KR101729554B1 - 매우 작고 균일한 크기의 산화철계 상자성 나노입자의 제조방법 및 이를 이용하는 ｍｒｉ ｔ１ 조영제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 상자성 혹은 유사상자성을 가지는 산화철계 나노입자의 제조방법 및 이에 의해 제조되는 산화철계 나노입자, 및 상자성 혹은 유사상자성 산화철 나노입자를 포함하는 T1 조영제에 관한 것으로, 좀더 상세하게는 올레산철 착물(iron oleate)의 열분해를 기반으로 4 nm 이하의 매우 작고 균일한 크기의 산화철 나노입자를 제조하는 방법 및 이를 통해 제조되는 상자성 혹은 유사상자성 산화철계 나노입자 및 상자성 혹은 유사상자성 산화철계 나노입자를 포함하는 T1 조영제에 관한 것이다.

Description

매우 작고 균일한 크기의 산화철계 상자성 나노입자의 제조방법 및 이를 이용하는 ＭＲＩ Ｔ１ 조영제{Preparation of Very Small and Uniform Sized Iron Oxide Nanoparticles and the MRI T1 Contrast Agents Using Thereof}
본 발명은 T1 조영제로 사용하기 위한 균일한 크기의 상자성 혹은 유사상자성(pseudo-paramagnetic) 산화철계 나노입자의 제조방법 및 이에 의해 제조되는 산화철계 나노입자, 및 상기 나노입자를 포함하는 T1 조영제에 관한 것으로, 좀 더 상세하게는 올레산철 착물(iron oleate)의 열분해를 기반으로 4 nm 이하의 매우 작고 균일한 크기의 산화철 나노입자를 제조하는 방법 및 이를 통해 제조되는 상기 산화철계 나노입자, 및 상자성 혹은 유사상자성 나노입자를 포함하는 T1 조영제에 관한 것이다.
최근 세포 염색, 세포 분리, 생체내 의약 전달, 유전자 전달, 질병이나 이상의 진단 및 치료, 분자 영상 의학(molecular imaging) 등의 생의학 분야에서 다양한 종류의 나노입자를 이용한 연구가 활발하게 진행되고 있다.
이러한 나노입자의 의학적 적용이 실질적인 의미를 갖기 위해서는 필수적으로 생체 외(in-vitro) 및 생체 내(in-vivo)에서 모두 만족할 만한 결과를 나타낼 수 있어야 한다.
즉, 일차적으로 세포 실험을 통하여 효과가 입증된 나노입자에 대하여 이차적으로 동물 실험을 수행함으로써 최종적으로 의학적인 적용을 가능하게 할 수 있다.
자기공명영상(MRI, Magnetic Resonance Imaging)은 자기장 안에서 수소 원자의 스핀이 이완되는 현상을 이용해 신체의 해부학적, 생리학적, 생화학적 정보를 영상으로 얻는 방법으로서 현재 살아있는 사람이나 동물의 신체기관을 비침습적이며 실시간 영상화할 수 있는, 현재까지 가장 뛰어난 영상 진단 장비 중의 하나이다.
생명과학이나 의학 분야에서 MRI를 다양하고 정밀하게 활용하기 위해서 외부에서 물질을 주입하여 영상 대조도를 증가하는 방법을 사용하는데, 이러한 물질을 조영제라고 하며, 초상자성 혹은 상자성의 물질을 이용하여 MRI로 보여야 할 부분의 신호의 대비를 주어 명확하게 구별할 수 있게 하는 물질로 볼 수 있다.
MRI 이미지 상에서 조직들 사이의 대조도(contrast)는 조직 내의 물분자 핵스핀(nuclear spin)이 평형상태로 돌아가는 이완작용(relaxation)이 조직별로 다르기 때문에 생기는 현상인데, 조영제는 이러한 이완작용에 영향을 끼쳐 조직간 이완도의 차이를 벌리고 MRI시그널의 변화를 유발하여 조직간의 대조를 보다 선명하게 하는 역할을 한다. 조영제는 특징과 기능, 주입하는 대상에 따라 활용도와 정밀도의 차이가 생긴다.
조영제들을 이용한 증강된 대조는 특정 생체기관과 조직들의 영상신호를 주변에 비해 높이거나 낮추어서 보다 선명하게 영상화하게 해 준다. MRI영상을 얻기를 원하는 신체부위의 영상신호를 주위보다 상대적으로 높게 만드는 조영제를 'positive' 조영제(T1조영제)라고 하며, 이와 반대로 주위보다 상대적으로 낮게 만드는 조영제를 'negative' 조영제(T2조영제)라고 한다. 보다 상세하게는, MRI 조영제는 상자성 물질의 높은 스핀(high spin)을 이용한 T1 조영제와 강자성 혹은 초상자성 물질 주위의 자기 불균등성을 이용한 T2 조영제로 나눠어진다. 'positive' 조영제는, T1 이완, 즉 종이완에 관계하는 조영제이다. 이러한 종이완은 스핀(spin)의 Z축 방향의 자화성분(Mz)이 X 축으로부터 가해진 RF 에너지 충격흡수 이후 X-Y 평면의 Y 축에 정렬(align) 한 후 에너지를 외부로 방출하며 원래의 값으로 돌아오는 과정이며, 이 현상을 "T1 이완 (T1 relaxation)"이라고 표현한다. Mz가 처음값의 63％로 돌아올 때까지의 시간을 "T1 이완시간 (T1 relaxation time)" 이라고 하며, T1 이완이 짧을수록 MRI의 시그날은 크고, 따라서 영상 획득 시간도 짧아진다.
'negative' 조영제는 T2 이완, 횡이완에 관계하는 조영제이다. 스핀의 Z축 방향의 자화성분 Mz가 X 축으로부터 가해진 RF 에너지 충격흡수 이후 X-Y 평면의 Y 축에 정렬(align)한 후 스스로 에너지가 감쇠하거나 주변 스핀들에게 에너지를 방출하며 원래의 값으로 돌아오려고 하는데, 이 때 X-Y 평면상 에서 균등하게 넓어진 스핀(spin)의 성분 My가 지수 함수적으로 감쇠하는 현상을 "T2 이완 (T2 relaxation)"이라고 표현한다. My가 처음값으로 37％로 감쇠 할 때까지의 시간을 "T2 이완시간(T2 relaxation time)" 이라고 하며, My가 시간에 따라 감소하는 시간의 함수로 Y축에 설치된 수신코일을 통하여 측정 한 것을 자유 유도 감쇠 신호(free induction decay, FID)라고 한다. T2 이완시간이 짧은 조직은 MRI 상에 어둡게 나타난다.
현재까지 상업화된 MRI 조영제는 상자성(paramagnetic) 화합물이'positive' 조영제로, 초상자성(superparamagnetic) 나노입자가 'negative' 조영제로 사용되고 있다
현재 T2 조영제로 SPIO등 산화철 나노입자가 쓰이는데, T2 조영은 음조영으로서 주위에 비해 원하는 부위가 어두워지는 조영법으로 대비효과가 크지 않고, 블루밍 효과(blooming effect)로 실제보다 더 큰 면적이 조영되는 단점이 있다.
반면 TI 조영제는 양조영(positive contrast)이 되어 원하는 부위의 영상을 밝게 볼 수 있는 이점을 가지는데, 많은 스핀을 가진 물질(high spin material)이 사용된다. 그래서 보통 4f 오비탈의 홀스핀이 7개인 가돌리늄 복합체(complex)가 사용되고 있다. 그러나 가돌리늄복합체는 작은 분자량으로 인해 혈관 및 생체내 체류시간이 너무 짧아 정확한 진단이 어려우며, 신장기능이 떨어지는 사람에게는 전신성섬유증(Neuphrogenic Systemic Fibrosis)를 유발하기 때문에 사용이 불가능한 것으로, 최근 미국 식품의약청(FDA)에 의해 경고된 바 있다. 따라서, 가돌리늄 복합체의 단점인 짧은 체류시간, 신장 환자에 대한 과도한 독성 등의 문제를 해결한 T1조영제 개발이 절실히 요구된다.
T1 조영제의 새로운 연구동향으로서 3d 오비탈의 홀스핀이 5개인 산화망간 나노입자를 사용한 논문(H. B. Na et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2007, 46, 5397)이 발표되었다.
산화망간 나노입자의 장점은 망간 이온이 가진 특징인 좋은 T1 완화효과와 더불어 나노입자가 가진 특징인 표적하는 분자를 쉽게 결합할 수 있고, 세포내 주입도 쉽다는 점이다. 그런데 산화망간 나노입자가 세포 내에 엔도좀(endosome)으로 들어가면 내부의 산성 환경에 의해 망간 이온이 빠져 나오게 되는데 이로 인해 망간 이온이 체내에 잔류하게 된다면, 칼슘 채널을 교란시키는 문제가 발생할 수도 있다(L. K. Limbach, et al. Environ. Sci. Technol. 2007, 41, 4158).
따라서 이러한 단점을 극복하기 위해 망간보다 생체적합성을 가지면서 5개의 홀스핀을 가지는 산화철을 T1 조영제로 이용하는 방법을 제기할 수 있다.
그런데 일반적인 산화철(magnetite) 나노입자는 초상자성(superparamagnetic)을 띤다. 이 높은 자화도로 말미암아 T2 값이 증가하고 감수율(susceptibility) 효과로 말미암아 신호를 왜곡시키는 문제가 발생하여 T1 조영제 로서는 적합하지 않다고 보고되고 있다(Y.-w. Jun, et al. J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 5732).
그러나 이러한 문제점은 산화철 나노입자의 크기를 조절함으로써 해결할 수 있다. 산화철의 크기가 작아질수록 입자가 가지는 자성이 작아지고 자성불균일성(magnetic inhomogeniouty)이 작아져 T1 조영제로 사용이 기대된다. 초상자성체(superparamagnetic) 산화철의 입자 크기를 감소시켜 T1이완률(r1)을 향상시킨 예로 미국특허 제 6,638,494(발명자: Herbert Pilgrimm)가 있다. 공침법으로 합성되며, 입자 크기가 1-10nm이고, 평균크기(d50:중앙값) 2-4nm인 산화철 나노입자를 표면 친수화시킨 경우, T1 이완율(r1)이 2-50L/mmolosec, r2/r1은 5이하를 나타냈음을 보여 준다. 그러나, 입자 평균값(중앙값)은 작으나 구성입자 크기가 1-10nm로 매우 불균일하다. 산화철 입자가 4nm이상으로 커지는 경우 T2효과 급격히 상승한다. 따라서, 평균크기가 작더라도 입자크기가 균일하지 못하면 T1이완률 향상은 높지 않아, T1조영제로서 사용하기에는 부적합하다.
최근 연구로는 4-6 nm의 산화철 나노입자를 이용하여 T1 조영제로서 응용한 연구가 있다.(E. Taboada et al. Langmuir, 2007, 23, 4583;U. I. Tromsdorf et al. Nano Lett. 2009, 9, 4434). 그러나, 입자크기가 크기 때문에 여전히 T2 효과가 크게 나와 T1 조영제로서의 응용에 한계가 있다.
현재 림프절 조영제로서 임상시험에 있다고 알려진 Combidex?AMAG사) 역시 T1조영을 연구한 바 있다. 그러나, 산화철 나노입자의 평균크기가 4-6nm로 크고, 게다가 구성입자의 크기가 불균일하기 때문에, T1효과보다 T2효과가 우세한 것으로 알려져 있다(Claire Corot et al. Advanced Drug Delivery Reviews 58 (2006) 1471).
균일한 크기의 산화철 입자를 제조하는 방법으로 열분해법이 있지만, 4nm이하 크기의 산화철 나노입자를 제조하기엔 까다로운 조건이 필요한 것으로 보여 상업적 적용에는 부적합하다(Jongnam Park, et al., Nature Mater., 3(2004), 891).
설사 4nm 이하 크기를 제조할 수 있다 하더라도 원료가 비싸거나 독성이 커서 상업적 의의가 적다(Xiaowei Teng, J. Mater. Chem., 14(2004), 774).
따라서, 4 nm 이하의 작고 균일한 크기의 산화철 나노입자를 재현성 높게 대량으로 값싸게 합성하고, 이를 이용한 T1조영 연구가 필요하나 아직 보고된 바 없다.
기존의 자기공명 T1조영제인 가돌리늄복합체는 분자량이 작아 혈관 및 생체내 체류시간이 짧고, 신장환자에 대한 과도한 독성 문제가 있다. 산화철 나노입자는 결정이기 때문에 입자 크기가 커 혈관 및 생체내 체류시간을 길게 할 수 있고, 독성이 거의 없는 장점이 있어, 이를 이용한 새로운 T1조영제를 개발하고자 하는 시도가 있어 왔다. 그러나, 통상의 산화철은 입자 크기가 너무 커서 T1효과보다 T2효과가 지배적인 문제가 있었기 때문에 이를 해결하지 않고는 T1조영에 부적합하다.
본 발명의 목적은 T1 조영제로 사용될 수 있는 크기가 작고 균일하며 제조방법이 용이하고 대량생산이 가능한 산화철 나노입자의 제조방법을 제공하는 것이다.
상세하게, 본 발명의 목적은 기존의 산화철이 가지는 초상자성(superparamagnetic)이 아니라, 상자성(paramagnetic) 혹은 유사상자성(pseudo paramagnetic)을 가지고, 크기가 균일하며, 불순물을 포함하지 않는 4 nm 이하의 작은 크기의 산화철 나노입자의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 기존까지 제공할 수 없었던, 상자성(paramagnetic) 혹은 유사상자성(pseudo paramagnetic)을 가지고, 크기가 균일하며, 불순물을 포함하지 않는 4 nm 이하의 작은 크기의 산화철 나노입자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 상자성 혹은 유사상자성 산화철 나노입자를 포함하는 자기공명영상(MRI) T1 조영제를 제공하는 것으로, 상세하게, 영상을 밝게 해주면서도 영상의 왜곡이 없는 T1 조영효과를 나타내며, 나노입자의 형태로서 높은 세포 내부 침투율 및 세포내 축적 능력, 목표지향성 조영효과, 용이한 전달성, 안전한 소거, 부작용이 최소화될 수 있는 산화철 나노입자를 포함하는 자기공명 T1조영제를 제공하는 것이다. 나아가, 기존의 Gd계 T1조영제가 제공할 수 없었던, 혈관 혹은 생체내에서 체류시간이 너무 짧지 않은 T1조영제를 제공한다.
본 발명자들은 상기에 언급된 문제점을 극복하기 위하여 연구를 거듭한 결과, 본 출원인은 올레산철 착물(iron oleate)의 열분해를 기반으로 4 nm 이하의 매우 작고 균일한 크기의 산화철 나노입자를 매우 쉬운 방법으로 합성할 수 있었고 이를 T1 조영제 로서 사용함으로써 본 발명을 완성할 수 있었다.
즉, 본 발명은 a) 철을 중심원자로 하고 C4 내지 C25을 포함하는 유기산기(carboxylate)가 리간드로 결합되어 있는 철 착물 C4 내지 C25을 포함하는 지방산 및 C4 내지 C25을 포함하는 지방족 알코올 또는 C4 내지 C25을 포함하는 지방족 아민을 150℃ 내지 350℃ 하에서 반응하여 철 산화물 나노입자를 제조하는 단계를 포함하는 제조방법을 제공하며, 바람직하게 a) 단계 이후, b) 상기 나노입자를 냉각하고 수세한 후 침전물을 유기용매에 분산시키는 단계를 포함하는 철 산화물 나노입자의 제조방법을 제공한다.
상기 제조된 철 산화물 나노입자의 크기는 4nm 이하이며, 상자성 혹은 유사상자성을 가지는 것을 특징으로 하여 자기공명영상(MRI) T1 조영제로 사용이 가능할 수 있다.
상기 철 산화물 나노입자를 제조하는 단계에서 사용될 수 있는 철 전구체는 바람직하게는 C10 내지 C22를 포함하는 지방산기가 철원자에 리간드로 결합된 것이며, 보다 바람직하게는, 상기 철 전구체는 올레산철 착물(iron oleate) 이 사용될 수 있다.
또한 철 산화물 나노입자를 제조하는 단계에서 사용될 수 있는 지방산 및 지방족 알코올(또는 지방족 아민)은 바람직하게는, C10 내지 C22를 포함하는 지방산 및 지방족 알코올(또는 지방족 아민)이 사용가능하며, 보다 바람직하게는, 상기 지방산 및 지방족 알코올은 올레산(oleic acid)과, 올레일 알코올(oleyl alcohol)이 사용가능하며 지방족 아민의 경우에는 보다 바람직하게는 올레일 아민(oleyl amine) 이 사용될 수 있다.
한편, 상기 철 산화물 나노입자를 제조하는 단계의 구체적인 공정조건은 상기 반응원료인 철 착물, 지방산 및 지방족 알코올 혼합물(또는 지방족 아민)을 실온에서 200 내지 310 ℃까지 5℃/min 이상의 승온속도로 가온하여 200 내지 310 ℃에서 5 ~ 60분 반응에 의해 달성될 수 있다.
또한 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조되는 산화철 나노입자를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다. 상기 산화철 나노입자의 크기는 4nm 이하이며, 상자성 혹은 유사상자성을 가지는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 의해 제조되는 산화철 나노입자의 크기는 반응원료인 C4 내지 C25을 포함하는 지방산, 및 C4 내지 C25을 포함하는 지방족 알코올(또는 지방족 아민)의 투입되는 몰비를 조절함에 의해 조절될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의하여 제조된 산화철계 나노입자를 포함하는 MRI 조영제를 제공할 수 있고, 이는 산화철의 표면을 Phospolipid PEG(인지질-PEG) 로 개질함에 의해 이루어질 수 있으며, 바람직하게는 산화철의 표면을 인산기 혹은 포스핀 옥사이드기에 PEG(Poly Ethylene Glycol)가 달린 분자 PEG-Phosphate(PO-PEG)로 개질함에 의해 이루어질 수 있다.
또한, 본 발명에 의하면, 이미 알려진 방법에 의해 합성되었다 하더라도 산화철 나노입자 크기가 4nm이하인 경우 상자성 혹은 유사상자성을 띨 수 있으며, 이 경우 T1조영 효과가 향상됨을 알 수 있다.
본 발명의 다른 제조방법은 철을 중심원자로 하고 C4 내지 C25을 포함하는 유기산기(carboxylate)가 리간드로 결합되어 있는 철 착물 C4 내지 C25을 포함하는 지방산을 3 내지 3.5℃/min의 승온속도로 290 내지 310℃에서 반응하여 철 산화물 나노입자를 제조하는 단계를 포함하여 철 산화물 나노입자를 제조하는 특징이 있으며, 본 발명의 또 다른 제조방법은 철을 중심원자로 하고 C4 내지 C25을 포함하는 유기산기(carboxylate)가 리간드로 결합되어 있는 철 착물 C4 내지 C25을 포함하는 지방산을 265 내지 275℃에서 1차 반응한 후, 315 내지 325℃에서 2차 반응하여 철 산화물 나노입자를 제조하는 단계를 포함하여 철 산화물 나노입자를 제조하는 특징이 있다.
본 발명의 목적들은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 본 발명의 다른 목적 및 장점들은 하기의 설명에 의해서 이해될 수 있으며, 본 발명의 실시예에 의해 보다 분명하게 알게 될 것이다.
또한, 본 발명의 목적 및 장점들은 특허청구범위에 나타낸 수단 및 그 조합에 의해 실현될 수 있음을 쉽게 알 수 있을 것이다.
본 발명에 따르면, 4nm 이하의 균일한 크기의 상자성 혹은 유사상자성의 산화철계 나노입자를 값싼 원료들을 사용하여, 기존의 방법보다 용이한 방법에 의하여 재현성 높게 대량으로 생산가능하며, 그 크기도 용이하게 조절할 수 있는 장점이 있다.
또한 상기 제조방법에 의해 제조된 산화철 나노입자는 종래 방법에 비하여 크기분포가 균일하여 조영 효과가 일정한 장점을 포함하고 있다.
또한 본 발명은 상자성 혹은 유사상자성 산화철 나노입자를 포함하는 T1조영제를 제공함으로써 기존의 방법으로는 불가능하였던 높은 수준의 T1대조도를 나타낼 수 있다.
도 1은 실시예 1의 방법으로 합성된3 nm 산화철 나노입자의 TEM(Transmission Electron Microscopy) 사진으로서, (a)는 TEM 사진, (b)는 넓은 범위의 TEM사진, (c)는 HR-TEM(High Resolution- Transmission Electron Microscopy) 사진, (d)는 SAED (Selected Area Electron Diffraction) 패턴이고,
도 2는 실시예 1의 방법으로 합성한 3nm 나노입자의 XRD(X-ray Diffraction)스펙트럼이며,
도 3은 실시예 2의 방법으로 합성한 2.3nm산화철 나노입자의 TEM 사진이며,
도 4는 실시예 3 방법으로 합성한 1.8nm의 산화철 나노입자의 TEM 사진이며,
도 5는 실시예 4의 방법으로 합성한 3.3nm 의 산화철 나노입자의 TEM 사진이며,
도 6은 실시예 5의 방법으로 합성한 3.5nm 의 산화철 나노입자의 TEM 사진이며,
도 7은 실시예 6의 방법으로 합성한 1.6nm의 산화철 나노입자의 TEM 사진이며,
도 8은 실시예 7의 방법으로 합성한 2.4nm의 산화철 나노입자의 TEM 사진이며,
도 9는 실시예 8의 방법으로 합성한 3.5nm의 산화철 나노입자의 TEM 사진이며,
도 10은 실시예 9의 방법으로 합성한 2.3nm의 산화철 나노입자의 TEM 사진이며,
도 11의 (a)는 실시예 10의 방법으로 합성한 2.7nm의 산화철 나노입자의 TEM사진이고, (b)는 비교예 1의 방법으로 합성한 산화철 나노입자의 TEM 사진이고, (c)는 비교예 2의 방법으로 합성한 산화철 나노입자의 TEM 사진이며,
도 12의 (a)는 실시예 1의 방법으로 합성된 3nm 나노입자의 5K, 300K 에서의 M-H곡선이며, (b)는 크기에 따른 나노입자의 300K 에서의 M-H 곡선의 변화를 나타내며, (c)는 실시예 2의 방법으로 합성된 2.3nm 나노입자의 무자장냉각(Zero field cooling) 과 자장냉각(Field Cooling) M-T 곡선이고, (d)는 실시예 1의 방법으로 합성된 3nm 나노입자의 M-T 곡선이며, (e)는 비교예 3의 방법으로 합성된 12nm 나노입자의 M-T 곡선이며, (f)는 실시예 6의 방법으로 합성된 1.6nm 나노입자의 5K, 300K에서의 M-H 곡선이고, (g)는 실시예 6의 나노입자의 M-T 곡선이며, (h)는 실시예 9에서 합성된 2.3nm 나노입자의 5K, 300K 에서의 M-H 곡선이며
도 13은 실시예 13의 방법으로PEG-Phosphate(PO-PEG)를 이용하여 물에 분산시킨 3nm 나노입자의 수평균 수화지름의 분포(수평균 11.8nm)를 나타내며,
도 14는 크기별 산화철 나노입자를 PEG-Phosphate(PO-PEG) 와Phospolipid PEG(인지질-PEG)로 표면 개질한 후 물에 분산시킨 분산액을 MRI phantom T1이미지를 나타낸 것으로써, 2.3nm, 3nm, 4nm, 7nm를 PEG-Phosphate (PO-PEG)로 처리한 경우는 각각 2.3P, 3P, 4P, 7P로 표시하고, Phospolipid PEG (인지질-PEG)로 처리한 경우는 각각 2.3L, 3L, 4L, 7L로 표기하였으며,
도 15는 3 nm 나노입자와 12 nm 나노입자의 세포 phantom MRI 결과로서, (a)는 3nm 나노입자의 세포 phantom MR 영상이고, (b)는 12 nm 나노입자의 세포 phantom MR 영상이고,
도 16 은 통상적으로 T1 조영제로 쓰이는 가돌리늄 complex인 Gadovist?Bayer Schering사)와 비교해서 경동맥, 경정맥, 대동맥등이 선명하게 조영되는 것을 보여준다. (a)는 3nm 입자의 in vivo MRI 혈관 조영 영상이며, (b)는 Gadovist?의 in vivo MRI 혈관 조영 영상이며,
도 17 은 실시예17의 친수화된 산화철 나노입자의 MCF-7 세포에 대한 MTT assay 결과이며,
도 18 은 비교예 3의 방법으로 합성한 12nm의 산화철 나노입자의 TEM 사진이며,
도 19는 비교예 4의 방법으로 합성한 12nm의 산화철 나노입자의 TEM 사진이며,
도 20 은 비교예 5의 방법으로 합성한 7nm의 산화철 나노입자의 TEM 사진이며,
도 21 은 비교예 6의 방법으로 4nm 크기의 산화철 나노입자를 응집(aggregate)되게 캡슐화 하여 음성염색 (negative staining)한 TEM 사진이며,
도 22 는 실시예 19의 MALDI-TOF를 이용하여 산화철 나노입자의 분자량을 분석한 결과이며,
도 23은 비교예 7의 방법으로 합성한 6nm 의 산화철 나노입자의 TEM 사진이며,
도 24는 실시예 15의 방법으로 합성한 4nm 의 산화철 나노입자의 TEM 사진이다.
상술한 목적, 특징 및 장점은 첨부된 도면을 참조하여 상세하게 후술되어 있는 상세한 설명을 통하여 보다 명확해 질 것이며, 그에 따라 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명의 기술적 사상을 용이하게 실시할 수 있을 것이다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어서사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 본 발명과 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에 그 상세한 설명을 생략하기로 한다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다.
본 발명에 따른 산화철계 나노입자 제조방법은 a) 철을 중심원자로 하고 C4 내지 C25을 포함하는 유기산기(carboxylate)가 리간드로 결합되어 있는 철 착물 C4 내지 C25을 포함하는 지방산 및 C4 내지 C25을 포함하는 지방족 알코올 또는 C4 내지 C25을 포함하는 지방족 아민을 150℃ 내지 350℃하에서 반응하여 철 산화물 나노입자를 제조하는 단계를 포함하여 수행되는 특징이 있으며, 바람직하게, 상기 a) 단계 후, b) 상기 철 산화물 나노입자를 냉각하고 수세한 후 침전물을 유기용매에 분산시키는 단계가 더 수행된다.
상기 철 산화물 나노입자를 제조하는 단계 (a)에서 사용될 수 있는 철 전구체는 바람직하게는 C10 내지 C22를 포함하는 지방산기가 철원자에 리간드로 결합된 것이 사용될 수 있고, 그 예로서는 철에 결합될 리간드의 종류들로서는 스테아르 산, 올레산, 리놀레산, 팔미트산, 팔미톨레산, 미리스트산, 라우르산, 아라키돈산, 베헨산 등이 사용가능하고, 보다 바람직하게는, 상기 철 전구체는 올레산철 착물(iron oleate)이 사용될 수 있다.
또한 철 산화물 나노입자를 제조하는 단계에서 사용될 수 있는 지방산 및 지방족 알코올은 바람직하게는, C10 내지 C22를 포함하는 지방산 및 C10 내지 C22를 포함하는 지방족 알코올 또는 C10 내지 C20을 포함하는 지방족 아민이 사용가능하며, 지방산의 예로서는 스테아르 산, 올레산, 리놀레산, 팔미트산, 팔미톨레산, 미리스트산, 라우르산, 아라키돈산, 레시놀레산, 베헨산 등이 사용가능하고 지방족 알코올의 종류로서는 스테아릴 알코올(옥타데칸올), 올레일 알코올, 리놀레일 알코올, 헥사데칸올, 팔미톨레일 알코올, 테트라데칸올, 도데칸올, 아라키도닐 알코올, 아이코산올, 도코산올, 헥사디칸디올등이 사용가능하고, 지방족 아민의 경우에는 스테아릴아민(옥타데실아민), 올레일아민, 헥사데실아민, 팔미톨레일아민, 테트라데실아민, 도데실아민, 아라키도닐아민등이 가능하다.
보다 바람직하게는, 상기 지방산 및 지방족 알코올은 올레산(oleic acid)과, 올레일 알코올(oleyl alcohol)이 사용될 수 있고, 지방족 아민은 올레일아민(oleyl amine)이 사용될 수 있다.
한편, 상기 철 산화물 나노입자를 제조하는 단계의 구체적인 공정조건은 상기 반응원료인 철 착물, 지방산 및 지방족 알코올(또는 지방족 아민) 혼합물을 실온에서 200 내지 310 ℃까지 5℃/min 이상의 승온속도로 가온하여 200 내지 310 ℃에서 5 ~ 60분 반응에 의해 달성될 수 있다.
또한 본 발명에 의해 제조되는 산화철 나노입자의 크기는 4nm 이하인 것을 특징으로 하며, 이하 본 발명에 의한 제조방법으로 제조되는 산화철의 특성을 살펴본다.
도1의 (a)와 (b)는 3 nm 산화철 나노입자의 TEM 사진이다. 매우 작고 균일한 입자가 형성됨을 알 수 있다. 넓은 범위의 이미지인 (b)는 작은 입자들이 일부분에만 모여 있는 것이 아니라 넓은 범위에서도 큰 입자들이 섞이지 않고 작고 균일한 입자들만 있는 것을 보여준다. 산화물은 금속 나노입자에 비해 전자밀도가 옅은데다 크기까지 매우 작으므로 입자가 명시적으로 보이지는 않는다. 또한 도1의 (b)에서 확인할 수 있는 바와 같이 TEM 전자선의 에너지로 인해 HR-TEM으로 격자구조가 잘 보이지 않으나, 도1의 (d)는 ED(electron diffraction) 패턴을 보면 마그네타이트(magnetite)의(3 1 1), (4 0 0) 픽이 나타남을 보여준다.
도 2는 3nm 나노입자의 XRD 스펙트럼으로서, 3 nm 나노입자는 크기가 작기 때문에 넓은 픽을 보이나 (3 1 1) (4 0 0) (4 4 0) 픽 등이 마그네타이트(magnetite) 구조임을 나타내고 있다. Debye-Scherrer 식으로 계산하면 3 nm 가 나오는 데 이를 보아 매우 좋은 결정성을 가지고 있음을 알 수 있다.
한편, 본 발명에 의해 제조되는 산화철 나노입자의 크기는 반응원료인 C4 내지 C25을 포함하는 지방산, 및 C4 내지 C25을 포함하는 지방족 알코올(또는 지방족 아민)의 투입되는 몰비를 조절함에 의해 조절될 수 있다.
본 발명에 의하면, 산화철 나노입자의 크기를 조절하기 위해 철 전구체의 농도를 줄이면 더 작은 크기의 나노입자가 형성되는 것을 보여준다.
또한 반응물인 지방산 알코올(또는 지방족 아민)의 양을 더 많이 넣을수록 더 작은 크기가 합성될 수 있으나, 이는 구체적인 반응물의 종류와 반응조건에 따라 달라질 수 있다.
예를 들어, 철 전구체로서 올레산철 착물(Iron oleate)을 사용하는 경우,다른 공정조건을 그대로 둔 채, 반응물인 올레산철 착물(Iron oleate)의 농도를 절반으로 줄이게 되면,더 작은 크기의 나노입자가 합성됨을 도 3(초기 전구체 농도 0.2 M일 때 합성한 3nm 나노입자(a), 초기 전구체 농도 0.1 M일 때 합성한 2.3nm 나노입자(b))을 통해 확인할 수 있으며, 이 결과는 반응물인 철 전구체의 양에 따라 산화철 나노입자의 크기를 조절 가능한 것을 보여준다.
또한 지방산 알코올(또는 지방족 아민)과 지방산의 비율에 따라 크기가 조절되는 정도를 살펴보면, 상기 비율이 나노입자의 크기변화에 크게 영향을 미치지는 않는 것으로 보이나 지방산 알코올인 올레일 알코올(oleyl alcohol)을 더 넣을수록 크기가 작아지게 된다.
한편, 본 발명에서 사용되는 지방산 알코올 대신 약한 환원제인 지방산 아민을 사용하더라도 산화철 나노입자가 제조될 수 있다.예컨대 지방산 아민으로서 C4 내지 C25을 포함하는 지방산아민, 바람직하게는 올레일아민이 사용될 수 있다.
지방산 알코올 대신 알칸디올을 사용하더라도 산화철 나노입자를 얻을 수 있으나, 이 경우 크기가 4nm이하의 산화철 나노입자를 얻을 수 없다.
본 발명의 산화철 나노입자의 크기와 균일도를 위해서는 비교적 빠른 승온과정이 바람직하다, 바람직한 승온속도는 5℃/min이상이 좋으며, 더욱 바람직하게는 10℃/min 이상이 좋다.
이는 빠르게 승온하면 더 극렬한 핵생성(burst nucleation)이 잘 일어나기 때문일 것으로 추측되며, 균일하고 작은 산화철 나노입자의 합성에 유리한 조건이 된다. 상술한 바와 같이, 상기 승온속도를 조절하여 산화철 나노입자의 크기와 균일도가 조절되며, 승온속도를 높임으로써 보다 균일하고 작은 산화철 나노입자를 제조할 수 있다. 이때, 실질적으로 상기 승온속도는 200℃/min 이하이다.
예컨대, 올레산과 올레일 알코올을 사용하는 경우의 산화철 나노입자의 크기와 승온속도와의 관계를 살펴보면, 3.3℃/min, 5℃/min, 10℃/min, 20℃/min의 다른 승온속도로 반응시켜 산화철 나노입자를 제조하는 경우 낮은 승온속도는 3 nm 중반대의 나노입자에 6 nm 정도의 큰 나노입자가 섞인 불균일한 입자가 합성된다. 반면에 10℃/min의 속도로 승온하면 3 nm, 20℃/min의 속도로 승온하면 2.7 nm의 균일한 입자가 합성된다.
또한, 본 발명에 의해 제조되는 산화철 나노입자는 그 크기가 작아지면서 상자성 혹은 유사상자성을 가지게 되기 때문에 T2 완화의 증가에 의한 T1 완화의 간섭을 최소화 할 수 있어 T1 MRI 조영제로 적합하므로, 본 발명의 산화철 나노입자는 MRI 조영제 에 적용할 수 있다.
본 발명에 의해 제조되는 산화철 나노입자는 다른 금속 산화물에 비해 독성이 적어 생체 적합성을 가지게 된다. 상기 산화철 나노입자는 그 표면을 Phospolipid PEG (인지질-PEG)로 개질함에 의해 T1 MRI 조영제로 사용가능하며, 구체적으로는 이 나노입자를 PEG-Phosphate (PO-PEG)로 물에 분산시켜 r1 효과를 보고 독성이 적은 T1 혈관 조영제로 적용할 수 있다.
철 산화물 나노입자를 제조하기 위해 Nat. Mater. 2004, 4, 891에 기재된 방법과 같이, 올레산철 착물을 열분해함으로써 산화철 나노입자를 합성될 수 있다. 그러나 상기 문헌에 기재된 방법은 철 착물을 올레산만을 계면활성제로 하여 합성함으로써, 4nm이하의 산화철 나노입자를 제조하기 어려운 단점을 가지고 있다.그러나 본 출원인은 기공지된 특허의 방법에서 승온조건을 달리하여 나노입자의 생성 조건을 달리하여 4nm이하 크기의 산화철 나노입자를 합성할 수 있었다. 나노입자의 생성조건을 제어 하도록 2가지 방법을 이용하였다.
첫 번째는 실시예 6, 7과 같이 반응 중 많은 수의 핵을 만드는 방법으로 작은 크기의 나노입자를 합성하여 입자 성장 시 입자 한 개당 붙는 철 원자의 개수를 줄어들게 하는 방법이다. 이는 반응 온도조절을 통하여 핵 형성을 조절하는 방법이다. 그러나, 본 발명에 따른 바람직한 제조방법인 철을 중심원자로 하고 C4 내지 C25을 포함하는 유기산기(carboxylate)가 리간드로 결합되어 있는 철 착물 C4 내지 C25을 포함하는 지방산 및 C4 내지 C25을 포함하는 지방족 알코올 또는 C4 내지 C25을 포함하는 지방족 아민을 150℃ 내지 350℃하에서 반응하여 철 산화물 나노입자를 제조하는 방법에 비해 온도조절을 통한 핵 형성 방법은 정확한 조절이 어렵기 때문에 재현성이 우수하지 못한 단점을 확인 할 수 있었다.
두 번째는 실시예 8과 같이 나노입자의 성장속도를 제어하는 방법을 이용하여 작은 크기의 나노입자의 합성을 시도하였다. 입자의 성장속도를 늦추어 입자 성장 중간 반응 단계를 잡아내는 방법으로서 이 방법 역시 온도의 제어를 통한 방법이다. 그러나, 본 발명에 따른 바람직한 제조방법인 철을 중심원자로 하고 C4 내지 C25을 포함하는 유기산기(carboxylate)가 리간드로 결합되어 있는 철 착물 C4 내지 C25을 포함하는 지방산 및 C4 내지 C25을 포함하는 지방족 알코올 또는 C4 내지 C25을 포함하는 지방족 아민을 150℃ 내지 350℃하에서 반응하여 철 산화물 나노입자를 제조하는 방법에 비해 온도조절을 통한 성장 속도 제어 방법은 모든 반응마다 성장하는 시간이 동일하지 않으므로, 입자의 성장속도를 정확하게 제어할 수 없기 때문에 수율 및 재현성이 떨어지는 단점을 확인 할 수 있었다.
하기의 실시예에서 올레산 나트륨(Sodium oleate), 올레일 알코올(oleyl alcohol), 디페닐에테르(phenyl ether)는 TCI에서, 염화제2철육수화물(iron chloride(3) hexahydrate), 올레산(oleic acid 90%), 1옥타데센(1-octadecene 90%), 1,2-헥사데칸디올(1,2-hexadecanediol) 은 Aldrich에서, 올레일아민(oleyl amine)은 Acros에서 구입하였다. 에탄올, 헥산은 삼전화학에서 구입하였다.
TEM은JEOL-2010, XRD는 Rigaku Ka, VSM은 VSM-PPMS로 측정하였고, VSM의 M-T는 5 K/min으로 승온하면서 측정하였다.
올레산철 착물(iron-oleate complex, Iron oleate)은 J. Park et al. Nat. Mater. 2004, 4, 891에 기재된 방법으로 올레산 나트륨(sodium oleate)과 염화제이철(FeCl3)을 반응하여 제조한 것을 사용하였다. 상세하게, 염화제2철 육수화물 10.8 g과 올레산 나트륨 36.5g을 물 60 mL, 에탄올 80 mL, 헥산 140 mL에 섞고 강하게 교반하면서 60℃ 정도로 4시간 반응시킨다. 두 층으로 분리된 생성물중에 투명한 아래층을 분별깔대기를 이용하여 제거하고 남은 갈색 빛의 유기층에 물을 섞고 다시 물층을 제거하여 남은 수용성 염을 제거한다. 이러한 수세과정을 세 번 반복한다. 정제된 착물 용액의 헥산 용매를 증발시켜 올레산철 착물을 얻는다.
하기의 실시예 및 비교예에서 제조된 물의 분석에 있어, 도 1은 실시예 1의 방법으로 합성된3 nm 산화철 나노입자의 TEM(Transmission Electron Microscopy) 사진으로서, (a)는 TEM 사진, (b)는 넓은 범위의 TEM사진, (c)는 HR-TEM(High Resolution- Transmission Electron Microscopy) 사진, (d)는SAED (Selected Area Electron Diffraction) 패턴이다. 도 2는 실시예 1의 방법으로 합성한 3nm 나노입자의 XRD(X-ray Diffraction)스펙트럼이며, 도 3은 실시예 2의 방법으로 합성한 2.3nm산화철 나노입자의 TEM 사진이며, 도 4는 실시예 3 방법으로 합성한 1.8nm의 산화철 나노입자의 TEM 사진이며, 도 5는 실시예 4의 방법으로 합성한 3.3nm 의 산화철 나노입자의 TEM 사진이며, 도 6은 실시예 5의 방법으로 합성한 3.5nm 의 산화철 나노입자의 TEM 사진이며, 도 7은 실시예 6의 방법으로 합성한 1.6nm의 산화철 나노입자의 TEM 사진이며, 도 8은 실시예 7의 방법으로 합성한 2.4nm의 산화철 나노입자의 TEM 사진이며, 도 9는 실시예 8의 방법으로 합성한 3.5nm의 산화철 나노입자의 TEM 사진이며, 도 10은 실시예 9의 방법으로 합성한 2.3nm의 산화철 나노입자의 TEM 사진이며, 도 11의 (a)는 실시예 10의 방법으로 합성한 2.7nm의 산화철 나노입자의 TEM사진이고, (b)는 비교예 1의 방법으로 합성한 산화철 나노입자의 TEM 사진이고, (c)는 비교예 2의 방법으로 합성한 산화철 나노입자의 TEM 사진이다. 도 12의 (a)는 실시예 1의 방법으로 합성된 3nm 나노입자의 5K, 300K 에서의 M-H곡선이며, (b)는 크기에 따른 나노입자의 300K 에서의 M-H 곡선의 변화를 나타내며, (c)는 실시예 2의 방법으로 합성된 2.3nm 나노입자의 무자장냉각(Zero field cooling) 과 자장냉각(Field Cooling) M-T 곡선이고, (d)는 실시예 1의 방법으로 합성된 3nm 나노입자의 M-T 곡선이며, (e)는 비교예 3의 방법으로 합성된 12nm 나노입자의 M-T 곡선이며, (f)는 실시예 6의 방법으로 합성된 1.6nm 나노입자의 5K, 300K에서의 M-H 곡선이고, (g)는 실시예 6의 나노입자의 M-T 곡선이며, (h)는 실시예 9에서 합성된 2.3nm 나노입자의 5K, 300K 에서의 M-H 곡선이다. 도 13은 실시예 13의 방법으로PEG-Phosphate(PO-PEG)를 이용하여 물에 분산시킨 3nm 나노입자의 수평균 수화지름의 분포(수평균 11.8nm)를 나타낸 것이다. 도 14는 크기별 산화철 나노입자를 PEG-Phosphate(PO-PEG) 와Phospolipid PEG(인지질-PEG)로 표면 개질한 후 물에 분산시킨 분산액을 MRI phantom T1이미지를 나타낸 것으로써, 2.3nm, 3nm, 4nm, 7nm를PEG-Phosphate (PO-PEG)로 처리한 경우는 각각 2.3P, 3P, 4P, 7P로 표시하고, Phospolipid PEG (인지질-PEG)로 처리한 경우는 각각 2.3L, 3L, 4L, 7L로 표기하였다. 도 15는 3 nm 나노입자와 12 nm 나노입자의 세포 phantom MRI 결과로서, (a)는 3nm 나노입자의 세포 phantom MR 영상이고, (b)는 12 nm 나노입자의 세포 phantom MR 영상이고, 도 16 은 통상적으로 T1 조영제로 쓰이는 가돌리늄 complex인 Gadovist?Bayer Schering사)와 비교해서 경동맥, 경정맥, 대동맥등이 선명하게 조영되는 것을 보여준다. (a)는 3nm 입자의 in vivo MRI 혈관 조영 영상이며, (b)는 Gadovist?의 in vivo MRI 혈관 조영 영상이다. 도 17 은 실시예17의 친수화된 산화철 나노입자의 MCF-7 세포에 대한 MTT assay 결과이다. 도 18 은 비교예 3의 방법으로 합성한 12nm의 산화철 나노입자의 TEM 사진이며, 도 19는 비교예 4의 방법으로 합성한 12nm의 산화철 나노입자의 TEM 사진이며, 도 20 은 비교예 5의 방법으로 합성한 7nm의 산화철 나노입자의 TEM 사진이며, 도 21 은 비교예 6의 방법으로 4nm 크기의 산화철 나노입자를 응집(aggregate)되게 캡슐화 하여 음성염색 (negative staining)한 TEM 사진이며, 도 22 는 실시예 19의 MALDI-TOF를 이용하여 산화철 나노입자의 분자량을 분석한 결과이며, 도 23은 비교예 7의 방법으로 합성한 6nm 의 산화철 나노입자의 TEM 사진이다. 도 24는 실시예 15의 방법으로 합성한 4nm의 산화철 나노입자의 TEM 사진이다.
(실시예 1)
3 nm 산화철 나노입자의 합성
올레산철 착물(Iron oleate) 1.8g(2mmol)과 올레산(oleic acid) 0.57 g(2mmol), 올레일 알코올(oleyl alcohol) 1.61 g(6mmol)을 디페닐에테르 10 g과 혼합한 뒤 둥근바닥플라스크에 넣고 1시간정도 80℃에서 진공을 잡아 기체를 빼낸다. 아르곤을 흘려주어 비활성 환경을 만든 뒤 250℃까지 10℃/min으로 올리며 반응시킨 후, 반응이 진행됨에 따라 반응물의 색이 검정색으로 변하는 것을 볼 수 있다. 250℃까지 승온한 후 30분간 반응시키면 3 nm 나노입자가 제조되며(도 1, 도 2), 30분간 반응시킨 후 빠른 속도로 냉각한 뒤 과량의 아세톤으로 수세한다. 수세한 후 얻어진 침전물을 클로로포름(chloroform) 또는 헥산(hexane)의 유기용매에 분산시킨다.
(실시예 2)
2.3 nm 산화철 나노입자의 합성
2.3 nm 나노입자는 올레산(oleic acid) 없이 상기 올레산철 착물(iron oleate) 0.9 g (1mmol)과 올레일 알코올(oleyl alcohol) 3.22 g (12mmol)을 디페닐에테르 10 g과 혼합한 뒤 실시예 1과 동일한 조건으로 열분해하여 합성한다.
(실시예 3)
1.8 nm 산화철 나노입자의 합성
1.8 nm 나노입자는 올레산(oleic acid) 없이 상기 올레산철 착물(iron oleate) 0.9 g (1mmol)과 올레일 알코올(oleyl alcohol) 3.22 g (12mmol)을디페닐에테르 10 g과 혼합한 뒤 20℃/min의 승온속도로 200℃까지 올리고 200℃에서 30분간 반응시켜 합성한다. 나머지는 실시예1과 동일하다.
(실시예 4)
1-옥타데센을 사용한 3.3 nm 나노입자 합성
올레산철 착물 1.8 g과 올레산 0.57g과 올레일 알코올 1.6 g을 1-옥타데센 10 g과 혼합한 뒤 10℃/min의 승온속도로 250℃까지 올리고 250℃에서 30분간 성장시켜 합성한다. 나머지는 실시예1과 동일하다.
(실시예 5)
올레일아민(oleyl amine)을 사용한 3.5 nm 나노입자 합성
올레산철 착물 1.8 g과 올레산 0.57g과 올레일아민 1.6 g을 디페닐에테르 10 g과 혼합한 뒤 10℃/min의 승온속도로 250℃까지 올리고 250℃에서 30분간 성장시켜 합성한다. 나머지는 실시예1과 동일하다.
(실시예 6)
1.6nm 산화철 나노입자의 제조
기지의 합성법(Nature mater, 3(2004), 891)을 참조하여 이전의 합성법에서는 찾아내지 못한 입자의 성장속도를 제한하는 방법을 이용하여 산화철 나노입자를 합성하고 이를 원심분리하여 작은 산화철 나노입자를 얻었다. 이는 올레산철 착물(Iron oleate)의 열분해에 의한 나노입자 합성의 일반적인 합성 온도는 320℃이고 이 온도에서 성장이 급격하게 진행되는데 320℃는 성장에 충분한 에너지가 공급되지 않아 성장 속도가 매우 느려지게 된다. 따라서 320℃에서 반응을 진행시킬 때 잡아 낼 수 없었던 성장 단계중의 매우 작은 크기의 나노입자들을 300℃에서 반응하면서 잡아내는 것이다.
올레산철 착물(Fe-oleate) 1.8g(2mmol)과 올레산(oleic acid) 0.57g(2mmol)을 1-옥타데센(1-octadecene) 10g과 혼합한 뒤, 둥근플라스크에 넣고 1시간동안 80℃에서 진공을 잡아 기체를 빼낸다. 아르곤 가스를 흘려주어 비활성분위기로 만든 뒤, 300℃까지 3.3℃/min으로 승온하여 300℃에서 30분간 반응시킨 후 실온까지 빠르게 냉각하여 상온근처에서 에탄올을 가해 침전시킨 후 1.6nm의 산화철을 얻는다.
(실시예 7)
2.4nm 산화철 나노입자의 제조
실시예 6에서 같은 나노입자의 성장속도를 제한하는 방법을 이용하여 2.4nm의 산화철 나노입자를 합성하였다.
즉, 올레산철 착물(Fe-oleate) 1.8g(2mmol)과 올레산(oleic acid) 0.57g(2mmol)을 1-옥타데센(1-octadecene) 10g과 혼합한 뒤, 둥근플라스크에 넣고 1시간동안 80℃에서 진공을 잡아 기체를 빼낸다. 아르곤 가스를 흘려주어 비활성분위기로 만든 뒤, 300℃까지 3.3℃/min으로 승온하여 300℃에서 35분간 반응시킨 후 실온까지 빠르게 냉각하여 상온근처에서 에탄올을 가해 침전시킨 후 2.4nm의 산화철을 얻는다.
(실시예 8)
3.5nm 산화철 나노입자의 제조
많은 수의 핵을 만드는 방법을 이용하여 기지의 합성법(Nature mater, 3(2004), 891)을 참고로 하여 온도를 변화시켜 작은 크기 나노입자 합성을 시도해 보았다. 올레산철 착물(Fe-oleate)의 열분해시 핵 생성 온도는 약 270℃이다. 이를 이용하여 핵 생성 온도인 270℃에서 오래 머물러 많은 핵 생성을 도모하였다. 이는 많은 핵을 형성시킨 후 이에 따라 입자 한 개당 붙는 철 원자의 개수가 줄어들게 되어 크기가 작아지는 것이다.
올레산철 착물(Fe-oleate) 1.8g(2mmol)과 올레산(oleic acid) 0.57g(2mmol)을 1-옥타데센(1-octadecene) 10g과 혼합한 뒤 삼구 바닥 플라스크에 넣고 불활성(inert) 분위기에서 270℃까지 가열하고 20분간 그 온도로 머물러서 합성한다. 핵이 생성된 뒤 추가 반응을 억제하기 위해 성장온인 318℃까지 빠르게 승온하고 318℃에서 10분을 추가로 머물러서 3.5nm크기의 나노입자를 합성하였다.
(실시예 9)
2.3nm 산화철 나노입자 합성
올레산 0.64g과 1,2헥사 데칸디올 0.59g이 디페닐에테르 15.81g에 혼합된 용액을 70℃ 정도에서 1시간 정도 진공을 잡아 불순물을 정제한다. 아르곤을 흘려주어 비활성분위기로 만든 후 아르곤 가스를 멈춘다. 철 펜타카보닐(Iron Pentacarbonyl) 0.3ml를 주입한다. 3.3℃/min의 속도로 250℃까지 올리고 250℃에서 30분간 반응시키면 2.3nm의 나머지가 제조된다. 나머지는 실시예1과 동일하다.
(실시예 10)
승온속도에 따른 입자크기 및 분포
올레산철 착물 1.8 g과 올레산 0.57g과 올레일 알코올 1.6 g을 디페닐에테르 10 g과 혼합한 뒤 20℃/min의 승온속도로 250℃까지 올리고 250℃에서 30분간 성장시켜 2.7 nm의 균일한 나노입자를 합성한다. 나머지는 실시예1과 동일하다.
(비교예1)
승온속도에 따른 입자크기 및 분포
올레산철 착물 1.8 g과 올레산 0.57g과 올레일 알코올 1.6 g을 디페닐에테르 10 g과 혼합한 뒤 3.3℃/min의 승온속도로 250℃까지 올리고 250℃에서 30분간 성장시켜 3 nm 중반의 입자에 6 nm 나노입자가 섞인 불균일한 나노입자를 합성한다. 나머지는 실시예1과 동일하다.
(비교예 2)
승온속도에 따른 입자크기 및 분포
올레산철 착물 1.8 g과 올레산 0.57g과 올레일 알코올 1.6 g을 디페닐에테르 10 g과 혼합한 뒤 5℃/min의 승온속도로 250℃까지 올리고 250℃에서 30분간 성장시켜 3 nm 중반의 입자에 6 nm 나노입자가 섞인 불균일한 나노입자를 합성한다. 나머지는 실시예1과 동일하다.
(비교예 3)
12 nm 나노입자의 합성
12 nm 나노입자는 (J. Park et al. Nat. Mater 2004, 4, 891)과 동일하게 합성한다. 올레산철 착물 1.8 g과 올레산 0.28 g을 1-옥타데센(octadecene) 10 g과 혼합한 뒤 3.3℃/min의 승온속도로 318℃까지 올리고 318℃에서 30분간 성장시켜 합성하였으며, 도 18은 합성된 나노입자를 관찰한 TEM 사진이다.
(비교예 4)
베헨산(Behenic acid)을 이용한 산화철 나노입자 합성
계면활성제를 벌키(bulky)한 것으로 사용하여 입체 장애(steric hindrance)로 나노입자가 크게 성장하는 것을 방해하여 작은 크기의 나노입자를 만들도록 하였다. 올레산(Oleic acid) 보다 입체 장애가 큰 베헨산(behenic acid)을 합성에 첨가하여 나노입자가 크게 성장하는 것을 방해하도록 하였다.
합성 방법은 올레산철 착물 1.8g과 베헨산 0.34g을 1-옥타데센(octadecene) 10g과 혼합한 뒤 3.3℃/min의 승온속도로 318℃까지 올리고 318℃에서 30분간 성장시켜 합성한다. 합성결과 12nm크기의 산화철 나노입자가 관찰되었고, 이는 steric hindrance가 작은 올레산으로 합성한 것과 같은 크기이다. 이 결과로 올레산철 착물의 열분해법의 경우 steric hindrance를 이용해서는 산화철 나노입자의 크기가 조절되지 않음을 알 수 있다. 도 19는 합성된 나노입자를 관찰한 TEM 사진이다.
(비교예 5)
7 nm 산화철 나노입자의 합성
7 nm 나노입자는 올레산철 착물 1.8 g과 올레산 0.57 g을 1-옥타데센10 g과 혼합한 뒤 5℃/min의 승온속도로 318℃까지 올리고 318℃에서 30분간 성장시켜 합성였으며, 도 20은 합성된 나노입자를 관찰한 TEM 사진이다.
(비교예 6)
4nm 산화철 나노입자가 응집돼 있는 친수화 캡슐 제조
4nm의 산화철 나노입자(40mg)와 PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)) 40mg을 에틸아세테이트 용액에 분산시킨 후, Pluronicㄾ F127(BASF Corporation, difunctional block copolymer) 4ml용액과 섞은 후 교반하여 캡슐화하였다. TEM 관찰결과(도 8), 나노입자가 여러 개 응집된 형태로 캡슐에 싸여 있는 것을 알 수 있었다. DLS(Dynamic Light Scattering)(Maker:Malven)로 측정한 수화직경(z- average)은 117nm였다(도 21).
(비교예 7)
1,2-헥사데칸디올(1,2-hexadecanediol)을 이용한 합성
올레산철 착물 1.8 g과 올레산 0.57g과 1,2-헥사데칸디올 1.55 g을 디페닐에테르 10 g과 혼합한 뒤 10℃/min의 승온속도로 250℃까지 올리고 250℃에서 30분간 성장시켜 합성한다. 나머지는 실시예1과 동일하다. TEM 관찰 결과, 6 nm 크기의 약간 불균일한 나노입자가 합성된다. 올레일 알코올 대신 하이드록시(hydroxyl)기가 두개인 1,2-헥사데칸디올로 합성하였을 때 낮은 온도에서 열분해가 되나 4 nm의 작은 크기는 얻을 수 없었다(도 23).
(실시예 11)
제조된 산화철 나노입자의 물리화학적 특성
나노입자들의 자성을 섭동시료자력계 (Vibrating Sample Magnetometer; VSM)을 이용하여 측정하였다. 도 12는 실시예에서 합성된 2.3, 3, 12 nm 나노입자의 자화도-자기장 (magnetization-magnetic field; M-H) 곡선을 보여준다. 도 12의 (a )는 실시예 1의 방법으로 합성된 3nm 나노입자의 5K, 300K에서의 M-H 곡선이며, (b)는 크기에 따른 나노입자의 300K에서의 M-H 곡선의 변화를 나타내며, (c)는 실시예 2의 방법으로 합성된 2.3nm 나노입자의 무자장냉각 (Zero field cooling) 과 자장냉각(Field Cooling) M-T 곡선이고, (d)는 실시예 1의 방법으로 합성된 3nm 나노입자의 M-T 곡선이며, (e)는 비교 예 3의 방법으로 합성된 12nm 나노입자 의 M-T 곡선이며, (f)는 실시예 6의 방법으로 합성된 1.6nm 나노입자의 5K, 300K에서의 M-H 곡선이고, (g)는 실시예 6의 방법으로 합성된 1.6nm 나노입자의 M-T 곡선이며, (h)는 실시예9에서 합성된 2.3nm 나노입자의 5K, 300K에서의 M-H 곡선이다.
도 12를 참조하면, 5 K에서 12 nm 산화철 나노입자는 보자력(coercivity)과 잔여자력(remanent magnetization)이 나타나는 페리자성의 성질을 띤다. 3 nm 산화철 나노입자도 또한 약간의 보자력과 잔여자력이 있는 페리자성의 성질을 띠나, 2.3 nm 나노입자에서는 보자력과 잔여자력이 보이지 않는다. 즉 5 K까지 상자성의 형태로 남아있는 것이다. 이는 초상자성을 띠는 자성체 나노입자에서 매우 이례적인 경우이다. 이는 자화도-온도(magnetization-temperature; M-T) 곡선을 보면 명확히 드러나는데, 12 nm에서는 장벽온도(blocking temperature)가 200 K에서 나타나고 3 nm 입자는 10 K에서 나타나지만 2.5 nm 입자는 장벽온도가 5 K까지 나타나지 않는다. 장벽온도란 초상자성과 강자 혹은 페리자성의 물성이 바뀌는 전이온도로서 입자의 부피에 비례하기 때문에 크기가 작아질수록 장벽온도는 작아지게 된다. 크기가 3 nm 이하로 작아지면 장벽온도는 5 K까지 나타나지 않아 3 nm 입자는 극저온에서도 상자성 혹은 상자성과 비슷한 물성을 띠는 것을 볼 수 있다. Ferrite 구조를 가지는 산화철 나노입자에서 이러한 성질은 처음 발견되었는데 초상자성과 구분해서 상자성과 유사하다고 하여 유사상자성(pseudo-paramagnetic)이라고 이름붙이기로 한다. 3 nm 이하의 작은 크기의 산화철 나노입자는 초상자성 나노입자이나 표면의 배열되지 않은(disordered) 스핀이 입자의 대부분을 차지하므로 입자는 상자성을 띠는 것처럼 보인다. 이는 엄밀히 말하면 상자성은 아니나 상자성과 비슷한 거동을 보인다고 하여 유사상자성이라고 이름 붙일 수 있다.
상온에서의 자화도-자기장 곡선을 중첩해서 나타내보았다(도12(b)). 입자의 크기가 작아짐에 따라 자화도도 작아지는 것을 볼 수 있다. 이는 입자크기가 작을수록 이방성 에너지가 작아져서 닐 완화가 잘 일어나며 입자 전체의 자화도 값이 작아서 제만(Zeeman) 에너지가 작기 때문에 열적 요동이 크기 때문으로 생각되어진다. 그런데 특이한 것은 3 nm와 2.3 nm의 작은 크기의 변화에도 불구하고 자성의 차이는 매우 큰 것이다. 이에 대한 해석은 스핀 기울어짐 효과(spin canting effect)로 설명할 수 있다. (J. M. D. Coey, Phys. Rev. Lett. 1971, 27, 1140) 자성체 나노입자는 벌크일 때보다 작은 자화도를 가지는데, 이는 표면의 자성체 원자들은 벌크의 원자와 다른 환경에 있으므로 스핀의 방향이 전체 스핀의 방향과 다른 각도를 가지게 되고 이로 인해 스핀의 전체 배열이 되지 않기 때문에 자화도가 작아지게 된다는 효과이다. Linderoth는 스핀이 기울어지는 표면의 두께를 약 0.9 nm로 계산하였다(S. Lindroth et al. J. Appl. Phys. 1994, 75, 6583). 이에 따르면 2.3 nm의 나노입자는 스핀 기울어짐 효과에 의해 영향받지 않는 코어부분의 비율이 입자 전체 부피의 1.0%이고, 3 nm 나노입자의 경우는 입자의 6.4% 이므로 자화도의 차이가 크게 나타나는 것이다.
Lindroth의 계산에 따르면 입자의 모든 부분이 스핀이 기울어지는 표면에 의해 영향을 받게 되는1.6nm 나노입자의 경우 상온에서의 M-T 그래프가 선형관계를 보이는 전형적인 상자성을 나타내고 있다(도12f). 또한 5 K에서도 큰 자기장까지 포화되지 않음을 보인다.
본 발명에 따른 나노입자는 페라이트(ferrite) 구조를 가진 산화철 나노입자이면서도(도 2) 초상자성(superparamagnetic)보다 상자성(paramagnetic) 혹은 유사상자성(pseudoparamagnetic)의 산화철 나노입자라는 독특한 물성을 가지고 있다. 때문에 T1 MRI 조영제로의 응용에 매우 유리한 것으로 보인다.
(실시예12)
Phospolipid PEG (인지질-PEG)를 이용한 산화철 나노입자의 친수화
실시예1에서 제조된 3nm 크기의 산화철 나노입자 10mg을 10ml의 클로르포름에 분산시킨 후 Phospholipid-PEG {1,2-distearyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N[methoxy (polyethylene glycol-2000)]} 10mg을 추가하여 교반한 후 클로르포름을 서서히 증발시킨 후 물을 첨가하여 분산시켰다. DLS분석결과, 수화지름 15nm의 입자를 얻었다.
(실시예 13)
PEG-Phosphate (PO-PEG)를 이용한 산화철 나노입자의 친수화
POCl3 0.15g과 polyethylene glycol methyl ether(Mn: 2000) 6g을 7ml의 Tetrahydrofuran(THF)용액에 넣은 후 4시간 교반하였다. THF를 제거하여 PEG-Phosphate (PO-PEG)를 얻었다. 실시예1에서 제조된 3nm 크기의 산화철 나노입자 10mg과 100mg의 PEG-Phosphate (PO-PEG)를 에탄올에 혼합하고 밀봉하여 70℃에서 4시간 동안 교반 하여 리간드를 치환한다. N-Hexnae으로 세 번 수세하고 에탄올을 증발시킨 다음 물을 첨가하여 물에 분산 시켜 수화지름 11.7nm의 입자를 얻었다.
(실시예 14)
친수화시킨 산화철 나노입자의 MR in vitro 이완 특성
실시예 12, 13, 비교 예 6의 방법으로 친수화 시킨 산화철 나노입자의 MR 조영 능력을 측정하기 위하여 1.6nm(실시예 6), 2.4nm(실시예 7), 3nm(실시예 1), 4nm(실시예 15), 7nm(비교예 5)의 산화철 나노입자를 0.5, 0.25, 0.13, 0.063, 0.031, 0.016, 0.0078, 0.0039mg/ml의 농도로 팬텀을 준비하였다. 1.5T MR 영상의 경우 MR 스캐너(GE health care, signa excite)에 head coil을 이용하여 얻어졌다. T1 값은 IR-FSE sequence를 이용해 얻어졌으며 사용된 파라미터는 다음과 같다(TR/TE/TI = 4000 ms/8.4 ms/ 50~4000ms). T2값은 CPMG sequence를 이용해 얻어졌으며 사용된 파라미터는 다음과 같다.(TR/TE=5000ms / 16~200ms)
4.7T MR 영상의 경우 (Biospec 47/40, Bruker Biospin MRI GmbH)에서 BGA12 gradient coil을 이용하여 이완성능을 평가하였다. 산화철-PLGA 나노캡슐 분말의 철 농도를 ICP-AES를 통해 분석한 뒤, 이를 0.01M PBS(Phosphate Buffered Saline, pH 7.4)2, 1, 0.5, 0.25, 0.125mg/ml의 농도로 측정 하였고, T2 이완시간 측정은MSME(Multi Slice-Multi Echo sequence)펄스대열을 이용하였으며, 구체적인 파라미터는 다음과 같다.
TR(repetition time)=10,000ms, TE(echo time)=8~2048ms(8ms 간격으로 256회), FOV=60x40mm, Resolution=0.234x0.156mm/pixel, slice thickness=1 mm, number of acquisition=1, Matrix size=128x128
하기 표 1은 여러 크기의 나노입자의 1.5T에서 r1, r2 값 및 그 비율을 나타낸 것으로, 표1을 참조하면 Phospolipid PEG (인지질-PEG)로 표면을 개질한 산화철 나노입자의 크기에 따른 1.5 Tesla phantom MRI 완화값을 보여준다. r1 값은 7 nm 근방에서 가장 크게 나오나 값의 차이가 크지 않는 반면, 크기가 작아질수록 r2값이 크게 작아져 r2/r1 값은 크게 감소하게 된다. 1.6 nm의 경우 1.5 T 자기장에서 1.47의 매우 작은 r2/r1 값을 가진다. 작은 r2/r1 값은 T1 MRI 조영제로 사용하기에 적합함을 보여준다. 또한, 표1의 비교 예5를 참조하면, 산화철 나노입자의 직경이 4nm일지라도 이들 입자끼리 뭉쳐 있는 상태(도21)이면, r2/r1값이 너무 증가하여 T1으로서 적합하지 않다는 것을 알 수 있다.
(표1)
Figure 112010050536341-pat00001

(실시 예 15)
4 nm 산화철 나노입자의 합성
실시예 6의 방법을 참고로 하여 입자의 성장 속도를 제어하여 4nm 크기의 산화철 나노입자를 합성하였다. 4 nm 나노입자는 올레산철 착물 1.8 g과 올레산 0.57 g을 1-옥타데센10 g과 혼합한 뒤 10℃/min의 승온속도로 318℃까지 올리고 318℃에서 30분간 반응시킨 후 실온까지 빠르게 냉각하여 상온근처에서 에탄올을 가해 침전시킨 후 4nm의 산화철을 얻는다.
이상과 같이 본 발명에서는 특정된 사항들과 한정된 실시예 및 도면에 의해 설명되었으나 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐, 본 발명은 상기의 실시예에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이러한 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다.
따라서, 본 발명의 사상은 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 아니되며, 후술하는 특허청구범위뿐 아니라 이 특허청구범위와 균등하거나 등가적 변형이 있는 모든 것들은 본 발명 사상의 범주에 속한다고 할 것이다.

Claims (23)

  1. 올레산철 착물(iron oleate), 올레산 및 올레일 알코올(oleyl alcohol)이나 올레일 아민(oleyl amine)을 10℃/min 내지 200℃/min의 승온속도로 가온하여 150℃ 내지 350℃하에서 반응시켜 철 산화물 나노입자를 제조하는 단계를 포함하는 철 산화물 나노입자의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제조된 나노입자를 냉각하고 수세하는 단계를 더 포함하는 철 산화물 나노입자의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 철 산화물 나노입자의 크기는 1nm 내지 3nm인 것을 특징으로 하는 철 산화물 나노입자의 제조방법.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서, 상기 철 산화물 나노입자를 제조하는 단계는 실온에서 200 내지 310 ℃까지 10℃/min 내지 200℃/min의 승온속도로 가온하여 200 내지 310 ℃에서 5 ~ 60분 반응하는 것을 특징으로 하는 철 산화물 나노입자의 제조방법.
  9. 삭제
  10. 제3항에 있어서, 상기 올레산 및 올레일 알코올이나 올레일 아민의 몰비를 조절함에 의해 철 산화물의 크기를 조절하는 것을 특징으로 하는 철 산화물 나노입자의 제조방법.
  11. 제1항 내지 제3항, 제8항 및 제10항에서 선택된 어느 한 항의 방법에 의해 제조되며, 1nm 내지 3nm 크기의 산화철 나노입자.
  12. 제11항에 있어서, 상기 산화철 나노입자는 마그네타이트 구조(magnetite structure)인 것을 특징으로 하는 산화철 나노입자.
  13. 제11항의 산화철 나노입자를 유효성분으로 하는 자기공명영상(MRI) 양조영(positive) 조영제.
  14. 제13항에 있어서, 상기 조영제는 산화철의 표면을 인지질 폴리에틸렌글리콜 (Phospolipid polyethylene glycol)로 개질한 것을 특징으로 하는 조영제.
  15. 제13항에 있어서, 상기 조영제는 산화철의 표면을 폴리에틸렌글리콜-포스페이트(PO-PEG; Polyethylene Glycol-Phosphate)로 개질한 것을 특징으로 하는 조영제.
  16. 상자성 혹은 유사상자성을 가지는 1nm 내지 3nm 크기의 산화철 나노입자.
  17. 제16항에 있어서, 산화철 나노입자는 마그네타이트 구조(magnetite structure)인 산화철 나노입자.
  18. a) 20K 온도에서 상자성 혹은 유사상자성을 가지며,
    b) 입자 크기는 1nm에서 3nm 이며,
    c) 표면은 인지질 폴리에틸렌글리콜(Phospolipid polyethylene glycol) 또는 폴리에틸렌글리콜-포스페이트(PO-PEG; Polyethylene Glycol-Phosphate)로 둘러싸여 있으며,
    d) 입자 간의 응집이 없는 것을 특징으로 하는,
    산화철 나노입자.
  19. 삭제
  20. 제18항의 산화철 나노입자가 물에 분산되어 있는 산화철 나노입자 콜로이드.
  21. 제16항 또는 제18항의 산화철 나노입자를 유효성분으로 하는 자기공명영상(MRI) 양조영(positive) 조영제.

  22. 삭제
  23. 삭제
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