーバーを介して投与することができる。「非経口投与」という用語は、静脈内、筋肉内、皮下、動脈内、関節内、滑膜内、胸骨内、髄腔内、腹腔内、槽内、肝内、病変内、頭蓋内及びリンパ内への注射又は注入法を包含する。Ｚ^１−（ＰＭＬ）−Ｚ^２含有化合物は又、カテーテルを介して、又は針から組織に投与してもよい。

一実施形態においては、本発明の化合物が、有効量（蛍光を生じるか増大させるのに有効な量）投与される。一実施形態においては、本発明の化合物が、約１ｎｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約１００ｎｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇ、約５０μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ投与される。

好ましいＺ^１−（ＰＭＬ）−Ｚ^２含有化合物は、以下の特性を有する：即ち、（１）高量子収率（例えば、水性媒体中で５％を超える量子収率）、（２）狭小な発光スペクトル（例えば、７５ｎｍ未満；より好ましくは５０ｎｍ未満）、（３）吸収及び発光スペクトルの差（例えば、２０ｎｍ超；より好ましくは５０ｎｍ超の差）、（３）高い化学的安定性及び光安定性（例えば、露光後に蛍光特性を維持）、（４）イメージングプロトコルに使用される線量における細胞又は対象への無毒性又は最小限の毒性（例えば、ＬＤ_５０又は刺激試験又は当該技術分野で既知のその他の同様の方法により測定）、及び／又は（５）商業的実現性及び大量（例えば、グラム及びキログラム量）生産のための規模拡大性。

本発明の化合物は、好適な有機又は無機塩基と反応して塩基付加塩を形成することができる１つ以上の十分に酸性のプロトンを有してもよい。塩基付加塩には、無機塩基（例えば、アンモニウム又はアルカリ又はアルカリ土類金属の水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩）及び有機塩基（例えば、アルコキシド、アルキルアミド、アルキル及びアリールアミン等）に由来するものが含まれる。従って、本発明の塩を調製するのに有用なこのような塩基には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、炭酸カリウム等が含まれる。

アミン等の十分に塩基性の基を有する本発明の化合物は、有機又は無機酸と反応して、酸付加塩を形成してもよい。塩基性基を有する化合物から酸付加塩を形成するのに一般的に使用される酸には、無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、リン酸等）及び有機酸（例えば、ｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、ｐ−ブロモフェニルスルホン酸、炭酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、酢酸等）がある。このような塩の例には、硫酸塩、ピロ硫酸塩、重硫酸塩、亜硫酸塩、重亜硫酸塩、リン酸塩、一水素リン酸塩、二水素リン酸塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸塩、プロピオン酸塩、デカン酸塩、カプリル酸塩、アクリル酸塩、ギ酸塩、イソ酪酸塩、カプロン酸塩、ヘプタン酸塩、プロピオル酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、１，４−二酸ブチン、１，６−二酸ヘキシン、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、フタル酸塩、スルホン酸塩、キシレンスルホン酸塩、フェニル酢酸塩、フェニルプロピオン酸塩、フェニル酪酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、γヒドロキシ酪酸塩、グリコール酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、プロパンスルホン酸塩、１−スルホン酸ナフタレン、２−スルホン酸ナフタレン、マンデル酸塩等が含まれる。

本明細書で使用される「アルキル」という用語は、飽和の直鎖、分枝鎖又は環状炭化水素を意味する。直鎖又は分枝鎖の場合、アルキル基は一般的に、Ｃ１−Ｃ２０、より一般的にはＣ１−Ｃ１０であり；環状の場合、アルキル基は一般的に、Ｃ３−Ｃ１２、より一般的にはＣ３−Ｃ７である。アルキル基の例には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル及びｔｅｒｔ−ブチル及び１，１−ジメチルヘキシルが含まれる。

「脂肪族基」は非芳香族であり、場合により１つ以上の不飽和単位（例えば、二重及び／又は三重結合）を含有する場合がある。脂肪族基は、直鎖である場合もあれば、分枝鎖である場合もあり、一般的には１〜１２個の炭素原子、より一般的には１〜６個の炭素原子、更により一般的には１〜４個の炭素原子を含有する。脂肪族基内の１つ以上のメチレン基は、場合によりＯ、Ｓ又はＮＨで置換されてもよい。

本明細書で使用される、非芳香族炭素環式環又は非芳香族複素環式環という用語は、単独で又はより大型の部分の一部として使用される場合、単環式環及び多環式環を含む３〜１４個の原子を有する、飽和していてもよければ、１つ以上の不飽和単位を含有していてもよい、非芳香族の炭素又はヘテロ原子含有基を指し、この場合、該炭素環式環又は複素環式環は、１つ以上の非芳香族の炭素環式環若しくは複素環式環、又は１つ以上の芳香族（炭素環式又は複素環式）環に縮合してもよい。

本明細書で使用される「アルコキシ」という用語は、−ＯＲ^＊＊（式中、Ｒ^＊＊は上に定義したようなアルキル基である）で表される。

本明細書で使用される「カルボニル」という用語は、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^＊＊（式中、Ｒ^＊＊は上に定義したようなアルキル基である）で表される。

「芳香族基」という用語は、炭素環式芳香族環及びヘテロアリール環を包含する。「芳香族基」という用語は、「アリール」、「アリール環」、「芳香族環」、「アリール基」及び「芳香族基」という用語と交換可能に使用される場合がある。

炭素環式芳香族環基は、炭素環原子（一般的には６〜１４個）のみを有し、単環式芳香族環（例えば、フェニル及び縮合多環式芳香族環系）を包含し、この場合、炭素環式芳香族環は、１つ以上の芳香族環（炭素環式芳香族又は複素芳香族）に縮合する。例としては、１−ナフチル、２−ナフチル、１−アントラシル及び２−アントラシルが含まれる。又、本明細書で使用される「炭素環式芳香族環」という用語の適用範囲には、インダニル、フタリミジル、ナフチミジル、フェナントリジニル又はテトラヒドロナフチル中等において、芳香族が１つ以上の非芳香族環（炭素環式環又は複素環式環）に縮合する基である。

「ヘテロアリール」、「複素芳香族」、「ヘテロアリール環」、「ヘテロアリール基」及び「複素芳香族基」という用語は、単独で又は「ヘテロアラルキル」等のより大型の部分の一部として使用される場合、単環式複素芳香族環及び多環式複素芳香族環を含めた５〜１４員の複素芳香族環基を指し、この場合、単環式芳香族環はその他１つ以上の芳香族環（炭素環式環又は複素環式環）に縮合する。ヘテロアリール基は１つ以上の環ヘテロ原子を有する。ヘテロアリール基の例には、２−フラニル、３−フラニル、Ｎ−イミダゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、５−イミダゾリル、３−イソキサゾリル、４−イソキサゾリル、５−イソキサゾリル、オキサジアゾリル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、Ｎ−ピラゾリル、３−ピラゾリル、４−ピラゾリル、５−ピラゾリル、Ｎ−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジニル、４−ピリミジニル、５−ピリミジニル、３−ピリダジニル、４−ピリダジニル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、２−チエニル、３−チエニル、カルバゾリル、ベンゾチエニル、ベンゾフラニル、インドリル、キノリニル、ベンゾチアゾール、ベンゾオキサゾール、ベンズイミダゾリル、イソキノリニル及びイソインドリルが含まれる。又、本明細書で使用される「ヘテロアリール」という用語の適用範囲には、芳香族環が１つ以上の非芳香族環（炭素環式環又は複素環式環）に縮合する基も含まれる。

非芳香族複素環式基という用語は、単独で又はより大型の部分の一部として使用される場合、単環式複素環式環及び多環式環式環を含めた３〜１４員の非芳香族複素環式環基を指し、この場合、単環式環はその他１つ以上の非芳香族炭素環式環若しくは複素環式環又は芳香族環（炭素環式環又は複素環式環）に縮合する。複素環式基は、１つ以上のヘテロ原子を有し、飽和してもよければ、１つ以上の不飽和単位を含有してもよい。複素環式環の例には、ピペリジニル（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌ）、ピペリジニル（ｐｉｐｅｒｉｚｉｎｙｌ）、ピロリジニル、ピラゾリジニル、イミダゾリジニル、テトラヒドロキノリニル、インドリニル、イソインドリニル、テトラヒドロフラニル、オキサゾリジニル、チアゾリジニル、ジオキソラニル、ジチオラニル、テトラヒドロピラニル、ジヒドロピラニル、アゼパニル及びアゼチジニルが含まれる。

「ヘテロ原子」という用語は、窒素、酸素又は硫黄を意味し、窒素及び硫黄の何れかの酸化形態、並びに何れかの塩基性窒素の４級化形態を包含する。又、「窒素」という用語は、ヘテロアリール又は非芳香族複素環式基の置換可能な窒素を包含する。一例として、酸素、硫黄又は窒素から選択される０〜３個のヘテロ原子を有する飽和又は部分不飽和環において、窒素は、Ｎ（３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピロリルの場合）、ＮＨ（ピロリジニルの場合）又はＮＲ”（Ｎ−置換ピロリジニルの場合）（式中、Ｒ”は、以下に定義する通り、非芳香族窒素含有複素環式基の環内の窒素原子に好適な置換基である）である場合がある。好ましくは、窒素は未置換である。

本明細書で定義する置換アリール基は、炭素又は窒素環原子等の１つ以上の置換可能な環原子を含有する。アリール又は脂肪族基の置換可能な環炭素原子上の好適な置換基の例には、ハロゲン（例えば、−Ｂｒ、Ｃｌ、Ｉ及びＦ）、−ＯＨ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４ハロアルキル、−ＮＯ_２、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、Ｃ１−Ｃ４ハロアルコキシ、−ＣＮ、−ＮＨ_２、Ｃ１−Ｃ４アルキルアミノ、Ｃ１−Ｃ４ジアルキルアミノ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−ＯＣ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−ＯＣ（Ｏ）（アリール）、−ＯＣ（Ｏ）（置換アリール）、−ＯＣ（Ｏ）（アラルキル）、−ＯＣ（Ｏ）（置換アラルキル）、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｈ、−ＮＨＣ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｃｌ−Ｃ４アルキル）_２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃｌ−Ｃ４アルキル）、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ_２、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ（Ｃｌ−Ｃ４アルキル）、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｃｌ−Ｃ４アルキル）_２、−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ_２、−ＳＯ_２ＮＨ_２−ＳＯ_２ＮＨ（Ｃ１−Ｃ３アルキル）、−ＳＯ_２Ｎ（Ｃ１−Ｃ３アルキル）_２、ＮＨＳＯ_２Ｈ、ＮＨＳＯ_２（Ｃ１−Ｃ４アルキル）及びアリールが含まれる。アリール基上の好ましい置換基は、本明細書全体で定義する通りである。

アリール基の置換可能な環窒素原子上の好適な置換基の例には、Ｃ１−Ｃ４アルキル、ＮＨ_２、Ｃ１−Ｃ４アルキルアミノ、Ｃ１−Ｃ４ジアルキルアミノ，−Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−ＣＯ_２Ｒ^＊＊、−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒ^＊＊、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−ＳＯ_２ＮＨ_２−ＳＯ_２ＮＨ（Ｃ１−Ｃ３アルキル）、−ＳＯ_２Ｎ（Ｃ１−Ｃ３アルキル）_２、ＮＨＳＯ_２Ｈ、ＮＨＳＯ_２（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（＝Ｓ）ＮＨ_２、−Ｃ（＝Ｓ）ＮＨ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、−Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）_２、−Ｃ（＝ＮＨ）−Ｎ（Ｈ）_２、−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）及び−Ｃ（＝ＮＨ）−Ｎ（Ｃ１−Ｃ４アルキル）_２が含まれる。

本明細書に定義する好適なアルキル、脂肪族、非芳香族の炭素環式又は複素環式基は、１つ以上の置換基を含有する。アルキル基に好適な置換基の例には、アリール及び脂肪族の置換可能な炭素について上に列挙したもの、並びに以下が含まれる：＝Ｏ、＝Ｓ、＝ＮＮＨＲ^＊＊、＝ＮＮ（Ｒ^＊＊）_２、＝ＮＮＨＣ（Ｏ）Ｒ^＊＊、＝ＮＮＨＣ０_２（アルキル）、＝ＮＮＨＳＯ_２（アルキル）、＝ＮＲ^＊＊、スピロシクロアルキル基、又は縮合シクロアルキル基。各存在におけるＲ^＊＊は、独立して−Ｈ又はＣ１−Ｃ６アルキルである。アルキル脂肪族、非芳香族炭素環式又は複素環式基上の好ましい置換基は、本明細書全体で定義する通りである。

（ｉｎ ｖｉｔｒｏでの試験及び使用）
本発明の化合物（蛍光色素）及び生体適合性蛍光分子は、その生物学的及び性能特性を評価するために、当業者によってｉｎ ｖｉｔｒｏで試験することができる。例えば、培養物中で成長する種々の型の細胞を使用して、生物学的及び性能特性を評価することができる。蛍光色素及び生体適合性蛍光分子の取込み、標識、結合ターゲティング又は細胞局在化は、分光法、蛍光顕微鏡検査及びフローサイトメトリー等の当該技術分野で既知の技法を使用して評価することができる。例えば、本発明の蛍光色素及び生体適合性蛍光分子は、一定期間にわたり試料と接触させた後、遊離又は未結合の分子を洗浄除去することができる。次いで、本発明の蛍光色素及び生体適合性蛍光分子の光学特性に適合した適切なフィルターを装着した蛍光顕微鏡を使用して、試料を観察することができる。培養物中の細胞の蛍光顕微鏡検査は又、１つ以上の細胞レベル下のコンパートメントで取込み及び結合が生じたかどうかを判定するのに好都合な手段でもある。組織、組織切片、並びにサイトスピン試料等のその他の種類の試料も又、分子の生物学的及び性能特性を評価するために同様の様式で使用することができる。フローサイトメトリー、免疫検定、ハイブリダイゼーション検定及びマイクロアレイ分析を含むがこれらに限定されないその他の蛍光検出方法も使用することができる。

（光学イメージング）
本発明の実施には、蛍光、光学画像収集及び画像処理の一般的原理を適用することができる。光学イメージング法のレビューについては、例えば、Ａｌｆａｎｏ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２０：２４８−２７０，１９９７を参照されたい。

本発明の実施において有用なイメージングシステムは、一般的に以下の３つの基本構成要素を備える：（１）蛍光色素及び生体適合性蛍光分子を励起するのに適切な光源、（２）励起に使用した光の発光を分離又は区別する手段、及び（３）発行された光学シグナルを検出する検出システム。

一般的に、光学検出システムは、集光／画像形成システム及び光学検出／画像記録装置を備えるものと捉えられる。光学検出装置はこれらの両装置を組み込んだ単一の統合装置ではあるが、以下では集光／画像形成装置及び光検出／画像記録装置を別個に考察する。

特に有用な集光／画像形成装置には内視鏡がある。多くの組織及び臓器（例えば、腹腔（Ｇａｈｌｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．Ｂ ５２：１３１−１３５，１９９９）、卵巣癌（Ｍａｊｏｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．６６：１２２−１３２，１９９７）、結腸及び直腸（Ｍｙｃｅｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ．Ｅｎｄｏｓｃ．４８：３９０−３９４，１９９８；及びＳｔｅｐｐ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｓｃｏｐｙ ３０：３７９−３８６，１９９８）、胆管（Ｉｚｕｉｓｈｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ４６：８０４−８０７，１９９９）、胃（Ａｂｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｓｃｏｐｙ ３２：２８１−２８６，２０００）、膀胱（Ｋｒｉｅｇｍａｉｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｕｒｏｌ．Ｉｎｔ．６３：２７−３１，１９９９；及びＲｉｅｄｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｎｄｏｕｒｏｌ．１３：７５５−７５９，１９９９）、肺（Ｈｉｒｓｃｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７：５−２２０，２００１）、脳（Ｗａｒｄ，Ｊ．Ｌａｓｅｒ Ａｐｐｌ．１０：２２４−２２８，１９９８）、食道、及び頭頚部領域を含む）のｉｎ ｖｉｖｏ光学イメージングに使用されている内視鏡デバイス及び技法を、本発明の実施に使用することができる。

本発明において有用なその他の種類の集光装置には、ファイバーオプティクスデバイスを含めたカテーテルデバイスがある。このようなデバイスは、血管内イメージングに特に好適である。例えば、Ｔｅａｒｎｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：２０３７−２０３９，１９９７；及びＣｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９４：３０１３，１９９６を参照されたい。

更に他のイメージング技術（フェーズドアレイ技術（Ｂｏａｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１ ：４８８７−４８９１，１９９４；Ｃｈａｎｃｅ，Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８３５：２９−４５，１９９８）、光学断層撮影（Ｃｈｅｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｐｔｉｃｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ ３：１１８−１２３，１９９８；及びＳｉｅｇｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｐｔｉｃｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ ４：２８７−２９８，１９９９）、生体内顕微鏡検査（Ｄｅｌｌｉａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ８２：１５１３−１５１８，２０００；Ｍｏｎｓｋｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：４１２９−４１３５，１９９９；及びＦｕｋｕｍｕｒａ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ９４：７１５−７２５，１９９８）、共焦点イメージング（Ｋｏｒｌａｃｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：８４６１−８４６６，１９９９；Ｒａｊａｄｈｙａｋｓｈａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１０４：９４６−９５２，１９９５；及びＧｏｎｚａｌｅｚ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．３０：３３７−３５６，１９９９）及び蛍光分子断層撮影（ＦＭＴ）（Ｎｚｉａｃｈｒｉｓｔｏｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ８：７５７−７６０，２００２；米国特許第６，６１５，０６３号、ＰＣＴ特許出願第ＷＯ ０３／１０２５５８号及び第ＰＣＴ ＵＳ／０３／０７５７９号）を、本発明の実施に使用することができ、ＩＶＩＳ（登録商標） Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｘｅｎｏｇｅｎ［米国カリフォルニア州アラメダ］）、Ｍａｅｓｔｒｏ（ＣＲＩ［米国マサチューセッツ州ウォーバーン］）ＳｏｆｔＳｃａｎ（登録商標）及びｅＸｐｌｏｒｅ Ｏｐｔｉｘ^ＴＭ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ［カナダ モントリオール］）装置も、本発明の実施に使用することができる。

好適な光学検出／画像記録装置（例えば、電荷結合素子（ＣＣＤ）システム又は写真フィルム）を、本発明に使用することができる。光学検出／画像記録の選択は、使用する集光／画像形成装置の種類を含めた種々の要因により変動する。好適な装置の選択、それらの光学イメージング装置への組込み、及び装置の操作は、当業者の知るところである。

（診断及び疾患の適用及び方法）
本発明の方法は、幾つかの兆候の測定（対象における蛍光色素及び生体適合性蛍光分子の局在化の経時的な追跡、又は対象における代謝の変化又は改変及び／又は分子の脱離の評価を含む）に使用することができる。これら方法は又、分子の事象をイメージングすることによるこのような疾患の治療法、及びこのような治療法により調節された生物学的経路の追跡（薬効、最適な時期、最適な線量レベル（個々の患者又は試験対象に最適なレベルを含む）、及び複合療法の相乗作用を評価するために使用することができる。

本発明は、医師又は外科医が、関節炎、癌及び特に結腸ポリープ又は脆弱性プラーク等の疾患の領域を特定及び特性付ける場合、疾患組織と正常組織を区別する場合、（例えば、脳手術において）通常の手術用顕微鏡を使用して検出するのが困難な腫瘍縁を検出する場合、（例えば、患部が癌性のものであり除去すべきか、或いは非癌性のものであり放置するかを決定することにより）治療的又は外科的介入の判断の材料とする場合、又は外科的に病期判定する場合（例えば、術中のリンパ節の病期判定、歩哨リンパ節マッピング又は術中の出血の評価）に、使用することができる。

本発明の方法は又、疾患（特に早期疾患）の局在化、疾患又は疾患に関連する病態の重症度の検出、特徴付け及び／又は判定、疾患の病期判定、並びに外科的処置等の種々の治療的介入の監視及び指針提供、並びに細胞系療法を含めた薬物療法の監視においても使用することができる。本発明の方法は又、疾患又は疾患病態の予後判定においても使用することができる。このような疾患又は疾患病態の例には、炎症（例えば、関節炎、例えば慢性関節リューマチにより生じる炎症）、癌（例えば、結腸直腸癌、卵巣癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、頚部癌、皮膚癌、脳癌、胃腸癌、口腔癌、食道癌、骨癌）、心臓血管疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症、血管の炎症性病態、虚血、卒中、血栓）、皮膚疾患（例えば、カポジ肉腫、乾癬）、眼科疾患（例えば、黄斑変性、糖尿病性網膜症）、汗腺性疾患（例えば、細菌、ウイルス、カビ及び寄生虫感染（後天性免疫不全症候群を含む））、免疫疾患（例えば、自己免疫疾患、リンパ種、多発性硬化症、慢性関節リューマチ、真性糖尿病）、中枢神経系疾患（例えば、パーキンソン病又はアルツハイマー病等の神経変性疾患）、遺伝病、代謝疾患、環境疾患（例えば、鉛、水銀及び放射性物質による中毒、皮膚癌）、及び骨関連疾患（例えば、骨粗鬆症、原発性又は転移性骨腫瘍、骨関節炎）が含まれる。従って、本発明の方法は、腫瘍細胞の存在及び腫瘍細胞の局在化、炎症の存在及び局在化（活性化マクロファージ（例えば、アテローム性動脈硬化症又は関節炎の場合）の存在）、冠動脈及び抹消動脈における急性閉塞（即ち、脆弱性プラーク）の危険性がある領域、拡大中の動脈瘤の領域、頚動脈内の不安定なプラーク、及び虚血領域を含めた、血管疾患の存在及び局在化の判定に使用することができる。本発明の方法及び化合物（組成物）は又、アポトーシス、壊死、低酸素及び血管形成の特定及び評価にも使用することができる。

光学イメージングの様式及び測定法には、蛍光イメージング；内視鏡；蛍光内視鏡；光干渉断層撮影；光透過イメージング；時間分解光透過イメージング；共焦点イメージング；非線形顕微鏡検査；光音響イメージング；音響光学イメージング；分光法；リアクタンス分光法；生体内イメージング；２光量子イメージング；干渉分析法；コヒーレンス干渉分析法；拡散光断層撮影及び蛍光分子断層撮影、並びに光散乱、吸収、分極、発光、蛍光寿命、量子収率及び消光の測定が含まれる。

本発明の化合物（組成物）及び方法は、その他のイメージング組成物及び方法と組み合わせて使用することができる。例えば、本発明の方法は、その他の伝統的なイメージング様式（Ｘ線、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）、単光子コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）及び磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ））と組み合わせて使用することができる。例えば、本発明の化合物（組成物）及び方法は、ＣＴ及びＭＲイメージングと組み合わせて使用して、例えば、断層撮影画像を別のイメージング様式により作成した画像と共に同時登録することにより、解剖学的及び生物学的な情報を同時に取得することができる。特に、ＭＲＩ又はＣＴとの組み合わせは、これらのイメージング法が高い空間的解像度を有する場合に好ましい。本発明の化合物（組成物）及び方法は又、Ｘ線、ＣＴ、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ及びＭＲ造影剤と組み合わせて使用してもよければ、本発明の蛍光シリコンナノ粒子イメージングプローブが又、光学イメージングと共にＣＴ、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ及びＭＲのイメージング様式を使用して検出することができる、ヨウ素、ガドリニウム原子及び放射性同位体等の成分を含有する場合もある。

（キット）
本明細書に記載の化合物（組成物）は、キットとしてパッケージ化されてもよく、このキットは場合により、種々の例示的な用途において蛍光色素又は生体適合性蛍光分子を使用するための説明書を備える場合がある。非限定的な例には、例えば、粉末又は凍結乾燥形態の化合物（組成物）、及びｉｎ ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ ｖｉｔｒｏの用途のための再構成、用量情報及び保存情報を含めた使取扱説明書を含むキットが含まれる。キットは場合により、直ぐに使用可能か、又は投与に当たり溶液を更に混合することが必要な液体形態の化合物（組成物）の容器を含む場合がある。ｉｎ ｖｉｖｏの用途の場合、本キットは、特定用途に好適な用量及び形態（例えば、バイアル中の液体、局所用クリーム等）で化合物（組成物）を含む場合がある。

本キットは、対象への単位用量の投与に役立つ任意の構成要素（例えば、再構成用の粉末形態のバイアル、注射用シリンジ、専用の静脈内送達システム、吸入器等）を含んでもよい。本キットは、滅菌性を維持しつつ皮下注射針で単回又は複数回穿刺するのに好適なシール（例えば、クリンプオンセプタムシール蓋）を備えた容器内に供給される場合がある。このような容器は、単回又は複数回の対象用量を含有する場合がある。更に、単位用量キットは、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏにおける化合物（組成物）の検出に役立つ専用の構成要素（例えば、特殊な内視鏡、光フィルター）を含んでもよい。本キットは又、化合物（組成物）の調製及び投与に関する説明書を含む場合もある。本キットは、１名の対象に対する単回使用の単位用量、特定の対象に対する複数回使用の単位用量として製造される場合もあれば；或いは、本キットは、複数対象への投与に好適な多用量（「バルクパッケージ」）を含む場合もある。本キットの構成要素は、ボール箱、ブリスターパック、ボトル、チューブ等に集約される場合がある。

特に定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様又は同等の方法及び材料を本発明の実施又は試験において使用することができるが、好適な方法及び材料を以下に記載する。本明細書で言及する全ての刊行物、特許出願、特許及びその他の参考文献は、全体が参考として本明細書で援用される。更に、本材料、方法及び実施例は、単に例示を目的としたものであり、限定を目的としたものではない。

以下の非限定的な実施例は、ニコチン酸及びピコリン酸誘導近赤外線蛍光団の合成を示す。本発明の化合物の調製で使用される場合がある代表的な材料及び方法を、以下に詳述する。全ての化学薬品及び溶媒（試薬等級）は、特に精製することなく記載の入手元より供給された状態で使用した。

通常使用する分析及び分取ＨＰＬＣ法は、以下の通りである。
Ａカラム：Ａｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂａｘ ８０Å、Ｅｘｔｅｎｄ Ｃ１８、４．６×２５０ｍｍ（５μｍ）。移動相：アセトニトリル及び２５ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム。
Ｂカラム：Ｖａｒｉａｎ Ｄｙｎａｍａｘ、１００Å、Ｃ１８、４１．４×２５０ｍｍ。移動相：アセトニトリル及び２５ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム。
Ｃカラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ、３００Å、Ｃ１８。移動相：アセトニトリル及び２５ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム。

（実施例１）
実施例１の合成

第Ａ部：６−ヒドラジノ−１，３−ナフタレンジスルホン酸塩（Ｉ）

６−アミノ−１，３−ナフタレンジスルホン酸２ナトリウム塩（１０ｇ、２９ｍｍｏｌ）（ＴＣＩ）を水３０ｍＬに溶解し、水５０ｍＬ及び濃塩酸１５ｍＬに添加した。スラリーを氷アセトンバス中で０℃未満に冷却し、亜硝酸ナトリウム（２．２ｇ、３２ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）を冷水４０ｍＬ中で１０分間かけて滴下した。塩化スズ（１１ｇ、５８ｍｍｏｌ）（Ａｌｄｒｉｃｈ）を水３０ｍＬ及び濃塩酸６ｍＬ中に溶解し、０℃に冷却し、１０分間かけて反応混合物に添加した。得られた溶液を攪拌し、３時間かけて室温にまで戻し、透明な茶色の溶液を得た。ロータリーエバポレーターにより溶液の容量を減少させ、イソプロパノールを添加することにより生成物を沈殿させた。生成物（Ｉ）を濾過し、イソプロパノールで洗浄し、真空乾燥させた。
第Ｂ部：２，３，３−トリメチルベンズインドール−５，７−ジスルホン酸塩（ＩＩ）

６−ヒドラジノ−１，３−ナフタレンジスルホン酸（１０ｇ、２５ｍｍｏｌ）、イソプロピルメチルケトン（１２ｇ、１４０ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）及び酢酸カリウム（６ｇ、６１ｍｍｏｌ）を７５ｍＬの氷酢酸中で混合し、２２時間かけて１４５℃に加熱した。溶液を冷却し、ロータリーエバポレーターにより酢酸を除去した。残留物をメタノールに溶解し、濾過した。次に、生成物（ＩＩ）をメタノール濾液からイソプロパノールを使用して沈殿させ、濾過し、イソプロパノール及びエーテルで洗浄し、真空乾燥させた。
第Ｃ部：２，３，３−トリメチル−１−（３−スルホナトプロピル）ベンズインドリニウム−５，７−ジスルホン酸塩（ＩＩＩ）

２，３，３−トリメチルベンズインドール−６，８−ジスルホン酸塩（２．２ｇ、５ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ ５０ｍＬに溶解し、透明なオレンジ色の溶液を得た。１，３−プロパンスルトン（２．８ｇ、２３ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加し、溶液を１５時間密封試験管内で１４５℃に加熱し、暗紫色に変色させた。溶液を冷却し、１５０ｍＬの２−プロパノール中に注ぎ込んだ。混合物を遠心分離し、溶媒を傾瀉して除去した。固体生成物をフィルター上において２−プロパノール各５０ｍＬで３回、次にエーテル５０ｍＬで洗浄し、真空乾燥させ、暗紫色の固体２．５ｇを得た（９０％）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ ｍ／ｅ Ｃ_１８Ｈ_２２ＮＯ_９Ｓ_３ ^＋についての計算値、４９２．０５［Ｍ］^＋、実測値４９２．０５。
第Ｄ部：化合物ＩＶの調製

還流コンデンサーを装着した１００ｍＬ容量の丸底フラスコに２，３，３−トリメチル−１−（３−スルホナトプロピル）ベンズインドリニウム−５，７−ジスルホン酸塩（５６５ｍｇ、１ｍｍｏｌ）、２−（３−ヒドロキシカルボニル−６−ピリジル）−マロンジアルデヒド（９８ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）及び酢酸ナトリウム（５８７ｍｇ、７．１ｍｍｏｌ）を添加した。無水酢酸（１０ｍＬ）及び酢酸（１０ｍＬ）をフラスコに添加し、混合物を８時間還流下に加熱し、室温に冷却し、酢酸エチル２５ｍＬを添加した。暗青色の染料の沈殿を濾取し、水２０ｍＬに溶解し、分取逆相ＨＰＬＣで精製することにより、粉末として化合物ＩＶを得た。収量２８５ｍｇ、５０％。ＭＡＬＤＩ ＭＳ：予測値：１１３９．０９、実測値：１１３９．６７３２。
第Ｅ部：実施例１の調製
化合物ＩＶ（１１．４ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ ５００μＬ中でジスクシンイミジルジカーボネート（ＤＳＣ、５ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、２ｍｇ、０．０１６ｍｍｏｌ）と混合し、７０℃に加熱した。３０分後、冷酢酸エチル（５００μＬ）を反応混合物に添加し、生成物を析出させ、これを濾過し、真空乾燥させ、４℃に保存した。

（実施例２）
実施例２の合成

第Ａ部：化合物Ｖの調製

化合物Ｖは、無水酢酸６ｍＬ及び酢酸６ｍＬ中に混合したカリウム２，３，３−トリメチル−１−エチル−ベンズインドリニウム−５，７−ジスルホン酸塩（１８４ｍｇ、０．４２３ｍｍｏｌ）、２−（３−ヒドロキシカルボニル−６−ピリジル）−マロンジアルデヒド（４０ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）及び酢酸ナトリウム（３００ｍｇ、３．６６ｍｍｏｌ）から調製した。１６時間かけて１２５℃にて加熱した後、生成物を酢酸エチルから沈殿させ、逆相ＨＰＬＣで精製した。ＨＰＬＣ画分を急速に真空乾燥させた後、粉末形態の生成物を得た。Ｍ^＋についてのＭＡＬＤＩ．ｍ／ｚ計算値（実測値）：９５２．０５（９５２．１６）。収量１４０ｍｇ、７０％。
第Ｂ部：実施例２の調製
化合物Ｖの１等量を、ＤＭＦ ０．５ｍＬ中のジスクシンイミジルジカーボネート（ＤＳＣ）２等量及びＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）１等量と混合し、７０℃に加熱した。３０分間内に反応を終了させ;酢酸エチルを添加することによりＤＭＦ溶液から所望の生成物を沈殿させ、濾過し、真空乾燥させ、４℃に保存した。

（実施例３）
実施例３の合成

第Ａ部：化合物ＶＩの調製

化合物ＶＩは、無水酢酸６ｍＬ及び酢酸６ｍＬ中に混合した２，３，３−トリメチル−１−（３−スルホナトプロピル）−３Ｈ−ベンズインドリニウム−５，７−ジスルホン酸塩（１０１ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）、２−（２−ヒドロキシカルボニル−６−ピリジル）−マロンジアルデヒド（１７．４ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）及び酢酸ナトリウム（８８ｍｇ、１．０７ｍｍｏｌ）から調製した。４時間１２５℃にて加熱した後、生成物を酢酸エチルから沈殿させ、逆相ＨＰＬＣで精製した。ＨＰＬＣ画分を急速に真空乾燥させた後、粉末形態で生成物を得た。（Ｍ＋１）^＋についてのＭＡＬＤＩ．ｍ／ｚ計算値（実測値）：１１４０．３３（１１４０．１３）。収量６７ｍｇ、６５％。
第Ｂ部：実施例３の調製
化合物ＶＩの１等量を、ＤＭＦ ０．５ｍＬ中のジスクシンイミジルジカーボネート（ＤＳＣ）の２等量及びＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）の１等量と混合し、７０℃に加熱した。反応の進行はＨＰＬＣで監視した。３０分間内に反応を終了させた後、酢酸エチルを添加することによりＤＭＦ溶液から所望の生成物を沈殿させ、濾過し、真空乾燥させ、４℃に保存した。

（実施例４）
実施例４の合成

実施例４は、無水酢酸６ｍＬ及び酢酸６ｍＬ中に混合した２，３，３−トリメチル−１−（エチル）−３Ｈ−ベンズインドリニウム−５，７−ジスルホン酸塩（０．１８ｍｍｏｌ）、２−（２−ヒドロキシカルボニル−６−ピリジル）−マロンジアルデヒド（０．０９ｍｍｏｌ）及び酢酸ナトリウム（８８ｍｇ、１．０７ｍｍｏｌ）から調製した。１２５℃にて４時間加熱した後、生成物を酢酸エチルから沈殿させ、逆相ＨＰＬＣで精製し、ＨＰＬＣ画分を急速に真空乾燥させた後、粉末形態で得た。

（実施例５）
実施例５の合成

２，３，３−トリメチル−１−（３−スルホナトプロピル）−インドリニウム−５−スルホン酸塩（１１５ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）、２−（３−ヒドロキシカルボニル−６−ピリジル）−マロンジアルデヒド（２７ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）及び酢酸ナトリウム（８０ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）を無水酢酸５ｍＬ及び酢酸５ｍＬ中で混合した。１２５℃にて２時間加熱した後、反応混合物を冷却し、酢酸エチルから生成物を沈殿させ、その後逆相ＨＰＬＣで精製した。ＨＰＬＣ画分を急速に真空乾燥させた後、粉末形態で生成物を得た。収量８７ｍｇ、７０％。最大吸光（水）：６３５ｎｍ；最大発光（水）６５３ｎｍ。

（実施例６）
実施例６の合成

２−メチル−１−（３−スルホナトプロピル）−ベンゾチアゾリウム内部塩（１５０ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）及び２−（３−ヒドロキシカルボニル−６−ピリジル）−マロンジアルデヒド（５２ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）を２−メトキシエタノール及びトルエンの混合物（２：１、ｖ／ｖ）に添加し、Ｄｅａｎ−Ｓｔａｒｋコンデンサーを接続して１５０℃にて還流下に加熱した。４時間後、加熱を停止し、冷却して、溶媒をロータリーエバポレーターで除去した。濃縮した青色の染料を分取用ＨＰＬＣで精製した。ＨＰＬＣ画分を急速に真空乾燥させた後、粉末形態で生成物を得た。収量９５ｍｇ、５０％。最大吸光（水）：６４３ｎｍ；最大発光（水）６６３ｎｍ。

（実施例７）
実施例７の合成

化合物ＩＶのＮＨＳＥ １０ｍｇを乾燥ＤＭＦ １００μＬに溶解し、これに乾燥ＤＭＳＯ ２０μＬ中の３−アジドプロピルアミン（５ｍｇ）の溶液を添加し、混合物を室温にて１時間回転させた。エーテル１ｍＬを反応混合物に添加し、１０分間遠心分離した。上澄み溶液を廃棄し、残留物を５分間で急速に真空乾燥させ、水中に再懸濁し、ＲＰＣ１８ ｓｅｍｉ−ｐｒｅｐカラム上で精製した。生成物（実施例７）に対応する画分を収集し、急速に真空乾燥させ、７．２ｍｇ（６０％）を得た。これをＭＡＬＤＩで特性評価した。計算値：１２２２．３４、実測値：１２２２．５４。

（実施例８）
実施例８の合成

化合物ＩＶのＮＨＳＥ １０ｍｇを乾燥ＤＭＦ １００μＬに溶解し、これに乾燥ＤＭＳＯ１０μＬ中の３−プロパルギルアミン（５ｍｇ）の溶液を添加し、混合物を室温にて１時間回転させた。エーテル１ｍＬを反応混合物に添加し、１０分間遠心分離した。上澄み溶液を廃棄し、残留物を５分間で急速に真空乾燥させ、水中に再懸濁し、ＲＰＣ１８ ｓｅｍｉ−ｐｒｅｐカラム上で精製した。生成物（実施例８）に対応する画分を収集し、急速に真空乾燥させ、６ｍｇ（５２％）を得た。これをＭＡＬＤＩで特性評価した。計算値：１１７７．３２、実測値：１１７７．２１。

（実施例９）
実施例９の合成

化合物ＩＶのＮＨＳＥ １７ｍｇを乾燥ＤＭＦ ２５０μＬに溶解し、これに乾燥ＤＭＳＯ１０μＬ及びトリエチルアミン４μＬ中の塩酸２−（２−アミノエチル−ジチオ）ピリジン（１１ｍｇ）の溶液を添加し、混合物を室温にて一晩回転させた。酢酸エチル１ｍＬを反応混合物に添加し、１０分間遠心分離した。上澄み溶液を廃棄し、残留物を５分間で急速に真空乾燥させ、水中に再懸濁し、ＲＰＣ１８ ｓｅｍｉ−ｐｒｅｐカラム上で精製した。生成物（実施例９）に対応する画分を収集し、急速に真空乾燥させ、１０ｍｇ（６５％）を得た。これをＭＡＬＤＩで特性評価した。計算値：１３０８．５２、実測値：１３０８．５４。

（実施例１０）
細胞標識
マウス脾細胞を単細胞懸濁液として調製し、脾細胞調製物中のＴ細胞のサブ集団を、Ｂ細胞とマクロファージを除去するカラムを通過させることにより濃縮した（Ｒ＆Ｄキット、マウスＴ細胞濃縮カラム、ＭＴＣＣ５００）。Ｔ細胞を遠心分離して１０^７個の細胞ペレットを作成した。上澄みを細胞ペレットから除去し、１００μＬの実施例１の化合物の１０ｍｇ／ｍＬの溶液を添加した。細胞を室温にて５分間インキュベートした後、２回遠心分離し、生理学的緩衝剤中に再懸濁し、未結合の実施例１を洗浄除去した。細胞は蛍光顕微鏡検査により試験した。

（実施例１１）
細胞標識及びｉｎ ｖｉｖｏイメージング
マウス４Ｔ１乳癌細胞を遠心分離して１０^７個の細胞ペレットを作成した。上澄みを細胞ペレットから除去し、１００μＬの実施例１の化合物の１０ｍｇ／ｍＬの溶液を添加した。細胞を室温にて５分間インキュベートし、その後２回遠心分離し、生理学的緩衝剤中に再懸濁し、未結合の実施例１を洗浄除去した。細胞は蛍光顕微鏡検査により試験した。細胞を５×１０^５個／匹にてマウスに静脈注射し、注射直後及び注射後２４時間に生存マウスを蛍光分子断層撮影によりイメージングした。４Ｔ１細胞は主に肺に転移するため、肺の蛍光を定量化する。

（実施例１２）
実施例１の溶液をナノ粒子のアミン提示表面に化学結合し、ｉｎ ｖｉｖｏ光学イメージングのための生体適合性蛍光分子を得た。腫瘍細胞系統ＨＴ−２９（ヒト結腸癌／ＨＴＢ−３８）をＡＴＣＣ（米国バージニア州マナッサス）から入手した。ＨＴ−２９細胞は５％ＣＯ２含有湿潤雰囲気下の３７℃にて１０％ ＦＢＳ添加ＭｃＣｏｙ中で生育させた。指数生育細胞をトリプシン処理し、３×１０^７個／ｍＬの細胞密度でＨａｎｋ’ｓＢａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ溶液中に再懸濁した。６〜８週齢の雌ＮＵ／ＮＵマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ［米国マサチューセッツ州ウィルミントン］）に対し、第１乳房脂肪パッド内に両側性に３×１０^６ ＨＴ−２９細胞を皮下注射した。１週間後、腫瘍が約３０ｍｍ^３となった時点で、マウスに蛍光分子を静脈注射（１×ＰＢＳ １５０μＬ中）し、蛍光リアクタンスイメージング（ＦＲＩ、Ｋｏｄａｋ ２０００ＭＭ）装置上で２４時間後にイメージングした。結果を図１に示す。

以上において本発明を特にその好ましい実施形態について言及しながら提示及び説明してきたが、添付の特許請求の範囲により包含される本発明の適用範囲を逸脱することなく、形態及び詳細の種々の変化が行われる場合があることは、当業者により理解されるであろう。

図１は、蛍光リアクタンスイメージング（ＦＲＩ、Ｋｏｄａｋ ２０００ＭＭ）装置を使用して得た、２４時間後の雌ＮＵ／ＮＵマウス（６〜８週齢）の腫瘍内における本発明の化合物の蛍光画像である。

Claims (23)

1. 以下の化学式（２）の化合物であって：
   式中、
   Ｘが、Ｃ（ＣＨ_２Ｙ_１）（ＣＨ_２Ｙ_２）、Ｏ、Ｓ及びＳｅからなる群から独立して選択され；
   Ｙ_１及びＹ_２が、Ｈ、Ｃ_１−Ｃ_２０脂肪族基、並びにＯ、Ｎ又はＳを含むＣ_１−Ｃ_２０脂肪族基からなる群から独立して選択され；
   Ｗが、ベンゾ縮合、ナフト縮合又はピリド縮合環を表し；
   Ｒ_１が、Ｈ、（ＣＨ_２）_ｘＣＨ_３、（ＣＨ_２）_ｎＳＯ_３ ⁻及び（ＣＨ_２）_ｎＳＯ_３Ｈ（式中、ｘは０〜６から選択される整数であり、ｎは２〜６から選択される整数である）からなる群から選択され；
   Ｒ_４が、Ｈ、（ＣＨ_２）_ｘＣＨ_３、（ＣＨ_２）_ｎＳＯ_３ ⁻及び（ＣＨ_２）_ｎＳＯ_３Ｈ（式中、ｘは０〜６から選択される整数であり、ｎは２〜６から選択される整数である）からなる群から選択され；
   Ｒ_２及びＲ_３が、Ｈ、カルボン酸塩、カルボン酸、カルボン酸エステル、アミン、アミド、スルホンアミド、ヒドロキシル、アルコキシル、スルホン酸及びスルホネートからなる群から独立して選択され；
   Ｑが、（ｉ）カルボン酸により置換されたピリジン、カルボン酸エステルにより置換されたピリジン、または、カルボン酸塩により置換されたピリジンから選択されるカルボキシル置換ピリジン、（ｉｉ）ハロゲン化−Ｃ（Ｏ）−および−Ｃ（Ｏ）Ｒ ^＊＊ から選択されるカルボニル置換ピリジンであって、ここで、Ｒ ^＊＊ は飽和の直鎖炭化水素、分枝鎖炭化水素または環状炭化水素であるか、または（ｉｉｉ）以下：
   もしくは
   のいずれか１つである、
   化合物；或いはその塩。
2. Ｙ_１及びＹ_２が、Ｈ及びＣ_１−Ｃ_２０脂肪族基からなる群から独立して選択される、請求項１に記載の化合物。
3. Ｑが、カルボキシル置換ピリジン、イソニコチン酸、ニコチン酸及びピコリン酸からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の化合物。
4. Ｑが、以下からなる群から選択される構造式で表される：
   、
   請求項３に記載の化合物。
5. Ｑがカルボニル置換ピリジンである、請求項１又は２に記載の化合物。
6. 前記Ｒ_１〜Ｒ_３の少なくとも１つが、スルホン酸又はスルホネートである、請求項１又は２に記載の化合物。
7. Ｒ_１及びＲ_４が独立して、−Ｈ、（ＣＨ_２）_ｎＳＯ_３ ⁻又は（ＣＨ_２）_ｎＳＯ_３Ｈである、請求項１又は２に記載の化合物。
8. 以下の化学式の何れかを有する：
   、請求項１又は２に記載の化合物。
9. 以下の化学式（２）により表される蛍光化合物または該蛍光化合物の塩に共有結合する１つ以上の生体分子を含む生体適合性蛍光分子であって、該蛍光化合物は：
   で示され、式中、
   Ｘが、Ｃ（ＣＨ_２Ｙ_１）（ＣＨ_２Ｙ_２）、Ｏ、Ｓ及びＳｅからなる群から独立して選択され；
   Ｙ_１及びＹ_２が、Ｈ、Ｃ_１−Ｃ_２０脂肪族基、並びにＯ、Ｎ又はＳを含むＣ_１−Ｃ_２０脂肪族基からなる群から独立して選択され；
   Ｗが、ベンゾ縮合、ナフト縮合又はピリド縮合環を表し；
   Ｒ_１が、Ｈ、（ＣＨ_２）_ｘＣＨ_３、（ＣＨ_２）_ｎＳＯ_３ ⁻及び（ＣＨ_２）_ｎＳＯ_３Ｈ（式中、ｘは０〜６から選択される整数であり、ｎは２〜６から選択される整数である）からなる群から選択され；
   Ｒ_４が、Ｈ、（ＣＨ_２）_ｘＣＨ_３、（ＣＨ_２）_ｎＳＯ_３ ⁻及び（ＣＨ_２）_ｎＳＯ_３Ｈ（式中、ｘは０〜６から選択される整数であり、ｎは２〜６から選択される整数である）からなる群から選択され；
   Ｒ_２及びＲ_３が、Ｈ、カルボン酸塩、カルボン酸、カルボン酸エステル、アミン、アミド、スルホンアミド、ヒドロキシル、アルコキシル、スルホン酸及びスルホネートからなる群から独立して選択され；そして
   Ｑが、（ｉ）カルボン酸により置換されたピリジン、カルボン酸エステルにより置換されたピリジン、または、カルボン酸塩により置換されたピリジンから選択されるカルボキシル置換ピリジン、（ｉｉ）ハロゲン化−Ｃ（Ｏ）−および−Ｃ（Ｏ）Ｒ ^＊＊ から選択されるカルボニル置換ピリジンであって、ここで、Ｒ ^＊＊ は飽和の直鎖炭化水素、分枝鎖炭化水素または環状炭化水素であるか、または（ｉｉｉ）以下：
   もしくは
   のいずれか１つであり、
   該生体分子は、Ｑと反応して該生体適合性蛍光分子を生成することを介して、該蛍光化合物に対して共有結合される、
   生体適合性蛍光分子。
10. Ｙ_１及びＹ_２が、Ｈ及びＣ_１−Ｃ_２０脂肪族基からなる群から独立して選択される、請求項９に記載の生体適合性蛍光分子。
11. 前記化合物が
    （ａ）約５００ｎｍ〜約９００ｎｍ；または
    （ｂ）約６００ｎｍ〜約８００ｎｍ
    の吸光及び発光最大値を有する、請求項９又は１０に記載の生体適合性蛍光分子。
12. （ａ）前記生体適合性蛍光分子が標的相互作用後に活性化されるか、
    （ｂ）前記生体適合性蛍光分子が標的への高い結合親和性を有するか、或いは、
    （ｃ）前記生体分子が標識細胞である、
    請求項９又は１０に記載の生体適合性蛍光分子
13. ｉｎ ｖｉｖｏ光学イメージングにおける使用のための組成物あって、該組成物は、以下の化学式（２）により表される蛍光化合物または該蛍光化合物の塩に共有結合した１つ以上の生体分子を含み、該蛍光化合物は：
    で示され、式中、
    Ｘが、Ｃ（ＣＨ_２Ｙ_１）（ＣＨ_２Ｙ_２）、Ｏ、Ｓ及びＳｅからなる群から独立して選択され；
    Ｙ_１及びＹ_２が、Ｈ、Ｃ_１−Ｃ_２０脂肪族基、並びにＮ、Ｓ又はＯを含むＣ_１−Ｃ_２０脂肪族基からなる群から独立して選択され；
    Ｗが、ベンゾ縮合、ナフト縮合又はピリド縮合環を表し；
    Ｒ_１が、Ｈ、（ＣＨ_２）_ｘＣＨ_３、（ＣＨ_２）_ｎＳＯ_３ ⁻及び（ＣＨ_２）_ｎＳＯ_３Ｈ（式中、ｘは０〜６から選択される整数であり、ｎは２〜６から選択される整数である）からなる群から選択され；
    Ｒ_４が、Ｈ、（ＣＨ_２）_ｘＣＨ_３、（ＣＨ_２）_ｎＳＯ_３ ⁻及び（ＣＨ_２）_ｎＳＯ_３Ｈ（式中、ｘは０〜６から選択される整数であり、ｎは２〜６から選択される整数である）からなる群から選択され；
    Ｒ_２及びＲ_３が、Ｈ、カルボン酸塩、カルボン酸、カルボン酸エステル、アミン、アミド、スルホンアミド、ヒドロキシル、アルコキシル、スルホン酸及びスルホネートからなる群から独立して選択され；
    Ｑが、（ｉ）カルボン酸により置換されたピリジン、カルボン酸エステルにより置換されたピリジン、または、カルボン酸塩により置換されたピリジンから選択されるカルボキシル置換ピリジン、（ｉｉ）ハロゲン化−Ｃ（Ｏ）−および−Ｃ（Ｏ）Ｒ ^＊＊ から選択されるカルボニル置換ピリジンであって、ここで、Ｒ ^＊＊ は飽和の直鎖炭化水素、分枝鎖炭化水素または環状炭化水素であるか、または（ｉｉｉ）以下：
    もしくは
    のいずれか１つであり、
    該生体分子は、Ｑと反応して該生体適合性蛍光分子を生成することを介して、該蛍光化合物に対して共有結合され、
    該組成物は、対象に投与され、該組成物が該対象内に拡散するか、生物学的標的と接触又は相互作用するための時間が設けられることを特徴とし、そしてさらに組成物は、該組成物により吸収可能な波長の光を該対象に照射することで検出される光学シグナルを発光することを特徴とする、組成物。
14. 前記式（２）により表される化合物において、Ｙ_１及びＹ_２が、Ｈ及びＣ_１−Ｃ_２０脂肪族基からなる群から独立して選択される、請求項１３に記載の組成物。
15. 前記組成物により発光される前記シグナルが画像の構築に使用され、ここで、前記組成物により発光される光学シグナルの検出が、所定の間隔で繰り返され、それにより、前記対象における該組成物の該発光シグナルを経時的に評価することができ、ここで、該対象が動物又はヒトであり、該組成物は、シグナル特性が区別可能な２以上の蛍光分子と組み合わせて投与されることを特徴とする、請求項１３又は１４に記載の組成物。
16. 前記照射及び検出が、内視鏡、カテーテル、断層撮影システム、ハンドヘルド型光学イメージングシステム、手術用ゴーグル又は術中顕微鏡を使用して実施される、請求項１３又は１４に記載の組成物。
17. 前記組成物により発光されるシグナルの有無又はレベルが疾患状態を示す、またはｉｎ
    ｖｉｖｏ光学イメージングにおける前記組成物の使用が、疾患の検出及び監視のためである、請求項１３又は１４に記載の組成物。
18. 前記疾患が、癌、心臓血管疾患、神経変性疾患、免疫学的疾患、自己免疫疾患、呼吸器疾患、代謝疾患、遺伝的疾患、感染性疾患、骨疾患及び環境疾患からなる群から選択される、請求項１７に記載の組成物。
19. 前記組成物の前記対象への投与の前に、式（２）により表される化合物が、前記細胞を標識するために細胞と混合され、そして得られた該標識細胞が該対象に投与されるか；または
    該組成物により発光される前記シグナルが、細胞内輸送及び局在化を監視するため、又は細胞療法を評価するために使用される、請求項１３又は１４に記載の組成物。
20. Ｑが、−ＣＯ_２Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−ハライド、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ベンゾトリアゾリル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｎ−スクシンイミジル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−テトラフルオロフェニル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ペンタフルオロフェニル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−イミダゾリル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ｐ−ニトロフェニル、またはーＣ（＝Ｏ）Ｒ^＊＊で置換されたピリジンであり、Ｒ^＊＊は、飽和直鎖炭化水素、分岐炭化水素または環状炭化水素である、請求項１に記載の化合物、請求項９に記載の生体適合性分子、または請求項１３に記載の組成物。
21. Ｑが、
    で置換されたピリジンである、請求項１に記載の化合物、請求項９に記載の生体適合性分子、または請求項１３に記載の組成物。
22. Ｒ_２およびＲ_３が、独立してＨおよび−ＳＯ_３Ｈから選択される、請求項１に記載の化合物、請求項９に記載の生体適合性分子、または請求項１３に記載の組成物。
23. 前記（２）の化合物は、必要に応じて塩の形態である、以下：
    のうちの一つである、請求項１に記載の化合物、請求項９に記載の生体適合性分子、または請求項１３に記載の組成物。