JPH06502177A - 磁気共鳴映像用ポリマー−デフェロキサミン−第２鉄付加物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 磁気共鳴映像用ポリマー−デフエロキサミンー第２鉄付加物発明の分野 本発明は磁気共鳴（ＭＲ）映像化の増強のための組成物に関する。この組成物は ポリマー部分に結合した第２鉄−キレート化剤フンシュゲートを含む。より具体 的には、この組成物はデフエロキサミン部分、第２鉄、およびポリマー、このポ リマーは、水溶性の場合は、例えば、蛋白質または多糖類など、水不溶性の場合 は、例えば、セルロースまたはアガロースなどである。この組成物は第２鉄を高 濃度で脈管系または胃腸管系への安全な投与が可能である。本発明はさらに、Ｍ Ｒ映像法にこの組成物を用いる医薬組成物またはその方法に関する。

本発明の背景 プロトン磁気共鳴映像法は身体内構造の医学的映像化の分野では比較的新しい診 断技術である。人体の磁気共鳴（ＭＲ）映像は、組繊中の水に含まれるプロトン 、すなわち、水素原子核を高磁場およびラジオ波の複合作用にさらして得られる ものである。

ＭＲ映像はＭＲ傷信号よって得られ、所与の組織中のプロトンの密度、Ｔ１およ びＴ２と称されるこれらのプロトンの２個の緩和パラメーターによって変化する 。

人体内で最も強度の高いＴ１信号は、水の濃度が低いために脂肪組織から得られ る。一方、水の濃度が高い組織、例えば、脳を髄液および浮腫状組織は低強度の 信号を生じる。例えば、血液や筋肉組織のような蛋白質の濃度の高い部分は中程 度のＴ１信号に関与する。特定の部分への常磁性イオンの投与はＴ１プロトン緩 和を変化させる。１個またはそれ以上の不対電子の関与する磁場の導入はプロト ンとそれらの周囲環境の相互作用を変化させる。その結果、プロトンのＴ１緩和 時間は短縮される。この変化の大きさは、プロトンおよび常磁性イオンの両方の 相対的１１１１！ｊに依存する。

鉄、マンガンおよびガドリニウムなどの常磁性イオンはコントラスト増強剤とし て用いられてきた。これらのイオンのうち、ガドリニウムは７個の不対電子によ り、プロトンのＴＩ値に最も大きな影響を与える。従って、このイオンはコント ラスト増強を目的として広く用いられてきた。ガドリニウムは人体内には存在せ ず、動物に塩化ガドリニウムのような塩溶液として投与した場合、かなりの毒性 をもたらす（ギビイら、インベスティゲイティブ・ラジオロジイ、２５＋１６４ −１７２　（１９９０））。ガドリニウムの毒性を減少させるために、このイオ ンは通常、有機キレート化剤を用いてフンシュゲート形態で投与される。鉄およ びマンガンは生体分子として本来存在しているが、本質的に毒性のあるイオンで ある。これらの毒性もまた、キレート化により減少させることができる。鉄の場 合、デフエロキサミンが毒性の減少のために用いられる（ウオラーら、インベス ティゲイティブ・ラジオロジイ、２３　：５２８１−５２８５（１９８８））。

ガドリニウムはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）およびジエチレントリアミ ン五酢酸（ＤＴＰＡ）によるコンジュゲート化により無毒化されている（ウニイ ンマンら、Ａ、Ｊ、Ｒ，１４２：６１９−６２４　（１９８４））。Ｇｄ−ＤＴ ＰＡキレートは細胞外体液部分内に分布し、血液−脳関門を通過せず、迅速に腎 臓によって排出される（シュミイトルら、Ａ、Ｊ、Ｒ，１４７：１２６３−１２ ７０　（１９８６））。従って、Ｇｄ−ＤＴＰＡは、尿路映像化のための、炎症 および腫瘍からの異常な毛細管浸透性の検索のための、および血液−脳関門の完 全性の診断のための造影剤として有用である。

しかしながら、Ｇｄ−ＤＴＰＡの造影剤としての使用には限界がある。Ｇｄ−Ｄ 　Ｔ　Ｐ　Ａは、脈管を通る初期通過の際に、約５０％が脈管内から脈管性体液 部分に排出され、迅速に脈管内部分から除去される（シュミイトルら、Ａ、Ｊ、 　Ｒ。

１４７　：１２６３−１２７０　（１９８６））。それゆえ、Ｇｄ−ＤＴＰ、Ａ は、血液量または組織潅流を例えば測定し得るような脈管内空間の選択的増強も たらし得ない。

このような障害を克１１１ｉＬ、脈管的保持を可能にする造影剤を提供するため に、蛋白質および多糖類、例えば、アルブミン、でルロースおよび分子量約５０ ０００以上のデキストランなどの高分子成分を、ＤＴＰＡに共有結合させ、つい で、ガドリニウムとキレート化する（ブラノンユら、磁気共鳴映像法における造 影および造影剤、特別演題セミナー、Ｐ、　Ａ、リンク（編集）、医薬における 磁気共鳴に関するヨーロッパ・ワークンヨップ、ベルギー、７４−９３頁（１９ ８９））。蛋白質−（Ｇｄ−ＤＴＰＡ）コンジュゲートはひとおよび牡牛血清ア ルブミン、イムノグロブリンＧおよびフィブリノーゲンから製造されている。こ のような造影剤は優れた脈管内分布および保持を示す（（ンユミイトルら、Ａ、 Ｊ、　Ｒ，１４７・１２６３−１２７０　（１９８６）　、パーヤネンら、マグ ネティック・レゾナンス・イン・メディノン、１３　：　１８−４３　（１９９ ０））。

血清アルブミン分子へのＧｄ−ＤＴＰＡの結合が、蛋白質分子のよりゆっくりシ タ回転速度により、Ｇｄ−ＤＴＰＡのみを用いて観察されるよりＧｄ”３のモル 当たりのプロトン緩和を改善する。例えば、Ｇ　ｄ　−Ｄ　Ｔ　Ｐ　Ａのみに対 して、約１゜４−２倍、約３倍および５−１０倍の緩和値の増大が報告されてい る（パーヤネンら、マグネティック・レゾナンス・イン・メディシン、１３　： １８−４３　（１９９０））。

対照的に、Ｇｄ−ＤＴＰＡｉｉ合デキストランがＩＧｄイオン当たり１の場合の 緩和効果は、Ｇｄ−ＤＴＰＡよりほんの僅か良い。しかし、重合物質では、遊離 のＧｄ−ＤＴＰＡと比較してより少ないモル当たりのガドリニウムが、脈管内構 造を効果的に増強するために必要である。インビボの映像化研究により、Ｇｄ− ＤＴＰＡ蛋白質コンジュゲートは、ラットのＩＶ注注射９仔に残留していること が判明した（ンユミイトルら、Ａ．Ｊ．Ｒ．１４７：１２６３−１２７０　（１ ９８６））。アルブミン−（Ｇｄ−ＤＴＰＡ）の使用はい（っかの不利を招く。

アルブミン−（Ｇｄ−ＤＴＰＡ）は、ＤＴＰＡの環状無水物とアルブミンとを反 応させ、その後、過剰のＧｄ＋３イオンの付加により合成される。Ｄ　ＴＰ　Ａ 基は、共有結合によりアルブミンのアミン部分と結合し、Ｇｄ＋３イオンがＤＴ ＰＡ配位子にキレート化される（シュミイトルら、Ａ．　Ｊ．　Ｒ．　１４７　 ：１２６３−１２７０　（１９８６）　）。しかしながら、Ｄ　Ｔ　Ｐ　Ａ無水 物などの２官能基のキレート化剤を用いることにより、アルブミン部分の架橋も 同時に生じる。さらに、キレート化剤上の配位部位の１個がこの過程で変化する ため、キレート化剤に結合する蛋白質に対するガドリニウムイオンの親和性が減 少する。

アルブミン−（Ｇｄ−ＤＴＰＡ）コンジュゲートの別の欠点は、ＤＴＰＡとアル ブミンの比較的低い結合能が、多量のひと血清アルブミンの投与を要することに ある。この修飾蛋白質マトリックスに関連する免疫原的反応に対する可能性の高 さに関心が集まっている。

デキストランは、重合工程を経てＤＴＰＡと架橋され、１７０００ＭＷの小さな 粒子から、水不溶性の大きな粒子の分子を形成する。デキストランをＤ　Ｔ　Ｐ 　Ａで架橋する典型的な方法は、ＤＴＰＡの無水物を用いて、デキストランへの ＤＴＰＡのエステル化架橋を行うものである（ギビイら、インベスティゲイティ ブ・ラジオロジイ、２４　：　３０２−３０９　（１９８９））。しかし、ＤＴ ＰＡ無水物は２官能基架橋剤であるから、この重合化工程は困難であり、面倒で あることが理解され得る。さらに、この方法は、分子量分布が広く生成物の限定 が不十分になる。さらに、得られた生成物の溶解性が、出発物質であるデキスト ラン成分の溶解性よりも非常に低い。その上、ＤＴＰＡの５個のカルボン酸基の うちの２個の多糖類へのエステル架橋による置換が、結合金属イオンに対するＤ ＴＰＡデキストランコンジュゲートの親和性を非常に減少させる。多糖類からの ヒドロキシ基が部分的に負の電荷の損失を補うかもしれないことが提案されたが 、この仮説を支持するデータは示されなかった（ギビイら、インベスティゲイテ ィブ・ラジオロジイ、２４＋３０２−３０９　（１９８９））。

アルブミンなどの蛋白質または多糖類部分に対するＧｄ−ＤＰＴＡの付加は、特 異的でなく、脈管内に分布する造影剤を得るための手段を提供する。ＭＲ映像法 における現在の電点は、蛋白質に常磁性体を結合させ、組織または機能特異的で ある造影剤を得ることにある。例えば、蛋白質−映像化造影コンジュゲートは抗 体とＧｄ−ＤＰＴＡを結合させるユとによって製造されている。例えば、シアブ 、Ｐおよび．へＭ．エイゼンら、マグネティック・レゾナンス・イン・メディシ ン、３：３３６−３４０　（１９８６）参照。

常磁性核としてガドリニウムを用いる利点の１つは、第２鉄と比較してその高い 緩和性である。すなわち、信号増強を得るためにガドリニウムは低い濃度で投与 されることが要求される。しかし、ＤＴＰＡからのガドリニウムの欠落は、特に ＤＴＰＡ無水物がポリマー付加に使用される場合の周知の現象である。さらに、 ガドリニウムのＤ　Ｔ　Ｐ　Ａに対する、結合定数、すなわち親和性は、中性ｐ Ｈにおいて比較的低く、さらに重要なことは、ｐＨが低下する場合は急速に減少 することである。この特性はインビボ投与、特に、アシド−シスおよび総ｐＨ単 位と同程変にｐＨの局部的低下をもたらす虚血性発作に重大な問題である。

そのようなキレートの不安定性は、身体内で強い毒性形態になる、インビボでの 金ＩＩ複合体の溶解の恐れである。従って、そのような造影剤が依然として安定 なままであり、常磁性オンが、体内で結合し無毒性形態のまま存在することを確 実にすることは極めて重要である。

第２鉄を含む造影剤は、ガドリニウムの代わりとして使用されてきた。しかしな がら、ガドリニウムと同様に、第２鉄は、内服のために、例えば、デフェロキサ ミン（デスフェリオキサミン；ＤＦ○）とのキレート化により無毒化されなけれ ばならない。デフ二ロキサンの急性および慢性毒性は、比較的高（、静脈内投与 時、低血圧を引き起こす可能性がある。フェリオキサミンは、策２鉄（Ｆｅ”） とデフエロキサミンの安定な複合体であり、約ＩＱ−３０の結合定数を有する（ ）オーラウユイ等、プロン−ディング・オン・ナショナル・アカデミ−・オン・ サイエンシーズ（ニーニスニー）、第８６巻：１０１０８〜１０１１２頁（１９ ８９珀））。フェリオキサミン（ＦＯ）は、尿路のための増強剤としてそれを特 に有用にする尿中に第一に排泄される。更に、それは、局所血液脳関門欠損よび 腎排泄機能の評価を提供する（ウェスバイ等、Ｐｈｙｓｉｏｌ．　Ｃｈｅｗ．　 Ｐｈｙｓ．　ａｎｄ　Ｍｅｄ，　ＮＭＲ。

東１６巻：１４５〜１５５頁（１９８４年）；ウニインマン等、Ａ．　Ｊ．　Ｒ ．、Ｍ１４２巻、６１９〜６２４頁（１９８４年））。約２０分間の血漿半減期 を有するＧｄ−ＤＴＰＡとは異なり，ＦＯクリアランスは、投与量の約１／２が 排泄される約１２８分の最初の相、ついで７時間以上の半減期を有する長期排泄 相を育する、二相性である（ウオラ等、インベスティゲイティブ・ラジオロジー 、第２３巻＝５２８１〜５２８５頁（１９８８年））。

しかしながら、フェリオキサミン（ＦＯ）の毒性は、デフエロキサミンの毒性に 類似している（ホーラウェイ、等、ブロン−ディング・オン・ナショナル・アカ デミ−・オン・サイエンシーズ・ニーニスニー、第８６巻：１０１０８〜１０１ １２頁（１９８９年））。効果がすぐ現れる静脈注射によるいずれもの副作用は 、激しい血圧低下をもたらす場合がある（二−ドラッヒ等、インベスティゲイテ ィブ・ラジオロジー、第２３巻・６８７〜６９１頁、（１９８８年））。従って 、常磁性造影剤としてフェリオキサミンは、非常に低濃度でだけ使用し得、尿排 泄系に限定される。更に、２０ＭＨｚおよび３７℃でのフェリオキサミンの緩和 性は、１．４ｓ”ｍＭ−’であり、Ｇｄ−ＤＴＰＡより３低いファクターである 。

従って、フェリオキサミンは、同じ緩和効果を得るために、ガドリニウム含有キ レートより２〜３倍高い投与量で注射しなければならない。

タンパク質、例えば、免疫グロブリン、モノクローナル抗体および血液貯溜マー カーに結合する常磁性または鉄磁性剤を含む造影剤は腫瘍特異性ＭＲ剤としての 使用が提案されている（バーヤネン、等、マグネティック・レゾナンス・イン・ メディスン、第１３巻二３８〜４３頁（１９９０年））。高濃度の鉄の取込みを 成し遂げるために、金属キレート化剤は、初期には、ポリアミノ酸、例えば、ポ リリジン、ポリグルタミン酸、または他の有機ポリマー、例えば、ポリアクリル 酸に結合させた（ンアブ、Ｐ．およびＡＭ．アイゼン、マグネティック・レゾナ ンス・イン・メディスン、第３巻：３３６〜３４０頁（１９８６年））。この方 法は高濃度の結合鉄イオンとの付加物を生成したけれども、この方法はいくつか の欠点を有する。比較的煩雑であることに加えて、最終コンジュゲート生成物は 、約６０〜７０％活性域の構造的意味で非常に変化した抗体を含む。従って、信 号を増強し得る物は、特異性における損失であると思われる。更に、ポリアミノ 酸は、キレート化剤、例えば、デフエロキサミンと同じように明示的に高い親和 性をもって相互反応しない。非結合鉄のこの形態が毒性のある酸素および脂質由 来のラジカルの形成を導く反応に関与し得るので、緩く結合した鉄はかなりの毒 性に関与し得ることは特に重要である。しかしながら、デフ二口キサミンへ結合 した鉄は、全ての配位部位を占領されるので、そのような反応に関与し得ない。

従って、本発明の目的は、プロトン緩和時間を増大し、インビボでのコントラス ト増強に適当な投与量で毒性作用がなく、インビボで安全性を保ち、インビボで の生物学的半減期を保持および／または増大し、および所望の映像検討終了後に 体内から迅速に排泄される、磁気共鳴映像法に使用するための第２鉄を含む高分 子常磁性造影剤を提供することである。もう一つの目的は、哺乳類で組織特異的 またはコンパートメント特異的に分布し得る第２鉄造影剤を提供することである 。更に、もう一つの目的は、本発明の常磁性付加物を含む薬学的組成物および磁 気共鳴映像化を増強する組成物の使用法を提供することである。

本発明の概要 磁気共鳴（ＭＲ）映像法に適した組成物をもたらす本発明によりこれらおよび他 の目的に達する。更に具体的には、本発明は、ポリマーに共有結合したデフエロ キサミン部分のフンシュゲートとデフェロキサミン部分にキレート化した第２鉄 との付加物を含む組成物をもたらす。本発明のポリマー部分は、付加物の結合キ レート成分の毒性を減少し得る高分子物質であればよい。例えば、付加物は、多 糖類のような水溶性ポリマー、例として、デキストラン、でんぷん、ヒアルロン 酸、イヌリンおよびセルロース、および血清アルブミンおよびトランスフェリン のようなタンパク質、または、セルロース、寒天のような水不溶性ポリマーを含 み得る。

造影剤、すなわち、付加物は、鉄とのポリマー結合鉄キレート化剤上の結合部位 を飽和させて形成する。デフエロキサミン部分は、ポリマー成分に結合後、その キレート能を実買的に保持している。生じたポリマー（キレート化剤−第２鉄） 付加物は、無毒であり、哺乳類の脈管系、またはコンパートメント、または胃腸 系への高濃度の結合無置性第２鉄への投与を可能にする。第２鉄１ｍＭ以上の濃 度が、有害な副作用なしに血流に投与され得る。本発明の付加物は、脈管コンパ ートメント内の第２鉄の量を約５ｍＭまで増加させ得る。好ましくは、付加物に より得られる脈管系内の第２鉄の量は、約０．　５〜２ｍＭである。第２鉄それ 自身はプロトン磁気共鳴信号を増強する。磁気信号は、ポリマーへのイオン／キ レート化剤複合体の付加により更に増強される。

本発明は、也者の身体特徴の磁気共鳴映像化に使用するためのインビボでの投与 に適する組成物を提供する。本発明に記載の薬学的組成物は、生物適合性があり 、薬学的に許容し得る担体と組み合わせて薬学的に許容し得る付加物を含む。

付加物は身体特徴の映像化を増強する有効な量で存在することが好ましい。

本発明の組成物は、特定の細胞、組織および他の部分、特に脈管系の選択的な磁 気共鳴映像化を増強し得る。本発明の付加物は、循環不全、腫ｆ１１湿潤、脈管 漏出または浮腫、および虚血または再潅流により損傷した組織を監視する磁気共 鳴映像法において有用である。本発明は、診断手段、例えば、癌検診に有用であ る特足細胞または組織に対する特異性を有する磁気共鳴映像造影剤を含む。例え ば、脈管腫瘍、および乳癌のような固体状腫瘍の両方を含む、様々な腫瘍性細胞 型はトランスフェリン受容体の出現の増大に関連する。従って、鉄輸送タンパク 質であるトランスフェリンは、このタンパク質に対する結合部位または受容体の 出現が高い、細胞および／または領域に対してそのようなトランスフェリンコン ジュゲートの分布を増強する付加物のポリマー成分として使用され得る。

付加物は、身体特徴の有効な映像化を増強するのに必要な時間、好ましくは３０ 〜９０分間脈管内で保持される。好ましくは、本発明の付加物の大きさは、脈管 部から細胞外液部へ付加物の拡散速度を遅延させるのに有効であるので、臓器、 組織または他の脈管コンパートメントの他の部分のＭＲ映像化が行われ得る。付 加物は、少なくとも約５０００ダルトン、および２５００００ダルトンより少な （なく、更に好ましくは、約１００００〜５００００ダルトンである。映像化工 程完了後、付加物は体内から迅速に、好ましくは、２４時間以内に排泄される。

付加物が、体内から原糸を通って排泄される。

ＭＲ映像法の付加物を含む組成物の使用法も提供される。この方法は、本発明記 載の薬学的に許容される付加物を含む造影剤から成る組成物を投与し、従って、 造影剤が映像化される身体系に分布し、ＭＲ映像化技術に従って、その系または その一部分画像を測定する工程を含む。

図面の簡単な説明 図１は、左前方下降性冠状動脈（ＬＡＤ）閉塞前、閉塞中及び閉塞後および再潅 流後の種々の時間での食塩水群（対照、黒ぬりの円、ｎ＝９）　、ＨＥＳ−ＤＦ Ｏ−処理群（中空の円、ｎ＝７）及びＨＥＳ−ＤＦＯ−第２鉄処理群（中空の四 角、ｎ＝５）での虚血性再潅流区域のセグメント短縮％（対照の％）を示す。線 形を付けた及び黒ぬりの棒は、それぞれ薬物注入及びＬＡＤ閉塞の期間を示す。

全ての値は平均＝ＳＥＭである。

＊Ｐ＜０．０５対対照群。

図２は、ＬＡＤ閉塞、閉塞中及び閉塞後および再潅流後の種々の時間でのＨＥＳ −ＤＦＯ（中空の円、ｎ＝７）　、ＨＥＳ−ＤＦＯ−第２鉄（黒ぬりの円、ｎ＝ ４）及びＤＦＯ（中空の三角、ｎ＝６）の血漿濃度を示す。線形を付けた及び黒 ぬりの棒はそれぞれ 薬物注入及びＬＡＤ閉塞の期間を示す。全ての値は平均上ＳＥＭである。　Ｐ〈 ０．０５対ＤＦＯ群。

詳細な説明 本発明は、ポリマー成分に共有結合した第２鉄−キレート剤複合体の付加物であ るＭＲ造影剤を用いる哺乳動物の磁気共鳴（ＭＲ）映像法である。特に、それは 例えば腎臓、肝臓、心臓、脳、及びｌＷｇＡ管のような高度に新生国営が形成さ れる体の器官である脈管コンパートメントのＭＲ映像のコントラストを増強する 。

本発明は、ポリマー結合キレート化剤、特にデフェロキサミンの結合部位を鉄で 飽和させることにより生成しつる、改良されたＭＲ造影剤を提供する。得られる 化合物は、高濃度の結合した又は封鎖した、従って、無毒の第２鉄を身体構造及 び系、特に脈管系に導入することを提供する。第２鉄のみの常磁性性質がプロト ンのＴ１緩和時間の著しい増強を与える。磁気信号の付加的増強はデフエロキサ ミンー第２鉄複合体、すなわち、フェリオキサミンをポリマー成分、例えば蛋白 又は多糖に付着させることにより達成する。ポリマー−結合フェリオキサミンの 静脈内注入は、１ｍＭよりも過剰の濃度で第２鉄の一時的血管濃度を安全に得る ための手段を提供する。本発明の組成物は、さらに、脈管系内の特定の部位の選 択的磁気共鳴映像増強のための手段を提供する。

ポリマー部分は、結合したキレート成分の毒性を減じつる全ての高分子物質であ りうる。本発明による適当なポリマーは、水溶性ポリマー、例えば多糖類、例と してデキストラン、澱粉、ヒアルロン酸、イヌリン及びセルロース、並びに水不 溶性ポリマー、例えばセルロース及びアガロースを含む。ポリマーは、身体内で の特別な生理的分布及び脈管保持に関して特別な臨床的必要性のための付加物を 提供するよう設計しうる。例えば、水不溶性ポリマーは、胃腸管映像用付加物を 提供し、水溶性ポリマーは血管映像用付加物を提供する。

本発明の付加物は、付加物の脈管内から脈管外の体液空間への速やかな拡散を遅 延させるのに有効な大きさであるべきで、これにより付加物は脈管内にとどまり 映像化されている器管又は組織の有効なコントラストの増強を与える。付加物は 脈管コンパートメントに約３０−９０分間とどまるのが好ましい。好ましくは、 付加物は、ゲル浸透クロマトグラフィーにより測定して、５．０００ないし２５ ｏ、ｏｏｏダルトンの間の、より好ましくは約１０．０００ないし５０，０００ ダルトンの分子量を有する。

本発明の付加物を製造するため、デフニロキサミンを製薬上許容しうる有機ポリ マーに直接共有結合し、次いでコンジュゲートを第２鉄で飽和する。別法として 、製造された形態のデフニロキサミンー第２鉄複合体、例えばフェリオキサミン Ｂをポリマー部分に結合させ、コンジュゲートを第２鉄で飽和しつる。デフニロ キサミン（Ｎ　−［５−Ｅ３−　Ｅ　（５−アミノペンチル）ヒドロキシヵルバ マモイルコブロビオンアミド］ペンチルＥ　３　ＣＣ５（Ｎ−ヒドロキシアセト アミド）ペンチル］カルバモイルコプロビオノヒドロキサム！！１）及びその製 薬上許容しうる塩の製造法は、例えばプレログ等により、ヘルベチヵ・上ミヵ・ アクタ、４５．６３１　（１９６２）　、ビンケル等、ヘルベチ力・キミ力・ア クタ、４６．１３８５　（１９６４）、ドイツ特許明細書１．１８６．０７６及 び米国特許第４゜４１９．３６５号に開示され、これらの開示を引用して明細書 記載の一部とする。

そのような塩は、メタンスルホン酸、リン酸、酢酸、酪酸、酒石酸、クエン酸等 の酸付加塩を含む。

デフエロキサミンの末端アミノ（ＮＨｚ）基を製薬上許容しうる有機ポリマーの 分子に結合させるのが好ましい。アミン基はポリマー上のカルホキ／酸部分に直 接結合し、例えばアミド結合を形成する。好ましくは、デフェロキサミンアミノ 基は反応式 ％式％ （式中、反応１はノッフ塩基を生成し、これは反応２で還元され共有結合を生ず る） によってポリマー上のアルデヒド（ＣＨＯ）部分に直接結合する。多くのデフェ ロキサミン部分が単一のポリマー分子に結合しつる。

上記方法（ここでポリマーは可溶性バイオポリマー、例えば多糖類又は蛋白であ る）の適用により、固着されないキレートと同様のキレート能力を本質的に保持 する可溶性キレート剤が得られる。

アルデヒド基は、既知の技術により、例えば過ヨウ素酸ナリトウムによる炭水化 物又は他のジオールのノアルデヒドへの酸化により、ポリマー基質に導入できる 。例えばウィルソン等、イムノフルオレッセンス・アンド、リレイテッド・ステ イニング・テクニクス、カップ等（纒ＪＩ）エルセヴイア／ノース・ホランド・ バイオメディカル・プレス（１９７８）２１５頁、フレミング等、アクタ・パイ オル、メト　ゲル　３０，１７７　（１９７３）及びニス、−シー、タム等、プ ロシーディンゲス・ナショナル・アカデミイ・オン・サイエンス（ＵＳ、Ａ）７ ３．２１２８　（１９７６）参照、これらの開示を引用して明細書記載の一部と する。

ある適用では、デフニロキサミンの末端アミノ基は又、ジアルデヒド結合剤、例 えばゲルタールアルデヒドの使用により、次いで、例えば水素化ホウ素ナトリウ ムによる還元により、ポリマーのアミノ基に間接的に結合できる。

これらの反応により達成しつるデフェロキサミン：ポリマーのモル比は、因子、 例えばポリマー上の反応性基の数、立体障害、シッフ塩基又はアミド形成の程度 等により広範囲に変る。−例として、約０．６−０．７ｇのデフエロキサミンは 、デキストランに導入されたアルデヒド基によるデフエロキサミンの反応、次い で還元により、約２５ｇの反応デキストラン４０と結合できる。デフエロキサミ ンとの反応用の基質物質として用いた有機ポリマーは水溶性又は水不溶性のいず れでもありうる。製薬学的に、および／ないしは使用中に接触する生理的溶液と 両立し得ることを条件として、どちらから形成されたキレート化剤も種々の適用 に有用である。

インビトロ調製と異なり、本発明の付加物のインビボ用途は特別な特質を有する 組成物を必要とする。例えば本則のキレート部分はポリマーに付着後、キレート 化剤としての有効性を維持しなければならない。好ましくは、デフェロキサミン 部分は、デフエロキサミン部分のキレート化能力が、インビトロで実質的に、好 ましくは固着されないデフエロキサミン程度に維持されるようにポリマー部分に 固着される。付加物は導入を容易にするため十分に可溶性であるべきであり、又 、フェリオキサミン単独に比べ脈管コンパートメントにおいて保持の増大をもた らすべきである。付加物は、最適コントラスト増強に必要な濃度より３ないし１ ０倍高い濃度で投与した場合でも実質的に無毒であるべきである。高分子物質は 著しい副作用を生ずるべきてな（、従って、生体適合性であるポリマーから選択 すべきである。

本発明のインビボ適用による応用に明らかに有用なポリマーは、多糖類、例えば デキストラン及びヒアルロン酸、澱粉誘導体、並びに蛋白、例えば血清アルブミ ン、トランスフェリン等を含むことが判明した。ポリマー出発物質、例えばデキ ストラン、ヒドロキシエチル澱粉、ヒトアルブミン及び血漿蛋白フラクションは 商業的に入手可能である。レミントンズ・ファーマンニーティカル・サイエン／ ズ　エイ、オソル　編集、マツグ・パブリノンング（１６版、１９８０）７５９ −７６１頁参照。この開示を引用して明細書記載の一部とする。さらに多くの種 類の不溶性合成及び天然有機ポリマー、例えば、水不溶性アガロース（セファ０ −ス（商標））、橋かけ結合デキストラン（セファデクス（（商標））、セルロ ース（例えば紙及び木綿）、澱粉等が上述した技術によりデフエロキサミンに結 合できる。

第２鉄のデフエロキサミンーポリマーコンジュゲートへの付加は、結合デフェロ キサミンの含量の注意深い測定、次いで塩化第２鉄を用いる０、９４−０．９． ６当量の第２鉄の添加により行う。次いで溶液のｐＨを水酸化ナトリウムを用い て中性に謂！する。

好ましくは、付加物におけるデフェロキサミンの比は約１．２ないし１，０１、 最も好ましくは１０６ないし１．０４である。生体系に潜在的に毒性でありうる 非特異的に結合した鉄の発生を減少させ及び／又は排除するためにわずかに過剰 のデフニロキサミンを用いることが必須である。本発明による組成物の好ましい 実施態様は、デフェロキサミン約３−４０重量％、より好ましくは約１０−２５ 重量％、約０．３−４重量％第２鉄、より好ましくは約１．０−２．５ｊｉ量％ を含む。従って、これらの合成鉄キレート化剤−ポリマーコンジュゲートは、ト ランスフニリンより高レベルの結合鉄を含み、鉄輸送蛋白は、その飽和形で、約 ０゜１５重量％の鉄を含む。

本発明の付加物は、デフェロキサミンーＮ２鉄部分の減少した毒性、及び非結合 フェリオキサミンに対して結合デフエロキサミンー第２鉄部分の増強された脈管 保持時間に王として関係する本質的利点を示す。以下に報告する実験結果から、 デフェロキサミン結合ポリマーー第２鉄付加物の機能が他のポリマー−結合ＭＲ 造影剤から容易に予想し得ないことが理解されよう。

ポリマー−（デフエロキサミンー第２鉄）付加物は哺乳類において特に血管コン パートメント、または経口投与の場合、胃腸系のＭＲ対比を増強する能力を有す る。例えば、付加物は、動脈流口復時の傷害組織への血液再潅流のＭＲ検出を可 能にし、脳に付随する脈管組織を強調し、腫瘍を明示することができる。さらに 、付加物は発作のような出血部位、血液量の勾配、血管の伸張または腎臓、腸、 心筋、または大脳虚血のＭＲによる明示または検出を発生から数分内に可能にす る。例えば、ヒドロキシエチル澱粉とコンジュゲートしたデフェロキサミンー第 ２鉄複合体は微少および巨大循環に関する心筋および脳血管のＭＲ映像を増強す る。このような薬は種々の器官の数種の型の血管の傷害の診断に有用である。さ らに、本発明の組成物は多くの解剖部位で再注射無しに組織を強調し得る。

本発明のＭＲ造影剤組成物は、特定の器官または組織のＭＲ映像法実施に効果的 な血管内保持時間を提供する。付加物は少なくとも約３０−９０分の血管の半減 期を持つことが好ましい。例えば、本発明の分子量２００００のヒドロキシエチ ル澱粉デフエロキサミン付加物は血液組織内で２から３時間保持される。映像法 の終了後、付加物が体内から排出されるのが好ましい。付加物は磁気共鳴映像法 の後２４時間以内に完全に排出するのが好ましい。さらに好ましくは付加物が原 糸を通って排出される。

付加物はまた血管組織以外の強調を提供する。例えば、付加物は注射等によって を椎素へ脳を髄の液循環、洞、尿性器系、リンパ系、および他のＭＲ法荷よって 検出される部位の細部構造を増強するために投与される。例えば、付加物は、下 顎下節、前−および後−耳介節、頭表面シ、腋の下の節、腿の付は根の節の様な リンパ節への注射によるリンパ系の増強を提供する。さらなる例としては、付加 物は、例えば競争馬に靭帯の構造または他の構造を増強するため関節の髄液に注 射し得る。

本発明は例えば癌の検出の診断具として、特定の細胞または組織に特異性をもつ ＭＲ増強付加物を含む。トランスフェリン受容体の発現の上昇は血液量および乳 癌のような固体癌の両方を含む種々の新生細胞型の性質の延票である。従って、 本発明の付加物はトランスフェリン結合部位または受容体の発現が高い細胞およ び／または領域に対する造影剤コンジュゲートの分配を増強するためにトランス フェリン、すなわち鉄輸送蛋白を含み得る。このような、トランスフェリン受容 体の発現を増強した細胞への特異性をもつＭＲ映像法造影剤はこのように、癌細 胞および／または組織診断方法を提供する。

本発明は更に哺乳類に投与するための薬理学的に許容可能なデフエロキサミン、 第２鉄およびポリマーの付加物を含む。本発明の付加物は薬理学的に許容可能な 液体または粉末担体のような付加物と両立できる溶媒と組み合わせ得る。例えば 、付加物は関節の髄液に注射するためにヒアルロン酸と組み合わせう得る。医薬 組成物は散剤、顆粒、液剤、軟膏、クリーム、噴霧剤、粉または液滴の形態であ り得る。液剤または液滴は適当な補助剤、緩衝液、防腐剤、および塩を含み得る 。

粉または顆粒の形の組成物は希釈剤、分散剤および／または界面活性剤と一緒に 液体と組み合わせ得る。組成物は経口、直腸、静脈内、非経口的、または直接造 影されるべき組織へ注射し得る。

本発明の組成物は好ましくはイン・ビボで溶液として、非経口的に、例えば筋肉 内、または静脈内注射または注入、または経口、直腸または膣経由で投与する。

組成物はまた造影されるべき系へ直接注射で投与し得る。適当な用量は増強され るべき器官または組織、患者の年齢、大きさおよび体重、投与形態等を含む適当 な臨床因子によって調節する。

特定の付加物の最適な用量は付加物の排泄速度、付加物の弛緩性、または付加物 が細胞外環境により希釈されるかどうかの付加物の数々の因子によって異なる。

薬が血液組織内に残る場合、低用量が要求される。しかしながら、実際の最適量 は環境の性質の組み合わせによって決まる。付加物が研究するべき器官の共鳴造 影を増強する量で投与されることが好ましい。好ましくは、ポリマー−（デフエ ロキサミンー第２鉄）コンジュゲートの量は約０．０１ないし０．１ミリモル／ 体重ｋｇ１または約６ないし６０＋ｇ／体重ｋｇフェロキサミンの間である。ポ リサラ力ライドーデフエロキサミンう第２鉄付加物は好ましくは約５−２０　ｍ ｇ／ｍｌの固定化デフエロキサミンー第２鉄複合体を含む。好ましくは０．５− ６ｗ１／体重ｋｇの間のデフェロキサミンー第２鉄、さらに好ましくは約ｌ１１ ７体重ｋｇを投与する。胃腸経路の増強のための付加物の経口投与には、大用量 を投与し得る。

本発明はさらに、哺乳類の体の磁気共鳴映像法の方法を含む。この方法は本発明 の付加物を含む組成物を、造影されるべき体の組織に分配されるように、患者に 投与し体の組織または部分の映像をＭＲ映像技術に従って検定することを含む。

例えば二−ンドルフおよびホースティン、コントラスト・アンド・コントラスト ・エージェント・イン・マグネティック・レゾナンス・イマージング、プロン− ディング・ヨーロピアン・ワーク／コツプ・万ン・マグ不テインク・レゾナンス ・イン・メディカル（１９８８年、９月）参照、その開示を、本明細書に包含さ せる。

本発明の方法によって投与された組成物は、薬理学的に許容可能な担体と組合わ さったデフエロキサミン、第２鉄、およびポリマーの薬理学的に許容可能な付加 物を含む。付加物が造影されるべき体の組織の磁気共鳴映像法を増強させるのに 前動な量存在するのが好ましい。リンパ系または腎臓／尿路もまた本発明により 増強され得る本発明の方法は特に哺乳類の高度に血管性の組織の造影増強を提供 する。血管系の増強を提供するために、付加物が血流に挿入されるのが好ましい 。

組成物は経口、ｉ！［ｖＡ、静脈内、非経口または直接造影されるべき組織へ投 与される。

フエロキサミン系付加物の利点は、第２鉄に対するデフエロキサミンの親和性ま たは結合定数がＤＰＴＡのがトリニウムイオンのそれと比較して高いことである 。従って、本発明の付加物は造影研究に必要な時間の間減少しない。ＧｄのＤＴ 　Ｐ　Ａからの損失は、特にＤ　Ｔ　Ｐ　Ａ無水物がポリマー拮合剤として使用 された場合、既知の現象である。第２鉄のデフニロキサミンに対する非常に高い 結合定数は鉄がイン・ビボで複合体から分離しないことを確実にする。

本発明のポリサラ力ライドーデフエロうサミン結合体の別の利点は、水溶性およ び非水溶性結合体をｆＪａ製できることである。ＤＦＯの２成分性、水溶性ポリ サンカライドおよび蛋白への結合は、非経口注射用によ（研究されている付加物 を提供する。キレート−鉄複合体のセルロース、アガロース等の不溶性物質への 結合は経口または直腸投与によく研究されている付加物を提供する。

さらに別の本発明の利点は、キレート化剤のアミノ基がポリマーの結合に使用で きるため、ポリマー対ポリマー架橋の危険性がないことである。結果として本発 明のコンジュゲートは最初のポリマー組成物と非常に類似した性質を残す。対照 的に、ポリマーへの２官能性架橋剤、ＤＴＰＡ無水物の結合は分子量が測定が困 難な巨大分子を導（ポリマー−ポリマー架橋を随伴している。

他の利点は、本発明のポリマー分子がキレート化剤の鉄結合特性を換えないこと である。ホールウェーら、プロン−ディンゲス・オン・ナショナル・アカデミ、 。

り・サイエンシズ・ニーニスニー、８６巻１０１０８−１０１１２頁参照これを 引用して本明細書に包含させる。

さらに別の利点は本発明のポリマー分子が薬理学的に許容可能な成分であること である。例えば、ヒドロモノエチル澱粉、デキストラン、イヌリンおよびヒアル ロン酸は血漿増量剤として広く臨床治療に使用されている。

本発明のさらなる利点は、ガドリニュウムコンジュゲートと異なり、本発明のフ ェロキサミンー含有化合物は色の範囲が暗茶色からオレンジにわたり、従って〜 １Ｒ造影剤の尿排泄の可視検出を増大する。

非毒性、生物学的半減期および血管因子への選択性の増大により、本発明の付加 物は種々の器官および組織用のＭＲ映像法における遊離Ｇｄ−ＤＴＰＡ、Ｇｄ− Ｇ　Ｔ　Ｐ　Ａコンジュゲートまたは遊離デフエロキサミンー第２鉄複合体と比 較して改良された造影剤を提供する。

本発明を種々の具体的および好ましい態様および技術を引用して説明する。し力 ＼しながら、多くの変形および修飾が本発明の目的および範囲内で行われ得るこ とは理解されるべきである。

実施例Ｉ ヒドロキシエチル澱粉、デフニロキサミンおよび第２鉄を含む付加物の合成この 実施例は、高分子量ポリサン力ライドーデフエ口キサミンー第２鉄付加物を合成 するためのデフェロキサミン（ＤＦＯ）のポリサッカライドヒドロキシエチル澱 粉（ＨＥＳ）への結合および第２鉄によるコンジュゲートの飽和を述べる。

ヒドロキシエチル澱粉−デフエロキサミノコンジニゲート。ヒドロキシエチル澱 粉（ＨＥＳ）（ヘタスターチ、デュポン・クリティカル・ケアー、ウオークガン 、イリノイ州）を濃度１リツトル当たり１００グラムで水に溶解した。ンスージ オールの開裂は最終量１００ｍＭになるように固体メタ過ヨウ素酸の添加により 行い、反応性アルデヒドを得た。溶液を１時間室温でインキュベーションした。

低分子量産物は、１０００００分子量除去フィルター（ミリポア・コーポレイシ ョン）を使用し脱パイロジエン水で限外濾過（ぺり＝ン・システム、ミリポア・ コーポレイション、ベトフォーフォード、マサチューセッツ）して除去した。ポ リマー濃度は溶液の屈折指数を基にして１００グラム／リツトルに合わせた。

デフェロキサミンはメジラード塩として最終濃度１００ｍＭになるように添加し 、室温で十分溶解させた。得られたデフエロキサミンのアミノ基とポリマーのア ルデヒド基の間のノソフ塩基は水素化シアノはう素ナトリウムを最終濃度１００ ｍＭになるように添加して還元した。室温で１時間後、水素化はう素ナトリウム を最終濃度１００ｍＭで残っているかもしれないアルデヒド基を還元するために 添加した。反応混合物は緩やかに１６時間室温でかき混ぜた。

ポリマー−デフエロキサミンコンジュゲートの濃縮および低分子量不純物の除去 は３００００分子量除去フィルターおよびパイロジエン非存在水を使用した限外 濾過で行った。ポリマー−デフエロキサミンコンジュゲートの濃度は屈折指数を 基にして１３０グラム／リツトルにあわせた。

ＨＥＳ−ＤＦ○コンツユゲートの第２鉄による飽和。

一定量のＨＥＳ−デフエロキサミンコンジュゲート溶液を取出し、デフェロキサ ミン濃度をスペクトル分光光度的に４２９ｎｍで過剰の硫酸第１鉄を加えた後測 定した。ポリマーーデフエロキサミンコンジュゲートから鉄飽和ポリマーデフェ ロキサミンー第２鉄形への変化は塩化第２鉄によるデフエロキサミンの９４−９ ６％滴定により成し遂げた。塩化第２鉄保存溶液（３００ｍＭ）の一定量をかき 混ぜなからポリマー−デフェロキサミン溶液に添加した。塩化第２鉄を添加した 後、１Ｍ水酸化ナトリウムをｌ）Ｈが中性になるまで添加した。材料を領２ミク ロンフィルターで濾過し、滅菌プラスチックバッグに移した。

とドロキシエチル澱粉−デフェロキサミンー第２鉄付加物の分子量分布は高速液 体クロマトグラフィーによって測定し、ヒドロキシエチル澱粉−デフェロキサミ ン：ンジュゲートの時と変化しなかった。

同じ方法がイヌリン、ヒアルロン酸またはテキストランをポリマー分子として含 む付加物の合成に使用し得る。天然の形では比較的溶解しに（いイヌリンの場合 、イヌリンーデフエロキサミンコンジュゲートを以下のキレートの付加によりさ らに溶解性にする。

実施例ＩＩ トランスフニリン、デフエロキサミン、および第２鉄を含む付加物の合成。

この実施例は高分子量蛋白−デフエロキサミンー第２鉄付加物を形成するための デフエロキサミンの蛋白トランスフェリンへの結合および第２鉄による飽和を記 載する。

デフエロキサミンをゲルタールアルデヒド架橋によりトランスフェリンに結合さ せた。最初に、デフェロキサミンーグルクールアルデヒドコンジュゲートを、か き混ぜながら１００ｍＭのゲルタールアルデヒド溶液に１００ｍＭのデフェロキ サミン溶液を添加することにより製造した。得られた溶液は主としてデフェロキ サミンーグルタールアルデヒドコンジュゲートを小量のデフェロキサミンーグル タールアルデヒドーデフエロキサミン結合体、非反応ゲルタールアルデヒドおよ び非反応デフエロキサミンと共に含む。

トランスフェリンの鉄飽和形であるひとホロトランスフェリンをシグマ・ケミカ ル・カンパニー、セントルイス、モナコから購入した。４５■１のトランスフェ リンの１０％溶液を等量のデフェロキサミンーグルクールアルデヒド含有上記製 造溶液と反応させた。トランスフェリンを等量の食塩水と混合した対照溶液は対 照として製造した。デフェロキサミンーグルタールアルデヒド付加物の最終混合 物での濃度は、５％または０．６２ｍＭ蛋白と比較して２５ｍＭである。

１０分のインキュベーションに続いて、２．２５ｍ１の１００ｍＭ水素化シアノ はう素ナトリウムを反応溶液に添加した。対照溶液は同様に希釈した。１０分の インキュベーションに続いて、両方の溶液を非反応低分子用物質を除去するため に食塩水に対して透析した。

一晩の透析の後、反応溶液中のトランスフェリンの濃度は０．３０および対照溶 液中は０２２ｍＭであった。これらの溶液をついで領１２５ｍＭに希釈し、続い て過剰の硫酸鉄を添加し、４２９止の吸光度はトランスフェリン分子に対して多 くのデフニロキサミン分子が結合子でいることを証明した。以下の値が得られた ・ 表１ 反応溶液　吸光度 （４２０ｎｍ） Ａ、トランスフェリンーデフエロキサミン十食塩水　０．５３６Ｂ　トランスフ エリンーデフエロキサミン士硫酸第１鉄１　１．７９０対照溶液 Ｃ，トランスフニリンーデフエロキサミン〒食塩水　０．４９９Ｄ、）ランスフ 二リンーデフエロキサミン＋硫酸第１鉄’　０．６０４１溶液ＢおよびＤ（対照 ）の硫酸第１鉄の最終濃度は１０ｍＭ；　１０ｍＭの硫酸第１鉄の４２９止での 吸光度は０．０１０゜対照トランスフニリン溶液への硫酸第１鉄添加時の０．１ ０５単位の吸光度上昇（溶液Ｄ（０，６０４）引く溶液Ｃ（０，４９９））は蛋 白への第２鉄の非特異的結合を示す。硫酸第１鉄をトランスフニリンーデフエロ キサミン＝ンジュゲートを含む溶ｅＢへ添加後の光学密度の上昇は、第２鉄がデ フエロキサミンへ結合したことを示す。トランスフニリンーデフェロ上サミンコ ンジュゲートを嶽独で含む溶液Ａは領５３６の光学密度を持つ、溶液Ｂでは、結 合体への硫酸第２鉄の添加が光学密度１７９０または１２５４の上昇を示す（溶 液Ｂ　（１，７９０）引く対照溶液Ａ（０，５３６）。トランスフェリン蛋白に 対する第２鉄の非特異的結合により得られた光学密度（溶液り引くＣ１または領 １５０）を次に１．２５４の値から引いて、光学密度１．１４９のトランスフニ リンーデフェロキサミンー硫酸鉄第１溶液Ｂの正味の上昇を示す。

デフエロキサミンのミリモル消滅係数が２．３であるため、この観察値は０．５ ｍＭデフエロキサミンに対応する。対照および反応溶液のトランスフェリン蛋白 の濃度は０．１２５ｍＭである。従って、それぞれのトランスフェリン分子は平 均で４個の結合デフエロキサミン分子を持つ。

溶液Ｂの吸光度の観察された変化がデフエロキサミン結合を示すかどうか決定す るために、溶液Ｂの材料をトリクロロ酢酸で沈澱させた。上清を次に中性化し、 光学密度を４２９ｎｍで測定した。この対照実験は１０％以下のデフェロキサミ ンが上清に残っていることを明らかにした。従って、９０％以上のデフエロキサ ミンが蛋白と結合した。

デフニロ千サミン濃度の計算に続いて、大量のトランスフエリンーデフエロキサ ミンー第２鉄付加物を計算量の硫酸アンモニウム第１鉄のような鉄塩をトランス フエリンーデフェロキサミン溶液に添加することにより製造し得る。通常の食塩 水に対する透析濾過に続いて、調製物は濾過滅菌し、凍結乾燥してまたはそのま ま５％溶液として使用した。

デフェロキサミンーグルタールアルデヒドの蛋白への比が変えることにより、１ ０モルの多さのデフニロキサミンを蛋白に結合し得る。しかしながら、このよう な調製物はポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った場合、有意な量の架橋蛋白 を示す。好ましくは、デフエロキサミンの蛋白に対する比は、約４−６モルデフ ニロキサミン、１モル蛋白である。

トランスフェリンーデフニロキサミ〉−第２鉄付加物はまたＨｅＬａ細胞上のひ とトランスフェリン受容体結合に一定の親和性を持つ。修飾蛋白−デフエロキサ ミンコンジュゲートによる不変蛋白因子の特徴であり得る特異的受容体結合親和 性の保持は、高濃度のトランスフェリン受容体をもつ細胞および組繊の結合とそ れに続く映像増強を成し遂げるために重要なパラメーターである。従って、本発 明の付加物はその蛋白分子に受容体結合親和性を残しているのが好ましい。

実施例■ ヒドロキシエチル澱粉−デフエロキサミンー第２鉄付加物の磁気共鳴特性デフエ ロキサミンー第２鉄複合体またはフェロキサミンの緩和性の研究は、数人の研究 者が行っている。研究は、この金属複合体のミリモル緩和性は１．０ｓ−１以よ り少し下であることを示唆した。２０ＭＨｚで１．３７５−’の値がウェスベイ たおよびウォラーら（１９８４年）によって報告された。５０ＭＨｚでより低い 値０．９−’がまた報告され、２０ＭＨ２で１．０−１．１の値に対応している ようである。２０ＭＨｚで１．８の値がまた報告された。研究は、ヒドロキシエ チル澱粉（ＨＥＳ）のデフエロキサミンー第２鉄への結合のミリモル緩和性はミ リモル値で２．０に近いことを示す。この示唆は、結合キレート化剤の回転自由 度の遅くなることの予期と付合する。Ｈ，ＥＳ−デフェロキサミンー第２鉄コン ジュゲートの２０ＭＨｚで１．６”の値が得られた。

実施例Ｉｖ 犬におけるヒドロキシエチルーデフエロキサミンー策２鉄の注入に続く虚血損傷 に対する血液勧学的効力および影響 ３種のデフェロキサミンを虚血損傷の２次的な心筋機能に対する影響に従って試 験するモデルをデザインした。“気を失った心筋−モデルでは、心臓の明確な部 位を短時間の虚血損傷に曝した。これらの虚血損傷は、血管形成術および他の心 臓過程の後に続く心筋傷害に対応する。

心筋機能に対する効力は、デフェロキサミン（ＤＦＯ）　、低分子量形のヒドロ キシエチル澱粉（ＨＥＳ−ＤＦＯ）へ結合したデフ二口キサミノコンジニゲート 、および９０−９５％の鉄部位が第２鉄で飽和されているヒドロキシエチルーデ フエロキサミンコンジュゲート（ＨＥＳ−ＤＦＯ）を使用して測定した。ＨＥＳ −ＤＦＯ−第２鉄のＤＦＯおよびＨＥＳ−ＤＦＯとの関連における生理学的効力 は、ヒドロキシエチル澱粉−デフェロキサミンー第２鉄のＭＲ映像造影剤として の適性を測定するため研究した。

デフェロキサミンおよびＨＥＳ−デフェロキサミンの両方とも、虚血および再潅 流により２次的に起こる傷害により媒介される酸素ラジカルに対して虚血組織を 保護することが示された（ポリ−ら、アメリカン・ジャーナル・オン・フィジオ ロジー、ハート・サーキュレーション・フィノオロジー２２巻Ｈ１２７２−Ｈ１ ３８０頁（１９８７年）、ファーバーら、サーキュレーション・リサーチ６３巻 ３５１−３６０頁（１９８８年））。ＭＲ造影剤は好ましくはこのような傷害を 改良も悪化もさせず、単純にＭＲ映像の質を増強する。同様に、デフエロキサミ ンおよびフェロキサミンの両方とも静脈に投与したとき有意な毒性を伴うことが 示されている。この毒性はそれ自身時に重いこともある低血圧により明白で有り 得る。好ましいＭＲ＠像促進剤は血管組織に高濃度で投与されたときでさえ、不 利な血液勧学的効果の原因にならない。

方法。

ＨＥＳ　デフェロキサミンコンジュゲートおよびＨＥＳ−デフエロキサミンー第 ２鉄付加物の物理的特性は犬の気を失った心筋モデルで特徴付けおよび比較した 。

成熟雄および雌雑種犬を麻酔し、バーバード呼吸器で１０−１５回呼吸／分で通 気量１５ｉ１／ｋｇで通気した。不全拡張は、末端での呼気の圧力をトラップに より５　７ｃｒ＋水柱Ｉこ維持することにより予防した。体温は加温パッドで３ ８℃に維持した。実験の間中ＤＨ，Ｉ）ＯＸおよびｐｃｏ２は呼吸の速度および 用量をｉ！５Ｌ、および二炭酸ナトリウムおよび１００％酸素を導入することに より生理学的濃度に維持した。

動脈血圧および左心室の圧力は動脈および左心室に頚動脈を通って二本の圧変換 器チップ付きカテーテルを挿入することにより追跡した。左心室ｄＰ／ｄｔは心 室圧力パルスによる電気的な変化により測定した。

左頚静脈にデフェロキサミン（ＤＦＯ）、ヒドロキシエチル澱粉−デフェロキサ ミンコンジュゲート（ＨＥＳ−ＤＦＯ）およびヒドロキシエチル−澱粉−デフエ ロキサミンー第２鉄付加物（ＨＥＳ−ＤＦＯ−第２鉄）を投与するために配管し た。

左開胸術は三番目の肋骨内部で行い、心腹切開し心臓を離被架中で懸濁した。

左前下降冠状情動＠　（ＬＡＤ）の一部を最初の対角線分枝から離れて分離し、 および電磁フロープローブを血管の回りに！いた。ＬＡＤ血流は流量測定器で測 定した。フロープローブから離れて、ミクロメーター推進機械的閉塞器がＬ　Ａ 　Ｄの全部の流れを閉塞するためおよびその後再潅流をさせるために置かれた。

心拍は１５０ビ一ト／分の速度にした。

セグメント短縮％または８８％で表した虚血／再潅流に続く改変心筋機能として の心筋セグメント機能はＬＡＤにより潅流されている場所および左湾曲経路冠状 環動脈で二セットの圧電結晶を使用して測定した。それぞれの結晶の導線は、二 つの結晶の間に伝達される音パルスをそれらの間の距離に比例する電気信号に変 える超音波増幅器と接続した。これらの追跡は、オンロスコープで追跡した。

８８％は以下の式により計算した：ＳＳ％＝　（ＤＬ−９Ｌ）／ＤＬＸ１００式 中ＤＬは拡張期の断片の長さおよびＳＬは収縮期の長さである。

領域の心筋血流はミクロスフニア−技術を用いて測定した。左心房付属物および 右大腿部動脈にマイクロスフェア−の投与および参考血流サンプル採取のために 配管した。放射活性マイクロスフェア−（直径１５＝３ｍ）を左動脈に注入し６ １の食塩水で洗浄した。マイクロスフェア−の投与前に、参考血流サンプルを大 腿部動脈から２−３分間一定速度で採取した。

それぞれの実験の終了後、インドインクを虚血ベッドサイズを描出するためにフ ロープローブの位置において動脈潅流圧でＬ　Ａ　Ｄに注入した。ついで、心臓 を摘出し、−晩１０％ホルマリンに保存した。次の日、心臓の心臓外膜下および 心筋中および心内膜下の正常および虚血部位の両方で切片をとり、サンプルの重 量を測定した。それぞれのサンプルの放射活性をガンマ−カウンターで測定した 。

ｌｌ考血流測定値を使用して、心筋および経！血流を測定した。

ＤＦＯ，ＨＥＳ−ＤＦＯおよびＨＥＳ−ＤＦＯ−蔦２鉄の血中濃度は、大腿部動 脈から得られた血液サンプルの冠状環閉塞の前、途中および後で得た。血液サン プルは遠心し血漿サンプルは一７０℃で後の分析のために保存した。これらの測 定の方法は、参考として本明細書に包含されているホールウェイら、ブロシーデ インダス・オン・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンシズ・ニーニスニー 、８６巻：１０１０８−１０１１２頁（１９８９年）に記載されている。

外科的ｗｌ製および安定化の後、血液勧学的対照測定値を得、放射活性マイクロ スフェア−を領域の心筋血流を測定するために投与した。４つの群の犬を使用し た。１つの群は食塩水を投与し、他の群は５０　ｍｇ／ｋｇのデフェロキサミン または等量のデフエロキサミンー第２鉄（フェリオキサミン）を３０分前および 閉塞の時間の１５分の間に投与した。溶液は２．３ｍｌ／分で注入した。最後に 、閉塞器をゆっくり開放し、Ｌ　Ａ　Ｄを３時間潅流した。この間、連続して血 液動力学的測定を行った。放射活性マイクロスフェア−は閉塞の１２分目および 再潅流の３０および１８０８０分目入した。

溶液は１０％ＨＥＳ−ＤＦＯまたは１０％ＨＥＳ−ＤＦＯ−第２鉄を生理食塩水 中に含む。本研究で使用した調製物の分子量は血管内の半減期が約２時間である ２００００である。ＨＥＳ−ＤＦＯコンジュゲートおよびＨＥＳ−ＤＦＯ−第２ 鉄付加物のキレート剤含有率は約１５％（Ｗ／Ｗ）であった。これらの調製物に おけるデフエロキサミンおよびデフェロキサミンー第２鉄（フェリオキサミン） の濃度は２８ｍＭであった。利用できる鉄結合部位の測定含量を基にして、ＨＥ Ｓ−ＤＦＯを含む溶液に塩化第２鉄としての第２鉄を０．９５等量加えてＨＥＳ −ＤＦＯ−第２鉄を調製した。得られた酸性溶液は水酸化ナトリウムで中性化し 、使用前に濾過した。

結果 技術的な理由のためまたは心室細動のため死亡した二とによる動物の排除後、２ ７匹の動物が本研究に含まれた。データの分析は９匹の対照穴、７匹のＨＥＳ− デフエロキサミノコンンユゲート処理大、５匹のＨＥＳ−デフェロキサミンー第 ２鉄付加物処理大および対照として６匹デフェロキサミン鳳独処理犬により行っ た。左心室および危険領域の大きさは本研究で使用した犬ではほとんど同様であ ったため、４つの群の間で等量の潅流ベッド領域が虚血の対象となった。

１、血液勧学 基底およびベース化鼓動速度に対象動物における差は観察されなかった。さらに 、対照（ＤＦＯ）　、ＨＥＳ−ＤＦＯおよｃＦＨＥｓ−ＤＦＯ−第２鉄群におい ｃ実験の開蓋が観察されなかった。これらの結果はＨＥＳ−ＤＦＯ−第２鉄付加 物が血液勧学上の安定性に変化を起こす原因とならないことを示す。しかしなが ら、ＤＦＯ群動物では、薬注入の間有意な平均動脈圧減少が観察された。したが ってＤＦＯが緩徐かつ制御下に送達された場合でも、有為な血圧低下の原因とな る。

４つの群で、虚血の前、閉塞の間および再潅流の開領域の心筋血流に差は観察さ れなかった。したがって、ＨＥＳ−ＤＦＯ−第２鉄付加物は正常のおよび傷害を 受けた心臓冠状環血流に影響を与えなかった。

２、心筋機能 心筋断片機能は断片の短縮または８８％で示した。非虚血（ＬＣＸ）領域におけ る心内膜下壁機能の差は４つの群で観察されなかった。虚血ＬＤＡ領域では４つ の群全部で８８％の同様の減少があり、それは受動心臓収縮延長を示す。

再潅流の間、８８％の回復は食塩水およびＨＥＳ−デフエロキサミンー第２鉄処 理動物で同様であった。これはＨＥＳ−デフエロキサミンー第２鉄付加物は虚血 の間に起る傷害に防御および悪化の両件用ともしないことを示す。これらの結果 は図１に示すように８８％が食塩水およびＨＥＳ−デフエロキサミンー第２鉄処 理動物より有意に上昇したＨＥＳ−デフェロキサミン処理動物で対竪的である。

これはＨＥＳ−デフエロキサミンのキレート能が虚血および再潅流による傷害を 弱める働きのあることを示唆する。加えて、ＨＥＳ−ＤＦＯ−第２鉄付加物に残 留コロイド保護作用は観察されなかった。従ってＨＥＳ−ＤＦＯはＨＥＳ−ＤＦ Ｏコンジュゲートの保護効果は鉄キレート特性に帰すことができる。

３、キレート結合体の血漿レベル ＤＦＯ，ＨＥＳ−ＤＦＯおよびＨＥＳ−ＤＦＯ−第２鉄血漿中濃度を図２に示す 。５０ｍｇ／ｋｇのＨＥＳ−ＤＦＯまたはＨＥＳ−ＤＦＯ−第２鉄の４５分にわ たる注入により、得られる血漿濃度は約１．０ｍＭであった。ＤＦＯの最大血漿 濃度は約１４ｍＭに到達し、それから急速に減少した。

要約 要約として、ヒドロキシエチル澱粉−デフエロキサミンー第２鉄付加物は５０ｍ ｇ７′ｋｇデフエロキサミンー第２鉄（フェリオキサミン）と等量静脈注入した 場合、観察可能な毒性の原因とはならなかった。心筋機能に対するＨＥＳ−デフ エロキサミンー第２鉄付加物の効果は、等量の食塩水ど識別不能であり、心臓に いかなる防御または悪化作用もないことを示す。ミリモル範囲の血漿濃度は付加 物の注入の終了後３０分にわたって続いた。

セグメント短縮％（対照の％） ○ 〜 血漿濃度（ｍＭ） 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８）

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. １．ポリマーに共有結合したデフェロキサミン部分のコンジュゲートおよびデフ ェロキサミン部分にキレート化した第２鉄の付加物を含む、ほ乳類の身体系の磁 気共鳴映像注に使用するに適した組成物。
2. ２．デフェロキサミンの量が組成物の総重量に対して約３〜４０重量％である、 請求項１記載の組成物。
3. ３．デフェロキサミンの量が組成物の総量量に対して約１０〜２５重量％である 、請求項１記載の組成物。
4. ４．第２鉄の量が組成物の総重量に対して約０．３〜４重量％である、請求項１ 記載の組成物。
5. ５．第２鉄の量が組成物の総重量に対して約１〜２．５重量％である、請求項１ 記載の組成物。
6. ６．利用可能なデフェロキサミン部分の少なくとも約９０〜９６％が第２鉄と複 合体形成している、請求項１記載の組成物。
7. ７．付加物がゲル浸透クロマトグラフィーで測定して約５．０００〜２５０，０ ００ダルトンの分子量をもつ、請求項１記載の組成物。
8. ８．付加物がゲル浸透クロマトグラフィーで測定して約１０．０００〜５０．０ ００ダルトンの分子量をもつ、請求項１記載の組成物。
9. ９．ポリマーが水不溶性である、請求項１記載の組成物。
10. １０．ポリマーがセルロースまたはアガロースである、請求項９記載の組成物。
11. １１．ポリマーが水溶性である、請求項１記載の組成物。
12. １２．ポリマーが蛋白質または多糖類である、請求項１１記載の組成物。
13. １３．ポリマーが蛋白質血清アルブミンまたはトランスフェリンである、請求項 １２記載の組成物。
14. １４．ポリマーが多糖類デキストラン、でんぷん、ヒアルロン酸、イヌリンまた はセルロースである、請求項１２記載の組成物。
15. １５．多糖類がヒドロキシエチルでんぶんである、請求項１４記載の組成物。
16. １６．付加物が脈管系、胃腸系、生殖秘尿系、リンパ系または脳脊髄系の磁気共 鳴映像法におけるコントラストを増強する能力をもつ、請求項１記載の組成物。
17. １７．付加物が組織灌流および脈管漏出の磁気共鳴検出を可能にする、請求項１ ６記載の組成物。
18. １８．付加物が少なくとも約３０〜９０分間の脈管内保持能力をもつ、請求項１ 記載の組成物。
19. １９．付加物が磁気共鳴映像注の施行後２４時間以内に身体から排出され得る、 請求項１記載の組成物。
20. ２０．ポリマーに共有結合したデフェロキサミン部分のコンジュゲートおよびデ フェロキサミン部分にキレート化した第２鉄の付加物を、医薬として許容される 担体と共に含み、上記付加物が患者の身体系の磁気共鳴映像化の増強に有効な量 で存在する、ほ乳類の身体系の磁気共鳴映像法に使用するに適した医薬組成物。
21. ２１．（ａ）造影剤が身体系に分布するようにほ乳類に造影剤を投与し、上記剤 はポリマーに共有結合したデフェロキサミン部分のコンジュゲートおよびデフェ ロキサミン部分にキレート化した第２鉄の医薬として許容される付加物を含み、 Φ）磁気共鳴映像法により系またはその一部分の磁気映像を測定することを含む 、ほ乳類の身体系の磁気共鳴映像化法。
22. ２２．脈管系内の特徴が強調される、請求項２１記載の方法。
23. ２３．剤が静脈内投与される、請求項２１記載の方法。
24. ２４．剤が経口または直腸投与される、請求項２１記載の方法。
25. ２５．剤が系内への直接注入により投与される、請求項２１記載の方法。