JPWO2008059835A1 - 金属キレート複合体及びプロトン緩和速度増強剤並びにmri造影剤 - Google Patents
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Abstract
Description
中でも、MRIは、軟部組織の解像力に優れ、任意の方向での撮像が可能で、PETのような大がかりも不要という利点があるため、汎用性が高い。
現在用いられているMRI造影剤としては、ガドリニウム等に代表される金属を中心としたキレート化合物(金属キレート)が挙げられる。
この金属キレートが、プロトンの緩和時間を短くする作用を有することから、被験物において、金属キレートを用いた造影剤が滞在する領域と、滞在しない領域との間のコントラストが、より強調される。
臓器移植には、提供者不足や、移植後の拒絶反応,拒絶反応を抑制するための免疫抑制剤による副作用等の問題点があるためである。
現在、ほぼ全ての組織,臓器の再生が臨床応用を目指して研究されており、皮膚,軟骨,血管などの再生は、臨床応用に耐えうる結果が示されているが、その応用の成果を確認する際にも、画像診断方法の果たす役割は、大きくなってきている。
また、上述の通り、高分子結合型造影剤やデンドリマー型造影剤等の比較的分子量の大きいものも開発されているが、これらもまた、細胞膜との相互作用の防止効果が十分で無いことから、やはり膜透過によって追跡対象とのズレが生じる可能性がある。しかも、上述した様に、非特許文献に記載されている高分子結合型MRI造影剤はいずれも、一回の撮像後には生分解されてしまうのが現状である。
1又は2以上の金属キレートと、ポリビニルアルコールを構成成分として含むことを特徴とする、金属キレート複合体である。
金属キレートが、リンカーを介してポリビニルアルコールに結合していることを特徴とする、第一の発明に記載の金属キレート複合体である。
リンカーが、ジアミンであることを特徴とする、第二の発明に記載の金属キレート複合体である。
キレート化剤が、DTPA,DTPA無水物,DOTA,DO3A,HP−DO3A,DTPA−BMAからなる群から選択される1又は2以上のキレート化剤であることを特徴とする、第一乃至第三の発明のいずれかに記載の金属キレート複合体である。
ポリビニルアルコールの重量平均分子量が2000〜10万であることを特徴とする、第一乃至第四の発明のいずれかに記載の金属キレート複合体である。
金属がガドリニウムであることを特徴とする、第一乃至第五の発明のいずれかに記載の金属キレート複合体である。
第一乃至第六の発明のいずれかに記載の金属キレート複合体を含むことを特徴とする、プロトン緩和速度増強剤である。
第一乃至第六の発明のいずれかに記載の金属キレート複合体を含むことを特徴とする、MRI造影剤である。
第一乃至第六の発明のいずれかに記載の金属キレート複合体を含むことを特徴とする、細胞内滞在型MRI造影剤である。
特に、細胞内に導入した場合には、細胞内に滞在し続け、1つの細胞内に複数導入してある場合には、細胞増殖等の後も、増殖細胞に分配されることから、再生過程の追跡が可能である。
本発明の金属キレート複合体は、1又は2以上の金属キレートと、ポリビニルアルコール(以下、「PVA」と記載することがある。)を構成成分として含んでいる。
(1)金属キレート
(i)金属
金属キレートに用いられる金属イオンとしては、各種の磁性金属が挙げられる。具体的には、ガドリニウムイオン,セリウムイオン,サマリウムイオン,ユウピウムイオン,ジスプロシウムイオン,ツリウムイオン,イットリビウムイオンなどのランタノイド系元素のイオン,クロミウムイオン,モリブデニウムイオン,タングステンイオンなどの6族元素のイオン,マンガンなどの7族元素のイオン,鉄イオン,ルテニウムイオン,オスニウムイオンなどの8族元素のイオン,コバルトイオン,ロジウムなどの9族元素のイオン,ニッケルイオン,パラジウムイオンなどの10族元素のイオン,銅イオンなどの11族元素のイオン,亜鉛イオン,カドミウムイオンなどの12族元素のイオンなどが挙げられる。
これらの中では、キレート化剤の原子と配位する数が最も多く、錯体の安定性が高いなどの点から、ガドリニウム(Gd)イオンを用いることが好ましい。ガドリニウムイオンを用いた本発明の金属キレート複合体は、プロトンの緩和速度増強効果が最も高く、造影剤としての効果が高いためである。
金属キレートに用いられるキレート化剤(キレート配位子)としては、公知のDTPA(ジエチレントリアミン五酢酸),DTPA−BMA(ジエチレントリアミン五酢酸−ブチルメタクリレート),DTPA無水物,DOTA(1,4,7,10−テトラアザシクロドデカン−1,4,7,10−テトラアセテート),DO3A(1,4,7,10−テトラアザシクロドデカン−1,4,7−トリアセテート),HP−DO3A(2−ヒドロキシプロピル−1,4,7,10−テトラアザシクロドデカン−1,4,7−トリアセテート)等が挙げられるが、特に、臨床で使用された実績が長いという点では、DTPAが好ましく、キレートの安定性の点では、DOTAが好ましい。
従って、本発明の化合物を、本発明の、細胞内滞在型MRI造影剤として用いる場合には、特に、長期間の細胞追跡を必要とするため、安定性の高いDOTAが好ましい。
本発明の金属キレート複合体に用いられる金属キレートは、オムニスキャン(登録商標,Gd−DTPA−BMA,第一製薬製),プロハンス(登録商標,Gd(HP−DO3A),エーザイ製),マグネスコープ(登録商標,Gd−DOTA,栄研又は田辺製薬製),マグネビスト(登録商標,Gd−DTPA,シェーリング製)等の市販されているものを用いることができるが、常法により製造することもできる。具体的には、金属イオンとキレート化剤を、例えば水溶液中で常温,常圧化、pH6〜6.5で、24時間混合する等の方法により、製造することもできる。
好ましいpHの範囲は、キレート化剤の種類にもよるが、一般に、キレート化が促進されという点で、上記のようなpH値とすることが好ましい。
本発明の金属キレート複合体に用いられるPVAとは、ビニルアルコールをその構成単位(モノマー)とする公知の高分子であり、非常に親水性の高い合成樹脂である。構成成分であるビニルアルコールは、分子構造的に不安定で、高分子の製造原料としては適さないことから、通常は、まず酢酸ビニルを重合し、ポリ酢酸ビニルとした後、酢酸エステル残基を加水分解によって水酸基とすることによって製造される。
重量平均分子量は、細胞膜を往き来し難く、血中半減期がある程度長く、一定エリアあるいは細胞内に留まり易いという点で2000以上が好ましく、体内に蓄積し難いという点で10万以下のものが好ましい。より好ましくは2万〜5万,更に好ましくは、3万〜4万である。
ケン化度は、85〜99.9%が好ましい。
ガラス転移温度は、10〜80℃が好ましい。
ガラス転移温度は、DSCで測定する。
溶液粘度は、1〜100000cpsが好ましい。
また、一つの種類のPVAを単独で用いても良く、複数種のPVAをブレンドして用いることもできる。
本発明のキレート複合体は、PVAへの金属キレートの導入率をコントロールし易い点で、リンカーを構成成分として含んでいることが好ましい。特に、金属キレートの導入率を上げるためには、リンカーを使用することが好ましい。本発明で言うリンカーとは、その両端において、PVAと金属キレートのそれぞれと結合することにより、PVAと金属キレートを結合させることのできる物質である。
リンカーの構成成分としては、ジアミン,トリアミン等のポリアミン類,ジアルコール等の多価アルコール類,オキシカルボン酸,アミノ酸,ジイソシアナート等が挙げられる。ジアミンの一端は、金属キレートの持つカルボキシル基と、アミド結合し、ジアミンの他端は、カルボキシイミダゾール(CDI)等のイミダゾール等の縮合剤を用いて、PVAのOH基とウレタン結合する。中でも、ジアミンが、特別な装置等を必要とせず、緩和な反応条件で行えるなど、反応が簡単であるため好ましい。
特に、生体材料としては6以下が好ましく、炭素数が2〜5がより好ましく、最も好ましいのは、プロパンジアミン類等の炭素数3のリンカーであり、特に、1,3−プロパンジアミンが好ましい。
本発明の金属キレート複合体は、例えばPVAのOH基に、エステル化剤等を用いて、直接、キレートのCOOH基を結合させ、その後金属イオンを導入する等、公知の方法によって製造することができるが、予め製造した金属キレートのCOOH基を、PVAのOH基と結合させても良い。尚、本発明の金属キレート複合体の製造過程の一例を表すスキームを図1に示す。
これら各々の結合,導入工程は、常法に従い行うことができる。
尚、金属イオンを、予めキレート化剤によって金属キレートとしてから、PVAへの結合に用いても良い。
まず、PVAをDMSO(ジメチルスルフォキシド)に溶解させる。さらにCDI(カルボキシジイミダゾール)を添加し、禁水条件で1日攪拌する。1日後ジアミンを過剰量加え、1日攪拌する。得られた反応溶液を水中で透析し、凍結乾燥により目的物を得る。
まず、DMSO中で、キレート化剤に対して、N−ヒドロキシスクシンイミドを加え、活性化エステルを形成させ、アミンと反応させる。得られた反応溶液を水中で透析し、凍結乾燥により目的物を得る。
まず、キレート化剤と金属イオンを水中、至適pHで攪拌させる。得られた反応溶液を水中で透析し、凍結乾燥により目的物を得る。
まず、例えば、アルデヒド型の金属錯体を用いてアミンと反応させ、シッフベースを形成させることで、リンカーに結合させる方法等である。
これらの反応は、常法に従って行うことができ、例えばBioconjugate Chem.; (Article)(2004; 15(4); P.841-849)に記載の方法等を用いることができる。
リンカーを用いた場合のPVAへのリンカー導入比率は、リンカーの添加量に相関するため、添加量を変化させることによって、導入比率を調整可能である。
ビニルアルコールを1つのユニットと考えた場合に、上述の方法で導入した場合の、全ユニットに対してリンカーが導入されたユニットの割合は、技術的には、数%〜90%程度まで可能であるが、十分なプロトン緩和速度増強効果を発揮し、かつ水溶性を維持するという観点からは、3%〜40%が好ましく、更に好ましくは5%〜30%程度である。
尚、リンカーを用いず、直接PVAに対して、キレート化剤あるいは金属キレートを導入する場合の導入比率は、種々の実験条件によって、またキレート化剤あるいは金属キレートの添加量によって調整可能である。この場合も、リンカーを用いる場合と同じく、全ユニットに対して金属キレートが導入されたユニットの割合が、1.5〜40%であることが好ましく、更に好ましくは2.5〜30%である。
本発明の金属キレート複合体は、細胞膜を通り抜け難い性質を有している。特に、PVAのケン化度が高い場合は、細胞膜への吸着が少ないという性質を有しており、細胞膜に近づくこと自体が少ないという利点を有している。
特に、PVAのケン化度が高い場合は、細胞膜への吸着が少ないという性質を有している。
このことによって、例えば、再生治療等において、MRI等の手段によって、移植細胞の増殖の様子を観察可能であることが分かった。
本発明の金属キレート複合体は、後述のプロトン緩和速度増強剤や、MRI造影剤等として利用することが可能である。特に、細胞膜を通り抜け難いため、細胞内滞在型MRI造影剤として特に有用である。
本発明のプロトン緩和速度増強剤は、上記<1>の金属キレート複合体を含むことを特徴とする。
本発明のプロトン緩和速度増強剤中の、上記<1>の金属キレート複合体の濃度は、0.1〜10重量%が好ましく、更に好ましくは、0.5〜5重量%である。0.1重量%以上で、プロトン緩和速度増強効果が得られ、10重量%以下では、粘性が抑えられ、注射液等に好適であるからである。
本発明のプロトン緩和速度増強剤は、上記<1>の金属キレート複合体の他、水,アルコール,生理食塩水等の溶媒の他、マンニトール等の、注射剤等に一般に用いられる成分,あるいはプロトン緩和速度増強剤や、MRI造影剤に、一般に用いられている成分を、更に含ませることができる。
本発明のプロトン緩和速度増強剤は、注射剤,カテーテル用液剤,経口用液剤,細胞処理液,組織処理液等の、液剤の形態が好ましく、中でも、移植細胞を処理する場合の細胞処理液,組織処理液が好ましい。
本発明のプロトン緩和速度増強剤は、上記の主成分である金属キレート複合体と、上記の第2成分等の他の成分各々を、常温,常圧下で混合する等の方法によって、得ることができる。
本発明のプロトン緩和速度増強剤は、主成分である金属キレート複合体が、細胞膜を通り抜け難い性質を有しており、細胞膜に近づくこと自体、少ないという性質を有している。
また、本発明のプロトン緩和速度増強剤を細胞内に導入した場合、細胞分裂後も、細胞群のほぼ全体に亘って、プロトン緩和速度増強剤の存在が観察された(図15,16)。
このことによって、例えば、再生治療等において、MRI等の手段によって、移植細胞の増殖の様子を観察可能であることが分かった。
本発明のプロトン緩和速度増強剤は、後述のMRI造影剤,中でも、細胞内滞在型のMRI造影剤として適している。
本発明のMRI造影剤は、上記<1>の金属キレート複合体を含むことを特徴とする。
本発明のMRI造影剤中の、上記<1>の金属キレート複合体の濃度は、0.1〜10重量%が好ましく、更に好ましくは、0.5〜5重量%である。0.1重量%以上で、プロトン緩和速度増強効果が得られ、10重量%以下では、粘性が抑えられ、注射液等に好適であるからである。
本発明のMRI造影剤は、上記<1>の金属キレート複合体の他、水,アルコール,生理食塩水等の溶媒の他、マンニトール等の、注射剤等に一般に用いられる成分,あるいはMRI造影剤に、一般に用いられている成分を、更に含ませることができる。
本発明のMRI造影剤は、注射剤,カテーテル用液剤,経口用液剤,細胞処理液,組織処理液等の、液剤の形態が好ましく、中でも、移植細胞を処理する場合の細胞処理液,組織処理液が好ましい。
本発明のMRI造影剤は、上記の主成分である金属キレート複合体と、上記第2成分等の他の成分各々を、常温,常圧下で混合する等の方法によって、得ることができる。
本発明のMRI造影剤は、主成分である金属キレート複合体が、細胞膜を通り抜け難い性質を有しており、細胞膜に近づくこと自体、少ないという性質を有している。
また、本発明のMRI造影剤を細胞内に導入した場合、細胞分裂後も、細胞群のほぼ全体に亘って、MRI造影剤の存在が観察された(図15,16)。
このことによって、例えば、再生治療等において、移植細胞の増殖の様子を観察することが可能となる。
本発明のMRI造影剤は、特に、後述の細胞内滞在型のMRI造影剤として適している。
本発明の細胞内滞在型MRI造影剤は、上記<1>の金属キレート複合体を含むことを特徴とする。
本発明の細胞内滞在型MRI造影剤中の、上記<1>の金属キレート複合体の濃度は、0.1〜10重量%が好ましく、更に好ましくは、0.5〜5重量%である。0.1重量%以上で、プロトン緩和速度増強効果が得られ、10重量%以下では、粘性が抑えられ、注射液等に好適であるからである。
本発明の細胞内滞在型MRI造影剤は、上記<1>の金属キレート複合体の他、水,アルコール,生理食塩水等の溶媒の他、マンニトール等の、注射剤等に一般に用いられる成分,あるいはMRI造影剤に、一般に用いられている成分を、更に含ませることができる。
本発明の細胞内滞在型MRI造影剤は、注射剤,カテーテル用液剤,経口用液剤,細胞処理液,組織処理液等の、液剤の形態が好ましく、中でも、移植細胞を処理する場合の細胞処理液,組織処理液が好ましい。
本発明の細胞内滞在型MRI造影剤は、上記の主成分である金属キレート複合体と、上記の第2成分等の他の成分各々を、常温,常圧下混合する等の方法によって、得ることができる。
本発明の細胞内滞在型MRI造影剤は、主成分である金属キレート複合体が、細胞膜を通り抜け難い性質を有しており、細胞膜に近づくこと自体、少ないという性質を有している。
また、本発明の細胞内滞在型MRI造影剤は、細胞内に導入した際、細胞内に長期間滞在し、細胞分裂後は、細胞群のほぼ全体に亘って、細胞内滞在型MRI造影剤の存在が観察された(図15,16)。
このことによって、例えば、再生治療等において、移植細胞の増殖の様子を観察することが可能となる。
本発明のプロトン緩和速度増強剤,MRI造影剤,細胞内滞在型MRI造影剤を、筋肉,血管,臓器その他の組織に投与する場合の投与方法としては、経口投与,カテーテル投与,静注等の静脈投与,筋肉内投与,経皮投与,経鼻投与,皮内投与,皮下投与,腹腔内投与,直腸内投与,粘膜投与、吸入等が挙げられるが、安全かつ血中濃度を一定に保つという点では、静注等の静脈投与が好ましい。
マウス等の実験動物が測定対象の場合には、尾静脈注射等の方法も挙げられる。
本発明のプロトン緩和速度増強剤,MRI造影剤,細胞内滞在型MRI造影剤の剤形は、エレクトロポレーション等に用いる細胞処理液,組織処理液の形態のほか、注射剤やカテーテル用液剤,経口用液剤等の形態が挙げられるが、必ずしもこれらに限られるものでは無い。
投与量は、標的となる組織や細胞の種類,数,疑われている疾患の種類,進行度,患者の年齢,性別,体重等により適宜調整することができ、必ずしも限定されるものでは無いが、一般に、下記の量が選択し得る。
経口,経皮,注射等によって、組織に投与する際には、1回の投与量は、通常金属キレート複合体量として、0.01mg〜1000mg、好ましくは0.1mg〜1000mg、より好ましくは0.1mg〜100mgである。
Gd重量としては、1回の投与当たり、0.001mgから10mg投与することが好ましい。
また、マイクロインジェクション,エレクトロポレーション,細胞膜融合性リポソームを用いる方法等によって、細胞内に直接投与する際には、1細胞辺り107〜1012個の金属キレート複合体が入る様に投与することが好ましい。
この量を投与された細胞は、細胞分裂に際して、分裂細胞にも適当な量の金属キレート複合体が分配されるため、細胞移植の増殖による組織の再生課程の追跡が、より確実となるからである。
細胞移植に際し、in vivo,あるいはin vitroで、マイクロインジェクション,エレクトロポレーション,又は細胞膜融合性リポソームを用いる方法等によって、プロトン緩和速度増強剤,MRI造影剤,又は細胞内滞在型MRI造影剤を、移植する細胞に導入する。
当該導入細胞を移植した後、4.7T(3次元)MRI等によって、移植細胞,及びその分裂細胞の様子を、経時的に観察することができる。
本発明のプロトン緩和速度増強剤,MRI造影剤,又は細胞内滞在型MRI造影剤等を、細胞内に導入した場合、細胞分裂後も、細胞群のほぼ全体に亘って、それらが存在していることが観察されており(図15,16)、例えば再生治療等において、移植細胞の増殖の様子を観察することが可能となる。
PVAユニットに対するDOTA導入率 (%)は、PVAユニットに対するジアミンの仕込み量に相関していた。
結果を、表1に示す。
キレート化剤(DOTA)は、添加量が十分であれば、ほぼ100%のリンカー(ジアミン)に結合することから、表1の結果は、PVAへのリンカーの結合量が、リンカーの添加量に相関することを示している。
ガドリニウムをキレートに導入した際、およそ5〜7割程度の割合で、安定して導入されることを確認した。
結果を、後述する表1に示す。
プロトン緩和速度増強効果が、PVAに導入されたリンカー比率(≒金属キレート導入比率)や、プロトン緩和速度増強中の金属キレート複合体濃度に比例することを、実験により確認した。
本発明の金属キレート複合体を、下記の様にして製造した。
尚、製造過程は、図1に示した通りである。
重量平均分子量74800(重合度からの計算値),ケン化度98.5%,Tg45℃の、直鎖状PVAの側鎖OH基に対し、脱水剤である1,1’−カルボニルビス−1H−イミダゾールを用いて、1,3−プロパンジアミンを任意の割合で導入し、導入率の異なる4種のサンプル(A〜D)を得た。
下記表1に示す通りPVAユニットへのDOTA導入率は、1H−NMR測定により、ユニット比で、サンプルA:13.2%,サンプルB:7.5%,サンプルC:3.6%,サンプルD:12.9%であった。
次に、キレート化剤である1,4,7,10−テトラアザシクロドデカン−1,4,7,10−テトラアセテート(DOTA)を側鎖に導入した。
更に、中心金属であるガドリニウムをDOTAと錯形成させることで、本発明の金属キレート複合体を得た。
尚、サンプルDに関しては、DOTAの導入に先立って、測定用の蛍光標識(FITC)を添加し、PVAに結合した複数のリンカー(ジアミン)の一部に、DOTAでは無く、FITCを結合させた。
また、表中、Mnは、PVAの数平均分子量,Mwは重量平均分子量を表す。
上記サンプルA〜Cの金属キレート複合体を用い、795μlのD2Oと5μlのH2Oを混合した測定用溶液中で、プロトン緩和時間の測定を行った。
T1測定は、Varian Gemini 300 NMR spectrometerを使用し、Inversion Recovery法によって行った。
Inversion Recovery法(反転回復(IR)法)とは、電磁波を照射後、任意の時間にNMRスペクトルを測定し、信号強度の時間変化からT1を測定する方法である。このIR法では、まず始めに180°パルスを印加する。次に、任意の時間に90°パルスを印加し、得られる信号強度を時間に対してプロットすることでT1を得ることができる。
高分子濃度に対してプロトン緩和速度(緩和時間の逆数)をプロットしたところ、上記測定用溶液中の、金属キレート複合体(高分子)濃度や、金属キレート複合体中の金属キレートの量に対して比例的に、プロトン緩和速度が増加していることが分かった(図2)。
これらの結果から、本発明の金属キレート複合体は、濃度依存的にプロトン緩和速度を増強し、また複合体中の金属キレート量を調節することによって、緩和度を任意に設定可能であることが分かった。
T1 -1(=1/T1)=1/T0+R×C
T1:測定対象の緩和時間
T1 -1:測定対象の緩和速度
T0:物質固有の緩和時間
C:プロトン緩和速度増強剤(又はMRI造影剤)濃度
R:緩和度(グラフの傾き)
本発明の金属キレート複合体(サンプルD)と、公知の造影剤であるマグネビスト(登録商標,Gd−DTPA,シェーリング製)とで、プロトン緩和速度を比較した。結果を図3に表す。
即ち、本実験例における本発明のプロトン緩和速度増強剤の濃度と、緩和速度の関係、下記式の通りとなる。
本発明の金属キレート複合体の安全性を確認するため、テトラゾリウム塩(WST−1)を用いた細胞毒性試験を実施した。
WST−1を用いた細胞毒性試験は、公知の方法であり、市販の試験キット(Premix WST-1 Cell Proliferation Assay System:タカラバイオ(株)製/Cell Proliferation Reagent WST-1:ロッシュ製/W201:株式会社 同仁化学研究所製等)を用い、当該キットに付属の説明書等に従って行うことができるが、その原理は下記の通りである。
上述の方法に従い、比較対照となる公知のMRI造影剤である金属キレート(マグネビスト(登録商標,Gd−DTPA,シェーリング製)又は本発明の金属キレート複合体(サンプルB)を含むPBS溶液,あるいは対照となるPBS溶液を、NIH−3T3細胞を培養している培地に各々投与した場合の、生存細胞数を測定することによって、細胞毒性を確認した。結果を図4,5に示す。尚、縦軸はUVの値を表す。
尚、金属キレート又は金属キレート複合体を含む溶液の、キレート濃度は、図4,5に示す通りである。
本発明の金属キレート複合体(サンプルA,B)を含有する培養液を、エレクトロポレーションによって細胞内に導入した場合の、生存細胞数を、上述の方法に従って測定することにより、細胞毒性を確認した。結果を図6,7に示す。尚、縦軸はUVの値を表す。
本発明の金属キレート複合体(表1のサンプルA,B,C)を含むPBS溶液を、MRIを用いて撮像した。撮像されたそれぞれのサンプルの画像の輝度を画像処理等の方法によって測定した。
また、図12の縦軸はPBSの輝度を1とした場合におけるそれぞれのサンプルの輝度を表している。
本発明の金属キレート複合体(表1のサンプルA)を、エレクトロポレーションによってNIH−3T3細胞内に導入した。得られた細胞を封入したアガロースゲルを、MRIを用いて撮像した。得られた画像を画像処理により、アガロースゲルの輝度を1として、アガロース+細胞(細胞のみ)、アガロース+10-3Mの条件下で導入した細胞(10-3M)、アガロース+10-2Mの条件下で導入した細胞(10-2M)の輝度を求め、各々グラフ化した。
NIH−3T3細胞内にエレクトロポレーション法を用いてサンプルを導入し、細胞内のサンプル量の経時的変化を、蛍光測定を用いて測定した。本発明の金属キレート複合体サンプルとしては、サンプルDを用いた。結果を図14に表す。尚、図中の縦軸は、蛍光強度の値である。
本発明の金属キレート複合体(サンプルD)を用い、エレクトロポレーション法により細胞内への導入を行った。導入2日後の顕微鏡写真(明視野、蛍光)を示す(図15,16)
また、細胞が増殖しているにも関わらず、ほとんどすべての細胞が光っていることから、サンプルが、細胞分裂の過程で、細胞外に漏れ出していないだけでなく、個々の分裂細胞にも、ある程度均等に、サンプルが分配されていることが分かった。
実施例8と同様にして、本発明の金属キレート複合体(サンプルD)を細胞内に投与した後の、金属キレート複合体の細胞内滞在性の経時的変化を、細胞の増殖性と共に測定した結果を、図17に示す。
つまり、時間が経過しても細胞内にサンプルが保持されており、細胞移植しても長期間MRI等によって追跡が可能であることを示唆している。
本発明の金属キレート複合体(表1のサンプルD)を、エレクトロポレーションによってNIH−3T3細胞内に導入後、試験管底部に細胞を集積させ、試験管底部を含むように水平方向にスライスし、MRI撮像を行った。結果を図18に示す。
比較対象として、サンプルを導入していないNIH−3T3細胞,及び培地のみを入れた試験管を用いた。
本発明の金属キレート複合体(表1のサンプルD)を、エレクトロポレーションによってNIH−3T3細胞内に導入後、アガロースゲル内に細胞を封入した。
得られたゲルをマウス皮下に移植し、MRI撮像を行った。結果を図19に示す。
比較対象として、アガロースゲルのみを、同マウスの別の部位(皮下)に移植した。
これより、in vivoにおいても、MRIを用いて細胞の追跡が可能であることが確認できた。
Claims (9)
- 1又は2以上の金属キレートと、ポリビニルアルコールを構成成分として含むことを特徴とする、金属キレート複合体。
- 金属キレートが、リンカーを介してポリビニルアルコールに結合していることを特徴とする、請求項1記載の金属キレート複合体。
- リンカーが、ジアミンであることを特徴とする、請求項2記載の金属キレート複合体。
- キレート化剤が、DTPA,DTPA無水物,DOTA,DO3A,HP−DO3A,DTPA−BMAからなる群から選択される1又は2以上のキレート化剤であることを特徴とする、請求項1乃至3のいずれかに記載の金属キレート複合体。
- ポリビニルアルコールの重量平均分子量が2000〜10万であることを特徴とする、請求項1乃至4のいずれかに記載の金属キレート複合体。
- 金属がガドリニウムであることを特徴とする、請求項1乃至5のいずれかに記載の金属キレート複合体。
- 請求項1乃至6記載のいずれかに記載の金属キレート複合体を含むことを特徴とする、プロトン緩和速度増強剤。
- 請求項1乃至6記載のいずれかに記載の金属キレート複合体を含むことを特徴とする、MRI造影剤。
- 請求項1乃至6記載のいずれかに記載の金属キレート複合体を含むことを特徴とする、細胞内滞在型MRI造影剤。
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