CN115429902A - 磁性氧化铁细胞标记材料及其制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于检测材料领域，具体涉及一种磁性氧化铁细胞标记材料，其特征在于，包括磁性氧化铁颗粒，以及包覆所述磁性氧化铁颗粒的聚合物包覆层，聚合物具有聚丙烯酸类聚合链，其链端修饰有多巯基化合物，链上的部分羧基修饰有氨基葡萄糖；所述的多巯基化合物为含有两个及以上的巯基的化合物。本发明还提供了所述的材料的制备方法和应用。本发明研究发现，得益于所述聚合物链以及链端修饰的多巯基化合物以及链段上修饰的氨基葡萄糖的协同，能够意外地显著改善材料的细胞摄取效果，能够有效改善其细胞MRI标记示踪性能。

Description

磁性氧化铁细胞标记材料及其制备和应用
技术领域
本发明属于材料领域，具体涉及细胞核磁标记材料技术领域。
背景技术
体内示踪细胞的迁移、归巢已成为分子影像学的研究热点。目前已开发的用于体内示踪干细胞的迁移、归巢的分子影像学技术有磁共振、核素成像和光学成像等。核素显像由于具有一定的放射性，一定时间内频繁检查对受试者身体会造成一定的损害，因此不适用于长期示踪。生物光学成像技术利用荧光标记物等手段标记细胞从而在多种光学显像仪器下做到可视化，但荧光在人体内传播距离有限，穿透性不足，显像深度不够，因此这种显像方法更多的适用于体外实验或小动物模型。磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)具有无创、空间分辨率高、穿透性强、副作用小等优点，目前在临床上广泛用于深部组织病变等的检查。与X线、CT成像等不同，MRI不会对人体造成电离辐射损伤，因此多次接受MRI检查对人体影响较小，非常适合作为临床上细胞治疗的一种长期示踪手段。超高场MRI系统的空间分辨力接近50μm×50μm×50μm，具备在活体检测单个干细胞存在的能力。为了追踪体内的干细胞，MRI的显像需要具有长效的，高度细胞相容性、高灵敏度的显像剂。开发具有长效的，高度细胞相容性、高灵敏度的细胞MRI示踪剂，并利用这些细胞MRI示踪剂标记细胞有助于解答细胞治疗中存在的这一系列问题。
目前常用的MRI显像剂有T1阳性(钆衍生物)或T2阴性造影剂(氧化铁纳米颗粒)。由于钆衍生物中钆离子的细胞毒性问题，氧化铁纳米颗粒在细胞标记方面更有应用前景。氧化铁在自然界中以多种形式存在，其中以磁铁矿(Fe3O4)、磁赤铁矿(γ-Fe2O3)和赤铁矿(α-Fe2O3)为最常见的形式。其中，以磁性氧化铁(Iron Oxide Nanoparticles，IONPs)纳米微粒为核心且具有超顺磁性的的氧化铁纳米颗粒被称为超顺磁性氧化铁纳米颗粒(superparamagnetic iron oxide NPs，SPIONs)，其基本结构多以Fe3O4或γ-Fe2O3颗粒为核心，外层包被多聚物涂层。SPIONs具有超顺磁性，可以引起局部磁场不均匀造成邻近氢质子自旋快速失相位而缩短 T2时间，从而在T2加权MR图像上形成暗反差。根据颗粒的大小，SPIONs可分为3大类，粒径介于50nm到180nm的被称为超顺磁性氧化铁纳米颗粒 (SPIONs)、粒径介于10nm到50nm的被称为超小超顺磁性氧化铁纳米颗粒 (ultrasmallsuperparamagnetic iron oxide NPs，示踪材料s)，粒径小于10nm的被称为超微超顺磁性氧化铁纳米颗粒(very small superparamagnetic iron oxide NPs，VSPIONs)。从避免氧化铁纳米颗粒在体内蓄积的角度，粒径小于10nm 的VSPIONs相比于SPIONs和示踪材料s更容易从体内溶解或肾小球滤过等途径排出，从而更具临床安全性。SPION的示踪效果强弱有赖于细胞内铁含量，因此细胞对磁性氧化铁颗粒的吞噬率决定了显像效果。而不同于体内环境，细胞在体外培养条件下，其吞噬能力会有显著下降，而临床上常用的SPIONs造影剂如Feridex和Ferumoxytol水溶性和分散性不好，在体外条件下被细胞吞噬率低，难以满足细胞治疗中的显像需求。此外，目前已有的大多数氧化铁纳米颗粒具有较大的r2/r1比值，尽管可以利用氧化铁纳米颗粒标记的细胞在MRI上呈现低信号影像进行细胞示踪观察，原本的无信号背景会限制氧化铁纳米颗粒浓度的定量以及细胞数量的分析。与T1阳性造影剂相比，T2或敏感性加权成像可以在更小的浓度和亚毫米区域检测到它们。但异质性解剖缺乏特异性，可能与出血、钙化、金属沉积(如内源性铁)和其他易感性伪影的信号混淆，限制了它们的应用。临床上迫切需要一种同时能进行T1加权成像和T2加权成像的双模式造影剂，然而床上常用的SPIONs造影剂如Feridex和Ferumoxytol等仅具有较好的T2 加权成像效果，T1加权成像效果不好，与出血、钙化、金属沉积(如内源性铁) 和其他易感性伪影的信号混淆，限制了它们的应用。
氧化铁纳米颗粒对细胞的标记受到以下几个因素的严重限制:①纳米颗粒具有较大的表面/体积比，容易团聚，不容易被细胞摄取，且团聚会改变表面/体积比，使其更容易被细胞排出；②细胞摄取纳米颗粒效率低。氧化铁纳米颗粒在培养基中的团聚现象影响细胞的吞噬效率。在接触细胞培养基后，氧化铁纳米颗粒将与多种生物大分子相互作用，团聚是一种常见现象。氧化铁纳米颗粒团聚可改变细胞摄取效率和氧化铁纳米颗粒的细胞毒性，也会使氧化铁纳米颗粒更容易被细胞排出。增加氧化铁纳米颗粒胶体溶液的空间稳定性是提高氧化铁纳米颗粒悬浮稳定性最常用方法，通常通过在氧化铁纳米颗粒外层覆盖合成(如聚乙二醇；聚丙烯酸；聚甲基丙烯酸等)和天然(如葡聚糖、壳聚糖、海藻酸盐等)聚合物涂层。此外，在培养基之中，胶体氧化铁纳米颗粒系统的失稳与培养基蛋白和氧化铁纳米颗粒相互作用密切相关。而消除蛋白吸附对氧化铁纳米颗粒胶体稳定性的影响的方法有两种：一种是保证培养基蛋白的均匀单层吸附在氧化铁纳米颗粒表面，另一种是降低培养基蛋白对培养基蛋白的吸附。要实现培养基蛋白的均匀单层吸附比较困难，因此目前常采用降低培养基蛋白对氧化铁纳米颗粒吸附的方式。当氧化铁纳米颗粒的外层修饰上亲水性、中性表面活性剂和聚合物时，能显著降低甚至消除氧化铁纳米颗粒的吸附。而另外一种提高氧化铁纳米颗粒稳定性的方法是提高氧化铁纳米颗粒胶体溶液的电空间稳定性，通过提升氧化铁纳米颗粒之间的静电斥力，从而实现空间稳定化。这通常是通过在氧化铁纳米颗粒表面的附加带电聚合物涂层来实现的。该方法全面考虑了高离子浓度介质对氧化铁纳米颗粒表面的影响，以及氧化铁纳米颗粒与溶液中其他分子之间可能存在的相互作用。研究表明，聚丙烯酸基团功能化修饰的粒径小于10nm的Fe2O3和CeO2纳米颗粒在细胞培养基中能维持稳定时间超过一周。此外，多项研究也证实通过在外层附加带电聚合物涂层能有效的提高氧化铁纳米颗粒溶液的稳定性。然而，研究也表明，氧化铁纳米颗粒的标记效率过低会显著影响细胞在移植到体内后0-72 小时内的MRI示踪效果。氧化铁纳米颗粒的粒径越大越利于被干细胞摄取，因此与SPIONs相比，示踪材料s和VSPIONs由于粒径较小导致其细胞摄取率较 SPIONs要低。细胞吞噬氧化铁纳米颗粒的最适宜直径在20-800nm之间，过小和过大均会导致细胞摄取率降低)。然而示踪材料s和VSPIONs粒径较小的特性使得其在细胞中能做到均匀标记，因此示踪材料s和VSPIONs相较SPIONs更加适用于细胞标记示踪。但是由于示踪材料s和VSPIONs的细胞摄取效率较 SPIONs要低，因此研发提高示踪材料s和VSPIONs摄取率的改进方法就成了一项迫切的需求。聚丙烯酸基团和聚甲基丙烯酸基团功能化修饰的示踪材料和 VSPIONs细胞吞噬率低，显像效果不好。
发明内容
本发明第一目的在于，提供一种磁性氧化铁细胞标记材料，旨在提供一种具有良好分散性、稳定性和细胞摄取效果、较长的MRI标记示踪时间并且能同时能进行T1加权成像和T2加权成像的双模式造影剂。
本发明第二目的在于，提供一种所述的磁性氧化铁细胞标记材料的制备方法。
本发明第三目的在于，提供一种包含所述的磁性氧化铁细胞标记材料的复合材料。
本发明第四目的在于，提供一种所述的磁性氧化铁细胞标记材料及其复合材料作为MRI标记细胞示踪材料的用途。
一种磁性氧化铁细胞标记材料，包括磁性氧化铁颗粒，以及包覆所述磁性氧化铁颗粒的聚合物包覆层，聚合物具有聚丙烯酸类聚合链，其链端修饰有多巯基化合物，链上的部分羧基修饰有氨基葡萄糖；
所述的多巯基化合物为含有两个及以上的巯基的化合物。
本发明提供了一种全新的磁性氧化铁细胞标记材料。研究发现，得益于所述聚合物链以及链端修饰的多巯基化合物以及链段上修饰的氨基葡萄糖的协同，能够意外地显著改善材料的细胞摄取效果，能够有效改善其细胞MRI标记示踪性能。
本发明研究发现，以聚丙烯酸类聚合链为链段主体，且在其链段上双重修饰氨基葡萄糖和多巯基化合物是协同解决材料团聚，改善材料细胞摄取效果的关键。此外，本发明所述的材料，还具有以下优势：1、有利于体内的降解和排出，具有更好的临床安全性和更短的体内代谢时间；2、同时具有T1加权和T2加权显像能力，通过T2加权成像可以在更小的浓度和亚毫米区域检测到标记的细胞，通过T1加权成像可以与出血、钙化、金属沉积(如内源性铁)和其他易感性伪影的信号相区别；3、细胞毒性小，细胞相容性好，不影响细胞的增殖和分化能力； 4、水溶性和分散性好，能够在细胞培养基中稳定，有利于对细胞的均匀标记和对悬浮细胞的标记；5、细胞标记速度快，吞噬效率高，被细胞吞噬后不易被细胞排出。
本发明中，所述的氨基葡萄糖可以基于现有手段修饰在聚丙烯酸类聚合物链段中。
作为优选，所述的氨基葡萄糖基于酰胺键修饰在聚丙烯酸类聚合物的链段上。例如，所述的氨基葡萄糖基于其分子中的氨基和聚丙烯酸类聚合物中的羧基形成酰胺基的手段化学接枝修饰在聚合物链段中。
本发明所述的多巯基化合物，包括一个支化中心(标记为A，也称为交联中心)或者由两个及以上的支化中心相互连接形成的多支化中心。所述的支化中心优选为3级碳或者四级碳。
所述的巯基通过烷基(R)、醚基(例如A-O-R-SH)、酯基(例如A-CO-O-R-SH，或者A-O-CO-R-SH)、酰胺基(例如A-CO-N-R-SH，或者A-N-CO-R-SH)等基团和支化中心连接；所述的R为C1～C4的烷基。
优选地，所述的多巯基化合物的游离的巯基数量为2～4个。
本发明中，所述的多巯基化合物也可基于现有手段修饰在聚丙烯酸类聚合链的链端上。例如，所述的多巯基化合物通过酯基、烷基、酰胺基或二硫基修饰在聚合物链段中。
作为优选，修饰的多巯基化合物具有式1结构式；
Figure RE-GDA0003130232000000041
式1。
作为优选，所述的多巯基化合物修饰在聚合物链的一端或者两端。
作为优选，所述的聚合物具有式2结构式：
Figure RE-GDA0003130232000000042
式2
所述的R4、R5中，至少一个取代基为多巯基化合物残基；剩余的取代基为H；
所述的R2、R3独自为H、C1～C3的烷基；
所述的n个R1中，部分为H，剩余部分为式3所示的基团；
Figure RE-GDA0003130232000000051
式3
所述的n为小于或者等于10000的整数，n个R1中，式3取代基的摩尔比占比大于或等于0.1％；
进一步优选，所述的聚合物具有式2-A结构式的聚合物：
Figure RE-GDA0003130232000000052
式2-A。
本发明所述的聚合物，可以基于聚合物链段的羧基和铁氧化物表面作用，均匀包覆(锚定)在聚合物的表面。
作为优选，所述的磁性氧化铁颗粒为磁铁矿(Fe3O4)、磁赤铁矿(γ-Fe2O3)和赤铁矿(α-Fe2O3)中的至少一种。
本发明中，所述的磁性氧化铁颗粒可以是生物使用的任意粒径，例如，可以是纳米颗粒，也可以是微米颗粒。
作为优选，所述的磁性氧化铁颗粒的颗粒度为0.5nm～50微米；优选为1nm～10nm。
本发明还提供了一种所述的磁性氧化铁细胞标记材料的制备方法，包括以下步骤：
步骤(1)：将多巯基化合物和丙烯酸类单体进行聚合反应，制得修饰有多巯基化合物的聚丙烯酸类聚合物；
步骤(2)：采用修饰有多巯基化合物的聚丙烯酸类聚合物对磁性氧化铁颗粒进行包覆，随后再和氨基葡萄糖进行接枝修饰反应，即得。
本发明中，步骤(1)中，多巯基化合物和丙烯酸类单体的摩尔比为1:1～10000； 1:5～100。
优选地，步骤(1)中，聚合反应在引发剂下进行，所述的引发剂为能够引发丙烯酸单体聚合的引发剂，例如为AIBN。
优选地，步骤(1)中，聚合反应的溶剂为醇类溶剂，例如为乙醇。
优选地，步骤(1)中，聚合反应的温度为70～100℃。
优选地，步骤(2)中，将修饰有多巯基化合物的聚丙烯酸类聚合物和铁源混合，然后添加氨水，反应，得到聚合物包覆的氧化铁(Fe-NPs@聚合物)。
将获得的Fe-NPs@聚合物表面修饰羧酸，随后再和氨基葡萄糖进行偶联，制得目标产物。优选地步骤为：将Fe-NPs@聚合物和MES吗啉乙磺酸混合，进行羧酸修饰；随后和氨基葡萄糖在脱水剂下进行酰胺化反应，获得最终的产物。
本发明还提供了一种磁性氧化铁细胞标记复合材料，包含所述的磁性氧化铁细胞标记材料；还包含表面转染剂。
本发明还提供了一种细胞示踪的复合材料，得益于所述的磁性氧化铁细胞标记材料材料内协同，及其和表面转染剂的材料间的进一步协同，能够显著改善复合材料的细胞摄取效果，并改善材料的核磁示踪效果。
优选地，所述的表面转染剂为多聚-L-赖氨酸(poly-L-lysine，PLL)、硫酸鱼精蛋白(protamine sulfate，PS)、阳离子脂质体(lipofectamine)中的至少一种。
本发明还提供了一种磁性氧化铁细胞标记材料的应用，将其用作细胞MRI 示踪材料。
有益效果
1、本发明提供了一种全新的磁性氧化铁细胞标记材料，且发现基于所述的聚丙烯酸类聚合物链段及其链段上的氨基葡萄糖和多巯基化合物的双重协同修饰，能够有效避免团聚，有助于协同改善细胞摄取效果。
2、本发明研究发现，将所述的磁性氧化铁细胞标记材料和表面转染剂联用，能够进一步实现材料间协同，有助于进一步改善细胞的摄取效果。
3、本发明所述的标记材料以及复合标记材料，除了具有良好的摄取效果外，还具有良好的细胞相容性，不影响被标记细胞的增殖和分化，能够有效避免团聚，具有良好的细胞示踪效果，同时具有MRI仪器T1加权和T2加权显像能力。
附图说明
图1为VSPIONs@PTMP-PMAA被GLCN修饰前后产物的红外光谱图；
图2为VSPIONs@PTMP-PMAA被GLCN修饰前后产物的XRD图；
图3为VSPIONs@PTMP-PMAA被GLCN修饰前后的电镜及其粒径分布图；
图4为实施例3的三种配体Fe3O4在不同pH下和不同浓度的体外核磁共振成像结果；
图5为实施例4的体内示踪效果及持续时间；
图6为细胞相容性测定结果，图中的USPIO代号指的材料是 VSPIONs@PTMP-PMAA，代号G和GLcN均指代GLCN；
图7为实施例6的GLCN修饰前后的材料的粒径分布图；
图8为实施例7的不同材料的标记效果图；
图9为实施例8的本发明示踪材料和PLL的协同结果图，图中的USPIO代号指的材料是VSPIONs@PTMP-PMAA，代号G和GLcN均指代GLCN；
图10为实施例9的有效时间结果图；
图11为实施例10的稳定性结果图；
图12和图13为实施例11的不同材料的细胞摄取结果图；
图14为PTMP-PMAA的H-NMR图；
图15为ODT-PMAA的H-NMR图；
具体实施方案
1、SD大鼠BMSC提取培养
取2周SD乳鼠，断颈处死后在大烧杯中酒精浸泡5min。完整取出双侧下肢骨，剔除骨表面软组织。眼科剪剪开股骨及胫骨两端，使用F-12/MEM培养基吹打股骨及胫骨干数次骨质变为白色。收集培养基，1000转离心3分钟，吸去上清液，含10％FBS的F-12/MEM完全培养基混匀，在37℃5％CO2条件下孵育。定期换液，细胞长满80％后传代。选用第3-4代细胞用于下一步实验。
2、PLL-GLCN-VSPIONs@PTMP-PMAA(本发明的示踪材料+PLL)标记 BMSC
将第3代BMSC以3.0×106/孔浓度接种于6孔板中，贴壁后分别将不同浓度 (0/10/25/50/75/100/125/150μg/ml)的GLCN-PLL-VSPIONs-PMAA(本发明的示踪材料+PLL)加入培养基，每孔2ml，在37℃5％CO2下孵育。12小时后弃去培养基，PBS洗涤3遍，0.25％胰酶消化后以3.0×106/孔重新接种在6孔板内，继续在37℃5％CO2条件下孵育。PB染色后，分别在不同倍数下，每孔上下左右四个象限分别随机取3个视野图像。计算各视野中细胞数及被标记细胞数，计算标记率(标记细胞数/视野内总细胞数)。并用ImageJ计算视野内PB着色面积百分比，即为标记百分比。
3、PB染色
标记后BMSC用PBS洗涤2遍，4％多聚甲醛固定15分钟，之后PBS洗涤 2遍。配制普鲁士蓝染液，将普鲁士蓝A液和普鲁士蓝B液等量混合，摇匀，加入孔板内，室温下静置反应30分钟。反应结束后，PBS洗涤2遍，每孔加入伊红染料1ml，反应15秒后吸走伊红，流水洗涤2遍后镜下观察染色效果。
4、三系诱导及鉴定
将标记BMSC以1.0×106/孔接种在6孔板内，设置4个组，每组6孔，分别加入：①成骨诱导培养基；②成脂诱导培养基；③成软骨诱导培养基；④10％FBS 的F-12/MEM完全培养基。诱导21天后分别：①组行茜素红染色，②组行油红 O染色，③组行阿利辛蓝染色，④组分别取2个孔做三系染色。倒置显微镜下镜下观察染色情况。
5、PLL-GLCN-VSPIONs@PTMP-PMAA的生物相容性测定
利用CCK-8测试不同浓度GLCN-PLL-VSPIONs-PMAA(本发明的示踪材料 +PLL)的细胞毒性。96孔板内以1×104/孔浓度接种第3代BMSC，37℃孵育12 小时至完全贴壁。分别用不同浓度GLCN-PLL-VSPIONs-PMAA(本发明的示踪材料+PLL)标记，在37℃5％CO2孵育24小时。每孔PBS洗涤2遍，避光环境下加入含有10％CCK-8的F-12培养100ul，37℃下避光孵育3小时。分光光度计在波长450nm处测量吸光度。
6、细胞内铁含量测定
使用Biovision公司的总铁含量测试试剂盒测试每组细胞铁含量。
实验组处理：向含PLL-GLCN-VSPIONs@PTMP-PMAA(本发明的示踪材料+PLL)标记BMSC的6孔板内每孔加入IronAssay Buffer各65ul，孵育5-10 分钟，镜下观察至细胞溶解。收集溶解细胞，移入1.5mlEP管内，在16000g下离心10分钟。小心吸取上层清液50ml，勿触及底层沉淀物，移入96孔板内。继续加入IronAssayBuffer至每孔100ul，之后每孔加入IronReducer 5ul。
设置标准组：将495ul双蒸水与5ul Iron Standard溶液混合配制出1mM的标准铁溶液。从中分别取出0、2、4、6、8、10ul分别加入同一96孔板内，每孔继续分别加入IronAssayBuffer 100、98、96、94、92、90ul补至100ul，每孔加入IronReducer 5ul。
标准组与实验组在室温下静置反应30分钟。之后每孔加入Iron Probe 100ul，包裹锡箔纸，放置在室温下避光反应1小时。利用分光光度计测量各组吸光度，波长设置为593nm。根据标准组吸光度绘制标准铁曲线，根据曲线计算实验组每孔铁含量。单个细胞内铁含量即为每孔铁含量/每孔细胞数。
7、CS-TBA/HA凝胶制备
按前述文献方式制备CS-TBA/HA水凝胶。取800mg壳聚糖放置于烧杯中，加入400mL1％醋酸溶液溶解。加入80mg 2-亚氨基硫烷盐酸盐，用5M的NaOH 调节pH到6，匀速搅拌24h。依次进行进行5次透析后于-20℃中冷冻至固态。后于-80℃真空环境下冷冻干燥48小时至海绵状，获得CS-TBA凝胶。
200mg CS-TBA凝胶加入9mL去离子水中搅拌溶解。加入200mg羟基磷灰石，超声搅拌至分散均匀。560mgβ-甘油磷酸钠(β-GP)溶于1mL去离子水中，制成溶液，并加入CS-TBA凝胶制成CS-TBA/HA水凝胶。
8、凝胶植入SD大鼠模型制备
制备搭载PLL-GLCN-VSPIONs@PTMP-PMAA标记BMSC的CS-TBA/HA 水凝胶。每1mlCS-TBA/HA水凝胶上接种1×106个 PLL-GLCN-VSPIONs@PTMP-PMAA标记BMSC。
12只雄性SD大鼠(220-250g，来自南方医科大学实验动物中心)适应性饲养1周。分为三组：①标记BMSC组：单侧注射搭载标记BMSC的CS-TBA/HA 水凝胶；②未标记BMSC组：单侧注射搭载未标记BMSC的CS-TBA/HA水凝胶；③双侧对照组：双侧同时注射搭载标记BMSC和未标记BMSC的CS-TBA/HA 水凝胶。具体步骤如下：
SD大鼠腹腔注射4％水合氯醛，用量为0.8ml/100g。背部中央备皮，消毒铺单。2ml注射器抽取制备好的不同组CS-TBA/HA水凝胶，分别注射进大鼠背部皮下，制备皮下异位成骨模型。单侧注射组均注射在大鼠左侧皮下，双侧对照组左侧注射标记BMSC组凝胶，右侧注射未标记BMSC组凝胶。恒温25℃环境下饲养，术后连续3天每天肌肉注射8万单位青霉素，每日观察植入处皮肤情况。
9、参数及显像检测
SD大鼠注射不同组CS-TBA/HA水凝胶后，分别在注射后12小时、4天、9 天、13天做体内成像测试。大鼠麻醉后固定于大鼠用磁共振项圈后放置于3.0T 核磁共振仪内，成像序列选择自旋回波T2加权序列(SE T2WI)，具体参数如下：
Figure RE-GDA0003130232000000091
10、统计学分析
本研究所得的数据均为计量资料，所有数据采用均数±标准差(x±SD)的形式来表示，在数据整理后，采用SPSS20.0软件进行数据分析。统计学分析选用析因分析或重复测量的方差分析进行统计处理，根据方差齐性检验(Levene’s检验) 结果选择校正或不校正的F值和P值。对多因素数据中的某因素组间进行比较，两组之间的比较采用t检验，多组之间的比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)及LSD多重比较，以P<0.05认为差异有统计学意义。
试剂名称：六水氯化铁(FeCl3·6H2O,99％)AR国药集团化学试剂有限公司(简称国药)。七水硫酸亚铁(FeSO4·7H20，99％)AR国药集团化学试剂有限公司。盐酸(HCl，38％)AR国药集团化学试剂有限公司。氢氧化钠 (NaOH)AR国药集团化学试剂有限公司。氨水(NH3·H2O，28％)AR国药集团化学试剂有限公司。正十八硫醇(ODT，99％)AR国药集团化学试剂有限公司。巯基丁二酸(MSA)AR国药集团化学试剂有限公司。聚甲基丙烯酸(PAA)AR国药集团化学试剂有限公司。季戊四醇四-3-巯基丙酸酯 (PTMP)AR国药集团化学试剂有限公司。甲基丙稀酸(MAA，99％)
AR国药集团化学试剂有限公司。偶氮二异丁腈(AIBN，98％)AR国药集团化学试剂有限公司。无水乙醚AR国药集团化学试剂有限公司。无水丙酮
AR国药集团化学试剂有限公司。无水乙醇AR麦克林试剂有限公司。透析袋8000-14000MW。MW上海易佰聚经贸有限公司。牛血清白蛋白(BSA)
AR国药集团化学试剂有限公司。细胞培养基(DMEM)AR国药集团化学试剂有限公司。超纯水AR实验室自备。
实施例1：制备例：
第一步，先合成多聚物PTMP-PMAA(见反应式1)：
将季戊四醇四-3-巯基丙酸酯(PTMP)与甲基丙稀酸(MAA)以一定摩尔比(MAA摩尔/PTMP摩尔介于1比1和10000比1之间)通过自由基聚合形成水溶性聚合物配体。下面是具体的化学合成过程举例：将AIBN(0.08g，0.5mmol) 加入30mL无水乙醇中，超声溶解后加入100mL三口烧瓶中，打开磁力搅拌器，通氮30min，然后加入MAA(4.3g，50mmol)，PTMP(2.44g，5mmol)，然后开始加热，做好回流装备的摆设，打开回流水，当温度到达75℃时，开始计时，反应5h。反应结束后，在氮气接通条件下将样品冷却到室温，加入准备好的冰乙醚，会有白色沉淀产生，用布氏漏斗将溶液杂质的溶剂除去，重复三次，得到白色物质，然后将物质送入真空干燥箱45℃抽真空干燥12h将多余的溶剂以及单体去除，将得到的白色粉末。H-NMR图见图14，PTMP-PMAA(D6 DMSO) δ(ppm):δ0.81～1.14；δ1.42～1.54；δ1.61～1.28；δ2.24～2.40；δ2.51～2.84,；δ3.17～3.50；δ3.91～4.40；
配体合成反应式如下：
Figure RE-GDA0003130232000000101
n的范围为1～10000.(反应式1)
第二步，用多聚物PTMP-PMAA合成氧化铁纳米颗粒(标记为 VSPIONs@PTMP-PMAA)：
具体途径如下：在装有回流冷凝器、温度计和供氮装置的500mL三颈圆底烧瓶中，加入100mL水。用氮气净化水中的氧气，磁搅拌加热油浴回流。将聚合物配体PTMP-PMAA(0.225g，1mM)引入烧瓶，浓度为1mM。准备FeCl3.6H2O (0.291g，1.08mmol)，FeSO4.7H2O(0.150g，0.54mmol)溶解在2mL原始盐酸，当温度到达100℃加入，30mL(原始氨水)加在5秒内添加完，快速搅拌。在添加铁前体溶液,反应混合物的颜色变成黄色和添加氨水反应混合物的颜色变成了深黑色突然表明氧化铁NPs的形成。然后继续在这个温度为回流2h。2h 后关闭装置，产物在氮气下冷却到室温。将得到的产物水洗除杂，然后再45℃在真空干燥箱中干燥，得到黑色粉末。氧化铁(代号：VSPIONs)核心粒径应小于10nm；
第三步：用氨基葡萄糖(GLCN)分子对第二步的产物进行修饰，利用氨基和羧基之间的偶联反应(见反应式2)：
在偶联剂的帮助下，对PTMP-PMAA氧化铁纳米颗粒表面的部分羧基进行 GLCN修饰。
准备浓度为0.1M的NaOH和10mM的稀盐酸水溶液各50mL，用于制备过程pH的调节。100mM MES吗啉乙磺酸缓冲液(2-(N-morpholino) ethanesulfonic MES,pH＝5.5用100mM的MES缓冲液配置10mg/mL的 PTMP-PMAA修饰的Fe3O4溶液50mL得到溶液A(测量一下pH是否在5～6.0 之间,若不在则调节至此范围)；将1.075g D-GLCN加入PBS溶液搅拌溶解设置为B液；然后将A和B充分混合超声溶解以后，倒入1g EDC和0.2g NHS至混合溶液中,充分溶解以后，避光反应4h后，加NaOH调节pH值至7.5左右；收集产物用透析袋在去离子水中透析8次左右，最后将得到的产物离心分离3次，将产物在真空干燥箱中真空干燥12h。制得复合材料，标记为：(标记为GLCN 修饰后的VSPIONs@PTMP-PMAA)
Figure RE-GDA0003130232000000111
IR测定以及分析：
图1制得的材料的红外图，其中，PTMP-PMAA聚合物在未与Fe3O4结合前， COOH峰位在1725～1700cm-1。1610～1550cm-1归属于羧酸根离子的对称伸缩振动吸收峰，1420～1300cm-1处的吸收峰归属于羧酸根离子的不对称伸缩振动吸收峰，C＝O峰位红移并减弱，并出现了-COO-与Fe的结合峰，位于1501和1403cm-1附近。通过GLCN修饰后，我们在1650cm-1处发现了酰胺I谱带的特征吸收峰，提示部分羧基已被GLCN修饰，GLCN通过酰胺键结合在PTMP-PMAA配体上。 2600～2450cm-1处微弱的吸收峰归属于S-H的吸收峰。695～655cm-1处的吸收峰归属于-CH2-S-CH2-的伸缩振动吸收峰。1190～170cm-1和1145～1130cm-1的吸收峰归属于-NH-键的吸收峰。(红外检测证明了PTMP-PMAA聚合物上有丰富的羧基和巯基，提示PTMP分子与PMAA链段间通过-CH2-S-CH2-相连。PTMP-PMAA 聚合物通过-COO-与Fe离子结合，PTMP-PMAA多羧基配体结合在氧化铁核心上。进一步的用GLCN修饰后，部分羧基被GLCN修饰，GLCN通过酰胺键结合在PTMP-PMAA配体上PTMP-PMAA)。
XRD测定以及分析：
图2为GLCN修饰后的VSPIONs@PTMP-PMAA产物的XRD图
如图2为GLCN修饰后的VSPIONs@PTMP-PMAA的XRD图。通过对比标准PDF卡片通过(JCPDS:75-0449)，说明产物的无机成分是Fe3O4，晶体结构是尖晶石结构。在2θ＝30.1°、35.6°、43.0°、53.0°、57.3°和62.9°处出现的衍射峰分别对应Fe3O4(220)、(311)、(400)、(422)、(511)和(440)晶面，峰形较粗糙，一定程度说明生成的物质晶粒细小。根据晶体面(311)特征衍射峰宽度计算出修饰前后Fe3O4的平均晶体粒径为5.23nm。(XRD检测证明氧化铁的核心成分，本例子是制备了纯的Fe3O4，通过改变合成条件，可以获得其他的氧化铁成分，通过本发明的方法获得了核心粒径小于10nm的超小氧化铁纳米材料)。
TEM测定以及分析
图3为GLCN修饰后的VSPIONs@PTMP-PMAA的TEM图；用TEM对 GLCN修饰后的VSPIONs@PTMP-PMAA形貌进行了表征。如图3可知，通过 Image J软件计数300个点，计算得到粒径为4.998±1.657nm。(TEM检测进一步证明了本发明的氧化铁核心粒径小于10nm)。
实施例2：
本实施例介绍如何应用本发明的材料和常用的细胞转染助剂复合进行细胞标记：以常用转染剂PLL为例制备PLL-GLCN-VSPIONs@PTMP-PMAA细胞标记液：
PLL-GLCN-VSPIONs@PTMP-PMAA细胞标记液需要在实验前现配现用。用含10％FBS的F-12/MEM完全培养基将GLCN修饰后的 VSPIONs@PTMP-PMAA稀释至不同浓度：0μg/ml、10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、 75μg/ml、100μg/ml、125μg/ml、150μg/ml。每种浓度内加入PLL使每毫升溶液中PLL浓度为1.5μg/ml。避光条件下反应20分钟后，即制备完成不同浓度 PLL-GLCN-VSPIONs@PTMP-PMAA细胞标记液，用于标记细胞。
对比例1--VSPIONs@MSA-PMAA的制备
和实施例1相比，区别仅在于，进行步骤(1)和(2)，其中，步骤(1)中，采用等摩尔量的MSA。
反应式为：
Figure RE-GDA0003130232000000131
Figure RE-GDA0003130232000000132
将AIBN(0.08g，0.5mmol)加入30mL无水乙醇中，超声溶解后加入100 mL三口烧瓶中，打开磁力搅拌器，通氮30min，然后加入MAA(4.3g，50mmol)、 MSA(0.75g，5mmol)。
然后开始加热，做好回流装备的摆设，打开回流水，当温度到达75℃时，开始计时，反应5h。反应结束后，在氮气接通条件下将样品冷却到室温，加入准备好的冰乙醚，会有白色沉淀产生，用布氏漏斗将溶液杂质的溶剂除去，重复三次，得到白色物质，然后将物质送入真空干燥箱45℃抽真空干燥12h将多余的溶剂以及单体去除，将得到的白色粉末。
在装有回流冷凝器、温度计和供氮装置的500mL三颈圆底烧瓶中，加入100 mL水。用氮气净化水中的氧气，磁搅拌加热油浴回流。分别
将聚合物配体10％的MSA-PMAA(0.215g，1mM)引入烧瓶，浓度为1 mM。
准备FeCl3·6H2O(0.291g，1.08mmol)和FeSO4·7H2O(0.150g，0.54mmol) 溶解在2mL原始盐酸，当温度到达100℃加入，30mL(原始氨水)加在5秒内添加完，快速搅拌。在添加铁前体溶液,反应混合物的颜色变成黄色和添加氨水反应混合物的颜色变成了深黑色突然表明氧化铁NPs的形成。然后继续在这个温度为回流2h。2h后关闭装置，产物在氮气下冷却到室温。将混合液用 8000-14000kDa的透析袋在超纯水中透析，透析三天换4到5次超纯水。然后将产物用250nm的过滤膜过滤，将得到的产物减压旋转蒸发浓缩，然后再45℃在真空干燥箱中干燥，得到黑色粉末。
对比例2--VSPIONs@ODT-PMAA的制备
反应式为：
Figure RE-GDA0003130232000000141
Figure RE-GDA0003130232000000142
将AIBN(0.08g，0.5mmol)加入30mL无水乙醇中，超声溶解后加入100 mL三口烧瓶中，打开磁力搅拌器，通氮30min，然后加入MAA(4.3g，50mmol)、 ODT(1.43g，5mmol)。
然后开始加热，做好回流装备的摆设，打开回流水，当温度到达75℃时，开始计时，反应5h。反应结束后，在氮气接通条件下将样品冷却到室温，加入准备好的冰乙醚，会有白色沉淀产生，用布氏漏斗将溶液杂质的溶剂除去，重复三次，得到白色物质，然后将物质送入真空干燥箱45℃抽真空干燥12h将多余的溶剂以及单体去除，将得到的白色粉末。H-NMR见图15，(D6 DMSO)δ(ppm): 0.9(b)CH3,1.24(CH2)91.7(b)CH2(backbone),2.4CH2(fromODT),12.3(b)CO2H
在装有回流冷凝器、温度计和供氮装置的500mL三颈圆底烧瓶中，加入100 mL水。用氮气净化水中的氧气，磁搅拌加热油浴回流。分别将聚合物配体 ODT-PMAA(0.235g，1mM)引入烧瓶，浓度为1mM。
准备FeCl3·6H2O(0.291g，1.08mmol)和FeSO4·7H2O(0.150g，0.54mmol) 溶解在2mL原始盐酸，当温度到达100℃加入，30mL(原始氨水)加在5秒内添加完，快速搅拌。在添加铁前体溶液,反应混合物的颜色变成黄色和添加氨水反应混合物的颜色变成了深黑色突然表明氧化铁NPs的形成。然后继续在这个温度为回流2h。2h后关闭装置，产物在氮气下冷却到室温。将混合液用 8000-14000kDa的透析袋在超纯水中透析，透析三天换4到5次超纯水。然后将产物用250nm的过滤膜过滤，将得到的产物减压旋转蒸发浓缩，然后再45℃在真空干燥箱中干燥，得到黑色粉末。
实施例3：
T1加权和T2加权显像能力测定：
将VSPIONs@PTMP-PMAA材料配置成水溶液，配置Fe浓度梯度溶液 0.680mM、0.340mM、0.170mM、0.085mM、0.042mM、0.017mM。每个浓度取1mL于PE管中，Philips Ingenia测量这三种材料的T2加权核磁共振成像。用 Image J计算其灰度值并绘制柱状图。测试参数，T1加权参数：TR/TE＝649/20ms，FOV＝130×130mm，thickness＝2.0mm，3.0T，32℃。T2加权参数：TR/TE＝2339/80 ms，FOV＝130×130mm，thickness＝2.0mm，3.0T。
对VSPIONs@PTMP-PMAA材料进行T1加权和T2加权显像能力测定，结果见图4：从图4可以看出，本发明所述的VSPIONs@PTMP-PMAA同时具有 T1加权和T2加权显像能力，通过T2加权成像可以在更小的浓度和亚毫米区域检测到标记的细胞，通过T1加权成像可以与出血、钙化、金属沉积(如内源性铁) 和其他易感性伪影的信号相区别；并且本发明所述的VSPIONs@PTMP-PMAA 具有pH敏感性，随着pH值从7.4下降至pH5.5，T1加权图像信号越来越亮， T2加权信号越来越弱。这凸显了本发明所述材料的优势。作为一种细胞标记材料，由于该材料的信号能随着pH值发生变化，我们将能通过MRIT1加权和T2 加权信号的变化，检测该材料是否进入细胞，并且在细胞器的位置。众所周知，培养基的pH值在6.5到7.4之间，在这个pH值范围内，本发明所述的 VSPIONs@PTMP-PMAA的T1加权图像信号和T2加权信号基本没有变化。溶酶体的pH在3.5～6之间，随着该材料被细胞的内吞，材料将进入溶酶体，由于该材料在pH5.5时T1加权图像信号变亮，T2加权信号变弱，因此，通过MRI 信号的变化，我们能判断该材料已进入细胞。这是目前公知的氧化铁标记材料不具备的有益功能。
实施例4：
取800mg壳聚糖(CS)放置于烧杯中，加入400mL1％醋酸溶液溶解。加入80mg 2-亚氨基硫烷盐酸盐(TBA)，用5M的NaOH调节pH到6，匀速搅拌24h。依次进行进行5次透析后于-20℃中冷冻至固态。后于-80℃真空环境下冷冻干燥48小时至海绵状，获得CS-TBA凝胶。
200mg CS-TBA凝胶加入9mL去离子水中搅拌溶解。加入200mg羟基磷灰石，超声搅拌至分散均匀。560mgβ-甘油磷酸钠(β-GP)溶于1mL去离子水中，制成溶液，并加入CS-TBA凝胶制成CS-TBA/HA水凝胶。
将第3代骨髓间充质干细胞(BMSC)以3.0×106/孔浓度接种于6孔板中，贴壁后分别将不同浓度(0/10/25/50/75/100/125/150μg/ml)的 PLL-GLCN-VSPIONs@PTMP-PMAA细胞标记液加入培养基，每孔2ml，在37℃ 5％CO2下孵育。12小时后弃去培养基，PBS洗涤3遍，0.25％胰酶消化后以 3.0×106/孔重新接种在6孔板内，继续在37℃5％CO2条件下孵育。PB染色后，分别在不同倍数下，每孔上下左右四个象限分别随机取3个视野图像。计算各视野中细胞数及被标记细胞数，计算标记率(标记细胞数/视野内总细胞数)。并用ImageJ计算视野内PB着色面积百分比，即为标记百分比。
标记后BMSC用PBS洗涤2遍，4％多聚甲醛固定15分钟，之后PBS洗涤 2遍。配制普鲁士蓝染液，将普鲁士蓝A液和普鲁士蓝B液等量混合，摇匀，加入孔板内，室温下静置反应30分钟。反应结束后，PBS洗涤2遍，每孔加入伊红染料1ml，反应15秒后吸走伊红，流水洗涤2遍后镜下观察染色效果。
制备搭载用PLL-GLCN-VSPIONs@PTMP-PMAA细胞标记液标记的骨髓间充质干细胞(BMSC)的CS-TBA/HA水凝胶。每1mlCS-TBA/HA水凝胶上接种 1×106个PLL-GLCN-VSPIONs@PTMP-PMAA细胞标记液标记的BMSC。
12只雄性SD大鼠(220-250g，来自南方医科大学实验动物中心)适应性饲养1周。分为三组：①标记BMSC组：单侧注射搭载标记BMSC的CS-TBA/HA 水凝胶；②未标记BMSC组：单侧注射搭载未标记BMSC的CS-TBA/HA水凝胶；③双侧对照组：双侧同时注射搭载标记BMSC和未标记BMSC的CS-TBA/HA 水凝胶。具体步骤如下：
SD大鼠腹腔注射4％水合氯醛，用量为0.8ml/100g。背部中央备皮，消毒铺单。2ml注射器抽取制备好的不同组CS-TBA/HA水凝胶，分别注射进大鼠背部皮下，制备皮下异位成骨模型。单侧注射组均注射在大鼠左侧皮下，双侧对照组左侧注射标记BMSC组凝胶，右侧注射未标记BMSC组凝胶。恒温25℃环境下饲养，术后连续3天每天肌肉注射8万单位青霉素，每日观察植入处皮肤情况。
参数及显像检测
SD大鼠注射不同组CS-TBA/HA水凝胶后，分别在注射后12小时、4天、9 天、13天做体内成像测试。大鼠麻醉后固定于大鼠用磁共振项圈后放置于3.0T 核磁共振仪内，成像序列选择自旋回波T2加权序列(SE T2WI)，具体参数如下：
Figure RE-GDA0003130232000000161
体内示踪效果及持续时间
由于体内和体外的细胞外环境不同，细胞标记的时间也存在不同，因此我们进一步检测了体内条件下，本发明的示踪材料用于示踪骨组织工程学中干细胞的效果及持续时间。我们选择骨组织工程学中常用的CS-TBA/HA凝胶作为本发明的示踪材料标记BMSC(实施例2制得的材料)细胞的载体(图5A)。我们将 1*106标记BMSC接种于1ml CS-TBA/HA凝胶中，制备出搭载标记BMSC的CS-TBA/HA凝胶。按照以下分组制备异位成骨模型：①单侧皮下注射搭载标记 BMSC的CS-TBA凝胶；②单侧注射搭载未标记BMSC的CS-TBA凝胶；③左侧注射搭载标记BMSC凝胶，右侧注射搭载未标记BMSC凝胶(图5B，C)。
凝胶注射进小鼠体内后，在T2WI中，本发明的示踪材料标记BMSC呈显著低信号影，未标记BMSC呈稍高信号影，两者差异明显(图5D-F)。植入体内第13天后可见，T2WI下本发明的示踪材料标记组凝胶影像呈稍低信号影，与未标记组相近，提示凝胶内本发明的示踪材料已经基本代谢完毕(图5D4-F4)。体内实验结果表明，标记细胞搭载于CS-TBA/HA凝胶中时，其显像持续时间约 13天。体内实验持续时间较体外实验要短，考虑除了细胞分裂及被细胞排出外，部分标记细胞会随血流移动到其他位置，导致凝胶植入处标记细胞浓度减小。以上结果显示本发明的示踪材料用于骨组织材料中干细胞示踪时，体内有效持续时间在13天左右，且显像效果清晰，能很好满足前期示踪的需要。
结果见图5所示：右侧注射搭载未标记BMSC凝胶。C1-2大鼠单侧注射凝胶。D1-4载本发明的示踪材料标记BMSC凝胶组；E1-4载未标记BMSC凝胶组； F1-4左侧为载本发明的示踪材料标记BMSC凝胶组，右侧为载未标记BMSC凝胶组；1-4分别为12小时、4天、9天、13天各时间点MRI图像。
实施例5
PLL-GLCN-VSPIONs@PTMP-PMAA的生物相容性测定
利用CCK-8测试不同浓度PLL-GLCN-VSPIONs@PTMP-PMAA的细胞毒性。96孔板内以1×104/孔浓度接种第3代BMSC，37℃孵育12小时至完全贴壁。分别用不同浓度PLL-GLCN-VSPIONs@PTMP-PMAA标记，在37℃5％CO2孵育24小时。每孔PBS洗涤2遍，避光环境下加入含有10％CCK-8的F-12培养 100ul，37℃下避光孵育3小时。分光光度计在波长450nm处测量吸光度。
三系诱导及鉴定
将PLL-GLCN-VSPIONs@PTMP-PMAA标记的BMSC以1.0×106/孔接种在 6孔板内，设置4个组，每组6孔，分别加入：①成骨诱导培养基；②成脂诱导培养基；③成软骨诱导培养基；④10％FBS的F-12/MEM完全培养基。诱导21 天后分别：①组行茜素红染色，②组行油红O染色，③组行阿利辛蓝染色，④组分别取2个孔做三系染色。倒置显微镜下镜下观察染色情况。
细胞相容性测定；
本发明的示踪材料对BMSC(实施例2制备)性质的影响
既往研究还发现过高浓度纳米铁粒子标记细胞后会影响细胞的活性和增殖能力。我们利用CCK-8检测了不同浓度本发明的示踪材料标记后的细胞毒性(图 6A)。与空白组相比，100-150μg/ml组均影响BMSC活性，其中125μg/ml和 150μg/ml组显著影响细胞活性(P＜0.01)，并且浓度低于75μg/ml时，BMSC 活性没有受到显著影响(图6A)。结合标记效果及细胞毒性结果，我们可以认为50μg/ml是最合适的标记浓度。由于BMSC的分化潜能是其发挥治疗作用的关节，因此我们进一步研究本发明的示踪材料标记是否影响BMSC分化能力。
我们将50μg/ml本发明的示踪材料标记BMSC之后，分别加入成骨、成脂及成软骨培养基。诱导21天之后分别做茜素红、油红O及阿利新蓝染色。结果显示被标记的BMSC三系分化结果未受影响(图6B，C，D)。此外，没有添加诱导培养基的情况下，本发明的示踪材料对BMSC的标记不会影响细胞分化。因此，我们可以认为50μg/ml的本发明的示踪材料不仅没有细胞毒性，也不影响BMSC的分化潜能，是最合适的标记浓度。
图6中，B1-D1 BMSC三系分化后染色结果，B2-D2被标记BMSC三系分化后染色结果，B3-D3被标记BMSC正常培养后后染色结果。其中1-3分别为油红O染色、茜素红染色及阿利新蓝染色。
实施例6：
GLCN修饰前后VSPIONs@PTMP-PMAA标记效果对比
为证明GLCN修饰的有益效果，对比GLCN修饰后VSPIONs@PTMP-PMAA 标记BMSC效果，我们分别用50μg/ml PLL-GLCN-VSPIONs@PTMP-PMAA(本发明的示踪材料)与50μg/mlVSPIONs@PTMP-PMAA标记BMSC。 PLL-GLCN-VSPIONs@PTMP-PMAA(本发明的示踪材料)标记BMSC后，90％以上细胞被标记，放大后可见PLL-GLCN-VSPIONs@PTMP-PMAA(本发明的示踪材料)均匀的分布在细胞质内(图8A-B)。而VSPIONs@PTMP-PMAA被标记细胞比例也显著少于PLL-GLCN-VSPIONs@PTMP-PMAA(本发明的示踪材料)组(图8C)。透射电镜下均可在两种被标记BMSC内观察到吞噬了纳米粒子的溶酶体小泡，这证明了两种VSPIONs均能被BMSC有效摄取进细胞内(图 8C-D)。VSPIONs被细胞吞噬后，主要分布于细胞质中的溶酶体小泡(图8C2，D2)。与VSPIONs@PTMP-PMAA相比，PLL-GLCN-VSPIONs@PTMP-PMAA (本发明的示踪材料)在溶酶体小泡内分散更均匀，且数量更多。以上结果提示 PLL-GLCN-VSPIONs@PTMP-PMAA(本发明的示踪材料)能被BMSC摄取，较修饰前摄取率和分散性更好。
BMSC后光镜下图像；B1-B3是50μg/ml PLL-GLCN-VSPIONs@PTMP-PMAA(本发明的示踪材料)标记BMSC后PB染色图像；C1-C3为50μg/mlVSPIONs@PTMP-PMAA标记BMSC后PB染色图像。 C1-3是50μg/mlPLL-GLCN-VSPIONs@PTMP-PMAA(本发明的示踪材料)标记 BMSC后的透射电镜图像，D1-3是50μg/ml VSPIONs@PTMP-PMAA(文献报道的氧化铁材料)标记BMSC后的透射电镜图像。1-3透射电镜放大标尺分别为 2μm、200nm、200nm。圆圈内为吞噬了铁纳米微粒的细胞内结构。
实施例8
本发明示踪材料和PLL的协同：
由于本发明的细胞标记材料表面Zeta电位为负值，可以用带正电的细胞转染促进剂促进细胞对本发明所述材料的内吞。PLL是传统的细胞转染促进剂，本实施例以PLL为例，展示本发明本发明示踪材料和PLL的协同作用。
PLL是一种非病毒阳离子转染剂,作为GLCN-VSPIONs@PTMP-PMAA的改型剂，能使粒子表面带有正电荷。由于我们所用的 GLCN-VSPIONs@PTMP-PMAA表面带有较强的负电荷，因此通过简单地将 GLCN-VSPIONs@PTMP-PMAA与PLL混合在细胞培养基中，PLL即能与带负电的GLCN-VSPIONs@PTMP-PMAA形成稳定的带正电荷的复合物。 GLCN-VSPIONs@PTMP-PMAA复合物会与干细胞细胞膜之间发生静电相互作用互相吸引从而促进细胞摄取。但是在培养基环境中，由于蛋白质等多种大分子带负电荷，因此在培养过程中加入PLL容易与这些物质相互吸引结合而沉淀，降低了改型的效率。因此，我们在加入培养基之前预先将 GLCN-VSPIONs@PTMP-PMAA与PLL相互混合孵育，尽量增加两者结合率。
不同改型的VSPIONs@PTMP-PMAA标记BMSC后形态学比较
实验开始前将PLL分别加入GLCN-VSPIONs@PTMP-PMAA和 VSPIONs@PTMP-PMAA内孵育20分钟，制备 PLL-GLCN-VSPIONs@PTMP-PMAA和PLL-VSPIONs@PTMP-PMAA。配制50 μg/ml不同改型的VSPIONs溶液(PLL-GLCN-VSPIONs@PTMP-PMAA、 GLCN-VSPIONs@PTMP-PMAA、PLL-VSPIONs@PTMP-PMAA、 VSPIONs@PTMP-PMAA)与BMSC共培养，37℃下孵育12小时后用0.25％胰酶消化，以3.0×105/孔接种在6孔板内，每组3个孔，继续在37℃下孵育12小时至细胞完全贴壁。按照前述方式进行PB染色。
倒置显微镜下观察各组图像，每孔随机取3个视野，每组共9个图像，ImgeJ 软件计算染色面积和每个视野内总细胞数，计数被标记细胞数量，计数每个图像内细胞数。染色面积与总细胞数之比为平均染色面积，着色细胞与总细胞数之比为标记率。
不同改型的VSPIONs标记BMSC后细胞内铁含量检测
为了确定不同改型的VSPIONs标记BMSC的后细胞吞噬铁的含量，将50 μg/ml不同改型的VSPIONs溶液(PLL-GLCN-VSPIONs@PTMP-PMAA、 GLCN-VSPIONs@PTMP-PMAA、PLL-VSPIONs@PTMP-PMAA、 VSPIONs@PTMP-PMAA)与BMSC细胞孵育12小时后用0.25％胰酶消化，以 3.0×105/孔接种在6孔板内，每组3个孔，细胞孵箱内孵育12小时至细胞完全贴壁。
使用Biovision公司的总铁含量测试试剂盒测试每组细胞铁含量。
(a)实验组处理：往已孵育完毕的12孔板内加入PBS洗涤2遍，每孔加入IronAssayBuffer各100μl，孵育20分钟，镜下观察至细胞完全溶解。收集溶解细胞，移入1.5ml EP管内，在16000g下离心10分钟。小心吸取上层清液 100μl，勿触及底层沉淀物，移入96孔板内，之后每孔加入Iron Reducer 5μl。
(b)设置标准组：将495μl双蒸水与5μl Iron Standard溶液混合配制出1mM 的标准铁溶液。从中分别取出0、2、4、6、8、10μl分别加入同一96孔板内，每孔继续分别加入IronAssay Buffer 100、98、96、94、92、90μl补至100μl，每孔加入IronReducer 5μl。
(c)标准组与实验组在室温下静置反应30分钟。之后每孔加入Iron Probe 100μl，包裹锡箔纸，放置在室温下避光反应1小时。
利用分光光度计测量各组吸光度，波长设置为593nm。根据标准组吸光度绘制标准铁曲线，根据曲线计算实验组每孔铁含量。单个细胞内铁含量即为每孔铁含量/每孔细胞数(1.5×105)。
数据统计方法
所有数据均表示为平均值±标准误差，并且通过SPSS 22.0软件进行统计分析。各组间差异通过单因素方差分析(One-wayANOVA)进行统计分析，P值小于0.05即认为存在统计学意义。
分别对比GLCN-VSPIONs@PTMP-PMAA(本发明的示踪材料)， PLL-GLCN-VSPIONs@PTMP-PMAA(本发明的示踪材料+PLL)， VSPIONs@PTMP-PMAA(未被GLCN修饰的氧化铁材料)，PLL-VSPIONs@PTMP-PMAA(未被GLCN修饰的氧化铁材料+PLL)的标记效果(图9A-D)。各组平均标记百分比分比为99.74±0.16、89.91±3.58、62.89±0.96、 11.30±0.69(图9E)。而PB染色面积百分比分别为6.17±0.29、5.00±0.43、3.53±0.19、 1.67±0.09(图9F)。与VSPIONs@PTMP-PMAA(未被GLCN修饰的氧化铁材料)相比，其余三组在细胞摄取率上均有明显升高， PLL-GLCN-VSPIONs@PTMP-PMAA(本发明的示踪材料+PLL)的平均染色面积和细胞标记率分别为VSPIONs@PTMP-PMAA(未被GLCN修饰的氧化铁材料)的3.7倍和9倍(图9E，F)。而本发明的示踪材料+PLL组的摄取率要显著高于本发明的示踪材料和VSPIONs@PTMP-PMAA(未被GLCN修饰的氧化铁材料)+PLL组(P＜0.05)，这说明了添加多聚-L-赖氨酸能有效增加BMSC 对标记材料的摄取(图4)。以上结果证明，相较于无改型和单一改型，添加多聚-L-赖氨酸等转染剂能进一步有效增加细胞对本发明的示踪材料的吞噬。
为进一步确认BMSC对不同改型VSPIONs的吞噬情况，我们分别用50μg/ml 的不同示踪材料标记BMSC，检测各组细胞内铁含量。PLL-GLCN-VSPIONs@PTMP-PMAA(本发明的示踪材料+PLL)、 GLCN-VSPIONs@PTMP-PMAA(本发明的示踪材料)、 PLL-VSPIONs@PTMP-PMAA(文献报道的氧化铁材料+PLL)、 VSPIONs@PTMP-PMAA(文献报道的氧化铁材料)各组单个细胞内铁含量分别为18.18±0.44、11.30±3.16、10.07±1.79、9.30±0.48pg。 PLL-GLCN-VSPIONs@PTMP-PMAA(本发明的示踪材料+PLL)组铁含量显著高于VSPIONs@PTMP-PMAA组(P＜0.05)，约为VSPIONs@PTMP-PMAA(文献报道的氧化铁材料)组的2倍。而单独使用本发明的示踪材料 GLCN-VSPIONs@PTMP-PMAA和PLL-VSPIONs@PTMP-PMAA(文献报道的氧化铁材料+PLL)组铁含量要低于PLL-GLCN-VSPIONs@PTMP-PMAA(本发明的示踪材料+PLL)组，但单独使用本发明的示踪材料 GLCN-VSPIONs@PTMP-PMAA组要高于PLL-VSPIONs@PTMP-PMAA(文献报道的氧化铁材料+PLL)组。此外，我们对各组VSPIONs标记BMSC后的7 天内细胞毒性做了检测，证明四种VSPIONs(文献报道的氧化铁材料)对BMSC 均没有明显毒性。以上结果证明，GLCN和PLL均能提高 VSPIONs@PTMP-PMAA的细胞摄取率。但本发明的示踪材料+PLL能最高效的提高BMSC对示踪剂的摄取率，说明本发明的示踪材料可在其他细胞转染剂的作用下进一步提高本发明的标记效果。
测试结果见图9所示，图9A-D 50μg/ml PLL-GLCN-VSPIONs@PTMP-PMAA、GLCN-VSPIONs@PTMP-PMAA、 PLL-VSPIONs@PTMP-PMAA、VSPIONs@PTMP-PMAA标记BMSC后的PB染色图像，A1-D1放大倍数为10×，A2-D2为20倍。E各组细胞染色面积。F各组细胞标记率。G各组单个细胞内平均铁含量。H各组标记BMSC后7天内细胞 CCK-8检测结果。
实施例9
PLL-GLCN-VSPIONs@PTMP-PMAA(本发明的示踪材料+PLL)标记BMSC 的有效时间
我们制备PLL-GLCN-VSPIONs@PTMP-PMAA(本发明的示踪材料+PLL) 的目的是能在一段时间内对体内的细胞进行示踪，因此我们检测了体外标记细胞持续时间。用50μg/mlPLL-GLCN-VSPIONs@PTMP-PMAA(本发明的示踪材料 +PLL)标记BMSC后。分别在1d、3d、5d、7d、9d、11d、13d、17d等时间点染色并在倒置显微镜下取像观察。随着标记后细胞培养时间的增加，被标记细胞数量显著减少，而且普鲁士蓝染色面积也显著地减少(图10)。在最初的1d至 5d时间内，染色面积减少较缓，但是在标记7d之后，标记细胞减少非常显著，在第7天很难观测到被标记的细胞，且细胞内普鲁士蓝染色面积也明显的减少，这意味着细胞内的PLL-GLCN-VSPIONs@PTMP-PMAA(本发明的示踪材料 +PLL)含量随培养时间增加而减少。造成这一现象的可能性有两种：一是细胞增殖凋亡导致被标记细胞不断减少，因此标记细胞比例下降；其次是BMSC的胞吐作用不断地将吞噬进去的PLL-GLCN-VSPIONs@PTMP-PMAA(本发明的示踪材料)排出，导致标记细胞数量以及细胞内GLCN-PLL-VSPIONs-PMAA(本发明的示踪材料)含量的下降。但在标记细胞培养17天后，镜下图像中仍能观察到被标记的细胞存在，这表明PLL-GLCN-VSPIONs@PTMP-PMAA(本发明的示踪材料)在体外的标记能力能维持17天以上(图10J)。
图10A-H 50μg/mlPLL-GLCN-VSPIONs@PTMP-PMAA(本发明的示踪材料)标记BMSC后在1d、3d、5d、7d、9d、11d、13d、17d的PB染色图像(10X)，红色箭头指向被标记细胞。I为各组间PB着色面积，BMSC着色面积随时间显著减少，各组间存在显著差异(P＜0.01)。J为H局部放大4倍后图像。
实施例10
端基结构为巯基对细胞摄取的影响研究
样品制备参照实施例1，PB染色和检测方法同前。测试结果见图12和13；
三种聚合物配体的理论分子量和临界胶束浓度
Figure RE-GDA0003130232000000221
从测试结果可知，A列、B列和C列分别为VSPIONs@ODT-PMAA， VSPIONs@MSA-PMAA，VSPIONs@PTMP-PMAA标记BMSCs的效果，VSPIONs@PTMP-PMAA标记效果最好。定量比较结果如下：方法一、方法二和最新方法分别为VSPIONs@ODT-PMAA，VSPIONs@MSA-PMAA， VSPIONs@PTMP-PMAA标记BMSCs的定量比较结果。A材料和B材料端基不含巯基结构，A材料端基为烷基，B材料端基为羧基，C材料为本发明的代表材料，端基末端含3个巯基。
本发明的实验证实端基为PTMP巯基结构(共性特点为端基为多硫醇结构) 的氧化铁表面的PMAA配体极大的提高了细胞对氧化铁纳米颗粒的摄取。细胞实验未发现细胞毒性和影响细胞的分化。

Claims (10)

1.磁性氧化铁细胞标记材料，其特征在于，包括磁性氧化铁颗粒，以及包覆所述磁性氧化铁颗粒的聚合物包覆层，聚合物具有聚丙烯酸类聚合链，其链端修饰有多巯基化合物，链上的部分羧基修饰有氨基葡萄糖；
所述的多巯基化合物为含有两个及以上的巯基的化合物。
2.如权利要求1所述的磁性氧化铁细胞标记材料，其特征在于，氨基葡萄糖基于酰胺键修饰在聚丙烯酸类聚合物的链段上。
3.如权利要求1所述的磁性氧化铁细胞标记材料，其特征在于，
所述的多巯基化合物，包括一个支化中心或者由两个及以上的支化中心相互连接形成的多支化中心；
优选地，所述的支化中心为3级碳或者四级碳；
优选地，所述的巯基通过烷基、醚基、酯基、酰胺基基团和支化中心连接；
优选地，所述的多巯基化合物的游离的巯基数量为2～4个；
优选地，所述的多巯基化合物通过酯基、烷基、酰胺基或二硫基修饰在聚合物链段中；
优选地；修饰的多巯基化合物具有式1结构式；
Figure FDA0003100541920000011
4.如权利要求1所述的磁性氧化铁细胞标记材料，其特征在于，所述的多巯基化合物修饰在聚合物链的一端或者两端。
5.如权利要求1所述的磁性氧化铁细胞标记材料，其特征在于，所述的聚合物具有式2结构式：
Figure FDA0003100541920000012
所述的R4、R5中，至少一个取代基为多巯基化合物残基；剩余的取代基为H；
所述的R2、R3独自为H、C1～C3的烷基；
所述的n个R1中，部分为H，剩余部分为式3所示的基团；
Figure FDA0003100541920000021
所述的n为小于或者等于10000的整数。
6.如权利要求1所述的磁性氧化铁细胞标记材料，其特征在于，优选地，所述的聚合物具有式2-A结构式的聚合物：
Figure FDA0003100541920000022
7.如权利要求1所述的磁性氧化铁细胞标记材料，其特征在于，所述的磁性氧化铁颗粒为磁铁矿(Fe3O4)、磁赤铁矿(γ-Fe2O3)和赤铁矿(α-Fe2O3)中的至少一种；
优选地，所述的磁性氧化铁颗粒的颗粒度为0.5nm～50微米；优选为1nm～10nm。
8.如权利要求1所述的磁性氧化铁细胞标记材料，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(1)：将多巯基化合物和丙烯酸类单体进行聚合反应，制得修饰有多巯基化合物的聚丙烯酸类聚合物；
步骤(2)：采用修饰有多巯基化合物的聚丙烯酸类聚合物对磁性氧化铁颗粒进行包覆，随后再和氨基葡萄糖进行接枝修饰反应，即得。
9.一种磁性氧化铁细胞标记复合材料，其特征在于，包含权利要求1～7任一项所述的磁性氧化铁细胞标记材料或权利要求8所述制备方法制得的磁性氧化铁细胞标记材料；还包含表面转染剂；
优选地，所述的表面转染剂为多聚-L-赖氨酸(poly-L-lysine，PLL)、硫酸鱼精蛋白(protamine sulfate，PS)、阳离子脂质体(lipofectamine)中的至少一种。
10.一种磁性氧化铁细胞标记材料的应用，其特征在于，将其用作细胞MRI示踪材料。
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