WO2012021046A2 - 요오드를 함유한 방사형상의 고분자 화합물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 ｃｔ용 조영제 조성물 - Google Patents

요오드를 함유한 방사형상의 고분자 화합물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 ｃｔ용 조영제 조성물 Download PDF

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김윤경
김동억
정혜연
최윤희
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한국생명공학연구원
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Definitions

  • the present invention relates to a radial polymer compound containing iodine which can be used as an active ingredient of a CT contrast agent, a method for preparing the same, and a CT contrast agent composition comprising the same.
  • Computed tomography is an imaging technique in which the target area of the human body is irradiated from various directions and collected by a penetrating X-ray detector, and the computer reconstructs the hop aberration difference of the area using a mathematical technique.
  • the technique In other words, the camera rotates 360 ° around the body, and is an imaging technique that recombines numerous 2D X-ray images taken from different angles into computer 3D images. Therefore, such X-ray-based images generally represent bone-based images.
  • the degree of X-ray hops ( ⁇ ) is proportional to the atomic number ( ⁇ and the wavelength of the X-rays ( ⁇ ), ie the degree of X-ray hops ( ⁇ ) is inversely proportional to the energy of X-rays. do.
  • CT provides anatomical information in addition to magnetic resonance imaging (MRI), which differentiates it from PEKpositron emission tomography (SPK) or single photon emission computed tomography (SPECT) imaging, which provides information about physiological and biochemical functions. do.
  • MRI magnetic resonance imaging
  • SPK PEKpositron emission tomography
  • SPECT single photon emission computed tomography
  • CT imaging time is about one tenth or less than MRI, which is considered to be an indispensable diagnostic device for patients with fatal damage to the brain area, especially those who have to make a quick diagnosis.
  • iodine-containing low-molecular CT contrast agents are divided into ionic and nonionic materials.
  • the nonionic material since the nonionic material has much less side effects than the ionic material, most of the patients are currently administered a nonionic CT contrast agent.
  • a nonionic CT contrast agent shares 2-3 conventional low molecular nonionic CT contrast agents containing iodine with one benzene ring.
  • the molecular weight can be increased to extend the residence time slightly compared to conventional single benzene ring-based nonionic contrast agents.
  • these low-molecular CT contrast agents containing iodine generally have a very short residence time (half-life), so they can be administered an excess of 80-90 g in excess of 80-90 g depending on the weight of an adult in one CT scan to obtain an appropriate CT image.
  • a low molecular iodine compound or a derivative thereof may be covalently substituted with a low molecular iodine compound in a polymer skeleton, or a commercially available low molecule iodine in a polymer compound skeleton such as liposomes, micelles and other nanoparticles.
  • a commercially available low molecule iodine in a polymer compound skeleton such as liposomes, micelles and other nanoparticles.
  • Non-Patent Document 2 [A. Sachse, et al. , Invest. Radiol. 1997, 32, 44-50]
  • Non-Patent Document 3 [E. Samei, et al. , Int. J. Nanomedicine 2009, 4, 277-282 and Non-Patent Document 4
  • C.-Y. Kao, et al. , Acad. Radiol. 2003, 10, 475-483 discloses a method for containing a polymer compound-based liposome containing a low molecular CT contrast agent compound or a derivative thereof containing commercially available iodine.
  • Non-Patent Document 5 VS Trubetskoy, et al., J.
  • Non-Patent Document 6 [VP Torchilin, et al. , Acad. Radiol. 1999, 6, 61-65 discloses a method for containing a high molecular compound-based micelle containing a low molecular CT contrast agent compound or a derivative thereof containing commercially available iodine.
  • Non-Patent Document 7 [F. Hyafil, et al. , Nat. Med. 2007, 13, 636-641 discloses a method for containing a low molecular CT contrast agent compound or derivative thereof containing commercially available iodine in polymer compound-based nanoparticles.
  • the carboxylic acid terminal of the iodine compound was capped with an alkyl group to increase hydrophobicity, thereby making it well contained in the nanoparticles.
  • these nanoparticles containing iodine are injected into blood vessels, they can be easily absorbed into macrophage and increase the circulation time in the body. As time passes, inflammation, cancer and arteries are relatively distributed. Accumulation in areas such as hardening and consequently facilitated diagnosis of related diseases through CT imaging.
  • Patent document 1 discloses a contrast agent for CT based on gold (Au) nanoparticles whose surface is substituted with PEG.
  • Non-Patent Document 8 [I.-C. Sun, et al., Chem. Eur. J. 2009, 15, 13341-1334 discloses a contrast agent for CT based on gold nanoparticles coated with heparin.
  • Non Patent Literature 9 [MH Oh et al., J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 5508-5515 discloses a contrast agent for CT based on tantalum oxide nanoparticles of uniform size substituted with PEG and fluorescent material.
  • CT contrast agent based on the metal nanoparticles itself acts as a contrast agent (absorbs X-rays), and the surface of the nanoparticles is coated with PEG or heparin to improve biocompatibility and smooth CT imaging or liver by increasing the circulation time in the body, respectively. It was intended to increase the contrast effect of specific sites through the accumulation of.
  • the various polymer-based contrast agents described above are not only expensive but also have limitations of safety due to long-term accumulation in vivo (ie, half-lives of more than a few decades) without the smooth excretion, or stability of the compound structure, ie
  • the self-assembled structure will be difficult to secure the reproducibility to maintain the original structure stably even in the body environment and to obtain the same performance by obtaining a polymer compound showing the same molecular weight distribution at the time of manufacture. It is expected.
  • the material for human administration based on such a polymer compound there are various challenges to commercialization through practical clinical trials since the toxicity test standards have not yet been established worldwide.
  • CT angiographic contrast agents containing low molecular contrast media containing iodine in liposome form include Fenestra (ART of Canada) and eXIA160 (Binitio Biomedical of Canada), both for animal use only. It is sold.
  • the liposome CT angiography contrast agent is a very expensive price for a single vial (2.5 mL) to be injected into a mouse or rat 5-10 times. The injection of contrast medium through the tail vein of such a small animal is very expensive. It is not easy for basic medical researchers who need to take micro CT scans.
  • a small molecule contrast medium for human body is administered to a micro CT scan using a small animal, it may take at least 1-3 minutes for the animal to be moved to the CT scan immediately after the injection of the contrast medium and the software is operated to start the CT scan. In the meantime, most of the low-molecular contrast agent is discharged into the bladder through the kidneys, so that an adequate level of contrast is not practical. Therefore, in addition to the diagnosis of cardiovascular diseases in which the low-molecular CT contrast agent containing the above-mentioned iodine is excessively administered to humans to obtain an appropriate level of CT images, it is necessary to properly conduct experiments using small animals.
  • Dendrimers are relatively small, treelike or radial-shape polymers, typically less than 10 nm in diameter, that are pure monolecules obtained through stepwise iterative organic synthesis and purification. to be. Unlike most other typical polymers (polydisperse mixtures), dendrimers are always constant and somewhat predictable in certain environments (solvent, pH, temperature, etc.), especially in solution of polymer-based particles It is very advantageous as it can be selectively adapted to various research fields that are sensitive to hydrodynamic diameter.
  • dendrimers include the integrity of chemical structures, the ability to make up the dendrimer, and the subsequent modifications of physicochemical properties, depending on the organic synthesis method applied, and various functional units ( For example, low molecular weight drugs, target materials, surface modifiers, etc.) can be easily substituted into and inside dendrimers, and in biological applications, there is little potential for significant enzymatic degradation in vivo. None can turn etc.
  • Examples of the application of the dendrimer to the biopharmaceutical field include the use of polycationic dendrimers to form a charge complex with anionic genes and to efficiently carry it into cells (gene transfection); In the manner in which a dendrimer used as a drug delivery carrier carries a drug, the drug molecule is physically stored in a porous space in the dendrimer such that the drug is released only in the affected area by a specific stimulus (pH, light, enzyme, etc.).
  • Covalent substitution of the dendrimer in the form of physical encapsulation or prodrug Delivery of the drug at a targeted or controlled release rate through structural modification of the dendrimer carrier; Using a multivalent effect to significantly increase binding affinity upon interaction ions in the extracellular membrane between proteins and carbohydrate ligands; Examples of polysubstituting a small molecule compound based imaging agent into a dendrimer backbone to amplify the signal to enable more effective medical diagnosis; Biocompatible and biodegradation Examples include the manufacture and application of artificial tissue engineering based on biodegradable dendrimer skeletons.
  • Dendrimers were first described as polylysine dendrimers synthesized by Denkewalter in the late 1970s, and their molecular design and synthesis, their physicochemical properties, and basic use cases based on them (eg, self-assembly, Biomimetic systems, etc.), its materials and applications in the medical field have been actively studied.
  • Examples of polylysine dendrimer structures synthesized by Denkewalter are as follows (Patent 2 [US 4,410,688]).
  • PAMAM poly (amidoamine) dendrimers among the types of dendrimers are It was developed by Donald A. Tomalia at Dow Chemical Company in the 1980s, and its internal structure is composed of aliphatic amine group or aliphatic amide group, and its surface is composed of amine group, carboxyl group, and hydroxyl group. It is a functional group.
  • the structure of the 1-4 generation (Gl, G2, G3, and G4) PAMAM dendrimers whose core is ethylenediamine and whose surface is composed of amine groups is as follows.
  • G2 PA A endnmer (2a)
  • PAMAM dendrimers are known to be suitable for in vivo applications among dendrimers and are widely applied in the biopharmaceutical field.
  • dendrimers synthesized through stepwise organic synthesis and purification should in principle be a single molecule
  • commercially available PAMAM dendrimers manufactured by Dendritech, sold by Sigma-Aldrich
  • reactants reagent
  • divergent synthetic method a divergent synthetic method.
  • the mass production of very simple purification only by dialysis method, and relatively undesired side-products similar to the target are produced by the residual reaction product, resulting in incomplete and heterogeneity. Because of the problem of polydispersity index (PDI), ca.
  • PDI polydispersity index
  • Patent Document 3 [ PCT / EP94 / 04245], Patent Document 4 [PCT / EP96 / 02450], Patent Document 5 [PCT / FR92 / 01135], Patent Document 6 [PCT / EP94 / 648203], Patent Document 7 [PCT / EP95 / 730573] , Patent Document 8 [PCT / EP95 / 78263], Non-Patent Document 11 [AT Yordanov, et al., Nano Lett. 2002, 2, 595-599], Non-Patent Document 12 [Y. Fu, et al., Biocon jugate Chem. 2006, 17, 1043-1056).
  • Gd-DTPA gadopentetate dimeglumine
  • Magnevist a representative single low molecular weight compound MRI angiography currently administered to patients in hospitals.
  • Bayer Schering the first company to develop an angiography contrast agent for MRI based on a dendrimer and filed a patent (EP 430863, W0 97/02051, W0 98/24775, W0 98/24774, US 5911971). 17 “(black is called” Gd-DTPA-17 “or” SH L 643 A "; K. Nael, et al., J. Magn. Reson.
  • the radial polymer compound containing iodine characterized in that the biocompatible polymer forms a protective film surrounding the core and the iodine-containing compound substituted therein Biocompatible polymer chains with relatively long lengths of iodine-containing compounds, which significantly improve the duration of contrasting effects and cause toxicities and various adverse reactions substituted near the surface of the core, are significantly improved compared to the conventional low-molecular contrast agent-containing compounds. It forms a protective layer surrounded by layers to prevent their exposure to the external environment, which not only reduces the toxicity in the body, but also prolongs the circulation time by preventing the rapid absorption by macrophages.
  • An object of the present invention is to provide a radial polymer compound containing iodine.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing a radial polymer compound containing the iodine.
  • Still another object of the present invention is to provide a contrast agent composition for CT, comprising the radial polymer compound containing the iodine.
  • the present invention is a central core consisting of a circular or spherical symmetrical low molecular compound, or a radial polymer compound; An iodine-containing compound bonded directly or through a peptide to the core core; And a biocompatible polymer coupled directly or via a peptide to the core, or directly to an iodine-containing compound bound to the core, wherein the biocompatible is such that the core and iodine-containing compound are not exposed in vivo.
  • a radial polymer compound containing iodine having a structure in which a polymer forms a protective film.
  • the present invention comprises the steps of reacting the biocompatible polymer to the portion of the surface functional group of the core consisting of a circular or spherical symmetrical low molecular compound, or a radial high molecular compound (step 1); And reacting the iodine-containing compound to the unreacted surface functional group in the core of step 1 such that the iodine-containing compound is bonded directly or through a temper (step 2). do.
  • the present invention comprises the steps of reacting the iodine-containing compound to the portion of the surface functional group of the core consisting of a circular or spherical symmetrical low molecular compound, or a radial polymer compound (step 1); And a step (step 2) of reacting the biocompatible polymer to the iodine-containing compound bonded to the core in step 1 to provide a method for preparing the radial polymer compound containing the iodine.
  • the present invention comprises the step of reacting the iodine-containing compound is bound through the biocompatible polymer and peptide (step 1); And reacting the iodine-containing compound bound to the biocompatible polymer through the peptide in Step 1 so as to bind to the surface functional group of the core, which is composed of a circular or spherical symmetrical low molecular compound or a radial polymer compound (step 2).
  • Radial polymerization containing the iodine containing Provided are methods for preparing the compound.
  • the present invention provides a contrast agent composition for CT comprising the radial polymer compound containing the iodine as an active ingredient.
  • Radial polymer compound containing iodine according to the present invention is significantly improved the duration of contrast effect compared to the conventional low molecular contrast agent containing iodine, and may cause toxicity and various adverse reactions substituted near the surface of the core
  • a protective film that encloses iodine-containing compounds in a relatively long layer of biocompatible polymer chains prevents their exposure to the external environment, thereby reducing toxicity in the body and preventing rapid absorption by macrophages, thereby circulating in the body
  • extracorporeal discharge is made after proper time elapses after injection into the body, and the production method and purification method is very simple, so that mass production is possible with high yield and low cost, and the polydispersity is very low, making and effect Highly reproducible in terms of radial high iodine content Since all of the structure of the chair consists of a compound covalent bond structurally very stable and can be useful in the preparation of contrast agents for CT.
  • Example 1 is a graph measuring cytotoxicity with a compound according to an embodiment of the present invention.
  • A Example 1, b: Example 2, c: Example 3, d: Example 4
  • Figure 2 is a 2D X-ray radiograph of the CT contrast agent containing a compound according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 3 is an image taken by using a micro CT at 0-4 hours intervals the coronal surface of the rat administered a CT contrast agent containing a compound according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4 is an image taken using a micro CT at 8-48 hours intervals of the coronal surface of the rat administered a CT contrast agent containing a compound according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 is an image taken using a micro CT at 0-4 hours intervals of the sagittal surface of the rat administered a CT contrast agent containing a compound according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 is an image taken using a micro CT at 8-48 hour intervals of the sagittal surface of the rat administered a CT contrast agent containing a compound according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 7 is an image taken by using a micro CT of the coronal plane of the chest and abdomen of the rat administered the CT contrast agent containing the compound according to an embodiment of the present invention, vena (vena cava) and the image for comparing the trend of signal strength in the liver (liver) region.
  • 8 is an image taken by using a micro CT of the coronal plane of the chest and abdomen of the rat to which the CT contrast agent containing the compound according to an embodiment of the present invention, the trend of the signal intensity in the heart (heart) region Image for comparing.
  • FIG. 9 is an image taken using a micro CT of the coronal plane of the brain region of the rat administered a CT contrast agent containing a compound according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 10 is an image taken by using a micro CT of the sagittal plane of the brain region of the rat administered a CT contrast agent containing a compound according to an embodiment of the present invention.
  • the present invention is a core or core consisting of a circular or spherical symmetrical low molecular compound, or a radial polymer compound;
  • Iodine-containing compounds bonded directly to or through a peptide of the core; And a biocompatible polymer that is directly linked to the core or through a peptide or directly to an iodine containing compound bonded to the core.
  • a radial high molecular compound containing iodine having a structure in which the biocompatible polymer forms a protective film so that the core and the iodine-containing compound are not exposed in vivo.
  • the circular or spherical symmetrical low molecular compound constituting the core is ⁇ -, ⁇ - and cyclodextrin, glucose, galactose, mannose, and derivatives thereof.
  • Radial polymer compounds constituting the core include polyamidoamine (PAMAM) dendrimers, polylysine dendrimers, polypropyleneimine (PPI) dendrimers, polyester dendrimers, polyglutamic acid dendrimers, polyaspartic acid dendrimers, and polyglycerides Any one kind of dendrimers selected from the group consisting of dreamers and polymelamine dendrimers, polylysine, polyester, polyglutamic acid, polyaspartic acid, and polyglycene; Any one star-shaped polymer selected from the group consisting of a hyperbranched polymer, polyethylene glycol (PEG), and a copolymer derivative thereof, and derivatives thereof can be used.
  • PEG polyethylene glycol
  • a copolymer derivative thereof and derivatives thereof can be used.
  • a compound represented by the following Chemical Formulas 2, 3, 4 and 10 may be used as a preferred example of the iodine-containing compound.
  • R 1 , R and R are each independently or optionally selected from -NH 2 , -NHR 4 , -NR 4 2 , -NHNH 2 ( -NHNHR 4 , -NHNR 4 2) -OH, -OR 4 , -SH or -SR 4 ,
  • R 4 is —H, —Boc, 6 unsubstituted or substituted straight or branched chain alkyl or hetero Aryl or aryl of 7 to Tero, -alkyl, or unsubstituted or substituted C 5
  • the iodine-containing compounds of Formulas 2, 3 and 4 may be prepared by using the iodine compound represented by the following Formula 1 and Formula 9 as a precursor.
  • the biocompatible polymer may be polyethylene glycol (PEG), hyaluronic acid, heparin and derivatives thereof.
  • the peptide is dilysine, trilysine, tetralysine, diglutamic acid, triglutamic acid, tetraglutamic acid, diaspartic acid, triaspartic acid, tetraaspartic acid And a peptide having 2-4 repeating units selected from the group consisting of dicysteine, tricysteine, tetracysteine, dieserine, triserine, and tetraserine.
  • both ends of the connecting portion may be each independently or selectively.
  • A, - (CH 2) m - , - (CH 2) m (C 0) -, (: three eu 20 cycloalkyl - ((: 3 ⁇ 4) "- , C 4 - 20 aryl - (CH 2 ) m -and
  • the core is an amine group, hydroxy group, hydroxyamine (hydroxyamine) which can be combined with a peptide, an iodine-containing compound or a biocompatible polymer.
  • Carboxyl group carboxyhydrazide group, hydrazine group, thiol group, azide group, alkynyl group, halogen group , aldehyde (aldehyde) group eu ketone (ketone) group, an epoxy (epoxy) group, 3-carboxylic bome rock
  • aldehyde (aldehyde) group eu ketone (ketone) group
  • an epoxy (epoxy) group 3-carboxylic bome rock
  • non-piperidinyl (3-carbomethoxypyrroHdinone) group a tri- (alkoxy of d- 4) - silyl (tri- ( It has one or more surface functional groups, such as a d- 4 alkoxy) -silyl) group.
  • the radial polymer compound containing iodine according to the present invention preferably has an average molecular weight of 8,000-150,000 Da. If the average molecular weight is less than 8,000 Da, the long-term circulation in the blood vessel is not sufficient, and similarly to the low molecular weight compound, it may be discharged relatively quickly through the kidney. Difficulties in infusion and increase in the likelihood of abnormal reaction (shock, allergy, etc.) in the body, increased accumulation in the liver due to high toxicity, difficulty in extracorporeal discharge (very long half-life).
  • the contrast agent solution was a little thicker, and even more difficult than compounds lc, 2c, and 3c to dissolve in the complete solution at the concentration of the contrast agent.
  • the actual G5 PAMAM dendrimer-based materials were prepared, synthesized and analyzed. However, they were difficult to dissolve at the concentrations in the sediment for use as contrast agents, and thus could not be used in the actual injection experiments. Also, the PDKpolydispersity index was relatively Very high compound uniformity was found to be not very useful.
  • Preferred examples of the radial polymer compound containing iodine according to the present invention may be a compound represented by the following formulas (5) to (8).
  • the core is any one cyclic hydrocarbon, porphyrin and derivatives thereof selected from the group consisting of ⁇ - , ⁇ - and ⁇ -cyclodextrin, glucose, galactose and mannose, D0TA (1, 4,7, 10—tetraazacyclododecane- 1,4,7, 10-tetraacetic acid) and derivatives thereof, at least one peptide selected from the group consisting of lysine, aspartic acid, glutamic acid, serine, cysteine and tyrosine 2-4 Cyclic peptides, polyamidoamine (PAMAM) dendrimers, polylysine dendrimers, polypropyleneimine (PPI) dendrimers, polyester dendrimers, polyglutamic acid dendrimers, polyaspartic acid dendrimers, polyglycerol dendrimers and polymelamines Any one dendrimer, polylysine or polyester selected from the group consisting of dendrimers From the group consist
  • T and T are iodine-containing compounds
  • R and R are each independently or alternatively
  • D is a peptide such as lysine, trilysine, tetralysine digglutamic acid, triglutamic acid, tetraglutamic acid, diaspartic acid, triaspartic acid, tetraaspartic acid, discysteine, tricysteine, tetracysteine, diserine, triglycerine , And a peptide having 2-4 repeating units selected from the group consisting of tetraserine,
  • P is polyethylene glycol (PEG), hyaluronic acid, heparin or derivatives thereof
  • X is a surface functional group of the core, amine group, hydroxy group, hydroxyamine group, carboxyl (carboxyl) group, carboxyhydrazide group, hydrazine group, thiol group, azide group, alkynyl group, halogen group, aldehyde group Group, ketone group, epoxy group, 3-carbomethoxypyrrolidinone group, tri- (Ci- 4 alkoxy) -silyl (tri-CCw alkoxy) -si lyl )
  • a and b are each independently or optionally an integer of 0 or 1
  • c is an integer from 2-4
  • d, e, f, g, h and i are each independently or alternatively an integer from 2 to 60, j is an integer from 1 to 10.
  • j is an integer from 1 to 10.
  • an alkoxy group of the d- 4 is the terminal facing outward from the core.
  • the compound of formula 5 is imaged by combining the iodine-containing compound (red small circle) and the biocompatible polymer (long green wavy line) to the core (gray large circle), respectively.
  • the compound of formula 6 is imaged by binding a biocompatible polymer to an iodine-containing compound bonded to the core.
  • the compound of Formula 7 is imaged by independently binding a peptide (blue short wavy line) and a biocompatible polymer in which 2-4 iodine-containing compounds are bundled into a core,
  • 2-4 iodine-containing compounds bound to the core are imaged of the compound of Formula 8 by binding the biocompatible polymer to the peptide substituted by the bundle.
  • Radial polymer compound containing iodine according to the present invention is significantly improved the duration of contrast effect compared to the conventional low molecular contrast agent containing iodine, and may cause toxicity and various adverse reactions substituted near the surface of the core Iodine It forms a protective film that surrounds oil compounds with a relatively long biocompatible polymer chain layer to prevent their exposure to the external environment, thereby reducing toxicity in the body as well as preventing rapid absorption by macrophages, thereby reducing the body's circulation time.
  • the present invention comprises the steps of reacting the biocompatible polymer to the portion of the surface functional group of the core consisting of a circular or spherical symmetrical low molecular compound, or a radial high molecular compound (step 1); And
  • step 2 Providing a method for producing a radial polymer compound containing the iodine comprising the step (step 2) of reacting the iodine-containing compound directly or through the temper group to the unreacted surface functional group in the core of step 1 do.
  • the present invention comprises the steps of reacting the iodine-containing compound to a portion of the surface functional group of the core consisting of a circular or spherical symmetrical low molecular compound, or a radial polymer compound (step 1);
  • step 2 provides a method for producing a radial-phase polymer compound containing the iodine comprising the step (step 2) of reacting such that the biocompatible polymer is bonded to the iodine-containing compound bound to the core in step 1 above.
  • the present invention comprises the steps of reacting the iodine-containing compound to be bonded through a biocompatible polymer and a peptide (step 1);
  • Step 2 reacting the iodine-containing compound bound to the biocompatible polymer through the peptide in Step 1 to bind to a surface functional group of the core, which is composed of a circular or spherical symmetrical low molecular compound or a radial polymer compound (step 2). It provides a method for producing a radial polymer compound containing the iodine.
  • the circular or spherical symmetrical low molecular compound, the radial polymer compound, Table Examples of the surface functional group, the iodine-containing compound, the peptide, and the biocompatible polymer are as described above.
  • the surface functional group of the core remaining without the reaction by administering an excess of iodine-containing compound
  • the iodine content in the radial high molecular compound can be adjusted to about 15-50% by binding to.
  • the present invention also provides a contrast agent composition for CT containing the radial polymer compound containing the iodine as an active ingredient.
  • the radial polymer compound containing iodine preferably has an iodine content of 15-50%. If the iodine content is less than 15% of the radial polymer compound containing iodine, the contrast effect is not sufficient, so an excessive contrast agent should be administered. If exceeded, there is a problem that it is difficult to use for in vivo injection because of increased toxicity.
  • Triethylamine (0.82 mL, 5.88 ⁇ ol) was added to a solution of compound 60 ⁇ , 3.84 g, 5.89 mmol) and compound 9 (ethane to amine, 300 mg, 4.91 ⁇ ol) in DMS0 (8 mL), Heated to 50 ° C and stirred for 19 h. SEC column using DMF as mobile phase to remove DMS0 solvent from the reaction mixture (Model: Bio-Beads S-Xl, H
  • Step 2 Preparation of Gl PAMAM-mPEG ⁇ -TIPAA Binder (lc) Compound lb solution (5.65 g) obtained in step 1 and 4,5,6,7-tetraiodobene
  • reaction mixture After filling with argon gas, the reaction mixture was stirred at room temperature for 2 days, and then added thereto.
  • TIPN (3.00 g, 4.60 mmol) was added all at once, and the reaction mixture was stirred at room temperature for 24 hours.
  • the crude product obtained was purified by SEC (Model: Bio-Beads S-Xl, H 40 cm X0.D. 4.5 cm,
  • Iodine Content (Inductively coupled plasma mass spectrometry, I CP-MS) :
  • G2 PAMAM dendrimer (2a) purchased from Aldrich was dried in vacuo to remove methane.
  • the compound 2a (1.32 g, 0.405 mmol) was dissolved in DMS0 (90 mL) and mPEG carbonate compound 5 (3.94 g, 1.81 dl) was added to the stirring solution in one portion.
  • the reaction mixture was stirred for 2 days at room temperature, followed by dialysis under stirring for 6 hours in methanol (Model: Spectra / Por Regenerated Cel lulose (RC) membrane, MWCO 3500, manufacturer: Spectrum Laboratories) ) was performed twice.
  • methanol Model: Spectra / Por Regenerated Cel lulose (RC) membrane, MWCO 3500, manufacturer: Spectrum Laboratories
  • Step 2 Preparation of G2 PAMAM-mPEGpnoo-TIPAA conjugate (2c) Dissolve in solution 2b solution (5.20 g) and TIPN (6) OL89 g, 2.90 mmol) ol DMS0 (94 mL) obtained in step 1, here (0.80 mL, 4.6 ⁇ l ol) was added. After filling the argon gas in a semi-quilter, the semi-ung mixed mixture was stirred for 2 days at room temperature, and additionally, TIPN (990 mg, 1.52) ol) was added at a time, and the semi-ung mixed mixture was then heated at room temperature. Stir for 24 hours.
  • the reaction mixture was subjected to dialysis (Model: Spectra / Por Regenerated Cel lulose (RC) membrane, MWCO 8000, Spectrum Laboratories) twice with stirring for 6 hours on methanol.
  • the crude product obtained by removing the solvent under reduced pressure was purified by SEC (Model: Bio-Beads S-Xl, H 40 cm x O.D. 4.5 cm, Manufacturer: Bio-Rad).
  • SEC Model: Bio-Beads S-Xl, H 40 cm x O.D. 4.5 cm, Manufacturer: Bio-Rad.
  • the product purified above was combined and filtered through a SEC column (Sephadex LH-20, H 40 cm x O.D.
  • Iodine Content (Inductively coupled plasma mass spectrometry, I CP-MS) :
  • G3 PAMAM dendrimer (3a) purchased from Aldrich was dried in vacuo to remove methanol.
  • the reaction mixture was stirred at room temperature for 2 days, and then stirred for 6 hours on methanol (model name: Spectra / Por Regenerated Cel lulose (RC) membrane, MWCO 1000, manufactured by Spectrum Laboratories). Was carried out twice.
  • Step 2 Preparation of G3 PAMAM-mPEG ⁇ n-TIPAA conjugate (3c) Dissolve the compound 3b solution (3.24 g) and TIPN (6) (3.86 g, 5.92 ⁇ ol) obtained in step 1 above in 100 mL DMSC To this was added 50 mL of DIEAU, 8.61 ⁇ l). After filling the reaction vessel with argon gas, the reaction mixture was stirred at room temperature for 2 days, and further TIPNU.93 g, 2.96 ⁇ ol) was added at a time, and the reaction mixture was stirred at room temperature for 24 hours.
  • the reaction mixture was subjected to dialysis (Model: Spectra / Por Regenerated Cel lulose (RC) membrane, MWCO 1000, Spectrum Laboratories) twice with stirring for 6 hours on methanol.
  • the crude product obtained by removing the solvent under reduced pressure was purified by SEC (Model: Bio— Beads S-Xl, H 40 cm ⁇ O.D. 4.5 cm, Manufacturer: Bio-Rad).
  • SEC Model: Bio— Beads S-Xl, H 40 cm ⁇ O.D. 4.5 cm, Manufacturer: Bio-Rad.
  • the product purified above was combined and filtered through a SEC column (Sephadex LH-20, H 40 cm x O.D.
  • G4 PAMAM dendrimer (4a) purchased from Aldrich was dried under vacuum to remove methanol.
  • the compound 4a (579 mg, 0.0407 mmol) was dissolved in DMS0 (27 mL), and mPEG carbonate compound 5 (1.94 g, 0.890 ⁇ l) was added to the stirring solution in one portion.
  • the reaction mixture was stirred for 2 days at room temperature, followed by dialysis with stirring for 6 hours on methane (Model: Spectra / Por Regenerated Cel lulose (RC) membrane, MWCO 1000, manufacturer: Spectrum Laboratories) was performed twice.
  • methane Model: Spectra / Por Regenerated Cel lulose (RC) membrane, MWCO 1000, manufacturer: Spectrum Laboratories
  • Step 2 Preparation of G4 PAMAM-mPEGgnm-TIPAA conjugate (4c) Dissolve the compound 4b solution (1.63 g) and TIPN (6) (1.35 g, 2.07 mmol) obtained in step 1 above in DMS0 (32 mL), DIEA (0.54 mL, 3.10 t ol) was added.
  • the semi-ungmul mixture was stirred at room temperature for 2 days, and additionally, TIPN (677 mg, 1.04 ⁇ l) was added at a time, and the reaction mixture was stirred at room temperature for 24 hours. .
  • the reaction mixture was subjected to dialysis (Model: Spectra / Por Regenerated Cel lulose (RC) membrane, MWC0 1000, manufactured by Spectrum Laboratories) twice with stirring for 6 hours on methanol.
  • the crude product obtained by removing the solvent under reduced pressure was purified by SEC (Model: Bio-Beads S-Xl, H 40 cm x O.D. 4.5 cm, Manufacturer: Bio-Rad).
  • the product purified above was combined and filtered through a SEC column (Sephadex LH-20, H 40 cm x O.D. 3.0 cm) to remove the remaining DMF, and dissolved in ethanol (80 mL) for a syringe filter (Model: Puradisc 25 Syringe filter, pore size 0.45 im, PTFE, manufacturer: Whatman) sterilization-filtered and dried under vacuum for 3 days to obtain the target compound 4c (1.27 g).
  • Iodine content (Induct ively coupled plasma mass spectrometry, I CP-MS) ⁇ '
  • HeLa cell lines used for cytotoxicity test were purchased from American Type Culture Collection (ATCC), DMEM (Dulbecco) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 50 U / mL penicillin and 50 ⁇ g / mL streptomycin.
  • s modified eagle medium (Gibco) was stored at 37 ° C and 5% carbon dioxide (C0 2 ).
  • Preparation step preparation of contrast agent composition for CT
  • Table 1 summarizes the viscosity (viscosity, 30 ° C) and osmolality measurement results of the CT contrast agent of the present invention.
  • CT contrast agent 250 mg / mL
  • CT contrast agent 250 mg / mL
  • their X-ray hops were checked by preliminary inspection.
  • the positive control group is "Iobrix" (Taejun Pharmaceuticals), a low-molecular-weight compound-based CT contrast agent for rapid release during vascular injection, and an emulsion nanoparticle-based veterinary CT for long-term circulation during intravascular injection.
  • Contrast agent "Fenestra VC" (ART, Canada) was used.
  • each 250 mL tube contains four CT contrast agents prepared in the above preparation step and 20 mM Tris complete solution (pH 7.4, 0.1 mg / mL EDTA) as "Fenestra VC", "Iobrix” and negative control. Filled in each, and also an empty tube prepared as a negative control.
  • the eight tubes were placed side by side on a photographing bed of an NFR Polaris-G90 in vivo micro-CT scanner (manufacturer: NanoFocusRay), and 2D X-ray images were taken [Image parameters: 60 kVp]. ,
  • FIG. 2 X-ray transmittance of all CT contrast agents compared to 20 mM Tris buffer (X-ray transmission signal strength: 1359.5) and vacuo (X-ray transmission signal strength: 1676.5) used as a negative control ( Inversely proportional to X-ray absorbance) was much lower, and among them, the rapid X-ray absorbance (Iobrix), a CT contrast medium for humans, was the highest (X-ray transmission signal strength: 198.0).
  • CT contrast agents containing 2c, 3c, and 4c (X-ray transmission signal strength: 904.5, 838.0, 826.5, and 827.0 in sequence) were similar in all in vitro tube 2D X-ray tomography images. Levels of X-ray absorbance are shown. Therefore, it can be seen that the contrast agent for CT containing the radial polymer compound containing iodine according to the present invention has a striking contrast effect.
  • the micro animal CT device was used as follows. Experiment was as follows.
  • mice 15-22 g of 6-8 weeks old healthy male C57BL / 6 mice (Orient Bio, Korea) were used as experimental animals. Mice were not fed with water and rice from 12 hours before contrast injection to 4 hours after injection, and immediately after CT imaging after 4 hours after contrast injection.
  • the mouse was placed in an induction chamber in an oxygen atmosphere containing 33 ⁇ 4 isoflurane for 5 minutes without injecting the contrast agent, followed by anesthesia, and the mouse was subjected to NFR Polaris-G90 in vivo micro-CT.
  • the scanner bed (NanoFocusRay, Korea) was raised with the back facing up, and a baseline (ie precontrast) CT scan was performed while maintaining anesthesia under an oxygen atmosphere containing 1.5% isoflurane.
  • Image parameters 60 kVp, 60 ⁇ , 500 ms exposure time, 360 ° scan angle, 600 scan number, 512
  • si ices i.e., image number
  • FOV 80.00 83.71 mm for low resolution whole-
  • CT scans of each mouse were performed 1, 2, 4, 8, 24, and 48 hours after contrast injection, without additional contrast injection.
  • each mouse was transferred to an individual cage in a thoroughly controlled thermo-hygrostat environment (22-25 ° C and 50-60% humidity) for recovery.
  • Whole-body CT scans were performed at the time of post-infusion described above using 3-6 mice for each contrast medium, and one CT scan was performed 7 days after injection for each contrast medium. This was done to confirm that most of the contrast agent was discharged in vitro.
  • CT scans on the chest, mid resolution and brain area using the 1-2 mice for CT contrast media according to the present invention were performed at the imaging parameters described above.
  • the contrast effect of the CT contrast agent of the present invention at the resolution was examined.
  • the raw image file obtained after each CT scan was reassembled into 1 3 ⁇ 4 of DICOMCdigital imaging and communications in medicine (512X512 pixels) file immediately after the scan to check for cross-sectional errors.
  • 3D CT images were obtained from DIC0M files using Lucion software Clnfinitt Healthcare, Korea).
  • Coronal and sagittal planes showing several sites of interest taken over time after injection of CT contrast agents and "Fenestra VC" and "Iobrix" used as positive controls through the tail vein of mice
  • Coronal and sagittal planes showing several sites of interest taken over time after injection of CT contrast agents and "Fenestra VC" and "Iobrix" used as positive controls through the tail vein of mice
  • Whole body CT cross-sectional images of (sagittal) are shown in FIGS. 3-4 (coronal plane) and 5-6 (sagittal plane), respectively.
  • CT cross-sectional images of the chest, the abdomen, and the brain region (high resolution) taken over time are shown in FIGS. And abdomen) and 9-10 (brain region), respectively.
  • the blood vessel region of the mouse injected with CT contrast medium appeared light gray (bones appear as a very bright white area).
  • "Iobrix" a low-molecular-weight compound-based CT contrast agent for humans, used as a positive control group, can be seen to be excreted through the kidney at a very high rate within minutes (see CT scan 0 hours after injection).
  • “Fenestra VC” which is an emulsion nanoparticle-based contrast agent for CT for animals, contains a contrast agent for CT containing the compound prepared in Examples 1-4 of the present invention. Similarly, until 2-4 hours after contrast injection, the biodistribution was shown in a similar manner in the early stages, such as an intravascular contrast effect of the same intensity as immediately after injection, but 24 hours after the injection, the present invention Compared with CT contrast agent, the distribution of liver is much higher than that of CT.
  • the rats did not die during the CT scan by injecting the CT contrast agent of the present invention, the autopsy results after the CT scan was confirmed that no damage to the liver, kidneys and other organs. Therefore, it can be seen that the CT contrast agent containing the radial polymer compound containing iodine according to the present invention has a high contrast effect, a long contrast time, and an adequate in vitro discharge.

Abstract

본 발명은 CT 조영제의 유효성분으로 사용할 수 있는 요오드를 함유한 방사 형상의 고분자 화합물, 이의 제조방법 및 이를 함유하는 조영제 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 요오드를 함유한 방사형상의 고분자 화합물은 기존의 요오드를 함유한 저분자 조영제 화합물에 비해 조영효과 지속시간이 현저히 향상되고, 중심핵 표면 가까이에 치환된 독성과 각종 이상반응을 일으킬 소지가 있는 요오드 함유 화합물들을 비교적 길이가 긴 생체적합성 고분자 사슬 층으로 둘러싸는 보호막을 형성하여 이들의 외부환경에의 노출을 방지함으로써 체내 독성을 감소시킬 뿐만 아니라, 대식세포에 의한 빠른 흡수를 방지하여 체내 순환시간을 연장하며, 체외배출이 체내 주입 후 적절한 시간경과 후 이루어지고, 제조방법 및 정제방법이 매우 간단하여 고수율 및 저비용으로 대량생산이 가능하며, 다분산성(polydispersity)이 매우 낮아 제조와 효과면에서 재현성이 높고, 제조되는 요오드를 함유한 방사형상의 고분자 화합물의 구조가 모두 공유결합으로 이루어져 있어 구조적으로도 매우 안정하므로, CT용 조영제의 제조에 유용할 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
요오드를 함유한 방사형상의 고분자 화합물, 이의 제조방법 및 이를 포함하 는 CT용 조영제 조성물
【기술분야】
본 발명은 CT 조영제의 유효성분으로 사용할 수 있는 요오드를 함유한 방사 형상의 고분자 화합물， 이의 제조방법 및 이를 포함하는 CT용 조영제 조성물에 관 한 것이다. 【배경기술】
CT( computed tomography, 전산화 단층촬영)란 인체의 목적 부위를 여러 방향 에서 조사하여 투과한 X-선올 검출기로 수집하고, 그 부위에 대한 X-선의 홉수차이 를 컴퓨터가 수학적 기법을 이용하여 재구성하는 촬영기법을 말한다. 즉， 몸 주위 로 카메라가 360° 회전하며 여러 다른 각도에서 찍은 수많은 2차원 X-선 사진을 컴퓨터 프로그래밍으로 재조합하여 3차원 영상으로 만드는 영상기법이다. 따라서， 이러한 X-선에 기반한 영상은 일반적으로 뼈를 위주로 한 영상을 구 현한다ᅳ 원자번호가 비교적 높은 바륨이나 요오드계 조영제를 살아있는 동물이나 사람의 혈관에 주입하고 CT 영상을 촬영하는 경우, 몸 속에서 이들 물질이 존재하 는 곳에서는 광전자 효과 (photoelectric effect)에 의해 X-선이 잘 투과하지 못하 고 흡수되어 뼈 (매우 밝은 흰색)와 비슷하게 다른 부위에 비해 좀 더 밝은 흰색 또 는 회색 계열의 영상이 얻어지게 된다. 일반적으로， X-선이 홉수되는 정도 ( α)는 원자번호 (^와 X-선의 파장 (λ)에 각각 비례한다. 즉， X-선이 홉수되는 정도 ( α)는 X-선의 에너지에 반비례한다.
5 7/2
α= Ν \
CT는 MRI (magnetic resonance imaging)와 더불어 해부학적인 정보를 제공하 는데， 이러한 면에서 생리학적 /생화학적 기능에 관한 정보를 제공하는 PEKpositron emission tomography) 또는 SPECT( single photon emission computed tomography) 영상기법과 차별화 된다. 또한， MRI에 비하여 CT의 해상도가 떨어짐에 도 불구하고 CT는 병원에서 없어서는 안될 중요한 위치를 차지하고 있다. 그 주요 원인으로는 단시간 내에 촬영이 용이하고， 검사비용이 비교적 저렴하며， 대부분의 병원들이 구비하고 있어 장비에의 접근성이 용이하다는 것이다. 즉， CT 촬영시간이 MRI에 비해 10분의 1 정도 또는 그 이하로 짧아 빠른 진단을 내려야하는 특히 촌각 을 다투는 뇌 부위에 치명적 손상을 입은 환자에게 필수 불가결한 진단장비로 여겨 지고， MRI 촬영 시 발생되는 소음과 장시간의 촬영으로 인한 환자의 불편함을 감소 시킬 수 있으며， 장비에의 접근성이 용이하고， 촬영비용도 MRI에 비해 10분의 1 정 도 밖에 되지 않아 환자에게 부담감이 적다. 현재까지 알려져 있는 임상에 적용된 요오드를 함유한 저분자 CT용 조영제는 이온성 물질과 비이온성 물질로 나뉜다.
Figure imgf000004_0001
상기 화합물 중에서 비이온성 물질이 이온성 물질보다 부작용이 훨씬 적으므 로， 현재 환자들에게는 대부분 비이온성 CT용 조영제가 투여되고 있다. 또한， 벤젠 고리가 하나인 기존의 요오드를 함유한 저분자 비이온성 CT용 조영제 2-3개를 공유 결합으로 연결하여 분자량을 증가시켜 기존의 단일 벤젠고리 기반 비이온성 조영제 에 비해 체내 체류시간을 조금 더 연장시킬 수 있다. 하지만， 이러한 요오드를 함 유한 저분자 CT용 조영제는 일반적으로 체내 체류시간 (반감기)이 매우 짧아 적절한 수준의 CT영상을 얻기 위해 1회의 CT촬영 시 성인 몸무게에 따라 많게는 80-90 g이 상 과량을 투여해야 해서， 알러지와 쇼크 등의 이상반응이 일부 환자들에게서 종종 나타나고， 극히 드물기는 하지만 심할 경우 생명에 지장을 초래할 수 있는 문제점 이 있다. 이와 같은 현상은 특히 심장부위 등 주로 심혈관계 질환의 효과적인 진단 을 위해 필수적인 충분한 조영시간의 확보를 위해 매우 과량의 조영제를 투여해야 만 하는 경우에 더 자주 발생하게 된다. 따라서， 이와 같은 문제를 극복하기 위하 여 더 안전하고 비교적 소량의 CT용 조영제 투여만으로도 일정 시간 동안 우수한 조영효과를 유지하는 화합물의 개발이 시급히 이루어져야 한다. 그 밖에도 현재 이 러한 요오드를 함유한 저분자 CT용 조영제의 문제점으로는 낮은 LD50 값， 높은 삼투 압과 점도 등올 들 수 있다. 최근에는 이러한 요오드를 함유한 저분자 CT용 조영제가 지닌 한계를 극복하 고자 고분자 물질에 기반을 둔 새로운 요오드를 함유한 CT용 조영제의 개발에 관한 보고가 등장하고 있다. 예를 들어， 고분자 물질 골격에 저분자 요오드 화합물 다수 를 공유결합으로 치환하거나， 또는 리포좀， 미셸， 기타 나노입자와 같이 고분자화 합물 골격에 시판 중인 저분자 요오드를 함유한 저분자 CT용 조영제 화합물 또는 이의 유도체를 물리적으로 함유 (physical encapsulation)하게 하는 방식이 있다. 비특허문헌 1[J. Zheng, et al., Mol. Pharmaceutics 2009, 6， 571-580] , 비 특허문헌 2[A. Sachse , et al . , Invest . Radiol. 1997, 32， 44-50] , 비특허문헌 3[E. Samei , et al . , Int. J. Nanomedicine 2009, 4， 277-282] 및 비특허문헌 4[C.-Y. Kao, et al . , Acad. Radiol. 2003， 10， 475-483]에서는 시판 중인 요오드 를 함유한 저분자 CT용 조영제 화합물 또는 이의 유도체를 고분자 화합물 기반 리 포좀에 함유하는 방법이 개시되어 있다. 비특허문헌 5[V. S. Trubetskoy, et al., J. Drug Target . 1997, 4， 381- 388] 및 비특허문헌 6[V. P. Torchilin, et al . , Acad. Radiol. 1999, 6， 61-65]에 서는 시판 중인 요오드를 함유한 저분자 CT용 조영제 화합물 또는 이의 유도체를 고분자 화합물 기반 미셸에 함유하는 방법이 개시되어 있다. 비특허문헌 7[F. Hyafil, et al . , Nat. Med. 2007, 13， 636— 641]에서는 시판 중인 요오드를 함유한 저분자 CT용 조영제 화합물 또는 이의 유도체를 고분자 화합 물 기반 나노입자에 함유하는 방법이 개시되어 있다. 상기 비특허문헌 7의 경우, 요오드 화합물의 카르복실산 말단을 알킬기로 캡 핑 (capping)하여 소수성 (hydrophobicity)을 증가시킴으로써 나노입자의 내부로 잘 함유되도톡 하였다. 이러한 요오드를 함유한 나노입자가 혈관에 주입되면 일반적으 로 쉽게 대식세포 (macrophage)로 흡수되어 체내 순환시간을 늘릴 수 있었고， 시간 이 경과함에 따라 대식세포가 상대적으로 많이 분포하는 염증， 암， 동맥경화 등의 부위에 축적되어 결과적으로 CT촬영을 통해 관련 질환진단을 용이하게 하였다. 한 편， 상기 비특허문헌 5의 경우, 친수성 (hydrophilic)이면서 체내 순환시간을 연장 시킬 수 있는 PEG(poly( ethylene glycol), 폴리에틸렌글리콜) 사슬의 말단에 소수 성의 요오드를 함유한 저분자 화합물 다수를 공유결합으로 치환하여 미셸 구조를 형성할 수 있었다. 하지만， 이러한 자기조립 (self-assembly)에 근거한 리포좀이나 미셸과 같은 구조들은 체내 환경에 따라 언제든지 입자의 형태가 풀려서 내부에 함 유되었던 유독성의 요오드를 함유한 저분자 조영물질이 일시에 모두 방출되거나 일 부 누출될 우려가 있다. 따라서， 이러한 저분자 요오드 화합물을 함유하지 않고도 자체로서 조영효과 를 나타내는 금속 나노입자에 기반한 CT용 조영제가 개발되어 보고되었다.
특허문헌 l[PCT/KR2006/003452]에서는 표면이 PEG으로 치환된 금 (Au) 나노입 자 기반 CT용 조영제에 관하여 개시하고 있다. 비특허문헌 8[I.-C. Sun, et al .， Chem. Eur. J. 2009， 15， 13341-1334기에 서는 헤파린으로 코팅된 금 나노입자 기반 CT용 조영제에 관하여 개시하고 있다. 비특허문헌 9[M. H. Oh et al .， J. Am. Chem. Soc. 2011, 133， 5508-5515]에 서는 PEG와 형광물질로 치환된 균일한 크기의 산화 탄탈륨 (tantalum oxide) 나노입 자 기반 CT용 조영제에 관하여 개시하고 있다. 상기 금속 나노입자에 기반한 CT용 조영제는 높은 원자번호를 갖는 금속 (Au, Ta 등) 자체가 조영제의 역할 (X-선을 흡수)을 하는 원리로 나노입자의 표면을 PEG 이나 헤파린으로 코팅하여 생체적합성을 향상시키면서， 각각 체내 순환시간의 증대 를 통한 원활한 CT이미징 또는 간으로의 축적을 통한 특정부위의 조영효과 증대를 도모하였다.
그러나， 상기에서 설명한 여러가지 고분자 기반 조영제는 고비용의 문제뿐만 아니라， 원활한 배설이 이루어지지 않고 생체내 장기간 축적됨 (즉， 수년-수십년 이 상의 반감기)에 따른 안전성의 한계， 또는 화합물 구조의 안정성, 즉 자기조립 구 조체 (self-assembled structure)가 체내 환경에서도 안정하게 원래의 구조를 유지 하고， 제조 시 항상 동일한 분자량 분포를 보이는 고분자 흔합물을 얻어 동일한 성 능을 갖도록 하는 재현성 확보에의 어려움이 있을 것으로 예상된다. 또한， 이러한 고분자 흔합물에 기반한 인체내 투여용 소재의 경우， 현재까지 아직 독성 시험 기 준이 전세계적으로 정립되지 않아 실질적으로 임상시험을 거쳐 상업화하는데까지 여러가지 난관이 있을 것으로 보인다. 한편， 리포좀 형태로서 요오드를 함유한 저분자 조영물질을 포함하는 현재 상용화된 CT용 혈관 조영제로는 Fenestra (캐나다의 ART사)와 eXIA160(캐나다의 Binitio Biomedical사)를 들 수 있는데， 모두 동물용으로만 판매되고 있다. 상기 리포좀 형태의 CT용 혈관 조영제는 마우스 또는 랫트에 5-10회 주입할 양의 바이알 한 개 (2.5 mL) 가격이 100만원 정도로 가격이 매우 비싸고， 이러한 소형동물의 꼬 리 정맥을 통한 조영제 주입이 쉽지 않아 마이크로 CT 촬영을 해야하는 기초의학 연구종사자들이 사용하기에는 더욱더 부담이 크다. 또한， 소형동물을 이용하는 마 이크로 CT 촬영에 인체용 저분자 조영제를 투여할 경우， 조영제 주입 직후 동물을 CT 촬영대로 옮기고 소프트웨어로 기기를 작동하여 CT촬영을 시작할 때까지 최소한 1-3분 정도 시간이 소요되어 그 사이에 이미 저분자 조영제는 대부분 신장을 통해 방광으로 배출되므로 실질적으로 적절한 수준의 조영이 불가능하다. 따라서， 앞서 언급한 현재의 요오드를 함유한 저분자 CT용 조영제를 인간에 과량투여해야만 적절 한 수준의 CT영상이 확보되는 심혈관계 질환의 진단뿐만 아니라， 소형동물을 이용 한 실험을 제대로 수행하기 위해서는 가격이 저렴하고 과량투여할 필요없이 비교적 장시간 순환 후 원활한 배출이 이루어지는 CT용 혈관 조영제의 개발이 절실히 필요 한 실정이다. 이러한 취지에서， 1990년경부터 조금씩 고분자 골격으로서 덴드리머를 이용 한 요오드를 함유한 CT용 조영제에 대한 논문 및 특허들이 등장하기 시작했다. 즉， 단일분자인 덴드리머를 고분자 골격으로 이용할 경우 (아래 내용 참조)， 제조 및 성 능에 있어서의 재현성을 확보할 수 있고， 금속 나노입자 또는 선형고분자에 기반한 조영제들에 비해 크기가 매우 작아 체내축적의 염려없이 일정 시간 순환 후 원활한 배출을 기대할 수 있다. 덴드리머는 대개 지름 10 nm이하의 비교적 작은 방사형 (treelike 또는 radial -shape) 고분자로서， 한 층 (layer)씩 단계별로 (stepwise) 반복적인 (iterative) 유기합성과 정제를 통해 얻어지는 순수 단일분자 (unimolecule)이다. 대부분의 다른 전형적인 고분자 (다분산 (polydisperse) 흔합물)와는 달리 덴드리머 는 특정 환경 (용매， pH, 온도 등)에서의 크기가 항상 일정하고 어느 정도 예측이 가능하여， 특히 고분자기반 입자들의 용액 내 크기 (hydrodynamic diameter)에 민감 한 다양한 웅용연구 분야에 선택적으로 맞춤 적용할 수 있어 매우 유리하다. 구체 적인 덴드리머의 장점으로는 화학구조상의 온전함 (integrity)， 적용하는 유기합성 법에 따라 얼마든지 덴드리머를 구성하는 작용기와 이에 수반된 물리화학적 성질의 변형이 가능함， 여러가지 기능 단위 물질 (functional unit) (예를 들어， 저분자 약 물， 표적 물질， 표면 개질제 등)들을 덴드리머의 내부와 표면에 용이하게 치환할 수 있음， 그리고 생물분야에 응용될 경우 중요한 생체 내 효소에 의한 파괴 (enzymatic degradation) 가능성이 거의 없음 등을 돌 수 있다.
덴드리머가 바이오의약분야에 적용된 예로는， 다가양이온성 (polycationic) 덴드리머를 이용하여 음이온성의 유전자와 전하복합체 (charge complex)를 이루어 효과적으로 세포내로 운반 (gene transfection)하는 예; 약물전달 매개체 (carrier) 로 사용된 덴드리머가 약물을 운반하는 방식에 있어서, 특정 자극 (pH, light, enzyme 등)에 의해 환부에서만 약물이 방출되도록 약물분자를 덴드리머내 투과성 (porous) 공간에 물리적으로 함유 (physical encapsulation)하거나 전구약물 (prodrug)의 형태로 덴드리머에 공유결합으로 치환하는 예; 덴드리머 운송체 (carrier)의 구조 변형을 통해 약물을 표적 지향 또는 제어된 방출 속도로 전달하 는 예; 다중치환 효과 (multivalent effect)를 이용하여 단백질 (lectin)과 탄수화물 리간드간 세포외벽 (extracellular membrane)에서 상호작용 (interact ion)시 결합력 (binding affinity)을 대폭 증대시키는 예; 저분자 화합물 기반 이미징 제제를 덴 드리머 골격에 다중치환하여 신호를 증폭 (signal amplification)시킴으로써 보다 효과적인 의학적 진단을 가능하게 하는 예; 생체적합성 (biocompatible) 및 생분해 성 (biodegradable) 덴드리머 골격에 기반한 인공조직을 제조 (artificial tissue engineering)하고 적용한 예 등을 들 수 있다. 덴드리머는 1970년대 후반 Denkewalter에 의해 합성된 폴리라이신 (polylysine) 덴드리머로 처음 등장한 이래， 새로운 덴드리머의 분자설계와 이의 합성법， 이의 물리화학적 특성 연구와 이를 토대로 한 기초적 웅용사례 (예를 들어， 자기조립， 생체모방 시스템 등)， 이의 소재와 의료 분야에의 응용에 대한 연구가 활발히 진행되어 왔다. Denkewalter에 의해 합성된 폴리라이신 덴드리머 구조의 예 는 아래와 같다 (특허문 2[U.S 4,410,688]).
Figure imgf000009_0001
또한, 덴드리머의 종류 중 PAMAM(poly(amidoamine)) 덴드리머는 Dr. Donald A. Tomalia가 1980년대 다우케미컬사에 재직할 당시 개발한 물질로서， 내부 구조는 지방족 아민 (amine)기 또는 지방족 아미드 (amide)기로 구성되어 있으며， 이의 표면 은 아민기， 카르복실기， 히드록시기 등 여러가지 작용기로 되어 있다. 예로서， 코 어 (core)가 에틸렌디아민이고， 표면이 아민기로 이루어진 1-4 세대 (Gl, G2, G3, 및 G4) PAMAM 덴드리머의 구조는 아래와 같다. Gl
Figure imgf000010_0001
PAMA Dendrimw (1a) G2 PA A endnmer (2a) G3 PAMAM Dendrirmr (3a)
PAMAM 덴드리머는 덴드리머 중 가 생체내 적용에 적합한 것으로 알려져 있어 바이오의약 분야에 많이 응용되고 있다. 한편， 단계별 유기합성과 정 제 과정을 통해 합성되는 덴드리머는 원칙적으로 단일분자이어야 하는데, 시판 중 (Dendritech사 제조， Sigma-Aldrich사 판매)인 PAMAM 덴드리머는 발산 (diver gent) 합성 방법으로 반응물 (reagent)을 과량투여하고 투석 (dialysis)방법으로만 매우 간 략히 정제하여 대량생산된 것으로 잔여반웅물에 의해 목적물과 유사한 원하지 않는 부가물 (side-product)들이 비교적 많이 생성되어 화학구조상 불완전하고 이질성 (heterogeneity) (polydispersity index(PDI), ca. 1.01-1.1)의 문제 때문에 단일분 자수준의 정확한 구조분석이 불가능하다. 따라서， PAMAM 덴드리머는 해당 생물분야 응용연구의 목표에 부합하는 최적의 생체적합성 단일분자 덴드리머를 설계하고 합 성하기 이전에 덴드리머의 도입가능성을 신속하게 타진하기 위한 기본 검증차원에 서 사용함이 적절할 것으로 보인다. 현재까지 덴드리머 기반 요오드계 CT용 조영제의 예는 많이 알려져 있지 않 은데， 이는 제조방법이 너무 길고 복잡하며， 비용이 많이 들고， 비교적 독성이 심 하며， 저분자 물질에 비해 원하는 만큼 조영효과 지속시간이 많이 연장되지 않았 고, 조영효과도 그다지 우수하지 못하기 때문인 것으로 추정된다 (비특허문헌 10[W. Krause, et al . , Top. Curr. Chem. 2000， 210, 261-308] , 특허문헌 3[PCT/EP94/04245], 특허문헌 4[PCT/EP96/02450]， 특허문헌 5[PCT/FR92/01135]， 특 허문헌 6[PCT/EP94/648203]， 특허문헌 7[PCT/EP95/730573] , 특허문헌 8[PCT/EP95/78263], 비특허문헌 11[A. T. Yordanov, et al. , Nano Lett. 2002, 2, 595-599] , 비특허문헌 12[Y. Fu, et al . , Biocon jugate Chem. 2006， 17， 1043- 1056] ) . 한편, 유사한 맥락에서 덴드리머 기반 MRI용 조영제는 훨씬 더 많이 연구되 어 왔으며， 참고로 현재 병원에서 환자에게 투여되는 대표적 단일 저분자 화합물 MRI 혈관 조영제인 Gd-DTPA(gadopentetate dimeglumine; 상표명: 마그네비스트 (Magnevist))를 개발한 바이엘쉐링사는 가장 먼저 덴드리머에 기반한 MRI용 혈관 조영제를 개발하여 특허를 출원 (EP 430863， W0 97/02051 , W0 98/24775, W0 98/24774, US 5911971)하였으며， 현재 "Gadomer-17" (흑은 "Gd-DTPA-17" 또는 "SH L 643 A"로 불림 ; K. Nael, et al. , J. Magn. Reson. Imaging 2007， 25， 66—72; B. Misselwitz, et al . , Magn. Reson. Mater. Phys. Biol . Med. 2001， 12， 128-134)에 대한 임상시험이 진행 중이다. 따라서, 현재 임상에서 사용되는 요오드를 함유한 저분자 CT용 조영제가 지 닌 문제점을 해결할 수 있고, 제조방법이 비교적 간단하며, 비용이 저렴하고， 조영 제로서 적합한 물리화학적 특성을 지니며， 독성이 거의 없고， 조영시간이 층분히 확보되어 심혈관계 질환진단에 유리하고， 적절한 시점에 안전한 경로로 대부분 체 외배출이 이루어지는， 조영효과가 우수한 요오드를 함유한 방사형상의 고분자 화합 물을 포함하는 CT용 조영제의 개발이 절실히 요구되고 있다. 이에, 본 발명자는 상기 문제점들을 해결할 CT용 조영제에 관하여 연구하던 중, 생체적합성 고분자가 중심핵 및 내부에 치환된 요오드 함유 화합물을 둘러싸는 보호막을 형성하는 것을 특징으로 하는 요오드를 함유한 방사형상의 고분자 화합물 이 기존의 요오드를 함유한 저분자 조영제 화합물에 비해 조영효과 지속시간이 현 저히 향상되고， 중심핵 표면 가까이에 치환된 독성과 각종 이상반웅을 일으킬 소지 가 있는 요오드 함유 화합물들을 비교적 길이가 긴 생체적합성 고분자 사슬 층으로 둘러싸는 보호막을 형성하여 이들의 외부환경에의 노출을 방지함으로써 체내 독성 을 감소시킬 뿐만 아니라， 대식세포에 의한 빠른 흡수를 방지하여 체내 순환시간을 연장하며， 체외배출이 체내 주입 후 적절한 시간경과 후 이루어지고， 제조방법 및 정제방법이 매우 간단하여 고수율 및 저비용으로 대량생산이 가능하며 다분산성 (polydispersity)이 매우 낮아 제조와 효과면에서 재현성이 높고， 제조되는 요오드 를 함유한 방사형상의 고분자 화합물의 구조가 모두 공유결합으로 이루어져 있어 구조적으로도 매우 안정한 것을 확인하고， 본 발명을 완성하였다.
【발명의 상세한 설명】 【기술적 과제】
본 발명의 목적은 요오드를 함유한 방사형상의 고분자 화합물을 제공하는 것 이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 요오드를 함유한 방사형상의 고분자 화합물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 요오드를 함유한 방사형상의 고분자 화합물 을 포함하는 CT용 조영제 조성물을 제공하는 것이다.
【기술적 해결방법】
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 원형 또는 구형의 대칭형 저분자 화합물, 또는 방사형의 고분자 화합물로 구성되는 중심핵; 상기 증심핵에 직접 또 는 펩티드를 통해 결합되는 요오드 함유 화합물; 및 상기 중심핵에 직접 또는 펩티 드를 통해 결합되거나， 또는 상기 중심핵에 결합된 요오드 함유 화합물에 직접 결 합되는 생체적합성 고분자를 포함하되， 상기 중심핵 및 요오드 함유 화합물이 생체 내에서 노출되지 않도록 상기 생체적합성 고분자가 보호막을 형성하는 구조를 갖는 요오드를 함유한 방사형상의 고분자 화합물을 제공한다.
또한， 본 발명은 원형 또는 구형의 대칭형 저분자 화합물， 또는 방사형의 고 분자 화합물로 구성되는 중심핵의 표면작용기 일부에 생체적합성 고분자가 결합되 도록 반웅시키는 단계 (단계 1); 및 상기 단계 1의 중심핵에서 미반웅된 표면작용기 에 요오드 함유 화합물이 직접 또는 템티드를 통해 결합되도록 반웅시키는 단계 (단 계 2)를 포함하는 상기 요오드를 함유한 방사형상의 고분자 화합물의 제조방법을 제공한다.
나아가, 본 발명은 원형 또는 구형의 대칭형 저분자 화합물， 또는 방사형의 고분자 화합물로 구성되는 중심핵의 표면작용기 일부에 요오드 함유 화합물이 결합 되도톡 반웅시키는 단계 (단계 1); 및 상기 단계 1에서 중심핵에 결합된 요오드 함 유 화합물에 생체적합성 고분자가 결합되도톡 반웅시키는 단계 (단계 2)를 포함하는 상기 요오드를 함유한 방사형상의 고분자 화합물의 제조방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 요오드 함유 화합물이 생체적합성 고분자와 펩티드를 통해 결합되도톡 반웅시키는 단계 (단계 1); 및 상기 단계 1에서 펩티드를 통해 생체적합 성 고분자에 결합된 요오드 함유 화합물이 원형 또는 구형의 대칭형 저분자 화합 물， 또는 방사형의 고분자 화합물로 구성되는 중심핵의 표면작용기에 결합되도록 반웅시키는 단계 (단계 2)를 포함하는 상기 요오드를 함유한 방사형상의 고분자 화 합물의 제조방법을 제공한다.
나아가， 본 발명은 상기 요오드를 함유한 방사형상의 고분자 화합물을 유효 성분으로 포함하는 CT용 조영제 조성물을 제공한다.
【유리한 효과】
본 발명에 따른 요오드를 함유한 방사형상의 고분자 화합물은 기존의 요오드 를 함유한 저분자 조영제 화합물에 비해 조영효과 지속시간이 현저히 향상되고， 중 심핵 표면 가까이에 치환된 독성과 각종 이상반웅을 일으킬 소지가 있는 요오드 함 유 화합물들을 비교적 길이가 긴 생체적합성 고분자 사슬 층으로 둘러싸는 보호막 을 형성하여 이들의 외부환경에의 노출을 방지함으로써 체내 독성을 감소시킬 뿐만 아니라， 대식세포에 의한 빠른 흡수를 방지하여 체내 순환시간을 연장하며， 체외배 출이 체내 주입 후 적절한 시간경과 후 이루어지고， 제조방법 및 정제방법이 매우 간단하여 고수율 및 저비용으로 대량생산이 가능하며， 다분산성 (polydispersity)이 매우 낮아 제조와 효과면에서 재현성이 높고 제조되는 요오드를 함유한 방사형상 의 고분자 화합물의 구조가 모두 공유결합으로 이루어져 있어 구조적으로도 매우 안정하므로， CT용 조영제의 제조에 유용할 수 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 화합물로 세포독성을 측정한 그래프이다 .(a: 실시예 1， b: 실시예 2， c: 실시예 3， d: 실시예 4)
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 화합물을 함유한 CT용 조영제의 2D X-선 순간촬영 영상이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 화합물을 함유한 CT용 조영제를 투여한 쥐의 관상면을 0-4시간 간격으로 마이크로 CT를 이용해 촬영한 이미지이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 화합물을 함유한 CT용 조영제를 투여한 쥐의 관상면을 8-48시간 간격으로 마이크로 CT를 이용해 촬영한 이미지이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 화합물을 함유한 CT용 조영제를 투여한 쥐의 시상면을 0-4시간 간격으로 마이크로 CT를 이용해 촬영한 이미지이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 화합물을 함유한 CT용 조영제를 투여한 쥐의 시상면을 8-48시간 간격으로 마이크로 CT를 이용해 촬영한 이미지이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 화합물을 함유한 CT용 조영제를 투여한 쥐의 흉부와 복부의 관상면을 마이크로 CT를 이용해 촬영한 영상으로， 대정맥 (vena cava) 및 간 (liver) 부위에서의 신호세기의 추이를 비교하기 위한 이미지이다. 도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 화합물을 함유한 CT용 조영제를 투여한 쥐의 흉부와 복부의 관상면을 마이크로 CT를 이용해 촬영한 영상으로， 심장 (heart) 부위에서의 신호세기의 추이를 비교하기 위한 이미지이다.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 화합물을 함유한 CT용 조영제를 투여한 쥐의 뇌 부위의 관상면을 마이크로 CT를 이용해 촬영한 이미지이다.
도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 화합물을 함유한 CT용 조영제를 투여한 쥐의 뇌 부위의 시상면을 마이크로 CT를 이용해 촬영한 이미지이다.
【발명의 실시를 위한 최선의 형태】
이하， 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명은 원형 또는 구형의 대칭형 저분자 화합물， 또는 방사형의 고분자 화합물로 구성되는 중심핵;
상기 중심핵 '에 직접 또는 펩티드를 통해 결합되는 요오드 함유 화합물; 및 상기 중심핵에 직접 또는 펩티드를 통해 결합되거나， 또는 상기 중심핵에 결 합된 요오드 함유 화합물에 직접 결합되는 생체적합성 고분자를 포함하되，
상기 중심핵 및 요오드 함유 화합물이 생체내에서 노출되지 않도록 상기 생 체적합성 고분자가 보호막을 형성하는 구조를 갖는 요오드를 함유한 방사형상의 고 분자 화합물을 제공한다. 본 발명에 따른 요오드를 함유한 방사형상의 고분자 화합물에 있어서， 상기 중심핵을 구성하는 원형 또는 구형의 대칭형 저분자 화합물은 α-, β- 및 사이 클로덱스트린 (cyclodextrin), 글루코스， 갈락토스, 만노스 및 이들의 유도체로 이 루어지는 군으로부터 선택되는 어느 1종의 탄수화물， 포르피린 (porphyrin) 및 이의 유도체， D0TA(l,4,7,10-tetraazacyclododecane-l,4,7,10-tetraacetic acid) 및 이 의 유도체， 라이신， 아스파르트산， 글루타민산， 세린， 시스테인， 및 타이로신으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 1종 이상의 펩티드가 2-4개 연결되어 형성된 고리형 펩티드 및 이들의 유도체를 사용할 수 있고，
상기 중심핵을 구성하는 방사형의 고분자 화합물은 폴리아미도아민 (PAMAM) 덴드리머， 폴리라이신 덴드리머， 폴리프로필렌이민 (PPI) 덴드리머， 폴리에스터 덴 드리머， 폴리글루타민산 덴드리머, 폴리아스파르트산 덴드리머， 폴리글라이세를 덴 드리머 및 폴리멜라민 덴드리머로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 1종의 덴 드리머， 폴리라이신， 폴리에스터， 폴리글루타민산, 폴리아스파르트산, 및 폴리글라 이세를으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 1종의 고차분지형 (hyperbranched) 고분자， 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 및 이의 공중합체 (co-polymer) 유 도체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 1종의 별형상 (star-shaped)의 고분자 및 이들의 유도체를 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 요오드를 함유한 방사형상의 고분자 화합물에 있어서， 상기 요오드 함유 화합물의 바람직한 예로 하기 화학식 2， 3， 4 및 10으로 표현되는 화 합물을 사용할 수 있다.
【화학식 2】
Figure imgf000015_0001
상기 화학식 2-4 또는 화학식 10에 있어서，
R1, R 및 R은 각각 독립적으로 또는 선택적으로， -NH2, -NHR4, -NR4 2, -NHNH2( -NHNHR4, -NHNR4 2) -OH, -OR4, -SH 또는 -SR4이고，
R4는 -H, -Boc, 6의 비치환 또는 치환된 직쇄 또는 측쇄 알킬 또는 헤테로 알킬， 또는 비치환 또는 치환된 C5-7의 아릴 또는 해테로아릴이고，
R5는 R4와 같거나， -(O0)R4, -(C=0)0R4, -(C=0)NHR4 또는 -(C=0)NR2 4이다.
이때， 상기 화학식 2， 3 및 4의 요오드 함유 화합물은 하기 화학식 1 및 화 학식 9로 표시되는 요오드 화합물을 전구체로 하여 제조될 수 있다.
【 1】
Figure imgf000016_0001
본 발명에 따른 요오드를 함유한 방사형상의 고분자 화합물에 있어서， 상기 생체적합성 고분자는 폴리에틸렌글리콜 (PEG), 히알루론산, 헤파린 및 이들의 유도 체를 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 요오드를 함유한 방사형상의 고분자 화합물에 있어서， 상기 펩티드는 다이라이신， 트라이라이신， 테트라라이신, 다이글루타민산, 트라이글루타 민산， 테트라글루타민산， 다이아스파르트산， 트라이아스파르트산， 테트라아스파르 트산， 다이시스테인， 트라이시스테인， 테트라시스테인， 다이세린， 트라이세린, 및 테트라세린으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종의 반복단위가 2-4개인 펩티드 이다. 본 발명에 따른 요오드를 함유한 방사형상의 고분자 화합물에 있어서， 상기 중심핵， 요오드 함유 화합물， 펩티드 또는 생체적합성 고분자가 서로 연결되는 경 우， 상기 연결부위는 -NHC(=0)-, -C(=0)0-, -NHC(=0)NH -， -NHC(=0)0—， -NHC(=S)NH- ， -C=N-NH-, -ON-NHC(=0)-, -NH-, -S -， -SS -， -NHCH2CH(0H)-, -C卜 또는
Figure imgf000016_0002
이 될 수 있다.
나아가， 상기 연결부위 양 말단은 추가적으로 각각 독립적으로 또는 선택적 으로, -(CH2)m -， -(CH2)m(C=0)-, (:3ᅳ20의 시클로알킬 -((:¾)„-, C4-20의 아릴 -(CH2)m- 및
-NH-C¾CH2-으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나를 통해 상기 중심핵， 요오드 함유 화합물， 펩티드 또는 생체적합성 고분자와 연결될 수 있고, 여기서 상 기 m은 0-10의 정수인 것을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 요오드를 함유한 방사형상의 고분자 화합물에 있어서, 상기 중심핵은 펩티드， 요오드 함유 화합물 또는 생체적합성 고분자와 결합할 수 있는 아민 (amine)기， 히드록시 (hydroxy)기, 히드록시아민 (hydroxyamine)기， 카르복실 (carboxyl)기， 카르복시하이드라지드 (carboxyhydrazide)기， 하이드라진 (hydrazine) 기， 티올 (thiol)기， 아자이드 (azide)기， 알카이닐 (alkynyl )기， 할로겐 (halogen)기， 알데히드 (aldehyde)기ᅳ 케톤 (ketone)기， 에폭시 (epoxy)기, 3-카르보메록시피를리디 논 (3-carbomethoxypyrroHdinone)기， 트리 -(d-4의 알콕시) -실릴 (tri-(d-4 alkoxy)- silyl)기 등의 표면작용기를 하나 이상 갖는다. 본 발명에 따른 요오드를 함유한 방사형상의 고분자 화합물은 평균 분자량이 8,000-150,000 Da인 것이 바람직하다. 만약， 평균 분자량이 8,000 Da 미만일 경우 에는 혈관 내 장시간 순환이 충분히 이루어지지 않고 저분자 화합물과 유사하게 신 장을 통해 비교적 빨리 배출될 우려가 있고, 150,000 Da을 초과할 경우에는 높은 점도로 인한 혈관으로의 주입 시의 어려움과 체내 이상반웅 (쇼크， 알러지 등) 발생 가능성 증가， 높은 독성으로 인한 간으로의 축적 증가， 체외배출의 어려움 (매우 긴 반감기) 등의 문제가 있다. 본 발명의 실시예 1-4에서 만들어진 Gl, G2, G3, 및 G4 PAMAM 덴드리머를 중 심핵으로 사용한 고분자 화합물 lc, 2c, 3c, 및 4c의 NMR 및 ICP-MS에 의한 요오 드 함량에 근거한 이론적인 평균 분자량이 각각 대략 10,000， 18,000, 40,000， 및 86,000 Da이고， 다분산성의 (polydisperse) PAMAM 덴드리머와 PEG을 함유한 최종화 합물임을 고려할 때 (실시예 1-4의 MALDI-MS 참조)， 8,000-150,000 Da으로 범위를 잡는 것이 타당하다.
참고로 실시예 중 가장 분자량이 작은 실시예 1의 화합물 lc의 경우， 도 3에 서 나타난 바와 같이 조영제 주입 후 비교적 빠른 시간 내에 (1시간 경과 참조) 이 미 상당량이 신장에서 보였고 가장 분자량이 큰 실시예 4의 화합물 4c의 경우， 주 입 시 실시예 2의 화합물 2c나 실시예 3의 화합물 3c에 비해 조영제 용액이 좀 더 걸죽하게 느껴지고, 상기 조영제를 만든 농도로 완층액에 녹이기에도 화합물 lc, 2c, 및 3c에 비해 훨씬 더 어려웠으며 이때 상대적으로 더 많은 열을 발생하면서 더 긴 시간 동안 초음파 분쇄처리를 해줘야 해서 본 발명과 유사한 방식에 의해 화 합물 4c보다 더 분자량이 큰 고분자 화합물을 만드는 것은 CT용 조영제로서 적합하 지 않을 것으로 판단된다.
실제 G5 PAMAM 덴드리머에 기반한 물질을 제조하였고， 합성과 물질분석은 하 였으나 조영제로 사용하기 위해 완층액에 해당 농도로 용해시키는데 어려움이 많아 실제 주입실험에 사용할 수가 없었으며， 또한 PDKpolydispersity index)가 상대적 으로 매우 높아 화합물의 균일도가 떨어져 그다지 유용하지 못한 물질로 판단이 되 었다. 본 발명에 따른 요오드를 함유한 방사형상의 고분자 화합물의 바람직한 예로 하기 화학식 5 내지 8로 표현되는 화합물을 사용할 수 있다.
【화학식 5】
Figure imgf000018_0001
【 학식 7】
Figure imgf000018_0002
【화학식 8】
Figure imgf000019_0001
상기 화학식 5 내지 화학식 8에 있어서，
상기 중심핵은 α -， β- 및 γ -사이클로덱스트린 (cyclodextrin), 글루코스， 갈락토스 및 만노스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 1종의 고리형 탄화수 소， 포르피린 (porphyrin) 및 이의 유도체， D0TA(1,4,7, 10—tetraazacyclododecane- 1,4,7, 10-tetraacetic acid) 및 이의 유도체， 라이신， 아스파르트산， 글루타민산, 세린， 시스테인 및 타이로신으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 1종 이상의 펩티드가 2-4개 연결되어 형성된 고리형 펩티드, 폴리아미도아민 (PAMAM) 덴드리머， 폴리라이신 덴드리머， 폴리프로필렌이민 (PPI) 덴드리머， 폴리에스터 덴드리머， 폴 리글루타민산 덴드리머， 폴리아스파르트산 덴드리머， 폴리글라이세롤 덴드리머 및 폴리멜라민 덴드리머로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 1종의 덴드리머， 폴 리라이신， 폴리에스터， 폴리글루타민산， 폴리아스파르트산 및 폴리글라이세롤으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 1종의 고차분지형 (hyperbranched) 고분자， 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 및 이의 공중합체 (co-polymer) 유도체로 이루어지는 군으로 부터 선택되는 어느 1종의 별형상 (star-shaped)의 고분자 및 이들의 유도체이고，
T 및 T는 요오드 함유 화합물로서， T은
Figure imgf000019_0002
또
Figure imgf000019_0003
이며， 이때 상기 R 및 R은 각각 독립적으로 또는 선택적으로，
-NH-, -NR-, -醒 2-， -NNHR -NNR 2-, -0- 또는 -S-이고， R는 -NH2, -NHR， -NR2, -NHNH2) -NHNHR , -NHNR2, -OH, -OR , -SH 또는 SR이고， 상기 R는 H, -Boc, Ci-6 의 직쇄 또는 측쇄 알킬， 또는 비치환 또는 치환된 C5-7의 아릴 또는 헤테로아릴이 고， 상기 R3는 R4와 같거나， (C=0)R4, -(C=0)0R , -(OO)NHR4 또는 -(O0)NR4 2이고，
D는 펩티드로서， 다이라이신， 트라이라이신， 테트라라이신 다이글루타민산， 트라이글루타민산， 테트라글루타민산, 다이아스파르트산， 트라이아스파르트산， 테 트라아스파르트산， 다이시스테인， 트라이시스테인， 테트라시스테인， 다이세린， 트 라이세린， 및 테트라세린으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종의 반복단위가 2-4개인 펩티드이고,
P는 폴리에틸렌글리콜 (PEG), 히알루론산， 헤파린 또는 이들의 유도체이고, X는 상기 중심핵의 표면작용기로서， 아민 (amine)기， 히드록시 (hydroxy)기, 히드록시아민 (hydroxyamine)기， 카르복실 (carboxyl )기， 카르복시하이드라지드 (carboxyhydrazide)기， 하이드라진 (hydrazine)기， 티올 (thiol)기， 아자이드 (azide) 기， 알카이닐 (alkynyl)기， 할로겐 (halogen)기， 알데히드 (aldehyde)기， 케톤 (ketone)기， 에폭시 (epoxy)기， 3-카르보메톡시피를리디논 (3- carbomethoxypyrrolidinone)기 , 트리 _(Ci-4의 알콕시 ) -실릴 (tri-CCw alkoxy)-si lyl ) 기이고,
L1 및 L2는 상기 중심핵， 요오드 함유 화합물 (T1 또는 T2), 펩티드 (D) 또는 생체적합성 고분자 (P) 간 연결부위로서， -NHC(=0)_, -C(=0)0—， -NHC(=0)NH-, -NHC(=0)0-, -NHC(=S)NH_ _C=N-NH -， -C=N-NHC(=0)-, -NH-, -S-, -SS―，
-NHCH2CH(0H)-, -0- 또는
Figure imgf000020_0001
이고， 상기 연결부위 양 말단은 추가적으로 각각 -(CH2)m-, -(CH2)m(C=0)-, C3-2。의 시클로알킬 -(CH2)ra-, C4-20의 아릴 -(C¾)m- 및
-NH-CH2CH2-으로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 또는 선택적으로 선택되는 어느 하나를 통해 상기 중심핵， 요오드 함유 화합물， 펩티드 또는 생체적합성 고분자와 연결되고， 여기서 상기 m은 0-10의 정수이고，
a 및 b는 각각 독립적으로 또는 선택적으로, 0 또는 1의 정수이고,
c는 2-4의 정수이고,
d, e, f, g, h 및 i는 각각 독립적으로 또는 선택적으로， 2 내지 60의 정수 이고, j는 1-10의 정수이다. 이때, 상기 화학식 7 및 화학식 8의 경우， 상기 생체적합성 고분자가 PEG인 경우에는 중심핵으로부터 외부로 향하는 말단이 d-4의 알콕시기인 것을 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 요오드를 함유한 방사형상의 고분자 화합물의 바람직한 예로 상기 화학식 5 내지 8로 표현되는 화합물을 더욱 구체적으로 설명하기 위해， 하기 그 이미지를 나타내었다.
Figure imgf000021_0001
상기의 이미지에서，
A의 경우에는 중심핵 (회색의 큰원)에 각각 요오드 함유 화합물 (붉은색의 작 은원)과 생체적합성 고분자 (녹색의 긴 물결선)를 결합시키는 것으로 화학식 5의 화 합물을 이미지화한 것이고，
B의 경우에는 중심핵에 결합된 요오드 함유 화합물에 생체적합성 고분자를 결합시키는 것으로 화학식 6의 화합물을 이미지화한 것이고，
C의 경우에는 2-4개의 요오드 함유 화합물이 다발로 치환된 펩티드 (파란색의 짧은 물결선) 및 생체적합성 고분자를 중심핵에 독립적으로 결합시키는 것으로 화 학식 7의 화합물을 이미지화한 것이고，
D의 경우에는 중심핵에 결합된 2-4개의 요오드 함유 화합물이 다발로 치환된 펩티드에 생체적합성 고분자를 결합시키는 것으로 화학식 8의 화합물을 이미지화한 것이다. 본 발명에 따른 요오드를 함유한 방사형상의 고분자 화합물은 기존의 요오드 를 함유한 저분자 조영제 화합물에 비해 조영효과 지속시간이 현저히 향상되고， 중 심핵 표면 가까이에 치환된 독성과 각종 이상반웅을 일으킬 소지가 있는 요오드 함 유 화합물들을 비교적 길이가 긴 생체적합성 고분자 사슬 층으로 둘러싸는 보호막 을 형성하여 이들의 외부환경에의 노출을 방지함으로써 체내 독성을 감소시킬 뿐만 아니라， 대식세포에 의한 빠른 흡수를 방지하여 체내 순환시간을 연장하며， 체외배 출이 체내 주입 후 적절한 시간경과 후 이루어지고， 제조방법 및 정제방법이 매우 간단하여 고수율 및 저비용으로 대량생산이 가능하며， 다분산성 (polydispersity)이 매우 낮아 제조와 효과면에서 재현성이 높고， 제조되는 요오드를 함유한 방사형상 의 고분자 화합물의 구조가 모두 공유결합으로 이루어져 있어 구조적으로도 매우 안정하므로， CT용 조영제의 제조에 유용할 수 있다. 또한， 본 발명은 원형 또는 구형의 대칭형 저분자 화합물， 또는 방사형의 고 분자 화합물로 구성되는 중심핵의 표면작용기 일부에 생체적합성 고분자가 결합되 도록 반웅시키는 단계 (단계 1); 및
상기 단계 1의 중심핵에서 미반응된 표면작용기에 요오드 함유 화합물이 직 접 또는 템티드를 통해 결합되도록 반웅시키는 단계 (단계 2)를 포함하는 상기 요오 드를 함유한 방사형상의 고분자 화합물의 제조방법을 제공한다. 나아가， 본 발명은 원형 또는 구형의 대칭형 저분자 화합물， 또는 방사형의 고분자 화합물로 구성되는 중심핵의 표면작용기 일부에 요오드 함유 화합물이 결합 되도록 반응시키는 단계 (단계 1); 및
상기 단계 1에서 중심핵에 결합된 요오드 함유 화합물에 생체적합성 고분자 가 결합되도록 반응시키는 단계 (단계 2)를 포함하는 상기 요오드를 함유한 방사형 상의 고분자 화합물의 제조방법을 제공한다. 또한， 본 발명은 요오드 함유 화합물이 생체적합성 고분자와 펩티드를 통해 결합되도록 반응시키는 단계 (단계 1); 및
상기 단계 1에서 펩티드를 통해 생체적합성 고분자에 결합된 요오드 함유 화 합물이 원형 또는 구형의 대칭형 저분자 화합물， 또는 방사형의 고분자 화합물로 구성되는 중심핵의 표면작용기에 결합되도록 반응시키는 단계 (단계 2)를 포함하는 상기 요오드를 함유한 방사형상의 고분자 화합물의 제조방법을 제공한다. 본 발명에 따른 요오드를 함유한 방사형상의 고분자 화합물의 제조방법에 있 어서， 상기 원형 또는 구형의 대칭형 저분자 화합물， 방사형의 고분자 화합물， 표 면작용기， 요오드 함유 화합물， 펩티드， 생체적합성 고분자의 예들은 상술한 바와 같다. 본 발명의 일실시예에 따른 제조방법에 있어서， 중심핵의 표면작용기 일부에 생체적합성 고분자를 약 15—50% 정도로 결합시킨 후, 과량의 요오드 함유 화합물을 투여하여 반웅하지 않고 남아있는 중심핵의 표면작용기에 결합시켜 방사형상의 고 분자 화합물 중 요오드 함량이 약 15-50% 정도가 되도록 조절할수 있다. 또한， 본 발명은 상기 요오드를 함유한 방사형상의 고분자 화합물을 유효성 분으로 함유하는 CT용 조영제 조성물을 제공한다.
이때， 상기 요오드를 함유한 방사형상의 고분자 화합물은 요오드 함량이 15- 50%인 것이 바람직하다. 만약， 요오드를 함유한 방사형상의 고분자 화합물 중 요오 드 함량이 15% 미만일 경우에는 조영효과가 층분하지 못해 과량의 조영제를 투여해 야하므로 생체내 주입 시 이상반응 발생 가능성이 높은 문제가 있고， 50¾를 초과할 경우에는 독성이 증가하여 생체 주입용으로 사용하기 힘든 문제가 있다.
【발명의 실시를 위한 형태】
이하， 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐， 실시예 에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
<제조예 1> 고리화된 중성의 프탈이미드 유도체 (8)의 제조
Figure imgf000023_0001
화합물 6 TIPN, 2.40 g, 3.68 mmol) 및 화합물 yd e/^-Boc-에틸렌디아민， 200 mg, 1.22 mmol)을 DMS0(5.0 mL)에 녹이고， 여기에 트리에틸아민 (0.50 mL, 3.59 mmol)을 첨가하였다. 반응 용기에 아르곤 가스를 채운 후 상기 반웅 흔합물을 40 °C에서 16시간 동안 교반하였다. 상기 미정제 반웅 생성물을 크기배제 크로마토그 래피 (size-exclusion chromatography, SEC) 컬럼 (모델명: Bio-Beads S-Xl, H 36 cm X0.D. 4.5 cm, 제조사: Bio-Rad)으로 DMF에서 여과하여 DMS0를 제거하고, 감압 하에 용매를 제거한 후 실리카겔 크로마토그래피 (10:1 CH2Cl2/acetone)를 행하여 목 적화합물 8을 노란색 분말로 얻었다 (60.1 mg, 75.7 umol, 6%).
β{ ' 0.63 [silica gel, 10：1 CH2Cl2/acetone]；
H NMR (600 MHz, DMS0-i6) d 6.89 (t, 1H, J = 6.4 Hz, )， 3.60 (t, 2H, J = 5.6 Hz, Hi), 3.14 (q, 2H, J = 5.8 Hz, H2), 1.29 (s, 9H, H4);
13C NMR (150 MHz, DMS0- ) d 164.1， 155.7, 135.4, 134.4， 104.0, 77.7, 38.9， 37.5, 28.1；
HRMS (ESI) Calcd for C15H14N204l4Na (M + Na)+: 816.7030, Found: 816.7028.
<제조예 2>고리 된 중성의 프탈이미드 유도체 (10)의 제조
Figure imgf000024_0001
6 9 10
화합물 60ΊΡΝ, 3.84 g, 5.89 mmol) 및 화합물 9(에탄을아민, 300 mg, 4.91 隱 ol)을 DMS0(8 mL)에 용해시킨 용액에 트리에틸아민 (0.82 mL, 5.88 隱 ol)을 첨가 하고， 50 °C로 가열하며 19시간 동안 교반하였다. 상기 반옹 흔합물에서 DMS0 용매 를 제거하기 위해 이동상으로 DMF를 사용한 SEC 컬럼 (모델명 : Bio-Beads S-Xl, H
36 cm X0.D. 4.5 cm, 제조사: Bio—Rad)으로 분리하고, 감압하에 농축시켜 얻은 생 성물을 실리카겔 크로마토그래피 (10:1 CH2Cl2/acetone)로 정제하여 화합물 10을 노 란색 분말로 얻었다 (1.11 g, 1.60 mmol, 33%).
화합물 6 TIPN, 3.84 g, 5.89 mmol) 및 화합물 9(에탄을아민， 300 mg, 4.91 mmol)을 DMSC 8.0 mL)에 녹이고, 여기에 트리에틸아민 (0.82 mL, 5.88 讓 ol)을 첨가 하였다. 반응 용기에 아르곤 가스를 채운 후 상기 반웅 흔합물을 50 °C에서 19시간 동안 교반하였다. 상기 미정제 반응 생성물을 SEC 컬럼 (모델명: Bio-Beads S— XI,
H 36 cm xO.D. 4.5 cm, 제조사: Bio-Rad)으로 DMF에서 여과하여 DMS0를 제거하고， 감압하에 용매를 제거한 후 실리카겔 크로마토그래피 (10:1 CH2Cl2/acetone)를 행하 여 목적화합물 10을 노란색 분말로 얻었다 (1.11 g, 1.60 mmol, 33%) .
J?{: 0.37 [silica gel , 10:1 CH2Cl2/acetone]； H NMR (600 MHz, DMSO-G d 3.62 (t, 2H, J = 5.8 Hz, Hi), 3.55 (q, 2H, J = 5.8 Hz, ¾)；
13C NMR (150 MHz, DMS0-i/6) d 164.2, 135.5, 134.4, 104.0, 57.5, 41.3.
<실시예 i> Gl PAMAM-mPEG20oo-TIPAA 결합체 (lc)의 제조
Figure imgf000025_0001
단계 1: Gl PAMAM-mPEG9 j 결합체 (lb)의 제조
Figure imgf000025_0002
1b
Aldrich사에서 구입한 Gl PAMAM 덴드리머 (la)를 진공상태에서 건조하여 메탄 을을 제거하였다. 상기 화합물 la(1.31 g, 0.916瞧 ol)를 DMS0(100 mL)에 용해시키 고， 교반 중인 상기 용액에 mPEG 카보네이트 화합물 5(4.95 g, 2.27 mmol)를 한번 에 첨가하였다. 반응용기에 아르곤 가스를 채운 후 상기 반웅흔합물을 상온에서 2 일간 교반한 다음， 메탄올 상에서 6시간 동안 교반하며 투석 (모델명: Spectra/Por Regenerated Cel lulose(RC) membrane, MWCO 1000, 제조사: Spectrum Laboratories) 을 2회 실시하였다. 다음으로， 감압하에 용매를 제거하여 얻어진 미정제 생성물을
SEC 컬럼 (모델명 : Bio-Beads S-Xl, H 40 cm xO.D. 4.5 cm, 제조사: Bi으 Rad)으로
DMF에서 정제하고， 진공상태에서 건조하여 화합물 lb를 용매 일부가 포함된 채로 얻었다 (5.65 g).
H NMR (600 MHz, DMS0-i¾) d 8.12-7.87 (m, NH∞ and NHG1), 7.22 (br s,
2.94H, NHPEG of major isomer), 6.80 (br s, 0.34H, NHPEG of minor isomer), 4.04 (t, 6.17H, J = 4.7 Hz, Hh)， 3.62-3.39 (m, 667.57H, Hi; ¾, and Hk), 3.24 (s, H,), 3.10-2.99 (m, 33.53H, ¾, Hf, HfPEG, and pEG), 2.66-2.58 (m, 33.08H, Hb and Hg), 2.43 (mᅳ 11.86H, He and Ha), 2.19 (m, 24.00H, Hc);
MS (MALDI-TOF, DHB matrix) Mn 7698.11, Mw 7747.40, PDI 1.01;
MS (MALDI-TOF, THAP matrix) Mn 7757.35, Mw 7795.41, PDI 1.00. 단계 2: Gl PAMAM-mPEG^-TIPAA결합체 (lc)의 제조 상기 단계 1에서 얻은 화합물 lb용액 (5.65 g) 및 4，5，6，7-테트라아이오도벤
조퓨란 -1，3-디온 (6XTIPN, 5.90 g, 9.05 mmol)을 DMSO(100 mL)에 녹이고， 여기에 ¬디이소프로필에틸아민 (DIEA, 2.40 mL, 13.8 麵 ol)를 첨가하였다. 반응용기에
아르곤 가스를 채운 후 상기 반응흔합물을 상온에서 2일간 교반하고， 여기에 추가
로 TIPN(3.00 g, 4.60 mmol)을 한번에 첨가한 후 반응흔합물을 상온에서 24시간 동
안 교반하였다. 상기 반웅 흔합물을 메탄올 상에서 6시간 동안 교반하며 투석 (모델
명: Spectra/Por Regenerated Cel lulose(RC) membrane, MWC0 1000， 제조사:
Spectrum Laboratories)을 2희 실시하였다. 다음으로， 감압하에 용매를 제거하여
얻어진 미정제 생성물을 SEC (모델명: Bio-Beads S-Xl, H 40 cm X0.D. 4.5 cm, 제
조사: Bio-Rad)으로 정제하였다. 상기에서 정제된 생성물을 합쳐서 SEC 컬럼
(Sephadex LH-20, H 40 cm xO.D. 3.0 cm)으로 여과하여 남아있는 DMF를 제거하고，
에탄올 (80 mL)에 녹여 실린지 필터 (모델명: Puradisc 25 Syringe Filter, 세공크기
0.45 urn, PTFE, 제조사: Whatman)로 멸균-여과한 후 진공상태에서 3일간 건조시켜
목적화합물 lc를 얻었다 (3.89 g).
요오드 함량 (Inductively coupled plasma mass spectrometry, I CP-MS)：
20.7%.
<실시예 2> G2 PAMAM-mPEGzooo-TIPAA 결합체 (2c)의 제조
Figure imgf000026_0001
단계 1: G2 PAMAM-mPEGgnnn conjugate (2b)의 제조
Figure imgf000027_0001
Aldrich사에서 구입한 G2 PAMAM 덴드리머 (2a)를 진공상태에서 건조하여 메탄 을을 제거하였다. 상기 화합물 2a(1.32 g, 0.405 mmol)를 DMS0(90 mL)에 용해시키 고, 교반 중인 상기 용액에 mPEG 카보네이트 화합물 5(3.94 g, 1.81 睡 ol)를 한번 에 첨가하였다. 반응용기에 아르곤 가스를 채운 후 상기 반응흔합물을 상온에서 2 일간 교반한 다음， 메탄올 상에서 6시간 동안 교반하며 투석 (모델명: Spectra/Por Regenerated Cel lulose(RC) membrane, MWCO 3500， 제조사: Spectrum Laboratories) 을 2회 실시하였다. 다음으로， 감압하에 용매를 제거하여 얻어진 미정제 생성물을
®
SEC 컬럼 (모델명 : Bio-Beads S— XI， H 40 cm xO.D. 4.5 cm, 제조사: Bio-Rad)으로
DMF에서 정제하고， 진공상태에서 건조하여 화합물 2b를 용매 일부가 포함된 채로 얻었다 (5.20 g).
H NMR (600 MHz, DMSC ) d 8.03-7.83 (m, ΝΗ∞, N¾， and NHG2), 7.21 (br s, 4.50H, NHpEG of major i somer ) , 6.80 (br s, 0.60H , NHpEG of minor isomer), 4.04 (t, 8.61H, J = 4.6 Hz, Hh), 3.62-3.39 (m, 925.04H, H;, ¾, and Hk), 3.24 (s, H , 3.10-3.00 (m, 70.07H, Hd) Hf, HfPEG, and pEG)， 2.65 (m, 52.49H, Hb), 2.57 (m, 19.21H, Hg), 2.43 (m, 27.58H, He and Ha)( 2.20 (m, 56.00H, Hc); MS (MALDI-T0F, THAP matrix) Mn 11742.14, Mw 11785.30, PDI 1.00.
단계 2: G2 PAMAM-mPEGpnoo-TIPAA 결합체 (2c)의 제조 상기 단계 1에서 얻은 화합물 2b 용액 (5.20 g) 및 TIPN(6)OL89 g, 2.90 mmol)올 DMS0(94 mL)에 녹이고， 여기에 DIEA(0.80 mL, 4.6 誦 ol)를 첨가하였다. 반 웅용기에 아르곤 가스를 채운 후 상기 반웅흔합물을 상온에서 2일간 교반하고， 여 기에 추가로 TIPN(990 mg, 1.52 隱 ol)을 한번에 첨가한 후 반웅흔합물을 상온에서 24시간 동안 교반하였다. 상기 반웅 흔합물을 메탄올 상에서 6시간 동안 교반하며 투석 (모델명 : Spectra/Por Regenerated Cel lulose(RC) membrane, MWCO 8000， 제조 사: Spectrum Laboratories)을 2회 실시하였다. 다음으로， 감압하에 용매를 제거하 여 얻어진 미정제 생성물을 SEC (모델명: Bio-Beads S-Xl, H 40 cm xO.D. 4.5 cm, 제조사: Bio-Rad)으로 정제하였다. 상기에서 정제된 생성물을 합쳐서 SEC 컬럼 (Sephadex LH-20, H 40 cm xO.D. 3.0 cm)으로 여과하여 남아있는 DMF를 제거하고， 에탄올 (80 mL)에 녹여 실린지 필터 (모델명: Puradisc 25 Syringe Filter, 세공크기 0.45 /m, PTFE, 제조사: Whatman)로 멸균-여과한 후 진공상태에서 3일간 건조시켜 목적화합물 2c를 얻었다 (3.04 g).
요오드 함량 (Inductively coupled plasma mass spectrometry, I CP-MS)：
23.0%.
<실시예 3> G3 PAMAM-mPEG2000-TIPAA 결합체 (3c)의 제조
Figure imgf000028_0001
단계 1: G3 PAMAM-mPEGgnnn conjugate (3b)의 제조
Figure imgf000028_0002
Aldrich사에서 구입한 G3 PAMAM 덴드리머 (3a)를 진공상태에서 건조하여 메탄 올을 제거하였다. 상기 화합물 3a(1.16 g, 0.168瞧 ol)를 DMS0(112 mL)에 용해시키 고， 교반 중인 상기 용액에 mPEG 카보네이트 화합물 5(3.27 g, 1.50 瞧 ol)를 한번 에 첨가하였다. 반응용기에 아르곤 가스를 채운 후 상기 반웅흔합물올 상온에서 2 일간 교반한 다음， 메탄올 상에서 6시간 동안 교반하며 투석 (모델명: Spectra/Por Regenerated Cel lulose(RC) membrane, MWCO 1000, 제조사: Spectrum Laboratories) 을 2회 실시하였다. 다음으로, 감압하에 용매를 제거하여 얻어진 미정제 생성물을 SEC 컬럼 (모델명 : Bio— Beads S-Xl, H 40 cm xO.D. 4.5 cm, 제조사: Bio-Rad)으로
DMF에서 정제하고， 진공상태에서 건조하여 화합물 3b를 용매 일부가 포함된 채로 얻었다 (3.29 g).
H NMR (600 MHz, DMS0-o d 8.13-7.83 (m, NHGO, NHG1, NHG2; and N¾3),
7.22 (br s, 8.98H, NHPEG of major isomer), 6.80 (br s, 1.16H, NHPEG of minor isomer), 4.04 (t, 17.51H, J = 4.5 Hz, Hh), 3.62-3.39 (m, 1846.66H, Hi ; ¾, and Hk), 3.24 (s, Hj), 3.10-2.99 (m, 149.85H, ¾， Hf, HfPEG) and HgPEG) , 2.66-2.59 (m, 146.61H, Hb and Hg)， 2.43 (m, 56.55H, He and Ha), 2.20 (m, 120.00H, Hc); MS (MALDI-T0F, DHB matrix) Mn 21045.06, Mw 22307.71, PDI 1.06.
단계 2: G3 PAMAM-mPEG^onn-TIPAA 겸합체 (3c)의 제조 상기 단계 1에서 얻은 화합물 3b 용액 (3.24 g) 및 TIPN(6)(3.86 g, 5.92 隱 ol)을 DMSC 100 mL)에 녹이고， 여기에 DIEAU.50 mL, 8.61 隱 ol)를 첨가하였다. 반웅용기에 아르곤 가스를 채운 후 상기 반응흔합물을 상온에서 2일간 교반하고， 여기에 추가로 TIPNU.93 g, 2.96 画 ol)을 한번에 첨가한 후 반웅흔합물올 상온에 서 24시간 동안 교반하였다. 상기 반웅 흔합물을 메탄올 상에서 6시간 동안 교반하 며 투석 (모델명 : Spectra/Por Regenerated Cel lulose(RC) membrane, MWCO 1000， 제 조사: Spectrum Laboratories)을 2회 실시하였다. 다음으로， 감압하에 용매를 제거 하여 얻어진 미정제 생성물을 SEC (모델명: Bio— Beads S-Xl, H 40 cm xO.D. 4.5 cm, 제조사: Bio-Rad)으로 정제하였다. 상기에서 정제된 생성물을 합쳐서 SEC 컬럼 (Sephadex LH-20, H 40 cm xO.D. 3.0 cm)으로 여과하여 남아있는 DMF를 제거하고, 에탄올 (80 mL)에 녹여 실린지 필터 (모델명: Puradisc 25 Syringe Filter, 세공크기 0.45 j , PTFE, 제조사: Whatman)로 멸균-여과한 후 진공상태에서 3일간 건조시켜 목적화합물 3c를 얻었다 (3.32 g). 요오드 함량 (Inductively coupled plasma mass spectrometry, I CP-MS)：
26.5%. <실시예 4> G4 PAMAM-mPEGzooo-TIPAA 결합체 (4c)의 제조
Figure imgf000030_0001
단계 1: G4 PAMAM-mPEGgnno 결합체 (4b)의 제조
Figure imgf000030_0002
Aldrich사에서 구입한 G4 PAMAM 덴드리머 (4a)를 진공상태에서 건조하여 메탄 올올 제거하였다. 상기 화합물 4a(579 mg, 0.0407 mmol)를 DMS0(27 mL)에 용해시키 고， 교반 중인 상기 용액에 mPEG 카보네이트 화합물 5(1.94 g, 0.890瞧 ol)를 한번 에 첨가하였다. 반웅용기에 아르곤 가스를 채운 후 상기 반응흔합물을 상온에서 2 일간 교반한 다음， 메탄을 상에서 6시간 동안 교반하며 투석 (모델명 : Spectra/Por Regenerated Cel lulose(RC) membrane, MWCO 1000， 제조사: Spectrum Laboratories) 을 2회 실시하였다. 다음으로， 감압하에 용매를 제거하여 얻어진 미정제 생성물을
SEC 컬럼 (모델명 : Bio-Beads S—Xl, H 40 cm X0.D. 4.5 cm, 제조사: Bio-Rad)으로
DMF에서 정제하고, 진공상태에서 건조하여 화합물 4b를 용매 일부가 포함된 채로 얻었다 (1.67 g).
H NMR (600 MHz, DMSO— c ) d 8.04-7.81 (m, ΝΗ∞, NHG1, NHG2, NHG3, and
NHG4), 7.22 (br s, 20.62H, NHPEG of major isomer), 6.81 (br s, 2.90H, NHPEG of minor isomer), 4.03 (t, 39.80H, J = 4.5 Hz, Hh) , 3.62-3.39 (m, 4330.96H, Hj, and Hk), 3.24 (s, )， 3.11-2.99 (m, 310.94H, Hd, Hf, HffEG, and HgpEG) , 2.68- 2.61 (mᅳ 299.21H, Hb and Hg), 2.43 (m, 104.94H, He and Ha) , 2.20 (m, 248.00H,
Hc);
MS (MALDI-T0F, DHB matrix) M„ 44435.05, Mw 46195.16, PDI 1.04. 단계 2: G4 PAMAM-mPEGgnm-TIPAA 결합체 (4c)의 제조 상기 단계 1에서 얻은 화합물 4b 용액 (1.63 g) 및 TIPN(6)(1.35 g, 2.07 mmol)을 DMS0(32 mL)에 녹이고, 여기에 DIEA(0.54 mL, 3.10 t ol)를 첨가하였다. 반웅용기에 아르곤 가스를 채운 후 상기 반웅흔합물을 상온에서 2일간 교반하고， 여기에 추가로 TIPN(677 mg, 1.04 睡 ol)을 한번에 첨가한 후 반응흔합물을 상온에 서 24시간 동안 교반하였다. 상기 반응 흔합물을 메탄올 상에서 6시간 동안 교반하 며 투석 (모델명 : Spectra/Por Regenerated Cel lulose(RC) membrane, MWC0 1000, 제 조사: Spectrum Laboratories)을 2회 실시하였다. 다음으로， 감압하에 용매를 제거 하여 얻어진 미정제 생성물을 SEC (모델명: Bio-Beads S-Xl, H 40 cm xO.D. 4.5 cm, 제조사: Bio-Rad)으로 정제하였다. 상기에서 정제된 생성물을 합쳐서 SEC 컬럼 (Sephadex LH-20, H 40 cm xO.D. 3.0 cm)으로 여과하여 남아있는 DMF를 제거하고， 에탄올 (80 mL)에 녹여 실린지 필터 (모델명: Puradisc 25 Syringe Filter, 세공크기 0.45 im, PTFE, 제조사: Whatman)로 멸균-여과한 후 진공상태에서 3일간 건조시켜 목적화합물 4c를 얻었다 (1.27 g).
요오드 함량 (Induct ively coupled plasma mass spectrometry, I CP-MS) ·'
25.2%.
<실험예 1>세포독성시험 (Cytotoxicity Assays)
세포독성시험에 사용한 HeLa 세포주는 ATCC(American Type Culture Collection, Manassas, VA)로부터 구입하였으며， 10% FBS( fetal bovine serum), 50 U/mL 페니실린 및 50 μg/mL 스트렙토마이신이 보층된 DMEM(Dulbecco' s modified eagle medium, Gibco)에서 37 °C， 5% 이산화탄소 (C02) 분위기하의 조건에서 보존하 였다.
실시예 1-4에서 제조한 진공상태에서 건조된 고체의 PAMAM-PEG2000-TIPM 결 합체 ic-4c 각 10 mg을 1.0 mL의 3차 증류수 (Mi 11 ipore Milli— Q)에 녹여 10 mg/mL 농도의 모액을 제조하였다. 각각의 모액은 짧게 초음파 처리하여 균질화하였다. 다 음으로， 무혈청 DMEM용액을 사용하여 1， 5， 10， 50, 100 및 500 mg/mL의 농도로 단 계적으로 희석된 샘플을 준비하였다. HeLa세포는 웰당 ixi()3의 밀도로 세포가 존재 하는 96-웰 플레이트 (Corning Costar, Cambridge, MA)에서 37 °C , 5% C02 분위기하 의 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 세포는 각 웰당 100 mL의 상기 희석액 또는 100 mL의 무혈청 DMEM (대조군)으로 처리하고 37 °C , 5% C02 분위기하의 조건에서 각 각 24, 48 및 72시간 동안 배양하였다. 상기 제제는 5 mg/mL 3-(4，5-디메틸티아졸- 2-일) -2，5-디페닐테트라졸리움 브로마이드 (MTT)를 녹인 무혈청 DMEM으로 대체하고， 세포를 추가로 4시간 동안 배양하였다. MTT를 흡입제거하고 DMSO(100 mL)를 각 웰 에 가하여 포르마잔 (formazan) 결정을 용해시켰다 (Mosmann, T. , J. Immunol. Methods 1983, 65， 55-63). 흡광도는 570 nm에서 마이크로플레이트 리더 (모델명: BioRad microplate reader , 제조사: BioRad)를 이용하여 측정하였고， 그 결과를 도 1에 나타내었다. 상기 분석은 4회씩 반복 측정하였다. 도 1에 나타난 바와 같이 , 실시예 1-4에서 제조한 4가지 CT용 조영제 화합물 lc, 2c, 3c, 및 4c는 시행한 세포독성테스트 환경 중 가장 극한의 조건 (500 mg/mL 의 조영제 농도 하에서 72시간 동안 배양)에서도 각각 순서대로 88.5%， 88.4%, 88.4%， 및 87.9% 의 매우 높은 세포 생존율을 보여 세포에 대한 독성이 거의 없는 것으로 나타났다. 따라서， 본 발명에 따른 요오드를 함유한 방사형상의 고분자 화합물을 함유 하는 CT용 조영제의 체내 안전성이 매우 우수함을 알 수 있다.
<실험예 2> 생체외 (in vitro) 마이크로 CT촬영 평가
실시예 1-4에서 제조한 화합물 lc_4c를 유효성분으로 함유한 조영제 조성물 로 생체외 (in vitro) 마이크로 CT를 촬영하였을 경우에 조영효과를 알아보기 위하 여 다음과 같이 실험하였다.
준비단계: CT용 조영제 조성물의 제조
실시예 1-4에서 제조한 각각의 PAMAM-PEG2000-TIPM 결합체 (화합물 lc, 2c,
3c, 및 4c)를 멸균 처리된 20 mM 트리스 완층액 (pH 7.4， 0.1 mg/mL EDTA 포함)에 녹여 250 mg/mL용액을 만들었다. 상기 용액을 짧게 초음파 처리하여 균질화하고， 바로 사용하지 않는 경우 4 °C에서 보관하였다. 상기 용액을 동물에 주입하기 전 에, 상기 용액을 넁장고에서 꺼내두어 실온으로 맞추고 보텍스 (vortex)로 흔들어 주었다.
하기 표 1에 본 발명의 CT용 조영제의 점도 (viscosity, 30 °C) 및 삼투압 (osmolality) 측정결과를 정리하였다. 【표 1】
Figure imgf000033_0001
상기 표 1에서 , 측정값은 평균士표준편차로 나타내었다. 각각 동일 조건 하 에서 5회씩 측정하고 최고치와 최저치를 제외한 나머지 3개의 데이터에 대한 평균 과 표준편차를 구하였다. 생체의 (in vitro) 마이크로 CT 촬영 평가
상기 준비단계에서 제조한 실시예 1-4의 화합물 lc, 2c, 3c, 또는 4c를 포함 하는 CT용 조영제 (250 mg/mL)를 생체 내에 주입하기에 앞서， 예비 점검으로 이들의 X-선 홉광도를 시판 중인 인체용 및 동물용 CT용 조영제와 비교하기 위하여 튜브상 에서 2D X-선 순간촬영 (snapshot) 영상을 얻는 하기와 같은 실험을 수행하였다. 여기서 양성 대조군으로는 혈관내 주입시 급속한 배출이 이루어지는 저분자 화합물 기반 인체용 CT용 조영제인 "Iobrix" (태준제약)와 혈관내 주입시 비교적 장 시간 순환이 가능한 에멀견 나노입자 기반의 동물용 CT용 조영제인 "Fenestra VC"(ART, Canada)를 사용하였다. 즉， 각각의 250 mL 튜브에 상기 준비단계에서 제 조한 CT용 조영제 4가지와 "Fenestra VC", "Iobrix" 그리고 음성대조군으로서 20 mM 트리스 완층액 (pH 7.4, 0.1 mg/mL EDTA 포함) 각 250 씩을 넣고， 또한 빈 튜 브 하나도 음성대조군으로 준비하였다. 상기 8개의 튜브를 NFR Polaris-G90 in vivo micro-CT scanner (제조사: NanoFocusRay)의 촬영용 베드 (bed)에 나란히 일렬 로 배열하여 올려놓고, 2D X-선 순간촬영 영상을 찍었고 [영상 파라미터: 60 kVp,
60 mA, 500 ras exposure time, field of view (F0V) 80.00X83.71 mm2, 1.4X magnification], 그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타난 바와 같이， 음성대조군으로 사용한 20 mM 트리스 완충액 (X-선 투과 신호세기: 1359.5) 및 빈 류브 (X-선 투과 신호세기: 1676.5)에 비하여 모든 CT용 조영제의 X-선 투과율 (X-선 흡광도에 반비례)이 훨씬 더 낮은 값을 나타내었 으며， 이 중 급속한 배출이 이루어지는 인체용 CT용 조영제인 "Iobrix"가 가장 높 은 X-선 흡광도 (X-선 투과 신호세기: 198.0)를 보였고， 동물용 CT용 조영제인 "Fenestra VC"(X_선 투과 신호세기: 866.0)와 실시예 1-4에서 제조한 화합물 lc, 2c, 3c, 및 4c를 함유한 CT용 조영제 (X-선 투과 신호세기: 순서대로 904.5, 838.0, 826.5, 및 827.0)들은 생체외 (in vitro) 튜브 2D X-선 순간촬영 영상에서 모두 비 슷한 수준의 X-선 흡광도를 나타내었다. 따라서 , 본 발명에 따른 요오드를 함유한 방사형상의 고분자 화합물을 함유 하는 CT용 조영제는 조영효과가 층분함을 알 수 있다.
<실험예 3> 생체내 (in vivo) 마이크로 CT촬영 평가
실시예 1-4에서 제조한 화합물 lc-4c를 유효성분으로 함유한 조영제 조성물 로 생체내 (in vivo) 마이크로 CT를 촬영하였을 경우에 조영효과를 알아보기 위하여 소형동물용 마이크로 CT기기를 이용하여 다음과 같이 실험하였다.
구체적으로， 실험동물로는 15-22 g의 6-8주령의 건강한 수컷 C57BL/6마우스 (Orient Bio, 한국)를 사용하였다. 마우스는 조영제를 주입하기 12시간 전부터 주 입 후 4시간 경과 후까지 물과 밥을 주지 않았고， 조영제 주입 후 4시간 경과 후의 CT촬영이 종료된 직후부터 물과 밥을 모두 주었다. 조영제 주입 전 음성대조군으 로서 조영제 주입 없이 마우스를 3¾ 이소플루란을 함유한 산소 분위기하의 유도챔 버 (induction chamber)에 5분 정도 넣어 두어 마취시킨 뒤， 마우스를 NFR Polaris- G90 in vivo micro-CT scanner (NanoFocusRay, 한국)의 촬영용 베드 (bed)에 등을 위 로 향하게 하여 올리고， 1.5% 이소플루란을 함유한 산소 분위기하에서 마취 상태를 유지하면서 기준선 (baseline) (즉， precontrast) CT스캔을 하였다 [영상 파라미터: 60 kVp, 60 μλ, 500 ms exposure time, 360° scan angle, 600 scan number , 512
2
si ices (i.e., image number); FOV: 80.00 83.71 mm for low resolution whole-
2
body imaging (1.4Xmagnif ication) , 33.94X35.52 mm for mid resolution chest
2
and abdominal imaging (3.3 magnification) , 및 26.67 27.90 mm for high resolution brain imaging (4.2 x magnification)] . 이 早， 기준선 (basel ine) CT 스 캔을 한 마우스를 1.5% 이소플루란을 함유한 산소 분위기하에서 마취 상태를 유지 하면서， 마우스의 꼬리를 미지근한 물에 30-60초 가량 담가 혈관을 확장시킨 뒤 , 각 조영제를 해당부피만큼 (실시예 1-4의 화합물을 함유한 조영제의 경우 15 mL/kg, 양성대조군 "Fenestra VC' '의 경우 10 mL/kg, 그리고 양성대조군 "Iobrix' '의 경우 2.5 mL/kg) 마우스의 꼬리 정맥을 통해 서서히 주입하였다. 조영제 주입 직후 즉시 마우스를 마이크로 CT기기의 촬영용 베드 (bed)에 둥을 위로 향하게 하여 올리고， 1.5% 이소플루란을 함유한 산소 분위기하에서 마취 상태를 유지하면서 해당 해상도 (low, mid, 또는 high)에서 CT스캔을 하였다. 이것이 주입 전 CT영상 (0 h)에 해당 된다.
그 이후로 같은 방식으로 추가적 조영제의 주입 없이 각 마우스에 대한 CT스 캔을 조영제 주입 후 1， 2， 4, 8， 24， 및 48 시간 경과 시점에 시행하였다. CT스캔 을 하지 않는 동안 각 마우스를 철저하게 통제된 항온항습 환경 (22-25 °C 및 50- 60% 습도)의 개별 케이지로 옮겨 회복시켰다. 각 조영제에 대하여 3-6마리의 마우 스를 사용하여 상기 기술한 주입 후 경과시점에 전신 (whole-body) CT스캔을 시행하 였고 각 조영제 별로 한 마리에 대하여 주입 후 7일 경과 후의 CT스캔을 시행하여 이 시점에 대부분의 조영제가 체외로 배출이 되었는지를 확인하였다.
또한, 본 발명에 따른 CT용 조영제에 대하여 1-2마리의 마우스를 사용하여 흉부와 복부 (mid resolution), 그리고 뇌 부위 (high resolution)에 대한 CT스캔을 상기 기술한 영상 파라미터에서 시행하여 보다 높은 해상도에서 본 발명의 CT용 조 영제의 조영효과를 검토하였다. 각 CT스캔 후 얻어진 로우 (raw) 영상 파일은 스캔 종료 직후 단면영상의 오류 여부를 확인하기 위해 바로 512X512 픽셀의 DICOMCdigital imaging and communications in medicine) 파일포1 ¾으로 재조합되었 다. 또한 Lucion softwareClnfinitt Healthcare, 한국)를 이용하여 DIC0M 파일로부 터 3D CT영상을 얻었다.
본 발명에 따른 CT용 조영제와 양성대조군으로 사용한 "Fenestra VC" 및 "Iobrix"를 마우스의 꼬리 정맥을 통해 주입한 후, 시간 경과에 따라 찍은 몇 가지 관심 부위를 나타내는 관상면 (coronal) 및 시상면 (sagittal)의 전신 CT 단면영상을 도 3-4(관상면) 및 도 5-6(시상면)에 각각 나타내었다.
또한， 본 발명에 따른 CT용 조영제를 마우스의 꼬리 정맥을 통해 주입한 후, 시간 경과에 따라 찍은 흉부와 복부 (mid resolution) 및 뇌 부위 (high resolution) 의 CT단면영상을 도 7-8(흉부와 복부)， 도 9-10(뇌부위)에 각각 나타내었다. 도 3 내지 도 6에 나타난 바와 같이， CT용 조영제가 주입된 마우스의 혈관 부위는 밝은 회색으로 나타났다 (뼈는 매우 밝은 흰색 부분으로 나타남). 여기서， 양성대조군으로 사용한 저분자 화합물 기반 인체용 CT용 조영제인 "Iobrix' '는 주입 직후 수분 이내 (주입 후 0시간 경과 CT스캔 참조)에 매우 빠른 속도로 신장을 통하 여 배출이 되었음을 볼 수 있고， 에멀젼 나노입자 기반의 동물용 CT용 조영제인 "Fenestra VC"는 본 발명의 실시예 1-4에서 제조한 화합물을 함유한 CT용 조영제와 마찬가지로 대략 조영제 주입 후 2-4시간까지는 주입 직후와 거의 동일한 세기의 혈관 내 조영효과를 보이는 등 초기에는 비슷한 양상으로 시간대별 체내 분포 (biodistribution)를 나타내었으나， 주입 후 24시간이 경과하면서 본 발명에 따른 CT용 조영제에 비하여 훨씬 더 상대적으로 간에 분포가 많이 되어 독성이 더 강한 것으로 추정된다. 도 7 내지 도 10에 나타난 바와 같이， 본 발명의 실시예 1-4에서 제조한 화 합물을 함유한 CT용 조영제의 경우 분자량 (즉， 크기)이 증가함에 따라 상대적으로 혈관에 순환하는 시간이 길어지는 양상을 보였으며， 체외배출 경로도 비교적 분자 량이 작은 실시예 1에서 제조한 화합물을 함유한 조영제의 경우 대부분 신장 (주입 후 1시간 CT영상 참조)을 거쳐 방광으로 배출되는 것으로 나타난 반면， 분자량이 커질수록 (실시예 2 < 실시예 3 < 실시예 4) 방광과 더불어 점점 더 간으로의 상대 적 분포가 증가하였고， "Fenestra VC"에 비하여 조영제 주입 후 24시간 경과 시점 까지도 심장 부위에서의 영상신호가 상대적으로 점점 더 강하게 감지되었다. 또한， 본 발명의 CT용 조영제를 주입하여 CT스캔을 실시하는 동안 쥐가 죽지 않았고， CT 스캔이 종료된 후 실시한 부검결과 간, 신장 등의 장기에 전혀 손상을 입히지 않는 것을 확인하였다. 따라서， 본 발명에 따른 요오드를 함유한 방사형상의 고분자 화합물을 함유 하는 CT용 조영제는 조영효과가 층분하고， 조영시간이 오래갈 뿐만 아니라， 체외배 출도 적절히 이루어짐을 알 수 있다.

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
원형 또는 구형의 대칭형 저분자 화합물， 또는 방사형의 고분자 화합물로 구 성되는 중심핵;
상기 중심핵에 직접 또는 펩티드를 통해 결합되는 요오드 함유 화합물; 및 상기 중심핵에 직접 또는 펩티드를 통해 결합되거나, 또는 상기 중심핵에 결 합된 요오드 함유 화합물에 직접 결합되는 생체적합성 고분자를 포함하되，
상기 중심핵 및 요오드 함유 화합물이 생체내에서 노출되지 않도록 상기 생 체적합성 고분자가 보호막을 형성하는 구조를 갖는 요오드를 함유한 방사형상의 고 분자 화합물 .
【청구항 2]
제 1항에 있어서， 상기 중심핵을 구성하는 원형 또는 구형의 대칭형 저분자 화합물은 α -， β- 및 Υ-사이클로텍스트린 (cyclodextrin), 글루코스， 갈락토스, 만노스 및 이들의 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 1종의 탄수화물， 포르피린 (porphyrin) 및 이의 유도체, D0TACL，4，7， 10-tetraazacyclododecane- 1,4,7, 10-tetraacetic acid) 및 이의 유도체， 라이신， 아스파르트산， 글루타민산， 세린， 시스테인, 및 타이로신으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 1종 이상 의 펩티드가 2-4개 모여 형성된 고리형 펩티드 및 이들의 유도체로 이루어지는 군 으로부터 선택되는 어느 1종인 것을 특징으로 하는 요오드를 함유한 방사형상의 고 분자 화합물.
【청구항 3]
제 1항에 있어서， 상기 중심핵을 구성하는 방사형의 고분자 화합물은 폴리아 미도아민 (PAMAM) 덴드리머, 폴리라이신 덴드리머， 폴리프로필렌이민 (PPI) 덴드리 머， 폴리에스터 덴드리머， 폴리글루타민산 덴드리머， 폴리아스파르트산 덴드리머， 폴리글라이세를 덴드리머 및 폴리멜라민 덴드리머로 이루어지는 군으로부터 선택되 는 어느 1종의 덴드리머， 폴리라이신， 폴리에스터, 폴리글루타민산， 폴리아스파르 트산， 및 폴리글라이세롤으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 1종의 고차분 지형 (hyperbranched) 고분자， 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 및 이의 공중합체 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 1종의 별형상 (star-shaped)의 고분자 및 이 들의 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는 요오드 를 함유한 방사형상의 고분자 화합물.
【청구항 4]
제 1항에 있어서, 상기 요오드 함유 화합물은 하기 화학식 2， 3， 4 및 10으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 1종인 것을 특징으로 하는 요오드를 함유한 방사형상의 고분자 화합물:
[화학식 2]
Figure imgf000038_0001
(상기 화학식 2-4 또는 화학식 10에 있어서，
R1, R 및 R은 각각 독립적으로 또는 선택적으로， N¾, -NHR , -NR4 2,
-NHNH2) -NHNHR4, -NHNR4 2, -OH, -OR4, -SH 또는 -SR4이고，
R4는 -H, -Boc, d-6의 비치환 또는 치환된 직쇄 또는 측쇄 알킬 또는 헤테로 알킬， 또는 비치환 또는 치환된 C5-7의 아릴 또는 헤테로아릴이고,
R5는 R4와 같거나, _(C=0)R4, -(C=0)0R , — (OO)NHR4또는 _(O0)NR2 4이다).
【청구항 5】 제 4항에 있어서， 상기 화학식 2， 3, 4 및 10의 요오드 함유 화합물은 하기 화학식 1 및 화학식 9로 표시되는 요오드 화합물을 전구체로 하는 것을 특징으로 하는 요오드를 함유한 방사형상의 고분자 화합물:
1]
Figure imgf000039_0001
【청구항 6]
제 1항에 있어서， 상기 생체적합성 고분자는 폴리에틸렌글리콜 (PEG), 히알루 론산, 헤파린 및 이들의 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 1종인 것 을 특징으로 하는 요오드를 함유한 방사형상의 고분자 화합물.
【청구항 7]
제 1항에 있어서， 상기 펩티드는 다이라이신， 트라이라이신， 테트라라이신， 다이글루타민산， 트라이글루타민산, 테트라글루타민산， 다이아스파르트산， 트라이 아스파르트산， 테트라아스파르트산， 다이시스테인， 트라이시스테인， 테트라시스테 인， 다이세린， 트라이세린， 및 테트라세린으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 종의 반복단위가 2-4개인 펩티드인 것을 특징으로 하는 요오드를 함유한 방사형상 의 고분자 화합물.
【청구항 8]
제 1항에 있어서， 상기 중심핵， 요오드 함유 화합물， 펩티드 또는 생체적합성 고분자 간 결합의 연결부위는 -NHC(=0)-, -C(=0)0-, — NHC(=0)NH -， -NHC(=0)0_, -NHC(=S)NH -， -C=N-NH_, -C=N-NHC(=0)_, -NH-, -S-, -SS -， -NHCH2CH(0H)-, -0-또는
Figure imgf000039_0002
인 것을 특징으로 하는 요오드를 함유한 방사형상의 고분자 화합물.
【청구항 9]
제 8항에 있어서， 상기 연결부위 양 말단은 추가적으로 각각 -(CH2)m -，
-(CH2)m(C=0)- , (:3-20의 시클로알킬 -(C¾)ra -， C4-20의 아릴 -(CH2)m- 및 -NH-CH2CH2-으로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 또는 선택적으로 선택되는 어느 하나를 통해 상 기 중심핵 , 요오드 함유 화합물， 펩티드 또는 생체적합성 고분자와 연결되고， 여기 서 상기 m은 0-10의 정수인 것을 특징으로 하는 요오드를 함유한 방사형상의 고분 자 화합물 .
【청구항 10]
제 1항에 있어서， 상기 중심핵은 요오드 함유 화합물， 펩티드 또는 생체적합 성 고분자와 결합할 수 있는 아민기， 히드록시 기， 히드록시아민기， 카르복실기， 카 르복시하이드라지드기， 하이드라진기， 티올기， 아자이드기， 알키 닐기， 할로겐기， 알데히드기， 케톤기， 에폭시기， 3-카르보메록시피를리디논기 및 트리 -(Cw의 알콕 시 ) -실릴기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 표면작용기를 갖는 것을 특징으로 하는 요오드를 함유한 방사형상의 고분자 화합물 .
【청구항 11]
제 1항에 있어서， 상기 방사형 고분자 화합물의 평균 분자량이 8 , 000-150 , 000 Da인 것을 특징으로 하는 요오드를 함유한 방사형상의 고분자 화합물 .
【청구항 12】
제 1항에 있어서， 상기 요오드를 함유한 방사형상의 고분자 화합물은 하기 화 학식 5 내지 화학식 8의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 요오드를 함유한 방사형 상의 고분자 화합물 :
[화학식 5]
Figure imgf000040_0001
[화 식 6]
Figure imgf000041_0001
[화학식 7] 'c
Figure imgf000041_0002
[화학식 8]
Figure imgf000041_0003
(상기 화학식 5 내지 화학식 8에 있어서，
상기 중심핵은 α-, β- 및 사이클로덱스트린 (cyclodextrin), 글루코스, 갈락토스 및 만노스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 1종의 고리형 탄화수 소， 포르피린 (porphyrin) 및 이의 유도체， D0TA(1,4,7, lO-tetraazacyclododecane- l^ , 10-tetraacet ic acid) 및 이의 유도체， 라이신， 아스파르트산， 글루타민산， 세린， 시스테인 및 타이로신으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 1종 이상의 펩티드가 2-4개 모여 형성된 고리형 펩티드 폴리아미도아민 (PAMAM) 덴드리머， 폴 리라이신 덴드리머, 폴리프로필렌이민 (PPI) 덴드리머， 폴리에스터 덴드리머， 폴리 글루타민산 덴드리머, 폴리아스파르트산 덴드리머， 폴리글라이세를 덴드리머 및 폴 리멜라민 덴드리머로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 1종의 덴드리머， 폴리 라이신， 폴리에스터， 폴리글루타민산， 폴리아스파르트산 및 풀리글라이세롤으로 이 루어지는 군으로부터 선택되는 어느 1종의 고차분지형 (hyperbranched) 고분자， 폴 리에틸렌글리콜 (PEG) 및 이의 공중합체 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 1종의 별형상 (star-shaped)의 고분자 및 이들의 유도체이고，
Figure imgf000042_0001
이며， 이때 상기 R 및 R은 각각 독립적으로 또는 선택적으로， -ΝΗ-, -NR，-, -讓 2-， -NNHR4-, -NNR , -0- 또는 -S-이고， R는 -NH2, -NHR4, -NR4 2,
-NHNH2( -NHNHR， -NHNR2, ~0Η, -OR， -SH 또는 -SR이고， 상기 R는 -H, -Boc, d-6 의 직쇄 또는 측쇄 알킬， 또는 비치환 또는 치환된 C5-7의 아릴 또는 해테로아릴이 고， 상기 R5는 R4와 같거나， (C=0)R4, — (O0)0R4, -(C=0)NHR 또는 -(CO)NR2 4이고，
D는 펩티드로서, 다이라이신, 트라이라이신， 테트라라이신， 다이글루타민산， 트라이글루타민산， 테트라글루타민산， 다이아스파르트산， 트라이아스파르트산， 테 트라아스파르트산， 다이시스테인， 트라이시스테인， 테트라시스테인， 다이세린， 트 라이세린， 및 테트라세린으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종의 반복단위가 2-4개인 펩티드이고，
P는 폴리에틸렌글리콜 (PEG), 히알루론산， 해파린 또는 이들의 유도체이고， X는 상기 중심핵의 표면작용기로서, 아민기, 히드록시기， 히드록시아민기， 카르복실기， 카르복시하이드라지드기， 하이드라진기， 티올기， 아자이드기， 알키닐 기, 할로겐기， 알데히드기， 케톤기， 에폭시기， 3-카르보메특시피를리디논기 또는 트리— (d-4의 알콕시) -실릴기이고，
L1 및 L2는 상기 중심핵， 요오드 함유 화합물 (T1 또는 T2), 펩티드 (D) 또는 생체적합성 고분자 (P) 간 연결부위로서， -NHC(=0)-, -C(=0)0-, -NHC(=0)NH— , -NHC(=0)0~, -NHC(=S)NH- -C=N-NH-, -ON-NHC(=0)_, -NH―， — S-, -SS-,
NHCH2CH(0H)-
Figure imgf000042_0002
이고， 상기 연결부위 양 말단은 추가적으로 각각 -((¾)m-, -(CH2)m(C=0)-, C3-20의 시클로알킬 -(C¾)m -， (〕4-20의 아릴 -((¾)„- 및 -NH-CH2CH2—으로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 또는 선택적으로 선택되는 어느 하나를 통해 상기 중심핵， 요오드 함유 화합물， 펩티드 또는 생체적합성 고분자와 연결되고， 여기서 상기 m은 0-10의 정수이고，
a 및 b는 각각 독립적으로 또는 선택적으로， 0 또는 1의 정수이고， c는 2-4의 정수이고，
d, e, fᅳ g, h 및 i는 각각 독립적으로 또는 선택적으로 2 내지 60의 정수 이고，
j는 1-10의 정수이다).
【청구항 13]
제 1항에 있어서， 상기 생체적합성 고분자가 PEG인 경우 중심핵으로부터 외부 로 향하는 말단이 d-4의 알콕시기인 것을 특징으로 하는 요오드를 함유한 방사형상 의 고분자 화합물.
【청구항 14]
원형 또는 구형의 대칭형 저분자 화합물, 또는 방사형의 고분자 화합물로 구 성되는 중심핵의 표면작용기 일부에 생체적합성 고분자가 결합되도록 반응시키는 단계 (단계 1)； 및
상기 단계 1의 중심핵에서 미반응된 표면작용기에 요오드 함유 화합물이 직 접 또는 펩티드를 통해 결합되도톡 반옹시키는 단계 (단계 2)를 포함하는 제 1항의 요오드를 함유한 방사형상의 고분자 화합물의 제조방법 .
【청구항 15】
원형 또는 구형의 대칭형 저분자 화합물， 또는 방사형의 고분자 화합물로 구 성되는 중심핵의 표면작용기 일부에 요오드 함유 화합물이 결합되도록 반응시키는 단계 (단계 1)； 및
상기 단계 1에서 중심핵에 결합된 요오드 함유 화합물에 생체적합성 고분자 가 결합되도록 반웅시키는 단계 (단계 2)를 포함하는 제 1항의 요오드를 함유한 방사 형상의 고분자 화합물의 제조방법.
【청구항 16]
요오드 함유 화합물이 생체적합성 고분자와 펩티드를 통해 결합되도록 반웅 시 키는 단계 (단계 1) ; 및
상기 단계 1에서 펩티드를 통해 생체적합성 고분자에 결합된 요오드 함유 화 합물이 원형 또는 구형의 대칭 형 저분자 화합물， 또는 방사형의 고분자 화합물로 구성되는 중심핵의 표면작용기에 결합되도록 반웅시 키는 단계 (단계 2)를 포함하는 제 1항의 요오드를 함유한 방사형상의 고분자 화합물의 제조방법 .
【청구항 17]
제 14항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서， 상기 요오드 함유 화합물은 하 기 화학식 1， 2， 3， 4, 9 및 10으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 1종인 것을 특징으로 하는 요오드를 함유한 방사형상의 고분자 화합물의 제조방법 :
[화학식 1]
Figure imgf000044_0001
Figure imgf000044_0002
Figure imgf000044_0003
Figure imgf000044_0004
Figure imgf000044_0005
10]
Figure imgf000045_0001
(상기 화학식 2-4 또는 화학식 10에 있어서，
R1, R2, R3 및 R5은 제 4항에서 정의한 바와 같다).
【청구항 18】
계 1항의 요오드를 함유한 방사형상의 고분자 화합물을 유효성분으로 포함하 는 CT용 조영제 조성물.
【청구항 19】
제 18항에 있어서， 상기 요오드를 함유한 방사형상의 고분자 화합물은 요오드 함량 이 15-50%인 것을 특징으로 하는 CT용 조영제 조성물.
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