KR20200007752A - 마그네틱 비드의 제조방법 및 분리방법 - Google Patents

마그네틱 비드의 제조방법 및 분리방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20200007752A
KR20200007752A KR1020190085154A KR20190085154A KR20200007752A KR 20200007752 A KR20200007752 A KR 20200007752A KR 1020190085154 A KR1020190085154 A KR 1020190085154A KR 20190085154 A KR20190085154 A KR 20190085154A KR 20200007752 A KR20200007752 A KR 20200007752A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
magnetic beads
iron
iron oxide
less
mixed solution
Prior art date
Application number
KR1020190085154A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102170388B1 (ko
Inventor
강지현
신희종
김민이
Original Assignee
주식회사 제놀루션
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 제놀루션 filed Critical 주식회사 제놀루션
Publication of KR20200007752A publication Critical patent/KR20200007752A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102170388B1 publication Critical patent/KR102170388B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/1013—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by using magnetic beads
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01G—COMPOUNDS CONTAINING METALS NOT COVERED BY SUBCLASSES C01D OR C01F
    • C01G49/00—Compounds of iron
    • C01G49/02—Oxides; Hydroxides
    • C01G49/08—Ferroso-ferric oxide [Fe3O4]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01P—INDEXING SCHEME RELATING TO STRUCTURAL AND PHYSICAL ASPECTS OF SOLID INORGANIC COMPOUNDS
    • C01P2004/00—Particle morphology
    • C01P2004/01—Particle morphology depicted by an image
    • C01P2004/03—Particle morphology depicted by an image obtained by SEM
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01P—INDEXING SCHEME RELATING TO STRUCTURAL AND PHYSICAL ASPECTS OF SOLID INORGANIC COMPOUNDS
    • C01P2004/00—Particle morphology
    • C01P2004/01—Particle morphology depicted by an image
    • C01P2004/04—Particle morphology depicted by an image obtained by TEM, STEM, STM or AFM
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01P—INDEXING SCHEME RELATING TO STRUCTURAL AND PHYSICAL ASPECTS OF SOLID INORGANIC COMPOUNDS
    • C01P2004/00—Particle morphology
    • C01P2004/60—Particles characterised by their size
    • C01P2004/64—Nanometer sized, i.e. from 1-100 nanometer

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Compounds Of Iron (AREA)

Abstract

본 발명은 마그네틱 비드의 제조방법에 관한 것이다. 더욱 자세하게, 본 발명은 산화철 및 실리카를 포함하는, 마그네틱 비드의 제조방법 및 분리방법에 관한 것이다.

Description

마그네틱 비드의 제조방법 및 분리방법{Method for Preparing Magnetic Beads and Method for Separating thereof}
본 발명은 마그네틱 비드의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 산화철 및 실리카를 포함하는, 마그네틱 비드의 제조방법에 관한 것이다.
진단(diagnosis)은 크게 체내 진단과 체외 진단으로 나뉘며, 체내 진단은 X선·핵자기공명장치(MRI)·컴퓨터단층촬영(CT) 등을 통해 체내에서 직접 질병 원인을 분석하는 방식이고, 체외 진단은 혈액, 소변 등 인체 유래 검체를 이용해 질병을 분석하는 방식이다. 특히, 체외 진단 중 한 분야인 분자 진단은, 유전자 정보를 담고 있는 핵산(DNA/RNA)을 검사해 질병을 진단하는 기술로서, 국내는 물론 글로벌 고령화 시기와 맞물려 전 세계적으로 이러한 진단 기술에 대한 필요성 및 요구가 급상승 중이다.
마그네틱 비드 (Magnetic Beads)는 자성을 가지는 입상 조성물로, 핵산 추출, 질병 진단용 바이오센서, MRI 조영제, 온열치료, 약물전달체 등 다양한 용도로 사용될 수 있다. 그러나, 마그네틱 비드의 크기는 약 1 내지 10,000nm 정도로 매우 다양한 크기를 가져, 마그네틱 비드의 크기를 조절하여 원하는 사이즈의 비드를 제조하는 것이 어렵다. 따라서, 마그네틱 비드를 목적하는 용도에 적합하게 특정한 크기를 가지도록 조절하여 제조하는 것이 어려우며, 마그네틱 비드를 한 번에 많은 양으로 생산할 경우에는 비드의 크기 조절이 특히 어렵고, 비드끼리 응집되는 문제점 등이 있다. 이에, 필요에 따라 마그네틱 비드를 소량 제조하여 사용할 수 밖에 없는 현실이다.
본 발명의 일예는 위와 같은 문제점을 해결하기 위해, 마그네틱 비드의 제조방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일예는, 마그네틱 비드를 대량으로 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일예는, 마그네틱 비드를 대량으로 제조하고, 제조된 마그네틱 비드를 크기 별로 분리하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일예는, 다양한 시료 (세포, 조직, 혈액, 소변 등)로부터 DNA 또는 RNA를 효과적으로 추출하기 위해, 추출 시약 및 이와 함께 사용될 소재로 실리카 코팅된 마그네틱 비드(magnetic bead)를 제공하는 것이다.
본 발명의 일예는, 용매에 철 전구체 및 산화제를 혼합한 혼합 용액을 균질화하여 산화철 코어를 얻는 단계; 상기 산화철 코어를 액상 매질에 첨가한 후, 실리카 전구체 용액을 적상하여 상기 산화철 코어를 실리카로 코팅하여 마그네틱 비드를 얻는 단계; 및 상기 액상 매질에서 마그네틱 비드를 분리하는 단계를 포함하는, 마그네틱 비드의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 일예는, 산화철 및 실리카를 함유하는 자성 비드를 포함하는, 핵산 추출용 입상 조성물에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 더욱 자세하게 설명한다.
본 발명의 일예에 따른 마그네틱 비드는 산화철 코어를 둘러싼 실리카 셀을 포함하는 코어-쉘 구조를 가질 수 있으며, 자성을 가지는 자성 비드일 수 있다. 상기 실리카는 화학식 SiO2인 것일 수 있고, 상기 산화철은 화학식 Fe3O4인 것일 수 있으며, 상기 마그네틱 비드는 실리카를 입힌 산화철을 뜻하는 "Fe3O4@SiO2"로 표시될 수 있으며, 상기 "Fe3O4@SiO2"는 본 발명의 일 예에 따른 마그네틱 비드 또는 자성 비드를 지칭하는 용어로 사용된다.
본 발명의 일예에 따른 마그네틱 비드는, 상기 산화철을 70 내지 99 중량%, 70 내지 95 중량%, 70 내지 90 중량%, 70 내지 85 중량%, 70 내지 80 중량%, 70 내지 75 중량%, 75 내지 99 중량%, 75 내지 95 중량%, 75 내지 90 중량%, 75 내지 85 중량%, 75 내지 80 중량%, 80 내지 99 중량%, 80 내지 95 중량%, 80 내지 90 중량%, 80 내지 85 중량%, 85 내지 99 중량%, 85 내지 95 중량%, 85 내지 90 중량%, 90 내지 99 중량%, 90 내지 95 중량%, 또는 95 내지 99중량%로 포함할 수 있다.
본 발명의 일예에 따른 마그네틱 비드는, 상기 실리카를 1 내지 30, 1 내지 25, 1 내지 20, 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5, 5 내지 30, 5 내지 25, 5 내지 20, 5 내지 15, 5 내지 10, 10 내지 30, 10 내지 25, 10 내지 20, 10 내지 15, 15 내지 30, 15 내지 25, 15 내지 20, 20 내지 30, 20 내지 25, 또는 25 내지 30중량%로 포함할 수 있다.
본 발명의 일예에 따른 마그네틱 비드에서, 상기 산화철 및 상기 실리카는, 9:1 내지 5:5, 9:1 내지 6:4, 9:1 내지 7:3, 9:1 내지 8:2, 8:2 내지 5:5, 8:2 내지 6:4, 8:2 내지 7:3, 7:3 내지 5:5, 7:3 내지 6:4, 또는 6:4 내지 5:5의 중량비로 포함될 수 있으며, 일예로 9:1 내지 8:2의 중량비로 포함될 수 있다.
본 발명의 일예에 따른 마그네틱 비드의 입경은, 하한치가 10 nm 이상, 50 nm 이상, 100 nm 이상, 150 nm 이상, 200 nm 이상, 250 nm 이상, 300 nm 이상, 350 nm 이상, 400 nm 이상, 450 nm 이상, 500 nm 이상, 550 nm 이상, 600 nm 이상, 650nm 이상, 700 nm 이상, 750 nm 이상, 800 nm 이상, 850 nm 이상, 900 nm 이상, 950 nm 이상, 또는 1,000 nm 이상일 수 있고, 상한치가 2,000 nm 이하, 1,900 nm 이하, 1,800 nm 이하, 1,700 nm 이하, 1,600 nm 이하, 1,500 nm 이하, 1,400 nm 이하, 1,300 nm 이하, 1,200 nm 이하, 1,100 nm 이하, 1,000 nm 이하, 900 nm 이하, 800 nm 이하, 750 nm 이하, 700 nm 이하, 650 nm 이하, 600nm 이하, 550 nm 이하, 500 nm 이하, 450 nm 이하, 400 nm 이하, 350 nm 이하, 300 nm 이하, 250 nm 이하, 200 nm 이하, 150 nm 이하, 또는 100 nm 이하일 수 있으며, 상기 마그네틱 비드의 입경은 상기 하한치와 상기 상한치의 조합으로 설정될 수 있다.
본 발명의 일예에 따른 마그네틱 비드의 입경은, 상기 마그네틱 비드의 사용 목적 또는 사용 용도에 따라 설정될 수 있다. 구체적으로, 입경이 비교적 작은 크기의 마그네틱 비드는 체내 삽입형 약물 전달체 용도로 사용될 수 있고, 중간 크기의 마그네틱 비드는 핵산 추출용으로 사용될 수 있으며, 비교적 큰 크기의 마그네틱 비드는 진단 검출용으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 입경 50 내지 500 nm의 마그네틱 비드는 약물 전달체 용도로 사용될 수 있고, 입경 500 내지 1,000 nm의 마그네틱 비드는 핵산 추출 용도로 사용될 수 있으며, 입경 1,000 내지 1,500 nm의 마그네틱 비드는 진단 검출 용도로 사용될 수 있다. 상기 진단 검출 용도는 엑소좀 (exosome) 또는 혈중종양세포 (circulating tumor cell) 등의 진단 또는 검출에 사용될 수 있으며, 예를 들어 면역친화성 (immunoaffinity)를 활용한 엑소좀의 분리, 면역형광법 (immunofluorescence)를 활용한 엑소좀의 탐지 등에 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일예에 따른 마그네틱 비드는, 핵산 추출 자동화 장비를 사용한 핵산 추출과정에서 잔여 비드 없이 진행될 수 있도록, 적정값의 포화자기도를 가질 수 있다. 예를 들어, 상기 마그네틱 비드는, 포화자기도의 하한치가 30 eum/g 이상, 35 eum/g 이상, 40 eum/g 이상, 45 eum/g 이상, 50 eum/g 이상, 51 eum/g 이상, 52 eum/g 이상, 53 eum/g 이상, 54 eum/g 이상, 55 eum/g 이상, 60 eum/g 이상, 65 eum/g 이상, 또는 70 eum/g 이상, 상한치가 100 eum/g 이하, 95 eum/g 이하, 90 eum/g 이하, 85 eum/g 이하, 80 eum/g 이하, 75 eum/g 이하, 70 eum/g 이하, 65 eum/g 이하, 60 eum/g 이하, 55 eum/g 이하, 54 eum/g 이하, 또는 53 eum/g 이하일 수 있으며, 상기 마그네틱 비드의 포화자기도는 상기 하한치와 상기 상한치의 조합으로 설정될 수 있다.
본 발명의 일예에 따른 마그네틱 비드의 제조방법은, 용매에 철 전구체 및 산화제를 혼합한 혼합 용액을 균질화하여 산화철 코어를 얻는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 "철 전구체"은 산화철 코어를 형성하기 위해 철 이온을 포함하는 물질이면 제한 없이 포함될 수 있으며, 예를 들어 염화제2철6수화물, 질산철, 황산철, 요오드화철, 브롬화철, 올레산철, 타우르산철, 라우르산철, 아세트산철, 펜타카르보닐철, 및 엔니카르보닐철로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어 "산화제"는 혼합 용액의 산성 pH를 유지시켜 산화철 코어를 형성하기 위해 사용될 수 있는 물질이면 제한 없이 포함될 수 있으며, 예를 들어 소듐 아세테이트 (NaOAc), 포타슘 하이드로겐 프탈레이트, 프탈레이트, 시트르산, 소듐 시트레이트, 및 아세트산으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일예에 따르면, 철 전구체와 Precipitating agent를 용매에 혼합하고, 100 내지 200
Figure pat00001
로 가열하여 적정 시간 동안 반응을 지속해주면, 약 3시간 뒤에 용액의 색상이 붉은색에서 검은색으로 변하기 시작하며, 검은색으로 변화된 용액에서 강한 자성을 이용하여 비드를 분리하여, 자성을 지닌 비드를 수득할 수 있다. 분리된 비드를 극성용매로 세척해주면, 균일한 크기의 비드를 얻을 수 있다. 이러한 방법은 한번에 1g 이하의 합성양을 보이는 기존의 방법과 달리, 한 번에 10g 이상의 비드를 합성할 수 있는 장점이 있다.
상기 철 전구체 및 상기 산화제는 용매에 혼합되어 혼합 용액을 형성할 수 있으며, 상기 철 전구체 및 상기 산화제의 혼합 중량비는 1:0.5 내지 1:5, 1:0.6 내지 1:5, 1:0.7 내지 1:5, 1:0.75 내지 1:5, 1:0.8 내지 1:5, 1:0.9 내지 1:5, 1:1 내지 1:5, 1:1.1 내지 1:5, 1:1.2 내지 1:5, 1:1.3 내지 1:5, 1:1.4 내지 1:5, 1:1.5 내지 1:5, 1:2 내지 1:5, 1:2.5 내지 1:5, 1:0.5 내지 1:4, 1:0.6 내지 1:4, 1:0.7 내지 1:4, 1:0.75 내지 1:4, 1:0.8 내지 1:4, 1:0.9 내지 1:4, 1:1 내지 1:4, 1:1.1 내지 1:4, 1:1.2 내지 1:4, 1:1.3 내지 1:4, 1:1.4 내지 1:4, 1:1.5 내지 1:4, 1:2 내지 1:4, 1:2.5 내지 1:4, 1:0.5 내지 1:3, 1:0.6 내지 1:3, 1:0.7 내지 1:3, 1:0.75 내지 1:3, 1:0.8 내지 1:3, 1:0.9 내지 1:3, 1:1 내지 1:3, 1:1.1 내지 1:3, 1:1.2 내지 1:3, 1:1.3 내지 1:3, 1:1.4 내지 1:3, 1:1.5 내지 1:3, 1:2 내지 1:3, 1:2.5 내지 1:3, 1:0.5 내지 1:2.5, 1:0.6 내지 1:2.5, 1:0.7 내지 1:2.5, 1:0.75 내지 1:2.5, 1:0.8 내지 1:2.5, 1:0.9 내지 1:2.5, 1:1 내지 1:2.5, 1:1.1 내지 1:2.5, 1:1.2 내지 1:2.5, 1:1.3 내지 1:2.5, 1:1.4 내지 1:2.5, 1:1.5 내지 1:2.5, 1:2 내지 1:2.5, 1:0.5 내지 1:2.3, 1:0.6 내지 1:2.3, 1:0.7 내지 1:2.3, 1:0.75 내지 1:2.3, 1:0.8 내지 1:2.3, 1:0.9 내지 1:2.3, 1:1 내지 1:2.3, 1:1.1 내지 1:2.3, 1:1.2 내지 1:2.3, 1:1.3 내지 1:2.3, 1:1.4 내지 1:2.3, 1:1.5 내지 1:2.3, 1:2 내지 1:2.3, 1:0.5 내지 1:2.2, 1:0.6 내지 1:2.2, 1:0.7 내지 1:2.2, 1:0.75 내지 1:2.2, 1:0.8 내지 1:2.2, 1:0.9 내지 1:2.2, 1:1 내지 1:2.2, 1:1.1 내지 1:2.2, 1:1.2 내지 1:2.2, 1:1.3 내지 1:2.2, 1:1.4 내지 1:2.2, 1:1.5 내지 1:2.2, 1:2 내지 1:2.2, 1:0.5 내지 1:2.1, 1:0.6 내지 1:2.1, 1:0.7 내지 1:2.1, 1:0.75 내지 1:2.1, 1:0.8 내지 1:2.1, 1:0.9 내지 1:2.1, 1:1 내지 1:2.1, 1:1.1 내지 1:2.1, 1:1.2 내지 1:2.1, 1:1.3 내지 1:2.1, 1:1.4 내지 1:2.1, 1:1.5 내지 1:2.1, 1:2 내지 1:2.1, 1:0.5 내지 1:2, 1:0.6 내지 1:2, 1:0.7 내지 1:2, 1:0.75 내지 1:2, 1:0.8 내지 1:2, 1:0.9 내지 1:2, 1:1 내지 1:2, 1:1.1 내지 1:2, 1:1.2 내지 1:2, 1:1.3 내지 1:2, 1:1.4 내지 1:2, 1:1.5 내지 1:2, 1:0.5 내지 1:1.9, 1:0.6 내지 1:1.9, 1:0.7 내지 1:1.9, 1:0.75 내지 1:1.9, 1:0.8 내지 1:1.9, 1:0.9 내지 1:1.9, 1:1 내지 1:1.9, 1:1.1 내지 1:1.9, 1:1.2 내지 1:1.9, 1:1.3 내지 1:1.9, 1:1.4 내지 1:1.9, 1:1.5 내지 1:1.9, 1:0.5 내지 1:1.8, 1:0.6 내지 1:1.8, 1:0.7 내지 1:1.8, 1:0.75 내지 1:1.8, 1:0.8 내지 1:1.8, 1:0.9 내지 1:1.8, 1:1 내지 1:1.8, 1:1.1 내지 1:1.8, 1:1.2 내지 1:1.8, 1:1.3 내지 1:1.8, 1:1.4 내지 1:1.8, 1:1.5 내지 1:1.8, 1:0.5 내지 1:1.7, 1:0.6 내지 1:1.7, 1:0.7 내지 1:1.7, 1:0.75 내지 1:1.7, 1:0.8 내지 1:1.7, 1:0.9 내지 1:1.7, 1:1 내지 1:1.7, 1:1.1 내지 1:1.7, 1:1.2 내지 1:1.7, 1:1.3 내지 1:1.7, 1:1.4 내지 1:1.7, 1:1.5 내지 1:1.7, 1:0.5 내지 1:1.6, 1:0.6 내지 1:1.6, 1:0.7 내지 1:1.6, 1:0.75 내지 1:1.6, 1:0.8 내지 1:1.6, 1:0.9 내지 1:1.6, 1:1 내지 1:1.6, 1:1.1 내지 1:1.6, 1:1.2 내지 1:1.6, 1:1.3 내지 1:1.6, 1:1.4 내지 1:1.6, 또는 1:1.5 내지 1:1.6 일 수 있으며, 예를 들어 1: 0.76 내지 1:3, 1:0.76 내지 1:2.5, 1:0.76 내지 1:2.3, 1:0.76 내지 1:2.2, 1:0.76 내지 1:2.1, 1:0.76 내지 1:2, 1:0.76 내지 1:1.9, 1:0.76 내지 1:1.8, 1:0.76 내지 1:1.7, 1:0.76 내지 1:1.6, 1:0.8 내지 1:3, 1:0.8 내지 1:2.5, 1:0.8 내지 1:2.2, 1:0.8 내지 1:2, 1:1.1 내지 1:3, 1:1.1 내지 1:2.5, 1:1.15 내지 1:3, 1:1.15 내지 1:2.5, 1:1.15 내지 1:2.4, 1:1.15 내지 1:2.3, 1:1.15 내지 1:2.2, 1:1.15 내지 1:2, 1:1.15 내지 1:1.8, 1:1.15 내지 1:1.7, 1:1.15 내지 1:1.6, 1:1 내지 1:2.5, 1:1 내지 1:2.2, 1:1 내지 1:2, 1:1.15 내지 1:2.5, 또는 1:1.15 내지 1:2.2 일 수 있다.
상기 철 전구체와 산화제의 중량비는 산화철 제조과정에서 산화철의 수득량, 산화철의 수율, 산화철의 자성 등을 고려하여 선택될 수 있으며, 예를 들어 산화제의 중량이 철 전구체 중량 대비 지나치게 많이 포함될 경우에는 비드가 변성되어 자성을 잃어버릴 수 있다. 예를 들어, 상기 산화제의 중량은 상기 철 전구체 중량의 3배 이하, 3배 미만, 2.5배 이하, 2.3배 이하, 2.2배 이하, 2.1배 이하, 2배 이하, 1.9배 이하, 1.8배 이하, 1.7배 이하, 또는 1.6배 이하일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 산화제의 중량이 철 전구체 중량 대비 지나치게 적게 포함될 경우에는 생성되는 산화철 코어의 양이 적어 생산효율이 떨어질 수 있다. 일예로, 철 전구체 27g에 산화제를 20.5g 첨가하여 산화철 코어를 제조할 경우, 제조된 혼합 용액을 자석에 1분 간 부착시킬 경우 형성된 산화철 코어가 모두 가라앉는 등 수율이 높지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 산화제의 중량은 상기 철 전구체 중량의 0.75배 이상, 0.76배 이상, 0.8배 이상, 0.9배 이상, 1배 이상, 1.1배 이상, 1.14배 이상, 1.15배 이상, 1.2배 이상, 1.3배 이상, 또는 1.4배 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 혼합 용액은 증류수, 알코올, 에테르, 에스테르, 아미드, 알데하이드, 케톤, 니트릴, 및 이의 조합으로부터 선택되는 것일 수 있으며, 예를 들어 증류수, 에틸렌글리콜, 에틸렌글리콜 모노메틸 에테르, 디에틸 에테르, 메틸에틸 에테르, 에틸프로필 에테르, 메틸프로필 에테르, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 펜타놀, 네오펜타놀, 1,2-디메톡시에탄, 메틸 아세테이트, 에틸 아세테이트, 프로필 아세테이트, 아세트알데하이드, 메틸포르메이트, 에틸포르메이트, 에틸 프로피오네이트, 메틸 프로피오네이트, 디클로로메탄, 클로로포름, 디메틸포름아미드, 아세트아미드, 디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈, 아세톤, 에틸메틸 케톤, 디에틸 케톤, 아세토니트릴, 프로피오니트릴, 및 이의 조합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것일 수 있다.
상기 산화철 코어는 철 전구체 및 산화제를 혼합한 혼합 용액을 균질화하여 얻을 수 있으며, 상기 균질화는 고온에서 전구체에 포함된 철이온들이 산소와 결합하여 산화철 입자를 형성하는 과정이다.
상기 철 전구체 및 산화제의 균질화 시간은, 하한치가 1시간 이상, 2시간 이상, 3시간 이상, 4시간 이상, 5시간 이상, 6시간 이상, 7시간 이상, 8시간 이상, 9시간 이상, 10시간 이상, 11시간 이상, 12시간 이상, 13시간 이상, 14시간 이상, 15시간 이상, 16시간 이상, 17시간 이상, 18시간 이상, 19시간 이상, 20 시간 이상, 21 시간 이상, 22 시간 이상, 23 시간 이상, 또는 24시간 이상일 수 있고, 상한치가 48시간 이하, 47 시간 이하, 46 시간 이하, 45 시간 이하, 44 시간 이하, 43 시간 이하, 42 시간 이하, 41 시간 이하, 40 시간 이하, 39 시간 이하, 38 시간 이하, 37 시간 이하, 36 시간 이하, 35 시간 이하, 34 시간 이하, 33 시간 이하, 32 시간 이하, 31 시간 이하, 30 시간 이하, 29 시간 이하, 28 시간 이하, 27 시간 이하, 26 시간 이하, 25 시간 이하, 또는 24시간 이하일 수 있으며, 상기 균질화 시간은 상기 하한치와 상기 상한치의 조합으로 설정될 수 있다. 예를 들어, 상기 균질화 시간은 18 내지 36시간, 18 내지 30시간, 18 내지 25시간, 21 내지 36시간, 21 내지 30시간, 또는 21 내지 25시간일 수 있다.
상기 균질화 단계의 온도는, 하한치가 100℃, 110℃, 120℃, 130℃, 140℃, 또는 150℃이상, 상한치가 200℃, 190℃, 180℃, 170℃, 160℃, 또는 150℃이하일 수 있으며, 상기 하한치와 상기 상한치의 조합으로 설정될 수 있다.
상기 산화철 코어를 얻는 단계는, 상이한 성장속도로 다양한 입경을 갖는 산화철 코어가 제조되는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 혼합 용액 내 철 이온의 충돌 빈도를 상이하게 조절하여, 산화철 코어로 성장되는 속도를 다양하게 조절하고, 제조되는 산화철 코어가 다양한 입경 분포를 가지도록 제조되는 것일 수 있다. 상기 혼합 용액 내의 철 전구체로부터 유래한 철 이온들이 산화제와 산화-환원 반응을 거쳐 산화철 코어로 성장되고, 철 전구체에 포함된 철이온들이 산소와 결합하며, 상기 산화철 코어의 성장 속도가 상이하게 조절되어, 제조되는 산화철 코어는 넓은 분포의 입경을 가지도록 제조될 수 있다.
본 발명의 일예에 따른 마그네틱 비드의 제조방법은, 상기 산화철 코어의 지름 (diameter) 길이의 표준편차가 100 nm 이상, 110 nm 이상, 120 nm 이상, 130 nm 이상, 140 nm 이상, 150 nm 이상, 160 nm 이상, 170 nm 이상, 180 nm 이상, 190 nm 이상, 200 nm 이상, 210 nm 이상, 220 nm 이상, 230 nm 이상, 240 nm 이상, 250 nm 이상, 260 nm 이상, 또는 270 nm 이상인 분포를 갖도록 얻어지는 것일 수 있고, 1000 nm 이하, 900 nm 이하, 800 nm 이하, 700 nm 이하, 600 nm 이하, 500 nm 이하, 400 nm 이하, 또는 300 nm 이하의 분포를 갖도록 얻어지는 것일 수 있으며, 예를 들어 본 발명의 일예에 따른 마그네틱 비드의 제조방법은, 상기 산화철 코어의 지름 길이의 표준편차가 적어도 100 nm이상인 분포를 갖도록 얻어지는 것일 수 있으며, 일예로 100 내지 1000 nm의 표준편차를 가지는 분포로 얻어질 수 있다.
상기 산화철 코어를 얻는 단계에서의 혼합 용액의 부피는, 상기 산화철이 상이한 성장 속도를 가져 다양한 입경을 갖는 산화철 코어로 제조되어, 넓은 크기 분포의 마그네틱 비드가 한 번에 제조될 수 있도록 하는 부피로 설정될 수 있다. 구체적으로, 상기 혼합 용액의 부피가 작을 때에는 균일한 크기의 마그네틱 비드가 제조되나 (실시예 1), 상기 혼합 용액의 부피를 크게 설정할 경우 다양한 크기 분포를 가지는 마그네틱 비드가 제조될 수 있다 (실시예 2). 예를 들어, 상기 혼합 용액의 부피는 200ml 이상, 300ml 이상, 400ml 이상, 500ml 이상, 600ml 이상, 700ml 이상, 800ml 이상, 900ml 이상, 또는 1,000ml 이상일 수 있으나, 통상의 기술자라면 다양한 크기 분포를 가지는 마그네틱 비드를 하나의 공정으로 제조하기 위한 목적 하에서 상기 혼합 용액의 부피를 적절하게 설정할 수 있을 것이다. 또한, 상기 혼합 용액의 부피의 상한값은 100,000 ml 이하, 90,000 ml 이하, 80,000 ml 이하, 70,000 ml 이하, 60,000 ml 이하, 50,000 ml 이하, 40,000 ml 이하, 30,000 ml 이하, 20,000 ml 이하, 10,000 ml 이하, 9,000 ml 이하, 8,000 ml 이하, 7,000 ml 이하, 6,000 ml 이하, 5,000 ml 이하, 4,000 ml 이하, 3,000 ml 이하, 2,000 ml 이하, 또는 1,000 ml 이하일 수 있으나, 통상의 기술자라면 상기 혼합 용액의 부피의 상한값이 설정되지 않더라도, 다양한 크기 분포를 가지는 마그네틱 비드를 하나의 단계로 제조하기 위한 목적하는 바에 따라 상기 혼합 용액의 부피의 하한값만으로도 명확하게 수행할 수 있을 것이다.
상기 산화철 코어, 또는 본 발명의 일예에 따른 마그네틱 비드의 입경 분포가 다양하게 제조될 수 있도록 상기 혼합 용액의 부피가 설정될 수 있으며, 이에 따라 상기 철 전구체 또는 상기 산화제는 적어도 20g 이상, 25g 이상, 30g 이상, 35g 이상, 40g 이상, 45g 이상, 50g 이상, 55g 이상, 60g 이상, 65g 이상, 70g 이상, 75g 이상, 80g 이상, 85g 이상, 90g 이상, 95g 이상, 100g 이상, 110g 이상, 120g 이상, 130g 이상, 140g 이상, 150g 이상, 160g 이상, 170g 이상, 180g 이상, 190g 이상, 200g 이상, 210g 이상, 220g 이상, 230g 이상, 240g 이상, 250g 이상, 260g 이상, 270g 이상, 280g 이상, 290g 이상, 300g 이상, 350g 이상, 400g 이상, 450g 이상, 500g 이상, 600g 이상, 700g 이상, 800g 이상, 900g 이상, 1,000g 이상, 1,500g 이상, 또는 2,000g 이상 혼합될 수 있다. 이때, 상기 철 전구체 또는 상기 산화제는 최대 10,000g 이하, 최대 5,000g 이하, 최대 3,000g 이하, 최대 1,000g 이하, 최대 500g 이하, 최대 200g 이하, 또는 최대 100g 이하로 혼합될 수 있다. 예를 들어, 상기 철 전구체는 혼합용액 1,000ml에 20 내지 100g, 상기 산화제는 혼합용액 1,000ml에 30 내지 200g 혼합될 수 있다.
본 발명의 일예에 따른 마그네틱 비드의 제조방법은, 산화철 코어를 액상 매질에 첨가한 후, 실리카 전구체 용액을 적상하여 상기 산화철 코어를 실리카로 코팅하여 마그네틱 비드를 얻는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 실리카 전구체 용액은 상기 산화철 코어를 실리카로 코팅하기 위해 사용되며, 예를 들어 에틸 실리케이트, 글리시드옥시프로필 트리메톡시 실란, 및 에폭시 시클로 핵실 에틸 트리메톡시 실란으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 실리카 코팅층의 두께는, 10 내지 100 nm, 10 내지 90 nm, 10 내지 80 nm, 10 내지 70 nm, 10 내지 60 nm, 10 내지 50 nm, 10 내지 40 nm, 10 내지 30 nm, 10 내지 20 nm, 20 내지 100 nm, 20 내지 90 nm, 20 내지 80 nm, 20 내지 70 nm, 20 내지 60 nm, 20 내지 50 nm, 20 내지 40 nm, 20 내지 30 nm, 30 내지 100 nm, 30 내지 90 nm, 30 내지 80 nm, 30 내지 70 nm, 30 내지 60 nm, 30 내지 50 nm, 30 내지 40 nm, 40 내지 100 nm, 40 내지 90 nm, 40 내지 80 nm, 40 내지 70 nm, 40 내지 60 nm, 40 내지 50 nm, 50 내지 100 nm, 50 내지 90 nm, 50 내지 80 nm, 50 내지 70 nm, 50 내지 60 nm, 60 내지 100 nm, 60 내지 90 nm, 60 내지 80 nm, 60 내지 70 nm, 70 내지 100 nm, 70 내지 90 nm, 70 내지 80 nm, 80 내지 100 nm, 80 내지 90 nm, 또는 90 내지 100 nm일 수 있다.
본 발명의 일예에 따른 마그네틱 비드는, 상기 산화철 코어에 실리카 층이 코팅되어 제조되기 때문에, 상기 실리카 층이 균일한 두께로 상기 마그네틱 비드에 코팅될 경우, 상기 마그네틱 비드의 지름 길이의 분포는 상기 산화철 코어의 지름 길이의 분포와 동일할 것임을 통상의 기술자가 명확하게 알 수 있을 것이다. 구체적으로, 상기 마그네틱 비드의 지름 길이의 분포는, 표준편차가 100 nm 이상, 110 nm 이상, 120 nm 이상, 130 nm 이상, 140 nm 이상, 150 nm 이상, 160 nm 이상, 170 nm 이상, 180 nm 이상, 190 nm 이상, 200 nm 이상, 210 nm 이상, 220 nm 이상, 230 nm 이상, 240 nm 이상, 250 nm 이상, 260 nm 이상, 또는 270 nm 이상일 수 있고, 1000 nm 이하, 900 nm 이하, 800 nm 이하, 700 nm 이하, 600 nm 이하, 500 nm 이하, 400 nm 이하, 또는 300 nm 이하일 수 있으며, 예를 들어 상기 마그네틱 비드는 지름 길이의 표준편차가 적어도 100 nm이상일 수 있으며, 일예로 100 내지 1000 nm일 수 있다.
본 발명의 일예에 따른 마그네틱 비드의 제조방법은, 제조된 마그네틱 비드들을 크기 순으로 나열하였을 때, 상위 10% 크기의 마그네틱 비드들의 평균 입경 또는 평균 지름값이, 하위 10% 크기의 마그네틱 비드들의 평균 지름값의 1.5배 내지 10배, 1.5배 내지 8배, 1.5배 내지 6배, 1.5배 내지 4배, 1.6배 내지 10배, 1.6배 내지 8배, 1.6배 내지 6배, 1.6배 내지 4배, 1.7배 내지 10배, 1.7배 내지 8배, 1.7배 내지 6배, 1.7배 내지 4배, 1.8배 내지 10배, 1.8배 내지 8배, 1.8배 내지 6배, 1.8배 내지 4배, 1.9배 내지 10배, 1.9배 내지 8배, 1.9배 내지 6배, 1.9배 내지 4배, 2배 내지 10배, 2배 내지 8배, 2배 내지 6배, 2배 내지 4배, 2.5배 내지 10배, 2.5배 내지 8배, 2.5배 내지 6배, 또는 2.5배 내지 4배일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일예에 따른 마그네틱 비드의 제조방법으로 제조된 마그네틱 비드를 이용하여 핵산을 추출하였을 때, 기존 마그네틱 비드를 이용한 경우보다 RNA 추출, 및 DNA 추출의 추출 농도, 추출 순도, Real-time PCR 결과 등에서 우수한 효과를 가짐을 확인하였다 (실험예 4 및 실험예 5). 따라서, 본 발명의 일예에 따른 마그네틱 비드의 제조방법에 의해 제조된 마그네틱 비드는, 입경 분포가 다양하게 제조됨과 동시에, 기존 마그네틱 대비 핵산 추출에 있어서 우수한 효과를 가짐을 알 수 있었다. 즉, 본 발명의 일예에 따른 마그네틱 비드의 제조방법은, 넓은 입경 분포를 가지도록 마그네틱 비드가 제조됨에도 불구하고, 특정 입경을 가지는 마그네틱 비드들을 분리하는 별도의 분리 공정을 거치지 않더라도, 핵산 추출의 효율이 기존 마그네틱 비드 보다 더욱 우수하였다.
본 발명의 일예에 따른 마그네틱 비드의 제조방법은, 액상 매질에서 마그네틱 비드를 분리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 마그네틱 비드를 분리하는 단계는, 상기 산화철 코어를 실리카로 코팅하여 마그네틱 비드를 얻은 뒤, 이를 액상 매질로부터 분리하는 단계이며, 제조된 마그네틱 비드를 액상 매질로부터 분리하는 형태, 혹은 제조된 마그네틱 비드를 크기에 따라 2 이상의 집합으로 분리하는 형태를 모두 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 마그네틱 비드를 분리하는 단계는, 상기 얻어진 마그네틱 비드들의 입경 분포에서, 특정 입경 범위를 갖는 마그네틱 비드의 집합을 분별하여 분리하는 것일 수 있다.
본 발명의 일예에 따른 마그네틱 비드의 제조방법은, 특정 입경을 가지는 마그네틱 비드들을 분리하는 별도의 분리 공정을 거치지 않더라도, 핵산 추출의 효율이 기존 마그네틱 비드 보다 더욱 우수하였다 (실험예 4 및 실험예 5). 그럼에도 불구하고, 마그네틱 비드의 핵산 추출 효율을 더욱 높이기 위해서, 핵산 추출에 보다 적합한 입경을 가지는 마그네틱 비드를 분리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일예로, 상기 분리하는 단계는, 제조된 마그네틱 비드를 10 내지 300rpm의 속도로 원심분리하여 분리하는 것일 수 있으며, 상기 분리된 마그네틱 비드의 평균 지름은 1,000 내지 1,500 nm일 수 있다. 이때, 상기 분리된 마그네틱 비드는 진단 검출 용도로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일예로, 상기 분리하는 단계는, 제조된 마그네틱 비드를 300 내지 800rpm의 속도, 예를 들어 500rpm의 속도로 원심분리하여 분리하는 것일 수 있으며, 상기 분리된 마그네틱 비드의 평균 지름은 500 내지 1,000 nm, 예를 들어 600 내지 700 nm일 수 있다. 이때, 상기 분리된 마그네틱 비드는 핵산 추출 용도, 예를 들어 핵산 자동화 추출장비에 적용되는 용도로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 핵산은 DNA, RNA 또는 이들의 변이체를 포함하며, 상기 RNA의 예는 rRNA, mRNA, 및 tRNA 등으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다.
일예로, 상기 분리하는 단계는, 제조된 마그네틱 비드를 900 내지 1,500 rpm, 900 내지 2,000 rpm, 900 내지 3,000 rpm, 900 내지 5,000 rpm, 900 내지 7,000 rpm, 900 내지 9,000rpm, 또는 900 내지 10,000 rpm의 속도, 예를 들어 1,000 rpm, 5,000 rpm, 또는 10,000 rpm의 속도로 원심분리하여 분리하는 것일 수 있으며, 상기 분리된 마그네틱 비드의 평균 지름은 50 내지 500 nm일 수 있다. 이때, 상기 분리된 마그네틱 비드는 약물 전달체 용도로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 마그네틱 비드는 동일한 rpm에서 원심분리 시간을 증가시킬 경우 분리되지 않고 하나의 집합을 유지하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일예에 따른 마그네틱 비드의 제조방법은, 1회 제조 시 적어도 5g 이상, 6g 이상, 7g 이상, 또는 8g 이상의 마그네틱 비드를 얻는 것일 수 있다. 이때, 상기 마그네틱 비드의 1회 제조 시 최대 합성량은 1,000g 이하, 500g 이하, 300g 이하, 200g 이하, 100g 이하, 80g 이하, 60g 이하, 50g 이하, 30g 이하, 20g 이하, 또는 10g 이하일 수 있다.
이에, 본 발명의 일예에 따른 마그네틱 비드의 제조방법은, 1회 제조 시 적어도 5g 이상의 대량의 마그네틱 비드를 제조할 수 있으면서도, 제조된 마그네틱 비드는 다양한 입경 분포를 가지므로, 제조된 마그네틱 비드를 특정 원심분리 속도로 2 이상의 집합으로 분리하여, 다양한 용도로 사용될 수 있는 마그네틱 비드를 하나의 공정으로 제조할 수 있다.
본 발명의 일예에 따른 마그네틱 비드의 제조방법은, Fe3O4를 합성하는 단계; 및 실리카를 코팅하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일예에 따른 마그네틱 비드의 제조방법은, 염화철제2철6수화물, 소듐 아세테이트, 증류수, 및 에틸렌 글리콜을 혼합하는 단계; 상기 혼합용액을 건조하여 산화철을 수득하는 단계; 및 상기 산화철에 에틸 실리케이트를 적상하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 제조방법은, 상기 에틸 실리케이트를 적상하는 단계 후, 극성 용매로 세척하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 극성 용매는 물, 에탄올과 같은 알코올계, 아세톤과 같은 케톤계, 디에틸에테르와 같은 에테르계, 및 디클로로벤젠과 같은 벤젠계 중에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 일예에 따른 마그네틱 비드의 제조방법은, 염화제2철6수화물, 소듐아세테이트, 증류수 및 에틸렌글리콜을 혼합하여 혼합용액을 제조하는 단계; 상기 혼합용액을 균질화하는 단계; 상기 균질화된 혼합용액을 증류수로 씻어내는 단계; 상기 증류수로 씻어낸 혼합용액을 진공건조하여 산화철을 수득하는 단계; 상기 산화철을 에탄올에 현탁시키는 단계; 상기 현탁된 산화철을 소니케이션 하는 단계; 상기 산화철을 증류수, 에탄올, 및 암모니아수와 혼합하는 단계; 상기 혼합액을 소니케이션하는 단계; 상기 혼합액에 에틸 실리케이트를 적상하는 단계; 상기 용액을 혼합하는 단계; 상기 혼합액을 극성 용매로 씻어내는 단계; 상기 혼합액에서 자성을 가지는 입자를 분리하는 단계; 및 상기 분리된 입자를 진공건조하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 극성 용매는 물, 에탄올과 같은 알코올계, 아세톤과 같은 케톤계, 디에틸에테르와 같은 에테르계, 및 디클로로벤젠과 같은 벤젠계 중에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다. 보다 바람직하게, 상기 극성 용매는 에탄올일 수 있다.
본 발명의 일예에 따른 마그네틱 비드의 제조방법은, 제조된 마그네틱 비드를 자석을 이용하여 분리하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일예에 따른 마그네틱 비드의 제조방법은, 상기 분리된 마그네틱 비드를 진공건조하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일예에 따른 핵산 추출 방법은, 혼합 용액을 균질화하여 산화철 코어를 얻는 단계; 상기 산화철 코어를 액상 매질에 첨가한 후, 실리카 전구체 용액을 적상하여 상기 산화철 코어를 실리카로 코팅하여 마그네틱 비드를 얻는 단계; 및 상기 마그네틱 비드를 이용하여 시료로부터 핵산을 추출하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 혼합용액은, 혼합 용액 1,000ml 당 철 전구체를 적어도 5g 이상, 10 g 이상, 15g 이상, 20g 이상, 25g 이상, 30g 이상, 35g 이상 포함할 수 있고, 이 때 상기 혼합 용액 1,000ml 당 포함되는 철 전구체 중량의 상한값이 특정되지 않더라도 목적하는 마그네틱 비드를 제조하기 위해 통상의 기술자가 적절하게 선택할 수 있을 것이며, 일예로 500g 이하, 300g 이하, 100g 이하, 50g 이하, 또는 40g 이하일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 혼합용액은, 혼합 용액 1,000ml 당 산화제를 적어도 20g 이상, 25g 이상, 30g 이상, 35g 이상, 40g 이상, 45g 이상, 50g 이상, 또는 55g 이상 포함할 수 있고, 이 때 상기 혼합 용액 1,000ml 당 포함되는 산화제 중량의 상한값이 특정되지 않더라도 목적하는 마그네틱 비드를 제조하기 위해 통상의 기술자가 적절하게 선택할 수 있을 것이며, 일예로 800g 이하, 500g 이하, 300g 이하, 100g 이하, 또는 60g 이하일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 혼합용액의 부피는 적어도 500ml 이상, 600ml 이상, 700ml 이상, 800ml 이상, 900ml 이상, 또는 1,000ml 이상일 수 있으며, 이 때 상기 혼합용액 부피의 상한값이 특정되지 않더라도 목적하는 마그네틱 비드를 제조하기 위해 통상의 기술자가 적절하게 선택할 수 있을 것이며, 일예로 10,000ml 이하, 9,000ml 이하, 8,000ml 이하, 7,000ml 이하, 6,000ml 이하, 5,000ml 이하, 4,000ml 이하, 3,000ml 이하, 2,000ml 이하, 1,500ml 이하, 또는 1,200ml 이하일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 핵산을 추출하는 단계는 핵산 추출 자동화 장비를 이용하여 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 일예에 따른 핵산 추출 방법은, 본 발명의 일예에 따른 입상 조성물 (마그네틱 비드)을 이용하여, 시료에서 핵산을 추출하는 단계를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 시료 및 입상 조성물을 혼합하는 단계; 혼합액을 씻어내는 단계; 및 완충액에 용해시키는 단계를 포함할 수 있다.
상기 시료 및 입상 조성물을 혼합하는 단계는, 용균(lysis) 및 핵산이 마그네틱 비드로 흡착되는 단계로, 추출 시약과 마그네틱 비드가 함께 혼합되는 단계이다. 이 과정에서 시료로부터 핵산이 추출되고, 추출된 핵산은 마그네틱 비드로 흡착된다.
상기 혼합액을 씻어내는 단계는, 핵산 washing I/washing II 과정으로, 마그네틱 비드와 흡착된 핵산 이외의 불순물이 제거되며, 결과에 영향을 끼칠 수 있는 불순물을 제거하는 과정이다.
상기 완충액에 용해시키는 단계는, 핵산의 용출(elution) 과정으로, 불순물이 제거된 핵산이 완충액에 용해되는 과정이다. 이러한 과정을 거쳐 효율적인 고순도의 핵산을 추출할 수 있다.
상기 시료는, 세포, 조직, 혈액, 소변, 머리카락, 대변, 손톱, 혈장, 객담, 및 타액 등으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 일예에 따른 마그네틱 비드의 제조방법은, 마그네틱 비드의 대량 생산이 가능하며, 다양한 크기를 가지는 마그네틱 비드를 한 번에 합성 후 분리하여 마그네틱 비드의 사용 용도에 따라 광범위하게 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 일예에 따른 마그네틱 비드는 핵산 추출 효율이 높아 효율적인 고순도의 핵산을 추출할 수 있다.
본 발명의 일예에 따른 마그네틱 비드는, 기존의 마그네틱 비드 대비 높은 핵산 추출율을 가지며, 기존의 마그네틱 비드와 동등 이상의 추출 순도를 가질 수 있다.
본 발명의 일예에 따른 핵산 추출용 입상 조성물의 제조방법은, 대량생산으로 scale-up 하여도 안정적인 핵산 추출용 입상 조성물 제조가 가능하여, 생산 속도 및 생산 효율을 높일 수 있으며, 제조된 핵산 추출용 입상 조성물은 기존 제품 대비 높은 핵산 추출 농도를 보이고, 추출된 핵산의 순도 또한 높아, 효율적인 핵산 추출이 가능한 기술적 효과가 존재한다.
도 1a는 본 발명에 따른 마그네틱 비드를 제조하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 1b는 좌측부터 산화철(Fe3O4), 및 Fe3O4@SiO2 마그네틱 비드의 SEM 현미경 사진과, Fe3O4@SiO2 마그네틱 비드의 구조를 나타낸 것이다.
도 2a는 균질화 시간이 상이하게 제조된 마그네틱 비드를 핵산 추출 자동화 장비 (Nextractor)에 적용한 모습을 나타낸 도면으로, 도 2a의 상단은 핵산을 추출하기 전의 모습을 나타낸 도면이고, 도 2a의 하단은 핵산을 추출한 후의 모습을 나타낸 도면이다.
도 2b는 균질화 시간을 더욱 세분화하여 제조된 마그네틱 비드를 핵산 추출 자동화 장비 (Nextractor)에 적용한 모습을 나타낸 도면으로, 도 2b의 상단은 핵산을 추출하기 전의 모습을 나타낸 도면이고, 도 2b의 하단은 핵산을 추출한 후의 모습을 나타낸 도면이다.
도 3은 철 전구체 및 산화제를 다양한 혼합비로 설정하여 마그네틱 비드를 제조하는 과정을 나타낸 도면으로, 도 3의 위는 합성된 산화철 코어가 포함되어 있는 혼합 용액의 사진이고, 아래는 합성된 산화철 코어가 포함되어 있는 혼합 용액을 자석과 일정 시간 (1분, 5분, 20분, 및 3시간) 접촉한 뒤의 사진이다.
도 4a는 실시예 1의 마그네틱 비드의 TEM 사진이다.
도 4b는 비교예 2의 마그네틱 비드의 TEM 사진이다.
도 4c는 실시예 1의 마그네틱 비드의 TEM 및 SEM 사진이다.
도 4d는 실시예 2의 마그네틱 비드의 TEM 사진이다.
도 4e는 실시예 2의 마그네틱 비드의 SEM 사진이다.
도 5a는 실시예 1, 비교예 1, 및 비교예 2의 마그네틱 비드의 포화자기도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5b는 비교예 1, 및 실시예 2의 마그네틱 비드의 포화자기도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6a는 비교예 1의 마그네틱 비드의 입자 크기 분포를 나타낸 것이다.
도 6b는 실시예 2의 마그네틱 비드의 입자 크기 분포를 나타낸 것이다.
도 7a는 실시예 2에서 합성된 마그네틱 비드를 400rpm에서 5분, 10분, 30분, 또는 60분 간 원심분리한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7b는 실시예 2에서 합성된 마그네틱 비드를 500rpm, 1,000rpm, 5,000rpm, 및 10,000rpm에서 10분 간 원심분리한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8a는 비교예 1 및 실시예 2의 마그네틱 비드를 사용하여 추출한 RNA의 농도 및 순도를 측정한 NanoDrop 결과이다.
도 8b는 비교예 1 및 실시예 2의 마그네틱 비드를 사용하여 추출한 RNA를 아가로즈 겔에 전기영동한 밴드 결과를 나타낸 것이다.
도 8c는 실시예 2 및 비교예 1의 마그네틱 비드를 이용하여 RNA를 추출한 결과를 그래프로 나타낸 것으로, 도 5c의 각 그래프는 좌측 상단부터 시계방향 순서로, RNA 농도, RNA 순도, real-time PCR 결과, 및 dsRNA 수율을 나타낸 것이다.
도 9a는 비교예 1, 비교예 2, 및 실시예 1의 마그네틱 비드를 사용하여 추출한 DNA의 농도 및 순도를 측정한 NanoDrop 결과이다.
도 9b는 비교예 1, 비교예 2, 및 실시예 1의 마그네틱 비드를 사용하여 추출한 DNA를 아가로즈 겔에 전기영동한 밴드 결과를 나타낸 것이다.
도 10a는 비교예 1, 및 실시예 2의 마그네틱 비드를 사용하여 추출한 DNA의 농도 및 순도를 측정한 NanoDrop 결과이다.
도 10b는 비교예 1 및 실시예 2의 마그네틱 비드를 이용하여 추출된 DNA를 4ul씩 로딩하여 150V로 15분 간 전기영동한 결과를 나타낸 것이다.
도 10c는 비교예 1, 및 실시예 2의 마그네틱 비드를 이용하여 DNA를 추출한 결과를 그래프로 나타낸 것으로, 도 10c의 각 그래프는 좌측 상단부터 시계방향 순서로, DNA 농도, DNA 순도, real-time PCR 결과, 및 dsRNA 수율을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
비교예 1: BIONEER 비드
비교예로서, AccuBeadTM Magnetic Beads (Bioneer, Cat no. TS-1010-3)를 사용하였다.
비교예 2: 고센 비드
비교예로서, G-mag sio2, magnetic bead (Goshen bio bead, Pd no. 3020506)를 사용하였다.
실시예 1: 마그네틱 비드의 제조 (1)
본 발명의 일예에 따른 마그네틱 비드를 제조하는 과정에 대한 모식도를 도 1a에 나타낸다.
비드 제조를 위한 재료로서, 염화제2철6수화물(FeCl3.6H2O), 에탄올, 암모니아수(NH4OH), 및 에틸 실리케이트(SiC8H20O4, TEOS)는 한국, 대정화금에서 구입하여 사용하였고, 소듐 아세테이트(NaOAc) 및 에틸렌글리콜(EG)은 미국, Sigma-Aldrich에서 구입하여 사용하였다.
구체적으로, 제1단계로서 염화제2철6수화물(Iron(Ⅲ) chloride hexahydrate, FeCl3.6H2O) 2.7g, 소듐 아세테이트(NaOAc) 4.1g, 및 증류수(DW) 5.7ml를 100ml의 에틸렌글리콜(ethylene glycol)에 녹여 혼합하였다. 얻어진 혼합용액을 150℃에서 24시간 동안 균질화 후, 증류수(DW)로 씻어낸 뒤 진공건조하여, 산화철 코어를 수득하였다. 수득된 산화철코어의 질량을 측정하여 하기 표 1에 나타내었다.
제2단계로서, 상기 얻어진 산화철 코어(Fe3O4) 0.8g을 에탄올 8ml에 현탁시키고, 3분간 소니케이션(sonication) 하였다. 산화철 코어 입자를 플라스크로 옮기고, 증류수(DW) 40ml, 에탄올 12ml, 및 24%(v/v) 암모니아수(NH4OH) 1.6ml와 혼합하였다. 입자를 분산시키기 위해 3분간 소니케이션(sonication) 후, 에틸 실리케이트(TEOS) 6.4ml를 적상(dropwise)하였다. 상기 혼합물을 실온에서 12시간 동안 격렬하게 흔들어주며(vigorous shaking) 반응시킨 후, 에탄올로 씻어내었다. 55℃에서 진공건조하여, Fe3O4@SiO2 마그네틱 비드를 얻었다.
위와 같은 방법으로 얻어진 산화철 코어(Fe3O4)와, 실리카로 코팅된 산화철 코어를 포함하는 마그네틱 비드의 질량을 측정하여 아래 표 1에 나타내었다. 상기 실험 결과, 실시예 1의 방법으로 마그네틱 비드를 제조하는 경우, 한 번에 최대 약 1g의 마그네틱 비드를 합성할 수 있었다.
구분 Fe3O4 Fe3O4@SiO2
실시예 1 823mg 1100mg
또한, 위와 같은 방법으로 얻어진 산화철 코어(Fe3O4)와, 실리카로 코팅된 산화철 코어를 포함하는 마그네틱 비드를 SEM 현미경으로 조사한 결과를 도 1b에 나타내었다. 도 1b는 산화철 코어(Fe3O4), 및 Fe3O4@SiO2 마그네틱 비드의 SEM 현미경 사진과, Fe3O4@SiO2 마그네틱 비드의 구조를 나타낸 것이다. 도 1b에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 방법으로 제조된 산화철 코어(Fe3O4)와 마그네틱 비드는 구형이며, 마그네틱 비드는 산화철 코어와 이를 둘러싼 외부의 쉘을 포함하는 구조임을 확인하였다.
실시예 2: 마그네틱 비드의 제조 (2)
염화제2철6수화물(Iron(Ⅲ) chloride hexahydrate, FeCl3.6H2O) 27g, 및 소듐 아세테이트(NaOAc) 41g을 증류수(DW) 57ml에 녹인 뒤, 에틸렌글리콜(ethylene glycol) 1L를 첨가하였다. 얻어진 혼합용액을 150℃에서 24시간 동안 균질화 후, 증류수(DW)로 씻어낸 뒤, 55℃에서 진공건조하여, 산화철 코어를 수득하였다. 수득된 산화철 코어의 질량을 표 2에 나타내었다.
상기 얻어진 산화철 코어(Fe3O4) 8g을 에탄올 80ml에 현탁시키고, 3분간 소니케이션(sonication) 하였다. 현탁액에서 산화철 코어 입자를 분리하여 플라스크로 옮기고, 증류수(DW) 400ml, 에탄올 120ml, 및 24%(v/v) 암모니아수(NH4OH) 16ml와 혼합하였다. 입자를 분산시키기 위해 3분간 소니케이션(sonication) 후, 에틸 실리케이트(TEOS) 64ml를 적상(dropwise)하였다. 상기 혼합물을 실온에서 12시간 동안 격렬하게 흔들어주며(vigorous shaking) 반응시킨 후, 에탄올로 씻어내었다. 자성이 강한 자석을 이용하여 제조된 마그네틱 비드를 분리해내었다. 자석에 비드를 30초간 붙여 상층액을 제거하였으며, 자성이 약하여 자석에 붙지 못한 작은 크기의 비드는 제거되었다. 자석으로부터 비드를 떼어낸 뒤 55℃에서 진공건조하여, Fe3O4@SiO2 마그네틱 비드를 얻었다.
위와 동일한 방법으로 3번 반복 (실시예 2-1 내지 2-3)하였고, 얻어진 산화철(Fe3O4) 및 마그네틱 비드의 질량을 아래 표 2에 나타내었다.
구분 Fe3O4 Fe3O4@SiO2
실시예 2-1 8.3g 8.3g
실시예 2-2 8.0g 8.6g
실시예 2-3 8.2g 8.1g
그 결과, 3번의 합성 모두 비슷한 양의 산화철 코어 및 마그네틱 비드를 얻을 수 있었고, 합성의 재연성이 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 한 번의 합성에서 8g 이상의 마그네틱 비드를 얻을 수 있어, 대량 생산이 가능함을 확인할 수 있었다.
실시예 3: 균질화 시간 변화에 따른 마그네틱 비드의 제조
(1) 균질화 시간 변화에 따른 마그네틱 비드의 제조 효율 변화
실시예 2와 실질적으로 동일한 방법으로 수행하되, 제1단계로서 산화철 코어의 제조과정에서 균질화 시간을 다양하게 설정하여 제조된 마그네틱 비드의 자성 및 핵산 추출 효율을 측정하였다.
구체적으로, 실시예 2에 따른 산화철 코어의 제조과정에서 혼합용액의 균질화 시간을 5시간 (실시예 3-1), 12시간 (실시예 3-2), 24시간 (실시예 3-5), 및 42시간 (실시예 3-8)으로 설정하여 수행하였으며, 균질화 시간 외의 조건은 동일하게 수행하였다. 그 결과를 도 2a에 나타내었다. 도 2a의 상단은 마그네틱 비드를 이용하여 핵산을 추출하기 전 핵산 자동화 추출 키트의 모습을 나타낸 사진이고, 도 2a의 하단은 마그네틱 비드를 이용하여 핵산을 추출한 후 핵산 자동화 추출 키트의 모습을 나타낸 사진이다.
다음으로, 균질화 시간을 더욱 세분화하여, 실시예 2에 따른 산화철 코어의 제조과정에서 혼합용액의 균질화 시간을 5시간 (실시예 3-1), 12시간 (실시예 3-2), 15시간 (실시예 3-3), 18시간 (실시예 3-4), 24시간 (실시예 3-5), 30시간 (실시예 3-6), 36시간 (실시예 3-7), 및 42시간 (실시예 3-8) 으로 설정하여 수행하였으며, 균질화 시간 외의 조건은 동일하게 수행하였다. 그 결과를 도 2b에 나타내었다. 도 2b의 상단은 실시예 3의 마그네틱 비드들을 추출하기 전의 사진이고, 도 2b의 하단은 실시예 3의 마그네틱 비드들을 추출한 후의 사진이다.
구체적으로, 균질화 시간을 달리하여 합성된 실시예 3의 마그네틱 비드를 추출 시약 (Wash1 칸)에 0.8mg (1X), 1.6mg (2X), 3.2mg (4X), 및 6.4mg (8X)로 각 농도별로 추출 시약에 첨가하였다. Lysis 용액이 들어있는 Lysis 칸에 핵산 추출을 위한 시료를 첨가 후, 핵산 추출 자동화 장비 (Nextractor)에 적용시켰다. Wash1 칸에 첨가된 마그네틱 비드가 Lysis 칸으로 옮겨져 시료 내의 핵산이 추출되었으며, 핵산과 결합된 마그네틱 비드가 Wash1 및 Wash2 칸으로 순차적으로 옮겨져 불순물의 washing 과정을 거친 뒤, 마지막 칸인 elution 칸으로 옮겨져 핵산과 마그네틱 비드가 분리되었다. 마지막으로, elution 칸에서 추출물과 분리된 마그네틱 비드를 일정한 자성 세기를 가지는 자석 막대를 사용하여 Wash2 칸으로 옮겼으며, 시료에서 추출된 핵산을 얻을 수 있었다. 최종 추출물에 불순물이 포함되었는지 확인하기 위해, 마그네틱 비드를 이용하여 핵산을 추출 후, 일정한 자성 세기를 가지는 자석 막대에 의해서 옮겨지고 남은 마그네틱 비드의 양을 관찰하였다.
핵산 추출 전 (도 2a 상단 및 도 2b 상단)에는 실시예 3-5 (24시간)를 포함하여 실시예 3-4 (18시간) 내지 실시예 3-6 (30시간) 에서 마그네틱 비드의 색이 가장 검정색에 가까운 것을 확인할 수 있었다. 또한, 핵산 추출 자동화 장비를 이용하여 핵산 추출 후 (도 2a 하단 및 도 2b 하단)에는 실시예 3-5의 경우 Lysis/Wash1/Elution 단계에 남겨진 비드의 양이 확연히 줄어드는 것을 확인할 수 있었으며, 실시예 3-4 (18시간) 내지 실시예 3-6 (30시간) 에서 elution 칸에 비드가 남지 않아, 검출단계에서 민감도를 떨어트리는 문제점이 없었다. 한편, 실시예 3-4 (18시간) 내지 실시예 3-6 (30시간)의 사진을 보면, waste (Wash2) 칸의 비드 양이 일관되게 높은 것을 확인할 수 있었고, 따라서 산화철 코어의 제조과정에서 균질화 시간을 18시간 내지 30시간 범위로 하는 것이 바람직함을 확인할 수 있었다. 또한, 실시예 3-4 내지 실시예 3-6의 경우 코어 사이즈가 적절하게 형성되어 응집 (aggregation)이 발생하지 않고, 핵산 추출 자동화 장비를 이용한 추출과정 동안, 핵산이 흡착된 비드들이 덩어리를 이루지 않고, strip에 붙지 않아 이동성이 우수하였다.
(2) 균질화 시간 변화에 따른 마그네틱 비드의 크기 분포
실시예 1과 실질적으로 동일한 방법으로 수행하되, 산화철 코어의 제조과정에서 균질화 시간을 다양하게 설정하여 제조된 마그네티 비드의 크기 분포를 분석해보았다.
구체적으로, 실시예 1에서 혼합용액의 균질화 시간을 5시간, 12시간, 또는 24시간으로 설정하여 수행하였으며, 균질화 시간 외의 조건은 동일하게 수행하였다. 상기 제조된 비드들의 평균 지름 및 표준편차를 표 3에 나타냈다.
구분 Effective Diameter (nm) Polydispersity Average Count Rate (kcps)
5시간 344.1±18.2 0.013 950
12시간 638.0±45.1 0.005 745
24시간 641.8±82.0 0.028 1300
실시예 1과 같이 마그네틱 비드를 제조할 경우, 균질화 시간이 길어짐에 따라 평균 비드 지름이 커졌으나, 균질화 시간이 변화하더라도 합성된 마그네틱 비드의 지름의 표준편차는 100nm 미만으로 작았다. 특히, 중량평균분자량/수량평균분자량을 나타내는 다분산성지수 (polydispersity index, PDI)로 크기 분포를 확인할 수 있으며 PDI가 1에 가까울수록 다분산에 가깝다고 할 수 있다. 실시예 1과 같이 소량 합성할 경우 산화철 코어를 형성하는 철 이온의 충돌 빈도가 비교적 균일하여 산화철 코어의 입경이 비교적 균일하게 형성되었으며, PDI 값이 0.1 이하로 측정되었으며, 이는 비교적 단분산 입자라고 판단할 수 있었다. 따라서 실시예 1의 제조방법은 균질화 시간에 무관하게 균일한 마그네틱 비드의 제조가 가능함을 알 수 있었다.
실시예 4: 철 전구체 및 산화제의 혼합비에 따른 마그네틱 비드의 제조
실시예 2와 실질적으로 동일한 방법으로 수행하되, 산화철 코어의 제조과정에서 소듐 아세테이트 (NaOAc)의 첨가량을 20.5g (기존 대비 50%), 30.8g (기존 대비 약 75%), 41g (기존 대비 100%), 61.5g (기존 대비 150%), 또는 82g (기존 대비 200%) 첨가하여 혼합용액을 제조하고, 150℃에서 24시간 동안 균질화 후, 증류수(DW)로 씻어낸 뒤, 55℃에서 진공건조하여, 산화철 코어를 제조하였다. 상기 산화철 코어를 제조하는 과정에서 혼합용액의 사진 및 혼합용액을 자석과 일정 시간 접촉한 모습을 나타낸 사진을 도 3에 나타내었다. 도 3에서 위 사진은 합성된 산화철 코어가 포함되어 있는 혼합 용액의 사진이고, 아래 사진은 합성된 산화철 코어가 포함되어 있는 혼합 용액을 자석과 일정 시간 (1분, 5분, 20분, 및 3시간) 접촉한 뒤의 사진이다.
소듐 아세테이트 (NaOAc) 농도가 증가할수록 pH가 낮아지면서 입자의 색이 밝은 갈색으로 변했으며, 마그네틱 비드의 자력과 합성량을 모두 고려해보았을 때 철 전구체와 산화제의 혼합 중량비는 1:1 내지 1:2.5가 바람직한 것을 알 수 있었다. 구체적으로, 철 전구체 대비 산화제의 함량이 지나치게 높아 pH가 너무 낮으면, 입자의 내부 성분이 변하거나 분해될 우려가 있고, 철 전구체 대비 산화제의 함량이 지나치게 적어 pH가 너무 높으면, 산화되지 않은 내부의 FeO 부분이 충분히 제거되지 않을 수 있다. 한편, 산화제인 소듐 아세테이트를 기존 대비 75% 내지 150%로 사용할 경우에, Fe 성분이 변성되지 않아 산화철 코어가 자성을 잃지 않았으며, 자석에 부착되는 입자량을 유지할 수 있었다. 따라서, 철 전구체와 산화제의 혼합 중량비는 1:1 내지 1:2.5의 중량비로 사용하는 것이 효율적 마그네틱 비드의 제조에 바람직함을 확인하였다.
실험예 1: 마그네틱 비드의 평균 입경
실시예 1, 비교예 1, 및 비교예 2의 마그네틱 비드를 투과전자현미경(TEM) 또는 주사전자현미경(SEM)을 이용하여 관찰하였다. 도 4a는 실시예 1의 마그네틱 비드의 TEM 사진이다. 도 4b는 비교예 2의 마그네틱 비드의 TEM 사진이다. 도 4c는 실시예 1의 마그네틱 비드의 TEM 및 SEM 사진이다. 실시예 1, 비교예 1, 및 비교예 2의 마그네틱 비드의 평균 크기를 측정하여 아래 표 4에 나타내었다.
구분 평균 입경 (nm)
비교예 1 200
비교예 2 550
실시예 1 650
실시예 2 600
또한, 실시예 2의 마그네틱 비드를 투과전자현미경(TEM) 및 주사전자현미경(SEM)을 이용하여 관찰하였다. 도 4d는 실시예 2의 마그네틱 비드의 TEM 사진이다. 도 4e는 실시예 2의 마그네틱 비드의 SEM 사진이다. 실시예 2의 마그네틱 비드의 평균 입경를 측정하여 표 4에 나타내었다.
그 결과, 도 4a 내지 도 4e의 전자현미경 사진에서 나타낸 것과 같이, 비교예 1의 마그네틱 비드는 사각 모양임에 반해, 실시예 1 및 실시예 2의 마그네틱 비드는 구의 형태를 가짐을 확인하였다.
실험예 2: 마그네틱 비드의 포화자기도 분석
2-1: 실시예 1 및 비교예 1 내지 2의 포화자기도 측정
실시예 1, 비교예 1, 및 비교예 2의 마그네틱 비드를 진동시료 자화율측정기(Vibrating Sample Magnetometer, VSM)를 이용하여 포화자기도를 측정하였다.
구체적으로, 한국기초과학연지원연구원에 분석을 의뢰하였으며, 샘플 7mg, 온도 300K, VSM Mode, -1.5T ~ 1.5T 에서 측정하였으며, Peak amplitude 2mm, averaging time 2초, Sweep rate 700Oe/sec 로 측정하였다.
그 결과를 표 5 및 도 5a에 나타내었다. 도 5a는 실시예 1, 비교예 1, 및 비교예 2의 마그네틱 비드의 포화자기도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
구분 VSM (emu/g)
비교예 1 49.2
비교예 2 64.9
실시예 1 91.9
추출자동화장비를 사용한 핵산 추출과정에서 잔여 비드 없이 진행되기 위해서는, 마그네틱 비드의 포화자기도가 40eum/g 이상이면 바람직하므로, 실시예 1의 마그네틱 비드를 핵산 추출에 사용 가능함을 확인하였다.
2-2: 실시예 2 및 비교예 1의 포화자기도 측정
실시예 2 및 비교예 1의 마그네틱 비드를 진동시료 자화율측정기(Vibrating Sample Magnetometer, VSM)를 이용하여 포화자기도를 측정하였다.
구체적으로, 한국기초과학연지원연구원에 분석을 의뢰하였으며, 샘플 3.5mg, 온도 300K, VSM Mode, -1.5T ~ 1.5T 에서 측정하였으며, Peak amplitude 5mm, averaging time 5초, Sweep rate 500Oe/sec 로 측정하였다.
그 결과를 표 6 및 도 5b에 나타내었다. 도 5b는 비교예 1, 및 실시예 2의 마그네틱 비드의 포화자기도를 측정한 결과를 나타낸 것이다. 실시예 2의 마그네틱 비드의 포화자기도는 평균 50.0emu/g로 관측되었다.
구분 VSM (emu/g)
비교예 1 39.2
실시예 2-1 54.3
실시예 2-2 53.0
실시예 2-3 54.5
추출자동화장비를 사용한 핵산 추출과정에서 잔여 비드 없이 진행되기 위해서는, 마그네틱 비드의 포화자기도가 40eum/g 이상이면 바람직하므로, 실시예 2의 마그네틱 비드를 핵산 추출에 사용 가능함을 확인하였다.
실험예 3: 마그네틱 비드의 크기 분포
실시예 1 및 실시예 2에서 제조된 마그네틱 비드의 크기 분포를 분석하기 위해 동적광산란(Dynamic Light Scattering, DLS) 분석을 수행하였다.
구체적으로, Brookhaven Instruments Co.의 ZetaPlus Particle Sizing software version 5.29 사용하여 측정하였으며, 실시예 1 및 실시예 2의 비드 20mg을 1ml 증류수(DW)에 분산시킨 후, 25℃온도, 670nm 파장에서 30초씩 3번 측정하였다.
상기 동적광산란 분석 결과를 표 7 및 도 6a 내지 도 6b에 나타내었다. 도 6a는 실시예 1의 마그네틱 비드의 입자 입경 분포를 나타낸 것이고, 도 6b는 실시예 2의 마그네틱 비드의 입자 입경 분포를 나타낸 것이다.
구분 Effective Diameter (nm) Polydispersity Average Count Rate (kcps)
실시예 1 638.0±45.1 0.005 745.0
실시예 2 599.3±272.7 0.190 947.0
동적광산란 분석 결과, 실시예 1과 같은 소량 제조에 비해, 실시예 2와 같은 대량 제조의 경우 다양한 크기 분포를 갖는 마그네틱 비드를 한 번에 제조할 수 있었다. 따라서, 넓은 크기 분포를 갖는 마그네틱 비드를 한 번에 대량 합성이 가능하였다. 즉, 마그네틱 비드의 대량 합성의 경우 많은 양의 마그네틱 비드를 합성할 수 있을 뿐만 아니라, 넓은 크기 분포를 갖는 마그네틱 비드가 한꺼번에 합성되어, 마그네틱 비드를 다양한 목적에 따라 광범위하게 사용 가능할 수 있었다. 특히, 실시예 2의 경우 실시예 1과 달리 다분산성지수 (polydispersity index, PDI) 값이 약 40 배 크게 나타나, 다분산 입자로 판단되었다.
실시예 2에서 넓은 입경 분포를 가지는 마그네틱 비드가 제조되는 이유를 명확하게 알 수는 없었으나, 마그네틱 비드 제조 시 산화철, 산화제, 및 용매의 혼합용액의 부피가 실시예 1보다 실시예 2에서 더 컸으므로, 실시예 2의 경우 반응 부피가 커서 입자들의 운동성이 증가되어 입자의 크기가 다양하게 형성되었다. 또한, 상기 혼합용액의 균질화 과정에서 산화철 간의 충돌 빈도가 일정하지 않았으며, 이에 산화철 간의 충돌 빈도의 상이함에 의해 산화철 코어의 성장속도가 상이하여 다양한 입경을 가지는 산화철 코어가 제조된 것으로 추론되었다.
실시예 5: 마그네틱 비드의 크기 별 분리
실시예 2에서 넓은 입경 분포를 갖는 대량 합성된 마그네틱 비드를 입자 크기별로 분별하였다.
(1) 원심분리 시간에 따른 마그네틱 비드의 분리
실시예 2에서 합성된 마그네틱 비드를 400rpm에서 5분, 10분, 30분, 또는 60분 간 원심분리하였다. 그 결과를 표 8 및 도 7a에 나타냈다.
Figure pat00002
(2) 원심분리 속도에 따른 마그네틱 비드의 분리
실시예 2에서 합성된 마그네틱 비드를 500rpm, 1,000rpm, 5,000rpm, 및 10,000rpm에서 10분 간 원심분리하였다. 그 결과를 표 9 및 도 7b에 나타냈다.
Figure pat00003
원심분리 시간은 마그네틱 비드의 크기 별 분리에 큰 영향이 없었으나, 원심분리 속도 변화에 의해 마그네틱 비드의 크기 별 분리가 가능하였다. 예를 들어, 원심분리 속도가 500 rpm일 경우 약 600 내지 700nm의 크기를 가지는 비드가 분리되었고 (평균 비드 크기: 약 650 nm), 원심분리 속도가 1,000 rpm일 경우 약 190 내지 550nm의 크기를 가지는 비드가 분리되었으며 (평균 비드 크기: 약 350 nm), 원심분리 속도가 5,000 rpm일 경우 약 140 내지 400nm의 크기를 가지는 비드가 분리되었고 (평균 비드 크기: 약 250 nm), 원심분리 속도가 10,000 rpm일 경우 약 100 내지 300nm의 크기를 가지는 비드가 분리되었다 (평균 비드 크기: 약 200 nm).
따라서, 500nm 이하의 비교적 작은 입경의 비드는 약물 전달용으로, 약 500 내지 1,000 nm 입경의 비드는 DNA 또는 RNA 등의 핵산 추출용으로, 이보다 더 큰 사이즈의 비드는 항체와 결합하여 진단검출용 (단백질 분리정제, 또는 특정 물질을 검출하는 용도, 예를 들어 ELISA 등), 특히 면역친화성(immunoaffinity)를 활용한 엑소좀의 분리, 면역형광법 (immunofluorescence)를 활용한 엑소좀의 탐지 등 엑소좀 또는 혈중종양세포 (Circulating Tumor cell) 등의 분리 및 탐지 등에 활용 가능할 것으로 보였다.
실험예 4: 비드를 이용한 RNA 추출
실시예 2 및 비교예 1의 마그네틱 비드를 이용하여 RNA 추출을 수행하였다.
구체적으로, 제놀루션 Cell RNA Kit 추출 시약 비드 칸에 비교예 1 및 실시예 2의 마그네틱 비드를 40mg/ml 농도로 40ul씩 다르게 분주하여 준비하였다. HeLa 1*106 Cells을 추출 시약에 첨가하여 제놀루션 사의 추출자동화장비 (Nextractor)를 이용하여 RNA을 추출하였다. 이 실험은 3회 반복 실험으로 진행되었다. 추출된 RNA은 NanoDrop을 통해 RNA 농도와 순도, Qubit을 통하여 dsRNA 추출 수율을 분석하였고, 아가로즈 겔(agarose gel)에 전기영동하여 밴드 세기를 비교 분석하였다. 상기 RNA 추출 결과를 도 8a 및 표 10에 나타내었다.
또한, 추출된 RNA의 순도를 확인하기 위해, Real-time PCR 분석을 수행하였다. 이 때 사용된 GAPDH primer 와 probe는 제놀루션 자체의 검출 시약을 사용했으며, Bio-Rad CFX96 기기를 사용하였다.
도 8a는 비교예 1 및 실시예 2의 마그네틱 비드를 사용하여 추출한 RNA의 농도 및 순도를 측정한 NanoDrop 결과이다. 실시예 2의 마그네틱 비드를 사용하여 추출한 RNA의 농도는 평균적으로 350ng/μl이었으며, 비교예 1의 마그네틱 비드(200ng/μl)보다 많은 양의 RNA를 추출하였다. 두 비드 모두 2.0 이상의 고순도 RNA를 추출하였다. 아가로즈 겔 상에도 실시예 2의 비드에서 intact한 밴드가 관찰되어, 비교예 1의 마그네틱 비드보다 추출 효율이 우세한 것을 확인하였다. 도 8b는 비교예 1 및 실시예 2의 마그네틱 비드를 사용하여 추출한 RNA를 아가로즈 겔에 전기영동한 밴드 결과를 나타낸 것이다.
구분 RNA 농도
(ng/ul)		 Purity
(A260/A230)		 Purity
(A260/A280)		 dsRNA
(ug)		 GAPDH
(Ct value)
비교예 1 198.3±0.8 2.2±0.0 2.0±0.0 17.6±0.1 19.9±0.2
실시예 2-1 348.9±1.1 2.2±0.0 2.0±0.0 31.2±0.1 19.9±0.1
실시예 2-2 276.4±7.4 2.2±0.0 2.0±0.0 25.9±0.8 20.2±0.3
실시예 2-3 357.2±2.1 2.2±0.0 2.0±0.0 33.5±0.5 20.3±0.2
도 8c는 표 10의 결과를 그래프로 나타낸 것으로, 실시예 2의 결과는 실시예 2-1 내지 2-3의 결과를 평균하여 나타내었다. 그 결과, 실시예 2의 마그네틱 비드를 이용한 경우, 오차범위를 포함한 비교예 1의 마그네틱 비드를 사용한 결과보다 농도, 순도, 및 Real-time PCR 결과에 있어서 모두 우세한 것을 확인하였다. 또한, 실시예 2의 경우 오차범위가 적어, 추출 효율의 재현성을 확인할 수 있었다. 도 8c의 각 그래프는 좌측 상단부터 시계방향 순서로, RNA 농도, RNA 순도, real-time PCR 결과, 및 dsRNA 수율을 나타낸 것이다.
Real-time PCR 분석은 모두 동일한 양의 50ng RNA을 template로 사용하였고, 이의 Ct 값 결과가 모든 그룹에서 동일한 것으로 보아, 추출된 RNA는 PCR inhibitor 없이 고순도인 것을 의미한다.
실험예 5: 비드를 이용한 DNA 추출
5-1: DNA 추출 효율
실시예 1 및 비교예 1 내지 2의 마그네틱 비드를 이용하여 DNA 추출 효율을 비교하였다.
구체적으로, 제놀루션 Whole Blood DNA Kit 추출 시약 비드 칸에 80mg/ml 농도의 비교예 1, 비교예 2, 및 실시예 1의 마그네틱 비드를 40ul씩 다르게 분주하여 준비하였다. Whole Blood를 0.2ml씩 추출 시약에 첨가하여 제놀루션 추출자동화장비 (Nextractor®)를 이용하여 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA은 NanoDrop을 통해 DNA 농도와 순도, Qubit을 통하여 dsDNA 추출 수율을 측정하였고, 아가로즈 겔에 전기영동함으로 밴드의 세기를 비교 분석하였다.
그 결과를 도 9a 및 표 11에 나타내었다. 도 9a는 비교예 1, 비교예 2, 및 실시예 1의 마그네틱 비드를 사용하여 추출한 DNA의 농도 및 순도를 측정한 NanoDrop 결과이다. 실시예 1의 마그네틱 비드를 사용하여 추출한 DNA의 농도는 평균적으로 55.8ng/ul 였으며, 비교예 1 (30.2ng/ul), 비교예 2 (51.8ng/ul)의 경우보다 많은 양의 DNA를 추출하였다. 3종류의 비드 모두 1.8의 고순도의 DNA를 추출하였다. 아가로즈 겔 상으로도 실시예 1에서 intact한 genomic DNA 밴드가 관찰되어, 비교예 1 및 비교예 2의 마그네틱 비드보다 추출 효율이 우세한 것을 확인하였다. 도 9b는 비교예 1, 비교예 2, 및 실시예 1의 마그네틱 비드를 사용하여 추출한 DNA를 아가로즈 겔에 전기영동한 밴드 결과를 나타낸 것이다.
no. Bead Conc.
(ng/ul)		 Purity
(A260/A280)		 dsDNA
(ug)		 Actin
(Ct value)
A 비교예 1 30.2 1.7 1.1 20.9
B 비교예 2 51.8 1.8 3.3 19.7
C 실시예 1 55.8 1.8 3.6 19.4
5-2: 실시예 2 및 비교예 1의 비드를 이용한 DNA 추출 효율 비교
비교예 1, 및 실시예 2의 마그네틱 비드를 이용하여 DNA 추출 효율을 비교하였다.
구체적으로, 제놀루션 Whole Blood DNA Kit 추출 시약 비드 칸에 80mg/ml 농도의 비교예 1, 실시예 2-1, 실시예 2-2, 및 실시예 2-3의 마그네틱 비드를 40ul씩 다르게 분주하여 준비하였다. Whole Blood를 0.2ml씩 추출 시약에 첨가하여, 제놀루션 추출자동화장비 (Nextractor)를 이용하여 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA은 NanoDrop을 통해 DNA의 농도와 순도, Qubit을 통하여 dsDNA 추출 수율을 측정하였고, 아가로즈 겔에 전기영동하여 밴드의 세기를 비교 분석하였다.
그 결과를 도 10a 및 표 12에 나타내었다. 도 10a는 비교예 1, 및 실시예 2의 마그네틱 비드를 사용하여 추출한 DNA의 농도 및 순도를 측정한 NanoDrop 결과이다.
구분 Conc.
(ng/ul)		 Purity
(A260/A280)		 dsDNA
(ug)		 Actin
(Ct value)
비교예 1 87.0 1.8 3.5 19.0
실시예 2-1 94.5 1.8 4.6 20.4
실시예 2-2 72.9 1.8 3.5 20.1
실시예 2-3 95.7 1.8 4.8 19.2
도 10c는 표 12의 결과를 그래프로 나타낸 것이다. 그 결과, 실시예 2의 마그네틱 비드를 사용한 경우, 추출된 DNA의 농도, 순도, 수율, 및 real-time PCR 결과에 있어서 모두 우세한 것을 확인하였다. 도 10c의 각 그래프는 좌측 상단부터 시계방향 순서로, DNA 농도, DNA 순도, real-time PCR 결과, 및 dsRNA 수율을 나타낸 것이다.
그 결과, 비교예 1의 마그네틱 비드를 사용한 경우보다, 실시예 2의 마그네틱 비드를 사용한 경우 추출된 DNA의 농도가 더 높아, 더욱 효과적인 DNA 추출이 가능함을 확인하였다.
다음으로, 비교예 1 및 실시예 2의 마그네틱 비드를 이용하여 추출된 DNA를 4ul씩 로딩하여 150V로 15분간 전기영동하였다. 그 결과를 도 10b에 나타내었다. 실시예 2의 마그네틱 비드를 사용한 경우 더욱 선명한 1kb 이상의 밴드가 관찰되어 genomic DNA가 추출됨을 확인하였고, 실시예 2의 마그네틱 비드가 더 효과적인 DNA 추출이 가능함을 확인하였다.
실시예 2-2의 경우, NanoDrop 상의 DNA의 농도는 비교예 1보다 낮게 측정되었으나, Quibit을 통한 dsDNA 정량에서는 비교예 1과 유사한 양으로 측정되었다. 이는 모든 핵산을 포함하는 NanoDrop 측정의 특성상, 비교예 1의 마그네틱 비드를 사용한 추출은 비 특이적인(non-specific) 결합으로 인하여 DNA 이외의 물질들이 함께 추출되어 실시예 2보다 높은 NanoDrop 농도 수치를 보이지만, dsDNA 양은 비교예 1 및 실시예 2가 유사한 것으로 보아, 실시예 2의 마그네틱 비드가 비교예 1의 마그네틱 비드보다 민감성이 좋은 것을 의미한다. 이는 전기영동을 걸어 젤 밴드의 세기를 통해 확인한 추출된 DNA 양이 비슷하다는 점에서 또한 확인할 수 있다.

Claims (27)

  1. 용매에 철 전구체 및 산화제를 혼합한 혼합 용액을 균질화하여 산화철 코어를 얻는 단계;
    상기 산화철 코어를 액상 매질에 첨가한 후, 실리카 전구체 용액을 적상하여 상기 산화철 코어를 실리카로 코팅하여 마그네틱 비드를 얻는 단계; 및
    상기 액상 매질에서 마그네틱 비드를 분리하는 단계를 포함하는,
    마그네틱 비드의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 산화철 코어를 얻는 단계는, 상기 혼합 용액 내 시간에 따른 철 이온의 충돌 횟수를 상이한 반응조건으로 조절하여, 상이한 성장속도로 다양한 입경을 갖는 산화철 코어가 제조되는 것인, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 혼합 용액의 부피는, 상기 균질화에 의해 상기 산화철이 상이한 성장 속도를 가져 다양한 입경을 갖는 산화철 코어로 제조되도록 하는 부피로 설정되는 것인, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 마그네틱 비드는 입경의 표준편차가 적어도 100nm 이상인 분포를 갖는 것인, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 제조된 마그네틱 비드의 입경 분포에서 상위 10% 입경을 갖는 마그네틱 비드들의 평균 입경이, 하위 10% 입경을 갖는 마그네틱 비드들의 평균 입경의 1.5배 내지 4배인, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 철 전구체 및 상기 산화제는 1:0.75 내지 1:3의 중량비로 사용되는 것인, 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 마그네틱 비드는 1회 제조 시 상기 혼합용액의 부피 1,000ml 당 적어도 5g 이상 얻어지는, 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 혼합용액을 균질화하는 시간은 18 내지 30시간인, 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 철 전구체는 상기 혼합용액의 부피 1,000ml 당 적어도 20g 이상, 상기 산화제는 적어도 30g 이상 혼합되는 것인, 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 마그네틱 비드를 분리하는 단계는, 상기 마그네틱 비드를 적어도 2 이상의 크기 그룹으로 분리하는 것인, 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 마그네틱 비드를 분리하는 단계는, 상기 얻어진 마그네틱 비드들의 입경 분포에서, 특정 입경 범위를 갖는 마그네틱 비드 그룹을 분별하여 분리하는 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 마그네틱 비드를 분리하는 단계는, 분리된 마그네틱 비드의 평균 입경이 50 내지 500 nm인, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 분리된 마그네틱 비드는 약물전달체용인, 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 분리하는 단계는, 분리된 마그네틱 비드의 평균 입경이 500 내지 1,000 nm인, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 분리된 마그네틱 비드는 핵산 추출용인, 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 마그네틱 비드를 분리하는 단계에서, 상기 마그네틱 비드는 동일한 rpm에서 원심분리 시간을 증가시킬 경우 분리되지 않는 것을 특징으로 하는, 방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 철 전구체는 염화철, 염화철 수화물, 염화제2철, 염화제2철6수화물, 질산철, 황산철, 요오드화철, 브롬화철, 올레산철, 타우르산철, 라우르산철, 아세트산철, 펜타카르보닐철, 및 엔니카르보닐철로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인, 방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 산화제는 소듐 아세테이트 (NaOAc), 포타슘 하이드로겐 프탈레이트, 프탈레이트, 시트르산, 소듐 시트레이트, 및 아세트산으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인, 방법.
  19. 제1항에 있어서, 상기 실리카 전구체는 에틸 실리케이트, 글리시드옥시프로필 트리메톡시 실란, 및 에폭시 시클로 핵실 에틸 트리메톡시 실란으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상으로 실리카 코팅되는 것인, 방법.
  20. 제1항에 있어서, 상기 산화철 코어를 얻는 단계는, 상기 혼합용액을 균질화하고, 상기 균질화된 혼합용액을 진공 건조하여 산화철을 수득하는 것인, 방법.
  21. 제1항에 있어서, 상기 마그네틱 비드를 얻는 단계는,
    상기 산화철 코어를 증류수, 알코올, 및 암모니아와 혼합하고, 상기 실리카 전구체 용액을 적상하여, 상기 산화철 코어를 실리카로 코팅하여 마그네틱 비드를 얻는 것인, 방법.
  22. 제1항에 있어서, 상기 마그네틱 비드는 지름이 100 내지 10,0000 nm 인 구체 형태인, 방법.
  23. 제1항에 있어서, 상기 마그네틱 비드는 포화자기도가 40 내지 200 eum/g 인, 방법.
  24. 제1항에 있어서, 상기 마그네틱 비드는 하기 (1) 내지 (3) 중 1종 이상의 특징을 가지는, 방법:
    (1) 상기 마그네틱 비드로 추출된 RNA의 순도 A260/A230 값이 2.0 이상,
    (2) 상기 마그네틱 비드로 추출된 RNA의 순도 A260/A280 값이 1.8 이상,
    (3) 상기 마그네틱 비드로 추출된 DNA의 순도 A260/A280 값이 1.5 이상.
  25. 제1항에 있어서, 상기 균질화는 100 내지 200℃의 온도에서 산화철 코어를 형성하는 것인, 방법.
  26. 혼합 용액 1,000ml 당 철 전구체 10 내지 40g 및 산화제 30 내지 60g이 포함되며, 적어도 500ml 이상의 부피를 가지는 혼합 용액을 균질화하여 산화철 코어를 얻는 단계;
    상기 산화철 코어를 액상 매질에 첨가한 후, 실리카 전구체 용액을 적상하여 상기 산화철 코어를 실리카로 코팅하여 마그네틱 비드를 얻는 단계; 및
    상기 마그네틱 비드를 이용하여 시료로부터 핵산을 추출하는 단계를 포함하는, 핵산 추출 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 핵산을 추출하는 단계는 핵산 추출 자동화 장비를 이용하여 수행되는 것인, 방법.
KR1020190085154A 2018-07-13 2019-07-15 마그네틱 비드의 제조방법 및 분리방법 KR102170388B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180081741 2018-07-13
KR20180081741 2018-07-13

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20200007752A true KR20200007752A (ko) 2020-01-22
KR102170388B1 KR102170388B1 (ko) 2020-10-27

Family

ID=69368286

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020190085154A KR102170388B1 (ko) 2018-07-13 2019-07-15 마그네틱 비드의 제조방법 및 분리방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102170388B1 (ko)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112725328A (zh) * 2020-12-28 2021-04-30 苏州白垩纪生物科技有限公司 诊断磁珠的大规模制造方法及其生物应用
KR20210152114A (ko) * 2020-06-08 2021-12-15 경북대학교 산학협력단 실리카로 코팅된 산화철 나노비드의 제조방법 및 이의 핵산 분리용 용도
KR102505472B1 (ko) * 2022-09-05 2023-03-06 주식회사 제놀루션 핵산 포획용 자성 입자 및 이를 이용한 핵산 포획 또는 선별 방법

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101053023B1 (ko) * 2008-02-14 2011-08-01 (주)바이오니아 구형 실리카 자성입자 및 이의 제조방법
JP2013526616A (ja) * 2010-05-26 2013-06-24 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション 磁性ナノ粒子
KR20160000439A (ko) * 2014-06-24 2016-01-04 (주)바이오니아 자성 입자를 이용한 핵산 분리 방법
KR101631721B1 (ko) * 2008-01-09 2016-06-17 매그포스 아게 나노입자 및 입자 제조 방법

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101631721B1 (ko) * 2008-01-09 2016-06-17 매그포스 아게 나노입자 및 입자 제조 방법
KR101053023B1 (ko) * 2008-02-14 2011-08-01 (주)바이오니아 구형 실리카 자성입자 및 이의 제조방법
JP2013526616A (ja) * 2010-05-26 2013-06-24 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション 磁性ナノ粒子
KR20160000439A (ko) * 2014-06-24 2016-01-04 (주)바이오니아 자성 입자를 이용한 핵산 분리 방법

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210152114A (ko) * 2020-06-08 2021-12-15 경북대학교 산학협력단 실리카로 코팅된 산화철 나노비드의 제조방법 및 이의 핵산 분리용 용도
CN112725328A (zh) * 2020-12-28 2021-04-30 苏州白垩纪生物科技有限公司 诊断磁珠的大规模制造方法及其生物应用
CN112725328B (zh) * 2020-12-28 2023-05-05 苏州白垩纪生物科技有限公司 诊断磁珠的大规模制造方法及其生物应用
KR102505472B1 (ko) * 2022-09-05 2023-03-06 주식회사 제놀루션 핵산 포획용 자성 입자 및 이를 이용한 핵산 포획 또는 선별 방법

Also Published As

Publication number Publication date
KR102170388B1 (ko) 2020-10-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102170388B1 (ko) 마그네틱 비드의 제조방법 및 분리방법
Guo et al. Magnetic colloidal supraparticles: design, fabrication and biomedical applications
Wang et al. Engine-trailer-structured nanotrucks for efficient nano-bio interactions and bioimaging-guided drug delivery
Kralj et al. Producing ultra-thin silica coatings on iron-oxide nanoparticles to improve their surface reactivity
Peng et al. Nanostructured magnetic nanocomposites as MRI contrast agents
WO2013012268A2 (ko) 균일한 크기의 실리카 나노입자 대량 제조 방법
JP6479799B2 (ja) 粒子への分子の接合
WO2011150212A2 (en) Magnetic nanoparticles
CN1736881A (zh) 一种超顺磁氧化铁复合纳米颗粒的制备方法
CN106913885B (zh) 一种磁性纳米粒子及其制备方法和应用
US20230287421A1 (en) Magnetic inorganic iron-based nanoparticles
CN106552603A (zh) pH响应型磁性金属有机框架复合纳米材料及其制备方法与应用
CN109433158B (zh) 用于多模式肽段富集的磁性纳米复合材料及其制备方法与应用
CN105366730B (zh) 一种使用dna纳米结构对疏水性纳米粒子相转换的方法
Baziulyte-Paulaviciene et al. Synthesis and functionalization of NaGdF4: Yb, Er@ NaGdF4 core–shell nanoparticles for possible application as multimodal contrast agents
CN114272396A (zh) T1-t2双猝灭-激活的mri造影剂及其制备方法
JP2007216134A (ja) 水分散性の磁性ナノ粒子
CN109939081B (zh) F3多肽靶向的纳米有机金属框架材料（nMOFs）及其制备方法
Cao et al. Preparation of Au nanoparticles-coated polystyrene beads and its application in protein immobilization
CN114870759B (zh) 树莓状硅羟基磁性微球的制备方法
CN103730226B (zh) 一种空心磁性高分子复合微球及其制备方法与应用
CN112675821B (zh) 基于双亲和位点用于糖肽富集的磁性共价有机框架材料及其制备方法与应用
CN110448700B (zh) 一种用于靶向诊疗胃癌的纳米载药复合物及制备方法
KR20090085435A (ko) 나노 복합체 입자 및 그의 제조방법
CN114459877A (zh) 用于富集外泌体的dna四面体复合磁性纳米材料及制备

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant