KR20090119324A - 금-증착된 산화철/글리콜 키토산 나노복합체, 이의제조방법 및 이를 포함하는 ｍｒｉ 조영제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 금-증착된 산화철/글리콜 키토산 나노복합체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 ＭＲＩ 조영제에 관한 것이다. 본 발명에 따른 금-증착된 산화철/글리콜 키토산 나노복합체는 금이 증착된 산화철 나노 입자에 글리콜 키토산을 흡착시켜 나노복합체를 형성한 후 헤파린으로 표면 개질하고 이를 트리블록 공중합체 수용액에 함침시킨 후 동결건조한 것을 특징으로 한다.

Description

금-증착된 산화철/글리콜 키토산 나노복합체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 ＭＲＩ 조영제{Gold-deposited iron oxide/glycol chitosan nanocomposite, preparation method thereof and MRI contrast agent comprising the same}

본 발명은 금-증착된 산화철/글리콜 키토산 나노복합체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 ＭＲＩ 조영제에 관한 것이다.

사람 몸의 질병을 내부 관찰로 진단할 수 있는 방법 중에서 MRI는 다른 영상화 기술에 비해 가장 안전한 최근에 개발된 기술이다. MRI의 장점은 조직에 대해서 민감성이 좋으면서 다른 영상진단기술과는 달리 방사능에 노출되지 않는다는 것이다. 최근 MRI의 응용성과 이용도가 날로 급속해지고 있어서 MRI 조영제에 대한 연구가 많이 진행되고 있다.

MRI 조영제는 자장에 미치는 영향에 따라서 상자성(paramagnetic), 초상자성 (super-paramagnetic) 제제로 구분된다. 상자성 MRI 조영제는 T1 감쇄효과가 우세하여 T1 강조영상에서 밝은 신호로 보이며, 초상자성 MRI 조영제는 T2 감쇄효과가 우세하여 T2 강조영상에서 신호를 어둡게 만든다.

상자성 MRI 조영제로는 현재 임상적으로 널리 사용되고 있는 가돌리늄(Gd) 및 망간(Mn) 제제를 들 수 있다. 가돌리늄(Gd) 및 망간(Mn) 자체는 독성이 매우 높기 때문에 현재 사용중인 제제들은 리간드와 결합시킨 킬레이트 형태로 하여 독성이 방출되지 않게 만들어 안정성을 개선하였다. 가돌리늄과 망간으로 만든 MRI 조영제를 인체에 주사하기 위해서는 생리식염수 혹은 5% 포도당 용액으로 희석하여 정맥에 주사하여야 한다. 그러나 희석하는 과정에서 킬레이트의 유기물이 떨어지면서 유독한 금속이 노출될 수 있다. 뿐만 아니라, 가돌리늄이나 망간 금속으로 만든 MRI 조영제는 반감기가 약 14분 정도로 극히 짧아서 투여 후 소변으로 급속히 배출되므로(Hiroki Yoshikwa et al, Gazpshindan, 6, 959-969, 1986), 일회 주사로 체내의 혈관 분포, 혈류 분포, 분포량, 투과 등을 진단하기 어렵다. 따라서 정상부위와 손상부위 사이의 MRI의 명확한 영상 대비를 얻기 위해서는 체내 머무르는 시간이 길어야 MRI 조영제로 바람직하다.

초상자성 MRI 조영제로는 산화철 입자가 대표적이며, 산화철로 만든 MRI 조영제는 이미 안정성 실험 결과를 통과한 독성이 없는 조영제이면서 체내에 8시간 정도 머무를 수 있어서 MRI의 정확한 진단에 매우 적합하다. 특히, 자성 나노 입자 중에서도 산화철은 나노 몰농도에서도 높은 자기공명 효율을 나타내므로 MRI 조영제로 많이 연구되고 있다. 이러한 초상자성 산화철 입자는 가돌리늄(Gd) 및 망간 (Mn)보다 더 긴 혈액 반감기를 가지며, 자기공명 효율이 상자성 복합체보다 10~100배 정도 더 높게 나타남으로써 더 작은 양을 사용할 수 있다는 장점이 있다.

상기한 초상자성 산화철 MRI 조영제 중에서 가장 널리 사용되는 조영제는 덱스트란-코팅된 초상자성 산화철 조영제이다. 덱스트란-코팅된 초상자성 산화철 조 영제는 간세포 중 쿠퍼세포(Kupffer cell)를 표적으로 하며, 1988년에 페루미시드 (ferumixde), 일명 '페리덱스(feridex)'라는 상품명으로 제품화되었다. 하지만 상기한 덱스트란-코팅된 초상자성 산화철 조영제는 입자의 평균 직경이 100㎚ 이상이므로 혈액 반감기가 짧은 단점이 있다. 이러한 덱스트란-코팅된 초상자성 산화철 조영제의 단점을 보완한 카복실덱스트란이 코팅된 '레조비스트(resovist)'라는 초상자성 산화철 조영제는 입자의 평균 직경이 60㎚로서, '페리덱스'와 구조적으로 비슷하고 원리와 영상은 동일하나 급속 주입시에도 저혈압 등의 부작용이 없고 역동영상을 얻을 수 있다.

최근에는 FeCup₃, Fe(acac)₃, Fe(CO)₅와 같은 다양한 산화철 전구체들의 열분해법을 이용한 방법들이 개발되고 있다. 이러한 방법들에 관하여, 대한민국등록특허 제 10-482278호에는 값이 싼 저급의 계면활성제와 용매 내에서 쉽고 간편한 방법으로 저급의 Fe(CO)₅을 열분해하고 잔류 산소에 의한 산화반응을 진행시켜 2가와 3가의 혼합 산화철 나노 분말을 제조하거나, 이 분말 용액에 공기를 주입시켜 산화 반응이 더욱 진행된 γ-Fe₂O₃ 나노 분말을 제조하는 방법에 대하여 기재되어 있다. 그러나, 상기 방법은 산화철이 286℃ 이상에서 합성되고 1~7일 동안 산화하는 등 제조온도가 너무 높고 제조시간이 너무 긴 문제점이 있다. 또한 산화철 제조원료로 사용되는 Fe(CO)₅는 매우 고가이며 보관이 어려운 문제점이 있다.

대한민국등록특허 제 10-550194호에는 철염을 유기용매 중에서 알콜, 카복실산 및 아민과 혼합하고 혼합물을 200 내지 360℃로 가열하는 자철광 나노입자의 합 성 및 Fe-기재 나노 재료의 제조방법에 대하여 기재되어 있다.

그러나 상기 방법들은 제조온도가 높고, 제조시간이 길며, 공정이 복잡하고, 사용원료가 고가이며, 유기용매의 사용에 의한 체내독성을 유발할 수 있다. 또한, 상기 방법들에 의해 제조된 산화철은 유기용매에 잘 녹기 때문에 의약 분야로의 응용에 제약이 따르게 된다.

초상자성 산화철 나노 입자는 화학적 결합, 조영제의 응집에 의한 점도와 면역, 및 리소자임과 같은 효소작용의 금지 등 생체 내 독성을 유발할 수 있으므로, 그 자체로는 사용할 수 없다. 따라서, 초상자성 산화철 나노 입자들을 MRI 조영제로 사용하기 위해서는 높은 영상 이미지, 적은 독성, 높은 효율성, 혈액 내에서의 긴 반감기, 조직 특이성에서의 분산력, 좋은 용해성과 생리학적인 유체에서의 안정성 등을 고려하여 생체적합성 고분자로 코팅하여야 한다.

따라서, 유기용매를 사용하지 않으면서 초상자성 산화철 나노 입자를 생체적합성 고분자로 간편하고 효과적으로 코팅하여 환경친화적이며 암세포 및 조직에 선택적으로 흡수할 수 있는 나노복합체의 개발이 절실히 요구되고 있다.

본 발명자들은 유기용매를 사용하지 않고 산화철을 이용한 생체적합성 나노복합체의 제조에 대하여 연구하던 중, 금이 증착된 산화철 나노 입자에 글리콜 키토산을 흡착시켜 나노복합체를 형성한 후 헤파린으로 표면 개질하고 이를 트리블록 공중합체 수용액에 함침시킨 후 동결건조하여 나노복합체를 제조하였으며, 상기 제조된 나노복합체가 MRI 영상에서 우수한 조영효과를 나타내며, 암세포 및 조직에 선택적으로 흡수가 가능함을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 종양 특이적 표적 특성을 지닌 금-증착된 산화철/글리콜 키토산 나노복합체 및 이의 제조방법을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 상기 금-증착된 산화철/글리콜 키토산 나노복합체를 포함하는 MRI 조영제를 제공하고자 한다.

본 발명은 금이 증착된 산화철 나노 입자에 글리콜 키토산을 흡착시켜 나노복합체를 형성한 후 헤파린으로 표면 개질하고 이를 트리블록 공중합체 수용액에 함침시킨 후 동결건조한 것을 특징으로 하는 금-증착된 산화철/글리콜 키토산 나노복합체를 제공한다.

또한, 본 발명은

1) FeCl₂·4H₂O와 FeCl₃·6H₂O를 증류수에 혼합한 수용액에 염기성 용액을 첨가한 후 초음파 분쇄에 의해 증류수에 분산된 산화철 나노입자 시드를 제조하는 단계;

2) 상기 증류수에 분산된 산화철 나노입자 시드에 금염(HAuCl₄)을 첨가한 후 구연산나트륨(Na₃C₆H₅O₇)으로 금염을 환원하여 금을 증착시키는 단계;

3) 상기 금이 증착된 산화철 나노입자 표면에 하기 화학식 1의 글리콜 키토산을 흡착시켜 나노복합체를 제조하는 단계;

4) 상기 형성된 나노복합체의 표면을 하기 화학식 2의 헤파린으로 안정화시키는 단계; 및

5) 상기 안정화된 나노복합체를 하기 화학식 3의 트리블록 공중합체 수용액에 함침시킨 후 동결건조하는 단계를 포함하는 금-증착된 산화철/글리콜 키토산 나노복합체의 제조방법을 제공한다.

상기 화학식 1에서, n은 1000 내지 5000의 정수이다.

상기 화학식 3에서, Y는 ≥10 이고, 2X는 이들 말단 부분이 중합체의 5 내지 95 중량%, 바람직하게는 20 내지 90중량%를 포함하도록 하는 수이다.

또한, 본 발명은 상기 금-증착된 산화철/글리콜 키토산 나노복합체를 포함하는 MRI 조영제를 제공한다.

이하, 본 발명에 따른 금-증착된 산화철/글리콜 키토산 나노복합체의 제조방법에 대해 단계별로 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명의 제조방법에서 상기 1)단계는 산화철 나노입자 시드를 제조하는 단계로, FeCl₂·4H₂O와 FeCl₃·6H₂O를 1:2 몰 비로 증류수에 혼합한 수용액에 염기성 용액을 첨가하여 pH를 9~12 범위로 조절한다. 이때 염기성 용액은 NH₄OH 또는 NaOH를 사용할 수 있다. 반응이 시작되면 처음 갈색의 혼합용액이 진한 갈색의 콜로이드가 형성되면서 침전물이 발생한다. 반응이 끝난 후 초음파 분쇄기를 사용하여 산화철을 분산시킨다. 이렇게 제조된 산화철 나노입자 시드를 투석막에 넣고 3차 증 류수에서 3시간 마다 증류수를 교환해주고 24시간 동안 투석하여 반응 후 미반응 성분과 용매를 제거한다.

상기 2)단계는 금이 증착된 산화철 나노입자를 제조하는 단계로, 상기 분산된 산화철 나노입자 시드에 금염(HAuCl₄)을 첨가한 후 환원제로 구연산나트륨 (Na₃C₆H₅O₇) 넣어 금염을 환원하여 금을 증착한다. 본 발명의 금이 증착된 금속 나노입자의 입자표면전하의 제타전위는 약 -45 내지 -55 mV로, 음이온 전하를 나타낸다. 따라서, 산화철 나노입자 시드 표면에 금을 증착함으로써 산화철과 생체적합성 고분자 사이의 이온 반응을 유도하여 산화철과 생체적합성 고분자 사이를 단단하게 고정할 수 있다.

상기 3)단계는 나노복합체를 제조하는 단계로, 상기 금이 증착된 산화철 나노입자 표면에 상기 화학식 1의 글리콜 키토산을 흡착시켜 나노복합체를 제조한다. 상기 금이 증착된 금속 나노입자 대 글리콜 키토산의 혼합 비율은 2:8 내지 99:1, 바람직하게는 1:4 내지 5:5이다. 만일 금이 증착된 금속 나노입자 대 글리콜 키토산의 비율이 상기 범주를 벗어나면 나노복합체 제조시의 수득율이 저하되거나 나노복합체의 크기가 급격히 증가하는 단점이 있다.

상기 화학식 1의 글리콜 키토산은 수용성 키토산으로 물에 용해한다. 키토산은 키틴을 고농도의 알칼리로 처리함으로써 N-탈아세틸화하여 제조되는 염기성 다당류로서, 세포 흡착능, 생체적합성, 생분해성 및 성형성 등에서 다른 합성고분자들에 비해 우수함이 알려져 있다. 본 발명에서 사용하는 글리콜 키토산은 400,000 의 분자량을 갖는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 4)단계는 나노복합체의 표면을 헤파린으로 안정화시키는 단계이다. 상기에서 제조된 나노복합체 내에 함유된 글리콜 키토산 대 헤파린의 혼합 비율은 2:8 내지 99:1, 바람직하게는 5:5 내지 9:1이다. 만일 나노복합체 내에 함유된 글리콜 키토산 대 헤파린의 혼합 비율이 상기 범주를 벗어나면 헤파린으로 개질화된 나노복합체 제조시의 수득율이 현저히 저하되거나 나노복합체의 크기가 급격히 증가하는 단점이 있다.

상기 화학식 2의 헤파린은 설페이트화된 선형의 다당류로 이루어져 있으며, 주로 우론산(uronic acid)으로 구성되어 있다. 헤파린은 다양한 구조의 혼합체로서 항혈전성, 염증억제, 혈관신생 암 성장 억제 및 면역 억제 등의 다양한 성질을 가지고 있다. 본 발명에서 사용하는 헤파린은 약 20,000의 분자량을 갖는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 헤파린은 실온에서 고체이고, 물에 잘 용해된다. 항응고제로 사용되는 헤파린은 암 환자들에게 많이 생길 수 있는 혈전현상을 막기 위해 사용되기도 한다. 또한 종양세포 주변에 응고작용 촉진 효소의 과정을 방해하여 피브린이 형성되는 것을 억제할 수 있고, 비정상적인 지혈 기전을 막을 수 있게 된다. 이와 관련하여 암 세포 주변의 피브린 형성은 일반적으로 두꺼운 쉘 (shell)을 형성하여 면역 시스템으로부터 영향을 받기 어려우나, 헤파린이 피브린 형성을 억제하면 종양세포가 자연살해세포로부터 좀 더 쉽게 접근할 수 있게 되고, 사이토카인 등과 결합하거나 그들의 활동성을 조절하여 면역 시스템 작용에 의한 종양세포의 파괴 또는 죽음을 유도할 수 있다.

상기 3)단계 및 4)단계에 필요한 시간은 일반적으로 실온에서 10~30분 정도가 바람직하며, 혼합물의 양에 따라 가변적이다.

상기 5)단계는 안정화된 나노복합체를 트리블록 공중합체 수용액에 함침시킨 후 동결건조하는 단계로, 분말 형태의 나노복합체를 얻을 수 있다. 상기 화학식 3의 트리블록공중합체는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌의 트리블록공중합체로 물에 용해한다. 상기 트리블록공중합체는 폴록사머가 바람직하다. 폴록사머는 문헌에 기재된 방법으로 제조할 수 있거나 시판되는 제품을 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용하는 폴록사머는 1000 내지 16000의 분자량을 가지며, 이들의 성질은 폴리옥시프로필렌 블록 및 폴리옥시에틸렌 블록의 비율, 즉 화학식 3에서 Y 및 2X의 비율에 좌우된다. 폴록사머는 실온에서 고체이고, 물과 에탄올에 용해되며, 폴록사머의 예로는 폴록사머 68, 127, 188, 237, 338, 및 407 등이 시판되고 있다. 예를 들어 폴록사머 188이란 Y가 30이고 2X가 약 75인 화학식 3의 화합물로서 분자량이 약 8350인 폴록사머를 의미한다.

상기한 방법으로 제조된 나노복합체의 평균 크기는 100㎚ 내지 10㎛, 바람직하게는 50㎚ 내지 5㎛이다.

본 발명에 따른 나노복합체의 제조방법은 유기용매를 사용하지 않으므로 잔류 물질이 없어 안정성이 우수하고, MRI 영상에서 우수한 조영효과를 나타내며, 암세포 및 조직에 선택적으로 흡수가 가능하여 실시간 조직 영상 및 비침투적 질병의 조기진단을 위한 센서로서 활용이 가능하다. 따라서, 본 발명에 따른 나노복합체는 종양 특이적 표적 특성을 지닌 MRI 조영제로 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 본 발명에 따른 나노복합체의 제조

1. 산화철 나노입자 시드의 제조

증류수 450㎖를 반응용기에 넣고, 80℃가 되도록 가열한 후 증류수 25㎖에 녹아있는 FeCl₂·4H₂O 0.235g(1.18mmol)을 첨가하였다. 상기 온도에서 20분 동안 유지한 후, FeCl₂·4H₂O와 FeCl₃·6H₂O의 몰 비가 1:2 비율이 되도록 증류수 25㎖에 녹아있는 FeCl₃·6H₂O 0.639g(2.36mmol)을 첨가하고 다시 상기 온도에서 20분 동안 유지하였다. 그 다음 상기 혼합용액에 7%(v/v) NH₄OH 2.6㎖를 주사기를 사용하여 천천히 첨가하였다. 반응이 시작되면 처음 갈색의 혼합용액이 진한 갈색의 콜로이드가 형성되면서 침전물이 발생함을 확인하였다. 반응이 끝난 후 실온으로 냉각시켜 반응을 종결시켰다. 형성된 산화철 나노 시드를 25kHz, 80W 조건의 초음파 분쇄기로 분산시켰다. 반응 후 미반응 성분과 용매를 제거하기 위하여, 상기 제조된 산화철 나노입자 시드를 분획분자량(molecular weight cut-off; MWCO) 50,000인 투석막 (Spectra/PorMembrane, Spectrum Laboratories, Inc., USA)에 넣고 3차 증류수에서 3시간 마다 증류수를 교환해주고 24시간 동안 투석하였다.

이렇게 얻어진 산화철 나노입자 시드를 투과전자 현미경(Transmittance Electron Microscopy, TEM)으로 관찰하였다. 결과는 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명의 산화철 나노입자 시드의 크기가 약 5~8㎚임을 확인하였다.

또한, 반응온도를 40℃부터 10℃ 단위로 80℃까지 다양하게 변화시켜 온도변화에 따른 산화철 나노입자 시드의 수득률(%)을 유도결합 플라즈마원자방출분광법 (Inductively Coupled Plasma Atomic emission spectroscopy, ICP-AES)으로 관찰하였다. 결과는 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, 산화철 나노입자 시드의 수득률은 40℃에서 약 25%, 50℃에서 약 50%, 60℃에서 약 58%, 70℃에서 약 88%, 80℃에서 약 90%로 나타났다. 따라서, 산화철 나노입자 시드의 수득률은 80℃에서 반응시켰을 때 가장 우수함을 알 수 있다.

2. 금이 증착된 금속 나노입자의 제조

상기 1에서 제조된 산화철 나노입자 시드가 분산되어 있는 용액 200㎖를 반응용기에 넣고 80℃가 되도록 가열하였다. 그 다음 10㎖의 1mM 금염(HAuCl₄)을 첨가한 후 상기 온도에서 20분 정도 유지하였다. 상기 금염과 산화철 나노입자 시드가 혼합된 용액에 환원제로 1 중량%의 구연산나트륨(Na₃C₆H₅O₇)을 금염과 동일한 부피로 첨가하였다. 시간이 지남에 따라 산화철 나노입자 시드에 금이 증착되었다.

금염 수용액의 부피 변화에 따른 금이 증착된 금속 나노입자의 입자표면전하 를 제타전위(zeta potential)로 분석하였으며, 결과는 도 4에 나타내었다.

또한, 산화철 나노입자 표면에 금이 증착된 것을 확인하기 위하여, 금염 수용액의 부피 변화에 따른 금이 증착된 금속 나노입자의 분광학적 특성을 자외선-가시광선 분광광도계(uv-visible spectroscopy)로 측정하였으며, 결과는 도 5에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명의 금이 증착된 금속 나노입자의 입자표면전하의 제타전위가 약 -45 내지 -55 mV로, 음이온 전하를 나타내었다.

또한, 도 5에 나타난 바와 같이, 400 내지 600㎚ 사이에서 산화철 나노입자의 특정 흡수띠가 나타나지 않았으며, 540㎚에서 금이 증착된 금속 나노입자의 최대 흡수띠가 나타났다. 따라서, 산화철 나노입자 표면에 금이 증착되었음을 알 수 있다.

3. 나노복합체의 제조

0.15g의 트윈 80을 상기 2에서 제조된 금이 증착된 금속 나노입자(0.19㎎/㎖)를 함유하는 수용액 5㎖와 혼합하고, 이어서 증류수에 용해된 0.05 중량%의 글리콜 키토산 용액 0.5㎖를 한번에 빠르게 첨가하여 나노복합체를 형성하였다. 상기 나노복합체가 형성된 수용액의 교반을 유지한 상태에서 증류수에 용해된 0.0625 중량% 헤파린 수용액 0.5㎖를 한번에 빠르게 첨가하여 나노복합체를 안정화시켰다. 상기 형성된 나노복합체를 5 중량%의 폴록사머 188(Pluronic F-68) 수용액에 함침시킨 다음 동결 건조시켜 분말 형태의 나노복합체를 얻었다.

상기 제조된 나노복합체의 수용액 내에서의 입자 크기를 입도분석기로 측정하였으며, 측정결과는 도 6에 나타내었다. 도 6에 나타난 바와 같이, 본 발명의 나노복합체의 수용액 내에서의 입자 크기는 약 150㎚ 정도임을 확인하였다.

또한, 상기 제조된 나노복합체를 전계방사형 주사전자 현미경(Field Emission-Scanning Electron Microscopy, FE-SEM)으로 관찰하였으며, 측정결과는 도 7에 나타내었다.

실험예 1 : 본 발명에 따른 나노복합체의 철 농도변화에 따른 MRI 영상( in vitro )

본 발명에 따른 나노복합체의 in vitro 진단 가능성을 알아보기 위하여, 3.0 T MRI(Magnetic Resonance Imaging)를 이용하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

펜톰 영상용 시료는 50㎖의 1% 아가로오스(BioRad, Hercules, CA)에 상기 실시예 1에서 제조한 나노복합체를 현탁시켜 제조하였다. 현탁액을 미리 제조한 24-웰 아가로오스 시료 용기에 로딩하고 48℃에서 고체화시켰다. 나노복합체의 철 농도변화(9.75μM ~ 1250μM)에 따른 MRI 영상을 확인하였다. 대조군으로는 상업적으로 시판되고 있는 초상자성 산화철 조영제인 레조비스트(resovist)를 사용하였다.

본 발명의 나노복합체의 철 농도변화에 따른 MRI 영상은 도 8에 나타내었으며, 도 8의 MRI 영상 신호 강도를 정량적으로 분석한 데이터는 도 9에 나타내었다.

도 8 및 도 9에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 나노복합체는 대조군인 레조비스트에 비해 향상된 T2 음성 영상을 나타내었다. 따라서, 본 발명에 따른 나 노복합체는 MRI 영상에서 우수한 조영효과를 나타냄을 알 수 있다.

실험예 2 : 본 발명에 따른 나노복합체의 MRI 영상( in vivo )

본 발명에 따른 나노복합체의 in vivo 진단 가능성을 알아보기 위하여, 4.7 T Bruker Biospin imager (Bruker Medical Systems, Karlsruhe, Germany)를 이용하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

편평세포암종(Squamous cell carcinoma, SCC cells; ATCC, Rockville, MD, USA)을 습한 5% CO₂ 배양기에서 37℃에서 10% FBS로 보충된 RPMI 배지 1640에서 배양하였다. 생리적 식염수 내 1×10⁶ 세포의 현탁액을 C3H/HeN 마우스(7주령, 20-25g)의 피하 오른쪽 종아리에 접종하였다. 종양 크기가 직경 1㎝ 일 때, 0.1㎖의 식염수와 혼합된 상기 실시예 1의 나노복합체 0.75㎎을 종양-함유 마우스의 꼬리정맥을 통해 투여하였다. 주사 후 1시간, 3시간 및 6시간에 MRI 영상을 확인하였다.

결과는 도 10에 나타내었다.

도 10에 나타난 바와 같이, 주사 1시간 후 종양 위치에서 MRI 영상 명암도가 증가하였다. 주사 6시간까지 종양 위치에서 MRI 영상 명암도의 유의적 향상이 관찰되었다. 따라서, 본 발명에 따른 나노복합체는 종양-특이적 표적 특성을 지닌 MRI 조영제로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 나노복합체의 제조방법은 유기용매를 사용하지 않으므로 잔 류 물질이 없으며 안정성이 우수하고, MRI 영상에서 우수한 조영효과를 나타내며, 암세포 및 조직에 선택적으로 흡수가 가능하여 실시간 조직 영상 및 비침투적 질병의 조기진단을 위한 센서로서 활용이 가능하다. 따라서, 본 발명에 따른 나노복합체는 종양 특이적 표적 특성을 지닌 MRI 조영제로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 금-증착된 산화철/글리콜 키토산 나노복합체의 모식도이다.

도 2는 본 발명에 따른 산화철 나노입자 시드를 투과전자 현미경(TEM)으로 관찰한 도이다.

도 3은 온도변화에 따른 본 발명의 산화철 나노입자 시드의 수득률(%)을 유도결합 플라즈마원자방출분광법(ICP-AES)으로 관찰한 도이다.

도 4는 금염 수용액의 부피 변화에 따른 본 발명의 금이 증착된 금속 나노입자의 입자표면전하를 제타전위(zeta potential)로 분석한 도이다.

도 5는 금염 수용액의 부피 변화에 따른 본 발명의 금이 증착된 금속 나노입자의 분광학적 특성을 자외선-가시광선 분광광도계로 측정한 도이다.

도 6은 본 발명에 따른 나노복합체의 수용액 내에서의 입자 크기를 입도분석기로 측정한 도이다.

도 7은 본 발명에 따른 나노복합체를 전계방사형 주사전자 현미경(FE-SEM)으로 관찰한 도이다.

도 8은 본 발명의 나노복합체의 철 농도변화(9.75μM ~ 1250μM)에 따른 in vitro 실험의 MRI 영상을 나타낸 도이다.

도 9는 도 8의 MRI 영상 신호 강도를 정량적으로 분석한 데이터이다.

도 10은 본 발명에 따른 나노복합체의 in vivo 실험의 MRI 영상을 나타낸 도이다.

Claims (8)

1) FeCl₂·4H₂O와 FeCl₃·6H₂O를 증류수에 혼합한 수용액에 염기성 용액을 첨가한 후 초음파 분쇄에 의해 증류수에 분산된 산화철 나노입자 시드를 제조하는 단계;

2) 상기 증류수에 분산된 산화철 나노입자 시드에 금염(HAuCl₄)을 첨가한 후 구연산나트륨(Na₃C₆H₅O₇)으로 금염을 환원하여 금을 증착시키는 단계;

3) 상기 금이 증착된 산화철 나노입자 표면에 하기 화학식 1의 글리콜 키토산을 흡착시켜 나노복합체를 제조하는 단계;

4) 상기 형성된 나노복합체의 표면을 하기 화학식 2의 헤파린으로 안정화시키는 단계; 및

5) 상기 안정화된 나노복합체를 하기 화학식 3의 트리블록 공중합체 수용액에 함침시킨 후 동결건조하는 단계를 포함하는 금-증착된 산화철/글리콜 키토산 나노복합체의 제조방법.

<화학식 1>

상기 화학식 1에서, n은 1000 내지 5000의 정수이다.

<화학식 2>

<화학식 3>

상기 화학식 3에서, Y는 ≥10 이고, 2X는 이들 말단 부분이 중합체의 5 내지 95 중량%를 포함하도록 하는 수이다.

제 1항에 있어서, 상기 1)단계에서 FeCl₂·4H₂O와 FeCl₃·6H₂O를 1:2 몰 비로 증류수에 혼합하는 것을 특징으로 하는 나노복합체의 제조방법.

제 1항에 있어서, 상기 1)단계에서 염기성 용액은 NH₄OH 또는 NaOH인 것을 특징으로 하는 나노복합체의 제조방법.

제 1항에 있어서, 상기 3)단계에서 금이 증착된 금속 나노입자 대 글리콜 키토산의 혼합 비율은 2:8 내지 99:1인 것을 특징으로 하는 나노복합체의 제조방법.

제 1항에 있어서, 상기 4)단계에서 나노복합체 내에 함유된 글리콜 키토산 대 헤파린의 혼합 비율은 2:8 내지 99:1인 것을 특징으로 하는 나노복합체의 제조방법.

제 1항에 있어서, 상기 5)단계에서 트리블록 공중합체는 폴록사머인 것을 특징으로 하는 나노복합체의 제조방법.

제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 의해 제조되고, 나노복합체의 평균 크기가 100㎚ 내지 10㎛인 것을 특징으로 하는 금-증착된 산화철/글리콜 키토산 나노복합체.

제 7항의 금-증착된 산화철/글리콜 키토산 나노복합체를 포함하는 MRI 조영제.

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