CZ304094B6 - Vyuzití polymethiniových solí jako mitochondriálních sond - Google Patents
Vyuzití polymethiniových solí jako mitochondriálních sond Download PDFInfo
- Publication number
- CZ304094B6 CZ304094B6 CZ20110782A CZ2011782A CZ304094B6 CZ 304094 B6 CZ304094 B6 CZ 304094B6 CZ 20110782 A CZ20110782 A CZ 20110782A CZ 2011782 A CZ2011782 A CZ 2011782A CZ 304094 B6 CZ304094 B6 CZ 304094B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- salts
- mitochondria
- mitochondrial
- cells
- group
- Prior art date
Links
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 title claims abstract description 43
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 18
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 title claims description 18
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 claims abstract description 49
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 48
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims abstract description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 13
- 125000001072 heteroaryl group Chemical group 0.000 claims abstract description 7
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims abstract description 5
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims abstract description 3
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 claims description 5
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 4
- IOJUPLGTWVMSFF-UHFFFAOYSA-N benzothiazole Chemical compound C1=CC=C2SC=NC2=C1 IOJUPLGTWVMSFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- -1 iodine , hydroxy- Chemical class 0.000 claims description 4
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical group I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- AIGNCQCMONAWOL-UHFFFAOYSA-N 1,3-benzoselenazole Chemical compound C1=CC=C2[se]C=NC2=C1 AIGNCQCMONAWOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- BCMCBBGGLRIHSE-UHFFFAOYSA-N 1,3-benzoxazole Chemical compound C1=CC=C2OC=NC2=C1 BCMCBBGGLRIHSE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- HYZJCKYKOHLVJF-UHFFFAOYSA-N 1H-benzimidazole Chemical compound C1=CC=C2NC=NC2=C1 HYZJCKYKOHLVJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- HCCNHYWZYYIOFM-UHFFFAOYSA-N 3h-benzo[e]benzimidazole Chemical compound C1=CC=C2C(N=CN3)=C3C=CC2=C1 HCCNHYWZYYIOFM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000000339 4-pyridyl group Chemical group N1=C([H])C([H])=C([*])C([H])=C1[H] 0.000 claims description 2
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical group [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- QMMFVYPAHWMCMS-UHFFFAOYSA-N Dimethyl sulfide Chemical group CSC QMMFVYPAHWMCMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000000066 S-methyl group Chemical group [H]C([H])([H])S* 0.000 claims description 2
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical group [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- AMTXUWGBSGZXCJ-UHFFFAOYSA-N benzo[e][1,3]benzoselenazole Chemical compound C1=CC=C2C(N=C[se]3)=C3C=CC2=C1 AMTXUWGBSGZXCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- KXNQKOAQSGJCQU-UHFFFAOYSA-N benzo[e][1,3]benzothiazole Chemical compound C1=CC=C2C(N=CS3)=C3C=CC2=C1 KXNQKOAQSGJCQU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- WMUIZUWOEIQJEH-UHFFFAOYSA-N benzo[e][1,3]benzoxazole Chemical compound C1=CC=C2C(N=CO3)=C3C=CC2=C1 WMUIZUWOEIQJEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 150000001805 chlorine compounds Chemical group 0.000 claims description 2
- XLJMAIOERFSOGZ-UHFFFAOYSA-M cyanate Chemical compound [O-]C#N XLJMAIOERFSOGZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 claims description 2
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims description 2
- 150000002825 nitriles Chemical class 0.000 claims description 2
- LHKVDVFVJMYULK-UHFFFAOYSA-N nitrosylazide Chemical compound [N-]=[N+]=NN=O LHKVDVFVJMYULK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 2
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 claims description 2
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 claims description 2
- 125000002023 trifluoromethyl group Chemical group FC(F)(F)* 0.000 claims description 2
- GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N trimethylamine Chemical compound CN(C)C GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- KZBUYRJDOAKODT-UHFFFAOYSA-N Chlorine Chemical group ClCl KZBUYRJDOAKODT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 39
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 37
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 18
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 11
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 11
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 8
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 6
- 230000025608 mitochondrion localization Effects 0.000 description 6
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 4
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000000921 elemental analysis Methods 0.000 description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 230000030570 cellular localization Effects 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 3
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- RYYVVCNGQOENKM-UHFFFAOYSA-N 2-pyridin-4-ylpropanedial Chemical compound O=CC(C=O)C1=CC=NC=C1 RYYVVCNGQOENKM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N Nitric oxide Chemical compound O=[N] MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091093105 Nuclear DNA Proteins 0.000 description 2
- 241001471187 Patu Species 0.000 description 2
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- INQOMBQAUSQDDS-UHFFFAOYSA-N iodomethane Chemical compound IC INQOMBQAUSQDDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 210000001700 mitochondrial membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000008811 mitochondrial respiratory chain Effects 0.000 description 2
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 2
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 2
- 230000010627 oxidative phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 2
- 239000003642 reactive oxygen metabolite Substances 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- MYFKCSWTHQYGJU-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-3-propyl-2h-1,3-benzothiazole Chemical compound C1=CC=C2N(CCC)C(C)SC2=C1 MYFKCSWTHQYGJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 206010052747 Adenocarcinoma pancreas Diseases 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000010833 Chronic myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 208000028698 Cognitive impairment Diseases 0.000 description 1
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 description 1
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WSMYVTOQOOLQHP-UHFFFAOYSA-N Malondialdehyde Chemical compound O=CCC=O WSMYVTOQOOLQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N Methyl tert-butyl ether Chemical compound COC(C)(C)C BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000033761 Myelogenous Chronic BCR-ABL Positive Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 206010034972 Photosensitivity reaction Diseases 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- FZWLAAWBMGSTSO-UHFFFAOYSA-N Thiazole Chemical compound C1=CSC=N1 FZWLAAWBMGSTSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- GKMBRSQQKZUCGD-UHFFFAOYSA-M [9-[4-(chloromethyl)phenyl]-6-(dimethylamino)xanthen-3-ylidene]-dimethylazanium;bromide Chemical compound [Br-].C=12C=CC(=[N+](C)C)C=C2OC2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=C(CCl)C=C1 GKMBRSQQKZUCGD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 1
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000008045 co-localization Effects 0.000 description 1
- 208000010877 cognitive disease Diseases 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 229940125782 compound 2 Drugs 0.000 description 1
- 229940126214 compound 3 Drugs 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000001085 differential centrifugation Methods 0.000 description 1
- ZGSPNIOCEDOHGS-UHFFFAOYSA-L disodium [3-[2,3-di(octadeca-9,12-dienoyloxy)propoxy-oxidophosphoryl]oxy-2-hydroxypropyl] 2,3-di(octadeca-9,12-dienoyloxy)propyl phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].CCCCCC=CCC=CCCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCCC=CCC=CCCCCC)COP([O-])(=O)OCC(O)COP([O-])(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCCC=CCC=CCCCCC)COC(=O)CCCCCCCC=CCC=CCCCCC ZGSPNIOCEDOHGS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000000695 excitation spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000003269 fluorescent indicator Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 1
- 229940042795 hydrazides for tuberculosis treatment Drugs 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 210000005061 intracellular organelle Anatomy 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 239000002932 luster Substances 0.000 description 1
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 1
- 229940118019 malondialdehyde Drugs 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 1
- DZVCFNFOPIZQKX-LTHRDKTGSA-M merocyanine Chemical compound [Na+].O=C1N(CCCC)C(=O)N(CCCC)C(=O)C1=C\C=C\C=C/1N(CCCS([O-])(=O)=O)C2=CC=CC=C2O\1 DZVCFNFOPIZQKX-LTHRDKTGSA-M 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- FNEZBBILNYNQGC-UHFFFAOYSA-N methyl 2-(3,6-diamino-9h-xanthen-9-yl)benzoate Chemical compound COC(=O)C1=CC=CC=C1C1C2=CC=C(N)C=C2OC2=CC(N)=CC=C21 FNEZBBILNYNQGC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000034636 mitochondrial DNA repair Effects 0.000 description 1
- 230000008437 mitochondrial biogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000004898 mitochondrial function Effects 0.000 description 1
- 230000030544 mitochondrion distribution Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008789 oxidative DNA damage Effects 0.000 description 1
- 230000004792 oxidative damage Effects 0.000 description 1
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 1
- 201000002094 pancreatic adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000007310 pathophysiology Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 208000007578 phototoxic dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000018 phototoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000019254 respiratory burst Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- MYFATKRONKHHQL-UHFFFAOYSA-N rhodamine 123 Chemical compound [Cl-].COC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=CC(=[NH2+])C=C2OC2=CC(N)=CC=C21 MYFATKRONKHHQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000037359 steroid metabolism Effects 0.000 description 1
- 230000004960 subcellular localization Effects 0.000 description 1
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035924 thermogenesis Effects 0.000 description 1
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 230000004102 tricarboxylic acid cycle Effects 0.000 description 1
- 230000004143 urea cycle Effects 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OIHZGFWAMWHYPA-UHFFFAOYSA-N xanthylium Chemical compound C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3[O+]=C21 OIHZGFWAMWHYPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Pouzití symetrických polymethiniových solí s gama heteroarylsubstitucí obecných vzorcu I a II, kde významy substituentu jsou uvedeny v popisné cásti, pro prípravu selektivních sond pro znacení mitochondrií, a to jak v zivých i mrtvých bunkách a pro znacení izolovaných mitochondrií.
Description
Oblast techniky
Vynález se týká použití systému založených na polymethiniových solích. Tyto systémy lze využít v oblasti selektivní intracelulámí lokalizace. Systémy jsou založeny na použití strukturního motivu polymethiniových solí připravených z příslušných malondialdehydů.
Dosavadní stav techniky
Mitochondrie jsou semiautonomní dynamické, pleomorfní organely (DiMauro, S., Schon. A. E. (2003): Mitochondrial respirátory chain diseases, N. Engl. J. Med,. 348, 2656-2668), které tvoří až 40 % cytoplazmy metabolicky aktivních eukaryotických buněk. Dynamika mitochondrií je dána jejich konstantním pohybem včetně jejich neustálého dělení a fúzování, což je doprovázeno změnami ve velikosti, tvaru, počtu a hmotě mitochondrií. (Niscdi, E., Carruba, M. O. (2006): Nitric oxide and mitochondrial biogenesis. J. Cell Sci. 119, 2855-2862).
Hlavní rolí mitochondrií v buňce je produkce energie ve formě adenosintrifosfátu (ATP) prostřednictvím elektronového transportního řetězce [ETC], (Anderson, S., Bankier, A. T., Barrell, B. G., de Bruijn, Μ. H., Coulson, A. R., Drouin, J., Eperon, C. I., Nierlich, D. P., Roe, A. B., Sanger, F., Schreier, Η. P., Smith, A. J., Staden, R., Young, G. O. (1981): Sequence and organization of the human mitochondrial genome. Nátuře 290, 457-465). Kromě produkce energie hrají mitochondrie klíčovou roli v řadě dalších funkcí týkajících se zprostředkování buněčné smrti apoptózy, termogeneze, translace a transkripce mitochondriálních genů. (Leonard, J. V., Schapira, A. Η. V. (2000): Mitochondrial respirátory chain disorders I: mitochondrial DNA defects. Lancet 335, 299-304). Navíc jsou v nich lokalizovány některé metabolické procesy, jako např. beta-oxidace, citrátový cyklus, degradace aminokyselin, biosyntéza hernu, metabolismus steroidů, močovinový cyklus, (Mancuso, M., Calsolaro, V., Orsucci, D., Carlesi, C., Choub, A., Piazza, S., Siciliano, G. (2009): Mitochondria, cognitive impairment, and Alzheimeťs disease. Int J Alzheimers Dis. Jul 6; 951548), udržení buněčného redoxně-oxidačního potenciálu, homeostáze vápenatých iontů a další. (Di Lisa, F., Bernardi, P. (1998): Mitochondrial function as a determinant of recovery or death in cell response to injury. Mol Cell Biochem. 184, 379-391).
Mitochondrie jsou křižovatkou na pomezí života a smrti buňky a jejich poškození je spojeno s řadou onemocnění. To je činí slibným cílem pro vývoj léků a nových terapeutických přístupů. (Anders, M. W., Robotham, J. L., Sheu, S. S. (2006): Mitochondria: new drug targets for oxidative stress-induced diseases. Expert Opin. Drug. Metab. Toxicol. 2, 71-79). Kromě výše jmenovaných funkcí jsou mitochondrie hlavními producenty intracelulárních reaktivních kyslíkových částic, které vznikají jako vedlejší produkt oxidační fosforylace. Díky různým deficiencím v oxidační fosforylaci je sníženo zásobování buněk energií a je zvýšena produkce reaktivních kyslíkových částic, která může indukovat mutace a oxidativní poškození mitochondriální DNA. (Larsen, Β. N., Ramussen, M., Ramussen, J. L. (2005). Nuclear and mitochondrial DNA repair: similar pathways? Mitochondrion 5, 89-108). Mnoho z těchto poškození mitochondriální DNA pravděpodobně přispívá ke vzniku rakoviny, stárnutí a neurodegenerativním onemocněním (Bohr, A. V. (2002): Repair of oxidative DNA damage in nuclear and mitochondrial DNA, and some changes with aging in mammalian cells. Free Rádie. Biol. Med. 32, 804-812).
Pro studium mitochondrií jsou využívány biochemické, genetické a elektronmikroskopické přístupy. Pro studium aktivity mitochondrií v buňkách, je využíváno dvou přístupů založených na jejich značení in šitu nebo izolaci mitochondrií uvolněných z buněk. Při jejich izolaci je tkáň mechanicky rozrušena a organely jsou purifikovány pomocí gradientově nebo diferenciální centrifugace. Izolované mitochondrie se však nemusejí chovat tak, jako za fyziologických podmínek a navíc může dojít ke zničení mitochondriální sítě. Během lyže buněk dochází k uvolnění
- 1 CZ 304094 B6 buněčných komponent včetně v nich obsažených proteáz, což může vést ke zničení anebo snížené regeneraci organel. Vývoj fluorescenčních značících technik v kombinaci s mikroskopií umožnil studium komplexní struktury a funkce neporušených organel in vivo. Použitím sond je možné se vyvarovat izolaci a purifikací organel a zachovat jejich strukturu. (Jakobs, S. (2006): High resolution imaging of live mitochondria. Biochim. Biophys. Acta 1763, 561-575). Nadějná je zejména mikroskopie buněk v reálném čase, která je nepostradatelným nástrojem pro objasnění časoprostorové mitochondriální dynamiky.
Obecně vzato jsou mitochondrie obtížně pozorovatelné pomocí fázového nebo Nomarského diferenciálního interferenčního kontrastu. Z tohoto důvodu je vyvíjena snaha nalézt vitální barviva pro specifické barvení mitochondrií v živých buňkách. Vstup většiny barviv do mitochondrií je závislý na membránovém potenciálu těchto organel v intaktním stavu. Některé z pozitivně nabitých, lipofilních fluorescenčních barviv mění svou emisi v závislosti na bezprostředním okolí a mohou být proto použity pro kvalitativní nebo dokonce kvantitativní měření mitochondriálního membránového potenciálu (Plasek, J., Sigler, K. (1996): Slow fluorescent indicators of membráně potential: a survey of different approaches to probe response analysis. J. Photochem. Photobiol. B. 33, 101-124). V současnosti jsou pro značení mitochondrií využívány zejména lipofilní kationické xantyliové deriváty jako tetrametylrosamin, rhodamin 123, rhodamin 6. (Rothe, G, Emmendórffer, A, Oser, A, Roesler, J, Válet, G. (1991): Flow cytometric measurement of the respirátory burst activity of phagocytes using dihydrorhodamine 123. J. Immunol. Methods 138, 133-135). Nicméně potenciál těchto fluorescenčních barviv je značně limitován. Nevýhodami jsou jejich nízká fotostabilita, nevhodné spektrální vlastnosti a vysoká fototoxicita. Navíc dochází při fixaci mitochondrií k vymytí barviva z buněk díky ztrátě membránového potenciálu. (Poot, M., Zhang, Y. Z., Kramer, A. J., Wells, K. S., Jones, J. L., Hanzel, D. K., Lugade, A. G., Singer, L. V., Haugland, P. R. (1996): Analysis of mitochondrial morphology and function with novel fixable fluorescent stains. J. Histochem. Cytochem., 44, 1363-1372).
U látek v dokumentu US 2010/0 143 960 Al byla sledována afinita polymethiniových solí vůči proteinům a jejich využití k fluorescenčnímu značení proteinů. Použití daných látek v tomto patentu se týká fluorescenčního značení proteinů, nikoli selektivní intracelulámí lokalizace v mitochondriích. Látky se musí synteticky opracovat například do stadia hydrazidů, aminů, tedy reaktivních struktur, které jsou v dalším kroku konjugovány s příslušným proteinem. V příkladech provedení jsou uvedeny pouze přípravy symetrických a nesymetrických pentamethiniových systémů bez gama aryl substituce. V rámci studia se autoři dokumentu US 2010/0 143 960 Al nezabývali blíže látkami typu symetrických polymethiniových solí s gama aryl substitucí.
Dokument WO 2007/028 118 A se týká polymethiniových solí ke značení proteinů a jiných biomolekul sNH2 skupinu. Právě přes tuto skupinu je k dané biomolekule či proteinu připojena fluorescenční proba, která jí propůjčuje dané optické vlastnosti. Tyto proteinové konjugáty lze využít jako fluorescenční proby pro buněčné organely (jádro, mitochondrie atd.) pouze při použití proteinu vyznačujícího se selektivitou k dané buněčné organele.
Dokument US 2005/0 208 534 A se týká interakce polymethiniových solí s DNA a RNA a rozpoznávání RNA vedle DNA.
Dokument US 6 291 203 se týká nesymetrických polymethiniových solí, podstatně náročnějších a dražších vzhledem kjejich přípravě. Tyto struktury vykazují pomalejší vstup do mitochondrií a horší optické vlastnosti (emise mezi 500 až 600 nm) absorpce (400 až 500).
Dokument WO 02/26 890 se týká aplikace polymethiniových solí jako fluorescenčních markérů biomolekul. Polymethiniové sole musí být konjugovány s danou biomolekulou pomocí aktivních esterů a pak jejich případná intracelulámí lokalizace související s rozlišováním buněk je funkcí daných biomolekul, nikoli však samotných solí.
. 7 .
ACTA Medica 2005, 48, 2,64 popisuje látky, které se vážou s mitochondriemi na základě membránového potenciálu. Absorpční maxima pro DIOC6 a JC-1 leží pod 500 nm. Emisní maximum DIOC6 a JC1 jsou okolo 500 nm a 590 nm. DIOC 6 a JC-1 patří do kategorie trimethiniových solí s výše zmíněnými rozdílnými spektrálními vlastnostmi a nejsou schopné zobrazovat mitochondrie mrtvých buněk.
Podstata vynálezu
Uvedené nevýhody odstraňuje využití symetrických polymethiniových solí s gama heteroarylsubstitucí, které vykazují velmi výraznou fluorescenci a vysokou afinitu pro mitochondrie, jako mitochondriálních sond.
Jedná se o polymethiniové sole obecného vzorce I
R kde obě koncové heteroaromatické skupiny methiniového řetězce jsou totožné a tvoří je benzthiazol, benzoimidazol, benzooxazol, benzoselenazol, jejichž konkrétní struktura je charakterizována skupinou A, Β, X, Y a s jednou nebo více skupinami R na obou koncích methiniové sole, kde skupina A jsou alkyl Cl až C12-substituenty, kde skupina B je 4-pyridyl, který může být dále substituován jedním či více stejnými nebo různými substituenty vybranými ze skupiny: fluor, chlor, brom, jod, hydroxy-, trifluormethyl, Omethyl, O-ethyl, O-propyl, O-trimethylsilyl, thiol, S-methyl, S-ethyl, S-propyl, amino, Nmethyl, N-ethyl, N-propyl, N-butyl, N-dimethyl, N-diethyl, N-dipropyl, N-dibutyl, N-bocyl, nitril, nitroso, azid, kyanát, kde v případě dvojnásobně nabitých solí, skupinu B tvoří /V-alkylpyridiniová skupina, kde alkyl je Cl až CIO, trimethylamoniový nebo dimethylsulfoniový substituent, kde skupina R je vodík, kde X je síra, kde Y je chlorid, bromid, jodid a polymethiniové sole obecného vzorce II (Π),
-3CZ 304094 B6 kde obě koncové heteroaromatické skupiny methiniového řetězce jsou totožné a tvoří je naftothiazol, naftoimidazol, naftooxazol, naftoselenazol a kde skupiny A, Β, X, Y a R mají vpředu uvedený význam.
Symetrické polymethiniové sole s gama heteroarylsubstitucí obecného vzorce I a II jsou vhodné pro přípravu selektivních buněčných sond pro značení mitochondrií, a to jak v živých i mrtvých buňkách. Polymethiniové sole jsou navíc zadrženy v mitochondriích i po fixaci různými činidly (např. formaldehyd, glutaraldehyd), popř. permeabilizaci (aceton, metanol).
Polymethiniové sole obecného vzorce I a II lze použít pro přípravu sond pro značení izolovaných mitochondrií.
Zjistili jsme, že tyto sole vykazují velmi výraznou fluorescenci. In vitro studie těchto látek zaměřené na jejich intracelulámí distribuci ukázaly jejich vysokou afinitu pro mitochondrie. Jejich mitochondriální lokalizace byla nalezena pro nejrůznější strukturní motivy těchto látek. Při vstupu, polymethiniových solí do mitochondrií dochází kjejich obarvení a díky jejich vysoké fluorescenci, jsou fluorescenčně značené mitochondrie snadno pozorovatelné a detekovatelné. Pro tento typ látek toto chování nebylo dosud pozorováno. Tento jev je způsoben jejich vysokou specifitou pro kardiolipin, kterýje hojně zastoupený ve vnitřní membráně mitochondrií.
Použití nových fluorescenčních vitálních barviv pro zobrazování mitochondrií by mohlo sloužit jako neinvazivní, finančně nenáročná a funkční alternativa komerčně dostupných barviv specifických pro mitochondrie. Tato barviva pro zobrazovací techniky mitochondrií by mohla být použita při studiu aktivity, morfologie a množství mitochondrií v buňce a sledování účinku farmakologických derivátů. Tyto sondy by tak umožnily monitorování klíčové intracelulámí organely v živých systémech v reálném čase a získat tak citlivý a specifický náhled do metabolismu, funkce, fyziologie a patofyziologie mitochondrií. Polymethiniové sole, které jsou předmětem tohoto patentu, jsou založeny na kondenzaci vhodného aromatického malondialdehydu se solí příslušného heteroaromátu (Schéma 1) tak, jak je příprava popsána pro podobné systémy. (Bříza, T., Kejík, Z., Císařová, I., Králová, J., Martásek, P., Král, V. (2008): Optical sensing of sulphate by plymethinium salt receptors: Colorimetric sensor for heparin. Chemical Communication. 1901-1903). Nesymetrické polymethiniové sole lze připravit dle námi, již dříve popsaných postupů týkajících se podobných struktur (Bříza T., Kejík Z., Králová J., Martásek P., Král V. Synthesis of unsymmetric cyanine dye via merocyaníne and their interaction with DNA. Coli. Czech. Chem. Comm. (2009), 74, 1081-1090) stím rozdílem, že je pro jejich syntézu využito neutrálního merocyaninového barviva, které je finálně kondenzováno se solí příslušného heteroaromátu (Schéma 1).
Dvakrát kvarternizované symetrické nebo nesymetrické polymethiniové sole se připravují tak, že se sůl kvarternizuje na příslušném heteroatomů do druhého stupně odpovídajícím alkylačním činidlem (Schéma 1).
-4CZ 304094 B6
Schéma 1
Přehled obrázků na výkresech
Obrázek 1
Lokalizace látky 1 v mitochondriích buněk myšího karcinomu mléčné žlázy 4T1. a, fázový kontrast; b, fluorescence látky 1; c, fluorescence mitochondriální sondy MitoTracker Green™; d, překryv snímků bac znázorňující jejich shodnou lokalizaci v mitochondriích.
Obrázek 2
Lokalizace látky 1 v mitochondriích v buněčné linii lidského osteosarkomu U2OS a, fázový kontrast; b, fluorescence látky 1; c, fluorescence jaderné sondy DAPI; d, překryv snímků bac.
Obrázek 3
Lokalizace látky 1 v mitochondriích primárních kuřecích fibroblastů CEF. a, fázový kontrast; b, fluorescence látky 1; c, fluorescence mitochondriální sondy MitoTracker Green™; d, překryv snímků bac znázorňující jejich shodnou lokalizaci v mitochondriích.
Vlastnosti a způsob přípravy nově připravených látek jsou doloženy následujícími příklady, aniž by jimi byly jakkoliv omezeny.
-5CZ 304094 B6
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Příprava látky 1. Směs 2-quinaxolidinmalondialdehydu (50 mg), 2-methyl-3-propylbenzothiazolu (180 mg) a suchého n-butanolu (7 ml) byla za míchání zahřívána na 110 °C po dobu 18 h. Po ochlazení na laboratorní teplotu byla směs zfdtrována, pevný podíl promyt metanolem (3 ml) a sušen ve vakuu. Produkt byl získán ve formě zeleného kovově lesklého prášku. Výtěžek 136 mg, 81 %.
Struktura látky 1
Charakterizace: 'H-NMR: 8,65 (1H, s); 8,49 (1H, d, J = 14,1 Hz); 8,32 (1H, d, J = 14,1 Hz); 8,24 - 7,99 (7H, m); 7,82 - 7,58 (6H, m); 7,46 (1H, t, J = 7,3 Hz); 4,82 (2H, s), 4,68 (2H, s); 2,05 (4H, m); 1,20 (6H, m). 13C-NMR: 158,3; 149,0; 147,9; 141,2; 140,5; 139,1; 138,6; 129,1; 128,8; 128,5; 128,3; 127,9; 127,8; 126,9; 126,5; 125,6; 124,9; 123,8; 123,2; 119,0; 115,3; 114,1; 106,4; 48,7; 47,3; 21,5; 20,4; 11,3; 10,8.
ES-MS vypočteno: 547; nalezeno: 545 (M+-2H); HRMS nalezeno: 545,1823.
Elementární analýza: vypočteno: C 58,75 %; H 4,63 %; nalezeno: C 59,12 %; H 4,87 %.
Absorpční maxima látky 1 v různých prostředích
| Prostředí | Ámax | Smax/100 000 |
| dimetylsulfoxid | 609 | 1,06 |
| Methanol | 608 | 1,34 |
| Fosfátový pufr (pH 7,4) | 493 | 0,33 |
Emisní maxima látky 1 v různých prostředích
| Prostředí | Ámax |
| dimetylsulfoxid | 637 |
| Methanol | 630 |
| Fosfátový pufr (pH 7,4) | 627 |
-6CZ 304094 B6
Příklad 2
Příprava látky 2. Směs 2-(4-pyridyl)malondialdehydu (150 mg), 2-methyl-3-propylbenzo5 thiazolu (640 mg) a suchého n-butanolu (10 ml) byla za míchání zahřívána na 110 °C po dobu
h. Po ochlazení na laboratorní teplotu byla směs přefdtrována, pevný podíl promyt metanolem (3 ml) a sušen ve vakuu. Produkt byl získán ve formě zeleného kovově lesklého prášku. Výtěžek 498 mg, 79 %.
Struktura látky 2
Charakterizace: 'H-NMR: 8,94 (2H, d); 8,14 - 7,80 (8H, m); 7,58 (2H, t); 7,45 (2H, t); 6,20 (2H, 15 d); 4,28 (4H, bs), 1,71 (4H, m); 0,85 (6H, t). 13C-NMR: 156.9; 148,2; 143,6; 141,3; 128,2; 127,1;
125,5; 123,2; 114,0; 98,3; 47,5; 20,9; 10,8.
ES-MS vypočteno: 496,7, nalezeno: 496,3.
Elementární analýza: vypočteno: C 57,78 %; H 4,85 %; nalezeno: C 57,86 %; H 4,93 %. Absorpční maxima látky 2 v různých prostředích
| prostředí | ^max | Smax/lOO 000 |
| dimetylsulfoxid | 656 | 0,76 |
| metanol | 645 | 0,82 |
| fosfátový pufr (pH 7,4) | 641 | 0,46 |
Emisní maxima látky 2 v různých prostředích
| prostředí | ^max |
| dimetylsulfoxid | 665 |
| metanol | 662 |
| fosfátový pufr (pH 7,4) | 667 |
Příklad 3
Příprava látky 3. Látka 2 (55 mg) byla rozpuštěna v dimethylformamidu (5 ml) a byl přidán nadbytek methyljodidu (2M roztok v t—BuOMe, 0,5 ml). Směs byla uzavřena v tlakové ampuli
-7CZ 304094 B6 a zahřívána přes noc 60 °C. Druhý den byla reakční směs probublávána dusíkem, pro odstranění přebytečného methyljodidu. Poté byla směs odpařena dosucha. Pevný podíl byl promyt dietyléterem a sušen ve vakuu. Produkt byl získán ve formě kovově lesklého prášku. Výtěžek 63 mg, 94 %.
I ch3
Struktura látky 3
Charakterizace: 'H-NMR: 8,96 (2H, d); 7,98 - 8,16 (6H, m); 7,60 (2H, t); 7,48 (2H, t); 6,32 (2H, d); 4,35 (7H, bs), 1,72 (4H, sextet); 0,85 (6H, t). I3C-NMR: 166,4; 153,4; 147,9; 145,3; 141,4; 128,3; 127,8; 125,7; 125,6; 123,3; 114,2; 98,6; 47,7; 47,1; 34,4; 21,1; 10,9.
ES-MS vypočteno: 255,8, nalezeno: 255,6 (M2+/2).
Elementární analýza: vypočteno: C 48,64 %; H 4,34 %; nalezeno: C 48,93 %; H 4,56 %. Absorpční maxima látky 3 v různých prostředích
| prostředí | λχηβχ | Smax/lOO 000 |
| dimetylsulfoxid | 645 | 0,33 |
| metanol | 631 | 0,40 |
| fosfátový pufr (pH 7,4) | 628 | 0,42 |
Emisní maxima látky 3 v různých prostředích
| prostředí | Ámax |
| dimetylsulfoxid | 666 |
| metanol | 650 |
| fosfátový pufr (pH 7,4) | 654 |
Příklad 4
Příprava látky 4. Směs 2-(4-pyridyl)malondialdehydu (75 mg; 0,50mM), 2-methy 1-3-propyl anaftothiazolium jodidu (373 mg; 10,lmM) a suchého n-butanolu (10 ml) byla za míchání zahřívána na 110 °C po dobu 18 h. Po ochlazení na laboratorní teplotu byla směs přefiltrována,
-8CZ 304094 B6 pevný podíl promyt metanolem (3x5 ml) a sušen ve vakuu. Produkt byl získán ve formě zelené ho kovově lesklého prášku. Výtěžek 302 mg, 83 %.
Struktura látky 4
Charakterizace: ‘H-NMR: 8,98 (2H, d, J = 5,6 Hz); 8,2 - 7,9 (12H, m); 7,80 (2H, t, J = 7,3 Hz); 7,67 (2H, t, J = 7,5 Hz); 6,36 (2H, d, J = 11,6 Hz); 4,45 (4H, t, J = 6,5 Hz); 1,78 (4H, sextet, J = 7,2); 0,94 (6H, t, J = 7,3 Hz). 13C-NMR: 165,6; 140,2; 130,8; 130,1; 129,8; 129,4; 127,5; 126,6; 123,5; 122,1; 113,8; 48,5; 21,9; 11,3.
HRMS vypočteno: 569,2189 (M+); nalezeno: 596,2184 (M+)
Elementární analýza: vypočteno: C 63,06 %; H 4,74 %; nalezeno: C 63,11 %; H 4,80 %. Absorpční maxima látky 4 v různých prostředích
| prostředí | Ámax | Smax/lOO 000 |
| dimetylsulfoxid | 686 | 0,99 |
| Methanol | 676 | 1,10 |
| fosfátový pufr (pH 7,4) | 600 | 0,32 |
Emisní maxima látky 4 v různých prostředích
| prostředí | Áinax |
| dimetylsulfoxid | 707 |
| Methanol | 694 |
| fosfátový pufr (pH 7,4) | 699 |
Využití polymethiniových solí jako buněčné sondy pro selektivní mitochondriální lokalizaci.
Látky uvedené v tomto patentu vykazují selektivní lokalizací v mitochondriích řady buněčných linií. Nově připravené, pozitivně nabité, symetrické polymethiniové soli mají vhodné spektroskopické vlastnosti: úzké excitační i emisní spektra, minimální fluorescenci ve vodném médiu, maximální fluorescenci při inkorporaci do lipofilního prostředí membrán mitochondrií. Tato barviva navíc vykazují výrazně vyšší fotostabilitu v porovnání s xantyliovými barvivý, komerčně
-9CZ 304094 B6 používanými pro značení mitochondrií. Látky jsou navíc v mitochondriích zadržovány permanentně, což umožňuje jak výměnu média, tak fixaci a permeabilizaci buněk bez ztráty barvení.
Mitochondriální lokalizace námi připravených nových symetrických polymethiniových solí byla pozorována např. v buněčných liniích HeLa (odvozeny z karcinomu děložního čípku), LNCaP a PC-3 (buňky odvozeny z karcinomu prostaty), U2OS (buňky z osteosarkomu), MiaPaCa-2, BxPC-3, PaTu, CAPAN-2 (buňky odvozeny z adenokarcinomu pankreatu), HEK 293T (embryonální ledvinové buňky), HL-60 (buňky akutní myeloidní leukémie), KU-812 (buňky chronické myelogenní leukémie), myší buněčná linie 4T1 (buňky z karcinomu mléčné žlázy) a v primárních kuřecích embryonálních fibroblastech (CEF). Těmito příklady však není použití našich látek nijak omezeno. Tyto látky vykazují vysokou selektivitu pro mitochondrie, a to v odlišném principu než běžně používaná mitochondriální barviva jako například Mitotracker Green™. Vysoká selektivita mitochondriální lokalizace byla pozorována při použití těchto látek, např. 1^4, a to v případě všech testovaných linií (viz Obrázek 1). V případě buněk U2OS byla účinnost lokalizace v mitochondriích dokonce značně vyšší než pro komerčně dostupný MitoTracker Green™, jehož distribuce v mitochondriích byla slabá a neselektivní (Obrázek 2).
Příklad 1'
Příprava zásobního roztoku:
Vzhledem k nízké rozpustnosti našich sloučenin ve vodě byly sloučeniny rozpuštěny v dimethylsulfoxidu (popř. dimethylformamid, metanol, etanol). Koncentrace zásobních roztoků, které byly uchovávány ve tmě při -20 °C, byla 5mM. Před použitím byly vzorky za nepřístupu světla ustáleny na laboratorní teplotu cca 23 °C a řádně promíchány.
Přiklad 2'
Příprava buněk pro značení mitochondrií
Buňky linie HeLa (popř. U2OS, MiaPaCa-2, HEK 293T, 4T1) byly kultivovány v DMEM médiu (Dulbecco's Modified Eagle medium, Sigma USA), LNCaP v Iscove médiu (Sigma, USA), BxPC-3 (popř. HL-60, KU-812) vRPMI-1640 médiu (Sigma,USA), CAPAN-2 v McCoy médiu (Sigma, USA), PaTu v DMEM:F12 (1:1) médiu (Sigma, USA) doplněných o 10% fetální bovinní sérum (FBS, Invitrogen, USA), 2mM Glutamax™ (Invitrogen, USA) a 1% směs vitamínů (MEM vitamins solution, Invitrogen, USA). Buňky byly udržovány v logaritmické fázi růstu a kultivovány za standardních podmínek (37 °C, 5% CO2, 95% vlhkosti). Pro mikroskopické experimenty bylo inokulováno 100 000 buněk na kultivační misky se skleněným dnem (průměr 35 mm, MatTek, USA). Buňky byly inkubovány 16 až 24 h za standardních podmínek.
Příklad 3'
Barvení mitochondrií v živých buňkách
Buňky připraveny podle Příkladu 2 byly třikrát omyty fosfátovým pufrem (PBS; pH 7,4) a 10 min. inkubovány s 0 až 200 nM polymethiniovou solí rozpuštěnou v kompletním médiu. Pro dosažení co nejúčinnějšího barvení mitochondrií a minimálního nespecifického barvení byla typicky používána 20 až 50nM koncentrace polymethiniových solí. Po barvení byly buňky 2x omyty fosfátovým pufrem a inkubovány v čerstvém kompletním médiu bez fenolové červeni.
-10CZ 304094 B6
Příklad 4'
Fixace mitochondrií
Mitochondrie značené našimi novými fluorescenčními sondami je možno pozorovat nejen za nativních podmínek, ale lze je také fixovat. Fixace je možná např. 8% roztokem glutaraldehydu ve fosfátovém pufru; pH 7,4 při pokojové teplotě po 20 min. anebo 4% roztokem paraformaldehydu ve fosfátovém pufru za stejných podmínek a mikroskopovány.
Příklad 5'
Kolokalizace dvou mitochondriálních barviv
Buňky připravené podle Příkladu 2 byly nejprve barveny roztokem polymethiniových solí 1, 2, 3 nebo 4 s 20 až 50nM koncentrací. Po barvení byly buňky 2x omyty fosfátovým pufrem adobarvovány 120nM roztokem mitochondriální sondy MitoTracker Green™ (Molecular Probes) rozpuštěné v kompletním médiu, kultivace buněk probíhala za standardních podmínek (37 °C, 5% CO2, 95% vlhkost) po dobu 10 min. Buňky byly 2x omyty fosfátovým pufrem a inkubovány s čerstvým kompletním médiem bez fenolové červeni a mikroskopovány (viz Obrázek 1 a Obrázek 3).
Příklad 6'
Značení mitochondrií a jiných organel v buňce
Buňky připravené podle Příkladu 2 byly barveny 20 až 50nM roztokem polymethinových solí 1, 2, 3 nebo 4. Po barvení byly buňky 2x omyty fosfátovým pufrem a barveny po 20 min. 150nM roztokem sondy pro lysosomy LysoTracke Green (Molecular Probes) rozpuštěné v kompletním médiu za standardních kultivačních podmínek. Buňky byly 2x omyty fosfátovým pufrem a inkubovány 5 min. s roztokem jaderné sondy 4,6'-diamidino-2-fenylindolu (DAPI, 5 pg/ml) v kompletním médiu (viz Obrázek 2). Buňky byly 2x omyty fosfátovým pufrem a inkubovány v čerstvém kompletním médiu bez fenolové červeni. Barvení mitochondrií je možné kombinovat se značením dalších buněčných organel, jako je např. endoplazmatické retikulum anebo Golgiho komplex.
Příklad 7'
Mikroskopie
Buňky byly třikrát omyty fosfátovým pufrem a pozorovány pomocí inverzního fluorescenčního mikroskopu CellAR (Olympus, Japonsko) za použití 60x (numerická apertura 1,4), popř. lOOx imersního objektivu (Immersion oil 30cc, Olympus, Japonsko). V závislosti na spektroskopických vlastnostech testované látky byl použit filtr pro červený fluorescenční protein (RFP; ex. 535 až 555 nm / em. 570 až 625 nm, cut off 565 nm) anebo Cy5 filtr (ex. 590 až 650 nm / em. 663 až 738 nm, cut off 660 nm). Byla studována subbuněčná lokalizace polymethiniových solí v živých buňkách jednotlivých buněčných linií v reálném čase anebo fixovaných preparátů.
Mitochondriální značení našimi novými pozitivně nabitými symetrickými polymethiniovými solemi je možné kombinovat s barvením dalších studovaných proteinů pomocí fluorescenčně značených protilátek.
- 11 CZ 304094 B6
Průmyslová využitelnost
Polymethiniové soli jsou využitelné ve farmaceutickém průmyslu k přípravě mitochondriálních sond pro využití v medicíně.
Claims (2)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Použití symetrických polymethiniových solí s gama heteroarylsubstitucí obecného vzorce 1 kde obě koncové heteroaromatické skupiny methiniového řetězce jsou totožné a tvoří je benzothiazol, benzoimidazol, benzooxazol, benzoselenazol, jejichž konkrétní struktura je charakterizována skupinou A, Β, X, Y a jednou nebo více skupinami R na obou koncích methiniové sole, kde skupina A jsou alkyl Cl až Cl 2- substituenty, kde skupina B je 4-pyridyl, který může být dále substituován jedním či více stejnými nebo různými substituenty vybranými ze skupiny: fluor, chlor, brom, jod, hydroxy-, trifluormethyl, Omethyl, O-ethyl, O-propyl, O-trimethylsilyl, thiol, S-methyl, S-ethyl, S-propyl, amino, Nmethyl, N-ethyl, N-propyl, N-butyl, N-dimethyl, N-diethyl, N-dipropyl, N-dibutyl, N-bocyl, nitril, nitroso, azid, kyanát, kde v případě dvojnásobně nabitých solí, skupinu B tvoří Λ-alkylpyridiniová skupina, kde alkyl je Cl až CIO, trimethylamoniový nebo dimethylsulfoniový substituent, kde skupina R je vodík, kde X je síra, kde Y je chlorid, bromid, jodid, a polymethiniové sole obecného vzorce II (Π),12CZ 304094 B6 kde obě koncové heteroaromatické skupiny methiniového řetězce jsou totožné a tvoří je naftothiazol, naftoimidazol, naftooxazol, naftoselenazol a kde skupiny A, Β, X, Y a R mají vpředu uvedený význam,5 pro přípravu selektivních buněčných sond pro značení mitochondrií, a to jak v živých i mrtvých buňkách.
- 2. Použití symetrických polymethiniových solí s gama arylsubstitucí obecného vzorce 1 a II, podle nároku 1 pro přípravu sond pro značení izolovaných mitochondrií.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20110782A CZ304094B6 (cs) | 2011-12-01 | 2011-12-01 | Vyuzití polymethiniových solí jako mitochondriálních sond |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20110782A CZ304094B6 (cs) | 2011-12-01 | 2011-12-01 | Vyuzití polymethiniových solí jako mitochondriálních sond |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2011782A3 CZ2011782A3 (cs) | 2013-06-12 |
| CZ304094B6 true CZ304094B6 (cs) | 2013-10-16 |
Family
ID=48570609
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20110782A CZ304094B6 (cs) | 2011-12-01 | 2011-12-01 | Vyuzití polymethiniových solí jako mitochondriálních sond |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ304094B6 (cs) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CZ305538B6 (cs) * | 2014-05-06 | 2015-11-25 | Vysoká škola chemicko- technologická v Praze | Benzothiazolem substituované cyklobut-3-en-1,2-dion-3-hydrazony a jejich použití k léčbě leukémií a nádorových onemocnění |
| CZ306320B6 (cs) * | 2014-04-01 | 2016-11-30 | Vysoká škola chemicko - technologická v Praze | Využití nových typů pentamethiniových solí s expandovanou chinoxalinovou jednotkou v protinádorové terapii |
| WO2018206126A1 (en) | 2017-05-08 | 2018-11-15 | Vysoká škola chemicko-technologická v Praze | Imaging agents and methods |
| WO2023160737A1 (en) | 2022-02-23 | 2023-08-31 | Univerzita Karlova | Polymethinium salts as inhibitors of dihydroorotate dehydrogenase |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6291203B1 (en) * | 1995-11-13 | 2001-09-18 | Molecular Probes, Inc. | Cyanine dyes that stain cells and mitochondria |
| WO2002026891A1 (en) * | 2000-09-29 | 2002-04-04 | Molecular Probes, Inc. | Modified carbocyanine dyes and their conjugates |
| US20050208534A1 (en) * | 2003-12-05 | 2005-09-22 | Dallwig Jason A | Methine-substituted cyanine dye compounds |
| WO2007028118A2 (en) * | 2005-09-02 | 2007-03-08 | Visen Medical, Inc. | Nicotinic acid and picolinic acid derived near-infrared fluorophores |
| US20100143960A1 (en) * | 2007-03-09 | 2010-06-10 | Cis Bio International | Cyanine derivatives, fluorescent conjugates containing same and use thereof |
-
2011
- 2011-12-01 CZ CZ20110782A patent/CZ304094B6/cs unknown
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6291203B1 (en) * | 1995-11-13 | 2001-09-18 | Molecular Probes, Inc. | Cyanine dyes that stain cells and mitochondria |
| WO2002026891A1 (en) * | 2000-09-29 | 2002-04-04 | Molecular Probes, Inc. | Modified carbocyanine dyes and their conjugates |
| US20050208534A1 (en) * | 2003-12-05 | 2005-09-22 | Dallwig Jason A | Methine-substituted cyanine dye compounds |
| WO2007028118A2 (en) * | 2005-09-02 | 2007-03-08 | Visen Medical, Inc. | Nicotinic acid and picolinic acid derived near-infrared fluorophores |
| US20100143960A1 (en) * | 2007-03-09 | 2010-06-10 | Cis Bio International | Cyanine derivatives, fluorescent conjugates containing same and use thereof |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Acta Medica (Hradec KralovÚ) Supplementum, 2005, svazek 48, cislo 2; str. 64 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CZ306320B6 (cs) * | 2014-04-01 | 2016-11-30 | Vysoká škola chemicko - technologická v Praze | Využití nových typů pentamethiniových solí s expandovanou chinoxalinovou jednotkou v protinádorové terapii |
| CZ305538B6 (cs) * | 2014-05-06 | 2015-11-25 | Vysoká škola chemicko- technologická v Praze | Benzothiazolem substituované cyklobut-3-en-1,2-dion-3-hydrazony a jejich použití k léčbě leukémií a nádorových onemocnění |
| WO2018206126A1 (en) | 2017-05-08 | 2018-11-15 | Vysoká škola chemicko-technologická v Praze | Imaging agents and methods |
| WO2023160737A1 (en) | 2022-02-23 | 2023-08-31 | Univerzita Karlova | Polymethinium salts as inhibitors of dihydroorotate dehydrogenase |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ2011782A3 (cs) | 2013-06-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10264976B2 (en) | Biocompatible flavonoid compounds for organelle and cell imaging | |
| Prime et al. | A ratiometric fluorescent probe for assessing mitochondrial phospholipid peroxidation within living cells | |
| Neto et al. | Selective mitochondrial staining with small fluorescent probes: importance, design, synthesis, challenges and trends for new markers | |
| US9334281B2 (en) | Fluorochromes for organelle tracing and multi-color imaging | |
| JP6196988B2 (ja) | チオールの選択的検出 | |
| CN110057804B (zh) | 基于n-甲基邻苯二胺盐酸盐的荧光碳点在溶酶体靶向中的应用 | |
| Dong et al. | Two-photon red-emissive fluorescent probe for imaging nitroxyl (HNO) in living cells and tissues | |
| CZ304094B6 (cs) | Vyuzití polymethiniových solí jako mitochondriálních sond | |
| AU2019319901B2 (en) | Silicon-substituted rhodamine dyes and dye conjugates | |
| Dai et al. | Red fluorescent probes based on a Bodipy analogue for selective and sensitive detection of selenols in solutions and in living systems | |
| Wang et al. | A multifunctional fluorescent probe for dual-color visualization of intracellular mitochondria and lipid droplets and monitoring of SO2 in vivo | |
| US20080124751A1 (en) | Combinatorial rosamine library and uses thereof | |
| CN111004246B (zh) | 监测线粒体自噬的罗丹明类pH荧光探针及制备和应用 | |
| Zhang et al. | A two-photon endoplasmic reticulum-targeting fluorescent probe for the imaging of pH in living cells and zebrafish | |
| Wang et al. | A multiple acetal chalcone-BODIPY-based fluorescence: synthesis, physical property, and biological studies | |
| Kurutos et al. | Organelle-selective near-infrared fluorescent probes for intracellular microenvironment labeling | |
| Hong et al. | Synthesis and properties of a lysosome-targeting fluorescent ionophore based on coumarins and squaramides | |
| Lynch et al. | Water soluble bis (indolenine) squaraine salts for use as fluorescent protein-sensitive probes | |
| US9670363B2 (en) | Substituted anthraquinone dyes for cellular stains and enzyme detection | |
| WO2008155593A2 (en) | Phthalimide derivatives for labeling lipid droplets, and a method for visualization of cells and/or cellular organelles | |
| Dahiwadkar et al. | AIE active cyanostilbenes for live-cell imaging of lipid droplets | |
| Ramu et al. | New imaging reagents for lipid dense regions in live cells and the nucleus in fixed MCF-7 cells | |
| Mondal et al. | Julolidine-based small molecular probes for fluorescence imaging of RNA in live cells | |
| Gao et al. | Synthesis of a fluorinated pyronin that enables blue light to rapidly depolarize mitochondria | |
| US11591476B2 (en) | In-vivo probe for real time longitudinal monitoring of inducible nitric-oxide synthase in living cells and animals |