CN109880108B - 一种聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁的制备方法及基因载体 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁的制备方法及基因载体，涉及基因载体技术领域。所述聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁的制备方法包括以下步骤：在惰性气氛下，向米糠多糖铁溶液中依次加入三乙胺和N,N‑羰基‑二咪唑溶液，避光反应形成反应溶液；将聚乙烯亚胺溶液加入到所述反应溶液中避光反应形成粗样液，并在反应过程中控制混合溶液呈碱性；对所述粗样液进行透析，取透过液醇沉、冷冻干燥后得聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁。本发明还提出一种基因载体，包括聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁。本发明旨在制备一种聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁，制备工艺简单、制备成本低，且制得的聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁具有较低的细胞毒性和高转染效率。

Description

一种聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁的制备方法及基因载体

技术领域

本发明涉及基因载体技术领域，特别涉及一种聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁的制备方法及基因载体。

背景技术

裸露的外源基因DNA难以进入细胞且容易被机体或细胞降解，因而难以表达，所以应寻找对病变组织具有选择性、高转染率及低毒性的载体协助目的基因进入靶细胞，用于转运目的基因进入靶细胞的载体即为基因载体，选择合适的基因载体是基因治疗的成功关键。基因载体主要有病毒载体和非病毒载体两类。目前常见的非病毒载体包括高分子载体和纳米材料载体，普遍存在制备反应复杂、细胞毒性高、转染效率有限的问题，限制了基因载体的进步发展。

发明内容

本发明的主要目的是提出一种聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁的制备方法及基因载体，旨在制备一种聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁，制备工艺简单、制备成本低，且制得的聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁具有较低的细胞毒性和高转染效率。

为实现上述目的，本发明提出了一种制备聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁的方法，所述聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁的制备方法包括以下步骤：

在惰性气氛下，向米糠多糖铁溶液中依次加入三乙胺和N,N-羰基-二咪唑溶液，避光反应形成反应溶液；

将聚乙烯亚胺溶液加入到所述反应溶液中避光反应形成粗样液，并在反应过程中控制混合溶液呈碱性；

对所述粗样液进行透析，取透过液醇沉、冷冻干燥后得聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁。

优选地，米糠多糖铁、N,N-羰基-二咪唑和聚乙烯亚胺的质量比为1：(2.0～3.0):(7.5～9.0)。

优选地，所述在惰性气氛下，向米糠多糖铁溶液中依次加入三乙胺和N,N-羰基-二咪唑溶液，避光反应形成反应溶液的步骤中，向米糠多糖铁溶液中加入三乙胺后米糠多糖铁溶液的pH为8～9；和/或，

所述避光反应时间为3～5h。

优选地，所述将聚乙烯亚胺溶液加入到所述反应溶液中避光反应形成粗样液，并在反应过程中控制混合溶液呈碱性的步骤包括：

将聚乙烯亚胺溶液滴加到所述反应溶液中，同时向所述反应溶液中滴加三乙胺并控制pH为8.8～9.2，避光条件下搅拌反应，得粗样液；

所述将聚乙烯亚胺溶液滴加到所述反应溶液中的时间不超过1h；和/或，

所述搅拌反应的时间为22～26h。

优选地，所述对所述粗样液进行透析，取透过液醇沉、冷冻干燥后得聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁的步骤中，

所述透析时，使用的透析袋的截留分子量为3000～3200；

所述透析的时间为36～60h；和/或，

所述醇沉的时间为36～50h。

优选地，所述在惰性气氛下，向米糠多糖铁溶液中依次加入三乙胺和N,N-羰基-二咪唑溶液，避光反应形成反应溶液的步骤之前，还包括：

将米糠多糖铁溶于有机溶剂中，得米糠多糖铁溶液；

将N,N-羰基-二咪唑溶于所述有机溶剂中，得N,N-羰基-二咪唑溶液；

将聚乙烯亚胺溶于所述有机溶剂中，得聚乙烯亚胺溶液。

优选地，所述有机溶剂为二甲基亚砜。

优选地，所述将米糠多糖铁溶于有机溶剂中，得米糠多糖铁溶液的步骤之前还包括：

将米糠多糖和柠檬酸三钠溶于水中，得混合溶液，并调节所述混合溶液的pH为8.5～9.0；

向所述混合溶液中滴加铁盐溶液至沉淀不再溶解后形成终点溶液，并在滴加过程中控制混合溶液pH在8.5～9.0范围内；

将所述终点溶液离心、醇沉、二次离心后，取沉淀物干燥得米糠多糖铁。

此外，本发明还提出了一种基因载体，所述基因载体包括根据上述聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁的制备方法制备的聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁。

本发明技术方案中，通过在米糠多糖铁的结构上接枝聚乙烯亚胺制得一种聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁。由于米糠多糖铁是米糠多糖的铁络合物，而米糠多糖具有天然无毒、生物相容性高、可生物降解的优点，且参与络合的三价铁离子不仅细胞毒性极低，还是机体所需的元素，因此，聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁进入细胞后可以顺利被代谢掉，避免在细胞内堆积引起细胞毒性。同时，聚乙烯亚胺结构上含有的大量氨基以及米糠多糖结构上络合的铁离子都加强了聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁的正电性，从而促进了聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁与DNA的凝聚效率和稳定程度，具有比聚乙烯亚胺更高的转染效率，是一种优质的基因载体或基因载体材料。此外，本发明提出的聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁的制备方法为只有两步的简单的接枝反应且反应条件要求低，在工业生产时，具有制备工艺简单易操作、耗费的成本低的优点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明提供的聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁的制备方法的一实施例的流程示意图；

图2为本发明提供的聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁的制备方法的另一实施例的流程示意图；

图3为本发明提供的聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁的制备方法的又一实施例的流程示意图；

图4为实施例1～10制得的聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁凝聚DNA后的产物的凝胶电泳图；

图5至图15为实施例1～10制得的聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁及对照品凝聚EGFP后的产物转染图。

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

目前常见的非病毒载体包括高分子载体和纳米材料载体，这类非病毒载体普遍制备反应复杂、反应步骤繁多，耗费的生产成本较高，且因为大多数分子量较大，进入细胞后不易被细胞内的酶代谢，从而在细胞内堆积，导致细胞毒性较高、安全性较差，此外，在基因转染效率上也还存在进一步提高的空间。

鉴于此，本发明提出一种基因载体，所述基因载体包括聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁。也就是说，本发明提出的基因载体包括：将聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁作为一种基因载体使用；或者，以聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁为核，添加其它原辅料(例如聚乙二醇、粘多糖、聚谷氨酸等)构建包覆外壳，制成基因载体。

米糠多糖是一种天然多糖，具有天然无毒、生物相容性高、可生物降解的优点，以米糠多糖为基本骨架生成的复合物同样具有上述优点，从而易于被代谢掉，而不会在细胞内堆积引起细胞毒性；米糠多糖铁是米糠多糖的铁络合物，一方面由于只引入了细胞毒性极低的三价铁离子，从而很好的保持了米糠多糖的低毒性，另一方面，络合结构简单稳定，很好地保持了米糠多糖的自身结构，进而最大程度地保持了米糠多糖的生物兼容性。因此，以米糠多糖铁为基本骨架，接枝聚乙烯亚胺，一方面，具有细胞毒性低、生物相容性好、可降解的优点，且降解后，铁离子作为人体所需的元素还能被人体吸收，进而起到补铁的作用；另一方面，聚乙烯亚胺结构上含有的大量氨基，即携带大量正电荷，络合的铁离子同样具有正电性，二者协同加强了聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁的正电性，从而可以促进聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁与DNA的凝聚效率和稳定程度，再加上聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁能够通过细胞膜的内吞作用进入细胞内，并在细胞内通过质子海绵效应释放DNA，因此，转染效率较高。

为此，本发明提出了一种聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁的制备方法，用于制备上述聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁，结合图1所示的聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁的制备方法的一实施例的流程示意图，所述聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁的制备方法包括以下步骤：

步骤S10、在惰性气氛下，向米糠多糖铁溶液中依次加入三乙胺和N,N-羰基-二咪唑溶液，避光反应形成反应溶液。

其中，向米糠多糖铁溶液中加入三乙胺后米糠多糖铁溶液的pH为8～9；所述避光反应时间为3～5h。

在碱性环境下，米糠多糖铁与N,N-羰基-二咪唑发生反应生成缩合产物，这一过程需要在碱性条件下进行，因此需要使用碱液进行pH调控，而由于N,N-羰基-二咪唑结构易被强碱影响，因此，本实施例中，选用三乙胺为酸碱调节剂，用于控制反应体系的pH，且其加入量以反应体系的pH为准，即当反应体系的pH达到8～9时，停止加入三乙胺。此外，采用的惰性气氛可以采用氮气保护。

步骤S20、将聚乙烯亚胺溶液加入到所述反应溶液中避光反应形成粗样液，并在反应过程中控制混合溶液呈碱性。

该反应同样需要在碱性条件下进行，因此，在整个反应过程中，要通过滴加酸碱调节剂控制反应体系的pH；此外，聚乙烯亚胺溶液的加入方式可以是一次性加入，也可以是逐滴加入，因此，在具体实施时，步骤S20可以包括：

将聚乙烯亚胺溶液滴加到所述反应溶液中，同时向所述反应溶液中滴加三乙胺并控制pH为8.8～9.2，避光条件下搅拌反应，得粗样液。

由于聚乙烯亚胺进入所述反应溶液后，会迅速包裹在缩合产物表面，如果一次性加入量较多，会导致里面的部分缩合产物无法参与反应，进而使合成产率降低，因此，在本实施例中，选用滴加的方式以促进反应顺利进行，提高产率。同时，为提高生产效率，滴加速度不宜过慢，因此，将聚乙烯亚胺溶液滴加到所述反应溶液中的时间优选为不超过1h。此外，为促进反应充分，所述搅拌反应的时间优选为22～26h。

此外，米糠多糖铁、N,N-羰基-二咪唑和聚乙烯亚胺的质量比为1：(2.0～3.0):(7.5～9.0)。反应物的加入量会直接影响到反应合成情况及收率，因此，在本实施例中，米糠多糖铁、N,N-羰基-二咪唑和聚乙烯亚胺的质量比优选为1：(2.0～3.0):(7.5～9.0)，也就是说，不管加入的米糠多糖铁溶液、N,N-羰基-二咪唑溶液和聚乙烯亚胺溶液各自的浓度为多少，假设投入的米糠多糖铁溶液中含有的米糠多糖铁的质量份数为1份，那么在步骤S10中，加入的N,N-羰基-二咪唑溶液中N,N-羰基-二咪唑的质量份数优选为2.0～3.0份；在步骤S20中加入的聚乙烯亚胺溶液中聚乙烯亚胺的质量份数优选为7.5～9.0份。

此外，上述米糠多糖铁溶液、N,N-羰基-二咪唑溶液和聚乙烯亚胺溶液也可以自行配制。上述步骤S10和步骤S20实施时，参阅图2所示的聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁的制备方法的另一实施例的流程示意图，步骤S10之前还可以包括以下步骤：

步骤S100、将米糠多糖铁溶于有机溶剂中，得米糠多糖铁溶液；

步骤S200、将N,N-羰基-二咪唑溶于所述有机溶剂中，得N,N-羰基-二咪唑溶液；

步骤S300、将聚乙烯亚胺溶于所述有机溶剂中，得聚乙烯亚胺溶液。

由于N,N-羰基-二咪唑在水中稳定性较差，因此，上述步骤S10和步骤S20的反应过程优选为在无水环境下进行，即，米糠多糖铁溶液、N,N-羰基-二咪唑溶液和聚乙烯亚胺溶液的溶剂优选为有机溶剂，在本实施例中，有机溶剂优选为二甲基亚砜。

需要说明的是，上述步骤S100、步骤S200和步骤S300无先后顺序要求，可以同时进行，也可以自由排列顺序进行。

此外，步骤S100中采用的米糠多糖铁同样可以自行合成，在本发明的又一实施例中，如图3所示，步骤S10之前还可以包括以下制备米糠多糖铁的步骤：

步骤S110、将米糠多糖和柠檬酸三钠溶于水中，得混合溶液，并调节所述混合溶液的pH为8.5～9.0；

步骤S120、向所述混合溶液中滴加铁盐溶液至沉淀不再溶解后形成终点溶液，并在滴加过程中控制混合溶液pH在8.5～9.0范围内；

步骤S130、将所述终点溶液离心、醇沉、二次离心后，取沉淀物干燥得米糠多糖铁。

即米糠多糖和铁盐在碱性条件下络合形成复合物，其中的铁盐可以包括任意一种三价铁离子的无机盐，例如，三氯化铁、硝酸铁等。

步骤S30、对所述粗样液进行透析，取透过液醇沉、冷冻干燥后得聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁。

其中，所述透析时，使用的透析袋的截留分子量优选为3000～3200；所述透析的时间优选为36～60h；所述醇沉的时间优选为36～50h。

粗样液中除聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁外，还含有三乙胺、过量的N,N-羰基-二咪唑、聚乙烯亚胺、有机溶剂等，因此，需要对粗样液透析提纯，并对透过液醇沉处理，得到聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁固体。且为了使最终得到的聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁产品纯度更高，透析的时间优选为36～60h，醇沉的时间优选为36～50h，且在醇沉后，可以进行多次洗涤及离心处理。

以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

取1g米糠多糖铁溶于80ml二甲基亚砜中，得米糠多糖铁溶液，备用；取2.5gN,N-羰基-二咪唑溶于40ml二甲基亚砜中，得N,N-羰基-二咪唑溶液，备用；取8g聚乙烯亚胺溶于100ml二甲基亚砜中，得聚乙烯亚胺溶液，备用。

在氮气保护下，向8ml上述米糠多糖铁溶液中依次加入三乙胺和N,N-羰基-二咪唑溶液4ml，形成待反应溶液(待反应溶液pH为8.0)，在避光环境下搅拌反应3h，形成反应溶液；在1h内，将10ml聚乙烯亚胺溶液滴加到上述反应溶液中，同时向反应溶液中滴加三乙胺以控制pH为8.8，避光条件下搅拌反应22h，得粗样液；将粗样液置于截留分子量为3000的透析袋中透析36h，取透过液。向透过液中加入3倍透过液体积的无水乙醇，醇沉36h后，冷冻干燥得聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁。

实施例2

取1g米糠多糖铁溶于90ml二甲基亚砜中，得米糠多糖铁溶液，备用；取2.2gN,N-羰基-二咪唑溶于40ml二甲基亚砜中，得N,N-羰基-二咪唑溶液，备用；取8.5g聚乙烯亚胺溶于100ml二甲基亚砜中，得聚乙烯亚胺溶液，备用。

在氮气保护下，向9ml上述米糠多糖铁溶液中依次加入三乙胺和N,N-羰基-二咪唑溶液4ml，形成待反应溶液(待反应溶液pH为9.0)，在避光环境下搅拌反应5h，形成反应溶液；在1h内，将10ml聚乙烯亚胺溶液滴加到上述反应溶液中，同时向反应溶液中滴加三乙胺以控制pH为8.9，避光条件下搅拌反应23h，得粗样液；将粗样液置于截留分子量为3100的透析袋中透析40h，取透过液。向透过液中加入3倍透过液体积的无水乙醇，醇沉48h后，冷冻干燥得聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁。

实施例3

取1g米糠多糖铁溶于100ml二甲基亚砜中，得米糠多糖铁溶液，备用；取2.2gN,N-羰基-二咪唑溶于40ml二甲基亚砜中，得N,N-羰基-二咪唑溶液，备用；取8.8g聚乙烯亚胺溶于100ml二甲基亚砜中，得聚乙烯亚胺溶液，备用。

在氮气保护下，向10ml上述米糠多糖铁溶液中依次加入三乙胺和N,N-羰基-二咪唑溶液4ml，形成待反应溶液(待反应溶液pH为8.2)，在避光环境下搅拌反应3.5h，形成反应溶液；在1h内，将10ml聚乙烯亚胺溶液滴加到上述反应溶液中，同时向反应溶液中滴加三乙胺以控制pH为9.0，避光条件下搅拌反应24h，得粗样液；将粗样液置于截留分子量为3200的透析袋中透析48h，取透过液。向透过液中加入3倍透过液体积的无水乙醇，醇沉40h后，冷冻干燥得聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁。

实施例4

取1g米糠多糖铁溶于85ml二甲基亚砜中，得米糠多糖铁溶液，备用；取2gN,N-羰基-二咪唑溶于40ml二甲基亚砜中，得N,N-羰基-二咪唑溶液，备用；取7.5g聚乙烯亚胺溶于100ml二甲基亚砜中，得聚乙烯亚胺溶液，备用。

在氮气保护下，向8.5ml上述米糠多糖铁溶液中依次加入三乙胺和N,N-羰基-二咪唑溶液4ml，形成待反应溶液(待反应溶液pH为8.8)，在避光环境下搅拌反应4h，形成反应溶液；在1h内，将10ml聚乙烯亚胺溶液滴加到上述反应溶液中，同时向反应溶液中滴加三乙胺以控制pH为9.1，避光条件下搅拌反应25h，得粗样液；将粗样液置于截留分子量为3000的透析袋中透析52h，取透过液。向透过液中加入3倍透过液体积的无水乙醇，醇沉50h后，冷冻干燥得聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁。

实施例5

取1g米糠多糖铁溶于95ml二甲基亚砜中，得米糠多糖铁溶液，备用；取3gN,N-羰基-二咪唑溶于40ml二甲基亚砜中，得N,N-羰基-二咪唑溶液，备用；取9g聚乙烯亚胺溶于100ml二甲基亚砜中，得聚乙烯亚胺溶液，备用。

在氮气保护下，向9.5ml上述米糠多糖铁溶液中依次加入三乙胺和N,N-羰基-二咪唑溶液4ml，形成待反应溶液(待反应溶液pH为8.5)，在避光环境下搅拌反应4.5h，形成反应溶液；在1h内，将10ml聚乙烯亚胺溶液滴加到上述反应溶液中，同时向反应溶液中滴加三乙胺以控制pH为9.2，避光条件下搅拌反应26h，得粗样液；将粗样液置于截留分子量为3200的透析袋中透析60h，取透过液。向透过液中加入3倍透过液体积的无水乙醇，醇沉45h后，冷冻干燥得聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁。

实施例6

取米糠多糖1g和柠檬酸三钠0.6g溶于水中，得混合溶液，并用10％氢氧化钠溶液调节所述混合溶液的pH为8.5；向所述混合溶液中滴加2mol/L的三氯化铁溶液至产生的红棕色沉淀不再溶解时，停止滴加氢氧化钠溶液和三氯化铁溶液，得终点溶液，滴加期间，同时向所述混合溶液中滴加10％氢氧化钠以控制pH在8.5～9.0范围内；将所述终点溶液离心、醇沉、二次离心后，取沉淀物干燥得米糠多糖铁，备用。

取1g上述米糠多糖铁溶于80ml二甲基亚砜中，得米糠多糖铁溶液，备用；取2.5gN,N-羰基-二咪唑溶于40ml二甲基亚砜中，得N,N-羰基-二咪唑溶液，备用；取8g聚乙烯亚胺溶于100ml二甲基亚砜中，得聚乙烯亚胺溶液，备用。

在氮气保护下，向8ml上述米糠多糖铁溶液中依次加入三乙胺和N,N-羰基-二咪唑溶液4ml，形成待反应溶液(待反应溶液pH为8.0)，在避光环境下搅拌反应3h，形成反应溶液；在1h内，将10ml聚乙烯亚胺溶液滴加到上述反应溶液中，同时向反应溶液中滴加三乙胺以控制pH为8.8，避光条件下搅拌反应22h，得粗样液；将粗样液置于截留分子量为3000的透析袋中透析36h，取透过液。向透过液中加入3倍透过液体积的无水乙醇，醇沉36h后，冷冻干燥得聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁。

实施例7

取米糠多糖1g和柠檬酸三钠0.6g溶于水中，得混合溶液，并用10％氢氧化钠溶液调节所述混合溶液的pH为8.8；向所述混合溶液中滴加2mol/L的三氯化铁溶液至产生的红棕色沉淀不再溶解时，停止滴加氢氧化钠溶液和三氯化铁溶液，得终点溶液，滴加期间，同时向所述混合溶液中滴加10％氢氧化钠以控制pH在8.5～9.0范围内；将所述终点溶液离心、醇沉、二次离心后，取沉淀物干燥得米糠多糖铁，备用。

取1g米糠多糖铁溶于90ml二甲基亚砜中，得米糠多糖铁溶液，备用；取2.2gN,N-羰基-二咪唑溶于40ml二甲基亚砜中，得N,N-羰基-二咪唑溶液，备用；取8.5g聚乙烯亚胺溶于100ml二甲基亚砜中，得聚乙烯亚胺溶液，备用。

在氮气保护下，向9ml上述米糠多糖铁溶液中依次加入三乙胺和N,N-羰基-二咪唑溶液4ml，形成待反应溶液(待反应溶液pH为9.0)，在避光环境下搅拌反应5h，形成反应溶液；在1h内，将10ml聚乙烯亚胺溶液滴加到上述反应溶液中，同时向反应溶液中滴加三乙胺以控制pH为8.9，避光条件下搅拌反应23h，得粗样液；将粗样液置于截留分子量为3100的透析袋中透析40h，取透过液。向透过液中加入3倍透过液体积的无水乙醇，醇沉48h后，冷冻干燥得聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁，备用。

实施例8

取米糠多糖1g和柠檬酸三钠0.6g溶于水中，得混合溶液，并用10％氢氧化钠溶液调节所述混合溶液的pH为8.9；向所述混合溶液中滴加2mol/L的三氯化铁溶液至产生的红棕色沉淀不再溶解时，停止滴加氢氧化钠溶液和三氯化铁溶液，得终点溶液，滴加期间，同时向所述混合溶液中滴加10％氢氧化钠以控制pH在8.5～9.0范围内；将所述终点溶液离心、醇沉、二次离心后，取沉淀物干燥得米糠多糖铁，备用。

取1g米糠多糖铁溶于100ml二甲基亚砜中，得米糠多糖铁溶液，备用；取2.2gN,N-羰基-二咪唑溶于40ml二甲基亚砜中，得N,N-羰基-二咪唑溶液，备用；取8.8g聚乙烯亚胺溶于100ml二甲基亚砜中，得聚乙烯亚胺溶液，备用。

在氮气保护下，向10ml上述米糠多糖铁溶液中依次加入三乙胺和N,N-羰基-二咪唑溶液4ml，形成待反应溶液(待反应溶液pH为8.2)，在避光环境下搅拌反应3.5h，形成反应溶液；在1h内，将10ml聚乙烯亚胺溶液滴加到上述反应溶液中，同时向反应溶液中滴加三乙胺以控制pH为9.0，避光条件下搅拌反应24h，得粗样液；将粗样液置于截留分子量为3200的透析袋中透析48h，取透过液。向透过液中加入3倍透过液体积的无水乙醇，醇沉40h后，冷冻干燥得聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁。

实施例9

取米糠多糖1g和柠檬酸三钠0.6g溶于水中，得混合溶液，并用10％氢氧化钠溶液调节所述混合溶液的pH为9.0；向所述混合溶液中滴加2mol/L的三氯化铁溶液至产生的红棕色沉淀不再溶解时，停止滴加氢氧化钠溶液和三氯化铁溶液，得终点溶液，滴加期间，同时向所述混合溶液中滴加10％氢氧化钠以控制pH在8.5～9.0范围内；将所述终点溶液离心、醇沉、二次离心后，取沉淀物干燥得米糠多糖铁，备用。

取1g米糠多糖铁溶于85ml二甲基亚砜中，得米糠多糖铁溶液，备用；取2gN,N-羰基-二咪唑溶于40ml二甲基亚砜中，得N,N-羰基-二咪唑溶液，备用；取7.5g聚乙烯亚胺溶于100ml二甲基亚砜中，得聚乙烯亚胺溶液，备用。

在氮气保护下，向8.5ml上述米糠多糖铁溶液中依次加入三乙胺和N,N-羰基-二咪唑溶液4ml，形成待反应溶液(待反应溶液pH为8.8)，在避光环境下搅拌反应4h，形成反应溶液；在1h内，将10ml聚乙烯亚胺溶液滴加到上述反应溶液中，同时向反应溶液中滴加三乙胺以控制pH为9.1，避光条件下搅拌反应25h，得粗样液；将粗样液置于截留分子量为3000的透析袋中透析52h，取透过液。向透过液中加入3倍透过液体积的无水乙醇，醇沉50h后，冷冻干燥得聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁。

实施例10

取米糠多糖1g和柠檬酸三钠0.6g溶于水中，得混合溶液，并用10％氢氧化钠溶液调节所述混合溶液的pH为8.7；向所述混合溶液中滴加2mol/L的三氯化铁溶液至产生的红棕色沉淀不再溶解时，停止滴加氢氧化钠溶液和三氯化铁溶液，得终点溶液，滴加期间，同时向所述混合溶液中滴加10％氢氧化钠以控制pH在8.5～9.0范围内；将所述终点溶液离心、醇沉、二次离心后，取沉淀物干燥得米糠多糖铁，备用。

取1g米糠多糖铁溶于95ml二甲基亚砜中，得米糠多糖铁溶液，备用；取3gN,N-羰基-二咪唑溶于40ml二甲基亚砜中，得N,N-羰基-二咪唑溶液，备用；取9g聚乙烯亚胺溶于100ml二甲基亚砜中，得聚乙烯亚胺溶液，备用。

在氮气保护下，向9.5ml上述米糠多糖铁溶液中依次加入三乙胺和N,N-羰基-二咪唑溶液4ml，形成待反应溶液(待反应溶液pH为8.5)，在避光环境下搅拌反应4.5h，形成反应溶液；在1h内，将10ml聚乙烯亚胺溶液滴加到上述反应溶液中，同时向反应溶液中滴加三乙胺以控制pH为9.2，避光条件下搅拌反应26h，得粗样液；将粗样液置于截留分子量为3200的透析袋中透析60h，取透过液。向透过液中加入3倍透过液体积的无水乙醇，醇沉45h后，冷冻干燥得聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁。

对实施例1～10制得的聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁进行检测，检测项目包括：DNA凝聚效果检测；转染效率检测；以及，细胞毒性检测。具体检测过程及结果如下：

(一)DNA凝聚效果检测

取实施例1～10制得的聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁各0.05g，溶于10mL水中，作为样品溶液。

将样品溶液和质粒DNA按不同的质量比混合(样品溶液与质粒DNA的质量比分别为0.5:1、1:1、1.5:1、2:1、2.5:1和3:1)，混合反应30min，反应结束后加入溴酚蓝溶液2ul，形成点样溶液。以未加入样品溶液的质粒DNA为空白对照。取点样溶液以及空白对照进行琼脂糖凝胶电泳，其中凝胶为1％琼脂糖凝胶，电泳仪的电压为90V，电流为80mA。电泳完成后在凝胶成像仪中观察并拍照，其凝胶电泳图如图2所示，图中，标记为0的加样孔对应空白对照，标记为1、2、3、4、5、6依次对应样品溶液与质粒DNA的质量比分别为0.5:1、1:1、1.5:1、2:1、2.5:1和3:1的点样溶液。

从图2可以看出，每张对应实施例的凝胶图中，0号加样孔形成了迁移条带，而加样孔1～6从左至右，迁移条带越来越短，即随着点样溶液中样品溶液的浓度增大，凝胶孔中滞留效果越明显，说明随着聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁的浓度增加，聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁DNA结合从而导致DNA滞留在凝胶孔中，也就是说，各实施例制备的聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁均与DNA凝聚。

(二)转染效率检测

将实施例1～10中制备的聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁与增强绿色荧光蛋白(EGFP)混合，制成样品溶液，同时以商用脂质体做对照。按下述方法检测：293T细胞分别播种到12孔板，每孔2.5×10 ⁵/ml的细胞。四周孔每孔加入0.5ml的Hanks液。细胞在37℃培养24h后，先用Hanks液清洗细胞，然后在每孔加入样品溶液，并用无血清的DMEM(一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基)定容到0.5ml。待细胞在培养箱中培养4h后，吸除无血清的DMEM，换成含有10％的血清的DMEM，每孔加入0.5ml，再将细胞在培养箱中培养24h后，用荧光显微镜观察，如图5至图15所示(图中的亮白色斑点状部分即为观测到的绿色荧光表达)。

从图5至图15中可以看出，各实施例对应的照片中，绿色荧光蛋白均可以在细胞内实现表达，且达到了脂质体对照转染效果的50％，说明本发明各实施例制备的聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁具有较好的转染效果。

(三)细胞毒性检测

采用噻唑蓝(MTT)法测定同一浓度下实施例1～10中制备的聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁对Hela细胞存活率的影响。Hela细胞在96孔板中的铺板密度为1x10⁴/孔，置于37℃、5％CO₂条件下培养24h，待细胞生长达到70-80％汇合度时，分别向各孔中加入浓度为0.05mg/mL的聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁溶液，相同条件下刺激细胞24h后，加入100μL5mg/mL的MTT溶液，相同条件下继续放置4h后，吸去细胞培养液，各孔中加入100μL二甲基亚砜溶解细胞生成的晶体，用酶标仪测定570nm处的吸光度值A1。以未加样品孔的细胞存活率为100％，吸光度值为A0。细胞存活率按公式1计算，结果如表1所示。

公式1：细胞存活率(％)＝A1/A0×100

表1实施例1-10中制得的荧光标记米糠多糖铁的细胞毒性

	Hela细胞存活率(％)
		实施例1	95.6
实施例2	97.7
		实施例3	96.2
实施例4	96.8
		实施例5	98.0
实施例6	97.8
		实施例7	95.2
实施例8	96.3
		实施例9	97.5
实施例10	97.8

由表1可以看出，各实施例制备的聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁浓度为5ug/mL时，Hela细胞的细胞存活率均为95％以上，说明通过此方法制备的聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁的细胞毒性很低，非常利于聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁运载基因进入细胞。

以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (9)

1.一种聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

在惰性气氛下，向米糠多糖铁溶液中依次加入三乙胺和N,N-羰基-二咪唑溶液，避光反应形成反应溶液；

将聚乙烯亚胺溶液加入到所述反应溶液中避光反应形成粗样液，并在反应过程中控制混合溶液呈碱性；

对所述粗样液进行透析，取透过液醇沉、冷冻干燥后得聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁。

2.如权利要求1所述的聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁的制备方法，其特征在于，米糠多糖铁、N,N-羰基-二咪唑和聚乙烯亚胺的质量比为1：(2.0～3.0):(7.5～9.0)。

3.如权利要求1所述的聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁的制备方法，其特征在于，所述在惰性气氛下，向米糠多糖铁溶液中依次加入三乙胺和N,N-羰基-二咪唑溶液，避光反应形成反应溶液的步骤中，

向米糠多糖铁溶液中加入三乙胺后米糠多糖铁溶液的pH为8～9；和/或，

所述避光反应时间为3～5h。

4.如权利要求1所述的聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁的制备方法，其特征在于，所述将聚乙烯亚胺溶液加入到所述反应溶液中避光反应形成粗样液，并在反应过程中控制混合溶液呈碱性的步骤包括：

将聚乙烯亚胺溶液滴加到所述反应溶液中，同时向所述反应溶液中滴加三乙胺并控制pH为8.8～9.2，避光条件下搅拌反应，得粗样液；

所述将聚乙烯亚胺溶液滴加到所述反应溶液中的时间不超过1h；和/或，

所述搅拌反应的时间为22～26h。

5.如权利要求1所述的聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁的制备方法，其特征在于，所述对所述粗样液进行透析，取透过液醇沉、冷冻干燥后得聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁的步骤中，

所述透析时，使用的透析袋的截留分子量为3000～3200；

所述透析的时间为36～60h；和/或，

所述醇沉的时间为36～50h。

6.如权利要求1所述的聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁的制备方法，其特征在于，所述在惰性气氛下，向米糠多糖铁溶液中依次加入三乙胺和N,N-羰基-二咪唑溶液，避光反应形成反应溶液的步骤之前，还包括：

将米糠多糖铁溶于有机溶剂中，得米糠多糖铁溶液；

将N,N-羰基-二咪唑溶于所述有机溶剂中，得N,N-羰基-二咪唑溶液；

将聚乙烯亚胺溶于所述有机溶剂中，得聚乙烯亚胺溶液。

7.如权利要求6所述的聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为二甲基亚砜。

8.如权利要求6所述的聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁的制备方法，其特征在于，所述将米糠多糖铁溶于有机溶剂中，得米糠多糖铁溶液的步骤之前还包括：

将米糠多糖和柠檬酸三钠溶于水中，得混合溶液，并调节所述混合溶液的pH为8.5～9.0；

向所述混合溶液中滴加铁盐溶液至沉淀不再溶解后形成终点溶液，并在滴加过程中控制混合溶液pH在8.5～9.0范围内；

将所述终点溶液离心、醇沉、二次离心后，取沉淀物干燥得米糠多糖铁。

9.一种基因载体，其特征在于，包括根据权利要求1～8任一项所述的聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁的制备方法制备的聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁。

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