DE2631045C3 - Verfahren zur Verbesserung der Aktivität von Coenzym-abhängigen Oxidoreduktasen - Google Patents

Verfahren zur Verbesserung der Aktivität von Coenzym-abhängigen Oxidoreduktasen

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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verbesserung der Aktivität von coenzymabhängigen Oxidoreduktaseenzymen, die in faserige Strukturen eingebettet sind.
Es ist bekannt, daß Enzyme nach verschiedenen Verfahren auf wasserunlöslichen Trägern immobilisiert und dann als heterogene Katalysatoren angewandt werden können, die leicht von dem Reaktionsgemisch abgetrennt und erneut angewandt werden können.
Im Falle von Enzymen oder enzymatischen Komplexen, die ein Coenzym vom NAD+-Typ erfordern, war es notwendig, dieses Coenzym zu dem Reaktionsgemisch zuzusetzen. Aufgrund des niederen Molekulargewichts des Coenzyms ist es natürlich schwierig, dieses zusammen mit dem Enzym auf dem gleichen Träger zu immobilisieren, um die kontinuierliche Zugabe dieses Coenzyms zu dem Reaktionsgemisch unnötig zu machen.
Außerdem ist eine kovalente Bindung des Coenzyms an -Jen Träger selbst, an den das Enzym gebunden ist, ungünstig aufgrund der sterischen Hinderung, die die Wechselwirkung zwischen dem Enzym und dem Coenzym verhindert oder stark begrenzt, die für die Aktivität erforderlich ist.
Soweit solche Coenzyme verhältnismäßig teuer sind, stellt die Tatsache, daß man sie kontinuierlich zu einem Reaktionsgemisch zusetzen muß, eine starke Begrenzung für die Anwendung von coenzymabhängigen Oxidoreduktasesystemen in Faserform dar.
Es ist ferner bekannt, daß NAD+ an der 6-Aminopuringruppe reaktionsfähig gemacht (funktionalisiert) werden kann und das reaktionsfähige NAD+ an wasserlösliche hochmolekulare Polymere gebunden werden kann, wie in der DT-OS 25 19 063 und der DT-OS 25 35 825 angegeben.
Es hat sich nun gezeigt, daß derartige Polymere, die Coenzymaktivität besitzen, in wasserunlöslichen polymeren faserigen Strukturen zusammen mit einem Enzym eingeschlossen werden können. Der gleichzeitige Einschluß von Enzymen und Coenzynien führt zu einer Stabilisierung der Oxidoreduktase, die, wenn kein Coenzym vorhanden ist, zu Assoziations- und Dissoziationsgleichgewichten der Untereinheiten führt, wodurch ein Aktivitätsverlust auftritt.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt es, ein polyenzymatisches biologisches Reagens herzustellen, bei dem das polymere wasserlösliche Derivat von NAD+ kontinuierlich durch den Gebrauch von zwei Oxidoreduktasen von der oxidierten Form in die reduzierte Form und zurück umgewandelt wird. Das NADf-Derivat kann nicht nur auf diese enzymatische Weise mit Hilfe von zwei Oxidoreduktasen zurückgebildet werdi:n, sondern auch auf eine kombinierte chemische und enzymatische Weise, indem man eine Oxidoreduktase und eine entsprechende chemische Verbindung anwendet. Das Umwandlungssystem wird so ausgewählt, daß es mit dem Produkt, das man erhalten möchte, in Übereinstimmung steht (vgl, die Beispiele).
Die Art, auf die das Enzymi und Coenzym eingeschlossen werden können, ist in der IT-PS 8 36 462 beschrieben. Dort sind auch nähere Einzelheiten des Verfahrens angegeben.
ίο Die Anwendung makromolekularer Coenzyme, die zusammen mit Enzymen in polymere Matrizes eingebettet sind, ermöglicht zahlreiche verschiedene Verfahren: Präparativ die Synthese von Steroiden bzw. eine Umwandlung von Steroidkernen an vorbestimmten
•5 Stellungen. Außerdem können stereoKpezifische Synthesen von Aminosäuren ausgehend von Hydroxysäuren oder Ketosäuren durchgeführt werden. Auf analytischem Gebiet ist es möglich, Enzyfr-Coenzym-Systeme einzuschließen, bei denen die letzte Reaktion
M der Oxidation des reduzierten Coenzyms oder der Reduktion des oxidierten Coenzyms mit Hilfe einer chemischen Substanz durchgeführt wird, deren Absorptionsspektrum davon abhängig ist, ob sie in reduzierter oder oxidierter Form vorliegt. Die Farbe einer solchen Substanz kann leicht gemessen werden und in Beziehung gesetzt werden zu der Menge der gesuchten Substanz.
Die Erfindung wird durch die folgenden, nicht einschränkenden Beispiele näher erläutert
Beispiel 1
Für den Einschluß steht eine Lösung in Puffer und Glycerin (75:25) von Polyäthylenimin-NAD+ (PEI-NAD+), Milchsäuredehydrogenase (LDH) (von Kaninchen) und Alanindehydrogenase (Ala DH) (von B. Subtilis) mit den folgenden Charakteristika zur Verfügung:
PEI NAD+ 37,5 mg/ml (= 0,63 μΜοΙ NAD+AnI) LDH 17,5 mg/ml (701. E, NAD+ als Substrat)
Ala DH 3,75 mg/ml
10 g Cellulosetriacetat werden unter Rühren in einem Reaktor in 133 g Methylenchlorid gelöst. Dann werden 20 g Enzymlösung zu der Polymerlösung zugegeben und
*5 die Emulgierung der beiden Phasen durch heftiges Rühren bei O0C innerhalb von 30 Minuten erreicht.
Die Emulsion wird in einen kleinen Schmelztiegel gegeben, bei O0C gehalten und unter Stickstoffdruck zu Fäden gesponnen. Die Fäden werden in Toluol bei 00C koaguliert und auf einem Spulenrahmen aufgenommen.
Es wird an der Luft getrocknet, um organische
Lösungsmittel zu entfernen. 2 g der so erhaltenen Fasern, entsprechend ungefähr 1 g trockenem Polymer, werden mit Bicarbonatpuffer pH 8,0 gewaschen, um die Enzyme und PEI-NAD+, die an der Oberfläche adsorbiert sind, zu entfernen, und anschließend werden die Fäden in 10 ml einer wäßrigen Lösung der folgenden Zusammensetzung gegeben: 3% Ammonium-L-Iactat (GewVVol.) pH 7,4.
Es wird bei Raumtemperatur (ungefähr 220C) gerührt. Nach IO Stunden wird mit Hilfe eines automatischen Aminosäureanalysators die Menge des entstandenen L-Alanins gemessen. Sie beträgt 0,163 g (96% der Theorie).
Nachdem das Gemisch entfernt worden ist, werden die gleichen Fäden mit einer frischen Lösung von Ammoniumlactat zusammengebracht, um erneut die Reaktion durchzuführen. Nach 7 Tage langer Anwen-
dung beträgt der Prozentsatz an L-Alanin innerhalb von JO Stunden 94% und nach 30 Tagen wieder innerhalb von 10 Stunden 90%%Das L-Alunin wird abgetrennt durch Ausfällung mit Äthanol bei einem pH-Wert von 6,Z[>]'0 5= +14,6° (c = 2,0;5n-HC|).
Beispiel 2
Es wird entsprechend Beispiel 1 ein Faden hergestellt, wobei anstelle von PEI-NAD+ Formyl-PEl-NAD+ verwendet wird. I ο
2 g des so erhaltenen Fadens, entsprechend etwa 1 g trockenem Polymer, werden mit 0,05 m Phosphatpuffer pH 8,0 gewaschen und in 10 ml einer wäßrigen Lösung der folgenden Zusammensetzung gegeben: 0,05 m Phosphatpuffer pH 8, enthaltend 5% (Gew/Vol.) Ammonium-DL-Iactat. Nach 10 Stunden sind 98% der Theorie Alanin entstanden. Der gleiche Faden wird wieder in 10 ml der Lösung gegeben und die Lösung alle 11 Stunden ausgewechselt Nach 30 Tagen kontinuierlichem Arbeiten bc'.rägt der Prozentsatz an Alanin, der innerhalb von lOSiunden gebildet wird. 95%.
Beispiel 3
Es wird ein Faden entsprechend den Beispielen 1 und 2 hergestellt unter Verwendung von Polylysin-NAD+. Wenn entsprechend den Beispielen 1 und 2 gearbeitet wird, werden innerhalb von 10 Stunden 92% der Theorie Alanin erhalten. Nach 30 Tagen ergibt die Anwendung des gleichen Fadens eine 87%ige Umwandlung.
Beispiel 4
Es steht eine Puffer-Glyoerin-(7J : 25-)Lösung zur Verfügung, die entsprechend üern erfindungsgemäßen Verfahren eingeschlossen werden kam.,enthaltend:
Polyäthylenimin-NAD+: 25,5 mg/ml (3,78 μΜοΙ NAD+/ml). 3-Λ, 20-j?-Hydroxysteroid-dehydrogenase (von Streptomyces hydrogenans): 12,5 mg/ml (225 Einheiten/ml; 25°C, Cortison als Substrat), Alkoholdehydrogenase (ADH) (aus Pferdeleber): 30 mg/ml (81 Einheiten/ml; 25°C; Äthanol als Substrat), Aldehyd-dehydrogenase (aus Hefe): 30 mg/ml (90 Einheiten/ml; 25°C; Acetaldehyd als Substrat).
Es wird ein Faden entsprechend Beispiel 1 hergestellt. 2 g des Fadens (der Fasern), entsprechend ungefähr 1 g trockenem Polymer, werden bei 25°C mit 10 ml einer Lösung in Triäthanolaminhydrochloridpuffer (0,1 m, pH 73) gerührt, enthaltend 0,3 m KCI, 5 m Mol 0-Mercaptoäthanol und 1% Äthanol, um die Substanzen zu entfernen, die an der Oberfläche adsorbiert sind um ein Stabilisierungsmedium für die eingeschlossene Aktivität zu erhalten.
Nach vollständigem Waschen liegt aufgrund der Wirkung der Alkoholdehydrogenase und Aldehyddehydrogenase das PEI-NAD+ in reduzierter Form vor.
Die Waschflüssigkeit wird abfiltriert, und es werden 10 ml der gleichen Pufferlösung zugegeben, enthaltend 28 mg Cortison (zl«-Pregnen-17-«, 21-diol-3,l1,20-trion).
Die Lösung wird 1 Stunde unter Rühren bei 25° C gehalten und das Gemisch anschließend entnommen. Die Lösung wird dreimal mit je 2 ml Chloroform extrahiert. Der organische Auszug wird im Vakuum auf ein Volumen von 1 ml eingeengt. Die Menge des Produktes (4<-Pregnen-17-a, 20-0, 21-triol-3,11-dion und Cortison werden gaschromatographisch bestimmt Man berechnet eine Ausbeute von 95%.
Der gleiche Faden wird 20mal zur Umwandlung von Cortison mit einem vernachlässigbar geringen Aktivitätsverlust angewandt.
Beispiel 5
Für den Einschluß steht eine Lösung in Puffer und Glycerin (75 :25) zur Verfügung, enthaltend:
Polyäthylenimin-NAD+: 25,5 mg/ml (3,78 μΜοΙ NAD+AnI) /J-Hydroxysteroiddehydrogenase (aus »Pseudomonas testosteron!«): 40 mg/ml, Diaphorase (aus Schweineherz II): 19,4 mg/ml des Handelsprodukts (enthaltend 6,45 mg/ml Enzymprotein).
Es wird entsprechend Beispiel 1 ein Faden hergestellt
2 g des Fadens, entsprechend ungefähr I g trockenem Polymer, werden mit 0,067 m Triäthanolaminhydrochloridpuffer pH 7,6 gewaschen, um Substanzen zu entfernen, die an der Oberfläche adsorbiert sind, und in 10 ml einer wäßrigen Lösung gegeben, enthaltend 0,067 m Triäthanolaminhydrochloridpuffer pH 7,6, 288 μg Testosteron (l"--0-Hydroxy--d4-andr<>sten-3-on), 2,9 mg 2,6-Dichlor-phenolindophenoI. Die Lösung wird bei 25°C gerührt und Sauerstoff durchgeleitet, um den reduzierten Farbstoff wieder zu oxidieren. Nach 4 Stunden wird das Gemisch dreimal mit je 3 ml Äthylacetat extrahiert. Der organische Auszug wird mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und zur Trockne eingedampft. Der feste Rückstand wird in 0,5 ml Methanol gelöst Die Menge des entstandenen Produktes (44-Androsten-3,17-dion) beträgt 90%, ausgehend von Testosteron.
Beispiel 6
Der gleiche Faden wie in Beispiel 5 wird angewandt. 1 g des Fadens, entsprechend ungefähr 0,5 g trockenem Polymer, wird mit 0,06 m Triäthanolaminhydrochloridpuffer pH 7,6 gewaschen, um Substanzen zu entfernen, die an der Oberfläche adsorbiert sind.
Es werden 5 Lösungen hergestellt, enthaltend 0,06 m Triäthanolaminhydrochloridpuffer (pH 7,6), 80 μΜοΙ 2,6-Dichlorphenolindophenol und Testosteron (17-/?- Hydroxy-id4-androsten-3-on) ΙΟμΜοΙ, 20 μΜοΙ, 30 μΜοΙ,40 μΜοΙ bzw. 50 μΜοΙ.
Die gewaschenen Fäden werden jeweils in 5 ml jeder Lösung gegeben und das Gemisch bei 25"C gerührt und die Absorption bei 600 nm (mm) gemessen. Es wird eine Eichgerade aufgestellt aus den Unterschieden der optischen Dichte und den Konzentrationen an Testosteron. Der gleiche Faden wird zur Messung von Testosteron in einer Lösung angewandt, enthaltend 30μΜοΙ. Bei 100 Ablesungen wurde keine Abweichung von der Eichgeraden festgestellt.

Claims (1)

  1. Patentanspruch:
    Verfahren zur Verbesserung der Aktivität von coenzymabhängigen Oxidoreduktasen, dadurch gekennzeichnet, daß man in eine faserige Struktur die Enzyme und entsprechendes Coenzym, das vorher funktionsfähig gemacht und an wasserlösliche hochmolekulare Polymere gebunden worden ist, einbaut
DE2631045A 1975-07-10 1976-07-09 Verfahren zur Verbesserung der Aktivität von Coenzym-abhängigen Oxidoreduktasen Expired DE2631045C3 (de)

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