CN112245407A - 一种基于金属-多酚网络结构的靶向纳米疫苗制备及其产品 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于金属‑多酚网络结构的靶向纳米疫苗的制备方法，是通过制备负载卵清蛋白OVA的介孔二氧化硅纳米颗粒，合成甘露糖修饰单宁酸分子，负载卵清蛋白OVA的介孔二氧化硅纳米颗粒表面涂覆金属‑多酚网络涂层，得到表面涂覆金属‑多酚网络涂层的负载OVA的介孔二氧化硅纳米颗粒，此即为基于金属‑多酚网络结构的靶向纳米疫苗，命名为MS@OVA@MPN@Man。本发明通过表面涂覆金属‑多酚网络涂层防止OVA的泄露并增加纳米颗粒的溶酶体逃逸功能；同时在表面修饰甘露糖，靶向免疫细胞表面的甘露糖受体，增强细胞对其摄取能力以提高疫苗递送效率，解决了纳米疫苗靶向性以及溶酶体逃逸效率的难题。

Description

一种基于金属-多酚网络结构的靶向纳米疫苗制备及其产品

技术领域

本发明涉及一种纳米疫苗制备及其产品，尤其涉及一种基于金属-多酚网络结构的靶向纳米疫苗制备及其产品，属于纳米材料和生物医药技术领域。

背景技术

纳米技术是21世纪科技发展的制高点，是新工业革命的主导技术。由于纳米颗粒具有独特的结构、磁性、机械和尺寸效应，被广泛用于包括生物传感、药物输送、生物成像、催化、纳米制造、润滑、电子、纺织等领域。而目前研究的热点之一是研究和探索用于生物医学领域的各种纳米粒子系统，尤其是应用于肿瘤治疗的纳米粒子，包括介孔二氧化硅、金属纳米粒子、磁性氧化物以及量子点等无机纳米粒子系统。

在肿瘤的各种治疗方式中，利用宿主免疫系统抑制肿瘤生长的免疫疗法在治疗和预防癌症复发方面具有巨大应用潜力。治疗性肿瘤疫苗是肿瘤免疫疗法的一个重要组成部分。近几年，传统肿瘤疫苗取得了不错的进展，但疫苗不能有效运输至引流淋巴结和免疫耐受环境，大大降低了肿瘤疫苗的疗效。纳米技术的引入为改善和解决这些问题提供了契机。与传统疫苗相比，纳米材料不仅能提高抗原/佐剂的稳定性，而且通过优化其组成、粒径、表面性质等，可以有效递送抗原/佐剂至淋巴结，提高抗原提呈细胞特别是树突状细胞(DCs)对抗原的吞噬和递呈，显著增强了疫苗的免疫应答反应。

但是，目前纳米疫苗的构建仍然存在很多亟待解决的问题：比如大量有机试剂的使用，严重影响了其生物相容性以及体内安全性；疫苗的靶向性较弱；疫苗的溶酶体逃逸效率低，诱导抗原特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)应答较弱等。已有的用于溶酶体逃逸材料中，最常用的材料是聚阳离子聚合物(例如聚乙烯亚胺(PEI))和细菌或病毒衍生的细胞穿透肽(cell penetrating peptides，CPPs)。由于PEI具有一定毒性，需要平衡逃逸效率和毒性之间的关系；相反，尽管CPPs显着改善了细胞毒性，但溶酶体逃逸效率也相对较低。因此，提高纳米疫苗的靶向性以及溶酶体逃逸效率是纳米疫苗亟需解决的课题。

经检索，有关利用生物相容性好的介孔二氧化硅纳米颗粒，静电吸附模式抗原卵清蛋白 (OVA)，通过表面涂覆金属-多酚网络(Metal-Phenolic Network,MPN)涂层防止OVA的泄露并增加纳米颗粒的溶酶体逃逸功能；同时在表面修饰甘露糖，靶向免疫细胞表面的甘露糖受体，增强细胞对其摄取能力以提高疫苗递送效率的基于金属-多酚网络结构的靶向纳米疫苗及其制备方法还未见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种基于金属-多酚网络结构的靶向纳米疫苗制备及其产品。

本发明所述的基于金属-多酚网络结构的靶向纳米疫苗的制备方法，步骤是：

(1)负载卵清蛋白OVA的介孔二氧化硅纳米颗粒制备

称取5mg氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒溶于1mL去离子水中，然后加入1mL浓度为1.2mg/mL的FITC标记的卵清蛋白OVA，按如此比例将两者混合，涡旋混匀，磁力搅拌 1-3h；将反应液8000r/min离心5-8min，获得上清液，利用BCA法检测上清液中卵清蛋白 OVA的含量，根据初始投入的OVA量计算介孔二氧化硅纳米颗粒中OVA的吸附量，再水洗两次，即得到负载OVA的介孔二氧化硅纳米颗粒；

(2)甘露糖修饰单宁酸分子的合成

取氨基化的甘露糖分子2-5mg，单宁酸15-25mg，使甘露糖与单宁酸的摩尔比为1:1-1:1.5；然后将两种化合物溶于5mL pH＝7-9的MOPS缓冲溶液中，磁力搅拌10-14h，用分子量为 700K的透析袋透析，即得到甘露糖修饰的单宁酸分子；

(3)负载OVA的介孔二氧化硅纳米颗粒表面涂覆金属-多酚网络涂层

取1mL浓度为3-5mg/mL甘露糖修饰的单宁酸溶液于EP管中，在涡旋状态下缓慢加入浓度为1-3mg/mL的FeCl₃·6H₂O溶液1mL，按如此比例量混合后再涡旋20-30s，得到甘露糖修饰的单宁酸与Fe^III离子通过配位作用形成的金属-多酚网络结构即MPN涂层或者一些自组装形成的颗粒溶液；将得到的溶液用0.22μm过滤器过滤，取1mL过滤后的溶液加入到1 mL步骤(1)制得的浓度为5mg/mL的负载OVA的介孔二氧化硅纳米颗粒溶液中；按如此比例量混合后在旋转仪上旋转反应8-15min，将反应后所得颗粒水洗3-4次，然后用pH＝8.5 的Tris-HCl缓冲溶液洗3-4次，6000-10000g离心5-8min，即得到表面涂覆金属-多酚网络涂层的负载OVA的介孔二氧化硅纳米颗粒，此即为基于金属-多酚网络结构的靶向纳米疫苗，命名为MS@OVA@MPN@Man。

上述基于金属-多酚网络结构的靶向纳米疫苗制备方法中，步骤(1)所述氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒的制备方法是：

称取介孔二氧化硅纳米颗粒30mg，溶于800-1000μL的乙醇溶液中，超声2-3min，使介孔二氧化硅纳米颗粒均匀分散在乙醇溶液中，然后缓慢加入40-60μL的氨水，在涡旋的条件下再加入20-40μL的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，加毕后再涡旋30-40s，放在封闭的反应瓶中磁力搅拌过夜；将过夜反应后的溶液7000-9000r/min离心5-8min，沉淀颗粒甲醇洗 3-4次，然后再用水洗3-4次，即得到氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒。

优选的氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒的制备方法是：

称取介孔二氧化硅纳米颗粒30mg，溶于900μL的乙醇溶液中，超声2min，使介孔二氧化硅纳米颗粒均匀分散在乙醇溶液中，然后缓慢加入50μL的氨水，在涡旋的条件下再加入20μL的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，加毕后再涡旋30s，放在封闭的反应瓶中磁力搅拌过夜；将过夜反应后的溶液8000r/min离心5-8min，沉淀颗粒甲醇洗3次，然后再用水洗 3次，即得到氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒。

上述基于金属-多酚网络结构的靶向纳米疫苗制备方法中，步骤(1)所述FITC标记的卵清蛋白OVA的制备方法是：

准确称取FITC 1mg，溶于30μL二甲基亚砜(DMSO)中，再称取卵清蛋白OVA 30mg，溶于5mL去离子水中，超声使其溶解分散；将所配制的FITC溶液与OVA溶液混匀，磁力搅拌2-3h，4℃过夜；将过夜后的混合液置于3500K的透析袋中透析48-54h，每隔6小时换水，透析完成后，将样品收集到离心管中冷冻干燥24-30h，即得到FITC标记的卵清蛋白 OVA样品。

上述基于金属-多酚网络结构的靶向纳米疫苗制备方法中，步骤(2)所述甘露糖修饰单宁酸分子的合成方法优选是：

取氨基化的甘露糖分子3.25mg，单宁酸20mg；然后将两种化合物溶于5mL pH＝8.5的MOPS缓冲溶液中，磁力搅拌12h，用分子量为700K的透析袋透析，即得到甘露糖修饰的单宁酸分子。

上述基于金属-多酚网络结构的靶向纳米疫苗制备方法中，步骤(3)所述金属-多酚网络结构即MPN涂层的制备方法优选是：

利用pH 8.5的Tris-HCl缓冲溶液将甘露糖修饰的单宁酸配制成浓度为4mg/mL的溶液，同时配制2mg/mL的Fecl₃·6H₂O溶液；取1mL甘露糖修饰的单宁酸溶液于EP管中，在涡旋状态下缓慢加入FeCl₃·6H₂O溶液1mL，再涡旋20s，得到甘露糖修饰的单宁酸与Fe^III离子通过配位作用形成的金属-多酚网络结构涂层溶液。

上述基于金属-多酚网络结构的靶向纳米疫苗制备方法中，步骤(3)所述在旋转仪上旋转反应优选是10min。

上述基于金属-多酚网络结构的靶向纳米疫苗制备方法中，步骤(3)所述离心条件优选是10000g离心5min。

本发明所述方法制备的基于金属-多酚网络结构的靶向纳米疫苗。

本发明利用生物相容性好的介孔二氧化硅纳米颗粒，静电吸附模式抗原卵清蛋白(OVA)，通过表面涂覆金属-多酚网络(Metal-Phenolic Network,MPN)涂层，防止OVA的泄露；金属-多酚网络的涂覆能够增加纳米颗粒的溶酶体逃逸功能；同时在表面进一步修饰靶向分子甘露糖，靶向免疫细胞表面的甘露糖受体，获得了增强细胞对其摄取能力、提高疫苗递送效率的基于金属-多酚网络结构的靶向纳米疫苗。

本发明的技术特点及有益效果是：

(1)将生物相容性好的介孔二氧化硅纳米颗粒表面氨基化，静电吸附模式抗原卵清蛋白(OVA)，通过表面涂覆金属-多酚网络(Metal-Phenolic Network,MPN)涂层，防止OVA的泄露。构建出一种具有抗原提呈细胞靶向、溶酶体逃逸功能且生物相容性好的纳米疫苗。

(2)金属-多酚网络的涂覆能够增加颗粒的溶酶体逃逸功能；表面进一步修饰靶向分子甘露糖，靶向免疫细胞表面的甘露糖受体，增强其细胞摄取能力，提高疫苗递送效率。本发明利用简单、易行的方法解决了纳米疫苗亟需克服的难题，实现了提高纳米疫苗的靶向性以及溶酶体逃逸效率，应用前景广阔。

附图说明

图1为实施例1-实施例7所述纳米颗粒的透射电子显微镜图片，分别为介孔二氧化硅纳米颗粒(MS)，表面涂覆MPN(MS@OVA@MPN)以及加入靶向分子甘露糖的纳米疫苗递送颗粒(MS@OVA@MPN@Man)，结果显示具有MPN涂层的纳米颗粒仍然具有少量介孔二氧化硅的介孔结构。

图2为实施例1-实施例7所述纳米颗粒动态光散射粒径分布，构建的纳米颗粒的动态水合粒径约为200nm。

图3 为为实施例1-实施例7所述纳米颗粒的Zeta电位图，可以看到不同的修饰之后其电位的变化。

图4为所制备的纳米疫苗对细胞活力的影响，在所测浓度范围内，细胞活力均大于80％，说明所得到的纳米颗粒生物相容性较好。

图5为小鼠骨髓间充质干细胞诱导的树突状细胞对所制备的纳米疫苗的摄取水平，加入靶向分子之后，其细胞摄取明显增强。

图6为所制备的纳米疫苗对小鼠骨髓间充质干细胞诱导的树突状细胞成熟标志物CD86 表达的影响。

图7为所制备的纳米疫苗对小鼠骨髓间充质干细胞诱导的树突状细胞成熟标志物CD40 表达的影响。

图8为所述纳米颗粒与RAW264.7细胞共培养后的激光共聚焦图片。

具体实施方式

下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

下述实施例中，所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径得到。

本发明中所用的介孔二氧化硅纳米颗粒可以是市售或以文献公开的方法进行合成，或以本发明实施例1公开的进一步优化的方法制备。氨基化的甘露糖购自买于Sigma公司，甘露糖结构式由式(I)表示。单宁酸购自买于Sigma公司，单宁酸分子的结构式由式(II)表示。所用的小鼠骨髓细胞，小鼠单核巨噬细胞RAW264.7均购自国家模式与特色实验细胞资源库/ 中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，地址：中国科学院细胞库，徐汇区岳阳路320号，上海200031。

实施例1：介孔二氧化硅纳米颗粒的合成(文献中常规制备方法优化)

按照文献中公开的合成方法，合成预设粒径大约110nm的介孔二氧化硅纳米颗粒。

首先称取960mg十六烷基三甲基对甲苯磺铵(CTAT)放入圆底烧瓶中，加入50mL 去离子水溶解。同时加入174mg的三乙醇胺(TEA)，使其充分溶解混匀。油浴温度保持在80℃搅拌1h，缓慢滴加7.81mL的正硅酸乙酯(TEOS)，继续搅拌两小时。将得到的产物水洗三次，乙醇洗三次(离心条件为13000g，10min)。然后将产物放在烘箱中60℃烘干12h。用研钵研磨碎，在马弗炉中保持600℃烧6h，即得到介孔二氧化硅纳米颗粒。将所得到的介孔二氧化硅纳米颗粒干燥保存，通过TEM观察其形貌。见图1。

实施例2：甘露糖修饰的单宁酸分子的合成

称取氨基化的甘露糖(购买于Sigma)3.25mg，称取单宁酸20mg，然后将两种化合物溶于5mL pH＝8.5的MOPS缓冲溶液中，磁力搅拌12h，用分子量为700K的透析袋透析，即得到甘露糖修饰的单宁酸分子。

实施例3：介孔二氧化硅纳米颗粒的氨基化

准确称取介孔二氧化硅纳米颗粒30mg，溶于900μL的乙醇溶液中，超声2min，使介孔二氧化硅纳米颗粒均匀分散在乙醇溶液中，然后缓慢加入50μL的氨水。在涡旋的条件下再加入30μL的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，加毕后再涡旋30s，放在封闭的反应瓶中磁力搅拌过夜。

将过夜反应后的溶液8000r/min离心5min，沉淀颗粒甲醇洗3次，然后再用水洗3次，即得到氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒，保存在4℃，进行表征以及后续实验。

实施例4：FITC标记模式抗原卵清蛋白OVA：

准确称取FITC 1mg，溶于30μL二甲基亚砜(DMSO)中，避光保存。

称取卵清蛋白OVA 30mg，溶于5mL去离子水中，超声使其溶解分散。

将所配制的FITC溶液与OVA溶液混匀，磁力搅拌2h，4℃过夜。

将过夜后的混合液置于3500K的透析袋中透析48h，每隔6小时换水，透析完成后，将样品收集到离心管中冷冻干燥24h，即得到FITC标记的OVA样品。

实施例5：介孔二氧化硅纳米颗粒吸附模式抗原卵清蛋白OVA

将实施例3得到的氨基化介孔二氧化硅纳米颗粒与OVA混合，通过静电吸附作用得到吸附OVA的介孔二氧化硅纳米颗粒。具体方法是：称取5mg氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒溶于1mL去离子水中，然后将1.2mg FITC标记的OVA溶于1mL的去离子水中，使其充分溶解，将两者混合，涡旋混匀，磁力搅拌2h。将所得到的颗粒进行离心(8000r/min,5min)，获得上清液，利用BCA法检测上清液中OVA的含量，根据初始投入的OVA量计算介孔二氧化硅纳米颗粒中OVA的吸附量，再水洗两次，重悬溶液，即得到负载OVA的介孔二氧化硅纳米颗粒溶液。于4℃保存，用于后续实验。

实施例6：金属-多酚网络涂层(MPN涂层)制备

Tris-HCl缓冲溶液的配制：准确称取Tris 1.2g，溶于100mL去离子水中，用HCl调节其pH至8.5，得到50mM Tris-HCl缓冲溶液。

利用上述Tris-HCl缓冲溶液将实施例2制得的甘露糖修饰的单宁酸配制成浓度为4 mg/mL的溶液，同时配制2mg/mL的Fecl₃·6H₂O溶液，上述两种溶液需要现配现用。

取1mL甘露糖修饰的单宁酸溶液(4mg/mL)于EP管中，在涡旋状态下缓慢加入浓度为2mg/mL的FeCl₃·6H₂O溶液1mL，再涡旋20s，得到甘露糖修饰的单宁酸与Fe^III离子通过配位作用形成的金属-多酚网络结构(MPN涂层)或者一些自组装形成的颗粒溶液。

实施例7：负载卵清蛋白OVA的介孔二氧化硅纳米颗粒表面涂覆金属-多酚网络涂层(MPN 涂层)

将实施例6得到的溶液用0.22μm过滤器过滤，取1mL过滤后的溶液加入到1mL实施例5制得的负载OVA的介孔二氧化硅纳米颗粒溶液(5mg/mL)中。然后在旋转仪上旋转反应10min，将反应后所得颗粒水洗三次，然后用Tris-HCl缓冲溶液(pH＝8.5)洗三次，10000g离心5min，即得到表面涂覆金属-多酚网络涂层(MPN涂层)的负载OVA的介孔二氧化硅纳米颗粒，此即为基于金属-多酚网络结构的靶向纳米疫苗，命名为MS@OVA@MPN@Man。

取1mL单宁酸(4mg/mL)与1mL FeCl₃·6H₂O(2mg/mL)过滤后的溶液，加入到1mL 实施例5制得的负载OVA的介孔二氧化硅纳米颗粒溶液(5mg/mL)中，然后在旋转仪上旋转反应10min，进行充分反应后将所得颗粒水洗三次，然后用Tris-HCl缓冲溶液(pH＝8.5)洗三次，10000g离心5min，即得到表面涂覆单宁酸与Fe^III通过配位作用形成的金属-多酚网络结构或者一些金属-多酚自组装形成的较大颗粒涂层的负载OVA的介孔二氧化硅纳米颗粒，命名为MS@OVA@MPN。以此作为对照，4℃保存，用于后期的实验。

应用实验例：

小鼠骨髓细胞的分离：选取6-8周雄性C57BL/6小鼠，拉颈方法处死，将小鼠置入75％酒精中浸泡5min，然后将老鼠固定在泡沫盒上，取C57BL/6小鼠胫骨和股骨，剥离骨上附着的肌肉，将小鼠胫骨和股骨放在含有1％青霉素/链霉素的PBS中，随后将小鼠胫骨和股骨放在70％乙醇中，浸泡10s后取出，用预冷且含1％双抗的PBS漂洗2次。剪掉骨两端，用1mL无菌注射器吸取含1％P/S双抗且冰冷的PBS，从骨的一端插入骨髓腔，反复冲洗胫骨和股骨3-4次，直至骨干颜色发白为止，将骨髓冲洗液置于15mL无菌离心管中，用滤膜过滤，即获得骨髓细胞的混合液，上述所有操作需要保持无菌的环境，并且在冰上进行，保持细胞活力。

小鼠骨髓来源树突状细胞的诱导(Dendritic Cells，DC)：将骨髓细胞混合液4℃离心 (1500r/min,5min)，弃上清液，加入1mL红细胞裂解液，反复吹打混匀，静置约5min，加入PBS终止裂解，离心(1500r/min,5min)，倒掉上清液，再加入PBS，重悬细胞，重复两次，最后加入5mL RPMI 1640全培养液(含有20ng/mL的GM-CSF以及10ng/mL的 IL-4)重悬细胞，吹匀，吸取20μL细胞混合液，稀释10倍，计数。将所得的细胞接种至6 孔细胞培养板，置于37℃、5％CO₂饱和湿度的培养箱中培养，记为第0天；在第2天小心吸出全部培养液，加入新培养液，之后每天换液(换一半)，第六天细胞培养完成，即可得到骨髓间充质干细胞诱导的树突状细胞。

所述纳米颗粒的细胞毒性检测：将上述所得到树突状细胞接种至96孔细胞培养板，接种密度为10⁶个/mL。在37℃、5％CO₂饱和湿度的培养箱中培养过夜，然后将5μg/mL、10μg/mL、 20μg/mL、40μg/mL的卵清蛋白OVA、MS@OVA@MPN、MS@OVA@MPN@Man与DC 共同培养24h，加入Alarm Blue试剂与RPMI 1640培养基，两者的比例为1:9，每孔加入150 μL，再孵育4h，将细胞液转入到透明板中，用酶标仪检测在570nm和600nm处的吸光度，通过公式计算细胞活力，每个实验至少重复三次。结果表明(图4)，得到的纳米颗粒在OVA 含量为5-40μg/mL的浓度范围内均没有毒性，可以选择合适的浓度用于后期的实验。

所述纳米颗粒的细胞摄取情况检测：将上述所得到树突状细胞(DC细胞)轻轻吹下，收集到离心管中，然后进行计数，接种至24孔细胞培养板中，接种密度为5.0×10⁵个/孔。于37℃、 5％CO₂饱和湿度的培养箱中培养过夜，分别采用负载20μg/mL OVA的MS@OVA@MPN和 MS@OVA@MPN@Man处理细胞，同时用20μg/mL的OVA处理细胞作为对照。4h后，收集细胞，用PBS洗涤细胞两次。加入1μL的PE-Cy7-CD11C抗体标记DC细胞，通过流式细胞仪分析树突状细胞对不同颗粒的细胞摄取情况。结果表明(图5)，相对于单纯的OVA，以及MS@OVA@MPN，MS@OVA@MPN@Man颗粒的细胞摄取能力最强，说明修饰了靶向分子甘露糖能够增强其细胞摄取。

所述纳米颗粒对骨髓来源树突状细胞(Dendritic Cells，DC)激活的影响：首先用移液管轻缓吹打由GM-CSF诱导6天的树突状细胞，将细胞收集到50mL离心管中，离心(1500rpm, 5min)，用RPMI 1640全培养液重悬细胞；取20μL细胞，加入80μL RPMI 1640全培养液进行稀释，滴到细胞计数板上进行计数，将上述所得到的细胞接种至24孔细胞培养板中，接种密度为5.0×10⁵个/孔，在37℃、5％CO₂饱和湿度的培养箱中培养过夜，然后加入浓度为 20μg/mL的OVA、MS@OVA@MPN、MS@OVA@MPN@Man，与树突状细胞共培养24h。孵育后，将细胞吹下，离心(1500r/min,5min)，上清液保存用于后期的实验，加入含2％FBS 的PBS，再离心，重复洗两次。最后倒置EP管，倒掉管中的PBS，然后加入60μL的PBS，将细胞弹起，分别加入1μL PE-Cy7-CD11c抗体，PE-CD86抗体，PE-Cy5.5-CD40抗体，于 4℃避光孵育，30min后，加入1mL的PBS终止反应，离心，PBS洗涤细胞，最后用PBS 重悬细胞，进行流式分析。通过流式细胞仪的荧光强度以及所示百分数分析纳米颗粒对骨髓来源的树突状细胞的激活情况。结果表明(图6，7)，与OVA单独处理相比较，靶向分子甘露糖修饰的纳米颗粒能够提高细胞表面成熟标志物的CD86和CD40的表达水平。

所述纳米颗粒的溶酶体逃逸功能检测：首先将小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)接种至激光共聚焦培养皿中，接种密度为12.5×10⁴个/孔，在37℃、5％CO₂饱和湿度的培养箱中培养过夜，然后加入浓度为20μg/mL的OVA、MS@OVA@MPN、MS@OVA@MPN@Man，与RAW264.7共培养8h。8h后，收集上清，用PBS洗涤细胞三次，加入500μL的4％多聚甲醛细胞固定液，37℃固定20min，PBS洗涤细胞三次，加入500μL的Lyso-Tracker Red 染料(50nM)，37℃孵育120min，对溶酶体进行染色，PBS洗涤细胞三次。加入500μL 细胞核染料Hoechst 33342(0.5μg/mL)，37℃放置20min，PBS洗涤细胞三次，最后加入PBS，用激光共聚焦显微镜观察拍照。结果表明(图8)，单独的FITC-OVA处理细胞后，绿色荧光分布在细胞核周围，绿色荧光与标记溶酶体膜的红色荧光重合，说明OVA主要在溶酶体内。相比之下，MS@OVA@MPN以及MS@OVA@MPN@Man处理细胞后，具有游离的绿色荧光分布在细胞质中，绿色荧光未与标记溶酶体膜的红色荧光完全重合，说明部分颗粒发生了溶酶体逃逸，这也是本纳米疫苗递送系统的主要创新点之一。

Claims (9)

1.一种基于金属-多酚网络结构的靶向纳米疫苗的制备方法，步骤是：

(1)负载卵清蛋白OVA的介孔二氧化硅纳米颗粒制备

称取5mg氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒溶于1mL去离子水中，然后加入1mL浓度为1.2mg/mL的FITC标记的卵清蛋白OVA，按如此比例将两者混合，涡旋混匀，磁力搅拌1-3h；将反应液8000r/min离心5-8min，获得上清液，利用BCA法检测上清液中卵清蛋白OVA的含量，根据初始投入的OVA量计算介孔二氧化硅纳米颗粒中OVA的吸附量，再水洗两次，即得到负载OVA的介孔二氧化硅纳米颗粒；

(2)甘露糖修饰单宁酸分子的合成

取氨基化的甘露糖分子2-5mg，单宁酸15-25mg，使甘露糖与单宁酸的摩尔比为1:1-1:1.5；然后将两种化合物溶于5mL pH＝7-9的MOPS缓冲溶液中，磁力搅拌10-14h，用分子量为700K的透析袋透析，即得到甘露糖修饰的单宁酸分子；

(3)负载卵清蛋白OVA的介孔二氧化硅纳米颗粒表面涂覆金属-多酚网络涂层

取1mL浓度为3-5mg/mL甘露糖修饰的单宁酸溶液于EP管中，在涡旋状态下缓慢加入浓度为1-3mg/mL的FeCl₃·6H₂O溶液1mL，按如此比例量混合后再涡旋20-30s，得到甘露糖修饰的单宁酸与Fe^III离子通过配位作用形成的金属-多酚网络结构即MPN涂层或者一些自组装形成的颗粒溶液；将得到的溶液用0.22μm过滤器过滤，取1mL过滤后的溶液加入到1mL步骤(1)制得的浓度为5mg/mL的负载OVA的介孔二氧化硅纳米颗粒溶液中；按如此比例量混合后在旋转仪上旋转反应8-15min，将反应后所得颗粒水洗3-4次，然后用pH＝8.5的Tris-HCl缓冲溶液洗3-4次，6000-10000g离心5-8min，即得到表面涂覆金属-多酚网络涂层的负载OVA的介孔二氧化硅纳米颗粒，此即为基于金属-多酚网络结构的靶向纳米疫苗，命名为MS@OVA@MPN@Man。

2.根据权利要求1所述的基于金属-多酚网络结构的靶向纳米疫苗制备方法，其特征在于，步骤(1)所述氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒的制备方法是：

称取介孔二氧化硅纳米颗粒30mg，溶于800-1000μL的乙醇溶液中，超声2-3min，使介孔二氧化硅纳米颗粒均匀分散在乙醇溶液中，然后缓慢加入40-60μL的氨水，在涡旋的条件下再加入20-40μL的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，加毕后再涡旋30-40s，放在封闭的反应瓶中磁力搅拌过夜；将过夜反应后的溶液7000-9000r/min离心5-8min，沉淀颗粒甲醇洗3-4次，然后再用水洗3-4次，即得到氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒。

3.根据权利要求2所述的基于金属-多酚网络结构的靶向纳米疫苗制备方法，其特征在于，步骤(1)所述氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒的制备方法是：

称取介孔二氧化硅纳米颗粒30mg，溶于900μL的乙醇溶液中，超声2min，使介孔二氧化硅纳米颗粒均匀分散在乙醇溶液中，然后缓慢加入50μL的氨水，在涡旋的条件下再加入20μL的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，加毕后再涡旋30s，放在封闭的反应瓶中磁力搅拌过夜；将过夜反应后的溶液8000r/min离心5-8min，沉淀颗粒甲醇洗3次，然后再用水洗3次，即得到氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒。

4.根据权利要求1所述的基于金属-多酚网络结构的靶向纳米疫苗制备方法，其特征在于，步骤(1)所述FITC标记的卵清蛋白OVA的制备方法是：

准确称取FITC 1mg，溶于30μL二甲基亚砜(DMSO)中，再称取卵清蛋白OVA 30mg，溶于5mL去离子水中，超声使其溶解分散；将所配制的FITC溶液与OVA溶液混匀，磁力搅拌2-3h，4℃过夜；将过夜后的混合液置于3500K的透析袋中透析48-54h，每隔6小时换水，透析完成后，将样品收集到离心管中冷冻干燥24-30h，即得到FITC标记的卵清蛋白OVA样品。

5.权利要求1所述的基于金属-多酚网络结构的靶向纳米疫苗制备方法，其特征在于，步骤(2)所述甘露糖修饰单宁酸分子的合成方法是：

取氨基化的甘露糖分子3.25mg，单宁酸20mg；然后将两种化合物溶于5mL pH＝8.5的MOPS缓冲溶液中，磁力搅拌12h，用分子量为700K的透析袋透析，即得到甘露糖修饰的单宁酸分子。

6.根据权利要求1所述基于金属-多酚网络结构的靶向纳米疫苗制备方法，其特征在于，步骤(3)所述金属-多酚网络结构即MPN涂层的制备方法是：

利用pH 8.5的Tris-HCl缓冲溶液将甘露糖修饰的单宁酸配制成浓度为4mg/mL的溶液，同时配制2mg/mL的Fecl₃·6H₂O溶液；取1mL甘露糖修饰的单宁酸溶液于EP管中，在涡旋状态下缓慢加入FeCl₃·6H₂O溶液1mL，再涡旋20s，得到甘露糖修饰的单宁酸与Fe^III离子通过配位作用形成的金属-多酚网络结构涂层溶液。

7.根据权利要求1所述基于金属-多酚网络结构的靶向纳米疫苗制备方法，其特征在于：步骤(3)所述在旋转仪上旋转反应10min。

8.根据权利要求1所述基于金属-多酚网络结构的靶向纳米疫苗制备方法，其特征在于：步骤(3)所述离心条件是10000g离心5min。

9.权利要求1-8之一所述方法制备的基于金属-多酚网络结构的靶向纳米疫苗。

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