SU618048A3 - Способ иммобилизации оксидоредуктазных ферментов - Google Patents

Claims (2)

1. ци .приводит к сохранению активности оксидоредуктаз в иммобилизованном состо нии . Полученные препараты не требуют - добавлени в реакционную среду НАД при циклических процедурах получени  продуктов ферментативных реакций, катализируемых оксидоредуктазами, что резко улучшает технологические свойства полученных препаратов. Кроме того, поскольку в волокна включают одновременно два оксидоредуктазных апофёрмента, при получении продуктов ферментативного превращени  происходит рециклизаци  иммобилизованного НАД за счет сопр женной реакции, катализируемой вторым оксидоредуктазным ферментом, РециклизациюНАД можно про- водить не только энзиматическим путем, за счет включени  в волокно второй окси- доредуктазы, но и химическим путем, ког да в волокно включена только одна оксидоредуктаза , а возвращение НАД в цикл осуществ етс  с использованием химического соединени . Система рециклизадии выбираетс  в зависимости от продукта, который желательно получить. Согласно изобретению описываетс  способ иммобилизации оксидоредуктазных ферментов , зависимых от НАД, с сохранением ферментами биологической активности и с улучщенными технологическими свойствами путем одновременного включени  в волокна лолимера на основе триацетил- целлюлозы иммобилизованного на водораст воримом поликатионите НАД и апоферментов оксидоредуктаз. Предпочтительно процесс провод т следующим образом. Готов т водный раствор, содержащий ферменты, подлежащие включению в волок- на и иммобилизованный на поликатионите (полиэтиленимине или полилизине) НАД. Далее раствор ют триацетилцеллюлозу в хлористом метилене в соотношении 1:14, и к этому раствору добавл ют вышеуказанную смесь в соотношении водный раствор - органическа  фаза, равном 1:7. Эмульгирование двух фаз интенсифицируют энергичным перемешиванием при О С в течение ЗО мин. Эмульсию выливают в открытую емкость выдерживаемую при ОС и ведут пр дение в атмосфере азота. Нити коагулируют в толуале при О С и собирают на каркасе катушки. Дл  удалени  органических растворителей производ т сушку волокон на воздухе. Полученные препараты используют многократно дл  получени  продуктов ферментативных реакций, катализируемых оксидоредуктазами. Пример-1.В смеси буфера и глицерина (75:25) раствор ют полиэтиленимин-НАД /РЕЗ-НАД/ (37,5 мг/мл, 0,63 мкмоль НАД в мл), лактатдегидрогеназу (препарат из мыщц кроликов фир- мы БоеНит е1, Mant he{fw,C mbHB концент рации 17,5 мг/мп и апаниндегидрогеназу (препарат из B.5ubt-i2is фирмыBoeltHU ек ,IVla«t11ie m,QmbH) в концентрации 3,75 мг/мл. 10 г триацетипцеппюлозы (E2ul a AQ. SUchS ) раствор ют при перемешивании в реакторе в 133 г хлористого ме- типена, к раствору попимера прибавл ют 20 г раствора энзима и эмульгирование двух фаз интенсифицируют энергичным перемешиванием при ОС в течение ЗОмин. Эмульсию выпивают в небольшой ппа- ви.тьный тигепь, выдерживаемый при темпера уре О С и пр дение ведут в атмосфере азота. Нити коагулируют в толуоле при О С и собирают на каркасе катушки. Дл  удалени  органических растворителей производитс  сушка на воздухе, 2 г свежеполученного волокна, что соответствует примерно 1 г сухого полимера, промывают бикарбонатным буферным раствором с рН 8,0 дл  удалени  непрочно св занных ферментов и РЕ О - НАД, а затем волокно помещают в 10 мл 3%-но- го водного раствора L, - лактама аммони , рН 7,4. Производ т перемешивание при комнатной температуре в течение 10 ч. Далее с помощью анализатора аминокислот определ ют количество образовавще- гос  Ц-аланина. Оно составл ет 0,163 г (96% от теории). То же волокно повторно ввод т в контакт со свежим раствором лактата аммони . После 7 циклов использовани  процентное содержание Ц - аланина составл ет 94% после 10 ч инкубации. После 33 цикла оно составл ет соответственно 90%. Ц - Аланин выдел ют осаждением этанолом при рН 6,2;|об} +14,6 (,0,5 н. HCt}.° Пример 2. 2г волокна, полученного как в примере 1, промьтают 0,05 М фосфатным буфером, рН 8 и помешают в 10 мл водного раствора еде дующего состава: 0,05 М фосфатный буфер, рН 8;5%-ный (вес/объем) D ,L -лак. тат аммони . Через 10 ч содержание апанина составл ет 98% от теоретичес56 кого. То же волокно повторно помещают в 10 МП анапогичного раствора и раствор замен ют через каждые 7 ч. Через ЗО дней непрерывной работы содержание аланина после 10-часового цикла составл ет 95% от теоретического. Примерз. Вопокно готов т, как это описано в примере 1, но с заменой PED -НАД на попилизин-НАД. Реакцию ведут аналогично примерам 1 и 2. В пер вом цикпе через 10 ч содержание аланин составл ет 92% от теоретического. Чере 30 дней использовани  достигаетс  87% степень превращени . Пример 4. Ферментсодержащий раствор готов т растворением компонент в смеси буфер глицерин (75:25)j РЕЗ -НАД 25,5 мг/мл (3,78 мкмоль НАД/МЛ); дегидрогеназа 3- об -2-й -оксистероида (фермент избг ерЬот сее wge rtatts фирмаБоеЬН «gev, Ма trn heiw, IТ H-j-v (- /. . .. f l f C ( vnbHj/ Г2,5мг/мл (22-5ед/мл,25°С, этан в качестве субстрата); альдегиддегидрогеназа (фермент из дрожжей, фирма51 гк Sl,l,OHiB) 30 мг/мл (90 ед./мл, ацетальдегид в качестве субстрата), Волокно готов т как в примере 1. 2 г волокна, соответствующие сухого полимера, промьшают при 25С в 10 мм буферного раствора триэтаноламина (0,1 М, рН 7,3), содержащего, 0,3 М КС 2 . 5 млмоль у& -меркаптоэтанол и 1% этаноп. При этой операции под действием дегидрогеназы спирта и дегидрогеназы альдегида PEtJ -НАД превращаетс  в свою восстановленную форму. Далее врлокно помещают в свежий буферный раствор (10 мл) того же соста ва, содержащий дополнительно 2 мг. кортизона (А 4-прегнен-17-(Хг-21-диол-3 ,11,20-трион). Раствор перемещивают при 25 С в течение 1 ч. Затем отдел ю волокно и раствор экстрагируют 3 порци ми хлороформа по 2 мл, органический экстракт концентрируют в вакууме до объема 1 мл и определ ют кортизон и Д 4-прегнен-17- сс;-20- Л -21-триол-3 ,11-дион. Степень превращени  составл ет 95% Тот же образец волокна использован в 20 циклах превращени  с незначительным снижением активности. П р и М е р 5. Ферментосодержащий раствор готов т растворением компонентов в смеси буфер - глицерин (75:25); РЕЗ-НАД 25,5 мг/мл (3,78 мкмоль НАД/МЛ); дегидрогеназар- оксистероида 8 ( фермент из Pseudomenas testoaienoni фирма 5л та,61,Ьоп15 сорт Л), 40 мг/мл; диафораза (фермент из сердца рвиньи, фирма Boehpinger Mannheim маркаII ) 19,4 мг/мп (содержит 6,45 мг/мл энзиматического белка). Волокно готов т как в примере 1. 2 г волокна промывают буферным раствсх.ром триэтаноламина(0,067 М рН 7,6) и помещают в 10 мл того же буфера, содержащего 288 мг тестостерона (17-/5-окси-д4-андростен-3-он ) и .2,9 мг 2,6-дихлорфенопиндофенола. Раствор перемещивают при 25 С при пропускании через него кислорода дл  окислени  восстановленного красител . Через 4 ч смесь экстрагируют трем  порци ми этилацетата по 3 мл, органический экстракт сущат безводным сульфатом натри , фильтруют и упаривают досуха. Твердый остаток раствор ют в 0,5 мл метанола и определ ют количество продукта Д 4-андростен-3,17-диона. Оно составл ет 9О%, из расчета на исходный тестостерон. П р и М е р 6. Используетс  то же волокно, что и в примере 5. 1 г волокна , соответствующий 0,5 г сухого полимера промывают буферным раствором гидрохлорида триэтанопамина, 0,06 М, рН7,6. Приготовлены п ть растворов, содержащих буферный раствор гидрохлорида триэтаноламина, 0,06 М, рН 7,6, 2,6- -дихлорфенопиндофеноп, 80 мкмопь и тестостерон (17/3 -окси- Д 4-андростен-3-он ); 10 мкм ОЛЬ, 20мкмоль, 30 мкмоль, 40мкмольи 50мкмоль. 1 гпромытого волокна помещают в 5 мл каждого раствора и смеси перемешивают при 25 С, измер   оптическую плотность при длине волны 600 нм. Построена калибровочна  пр ма , на которой откладьгаают разности оптической плотности. То же волокно повторно использовано дл  определени  тестостерона в растворе, который содержал его в концентрации 30 мкмоль. Во врем  ста отсчетов отклонений от калибровочной кривой не обнаружено. Формула изобретени  1. Способ иммобилизации оксидоредуктазных ферментов, зависимых от никотинамидадениндинуклеотида (НАД) путем включени  их в волокна полимера на основе триаце«тилцеллюлозы , отличающийс 

   76180488

   тем, что, с целью сохранени  активностипопикатионитами  вп ютс  попиэтиленимин

   иммобилизованных оксидоредуктаз, осу-и- попипизин.

   ществп ют одновременное включение вИсточники информации, прин тые во

   вопокна иммобилизованного на водораст-внимание при экспертизе:

   воримом попикатионите НАД и апофермен- 51.3 iinioblEi2,ed El1z flЦeз,0,T.2:olЪorlSK(,

   тов оксидоредуктаз.CTRC Pfess , i9T4.
2. 2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю-2. Патент ССОР №364173, кл.

   щ и и с   тем, что водорастворимыми покл,. 3D 01 о 1/10, 26.06,68.