CN114460163B - 一种检测生物组织铁含量的maldi质谱成像方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测生物组织铁含量的MALDI质谱成像方法，具体包括以下步骤：(1)将去铁胺溶解在生理盐水中，得到去铁胺溶液；(2)小鼠尾静脉注射去铁胺溶液，等待后选取小鼠的生物组织和血清；(3)将生物组织冰冻后切片，将血清滴加在载玻片上，并在载玻片上喷涂基质；(4)MALDI质谱成像仪扫描样品区域，测定去铁胺和铁胺的表达水平。本发明质谱成像方法针对性更强，更具有检测意义，并且可以对生物组织切片进行原位成像，解决了现有技术只能检测总铁含量的技术难题。

Description

一种检测生物组织铁含量的MALDI质谱成像方法
技术领域
本发明涉及分析检测技术领域，更具体的说是涉及一种检测生物组织铁含量的MALDI质谱成像方法。
背景技术
目前，生物组织样本或血液里铁含量的检测方法有电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)或者原子吸收(AAS)。但是，该技术方法需要将生物组织样本进行消解，而且只能测定生物组织样本中的总铁含量，却无法对生物组织样本进行原位成像。
因此，如何快速有效地检测生物组织铁含量是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测生物组织铁含量的MALDI质谱成像方法，以解决现有技术中的不足。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种检测生物组织铁含量的MALDI质谱成像方法，具体包括以下步骤：
(1)将去铁胺溶解在生理盐水中，得到去铁胺(DFO)溶液；
(2)小鼠尾静脉注射去铁胺溶液，等待后选取小鼠的生物组织和血清；
(3)将生物组织冰冻后切片，将血清滴加在载玻片上，并在载玻片上喷涂基质；
(4)MALDI质谱成像仪扫描样品区域，测定去铁胺和铁胺(FO)的表达水平。
进一步，上述步骤(1)中，去铁胺溶液的浓度为50mg/mL。
采用上述进一步技术方案的有益效果在于，DFO能与铁蛋白、含铁血黄素以及自由铁中的铁离子相结合并反应生成FO，但对转铁蛋白中的铁离子清除作用不强，更不能清除血红蛋白、肌球蛋白和细胞色素中的铁离子。
进一步，上述步骤(2)中，注射去铁胺溶液的体积为125μL；等待的时间为5min；生物组织包括肝脏、脾脏和肾脏。
采用上述进一步技术方案的有益效果在于，等待5min后，生物组织中DFO含量水平最高。
进一步，上述步骤(3)中，切片的厚度为15μm；血清的滴加体积为0.15μL；基质为2,5-二羟基苯甲酸(DHB)基质。
采用上述进一步技术方案的有益效果在于，质谱成像技术要求冰冻切片的厚度一般不大于20μm，否则不利于成像的分辨率，如果组织切片太薄(低于10μm)则对切片的质量不能保证，尤其是肝脏组织。折中考虑我们选择组织切片的厚度为15μm，可以满足实验要求。血清的体积没有特殊要求，是根据检测时间来优化的，体积越大在载玻片上形成的样品面积越大，增加了检测时间，因此在满足实验要求的条件下，我们选择了0.15μL的血清体积，既可以用移液枪准确量取，又使检测时间合理可行。DHB是MALDI质谱成像仪常用的一种基质，主要作用有以下几个方面：1.把样品分子隔离开；2.吸收激光能量；3.提供卷流，将样品分子送入气相；4.提供反应离子，将样品离子化。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1、本发明是以质谱技术为基础的成像方法，该方法通过MALDI离子源直接扫描生物组织样品成像，可实现不同分子的空间分布特征。
2、本发明质谱成像方法对生物组织切片可以进行原位成像，不同组织以及组别之间可进行相互比较，与现有技术相比更直观形象，而且对于血清中的DFO和FO含量还可以进行定量。
3、本发明质谱成像方法针对性更强，更具有检测意义，并且可以对生物组织切片进行原位成像，解决了现有技术只能检测总铁含量的技术难题。
附图说明
图1为DFO标准曲线；
图2为FO标准曲线；
图3为注射去铁胺溶液0min后肝脏中DFO含量水平；
图4为注射去铁胺溶液5min后肝脏中DFO含量水平；
图5为注射去铁胺溶液15min后肝脏中DFO含量水平；
图6为注射去铁胺溶液30min后肝脏中DFO含量水平；
图7为注射去铁胺溶液0min后脾脏中DFO含量水平；
图8为注射去铁胺溶液5min后脾脏中DFO含量水平；
图9为注射去铁胺溶液15min后脾脏中DFO含量水平；
图10为注射去铁胺溶液30min后脾脏中DFO含量水平；
图11为注射去铁胺溶液0min后肾脏中DFO含量水平；
图12为注射去铁胺溶液5min后肾脏中DFO含量水平；
图13为注射去铁胺溶液15min后肾脏中DFO含量水平；
图14为注射去铁胺溶液30min后肾脏中DFO含量水平；
图15为注射PHZ溶液和DFO溶液5min后肝脏中DFO的含量水平；
图16为注射PHZ溶液和DFO溶液5min后肝脏中FO的含量水平；
图17为注射PHZ溶液和DFO溶液5min后脾脏中DFO的含量水平；
图18为注射PHZ溶液和DFO溶液5min后脾脏中FO的含量水平；
图19为注射PHZ溶液和DFO溶液5min后肾脏中DFO的含量水平；
图20为注射PHZ溶液和DFO溶液5min后肾脏中FO的含量水平；
图21为注射PHZ溶液和DFO溶液5min后血清中DFO的含量水平；
图22为注射PHZ溶液和DFO溶液5min后血清中FO的含量水平。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
检测生物组织铁含量的MALDI质谱成像方法，具体包括以下步骤：
(1)将去铁胺溶解在生理盐水中，得到浓度为50mg/mL的去铁胺溶液；
(2)小鼠尾静脉注射去铁胺溶液125μL，等待5min后选取小鼠的肝脏和血清；
(3)将肝脏冰冻后切片15μm，将0.15μL血清滴加在载玻片上，并在载玻片上喷涂2,5-二羟基苯甲酸基质；
(4)MALDI质谱成像仪扫描样品区域，测定去铁胺和铁胺的表达水平。
实施例2
检测生物组织铁含量的MALDI质谱成像方法，具体包括以下步骤：
(1)将去铁胺溶解在生理盐水中，得到浓度为50mg/mL的去铁胺溶液；
(2)小鼠尾静脉注射去铁胺溶液125μL，等待5min后选取小鼠的脾脏和血清；
(3)将脾脏冰冻后切片15μm，将0.15μL血清滴加在载玻片上，并在载玻片上喷涂2,5-二羟基苯甲酸基质；
(4)MALDI质谱成像仪扫描样品区域，测定去铁胺和铁胺的表达水平。
实施例3
检测生物组织铁含量的MALDI质谱成像方法，具体包括以下步骤：
(1)将去铁胺溶解在生理盐水中，得到浓度为50mg/mL的去铁胺溶液；
(2)小鼠尾静脉注射去铁胺溶液125μL，等待5min后选取小鼠的肾脏和血清；
(3)将肾脏冰冻后切片15μm，将0.15μL血清滴加在载玻片上，并在载玻片上喷涂2,5-二羟基苯甲酸基质；
(4)MALDI质谱成像仪扫描样品区域，测定去铁胺和铁胺的表达水平。
性能测试
1、质谱检测的过程中发现DFO和FO标准品的分子量分别为583.34265和636.25421，并分别用不同浓度的DFO和FO标准溶液利用质谱成像技术做出标准曲线。结果如图1和图2所示。
图1为DFO标准曲线，图2为FO标准曲线。
2、各取实施例1-3注射去铁胺溶液5min后的生物组织，并分别以注射去铁胺溶液0min、15min和30min后的生物组织作为对比，后续按照实施例1-3步骤进行，检测其DFO含量水平。结果如图3-14所示。
图3-6依次为注射去铁胺溶液0min、5min、15min和30min后肝脏中DFO含量水平；图7-10依次为注射去铁胺溶液0min、5min、15min和30min后脾脏中DFO含量水平；图11-14依次为注射去铁胺溶液0min、5min、15min和30min后肾脏中DFO含量水平。
由图3-14可知，注射去铁胺溶液5min后的生物组织中DFO含量水平最高。因此，本发明采用“小鼠尾静脉注射去铁胺溶液125μL，等待5min后选取小鼠的肾脏和血清”，以获得最准确的质谱成像结果。
3、苯肼(PHZ)是一种有毒化合物，可以作为氧化损伤性溶血剂，常用于建立溶血性贫血的动物模型。小鼠腹腔注射PHZ溶液，PHZ溶液的浓度为10mg/mL(PBS pH＝7.4)，用量为60mg/kg，后续按照实施例1-3步骤进行，检测其DFO和FO的含量水平。结果如图15-22所示。
图15和图16依次为注射PHZ溶液和DFO溶液5min后肝脏中DFO和FO的含量水平，图17和图18依次为注射PHZ溶液和DFO溶液5min后脾脏中DFO和FO的含量水平，图19和图20依次为注射PHZ溶液和DFO溶液5min后肾脏中DFO和FO的含量水平，图21和图22依次为注射PHZ溶液和DFO溶液5min后血清中DFO和FO的含量水平。
由图15-22可知，PHZ组的生物组织和血清中的DFO水平都显著降低，而FO水平主要在脾脏和血清中上升，所以当小鼠发生溶血后，血清中的不稳定铁含量升高，并且脾脏中铁水平也有上升趋势。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (8)

1.一种检测生物组织铁含量的MALDI质谱成像方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)选取死亡后小鼠的生物组织和血清；所述小鼠在死亡前被静脉注射去铁胺溶液并且等待一段时间，所述去铁胺溶液是将去铁胺溶解在生理盐水中得到的；
(2)将生物组织冰冻后切片，将血清滴加在载玻片上，并在载玻片上喷涂基质；
(3)MALDI质谱成像仪扫描样品区域，测定去铁胺和铁胺的表达水平。
2.根据权利要求1所述的一种检测生物组织铁含量的MALDI质谱成像方法，其特征在于，步骤(1)中，所述去铁胺溶液的浓度为50mg/mL。
3.根据权利要求1所述的一种检测生物组织铁含量的MALDI质谱成像方法，其特征在于，步骤(1)中，所述注射去铁胺溶液的体积为125μL。
4.根据权利要求1所述的一种检测生物组织铁含量的MALDI质谱成像方法，其特征在于，步骤(1)中，所述等待的时间为5min。
5.根据权利要求1所述的一种检测生物组织铁含量的MALDI质谱成像方法，其特征在于，步骤(1)中，所述生物组织包括肝脏、脾脏和肾脏。
6.根据权利要求1所述的一种检测生物组织铁含量的MALDI质谱成像方法，其特征在于，步骤(2)中，所述切片的厚度为15μm。
7.根据权利要求1所述的一种检测生物组织铁含量的MALDI质谱成像方法，其特征在于，步骤(2)中，所述血清的滴加体积为0.15μL。
8.根据权利要求1所述的一种检测生物组织铁含量的MALDI质谱成像方法，其特征在于，步骤(2)中，所述基质为2,5-二羟基苯甲酸基质(DHB)。
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