JP4758346B2

JP4758346B2 - 高分子ミセル型ｍｒｉ造影剤

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Publication number: JP4758346B2
Application number: JP2006527787A
Authority: JP
Inventors: 昌幸横山; 光夫岡野; 恵美子中村
Original assignee: Kanagawa Academy of Science and Technology
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Filing date: 2005-01-06
Publication date: 2011-08-24
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Description

本発明は、核磁気共鳴画像造影剤に関し、より具体的には、ガドリニウム（Ｇｄ）内包高分子ミセルを有効成分とする造影剤に関する。

がんに対する療法は外科療法、放射線療法、化学療法の３つに大別される。各療法の進歩によって、有効率・治癒率は向上を続けているものの、がん発生率の上昇に追いつけずに、死亡率の増加を許しているのが現状である。これらの療法に共通しているのは、がんが早期に発見されれば治療成績は大きく向上することである。よって診断技術の進歩はがん死亡率低下に大きく貢献できる。

がんの診断技術には、採取した細胞の組織学的診断、血液の生化学的検査、画像診断等がある。画像診断は、Ｘ線ＣＴ、核磁気共鳴画像(ＭａｇｎｅｔｉｃＲｅｓｏｎａｎｃｅＩｍａｇｉｎｇ，以下、ＭＲＩと略す)、超音波画像などがあるが、その中で、ＭＲＩはＸ線などの被爆がなく非侵襲性であり、Ｘ線ＣＴに次ぐ解像度が得られることなどが特長である。

このＭＲＩの診断精度を上昇させる目的で、ＭＲＩ造影剤が用いられている。ＭＲＩ造影剤を血液内に投与した後に、ＭＲＩの撮影を行う。このＭＲＩ造影剤として頻繁に用いられているのはＧｄ原子を配位した低分子キレート化合物である。この様な錯体または複合体の代表例は商品名Ｍａｇｎｅｖｉｓｔの下に市販されているＧｄ−ＤＴＰＡである（ＤＴＰＡとは低分子キレート化剤のジエチレントリアミン五酢酸であり、１分子のＤＴＰＡがＧｄ１原子を配位している）。このキレート化剤中のＧｄ原子は周辺に存在する水分子の水素原子に働きかけて、そのＴ１（縦緩和時間）を短縮させる。ＭＲＩ測定の際に種々の装置パラメーターを適切に設定することで、この短縮したＴ１を有する水分子をその他の水分子と画像上で明確に区別することが可能となる。よって、このＴ１短縮効果のおかげて、ＭＲＩ画像上で高いコントラストを与えることができる。Ｇｄ−ＤＴＰＡは主に血液をコントラスト高く映し出すことで、ガン組織の異常血管形成を明瞭にすることで画像診断に役立てている。よって、Ｇｄ−ＤＴＰＡそれ自体は固形ガンなどに選択性があるわけではない。また、Ｇｄ−ＤＴＰＡは低分子であるために血管から組織への浸透が速いので、造影剤が生体に注入された後すぐにＭＲＩ造影を開始しなければならない。たとえば患者が急に気分が悪くなって２時間ほど休息するような場合には、ＭＲＩ造影は造影剤の注入からやり直さねばならない。

以上のような低分子ＭＲＩ造影剤の弱点を補い、さらに性能の高い造影剤の開発を目指して、ＭＲＩ造影効果のあるＧｄ原子を高分子に結合させる研究が１９８０年代から行われてきた。これらの研究は、主として、高分子の性質によって造影剤が固形がんなどに夕一ゲティングされ、標的に選択的なＭＲＩ画像が得られ、疾患のより正確な診断に役立て得ることを可能にすることを目的とし、さらには、高分子造影剤は血管から組織に拡散する速度が低分子造影剤よりも遅いことを利用し、投与後に適切な造影ができる時間範囲を広くし、患者及び医師の両方にとってＭＲＩ診断がより容易なものとすることを目的としている。

この高分子化ＭＲＩ造影剤の代表例としては、天然の高分子であるアルブミンや多糖誘導体や合成のポリ（Ｌ−リジン）誘導体を用いたものなどがある。より具体的には、以下の３つの例を挙げることができる。Ｗｉｋｓｔｒｏｍらは、アルブミンにキレート剤ＤＴＰＡを複数結合させそれにＧｄ原子を配位させたＭＲＩ造影剤を報告している（非特許文献１参照。）。Ｇｄ原子が高分子物質のアルブミンに結合することにより、Ｇｄ原子あたりのＴ１を短縮能力（緩和能という）は低分子のＧｄ−ＤＴＰＡに比べて約４倍に増加している。これはＧｄ原子が高分子物質に結合することでＧｄ原子の動きが規制されるために、緩和能が上昇するものと理解されている。この緩和能の上昇は、高分子ＭＲＩ造影剤の特長の１つである。また、Corotらは多糖のカルボキシメチルデキストランにキレート剤であるＤＯＴＡ（テトラアザシクロドデカン四酢酸）を結合させ、それにＧｄを配位させた高分子ＭＲＩ造影剤を報告している（非特許文献２参照）。この例でも高分子化することにより、Ｔ１の緩和能は上昇し、対応する低分子ＭＲＩ造影剤であるＤＯＴＡ−Ｇｄの３．４に対し、高分子化したものでは１０．６と３倍程になっている。この研究例ではラットに投与したときの血漿中濃度変化も観察している。静脈内投与後３０分で、投与量の４０％より少し多い量が血漿中に存在したと報告されている。対応する低分子の造影剤ＤＯＴＡ−Ｇｄに比べると約５倍高い濃度であるが、固形がんにターゲティングまたは送達するためには、これでも血液循環性は不足していると考えられる。

高分子の構造を最適化し、血液中を長期間に渡って安定に循環し、固形がんへの選択的ターゲティング（またはデリバリー）をもっとも良く達成し得た研究例は、Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒらによるものである（非特許文献３参照）。彼らは、ポリ（Ｌ−リジン）にポリエチレングリコール鎖を結合させた高分子をキャリヤーに用いることで、ＤＴＰＡに配位したＧｄを、血液中を長期間渡って安定に循環して固形がんにターゲティングすることに成功している（１５０ｇ程度の体重のラットに投与２４時間後の、固形がんへの蓄積量が約１．５％ｄｏｓｅ／ｇであった）。しかし、この場合でも明確ながんの画像を得ることに成功していない。

ＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅＲａｄｉｏｌｏｇｙ，２４，６０９−６１５（１９８９）ＡｃｔａＲａｄｉｏｌｏｇｉａ，３８，ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ４１２，９１−９９（１９９７）Ｊ．ＤｒｕｇＴａｒｇｅｔｉｎｇ，４，３２１−３３０（１９９７）

本発明の目的は、血液中を長期間に渡って安定に循環して固形がんにターゲティングし、しかも明確ながんの画像を得ることのできる造影剤を提供することにある。

本願の発明者らは、例えば、Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒらによる造影剤系の使用に際して、必ずしも明確ながん画像が得られないのは、がん組織のみではなく正常組織の血管までも高いコントラストになってしまうことに、主たる原因が存在すると推測した。より具体的には、一般に、高分子物質が血流からがん組織に移行する速度は遅いため、大量の高分子をがん組織に移行させるためには、長い時間血液を循環させて移行する機会が多く得られるように造影剤系を設計する必要があり、他方、かような造影剤系はがん組織に充分ターゲティングされた時点でもなお正常の血管中に多量の造影剤が残っていて、正常組織とがん組織との大きな信号強度の差が得られない状態となると推察した。

このような推察に基づいて、本発明者らはＧｄ−高分子コンジュゲートが、がん組織または部位で解離しやすいが、正常の血管の血流中ではある程度安定にＧｄ原子をブロックした状態を維持しうるＧｄ−高分子コンジュゲートを提供すべく研究してきた。その結果、ある一定のＧｄ内包高分子ミセルが上記目的を達成できることを見出した。

こうして、本発明によれば、内部コアにガドリニウム（Ｇｄ）原子を含有し、そして外部シェルが親水性ポリマー鎖セグメントを含んでなる高分子ミセルであって、生体内で固形がん組織もしくは部位に送達され、その内部に集積された後に高分子ミセル構造を解離しうる高分子ミセル、を有効成分とし、高分子ミセルが、親水性ポリマー鎖セグメントと側鎖にカルボキシル基及びキレート化剤残基を有するポリマー鎖セグメントとを含んでなるブロックコポリマーと、該ブロックコポリマーに配位したガドリニウム原子と、ポリアミンとから形成され、ブロックコポリマーが、ポリ（エチレングリコール）−ｂｌｏｃｋ−ポリ（アスパラギン酸）であって、アスパラギン酸の反復単位の５〜３０％にキレート化剤残基が導入されており、該キレート化剤は、アスパラギン酸の側鎖のカルボキシル基にリンカーを介して導入されており、該リンカー−キレート化剤残基が、-NHCH ₂ CH ₂ NHCOCH ₂ (HOOCH ₂ -)-NCH ₂ CH ₂ N(CH ₂ CH ₂ COOH)-CH ₂ CH ₂ N-(CHCHCOOH) ₂ である、MRI造影剤が提供される。

本発明によれば、上記のごとき高分子ミセルをＭＲＩ造影剤に使用することにより、正常組織内の血管と固形がん組織における水のＴ１緩和能力を明確に区別できる。つまり、本発明に従う、高分子ミセル（高分子が数百分子程度会合して形成する、内部コアと外部シェルの２層構造から構成されており、さらにコア部にＧｄ原子が配位している。）というナノサイズのキャリヤーシステムが、ＭＲＩ画像でのコントラストを作り出すＧｄ原子を固形がん局所に選択的に運搬（ターゲティング）することで、従来のＭＲＩがん診断システムでは得られなかった、微小がんを明確に描き出すことを可能とする。なお、Ｇｄ原子は、その周辺に存在する水分子の水素原子に働きかけて、そのＴ１（縦緩和時間）を短縮させる。このＴ１短縮によりＭＲＩ画像上に高いコントラストがもたらされる。

理論に拘束されるものでないが、本発明の高分子ミセルはなぜ固形がんにターゲティングでき、そして本発明の高分子ミセルはなぜ固形がん組織に高いＭＲＩコントラストをもたらすかについては、次のように理解されている。固形がん組織を構成する血管は、高分子やナノサイズの微粒子に対する透過性が異常に亢進していて、かつ正常の組織では血液から移行してきた高分子物質の排出経路であるリンパ毛細管が欠落するという特性を有する。このような特性によって、高分子やナノサイズの微粒子はがん組織に選択的に集積、つまりターゲティングされる。このような効果は、ＥＰＲ効果（ＥｎｈａｎｃｅｄＰｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙａｎｄＲｅｔｅｎｔｉｏｎｅｆｆｅｃｔ）として知られている（Ｍａｔｓｕｍｕｒａ，Ｙ．ｅｔａｌ., ＣａｎｃｅｒＲｅｓ., ４６，６３８７−６３９２（１９８６）参照）。ＥＰＲ効果を示すにはその表面が細胞に接着しない性質の高分子やナノサイズであればよく、がん細胞に対する特異抗体などを必要としないことが大きな特長である。この効果によって、正常組織に比べて３〜１０倍の濃度でがん組織に夕−ゲティングできることが様々な例で示されている。例えば、抗がん剤を固形がんにターゲティングしたものとして、本発明者でもある横山、岡野らが開発した、抗がん剤アドリアマイシンを内包した高分子ミセルシステムが挙げられる（Ｍ．Ｙｏｋｏｙａｍａ，ｅｔａｌ., Ｊ．ＤｒｕｇＴａｒｇｅｔｉｎｇ，７（３），１７１−１８６（１９９９）参照。）。

固形がんをＭＲＩ画像上で選択的に高いコントラストを与える工夫は、上述のターゲティング効果の他にもう一つある。それはミセル構造の形成・解離に基づくＴ１短縮能の変化である。血液中の循環を通して高分子ミセルの固形がんへのデリバリーの概念図を図１に示す。図１に示されるように、血液循環中に高分子ミセル構造を形成している間は、Ｇｄ原子はミセルの内部コアにあって外側の水分子からは隔離されているので、水分子のＴ１を短縮する能力を充分に発揮することができない。つまり、高分子ミセル構造が維持されている場合はＭＲＩコントラストの上昇は起こらない。他方、がん組織にターゲティングされた高分子ミセルは徐々にＧｄ結合ブロックコポリマーと正荷電ポリマーに解離する。この解離した状態では、Ｇｄ原子は水分子に近づくことができるので、Ｔ１短縮能を発揮してがん組織の高いコントラストを与える。さらに、高分子に結合しているＧｄ原子は、高分子によって動きが制限される効果によって、Ｇｄ原子一個あたりのＴ１短縮能が遊離のＧｄそれ自体よりも２〜３倍に増加することが知られている。仮に血液循環中にミセル構造が解離しても、腎臓のろ過作用によって解離したブロックコポリマーは、速やかに尿中に排出されてしまうので、血液に高いコントラストを与えることはない。一方、がん組織では解離したＧｄ配位ブロックコポリマーでも組織中に保持されるには充分な大きさであり、その結果、長い時間がん組織にとどまって高いＭＲＩコントラストをもたらし続けるものと解される。

本発明の高分子ミセルの血液中の循環を通して固形がんへのデリバリーの概念図である。本発明の高分子ミセルの好ましい１例の製造方法及び構造を模式的に示す概念図である。

以下、本発明の各構成についてさらに詳細に説明する。本発明に従う、高分子ミセルは、水性媒体中で、ポリマー分子が数百程度会合して形成する分子集合体であって、内部コアと外部シェルの２層構造から構成されており、さらにコア部にＧｄ原子が配位している。該高分子ミセルは、生体内（例えば、ヒトを初めとする哺乳動物における）で固形がん組織もしくは部位に送達しそして集積されるものであるから、ナノサイズ、例えば、直径が１０ｎｍ〜１００ｎｍ程度の超微粒子の形態にある。本発明にいう、「固形がん組織に集積された後に高分子ミセル構造を解離しうる」挙動は、例えば、固形がん組織のｉｎｖｉｔｒｏモデルとなりうる、血中の食塩濃度より高い食塩濃度の水溶旅中で高分子ミセルが解離するか否かを測定することにより確認できる。

かような高分子ミセルを形成する高分子は、親水性ポリマー鎖セグメントと、Ｇｄに配位できる側鎖を有するポリマー鎖とを含んでなるブロックコポリマーであって、ポリアミンの存在下の水性媒体中で上記のようなナノサイズの超微粒子たる高分子ミセルを形成し、そして、例えば固形がん組織中で高分子ミセル構造を解離（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）することができるものであり、ブロックコポリマーはポリエチレングリコールに由来するポリマー鎖セグメントを含む。同様に、ブロックコポリマーのもう一方のセグメントである、Ｇｄに配位してＧｄを固定できる内部コアを形成するポリマー鎖セグメントは、効果的にＧｄに配位できる側鎖を有するポリマー由来のものであって、本発明の目的に沿うものであり、具体的にはポリ（アスパラギン酸）に由来するセグメントであって、反復単位中のカルボキシル基の一定のものにキレート化残基が導入されたセグメントを挙げることができる。

かくして、本願発明で使用することのできるブロックコポリマーの具体的なものとしては、ポリエチレングリコール−ｂｌｏｃｋ−ポリ（アスパラギン酸）のカルボキシル基を介して、必要によりリンカーも介して、キレート化剤の残基が共有結合したものである。

ブロックコポリマー中の、ポリエチレングリコール部である親水性ポリマー鎖セグメントの分子量は２０００〜２万程度が好ましく、４０００〜１２０００程度がさらに好ましい。

リンカーの具体的なものとしては、エチレンジアミン（−ＮＨＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ−）である。

キレート化剤残基は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）であるキレート化剤に由来する残基であることができる。なお、言うまでもなく、キレート化剤は、ガドリニウム原子をキレートできるように、キレートに必要な基以外の部分で上記リンカー又は酸素原子に結合される。

なお、リンカーを介してキレート化残基を結合する場合、キレート化残基が結合されずに残るリンカーの割合はできるだけ少ないことが好ましく、遊離のリンカーの割合は、全リンカーに対して1/2以下が好ましく、さらに好ましくは1/3以下である。

本発明で好ましく使用することのできるブロックコポリマーとしては、それぞれキレート化剤残基が一定のカルボキシル基に導入されたポリエチレングリコール−ｂｌｏｃｋ−ポリ（アスパラギン酸）である。

上記のキレート化剤残基を有するブロックコポリマーは、都合よくは、例えば次の反応スキームに準じて製造でき、次いでＧｄに配位させることができる。なお、下記の反応スキームは、好ましいブロックコポリマーの一例の製造方法を示しているが、他のブロックコポリマーも同様な方法により製造することができる。また、下記反応スキームの各工程自体は、当業者が化学常識に基づいて容易に実施することができ、また、下記実施例に条件を詳細に記載しているので、実施例の記述に準じて容易に実施することができる。
反応スキーム：

高分子ミセルの形成：
上記のようにして得られるＧｄ担持ブロックコポリマーとポリアミンとを、ブロックコポリマーのカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）対ポリアミンのアミノ基（−ＮＨ_２）の比が１：５〜５：１、好ましくは１：２〜２：１となるよう調節した混合水溶液を調製し、必要によりｐＨを６．５〜７．５に調節した後、室温で、必要により加温もしくは冷却し、数分乃至数時間攪拌し、分画分子量１，０００の透析膜を使用して蒸留水に対して透析することにより高分子ミセルを調製できる。混合水溶液は、必要により、水混和性の有機溶媒、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、エチルアルコール等を加えてもよい。本発明で使用するポリアミンは、上記のブロックコポリマーと高分子ミセルを形成することができるものであれば如何なる種類、如何なる分子量であってもよい。限定されるものでないが、好ましく使用できるポリアミンとしては、ポリ（Ｌ−リシン）、ポリ（Ｄ−リシン）、ポリ（Ｌ−アルギニン）、ポリ（Ｄ−アルギニン）、キトサン、スペルミン、スペルミジン、ポリアリルアミン、プロタミン等を挙げることができる。そして、かようなポリアミンの分子量は、５００〜５０，０００のものが好ましく使用できる。

図２に、以上で説明した高分子ミセルの製造方法及び構造の好ましい１例を模式的に示す。

こうして得られる高分子ミセルは、上述した作用効果を奏し、該作用効果は、上記のように図１に模式的に示されている。

以下、具体例を挙げ、さらに本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の理解を容易にする目的で提供するものである。

実施例１：キレート化剤残基を有するブロックコポリマーの製造
（１）アルカリ加水分解
ポリエチレングリコール−ｂｌｏｃｋ−ポリ（β−ベンジルＬ−アスパルテート）（以下、ＰＥＧ−ＰＢＬＡと略記する。）のポリエチレングリコールの分子量が５，０００でβ−ベンジル L−アスパルテートの重合度が４４のもの１．００ｇを取り、０．５Nの水酸化ナトリウム水溶液をβ−ベンジル L−アスパルテートユニットに対し３．０倍モル等量加えて、室温で１５分程攪拌した。溶液が透明になったところで、６N塩酸をβ−ベンジル L−アスパルテートユニットに対し１０倍モル等量加えた。その後、この混合液を０．１N塩酸、次いで蒸留水中で透析した。最後に凍結乾燥して、ポリエチレングリコール−ｂｌｏｃｋ−ポリ（アスパラギン酸）（以下、ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）と略記する。）を得た。このアルカリ加水分解によって、ポリエチレングリコール−ｂｌｏｃｋ−ポリ（アスパラギン酸）のポリ（アスパラギン酸）部分の主鎖の約７５％がβ−アミド化すること、およびブロックコポリマーの主鎖の分解が起こらないことが確認されている。

以上と同様の手順により下記の表１に示す３種のＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）を得た。

（２）エチレンジアミン（ＥＤ）ユニットの結合
ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）のポリエチレングリコールの分子量が５，０００でアスパラギン酸のユニット数が４４のもの３９１ｍｇを取り、ジメチルスルホキシド７．８ｍＬに溶解し、Ｎ−Ｂｏｃ−エチレンジアミン１４４ｍｇと水溶性カルボジイミド１６６ｍｇを加えて室温で４時間攪拌した。反応溶液を分画分子量１，０００の透析膜を用いて、蒸留水に対して透析し、凍結乾燥でポリマーを回収した。次に、このポリマーをトリフルオロ酢酸に溶かし、０℃で１時間攪拌することでＢｏｃ基を脱離させた。その後、反応溶液を分画分子量１，０００の透析膜を用いて、蒸留水に対して透析し、凍結乾燥でポリマーを回収した。エチレンジアミンユニットの導入数は^１Ｈ−ＮＭＲ測定により求め、１６であった。

以上と同様の手順により表２に示す１０種のＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ−ＥＤ）を得た。

（３）ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）ユニットの結合
ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ−ＥＤ）５０００−４４−９（表２のｒｕｎ２）１００ｍｇをジメチルスルホキシドに溶かし、エチレンジアミン残基に対して１．５倍モル等量のトリエチルアミンと５倍モル等量のＤＴＰＡ無水物を加え、室温で１日攪拌した。得られた溶液を水に対して透析し、凍結乾燥した。得られたＤＴＰＡ導入ブロックコポリマー（ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ−ＥＤ−ＤＴＰＡ））のＤＴＰＡユニットの導入数は^１Ｈ−ＮＭＲ測定により求め、６であった。

以上と同様の手順により表３に示す９種のＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ−ＥＤ−ＤＴＰＡ）を得た。

実施例２：Ｇｄ（ガドリニウム原子）の結合
ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ−ＥＤ−ＤＴＰＡ）５０００−４４−１６−９（表３のｒｕｎ６)２０ｍｇを蒸留水1.5ｍＬに溶かし、ＤＴＰＡ残基の２．０モル等量のＧｄをＧｄＣｌ_３水溶液として加え、１５分室温で攪拌した。ブロックコポリマーのカルボキシル基と等モル等量のＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を加えて１０分攪拌した後、分画分子量１，０００の透析膜を用いて、蒸留水に対して透析し、凍結乾燥でポリマーを回収した。Ｇｄの導入量はＩＣＰ（ＩｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙＣｏｕｐｌｅｄＰｌａｓｍａ）発光分析装置を用いて決定したところ、７と求まった。

以上と同様の手順により表４に示す１７種のＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ−ＥＤ−ＤＴＰＡ−Ｇｄ）を得た。

実施例３：ブロックコポリマーとポリカチオンポリマーによる高分子ミセル形成
ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ−ＥＤ−ＤＴＰＡ−Ｇｄ）とポリカチオンポリマーを別々に０．５ＭのＮａＣｌ水溶液に溶かし、ｐＨを６．８〜７．２に調整した。この両液を同量混合し室温で１５分攪拌した後、分画分子量１，０００の透析膜を用いて、蒸留水に対して透析した。得られた溶液とＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ−ＥＤ−ＤＴＰＡ−Ｇｄ）の２倍希釈溶液について、以下の測定を行った。

（１）ゲルパーミエーションクロマトグラフィー
（２）動的光散乱
（３）^１Ｈ−ＮＭＲによる水のＴ１（縦緩和時間）の測定
ａ）まず、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーによってミセル構造形成の確認を行った。

表５に平均分子量１５，０００のポリアリルアミンとＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ−ＥＤ−ＤＴＰＡ−Ｇｄ）ブロックコポリマーを混合した結果を示す。ブロックコポリマーの流出体積は６．２ｍＬより大きく、またポリアリルアミンの流出体積は１０ｍＬである。よって、６．２ｍＬより小さな流出体積が得られれば、高分子ミセル構造が形成していることがわかる。表５に示すように、２種類のブロックコポリマーを各々荷電比０．５，１．０，２．０でポリアリルアミンと混合したところ、いずれの場合も流出体積は６．２ｍＬより小さく、ミセル構造が形成していることがわかった。Ｒｕｎ２の高分子ミセルの平均粒径を動的光散乱測定装置で計測したところ５５ｎｍであった。また、試した荷電比の中ではいずれのブロックコポリマーの場合も荷電比２．０の場合がもっとも流出体積が小さく、もっとも安定なミセル構造ができていた。そこで以下の検討は荷電比２．０で行った。

ｂ）次に、ブロックコポリマーとポリカチオンから成る高分子ミセルが標的組織・臓器にターゲティングされた後、徐々にミセル構造を解離させて、標的組織・臓器で緩和能を増加させることができるかのモデル実験を行った。

ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ−ＥＤ−ＤＴＰＡ−Ｇｄ）５０００−４４−１６−７−４と平均分子量１５，０００のポリアリルアミンから成る高分子ミセルに血液中の濃度より３倍以上高い濃度の０．５ＭのＮａＣｌを添加して、室温で約１５分経過した後ゲルパーミエーションクロマトグラフィーを測定した。下記の表６に示すように、０．５，１．０，２．０のいずれの荷電比においてもＮａＣｌ添加前は流出体積が５．０〜５．７ｍＬの範囲にあって高分子ミセル形成を示していたものが、ＮａＣｌ添加後は流出体積が１０〜１１ｍＬと大きくなった。これは、ＮａＣｌ添加によって高分子ミセル構造が解離したことを示す。この事実は生体内のＮａＣｌを主とするイオンによって本発明に従う高分子ミセルのミセル構造が徐々に解離するということも示す。

下記の表７には２種類のポリカチオン（ポリアリルアミンとプロタミン）を用いてＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ−ＥＤ−ＤＴＰＡ−Ｇｄ）との高分子ミセルを形成させることでの、緩和能（Ｒ１）の変化をまとめた。緩和能（Ｒ１）は式１によって得られる値で、これが大きいほどＧｄ１原子あたりの水の縦緩和時間（Ｔ１）を短縮させる能力が高いことを示し、ＭＲＩ画像上での高いコントラストを得ることができる。

表７のＲｕｎ１で示すように、分子量１５，０００のポリアリルアミンと高分子ミセルを形成すると、ブロックコポリマー単独（すなわち高分子ミセルを形成していない状態）よりも３０％程度緩和能Ｒ１が小さくなった。ブロックコポリマー組成の違うｒｕｎ２では、ミセル形成によって緩和能がより大きく変化した。ポリカチオンとして天然の塩基性ベプチドであるプロタミンを用いたｒｕｎ３，４の場合には、大きな緩和能の変化がみられ、ミセル形成に伴って緩和能がｒｕｎ３の場合には約１／１５、ｒｕｎ４の場合には１／５となった。以上より、高分子ミセル構造の形成・解離に伴って緩和能を大きく変化させ得るという、高分子ミセルＭＲＩ造影剤の基本設計が実証されたこととなる。

実施例４：ブロックコポリマーの組成の緩和能R1に及ぼす影響
ブロックコポリマーの組成の緩和能R1に及ぼす影響を表８にまとめた。３種のPEG-P(Asp-ED-DTPA)にそれぞれ、Gdの結合数を変えたものについてｐＨが2.8〜4.8の酸性と、pHが6.9〜7.3の中性での緩和能R1を測定した。どのRunでも酸性よりも中性での緩和能R1が小さくなった。また、同じPEG-P(Asp-ED-DTPA)を用いて結合Gd数を変えると、結合Gd数が多い方が緩和能R1が大きくなることがわかった。（それぞれRun1〜3、Run4〜6、Run7〜9）また、Run1〜3とRun4〜6を比べるとエチレンジアミン（ED）基の結合数の少ないRun4〜6の方が、緩和能R1が大きくなることがわかった。さらに、ポリエチレングリコール鎖の長さが異なるRun4〜6とRun7〜9を比べると、ポリエチレングリコール鎖の長さが短いRun7〜9が高い緩和能R1を示すことがわかった。

本発明によれば、正常組織内の血管と固形がん組織における水のＴ１緩和能力を明確に区別できる造影剤が提供される。したがって、本発明は造影剤の製造業、造影剤を使用する医療診断業で利用できる。

Claims

内部コアにガドリニウム（Ｇｄ）原子を含有し、そして外部シェルが親水性ポリマー鎖セグメントを含んでなる高分子ミセルであって、生体内で固形がん組織もしくは部位に送達され、その内部に集積された後に高分子ミセル構造を解離しうる高分子ミセル、を有効成分とし、高分子ミセルが、親水性ポリマー鎖セグメントと側鎖にカルボキシル基及びキレート化剤残基を有するポリマー鎖セグメントとを含んでなるブロックコポリマーと、該ブロックコポリマーに配位したガドリニウム原子と、ポリアミンとから形成され、ブロックコポリマーが、ポリ（エチレングリコール）−ｂｌｏｃｋ−ポリ（アスパラギン酸）であって、アスパラギン酸の反復単位の５〜３０％にキレート化剤残基が導入されており、該キレート化剤は、アスパラギン酸の側鎖のカルボキシル基にリンカーを介して導入されており、該リンカー−キレート化剤残基が、-NHCH ₂ CH ₂ NHCOCH ₂ (HOOCH ₂ -)-NCH ₂ CH ₂ N(CH ₂ CH ₂ COOH)-CH ₂ CH ₂ N-(CHCHCOOH) ₂ である、核磁気共鳴画像造影剤。