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Die vorliegende Erfindung bezieht
sich auf wasserlösliche
Carboxypolysaccharidmagnetisches Eisenoxid-Komplexe, die einen kleinen
Teilchendurchmesser besitzen und die im Bereich der Biologie und
der medizinischen Behandlung etc. z. B. als Kontrastmedium für nuklearmagnetische
Resonanzbildgebung (hiernach abgekürzt MRI) oder als Röntgenkontrastmittel
etc., nützlich
sind.
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Ein Komplex von magnetischem Eisenoxid, welcher
Kolloidgröße hat,
ist superparamagnetisch. Ein hieraus bestehendes wäßriges Sol
(d. h. eine magnetische Flüssiglceit)
hat in den letzten Jahren auf den Gebieten medizinischer Behandlung,
Biologie und Engineering als MRI-Kontrastmedium im speziellen die
Aufmerksamkeit auf sich gezogen. Wenn ein magnetischer Eisenoxidkomplex
als MRI-Kontrastmedium benutzt wird, z. B. wenn der Komplex intravaskulär verabreicht
wird, damit die Kupffer-Zellen der Leber in der Lage sind, ihn einzufangen,
darf der Komplex einen relativ großen Teilchendurchmesser besitzen.
In diesem Fall ist ein großer
Teilchendurchmesser eher vorteilhaft, weil hierdurch eine große T2-Relaxation erhalten werden kann (die T2-Relaxation ist ein Maßstab für die Konstrastierungsfähigkeit). Wenn
der Komplex jedoch als MRI-Kontrastmedium benutzt wird, das sich
zwischen Zellen und/oder Geweben bewegt, ist es erwünscht, daß der Teilchendurchmesser
des magnetischen Eisenoxidkerns und/oder der Gesamtteilchendurchmesser
des Komplexes klein ist und daß die
T2-Relaxation so groß wie möglich ist.
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Bisher sind mehrere verschiedene
Beschreibungen mit Bezug auf Verbindungen zwischen ultrafeinen magnetischen
Teilchen aus Eisenoxid und Polysacchariden gemacht worden. So beschreibt
z. B. die JP-PS 13521/1984 (US-Patent Nr. 4,101,435) einen Komplex
aus magnetischem Eisenoxid, welcher zuvor hergestellt wurde, und
Dextran oder Alkali-behandeltem Dextran. In der Literatur wird kein
spezifischer Teilchendurchmesser erwähnt, doch besitzt der Komplex,
der nach den Methoden, die in der angegebenen Literatur angegeben
sind, erhalten wird, einen Kerndurchmesser (magnetisches Eisenoxid) von
etwa 7 bis etwa 12 nm, und einen Gesamtdurchmesser von etwa 80 bis
etwa 200 nm, was mit den später
angegebenen Methoden gemessen wurde.
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Die US-PS 4.452.773 beschreibt mikrosphärisches
magnetisches Eisenoxid, welches mit Dextran beschichtet ist. Gemäß dieser
Druchschrift beträgt
der Kerndurchmesser etwa 10 bis etwa 20 nm, und der Gesamtdurchmesser,
gemessen durch SEM, beträgt
etwa 30 bis etwa 40 nm. P. Kronick und R.W. Gilpin, Journal of Biochemical
and Biophysical Methods, 12, 73–80
(1986) beschreiben einen Dextran-Magnetit-Komplex, der für Zellenseparation
benutzt wird, insbesondere für
Antikörperbindung.
Der Kerndurchmesser beträgt
3 nm gemäß der Literatur, aber
es wird befürchtet,
daß der
Gesamtdurchmesser aufgrund der Verwendung von Dextran groß ist und
daß der
Komplex hierdurch eine hohe akute Toxizität besitzt (welche eine wichtige
Eigenschaft eines Medikaments ist).
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Die JP-05 141119/1991 beschreibt
ein Verfahren zur Herstellung von ultrafeinen Magnetitteilchen,
die eine durchschnittliche Teilchengröße von 10 mit oder mehr aufweisen,
durch die Kontrolle des Verhältnisses
von Eisenionen und der Reaktionstemperatur während der Reaktion. Die JP-OS 242327/1991
beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von ultrafeinen magnetischen
Teilchen, die einen Teilchendurchmesser von 10–15 nm besitzen, durch Kontrolle
der Eisenionenkonzentration und der Dextrankonzentration während der
Reaktion.
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Die WO 88/00060 beschreibt ein Verfahren zur
Herstellung eines MR-Kontrastmittels, welches Teilchen aus superparamagnetischem
Metalloxid umfaßt,
welche unbeschichtet oder von einer Polymerschicht umgeben sind.
Obwohl Silanpolymere, Dextran und Rinderserumalbumin konkret als
Beispiele für
Polymere, die verwendet werden, angegeben sind, beträgt der spezifische
angegebene Gesamtdurchmesser der erhaltenen superparamagnetischen
Teilchen ausschließlich
140 und 173 nm. Bezüglich
des Konzepts von kleinen Teilchendurchmessern finden sich keine
Hinweise.
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Die EP-A-543 020, welche ein Dokument
unter Artikel 54(2) EPÜ ist,
beschreibt einen oxidierten Verbundkörper, welcher ein wasserlösliches
Carboxypolysaccharid und magnetisches Eisenoxid umfaßt, zum
Zwecke der Reduzierung von Nebeneffekten. Obwohl dieses Dokument
einen Bereich von 45 bis 90 nm als konkreten Gesamtdurchmesser der Rohmaterialien
und des oxidierten Verbundkörpers offenbart,
gibt es keine weiteren Hinweise auf das Konzept des kleinen Teilchendurchmessers.
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Weiterhin beschreiben R. Weissleder
et al., Radiology, 175, 489493 (1990) und R. Weissleder et al.,
Radiology, 181, 245249 (1991) jeweils eine Möglichkeit zur Herstellung eines
Komplexes mit kleinen Teilchendurchmessern, bei der ein Dextran-magnetisches
Eisenoxidkomplex einer Gelfiltrationsfraktionierung unterworfen
wird. Der so erhaltene Komplex hat sicherlich einen kleinen Kerndurchmesser,
aber es wird befürchtet,
daß der
komplex einen großen Gesamtdurchmesser
aufgrund der Verwendung von Dextran und der Anwendung der Gelfiltrationsfraktionierung
besitzt. Darüber
hinaus besitzt er eine starke akute Toxizität und eine geringe Stabilität. Weitere Probleme
ergeben sich durch die Herstellungsprozedur und die Ausbeuten.
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Die benannten Erfinder haben daher
extensive Studien durchgeführt,
um einen wasserlöslichen Carboxypolysaccharid-magnetisches
Eisenoxid-Komplex, welcher einen kleinen Teilchendurchmesser besitzt
(hiernach abgekürzt
zu "magnetischer Komplex" oder in manchen Fällen einfach "Komplex"), welcher
ein breiteres Anwendungsspektrum an lebenden Körpern besitzt, und ein Verfahren
für die
effiziente Herstellung des beschriebenen Komplexes zu entwickeln.
Als Ergebnis haben die benannten Erfinder gefunden, daß ein magnetischer Komplex,
der einen kleinen Kerndurchmesser besitzt und einen kleinen Gesamtdurchmesser,
und der darüber
hinaus eine relativ große
T2-Relaxation besitzt, effizient dargestellt
werden kann. Dieser Befund hat zur Vervollständigung der vorliegenden Erfindung
geführt.
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Gegenstand der Erfindung ist ein
wasserlöslicher
Carboxypolysaccharid-magneti sches Eisenoxid-Komplex mit kleinem
Teilchendurchmesser, bestehend aus einem wasserlöslichen Carboxypolysaccharid
mit einer Grundviskosität
im Bereich von 0,03 bis 0,2 dl/g, gemessen bei 25°C nach der
in Viscosity Measurement Test Method, Item 35, General Tests, The
Pharmacopeia of Japan (12. Auflage, 1991) beschriebenen Methode
und einem magnetischen Eisenoxid mit einem Kerndurchmesser im Bereich
von 2 bis 7 nm, wobei der Gesamtdurchmesser im Bereich von 15 bis
40 nm liegt, das Verhältnis
des Gesamtdurchmessers zu dem Kerndurchmesser 10 oder weniger beträgt und wobei
die T2-Relaxation im Bereich von 10 bis
150 (mmols)–1 liegt.
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1 ist
eine Photographie von ex-vivo-MR-Bildern von Leber, Milz und Lymphknoten
von Ratten, aufgenommen, nachdem der Komplex, erhalten in Vergleichs- Beispiel 1, einer
Ratte mit einer Konzentration von 200 μmol (als Eisen) pro kg Körpergewicht
intravenös
injiziert wurde.
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2 ist
eine Photographie von T1-gewichteten MR-Bildern
des Komplexes, erhalten in Beispiel 1, in verschiedenen
Konzentrationen. Die Bilder sind in S-Form plaziert, wobei sich
die niedrigste Konzentration oben rechts und die höchste Konzentration unten
links befindet.
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3 ist
eine Photograple von ex-vivo-MR-Bildern von Leber, Milz und Lymphknoten
einer Ratte, welche aufgenommen wurden, nachdem der Komplex, erhalten
in Beispiel 11, einer Ratte in einer Konzentration von
200 μmol
(als Eisen) pro kg Körpergewicht
intravenös
injiziert wurde.
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4 sind
Photographien von in-vivo-MR-Bildern des Beckenknochens eines Kaninchens,
aufgenommen (A) bevor der Komplex, erhalten in Beispiel 1, dem Kaninchen
intravenös
in einer Konzentration von 200 μmol
(als Eisen) per kg Körpergewicht
injiziert wurde und (B) 24 Stunden nach der intravenösen Injektion.
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Erfindungsgemäß ist das Polysaccharid, welches
ein Bestandteil des magnetischen Komplexes ist, ein Carboxypolysaceharid
mit Hinblick auf den Teilchendurchmesser, Toxizität, Sicherheit,
Ausbeute etc. des Komplexes. Als Polysaccharidmaterial für das Carboxypolysaccharid
können
z. B. Glucosepolymere, wie Dextran, Stärke, Glykogen, Pullulan, Schizophyllan,
Lentinan, Pestalotian und ähnliche; Mannosepolymere,
wie Mannan und ähnliche;
Galactosepolymere, wie Agarose, Galactan und ähnliche; Xylosepolymere, wie
Xylan und ähnliche;
und L-Arabinosepolymere, wie Arabinan und ähnliche, angegeben werden.
Von diesen werden Dextran, Stärke
und Pullulan bevorzugt, wobei Dextran besonders bevorzugt wird.
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Das Carboxypolysaccharid schließt Polysaccharide
ein, welche durch Umwand-1ung
der reduzierenden endständigen
Gruppe eines wasserlöslichen
Polysaccharids in eine Carboxylgruppe erhalten werden, und z. B.
durch eine Methode der Hitzebehandlung eines wasserlöslichen
Polysaccharids mit Alkalien, im speziellen Natriumhydroxid, oder
einer Methode der vorzugsweisen Oxidation nur der reduzierenden
Endgruppe eines wasserlöslichen
Polysaccharids durch die Verwendung eines Oxidationsmittels, wie
z. B. Indolin-Natriumhydroxid, Natriumltypochlorit oder ähnliche
produziert werden können.
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Von diesen Carboxypolysacchariden
wird ein wasserlösliches
Polysaccharid, welches durch Alkalibehandlung erhalten wird, bevorzurgt.
In der vorliegenden Erfindtung ist hierzu ein Carboxydextran, erhalten
aus Dextran durch Alkalibehandlung, das am meisten bevorzugte.
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Wenn das erfindungsgemäß eingesetzte wasserlösliche Carboxypolysaccharid
ein zu geringes Molekulargewicht besitzt, hat der resultierende magnetische
Komplex eine hohe Toxizität,
eine geringe Stabilität
und einen großen
Gesamtdurchmesser. Auch wenn das wasserlösliche Carboxypolysaccharid
ein zu hohes Molekulargewicht besitzt, besitzt der magnetische Komplex ähnliche
Eigenschaften. Daher besitzt das wasserlösliche Carboxypolysaccharid
eine Grundviskosität
von allgemein 0,03 bis 0,2 dl/g, bevorzugt 0,04 bis 0,15 dl/g, oder
mehr bevorzugt 0,05 bis 0,1 dl/g. In der vorliegenden Beschreibung
ist die Grundviskosität
[n] von wasserlöslichen
Carboxypolysacchariden ein Wert, der bei Messungen bei 25°C gemäß der Methode,
offengelegt in Viscosity Measurement Method, Item 35, General Tests,
The Pharmacopeia of Japan (12. Ausgabe 1991) erhalten wird.
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Das magnetische Eisenoxid, welches
die andere Komponente ist, die den erfindungsgemäßen magnetischen Komplex ausmacht,
wird vorzugsweise durch Behandlung einer wäßrigen Lösung von zwei oder mehr Eisensalzen
mit Alkalien hergestellt. Mit Hinblick auf die Kombination der Eisensalze,
die für
die Bildung des magnetischen Eisenoxids benutzt werden, kann z.
B. eine wäßrige gemischte
Eisensalzlösung,
die Eisen(II)-salze und Eisen(III)-salze beinhaltet, angegeben werden.
In diesem Fall beträgt das
molare Verhältnis
der Eisen(II)-salze zu den Eisen(III)-salzen im allgemeinen 1 :
19 bis 1 : 1,5, vorzugsweise 1 : 9 bis 1 : 2. Wenn das molare Verhältnis der
Eisen(II)-salze zu den Eisen(III)-salzen kleiner ist, sind der Gesamtdurchmesser,
der Kerndurchmesser (magnetische Eisenoxidteilchen) und die T2-Relaxation der resultierenden Komplexe
im allgemeinen kleiner: Erfindungsgemäß kann hierzu das molare Verhältnis abhängig vom
Zweck der Anwendung etc. des Komplexes experimentell bestimmt werden.
Ein Teil, z. B. etwa die Hälfte
oder weniger, der Eisen(II)-salze, kann durch ein Salz bzw. Salze anderer
zweiwertiger Metalle, z. B. einem Salz von mindestens einem der
folgenden Metalle: Magnesium, Zink, Cobalt, Mangan, Nickel, Kupfer,
Barium, Strontium etc., ersetzt werden. Der so erhaltene magnetische
Komplex ist ebenso in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
Als Salzarten können
erwähnt
werden z. B. Salze von Mineralsäuren,
z. B. Salzsäure,
Schwefelsäure,
Salpetersäure
und ähnliche.
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Der erfindungsgemäße Komplex kann vorteilhafterweise
in einem Schritt durch Mischen und Rühren einer wässrigen
gemischten Eisensalzlösung,
welche ein Eisen(III)-und ein Eisen(II)-salz enthält, mit
einer wässrigen
Alkalilösung
in Gegenwart eines wasserlöslichen
Carboxypolysaccharids für
1 Minute oder weniger, um die Reaktion einzuleiten, erhalten werden.
In diesem Fall bezieht sich die Zeitdauer auf den Zeitpunkt des
Starts der Zugabe oder des Mischens der wäßrigen gemischten Eisensalzlösung und
der wäßrigen Alkalilösung bis
zur Vervollständigung
der Zugabe oder des Mischens. Wenn die Zugabe- oder Mischzeit kürzer ist,
besitzt der resultierende Komplex einen geringeren Kerndurchmesser
und einen geringeren Gesamtdurchmesser, und seine T2-Relaxation
ist nicht so klein im Vergleich mit der geringen Größe des angegebenen
Durchmessers. Das Rülren,
welches während
der Reaktion durchgeführt
wird, wird vorzugsweise mit einer Geschwindigkeit durchgeführt, daß jede Lösung, die
zur Reaktion zugegeben wird, im wesentlichen gleichzeitig mit dem
Zutropfen jeder Lösung
in das System in dem Reaktionssystem dispergiert wird, da angestrebt wird,
daß die
einzelnen Komponenten in dem Reaktionssystem rasch gleichförmig verteilt
werden. Ein fortgesetztes Rühren
während
der Reaktion wird bevorzugt. Zweckmäßig enthält das Mischeisensalz ein Eisen(II)-salz
und ein Eisen(III)-salz in gegebenem Verhältnis während der Umsetzung mit dem
Alkali.
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Das obige Verfahren zum Erhalt des
erfindungsgemäßen Komplexes
kann je nach der Zugabe der Reihenfolge der Lösungen wie folgt aufgeteilt werden:
zu (A) einem Verfahren, umfassend die Zugabe einer wäßrigen Mischeisensalzlösung zu
einer wäßrigen Lösung eines
wasserlöslichen
Carboxypolysaccharids und anschließender Zugabe einer wäßrigen Alkalilösung, um
eine Reaktion zu bewirken; (B) ein Verfahren, umfassend die Zugabe
einer wäßrigen Alkalilösung zu
einer wäßrigen Lösung eines
wasserlöslichen
Carboxypolysaccharids und anschließende Zugabe einer wäßrigen Mischeisensalzlösung, um eine
Reaktion zu ergeben; (C) ein Verfahren, umfassend die Zugabe zu
einer wäßrigen Alkalilösung eines
Gemisches aus einer wäßrigen Mischeisensalzlösung und einer
wäßrigen Lösung eines
wasserlöslichen
Carboxypolysaccharids; (D) ein Verfahren, umfassend die Zugabe zu
einer wäßrigen Mischeisensalzlösung eines
Gemisches aus einer wäßrigen Alkalilösung und
einer wäßrigen Lösung eines
wasserlöslichen
Carboxypolysaccharids usw. Diese Verfahren (A), (B), (C) und (D)
unterscheiden sich nur hinsichtlich der Reihenfolge der Zugabe,
und sie unterscheiden sich praktisch nicht im Hinblick auf die anderen
Reaktionsbedingungen.
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Die Menge des wasserlöslichen
Carboxypolysaccharids, die in dem erfindungsgemäßen Komplex verwendet wird,
kann allgemein das 1- bis 15fache, vorzugsweise 3-bis 12fache, mehr
bevorzugt 7- bis 10fache der Gewichtsmenge des in dem Eisensalz
verwendeten Eisens betragen. Die Konzentration des Polysaccharids
ist keinen engen Begrenzungen unterworfen, doch liegt sie geeigneterweise
im Bereich von allgemein 1 bis 40 Gew./Vol.-%, vorztgsweise 5 bis
30 Gew./Vol.-%. Die Konzentration der wäßrigen Mischeisensalzlösung kann
innerhalb eines weiten Bereichs variiert werden, liegt aber geeigneterweise
in einem Bereich von im allgemeinen 0,1 bis 3 M, vorzugsweise 0,5
bis 2 M.
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Als wäßrige Alkalilösung kann
beispielsweise mindestens eine Alkalilösung, ausgewählt aus
Alkalimetallhydroxiden, wie NaOH, KOH und dgl., Aminen, wie Ammoniak,
Triethylamin und dgl.; usw. eingesetzt werden. Von diesen wird eine
wäßrige NaOH-
oder Ammoniaklösung
bevorzugt. Die Konzentration der wäßrigen Alkalilösung kann
ebenfalls innerhalb eines weiten Bereichs variiert werden, liegt aber
geeigneterweise im Bereich von 0,1 bis 10 N, vorzugsweise 1 bis
5 N. Die Menge des verwendeten Alkali ist eine derartige Menge,
daß der
pH-Wert des Reaktionssystems nach der Zugabe aller Lösungen grob
neutral bis 12 wird oder das Verhältnis von Eisensalz zu Alkali
1 : 1 bis 1 : 1,5, ausgedrückt
als Normalitätsverhältnis, wird.
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Die Zugabe der einzelnen wäßrigen Lösungen und
ihre Vermischung kann unter Rühren
im allgemeinen bei Raumtemperatur bis 100°C, vorzugsweise bei 40 bis 95°C, durchgeführt werden.
Erforderlichenfalls wird ein Alkali oder eine Säure (z. B. eine Mineralsäure) zur
pH-Einstellung zugesetzt. Dann wird 10 Minuten bis 5 Stunden, im
allgemeinen l. Stunde lang, unter Rückfluß auf 30 bis 120°C erhitzt.
Hierdurch kann die Re aktion zur Bildung eines wasserlöslichen
Carboxypolysaccharid-magnetisches Eisenoxidkomplexes vervollständigt werden.
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Von den obigen Verfahrren (A), (B),
(C) und (D) mit unterschiedlichen Reihenfolgen der Zugaben werden
die Verfahen (A) und (D) gegenüber
den Verfahren (B) und (C) wegen der hohen Komplexausbeute und der
hohen T2-Relaxation im Vergleich zu dem
Weit des Gesamtdurchmessers bevorzugt. Das Verfahren (A) wird besonders
bevorzugt. Einer der Vorteile der erfindungsgemäßen obigen Herstellungsverfahren
liegt darin, daß die
physikalischen Eigenschaften des erhaltenen magnetischen Komplexes
im wesentlichen durch die Synthesebedingungen bestimmt werden und
daß ein
Komplex mit einem kleinen Kerndurchmesser und Gesamtdurchmesser und
mit relativ großer
T2-Relaxation mit hoher Ausbeute erhalten
werden kann, wenn man beispielsweise keine Gelfiltrationsfraktionierung
anwendet.
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Das Verfahren der Zugabe und der
Vermischung von zwei Lösungen,
d. h. einer wäßrigen Lösung eines
wasserlöslichen
Carboxypolysaccharids und einer Mischeisensalz- und einer wäßrigen Alkalilösung, oder
von drei Lösungen,
d. h. einer wäßrigen Lösung eines
wasserlöslichen
Carboxypolysaccharids, einer wäßrigen Mischeisensalzlösung und
einer wäßrigen Alkalilösung mit
gegebenen Geschwindigkeiten, kann als besonders bevorzugtes Verfahren gemäß der Erfindung
bezeichnet werden, da die Zugabezeit im wesentlichen null Minuten
ist.
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Dann wird die Reinigung und Einstellung
des gebildeten Komplexes durchgeführt. Dies kann durch Anwendung
eines oder einer Kombination von zwei oder mehreren verschiedenen
an sich bekannten Verfahren geschehen. So wird beispielsweise das den
Komplex enthaltende Reaktionsgemisch mit einem mit Wasser mischbaren
organischen Lösungsmittel,
z. B. einem schlechten Lösungsmittel
für den Komplex,
wie Methanol, Ethanol, Aceton oder dgl., vermischt, um den Komplex
bevorzugt auszufällen, und
dann wird der Niederschlag abgetrennt. Dieser Niederschlag wird
in Wasser aufgelöst,
einer Dialyse gegen laufendes Wasser oder dgl. unterworfen und wie
erforderlich durch ein übliches
Verfahen eingeengt, wodurch ein wäßriges Sol des Komplexes mit gewünschter
Reinheit und Konzentration erhalten werden kann. Das wäßrige Sol
des Komplexes kann erforderlichenfalls einer Hitzebehandlung unterworfen
werden. Die Hit zebehandlung kann geeigneterweise im allgemeinen
bei 60 bis 140°C über einen Zeitraum
von 5 Minuten bis 5 Stunden und, wenn eine Sterilisierung erforderlich
ist, bei 121°C über einen
Zeitraum von 20 bis 30 Minuten durchgeführt werden.
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Weiterhin ist es erforderlichenfalls
vor oder nach der Hitzebehandlung möglich, verschiedene Hilfsmittel,
die physiologisch annehmbar sind, z. B. isotonische Mittel, wie
anorganische Salze (z. B. Natriumchlorid), Monosaccharide (z. B.
Glucose) oder Zuckeralkohole (z. B. Mannit oder Sorbit) und ein
Mittel zur Aufrechterhaltung des pHs, wie eine Phosphatpufferlösung oder
eine Trispufferlösung,
zuzusetzen.
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Bei einem anderen Reinigungsverfahren wird
das Reaktionsgemisch einer Ultrafiltration unterworfen, um nicht
umgesetztes wasserlösliches
Carboxypolysaccharid und niedermolekulare Verbindungen abzutrennen
und zu entfernen. Erforderlichenfalls wird eine gegebene Menge eines
wasserlöslichen
Carboxypolysaccharids zugesetzt. Hierdurch kann ein wäßriges Sol
des Komplexes mit gewünschter
Reinheit und Konzentration erhalten werden. Bei jedem beliebigen
Reinigungsverfahren können
eine pH-Einstellungs-, Zentrifugierungs- und/oder Filtrationsstufe
erforderlichenfalls im Verlauf oder nach der obigen Verfahrensweise
zugefügt
werden. Das gereinigte wäßrige Sol
des Komplexes kann in einen pulverförmigen Komplex überführt werden,
beispielsweise durch Sprühtrocknen
oder Gefriertrocknen oder durch Zugabe eines mit Wasser mischbaren
organischen Lösungsmittels,
wie Methanol, Ethanol, Aceton oder dgl., und Trocknen des resultierenden Niederschlags
bei vermindertem Druck. Das so erhaltene Pulver kann durch Zugabe
von Wasser leicht wieder in das wäßrige Sol zurückgeführt werden.
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Das Verhältnis von wasserlöslichem
Carboxypolysaccharid und magnetischem Eisenoxid in dem oben erhaltenen
Komplex hängt
vom Durchmesser der magnetischen Eisenoxidteilchen, dein Molelkulargewicht
des wasserlöslichen
Carboxypolysaccharids etc. ab, und kann innerhalb eines weiten Bereichs
variiert werden. Wenn das Verhältnis
groß ist,
dann hat das resultierende wäßrige Sol
eine hohe absolute Viskosität.
Wenn das Verhältnis
klein ist, dann ist der Gesamtdurchmesser des Komplexes aufgrund
einer Agglomerierung von Komplexteilchen groß, und die Stabilität des Komplexes
ist schlechter. Daher kann im allgemeinen der Komplex das wasserlösliche Carboxypolysaccharid
in einer Menge von 0,2 bis 5 Gewichtsteilen, vorzugsweise 0,5 bis
3 Gewichtsteilen, mehr bevorzugt 1 bis 2 Gewichtsteilen pro 1 Gewichtsteil
in dem magnetischen Eisenoxid vorhandenes Eisen, enthalten.
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Die Metallmenge in dein erfindungsgemäßen Komplex
[die die Gesamtmenge von Eisen und/oder eines anderen Metalls oder
von anderen Metallen (wenn vorhanden), enthalten in dem magnetischen Eisenoxid,
bezeichnet] ist ein Wert, der durch die Methode gemessen werden
kann, die in Atomic Absorption Spectroscopy, Item 20, General Tests,
The Pharmacopeia of Japan (12. Überarbeitung,
1991) beschrieben wird. Hierbei wird konzentrierte Salzsäure zu dem
wäßrigen Sol
des Komplexes oder zu dein pulverförmigen Komplex gegeben. Die
in dein komplex enthaltenen Metalle werden zersetzt, bis die Metalle
vollständig
in Chloride überfüht worden
sind. Das Reaktionsgemisch wird dann in geeigneter Weise verdünnt, und
die resultierende Lösung
wird einer Atomabsorptionsspektroskopie unterworfen, wobei Standardlösungen verwendet
werden, die die gleichen Metalle enthalten, um die Gesamtmenge der
in dein Komplex enthaltenen Metalle zu bestimmen.
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Die Menge des wasserlöslichen
Carboxypolysaccharids in dem Komplex ist ein Wert, der erhalten
wird, indem man eine Messung nach der Schwefelsäure-Anthron-Methode gemäß dem in
Analytical Chem., 25, 1656 (1953) beschriebenen Verfahren durchführt. Das
heißt,
die bei der obigen Messung der Menge von Eisen und anderen Metallen
erhaltene, mit Salzsäure
zersetzte Lösung
wird in geeigneter Weise verdünnt.
Zur resultierenden Lösung
wird das Schwefelsäure-Anthron-Reagens
gegeben, um eine Farbe zu entwickeln, und die Absorption wird gemessen.
Gleichzeitig wird in gleicher Weise eine Farbe entwickelt unter
Verwendung des bei der Herstellung des Komplexes verwendeten Carboxypolysaccharids
als Standardsubstanz. Die Absorption wird gemessen. Das Verhältnis dieser
zwei Absorptionen wird errechnet, um die Menge des wasserlöslichen Carboxypolysaccharids
zu bestimmen.
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Der Teilchendurchmesser des magnetischen Eisenoxids,
das den Kern des Komplexes bildet, wird unter Verwendung eines Röntgendiffraktometers (Target:
Co, Wellenlänge
1,790 Å)
bestimmt. Wenn das erfindungsgemäße Komplexpulver,
erhalten durch Gefriertrocknen, einer Röntgenbeugung unterworfen wird,
dann können
mehrere Beugungspeaks entsprechend einer spezifischen Verbindung
beobachtet werden, und es kann festgestellt werden, daß das in
dein Komplex enthaltene magnetische Eisenoxid in kristalliner Form
vorliegt. Der obige Beugungspeak ist breiter, nämlich kleiner, wenn der Durchmesser
des magnetischen Eisenoxids, das in dem Komplex enthalten ist, kleiner
ist. Somit kann im Falle, daß der
Teilchendurchmesser des in dem Komplex enthaltenen magnetischen
Eisenoxids 0,1 μm oder
weniger ist, der Teilchendurchmesser durch Röntgenbeugung bestimmt werden.
Das heißt,
der Teilchendurchmesser (d. h. Kerndurchmesser) kann nach der folgenden
Scherrer-Gleichung für
den stärksten
Peak bei der Röntgenbeugung
erhalten werden.
D = kλ/βcosθ,
β = (B2 – b2)1/2
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Darin bedeuten:
D: Teilchendurchmesser
(Å)
K:
Konstante, 0,9
λ:
Röntgenwellenlänge (1,790 Å)
θ: Braggwinkel
(Grad)
B : Halbwertsbreite der Probe (Radian)
b: Halbwertsbreite
der Standardprobe (Radian)
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Bei der obigen Methode ist die verwendete Standardprobe
ein Magnetit mit einem Teilchendurchmesser von 1 μm oder mehr.
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Der Gesamtdurchmesser des erfindungsgemäßen magnetischen
Komplexes ist ein Wert, der durch Messung unter Verwendung eines
dynamischen lichtstreuenden Photometers DLS-700, hergestellt von
Ohtsuka Electronic Co., nach der dynamischen Lichtstreuungsmethode
[vgl. z. B. Polymer J., 13, 1037–1043 (1981)] gemessen wird.
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Der erfindungsgemäße Komplex ist kein bloßes Gemisch,
sondern eine Verbindung aus magnetischem Eisenoxid und wasserlöslichen
Carboxypolysacchariden. Dies geht beispielsweise aus der Tatsache
hervor, daß beim
Fraktionieren eines wäßrigen Sols
des erfindungsgemäßen magnetischen
Eisenoxidkomplexes unter Verwendung einer Gelfiltrationssäule ein
Elutionspeak beim Elutionspunkt des höheren Molekulargewichts als
das Molekulargewicht des wasserlöslichen
Carboxypolysaccharids beobachtet wird, und daß bei der Analyse des Peaks
sowohl ein Saccharid als auch Eisen im Peak nachgewiesen werden,
und daß,
wenn bei der Vorbereitungsstufe für den magnetischen Komplex
die Reinigung unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran mit
einem Porendurchmesser durchgeführt
wird, der dazu im Stande ist, kleinere Teilchen als die Komplexteilchen durchzulassen,
das Verhältnis
von Saccharid zu Eisen in dem zurückgebliebenen wäßrigen Sol
allmählich
zu einem bestimmten Wert konvergiert. Im allgemeinen wird in dem
Gelfiltrationsmuster des erfindungsgemäßen Komplexes ein Peak von
Carboxypolysaccharid zusätzlich
zu dem Peak, bei dem sowohl ein Saccharid als auch Eisen vorhanden
sind, gesehen.
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Der Magnetismus (z. B. die Magnetisierung und
die Koerzitivkraft) des erfindungsgemäßen magnetischen Komplexes
kann durch eine Magnetisierungs-Magnetfeld-Kurve (als M-H-Kurve bezeichnet) bestimmt
werden, die unter Verwendung eines vibrierenden Probenmagnetmeßgeräts bei Raumtemperatur
erstellt wird. Weiterhin beträgt
die Koerzitivkraft des erfindungsgemäßen Komplexes etwa 5 Oersted oder
weniger, und der Komplex ist im wesentlichen superparamagnetisch.
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Die T2-Relaxation
des erfindungsgemäßen magnetischen
Komplexes kann in der Weise bestimmt werden, daß die Resonanzkurven des Protons
von Wasser oder der wäßrigen Sole,
erhalten durch Verdünnung
des erfindungsgemäßen Komplexes
mit Wasser, so, daß verschiedene
Konzentrationen erhalten werden, und des Verdünnungswassers mittels CW-NMR
von 60 MHz (das magnetische Feld beträgt etwa 1,4 Tesla) erstellt
werden, daß die
Halbwerttsbreite Δv1/2 (Einheit: Hz) des erhaltenen Peaks bestimmt
wird, daß 1/T2 (Einheit: s–1)
= πΔv1/2 berechnet wird, daß die Beziehung von 1/T2 zu der Eisenkonzentration (Einheit: mM)
in dem wäßrigen Sol
der Testprobe aufgetragen wird und daß die T2-Relaxation
[Einheit: (mMs)–1] aus der Neigung der
Geraden, bestimmt durch die kleinste Quadratmethode, bestimmt wird.
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In dem erfindungsgemäßen wasserlöslichen Carboxypolysaccharid-magnetisches
Eisenoxid-Komplex liegen der Kerndurchmesser, der Gesamtdurchmesser,
das Verhältnis
Gesamtdurchmesser/Kerndurchmesser und die T2-Relaxation
jeweils in den Bereichen von in allgemeinen 2 bis 7 nm, 5 bis 40
nm, 10 oder weniger und 10 bis 150 (mMs)–1;
vorzugsweise 3 bis 6 nm und 15 bis 120 (mM s)–1;
mehr bevorzugt 3 bis 5 nm, 15 bis 30 nm, 7 oder weniger, und 15
bis 100 (mMs)–1.
Weiterhin kann in dem erfindungsgemäßen Komplex die Magnetisierung
bei 1 Tesla im Bereich von im allgemeinen 10 bis 100 emu, vorzugsweise
20 bis 90 emu, pro g in dem Komplex enthaltenem Eisen liegen.
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Der erfindungsgemäße Komplex hat, wenn er dadurch
erhalten worden ist, daß das
Molverhältnis
von zweiwertigem Eisen zu dreiwertigem Eisen klein eingestellt wird
und daß weiterhin
die Zugabe- oder Mischzeit klein gemacht wird, im Vergleich zu einem
Produkt, das dadurch erhalten worden ist, daß lediglich das Molverhältnis klein
gemacht wurde, den Vorteil, daß der
Verminderungsgrad der T2-Relaxation im Vergleich
zu den Verminderungen des Durchmessers der magnetischen Eisenoxidkernteilchen und
des Gesamtdurchmessers des Komplexes klein ist. Wenn beispielsweise
der Komplex von Beispiel 7 (wie später beschrieben), erhalten
unter Verwendung eines Molverhältnisses
zweiwertiges Eisenldreiwertiges Eisen = 1 : 4 und einer Reaktionszeit
von 15 Minuten mit dem Komplex des Beispiels 8 (wie später beschrieben),
erhalten unter Anwendung des gleichen Molverhältnisses und einer Reaktionszeit
von 40 Sekunden, verglichen wird, dann beträgt der Durchmesser der magnetischen
Eisenoxidteilchen 6,7 nm bzw. 5,3 nm; der Gesamtdurchmesser beträgt 27 nm
bzw. 23 nm; und die T2-Relaxation beträgt 52 (mMs)–1 bzw.
64 (mMs)–1.
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Wenn verschiedene herkömmliche
magnetische Komplexe jeweils mit einem großen Teilchendurchmesser beispielsweise
intravenös
Kaninchen in Form eines wäßrigen Sols
verabreicht werden, dann wird bei den Kaninchen eine signifikante
Verringerung des Blutdrucks in mehreren Minuten bewirkt, und diese
sterben in einigen Fällen.
Demgegenüber tritt
bei dem erfindungsgemäßen Komplex
keine derartige Verminderung des Blutdrucks auf oder die Verminderung
des Blutdrucks ist sehr gering, und es wird eine signifikante Verbesserung
festgestellt.
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Es wurde auch gefunden, daß der erfindungsgemäße Komplex
eine sehr niedrige Plättchen-agglutinierende
Aktivität
hat. Das heißt,
wenn verschiedene Komplexe beispielsweise intravenös Kaninchen
in der Form eines wäßrigen Sols
verabreicht werden und das Verhältnis
der Plättchenzahl im
peripheren Blut 5 Minuten nach Verabreichung zu der Plättchenzahl
gerade vor der Verabreichung, d. h. wenn die prozentuale Retention
der Plättchen
gemessen wird, dann beträgt
die Plättchenretention
1 bis 10% im Falle von Komplexen mit großem Teilchendurchmesser, während sie
10% oder mehr im Falle des erfindungsgemäßen Komplexes beträgt. So gibt
beispielsweise der Komplex des Vergleichsbeispiels 1 (nachstehend
beschrieben) eine Plättchenretention
von 3%.
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Wenn der erfindungsgemäße wasserlösliche Carboxypolysaccharid-magnetisches
Eisenoxid-Komplex in Form eines wäßrigen Sols intravenös Mäusen verabreicht
wird, dann ist die akute Toxizität LD50 des Komplexes 30 bis 80 mmol/kg, ausgedrückt als
Metall. Demgegenüber
betragen die akuten Toxizitäten
LD50 der in den Vergleichsbeispielen erhaltenen
magnetischen Komplexe 5 bis 80 mmol/kg. Es wird somit ersichtlich,
daß die
"Coxizität
des erfindungsgemäßen Komplexes
im Vergleich mit den Komplexen der Vergleichsbeispiele äquivalent
oder sehr niedrig ist.
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Es wurde gefunden, daß mindestens
ein Teil des erfindungsgemäßen wasserlöslichen
Carboxypolysaccharid-magnetisches Eisenoxid-Komplexes, der intravenös verabreicht
wird, sich in Organen mit einem gut entwickelten Reticulo-endothelialen
System, wie der Leber, ansammelt. Auf der Basis dieser Tatsache
wurde der Metabolismus des erfindungsgemäßen Komplexes in der Weise
untersucht, daß der Magnetisierungsgrad
der Leber unter Anwendung von CW-NMR gemessen wurde. Hierzu wurde
das wäßrige Sol
des Komplexes intravenös
Ratten in einer Menge von 0,1 mmol/kg als Metall verabreicht. 1/T2 wurde bei der Rattenleber in der gleichen
Weise wie bei der Messung der T2-Relaxation zu Zeitpunkten
von beispielsweise dem Verstreichen von einer Stunde, 2 Stunden,
4 Stunden, 1 Tag, 3 Tagen, 7 Tagen und 14 Tagen nach der Verabreichung
bestimmt. Korrekturen erfolgten unter Verwendung des 1/T2-Werts der Lebern der Gruppe von Ratten,
denen nichts verabreicht worden war. Dann wurde der Metabolismus
jedes Komplexes als Halbwertszeit aus der Beziehung zwischen 1/T2 und der Zeit nach Verabreichung bestimmt.
Die Halbwertszeit des erfindungsgemäßen Komplexes beträgt etwa
2 bis etwa 3 Tage, während
diejenige der in den Vergleichsbeispielen erhaltenen Komplexe etwa
3 bis etwa 7 Tage beträgt.
Diese Ergebnisse zeigen daher, daß der erfindungsgemäße Komplex
leichter metabolisiert wird.
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Wie vorstehend beschrieben, wird
der erfindungsgemäße Komplex
in Organe aufgenommen, die ein Reticulo-endotheliales System haben,
wie Leber, Milz, Lymphknoten und Knochenmark. Die Mengen des aufgenommenen
oder in diesen Organen akkumulierten Komplexes werden vom Teilchendurchmesser
des Komplexes beeinflußt.
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Wenn beispielsweise der Teilchendurchmesser
klein ist, dann nimmt die Menge des in die Lymphknoten aufgenommenen
Komplexes zu, und die in-Blut-Halbwertszeit des verabreichten Komplexes wird
verlängert.
Erfindungsgemäß kann der
Teilchendurchmesser des Komplexes durch geeignete Auswahl der Reaktionsbedingungen
bei der Herstellung des Komplexes variiert werden. Somit können Komplexe
mit gewünschtem
Teilchendurchmesser und Akkumulationseigenschaften hergestellt werden.
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Der erfindungsgemäße Komplex weist verschiedene
ausgezeichnete Eigenschaften, wie oben erwähnt, auf, und er kann auf den
Gebieten der medizinischen Behandlung, der Biologie und des Engineering
verwendet werden, beispielsweise als Eisenergänzungsmittel, als Röntgenkontrastmittel,
als MRI-Kontrastmedium, als Reagens für die Messung des Blutstroms
und als Träger
für Arzneimittel,
wenn das Arzneimittel einem topischen Teil unter Anwendung eines
magnetischen Feldes verabreicht wird. Der erfindungsgemäße Komplex
kann besonders bevorzugt als MRI-Kontrastmedium für Lymphknoten, Knochenmark
und Blutgefäße oder
als Reagens für die
Messung der intravaskulären
Fließmenge
in Blutgefäßen, Lymphgefäßen oder
dgl. eingesetzt werden.
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Wenn der erfindungsgemäße Komplex
als MRI-Kontrastmedium verwendet wird, dann ist es zweckmäßig, den
Komplex in der Form eines wäßrigen Sols
einzusetzen. Obgleich die Komplexkonzentration über einen weiten Bereich variiert
werden kann, kann die Konzentration von beispielsweise im allgemeinen
1 mmol/l bis 4 mol/l, vorzugsweise 0,01 bis 2 mol/l, ausgedrückt als
Metall, eingestellt werden. Bei der Herstellung des wäßrigen Sols
ist es möglich,
verschiedene physiologisch annehmbare Hilfsstoffe, wie beispielsweise
anorganische Salze (z. B. Natriumchlorid), Monosaccharide (z. B.
Glucose), Zuckeralkohole (z. B. Mannit oder Sorbit), Phosphatpuffermittel
und Trispuffermittel zuzusetzen. Bei Verwendung des erfindungsgemäßen Komplexes
als MRI-Kontrastmedium hängen
diese Verwendungsmengen je nach den Diagnosestellen ab, liegen aber im
allgemeinen im Bereich von gewöhnlich
1 μmol/kg bis
10 mmol/kg, vorzugsweise 2 μmol/kg
bis 1 mmol/kg, ausgedrückt
als Metall. Als Verabreichtungsmethoden für den erfindungsgemäßen Komplex
können
beispielsweise intravenöse,
intraarterielle, intravesikale, intramuskuläre und subkutane Injektionen
genannt werden. In einigen Fällen
ist auch eine orale Verabreichung oder eine direkte enterale Verabreichung möglich. Im übrigen ist
der erfindungsgemäße Komplex
nicht nur als Kontrastmedium für
T2-Abbildungen geeignet, sondern auch als Kontrastmedium
für T1-Abbildungen.
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Um ein MRI-Bild zu erhalten, wird
der erfindungsgemäße Komplex
der zu untersuchenden Person in der oben genannten wirksamen Menge
verabreicht. Die Abbildung erfolgt durch an sich bekannte Verfahren
unter Verwendung einer an sich bekannten MRI-Vorrichtung. Auf diese
Weise kann ein Bild der Versuchsperson erhalten werden. Zu diesern
Zeitpunkt kann sowohl ein T1-gewichtetes
MR-Bild als auch ein T2-gewichtetes Bild
erhalten werden, indem die Pulsfrequenz ausgewählt wird. Die Zeit von der Verabreichung
des erfindungsgemäßen Komplexes bis
zur Photographie variiert entsprechend der Stelle, bei der ein MRI-Bild
genommen wird, liegt aber im allgemeinen nach der Verabreichung
bis etwa eine Woche danach. Die optimale Zeit kann leicht experimentell
ermittelt werden. Beispielsweise liegt der Zeitpunkt der Photograple
der Blutgefäße gerade
nach Verabreichung bis etwa 20 Stunden davon, vorzugsweise etwa
10 Stunden gerade nach der Verabreichung. Die Zeit für die Photographie
der Leber oder der Milz liegt etwa 15 Minuten bis etwa 1 Woche nach der
Verabreichung, vorzugsweise et- wa 30 Minuten bis etwa 3 Tage, und
die Zeit für
die Photographie der Lymphknoten beträgt etwa 5 Stunden bis etwa
1 Woche nach der Verabreichung, vorzugsweise etwa 10 Stunden bis
etwa 3 Tage.
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BEISPIELE
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Die Erfindung wird nachfolgend anhand
der Vergleichsbeispiele, der Beispiele etc. genauer erläutert.
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Vergleichsbeispiel 1
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105 g Carbaxydextran (nachstehend
als CDX abgekürzt)
mit einer grundmolaren Viskositit von 0,050 dl/g werden in 350 ml
Wasser aufgelöst. Hierzu
wird eine wäßrige Lösung, erhalten
durch Auflösen
unter einem Stickstoffstroin von 13,6 g Eisen(II)-chloridtetrahydrat
in 140 ml 1 M wäßriger Eisen(III)-chloridlösung (entsprechend
37,8 g Eisen(III)-chloridhexahydrat) gegeben. Hierzu werden 242
ml einer wäßrigen 3
N Natriumhydroxidlösung
innerhalb von 15 Minuten unter Erhitzen auf 80°C und Rühren gegeben. Dann wird der
pH-Wert der resultierenden Löstung
durch Zugabe von 6 N Salzsäure auf
7,0 eingestellt, und dann wird die Lösung erhitzt und eine Stunde
lang am Rückfluß gekocht.
Nach dem Abkühlen
wird bei 2100 G 30 Minuten lang zentrifugiert. Ethanol wird in einer
Menge entsprechend 78% des Überstandsvolumens
zugesetzt, um den Komplex auszufällen.
Es wird 10 Minuten lang bei 2100 G zentrifugiert. Der erhaltene
Niederschlag wird in Wasser aufgelöst und gegen laufendes Wasser
16 Stunden lang dialysiert. Das Dialysat wird auf einen pH-Wert
von 7,2 unter Verwendung von Natriumhydroxid eingestellt und bei
vermindertem Druck eingeengt. Das Konzentrat wird durch einen Membranfilter (Porengröße: 0,2 μm) filtriert,
wodurch 186 ml des angestrebten wäßrigen Sols des Komplexes des
Vergleichsbeispiels 1 erhalten werden. Eisenkonzentration: 52 mg/ml
(Eisenausbeute: 91%), Teilchendurchmesser des magnetischen Eisenoxids:
8,4 nm, Gesamtteilchendurchmesser: 61 nm, Gewichtsverhältnis wasserlösliches
Carboxypolysaccharid/Eisen: 1,15, Magnetisierung bei 1 Tesla: 98
emu/g von Eisen, T2-Relaxation: 240 (mMs)–1.
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Vergleichsbeispiel 2
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1050 g CDX mit einer Grundviskosität von 0,050
dl/g werden in 3500 ml Wasser gelöst. Hierzu wird eine wäßrige Lösung, erhalten
durch Auflösen unter
Stickstoffstrom von 136 g Eisen(II)-chloridtetrahydrat in 1400 ml
wäßriger 1
M Eisen(III)-chloridlösung
(entsprechend 378 g Eisen(III)-chloridhexahydrat) gegeben. Hierzu
werden 2420 ml einer wäßrigen 3
N Natriumhydroxidlösung
innerhalb von 12 Minuten unter Erhitzen auf 80°C und Rühren gegeben. Dann wird der
pH-Wert der resultierenden Lösung durch
Zugabe von 6 N Salzsäure
auf 7,1 eingestellt, und dann wird die Lösung erhitzt und zwei Stunden lang
am Rückfluß gekocht.
Nach dem Abkühlen
wird bei 2100 G 30 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand
wird durch einen Membranfilter (Porengröße: 0,2 μm) filtriert. Wasser wird zugesetzt,
um das Gesamtvolumen auf 10 1 einzustellen. Das Gemisch wird auf
1,5 l durch Ultrafiltration (fraktionelles Molekulargewicht: 100.000
Dalton) eingeengt. Unter Zugabe von Wasser zu dem Konzentrat wird
eine Ultrafiltration (fraktionelles Molekulargewicht: 100.000 Dalton)
durchgeführt,
bis die Menge der ausgetragenen Flüssigkeit 12 l wird. Zu der
Filtrationsinnenlösung
wird die erforderliche Menge von CDX zugesetzt, so daß das Gewichtsverhältnis von
CDX zu Eisen 1 : 1 wird. Dann wird der pH-Wert des Gemisches auf 7,0 mit Natriumhydroxid
eingestellt, und es wird bei 2100 G 1 Stunde und 30 Minuten lang
zentrifugiert. Das überstehende
Produkt wird durch einen Membranfilter (Porengröße: 0,2 im) filtriert, wodurch 1,9
1 des angestrebten wäßrigen Sols
des Vergleichsbeispiels 2 erhalten werden. Eisenkonzentration: 56
mg/ml(Eisenausbeute: 88%), Teilchendurchmesser des magnetischen
Eisenoxids: 8,4 nm, Gesamtteilchendurchmesser: 70 nm, Gewichtsverhältnis wasserlösliches
Carboxypolysaecharid/Eisen: 1,14, Magnetisierung bei 1 Tesla: 96
emu/g von Eisen, T2-Relaxation: 232 (mM s)–1.
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Vergleichsbeispiel 3
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500 ml einer Lösung, enthaltend 75,5 g Eisen(III)-chloridhexahydrat
und 32 g Eisen(II)-chloridtetrahydrat werden zu 500 ml 16%igem Ammoniakwasser,
in dem 250 g Dextran mit einer Grundviskosität von 0,075 dl/g aufgelöst worden
sind, allmählich im
Verlauf von 5 Minuten unter heftigem Rühren gegeben. Die resultierende
Aufschlämmung
wird einem Ultraschallvermahlen (30 Minuten) unterworfen, erhitzt
(100°C,
10 Minuten, abgekühlt
und zentrifugiert (1000 G, 20 Minuten). Der Überstand wird mit Wasser verdünnt, um
ein Gesamtvolumen von 2 1 einzustellen. Die resultierende Lösung wird
einer Ultrafiltration (fraktionelles Molekulargewicht: 100.000 Dalton)
unterworfen, um sie auf 500 ml einzuengen. Zu dein Konzentrat werden
1,61 Wasser gegeben. Die Lösung
wird einer Ultrafiltration (fraktionelles Molekulargewicht: 100.000
Dalton) unterworfen, um sie auf 500 ml einzuengen. Diese Verfahrensweise
der Zugabe von Wasser und der Einengung wird insgesamt fünfmal wiederholt.
Dann werden zu dem Konzentrat 500 ml einer 1 M Natriumcitratlösung gegeben.
Das Gemisch wird gegen einen 10 mM Ammoniumcitratpuffer mit Ammoniakwasser
auf einen pH-Wert von 8,2 eingestellt und 16 Stunden lang dialysiert.
Das Dialysat wird auf 120 ml durch Ultrafiltration (fraktionelles
Molekulargewicht: 100.000 Dalton) eingeengt. Das Konzentrat wird
durch einen Membranfilter (Porengröße: 0,2 μm) filtriert. Eine Autoklavenbehandlung
wird bei 121°C
30 Minuten lang durchgeführt, wodurch
115 ml des angestrebten wäßrigen Komplexsols
des Vergleichsbeispiels 3 erhalten werden. Eisenkonzentration: 57
mg/ml (Eisenausbeute: 23%), Teilchendurchmesser des magnetischen
Eisenoxids: 8,1 nm, Gesamtteilchendurchmesser: 220 nm, Gewichtsverhältnis Dextran/Eisen:
0,36, Magnetisieiung bei 1 Tesla: 83 emu/g von Eisen, T2-Relaxation:
255 (mMs)–1.
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Vergleichsbeispiel 4
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Der im Vergleichsbeispiel 1 erhaltene
Komplex wurde Ratten intravenös
in einer Menge von 200 μmol
als Fe pro kg Körpergewicht
verabreicht. 24 Stunden später
wurden die Leber, die Milz und die Lymphknoten (von verschiedenen
Körperteilen)
jeder Ratte herausgenommen, und ihre MR-Bilder wurden aufgenommen
und verglichen. Um den Vergleich der MR-Bilder zu erleichtern, wurde
ein ex-vivo-Test durchgeführt,
bei dem Schnitte der obigen Organe und Gewebe in ein Agarphantom
eingebettet wurden.
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Das MR-Bild des Agarphantoms wurde
bei 1,5 Tesla (Siemens Magnetom GBS2) mittels einer Spin-Echo-Technik
(TR 2000 ms, TE 15 ms, Schnittdicke 2 mm) aufgenommen. Die Ergebnisse
sind in 1 gezeigt.
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In der 1 ist
die Anordnung der Organe und der Gewebe, die in das Agarphantom
eingebettet sind, wie folgt.
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Anordnungsmuster der Organe und Gewebe im
Agarphantom
| Linke
Seite der Photographie | Rechte
Seite der Photographie |
| Leber | Milz |
| mandibulare
Lymphknoten (rechte Körperseite) | mandibulare
Lymphknoten (linke Körperseite) |
| axillare
Lymphknoten (rechte Körperseite) | axillare
Lymphknoten (linke Körperseite) |
| mesenteriale
Lymphknoten (rechte Körperseite) | mesenteriale
Lymphkoten (linke Körperseite) |
| iliale
Lymphknoten (rechte Körperseite) | iliale
Lymphknoten (linke Körperseite) |
| Inguinal-Lymphknoten (rechte
Körperseite) | Inguinal-Lymphknoten (linke
Körperseite) |
| Popliteal-Lymphknoten (rechte
Körperseite) | Popliteal-Lymphknoten (linke
Körperseite) |
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Aus 1 wird
ersichtlich, daß der
in Beispiel 1 erhaltene magnetische Eisenoxidkomplex feststellbare
Effekte in der Leber und in der Milz zeigt, aber in verschiedenen
Lymphknoten nur geringfügige oder
nicht ausreichende Effekte zeigt.
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Vergleichsbeispiel 5
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Die Bluteliminierungskinetik des
im Vergleichsbeispiel 1 erhaltenen Komplexes wurde bei Ratten untersucht.
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Ratten mit einem Körpergewicht
von 50 bis 300 g wurden unter Ethernarkose mit einem 50,5 cm langen
Polyethylenschlauch in der Arteria carotis communis katheterisiert.
Der Katheter (Schlauch) wurde mit einer heparinisierten physiologischen
Natriumchloridlösung
gefüllt.
Jeder Post-Narkose-Blutbasislinienwert wurde mit einer Blutprobe,
enthaltend 0,41 ml Blut, 0,2 ml heparinisierte physiologische Natriumchloridlösung vom
Schlauch und 0,1 ml heparinisierte physiologische Natriumchloridlösung, gelagert
in der Spritze, erhalten.
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Nachdem der im Vergleichsbeispiel
1 erhaltene Komplex in einer Menge von 200 μmol als Fe pro kg Körpergewicht
verabreicht worden war, wurden Blutproben (Gemische aus Blut und
heparinisierter physiologischer Natriumchloridlösung) 5, 10, 20, 30, 60, 90,
120, 180 und 240 Minuten nach der Verabreichung abgenommen. Der
Blutverlust durch die obige Probeabnahme wurde durch Injektion eines gleichen
Volumens einer heparinisierten physiologischen Natriumchloridlösung ausgeglichen.
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Die Blutproben wurden dreifach mit
destilliertem Wasser verdünnt.
Die Relaxationszeiten wurden direkt unter Verwendung eines Pulsspektrometers (Bruker
Minispec pc 120) gemessen. Die T1- und T2-Relaxationszeiten wurden durch die Inversion-Rückgewinnungs-Technik
bzw. die Spin-Echo-Technik bestimmt. Die kinetischen Parameter wurden
aus den Grundlinien-korrigierten Relaxationsraten über die
Zeit errechnet.
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Die Halbwertszeiten der Bluteliminierung nach
der Verabreichung des obigen Komplexes (200 μmol als Fe pro kg Körpergewicht),
erhalten durch Messung der T1- und T2-Relaxationszeiten, betrugen 0,78 ± 0,28
Stunden bzw. 0,72 + 0,34 Stunden, ausgedrückt als Mittelwert von Ratten
einer Gruppe (drei Ratten).
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Beispiel 1
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105 g CDX mit einer Grundviskosität von 0,050
dl/g werden in 350 ml Wasser gelöst.
Hierzu wird eine wäßrige Lösung, erhalten
durch Auflösen unter
einem Stickstoffstrom von 13,6 g Eisen(II)-chloridtetrahydrat in
140 ml wäßrigen 1
M Eisen(III)chloridlösung
(entsprechend 37,8 g Eisen(III)-chloridhexahydrat) gegeben. Hierzu
werden 242 ml wäßrige 3 N
Natriumhydroxidlösung
innerhalb von 30 Sekunden unter Erhitzen und Rühren gegeben. Dann wird der
pH-Wert der resultierenden Lösung
mit Zugabe von 6 N Salzsäure
auf 7,0 eingestellt, wonach die Lösung eine Stunde lang erhitzt
und am Rückfluß gekocht
wird. Nach dein Abkühlen
wird die gleiche Prozedur wie im Vergleichsbeispiel 1 angewendet,
wodurch 170 ml des angestrebten wäßrigen Sols des Komplexes des
Beispiels 1 erhalten werden. Eisenkonzentration: 59 mg/ml (Eisenausbeute:
84%), Teilchendurchmesser des magnetischen Eisenoxids: 5,8 nm, Gesamtteilchendurchmesser:
31 nm, Gewichtsverhältnis
wasserlösliches
Carboxypolysaccharid/Eisen: 1,26, Magnetisierung bei 1 Tesla: 77
emu/g von Eisen, T2-Relaxation: 85 (mMs)–1.
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Beispiel 2
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1050 g CDX mit einer Grundviskosität von 0,050
dl/g werden in 3500 ml Wasser gelöst. Danach wird eine wäßrige Lösung, erhalten
durch Auflösen unter
einem Stickstoffstrom von 136 g Eisen(II)-chloridtetrahydrat in
1400 ml einer wäßrigen 1
M Eisen(III)-chloridlösung
(entsprechend 378 g Eisen(III)-chloridhexahydrat) zugesetzt. Hierzu
werden 2420 ml wäßrige 3
N Natriumhydroxidlösung
innerhalb 30 Sekunden unter Erhitzen und Rühren gegeben. Dann wird die
gleiche Verfahrensweise wie in Vergleichsbeispiel 2 beschrieben
angewendet, wodurch 1,8 1 des angestrebten wäßrigen Sols des Komplexes des
Beispiels 2 erhalten werden. Eisenkonzentration: 57 mg/ml (Eisenausbeute:
83%), Teilchendurchmesser des magnetischen Eisenoxids: 5,7 nm, Gesamtteilchendurchmesser:
35 nm, Gewichtsverhältnis
wasserlösliches
Carboxypolysaccharid/Eisen: 1,28, Magnetisierung bei 1 Tesla: 75
emu/g von Eisen, T2-Relaxation: 82 (mMs)–1.
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Beispiel 3
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105 g CDX mit einer Grundviskosität von 0,050
dl/g werden in 350 ml Wasser aufgelöst. Hierzu wird eine wäßrige Lösung, erhalten
durch Auflösen unter
einem Stickstoffstrom von 9,1 g Eisen(II)-chloridtetrahydrat und
3,1 g Zinkchlorid in 140 ml einer wäßriger 1 M Eisen(III)-chloridlösung (entsprechend 37,8
g Eisen(III)-chloridhexahydrat) gegeben. Hierzu werden 242 ml einer
wäßrigen 3
N Natriumhydroxidlösung
innerhalb von 30 Sekunden unter Erhitzen und Rühren gegeben. Dann wird der
pH-Wert der resultierenden Lösung
durch Zugabe von 6 N Salzsäure
auf 7,0 eingestellt. Danach wird die Lösung eine Stunde lang erhitzt
und am Rückfluß gekocht.
Nach dem Abkühlen
wird 30 Minuten lang bei 2100 G zentrifugiert. Ethanol wird in einer
Menge entsprechend 70% des Überstandsvolumens
zugegeben, um einen Komplex auszufällen. Es wird bei 2100 G l0
Minuten lang zentrifugiert. Der erhaltene Niederschlag wird in Wasser
aufgelöst
und gegen laufendes Wasser 16 Stunden lang dialysiert. Das Dialysat
wird unter Verwendung von Natriumhydroxid auf einen pH von 7,2 eingestellt
und bei vermindertem Druck eingeengt. Das Konzentrat wird durch
einen Membranfilter (Porengröße: 0,2 μm) filtriert,
wodurch 144 ml des angestrebten wäßrigen Sols des Komplexes des
Beispiels 3 erhalten werden. Eisenkonzentration: 54 mg/ml, Zinkkonzentration:
6 mg/ml (Eisenausbeute: 83%, Zinkausbeute: 60%), Teilchendurchmesser
des magnetischen Eisenoxids: 4,9 nm, Gesamtteilchendurchmesser:
27 nm, Gewichtsverhältnis
wasserlösliches Carboxypolysaccharid/Eisen:
1,31, Magnetisierung bei 1 Tesla: 79 emu/g des Metalls, T2-Relaxation: 84 (mM s)–1.
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Beispiel 4
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105 g CDX mit einer Grundviskosität von 0,050
dl/g werden in 350 ml Wasser gelöst.
Hierzu wird eine wäßrige Lösung, erhalten
durch Auflösen unter
einem Stickstoffstrom von 13,6 g Eisen(II)-chloridtetrahydrat in
140 ml einer wäßrigen 1
M Eisen(III)-chloridlösung
(entsprechend 37,8 g Eisen(III)-chloridhexahydrat) gegeben. Hierzu
werden 242 ml einer wäßrigen 3
N Natriumhydroxidlösung
innerhalb von 50 Sekunden unter Erhitzen und Rühren gegeben. Dann wird die
gleiche Verfahrensweise wie in Vergleichsbeispiel 1 durchgeführt, wodurch
166 ml des angestrebten wäßrigen Sols
des Komplexes des Beispiels 4 erhalten werden. Eisenkonzentration:
57 mg/ml (Eisenaus beute: 82%), Teilchendurchmesser des magnetischen
Eisenoxids: 6,8 nm, Gesamtteilchendurchmesser: 40 nm, Gewichtsverhältnis wasserlösliches
Carboxypolysaccharid/Eisen: 1,55, Magnetisierung bei 1 Tesla: 79
emu/g von Eisen, T2-Relaxation: 135 (mMs)–1 .
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Beispiel 5
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105 g CDX mit einer Grundviskosität von 0,050
dl/g werden in 350 ml Wasser aufgelöst. Hierzu wird eine wäßrige Lösung, erhalten
durch Auflösen unter
einem Stickstoffstrom von 13,6 g Eisen(II)-chloridtetrahydrat in
140 ml wäßriger 1
M Eisen(III)chloridlösung
(entsprechend 37,8 g Eisen(III)-chloridhexahydrat) gegeben. Hierzu
werden 242 ml wäßrige 3 N
Natriumhydroxidlösung
innerhalb von 30 Sekunden unter Erhitzen auf 40°C und Rühren gegeben. Dann wird die
gleiche Verfahrensweise wie in Vergleichsbeispiel 1 angewendet,
wodurch 150 ml des angestrebten wäßrigen Sols des Komplexes des
Beispiels 5 erhalten werden. Eisenkonzentration: 59 mg/ml (Eisenausbeute:
76%), Teilchendurchmesser des magnetischen Eisenoxids: 5,5 nm, Gesamtteilchendurchmesser:
24 nm, Gewichtsverhältnis
wasserlösliches
Carboxypolysaccharid/Eisen: 1,11, Magnetisierung bei 1 Tesla: 81
emu/g von Eisen, T2-Relaxation: 82 (mMs)–1 .
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Beispiel 6
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105 g CDX mit einer Grundviskosität von 0,050
dl/g werden in 350 ml Wasser aufgelöst. Hierzu wird eine wäßrige Lösung, erhalten
durch Auflösen unter
einem Stickstoffstrom von 10,6 g Eisen(II)-chloridtetrahydrat in
158 ml wäßriger 1
M Eisen(III)chloridlösung
(entsprechend 42,7 g Eisen(III)-chloridhexahydrat) gegeben. Hierzu
werden 228 ml einer wäßrigen 3
N Natriumhydroxidlösung
innerhalb von 30 Sekunden unter Erhitzen und Rühren gegeben. Dann wird die
gleiche Verfahensweise wie in Vergleichsbeispiel 1 angewendet, wodurch
202 ml des angestrebten wäßrigen Sols
des Komplexes des Beispiels 6 erhalten werden. Eisenkonzentration:
51 mg/ml (Eisenausbeute: 91%), Teilchendurchmesser des magnetischen
Eisenoxids: 5,3 nm, Gesamtteilchendurchmesser: 28 nm, Gewichtsverhältnis wasserlösliches Carboxypolysaccharid/Eisen:
0,9, Magnetisierung bei 1 Tesla: 69 emu/g von Eisen, T2-Relaxation:
76 (mMs)–1.
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Beispiel 7
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105 g CDX mit einer Grundvislcosität von 0,050
dl/g werden in 350 ml Wasser aufgelöst. Hierzu wird eine wäßrige Lösung, erhalten
durch Auflösen unter
einem Stickstoffstrom von 8,3 g Eisen(II)-chloridtetrahydrat in
168 ml wäßriger 1
M Eisen(III)-chloridlösung
(entsprechend 45,4 g Eisen(III)-chloridhexahydrat) gegeben. Hierzu
werden 232 ml wäßrige 3 N
Natriumhydroxidlösung
innerhalb von 40 Sekunden unter Erhitzen und Rühren gegeben. Dann wird die
gleiche Verfahrensweise wie in Vergleichsbeispiel 1 angewendet,
wodurch 198 ml des angestrebten wäßrigen Sols des Komplexes des
Bei-spiels 8 erhalten
werden. Eisenltonzentration: 54 mg/ml (Eisenausbeute: 91%), Teilchendurchmesser
des magnetischen Eisenoxids: 5,3 nm, Gesamtteilchendurchmesser:
23 nm, Gewichtsverhältnis
wasserlösliches Carboxypolysaccharid/Eisen:
1,0, Magnetisierung bei 1 Tesla: 73 emtu/g von Eisen, T2-Relaxation:
64 (mMs)–1 .
-
Beispiel 8
-
105 g CDX mit einer Grundviskosität von 0,050
dl/g werden in 350 ml Wasser aufgelöst. Hierzu wird eine wäßrige Lösung, erhalten
durch Auflösen unter
einem Stickstoffstrom von 4,2 g Eisen(II)-chloridtetrahydrat in
189 ml einer wäßrigen 1
M Eisen(III)-chloridlösung
(entsprechend 51,0 g Eisen(III)-cliloridhexahydrat) gegeben. Hierzu
werden 240 ml wäßrige 3
N Natriumhydroxidlösung
innerhalb von 30 Sekunden unter Erhitzen und Rühren gegeben. Dann wird die
gleiche Verfahrensweise wie in Vergleichsbeispiel 1 angewendet,
wodurch 205 ml des angestrebten wäßrigen Sols des Komplexes des Beispiels
9 erhalten werden. Eisenkonzentration: 56 mg/ml (Eisenausbeute:
97%), Teilchendurchmesser des magnetischen Eisenoxids: 3,5 nm, Gesamtteilchendurchmesser:
21 nm, Gewichtsverhältnis
wasserlösliches
Carboxypolysaccharid/Eisen: 1,4, Magnetisierung bei 1 Tesla: 36
emu/g von Eisen, T2-Relaxation: 26 (mM.sec)–1.
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Beispiel 9
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Der in Beispiel 1 erhaltene Komplex
wurde intravenös
Kaninchen in einer Menge von 200 μmol als
Fe pro kg Könergewicht
injiziert. In-vivo-MR-Bilder wurden bei 1,5 Tesla (Siemens Magnetom
GBS2) gemäß der Gradienten-Echo-Technik
aufgenommen (TR 135 ins, TE 15 ins, Schnittdicke 3 mm, Flipwinkel 15°). Die Ergebnisse
sind in den
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4A und
4B gezeigt.
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Die 4A ist
ein MR-Bild, aufgenommen vor der Verabreichung des obigen Komplexes.
Die 4B ein MR-Bild, aufgenommen 24
Stunden nach der Verabreichung des gleichen Komplexes in einer Menge
von 200 μmol
als Fe pro kg Körpergewicht. Diese
zwei MR-Bilder zeigen jeweils die Beckenwand des Kaninchens.
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Beim Bild (A) vor der Verabreichung
werden Lymphknoten mit hoher Signalintensität bei der Aortenbifurkation
(Pfeile) gefunden. Im Bild (B) wird eine gleichförmige Signalverringerung in
den Lymphknoten gezeigt, die eine hohe Signalintensität vor der Verabreichung
zeigten (Pfeile). Dagegen werden Übersättigungseffekte durch die Verabreichung
im Knochenmark gesehen (krumme Pfeile).