KR20150078375A

KR20150078375A - 철산화물 나노입자를 포함하는 철결핍증의 예방 또는 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: KR20150078375A
Application number: KR1020130167673A
Authority: KR
Inventors: 전봉식; 권은별; 김응규; 명완재; 박주영
Original assignee: 한화케미칼 주식회사
Priority date: 2013-12-30
Filing date: 2013-12-30
Publication date: 2015-07-08
Also published as: US20160303163A1; WO2015102289A1; CN105848661A; EP3090750A1

Abstract

본 발명은 철산화물 나노입자를 포함하는, 철결핍증 및 이에 수반되는 빈혈의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

Description

철산화물 나노입자를 포함하는 철결핍증의 예방 또는 치료용 약학 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTION OR TREATMENT OF IRON DEFICIENCY COMPRISING IRON OXIDE NANOPARTICLE}

철은 살아있는 거의 모든 생명체에서 반드시 필요한 미량 필수영양성분으로서 철의 부족 및 과잉은 동물체의 세포기능을 억제하거나 저하시키는 역할을 한다. 일반적으로 체내 철 함유 물질은 대사와 효소 기능을 하는 기능성 철과, 운반과 저장에 사용되는 저장성 철로 크게 나뉜다. 철 결핍성은 빈혈을 일으키는 주요한 원인으로서 전 세계 인구의 약 15%가 철 결핍성 빈혈(iron-deficiency anemia, IDA)을 가지고 있다.

철 결핍성 빈혈은 전 세계적으로 사람에게 일어나는 가장 일반적인 병리적 상태 중 하나인 것으로 알려져 있다. 철 결핍성 빈혈은 대개는 철-함유 제제를 경구 투여함으로써 예방 또는 치료될 수 있으며, 이는 환자 입장에서 가장 간편한 방법이다. 그러나, 철분 제제의 경구 투여는 소화 장애를 유발할 수 있고, 투여한 철분 제제의 생체 이용률이 낮다는 문제가 있다.

또한, 비경구 투여용 철-함유 제제는 철이 헤모글로빈 합성에 쉽게 이용될 수 있어야 하고, 국소적 또는 전신적 부작용이 없어야 하며 반감기로 인한 충분한 저장 안정성이 있어야 하는 등의 조건을 만족시켜야 한다. 현재 미국에서 사용이 승인된 비경구 철 제제로는 철-덱스트란(예: 인페드(InFed), 덱스페럼(Dexferrum)), 철-글루코네이트 복합체(펠레시트(Ferrlecit)) 및 철-수크로오스(베노페럼(Venoferrum)) 등이 있다.

철-덱스트란은 미국에서 시판된 최초의 비경구 철 제품으로서, 아나필락시스 (anaphylactoid) 반응(호흡곤란, 천식성 기침, 흉부 통증, 저혈압, 두드러기, 혈관신경성 부종)의 발생 빈도가 높다. 철-덱스트란의 경우에는 심각하고 생명을 위협하는 반응이 가장 빈번하게 일어나며, 관절통, 등 부위 통증, 저혈압, 열, 근육통, 가려움증, 현기증 및 구토와 같은 증상도 일어난다. 이와 같은 아나필락시스 반응들의 높은 발생 빈도는 덱스트란 부분에 대한 항체의 형성에 기인하는 것으로 생각되며, 이러한 부작용이 나타나는 경우, 생명을 위협하는 정도가 아니라도 더 이상의 투여가 어려운 경우가 많다.

다른 비경구 철 제품(예: 철-수크로오스 및 철-글루코네이트)들은 덱스트란을 함유하지 않는 제품으로, 이러한 제품들을 사용할 경우 아나필락시스의 발생 빈도는 현저히 낮다. 그러나, 이들 화합물은 철의 결합력이 낮아 제품 내 유리 철의 농도가 더 높기 때문에, 이로 인해 투여 시 철 화합물의 독성이 있고, 높은 pH, 높은 몰농도, 등의 물리적 특성에 따라 투여량 및 투여 속도가 제한된다. 또한, 주사 가능한 고분자량 물질들은 저분자량 물질들에 비해 알레르기 반응을 더 많이 유발하는 단점이 있다.

이에, 철-착물이 아닌 비경구 투여용 철 함유 제제로 철산화물 나노입자를 기반으로 하는 페럼옥시톨(ferumoxytol)이 개발되었으며, 그 효능 및 투여에 관한 정보는 [Landry et al. (2005) Am J Nephrol 25, 400-410, 408]와 [Spinowitz et al. (2005) Kidney Intl 68, 1801-1807] 및 미국 특허 제 6,599,498호를 참조할 수 있다. 페럼옥시톨은 나노입자의 철산화물 중심입자 평균 입경이 약 7 nm 이며, 분자량이 731 kDa 으로 비교적 큰 크기를 가지며, 철-덱스트란, 철-수크로오스, 철-글루코네이트 등의 다른 비경구 철 제품에 비해 안정성이 뛰어나 유리 철의 농도가 낮다. 그러나, 페럼옥시톨을 이용한 통상의 치료 방법은 1 g 의 철을 투여하기 위해 일주일에 걸쳐 2 회 투여하며, 이러한 투여 방식은 튜브 및 주입액과 같은 비품에 대한 비용 및 환자의 불편함을 유발한다.

나노-바이오 분야에서 자기공명영상(MRI) 조영제, 세포 분리, 자기온열치료(Hyperthermia), 약물전달, 바이오센서 등의 다양한 응용분야에 적용이 가능한 철산화물 나노입자는 공침법(coprecipitation), 수열합성법(hydrothermal synthesis), 열분해법(thermal decomposition) 등으로 제조할 수 있으며, 이 중 공침법 및 수열합성법은 염화철(II)와 염화철(III) 용액을 수용상에서 직접 반응하여 침전시키는 방법으로 손쉽게 철산화물 나노입자를 제조할 수 있으나 크기를 제어하기 어렵다는 단점이 있다.

한국공개특허 10-2007-0102672호는 무독성인 금속염을 반응물로 이용하여 균일한 크기의 철산화물 나노입자를 제조하는 열분해법을 제시하고 있으나, 4nm 이하 크기의 철산화물 나노입자를 제조하기엔 까다로운 조건이 필요하여 상용화하기 어려운 단점이 있다. 또한, 한국공개특허 10-2012-0013519 호에는 4nm 이하 크기의 철산화물 나노입자를 제조하는 방법이 개시되어 있으나, 이의 용도는 T1 조영제로 한정된 것이다.

또한 철산화물 나노입자, 예를 들어 사산화삼철(Fe₃O₄ _,마그네타이트) 나노입자는 생체 내에서 쉽게 침전되므로, 기존에는 덱스트란(dextran)이나 키토산(chitosan)등과 같은 폴리머(polymer)로 표면처리하여 사용하였다. 그러나, 덱스트란을 사용한 경우, 즉시형 과민증 반응 중 하나인 아나필락시스 반응 빈도가 높아 생명을 위협할 수 있다. 또한, 키토산과 같은 비덱스트란 물질을 사용하는 경우 철 결합력이 낮아 체내로의 철분 전달력이 떨어지는 단점이 있었다.

이에, 종래 기술의 단점을 보완하여, 인체에 무해하고 아나팔락시스 반응이 낮고 철분 전달효율이 높은, 철산화물 나노입자를 포함하는 철결핍증 또는 이에 수반되는 철 결핍성 빈혈의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 대한 요구가 여전히 절실하다.

본 발명의 목적은 비경구 투여시 높은 유리 철 농도로 인해 야기되는 독성이 없으며, 아나필락시스 반응의 발생 빈도가 낮고, 생체 내 철 이용률이 높고, 실온에서 장기간 보관 안정성이 우수한, 철산화물 나노입자를 유효성분으로 포함하는, 철결핍증의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 철산화물 나노입자와 인산 또는 포스페이트-폴리에틸렌글리콜을 반응시킨 후 물에 분산시켜 나노입자 수용액을 얻는 단계; 상기 나노입자 수용액을 동결건조하여 건조된 나노입자를 얻는 단계; 및 상기 건조된 나노입자를 식염수에 분산시킨 후 농축하는 단계를 포함하는, 상기 약학 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 철산화물 나노입자를 포함하는, 철결핍증 또는 이에 수반되는 철 결핍성 빈혈의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 철산화물 나노입자는 철산화물을 중심입자로 하고, 포스페이트-폴리에틸렌글리콜(Phosphate-Polyethyleneglycol, PO-PEG) 로 표면개질된 것일 수 있으며, 상기 철산화물은 산화철(II)(FeO), 산화철(III)(Fe₂O₃) 및 사산화삼철(Fe₃O₄)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으며, 상기 철산화물 나노입자는 상자성 혹은 유사상자성을 가질 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 철산화물 나노입자와 인산 또는 포스페이트-폴리에틸렌글리콜 (PO-PEG)을 반응시킨 후 물에 분산시켜 나노입자 수용액을 얻는 단계; 상기 나노입자 수용액을 동결건조하여 건조된 나노입자를 얻는 단계; 및 상기 건조된 나노입자를 식염수에 분산시킨 후 농축하는 단계를 포함하는, 상기 약학 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 철산화물 입자의 표면을 인산 또는 포스페이트-폴리에틸렌글리콜(PO-PEG) 복합체로 개질하여 철의 체내로의 전달효율을 높이며, 생체적합성이 우수하여 독성이 없으며, 안정성을 높여 실온에서의 장기 보관이 가능하도록 한다.

이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명은 철산화물 나노입자를 포함하는, 철결핍증 또는 이에 수반되는 철 결핍성 빈혈의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서, '철산화물' 이란, 철이 산소와 결합하여 이루어진 물질을 의미한다. 상기 철산화물의 예는, 산화철(II)(FeO), 산화철(III)(Fe₂O₃)및 사산화삼철(Fe₃O₄ _,마그네타이트) 등을 포함하는 산화철(Iron oxide), 및 철금속산화물(Iron metal oxide)을 포함할 수 있으며 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 일례에서, 상기 철산화물 나노입자는 친수성 물질로 표면처리된 것일 수 있으며, 예를 들면 철산화물 입자의 표면을 인산 또는 포스페이트-폴리에틸렌글리콜(PO-PEG)로 개질하여 철의 체내로의 전달효율을 높일 수 있다. 특히 상기와 같은 코팅물질은 생체적합성이 우수하여 독성이 없으며, 안정성을 높여 실온에서의 장기 보관이 가능하다.

본 발명의 나노입자는 철산화물 중심입자의 평균입경이 1nm 이상 4nm 이하일 수 있으며, 바람직하게는 2nm 이상 4nm 이하일 수 있다. 본 발명의 철산화물 나노입자는 철 결핍증 또는 철 결핍성 빈혈의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 유효성분으로 사용되기 위해서 철산화물 나노입자는 작고 균일할 필요가 있다.

상기 나노입자의 철산화물 중심입자 입경은 철산화물 나노입자의 생체외 배출속도 및 생체이용률을 고려하여 1nm 이상인 것이 바람직하고, 만약 4nm를 초과하는 경우 철산화물 나노입자의 용적이 증가하여 입자의 분해 및 생체이용까지의 시간이 증가하고 혈관 외 장기로의 철산화물 나노입자의 이행이 증가하여 혈액으로의 이용률이 감소하는 문제가 있을 수 있다.

구체적인 일구현예로서 본 발명의 철산화물 나노입자는 상자성 혹은 유사상자성을 가지며, 예를 들면 철산화물 나노입자는 20K 이상의 온도에서 상자성 혹은 유사상자성을 가질 수 있다.

본 발명에 따른 구체적인 철산화물 나노입자는, a) 20K 이상의 온도에서 상자성 혹은 유사상자성을 가지며, b) 철산화물 중심입자의 평균입경이 1nm 에서 4nm이고, c) 친수성 표면물질로 처리되며 d) 입자 간의 응집이 없는 것일 수 있다. 바람직하게 상기 친수성 물질은 인산 또는 포스페이트- 폴리에틸렌글리콜 (PO-PEG)일 수 있다.

본 발명에 따른 철산화물 나노입자는 철결핍증 및 이에 수반되는 철결핍성 빈혈을 치료 및 예방하기 위한 의약으로 사용하기에 적합하다. 특히, 본 발명에 따른 철산화물 나노입자의 유리 철 농도를 측정하여 비교한 결과, 기존의 철분 제제에 비해 유리 철 농도가 매우 낮은 것을 확인할 수 있었다(도 6). 따라서, 본 발명의 조성물은 유리 철 농도가 낮아 이로부터 야기되는 독성 또한 거의 없어 생체에 투여하기에 매우 안전함을 확인하였다.

상기 철결핍성 빈혈, 예컨대 임신한 여성에 있어서의 철 결핍성 빈혈, 아동 및 청소년에 있어서의 잠복성 철결핍성 빈혈, 위장관 이상에 따른 철 결핍성 빈혈, 혈액 손실로 인한 철 결핍성 빈혈, 예컨대 위장관 출혈 (예컨대 궤양, 암종, 치질, 염증성 질환, 아세틸살리실산 섭취에 의한 것), 월경으로 인한 철 결핍성 빈혈, 상처로 인한 철 결핍성 빈혈, 스푸루(spurue)에 기인하는 철결핍성 빈혈, 및 특히 편식하는 아동 및 청소년에 있어서 철분이 부족한 식이에 기인하는 철결핍성 빈혈을 예방 또는 치료할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 약학 조성물은 철결핍증, 철결핍증에 수반되는 빈혈(철결핍성 빈혈)뿐만 아니라, 철결핍성 빈혈에 기인하는 질환 예를 들면, 면역결핍, 뇌기능 손상, 및 하지불안증후군 등을 예방 또는 치료하는데 이용될 수 있다.

병리학적인 상태에서는, 환원된 혈청 내 철 수준이 헤모글로빈 수준의 감소, 적혈구 생산 감소를 일으켜 이로 인한 빈혈을 야기한다. 빈혈의 외부 증상으로는 피로, 창백 및 집중력 저하 등을 들 수 있다. 빈혈의 임상적 증상으로는 낮은 혈청 철 수준(저철혈증), 낮은 헤모글로빈 수준, 낮은 헤마토크리트 수준 및 적혈구 수의 감소, 망상적혈구 감소 및 가용성 트랜스페린 수용체 수준의 증가를 들 수 있다.

본 발명에서 "예방"이라 함은, 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸리기 쉬운 경향이 있는 동물에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다. 또한 본 발명에서 "치료"라 함은 질환 또는 질병의 발전의 억제, 질환 또는 질병의 경감, 및 질환 또는 질병의 제거를 의미한다.

본 발명은 본 발명에 따른 철산화물 나노입자 및 임의로 1종 이상의 추가의 약학적으로 유효한 화합물, 및 임의로 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 보조물질 및/또는 용매를 포함하여 이루어지는 의약 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명의 약학 조성물은 아동, 청소년 및 성인에게 투여될 수 있으며, 경구 및 비경구 투여 경로 모두 가능하다. 바람직하게는 비경구 투여될 수 있다.

본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 질환의 치료를 필요로하는 개체에게 본 발명의 약학 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.

보다 구체적으로 본 발명은, 상기 비경구 투여는 정맥 또는 근육 내로 볼루스 주사(bolus injection)에 의하는 것인, 조성물일 수 있다. 또한, 비경구 투여로서, 주사용 제형으로는 등장성 수용액 또는 현탁액 등이 있으며, 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화 할 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는 이에 한정되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 환약, 에멀젼, 시럽 및 캡슐 등이 있다.

본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 상당히 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 경구 투여용 담체, 및 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있다. 이러한 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 또는 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 부형제로서 안정화제, 보존제, 항산화제, 완충액 및 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일구현예는, 철산화물 나노입자와 인산 또는 포스페이트-폴리에틸렌글리콜(PO-PEG)을 반응시킨 후 물에 분산시켜 철산화물 나노입자 수용액을 얻는 단계; 상기 철산화물 나노입자 수용액을 동결건조하여 건조된 나노입자를 얻는 단계; 및 상기 건조된 나노입자를 식염수에 분산시킨 후 농축하는 단계를 포함하는, 상기 약학 조성물의 제조방법에 관한 것이다. 상기 분산 및 농축단계에서, 약학적으로 허용되는 부형제 또는 첨가제를 추가할 수 있다.

본 발명에 따른 철산화물 나노입자를 유효성분으로 포함하는, 철 결핍성증의 예방 또는 치료용 약학 조성물은, 경구 투여 시 문제가 되는 소화 장애 및 낮은 생체 이용률을 극복할 수 있으며, 비경구 투여 시 문제가 되는 철분 제제의 해리에 의한 유리 철의 독성 문제, 특히 아나필락시스 반응 등을 최소화 할 수 있다. 또한, 철산화물 나노입자의 안정성을 증가시켜, 실온에서 장기 보관이 가능하며 볼루스 주사(bolus injection)가 가능한 철분 제제를 제공하여 환자의 편의성을 크게 증가시킨다.

도 1은 본 발명의 실시예 1-1에서 제조한 3 nm 크기의 철산화물 나노입자의 투과전자현미경 사진을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 실시예 1에서 제조한 약학 조성물인 KEG3 를 마우스에 투여 후 각 장기의 시간에 따른 철분(Fe-59)의 분포 변화를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 실시예 1에서 제조한 약학 조성물인 KEG3 를 마우스에 투여 후 혈장 및 혈구에서의 철분(Fe-59)의 분포 변화를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 실시예 1의 약학 조성물인 KEG3 를 정상 마우스에 투여 후 시간에 따른 혈중 헤모글로빈(Hb)의 수치변화를 부형제 투여군과 비교하여 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 실시예 1의 약학 조성물인 KEG3 를 정상 마우스에 투여 후 시간에 따른 평균 적혈구 용적(MCV)의 수치변화를 부형제 투여군과 비교하여 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 실시예 1의 약학 조성물인 KEG3 의 유리 철 함량을 나타낸 그래프로, 상용 빈혈치료제의 유리 철 함량을 비교하여 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 철산화물 나노입자를 함유하는 약학 조성물( KEG3 )의 제조

1-1: 3 nm 입경의 철산화물 나노입자의 제조

올레산철 착물(Iron oleate) 1.8 g(2 mmol) 과 올레산(oleic acid) 0.57 g(2 mmol), 올레일 알코올(oleyl alcohol) 1.61 g(6 mmol) 을 디페닐에테르(diphenyl ether) 10 g 과 혼합한 뒤 둥근바닥 플라스크에 넣고 1시간 정도 80℃에서 진공으로 기체를 탈기하였다. 상기 플라스크에 아르곤을 흘려주어 비활성 환경을 만든 뒤 250 ℃까지 10℃/min으로 올리며 반응시킨 후, 반응이 진행됨에 따라 반응물의 색이 검정색으로 변하는 것을 볼 수 있었다. 250 ℃까지 승온한 후 30분간 반응시킨 다음 빠른 속도로 냉각하고, 과량의 아세톤으로 수세하였다. 수세한 후 얻어진 침전물을 클로로포름(chloroform) 또는 헥산(hexane)의 유기용매에 분산시켰다.

도 1은 상기 실시예 1-1의 철산화물 나노입자를 투과전자현미경으로 관찰한 결과를 나타내는 사진이며, 상기 철분제제의 철산화물 중심입자는 평균 입경이 3.4 nm, 입경의 표준편차는 0.38 nm 이었다.

1-2: 포스페이트 - 폴리에틸렌글리콜 ( Phosphate - PEG , PO - PEG )를 이용한 철산화물 나노입자의 표면처리

포스포릴클로라이드(POCl₃) 0.15 g 과 폴리에틸렌 글리콜 메틸 에테르(polyethylene glycol methyl ether) 6g을 7 ml 의 테트라하이드로퓨란 (Tetrahydrofuran, THF) 용액에 넣은 후 4시간 동안 교반하였다. THF 를 제거하여 포스페이트- 폴리에틸렌글리콜 (PO-PEG)을 얻었다.

상기 실시예 1-1에서 제조된 3 nm 입경의 철산화물 나노입자 10 mg 과 상기 제조된 포스페이트- 폴리에틸렌글리콜 (PO-PEG) 100 mg 를 에탄올에 혼합하고 밀봉하여 70 ℃ 에서 4시간 동안 교반하여 리간드를 치환하였다. N-헥산(Hexane) 으로 세 번 수세하고 에탄올을 증발시킨 다음 물을 첨가하여 물에 분산시켜 수화지름 11.7 nm 의 표면처리된 철산화물 나노입자의 수용액을 얻었다.

1-3: 철산화물 나노입자를 포함하는 약학 조성물( KEG3 )의 제조

상기 실시예 1-2 에서 얻은 표면처리된 철산화물 나노입자 수용액을 동결건조하여 얻은 건조된 나노입자에, 100ml의 0.9% 식염수(normal saline)을 추가하여 분산시킨 후, 0.2 ㎛ 크기의 포어 크기를 갖는 시린지 필터에 통과시켰다. 통과된 여액을 15 ml의 부피크기를 갖는 Amicon

ultra centrifugal filter-ultracel

-50K에 나누어 담은 후, 3,000 rpm에서 60분간 원심분리하여 여액을 제거하여 농축하였다. 농축된 각 필터에 다시 0.9% 식염수를 추가하여 희석한 후 원심분리하여 농축하는 공정을 수 차례 반복하여 철산화물 나노입자가 0.9% 식염수에 농축된 용액을 얻었으며, 이를 KEG3로 명명하였다.

실시예 2. Fe -59로 표지된 KEG3 의 제조

⁵⁹FeCl₃ 가 첨가된 철-올레산염 복합체(Fe-oleate complex) 를 이용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1-1 에 기재된 것과 동일한 방법으로 제조한 철산화물 나노입자를 이용하고, 실시예 1 에 기재된 것과 동일한 공정을 이용하여 친수화된 나노입자 용액을 제조하였다. 투과전자현미경(transmission electron microscope, TEM) 을 통해 약 3 nm 철산화물 나노입자가 합성되었음을 확인하였으며, 친수화 후 측정 결과 입자의 수화지름(hydrodynamic diameter)은 14.1 nm 이었다.

실시예 1-3에 따라 제조된 KEG3 약학 조성물 내의 Fe-59로 표지된 3 nm 입경의 철산화물 나노입자의 방사능의 세기를 측정한 후 식염수 (0.9 % NaCl 수용액)을 첨가하여 철(Fe) 농도가 1409 ㎍Fe/mL 인 용액을 제조하였다.

비교예 1. 12 nm 입경의 철산화물 나노입자의 합성

12 nm 입경의 철산화물 나노입자를 Ultra-large-scale syntheses of monodisperse nanocrystals, J. Park et al. Nature Materials 3, 891 - 895 (2004) 에 개시된 방법과 동일하게 합성하였다. 올레산철 착물 1.8 g과 올레산 0.28 g을 1-옥타데센(octadecene) 10 g과 혼합한 뒤 3.3℃/min의 승온속도로 318℃까지 올리고 318℃ 에서 30분간 성장시켜 합성하였다.

실시예 3. 마우스에서 Fe -59로 표지된 KEG3 를 이용한 철산화물의 분포

6주령 이하 ICR mouse 의 꼬리정맥을 통해 실시예 3에서 제조한 Fe-59로 표지된 KEG3 용액 0.1 ml 를 주입하고 각각(n=3 ~ 4) 5분, 10분, 30 분, 1시간, 6 시간, 1일, 3일, 10일, 30일, 91일 및 182일차에 채혈 및 근육, 뼈, 지방, 심장, 간, 폐, 신장, 장, 췌장, 이자, 위를 적출하였다. 혈액 및 각종 장기에서 나노입자의 함량은 감마카운터를 이용하여 ⁵⁹Fe 의 방사능(radioactivity)을 측정하여 계산하였다. 철산화물 나노입자의 정맥투여에 의한 각 장기로의 노출을 평가하기 위하여 적출한 장기에서 측정한 방사능을 %ID(injection dose)/g 및 %ID/organ 로 정량화(%ID: 투여량 대비 잔여 분포비율(⁵⁹Fe), %ID/g: 단위 무게당 %ID, %ID/organ: 각 장기당 %ID) 하였다. 각 장기는 적출 후 무게를 측정하였으며, 혈액, 근육, 지방, 뼈는 전체 무게를 측정하기에 어려움이 있기 때문에 통상적으로 몸무게 대비 차지하는 비율을 이용하여 계산하였다(혈액: 7 %, 근육: 40 %, 지방: 7 %, 뼈: 10 %). 또한, 혈액에서 혈장과 적혈구에 분포하고 있는 ⁵⁹Fe 의 비율을 측정하기 위해 시간 별로 채혈한 혈액을 원심분리기를 이용하여 혈장 및 적혈구로 분리한 후 감마카운터로 각 성분의 방사능을 측정하였다.

도 2에 나타난 바와 같이 주요 섭취 장기는 혈액(blood), 간(liver), 비장(spleen) 이며, 간에서는 6시간까지 장기 내 %ID 가 증가하다가 6시간 이후부터 계속 감소하여 182일차에 3.73 %ID/g, 8.88 %ID/organ 을 나타내었다. 비장으로의 노출은 간으로의 노출과 유사한 경향을 보이며, 182일차에 12.4 %ID/g, 1.39 %ID/organ 를 나타내었다. 체내 철산화물 나노입자의 잔존비율 계산을 위해 해당 시간대의 전신(whole body)에서 측정된 ⁵⁹Fe 함량에서 적혈구에서 측정된 ⁵⁹Fe의 함량을 제외한 값을 평가하였다. 이 때, 근육, 지방, 뼈 등은 혈액에 포함된 방사능 세기가 중복 계산 될 우려가 있고, 모든 조직의 정량이 어려워 전신의 방사능 계산에서 제외하였다. 투여용량 5.2 mg Fe/kg 에서 철 성분은 투여 후 91일, 182일에 투여량의 약 33%, 64%를 배출함을 확인하였다.

또한 도 3(혈장, 적혈구의 ⁵⁹Fe 농도 비교 그래프)에 나타난 바와 같이 시간이 흐름에 따라 혈장의 ⁵⁹Fe는 점차 감소하는 반면 적혈구에서의 ⁵⁹Fe는 점차 증가하였으며, 3일 이후에는 혈액 내 존재하는 ⁵⁹Fe 대부분이 적혈구에 포함된 것을 확인하였다.

실시예 4. 랫드를 이용한 KEG3 의 약물동태시험

특정병원체부재(SPF) Sprague-Dawley 랫드 [Crl:CD(SD)] 45 마리에 실시예1에서 제조한 KEG3 용액을 2.6, 5.2 및 10.4 mg Fe/kg 용량으로 랫드에 단회 정맥투여한 후, 각 정해진 시간에 혈액을 취하였다. 혈중 KEG3 의 농도는 혈액을 원심분리하여 혈장성분만 얻은 다음 4.7T 자기공명영상(magnetic resonance imaging, MRI) 장비에서 혈장성분의 T2 완화시간(relaxation time) 을 측정하여 분석하였다.

시험기간 중 사망동물 및 이상증상은 나타나지 않았으며, 랫드에서 KEG3 의 약동학 파라미터(Pharmacokinetic parameters) 는 하기 표 1과 같다. KEG3 를 2.6, 5.2 및 10.4 mg Fe/kg 용량으로 수컷 랫드에 투여한 시험군에서의 전신노출 (AUC_inf 로 평가)은 투여용량이 1:2:4의 비율로 증가함에 따라 약 1:3:7 비율로 투여용량 의존적인 증가를 나타내었다. 시험물질 투여 후 시간에 따른 농도곡선은 모든 투여군에서 소실반감기(t₁ _/2)는 2.2-4.2 시간을 나타내었으며, 시험물질 투여 후 12-24 시간 경과 후에는 정량한계(3 ㎍ Fe/mL) 이하의 농도로 감소하는 것으로 나타났다.

실시예 5. 정상마우스에서 KEG3 가 혈액성분에 미치는 영향

정상 마우스에서 실시예 1의 KEG3 의 투여에 의한 영향을 분석하기 위해 9주령의 C57BL/6 mouse 42마리에 부형제 또는 실시예 1에서 제조한 KEG3 를 5.2 mg Fe/kg 의 용량으로 정맥투여하고, 투여당일 및 투여 후 1, 3, 7 및 14일에 혈액을 채취하여 혈액 성분 지표의 변화 분석을 통해 철산화물 나노입자에 의한 영향을 확인하였다.

시험기간 중 모든 시험동물에서 이상소견은 관찰되지 않았다. 도 4 에 나타난 바와 같이 부형제 투여군에 비해 KEG3 투여군의 혈중 헤모글로빈 (Hb) 수치는 통계적으로 유의한 변화가 나타나지 않았으며, 도 5에 나타난 바와 같이 시험물질 투여 후 14일차에 KEG3 투여군의 평균 적혈구 용적 (MCV) 수치가 부형제 투여군의 MCV 의 수치에 비해 통계적으로 유의(p<0.05)하게 증가하였으나, 혈액의 정상적인 MCV 수치를 만족하였다. 따라서, 정상 마우스에서 KEG3 의 투여에 따른 혈액 성분에는 크게 변화가 없음을 확인하였다.

실시예 6. KEG3 의 유리 철 농도 실험

실시예 1에서 제조한 KEG3 의 비경구 투여시 독성을 발생시키는 유리 철의 농도를 확인하기 위해 초미세여과(ultrafiltration)를 이용하여 상용 철분제 및 실시예 1 에서 제조한 KEG3 의 유리 철 농도를 분석하였다.

3가지의 상용 빈혈치료제(Venoferrum, Cosmofer, Ferinject) 및 실시예 1 에서 제조한 KEG3 를 2,000 ㎍Fe/mL으로 희석한 다음 분획분자량 (Molecular Weight CutOff, MWCO)이 10,000, 30,000, 50,000 및 100,000인 원심분리기에 각각 담아 3,000 rpm 으로 30분간 원심분리하여 여과액만 회수하였다.

용액 500 μL 에 내의 10 mM 아스코르브산(ascorbic acid) 을 포함하는 0.5M 시트르산 버퍼용액 50 μL 를 첨가한 다음 30분간 반응시키고, 여기에 10 μL 의 50mM BPS(Bathophenantroline disulfonate) 용액을 첨가한 다음 20분 이상 반응시켰다. 96-웰(well) 마이크로플레이트 에 각 용액을 100 μL씩 담아 마이크로플레이트 리더로 535 nm 에서 흡광도를 측정하여 유리철의 농도를 측정하였다.

도 6에 나타난 바와 같이 실시예 1 에서 제조한 KEG3 의 유리 철 농도는 분획분자량이 50,000 이하인 필터에서 분획분자량에 관계없이 균일한 수준으로 나타났으며, 상용 빈혈치료제 대비 낮은 수준의 유리 철 농도를 나타내어 독성이 낮을 것으로 예측되었다.

실시예 7. 랫드에서 단회 정맥투여 급성독성

특정병원체부재(SPF) Sprague-Dawley 랫드 [Crl:CD(SD)] 5 마리를 이용하여 KEG3 의 단회 정맥투여에 의한 급성독성을 확인하였다. 시험물질의 투여시 투여경로는 사람에서의 임상 예정 경로인 정맥투여를 실시하였으며, 투여용량은 단회 투여가능한 주사액의 최대 volume인 10 mL/kg을 기준으로 최대 투여용량을 840 mg/kg으로 하여 시험을 실시하였다. 다음 용량은 도즈프로그레션인자 (dose progression factor) 3.2를 적용하여 OECD Guideline No.425 에서 제시하는 용량으로 (1.75, 5.5, 17.5, 55, 175, 550 및 840 mg/kg) 투여하였다. 다음용량의 결정은 AOT425StatPgm에서 제시하는 한계검사(Limit test type)의 시험방법에 따라 한계용량인 840 mg/kg으로 1번 동물을 투여한 후 생존하면 같은 용량으로 다음 동물에 투여하며, 5마리까지 투여 중 3마리 이상이 사망하면 메인검사(Main test type)로 변경하여 시험하는 방법으로 실시하였다. 단회투여독성 시험군의 구성 및 투여량은 하기 표 2와 같다.

시험기간 중 사망동물은 나타나지 않았으며, 시험물질 투여와 관련되어 피부의 변색 및 착색뇨가 관찰되었고, 모든 동물에서 체중의 감소 및 증가억제가 관찰되었다. 시험물질 투여와 관련된 육안적인 부검소견은 관찰되지 않았다. 암컷 랫드에 있어서 철산화물 나노입자의 정맥투여에 의한 본 시험물질의 반수치사용량 (LD50) 값은 840 mg/kg (300 mg Fe/kg)을 상회하는 것으로 측정되었다.

Claims

철산화물 나노입자를 포함하는, 철결핍증 또는 철 결핍성 빈혈의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 철산화물 나노입자는,
철산화물을 중심입자로 하고, 포스페이트-폴리에틸렌글리콜로 표면개질된 것인, 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 철산화물 나노입자의 철산화물 중심입자 크기는 1nm 내지 4nm인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 철산화물은 산화철(II)(FeO), 산화철(III)(Fe₂O₃) 및 사산화삼철(Fe₃O₄)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 철산화물 나노입자는 상자성 혹은 유사상자성을 가지는 것인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 철산화물 나노입자는,
a) 20K 이상의 온도에서 상자성 혹은 유사상자성을 가지며,
b) 철산화물 중심입자 크기는 1nm 에서 4nm이고,
c) 표면은 친수성 물질로 둘러싸여 있으며,
d) 입자 간의 응집이 없는 것을 특징으로 하는 것인, 조성물.
제6항에 있어서, 상기 친수성 물질은 포스페이트-폴리에틸렌글리콜인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 철결핍성 빈혈은, 임신으로 인한 철 결핍성 빈혈, 아동 및 청소년기의 잠복성 철 결핍성 빈혈, 위장관 이상에 따른 철 결핍성 빈혈, 혈액 손실로 인한 철 결핍성 빈혈, 월경으로 인한 철 결핍성 빈혈, 상처로 인한 철 결핍성 빈혈, 스푸루(spurue)에 기인하는 철 결핍성 빈혈, 암 환자의 철 결핍성 빈혈, 화학요법에 기인하는 철 결핍성 빈혈, 염증에 의해 유발된 철 결핍성 빈혈 (AI), 울혈성 심부전에 의한 철 결핍성 빈혈 (CHF; 울혈성 심부전), 류마티스성 관절염 (RA)에 기인한 철결핍성 빈혈, 전신 홍반 루푸스 (SLE)의 철 결핍성 빈혈 및 염증성 장질환 (IBD)에 의한 철 결핍성 빈혈로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상인, 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 약학 조성물은 정맥 또는 근육 내로 볼루스 주사(bolus injection)로 투여되는 것인 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 부형제 또는 담체를 더 포함하는 것인, 약학 조성물.
철산화물 나노입자와 포스페이트-폴리에틸렌글리콜을 반응시킨 후 물에 분산시켜 나노입자 수용액을 얻는 단계;
상기 나노입자 수용액을 동결건조하여 건조된 나노입자를 얻는 단계; 및
상기 건조된 나노입자를 식염수에 분산시킨 후 농축하는 단계를 포함하는, 철산화물 나노입자를 포함하는 약학 조성물를 제조하는 방법.