DD236534A1

DD236534A1 - Verfahren zur herstellung von 13-o-glucosylierten gibberellinen

Info

Publication number: DD236534A1
Application number: DD27546085A
Authority: DD
Inventors: Gernot Schneider
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1985-04-23
Filing date: 1985-04-23
Publication date: 1986-06-11

Abstract

Ziel der Erfindung ist es, 13-0-glucosylierte Gibberelline herzustellen, die sich durch veraenderte physiologische Wirkung und modifizierte Transporteigenschaften auszeichnen und deshalb sowohl fuer die Entwicklung praktisch anwendbarer Wachstums- und Entwicklungsregulatoren als auch fuer die Erforschung der Biochemie und Physiologie der Gibberelline und ihrer Konjugate von Interesse sind. Erfindungsgemaess wird ein Gibberellin oder Gibberellinderivat, das eine 13-Hydroxygruppe, aber keine 1(2)-Doppelbindung besitzt, in einem Loesungsmittel oder einem Loesungsmittelgemisch geloest, an Pflanzen bzw. Pflanzenteile oder an Keimlinge bzw. Teile der Keimlinge von Mais (Zea mays L.) appliziert und nach einer Inkubationszeit von mindestens 12 Stunden das gebildete Gibberellin-13-0-glucosid isoliert. Die erfindungsgemaesse 13-0-Glucosylierung ermoeglicht die Herstellung von 13-0-glucosylierten Gibberellinen in praeparativem Massstab.

Description

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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 13-0-glucosylierten Gibberellinen. Darunter sind Gibberellinderivate zu verstehen, die in Position C-13 das ent-Gibberellan-Grundgerüst eine O-Glucosylgruppe besitzen. Dabei kann das ent-Gibberellan-Grundgerüst intakt oder leicht verändert (z. B. seco-, oder nor-ent-Gibberellan) und gegebenenfalls in verschiedener Weise substituiert sein, soll aber keine 1 (2)-Doppelbindung aufweisen.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die erfindungsgemäß hergestellten Verbindungen besitzen als wachstumsregulatorisch wirksame Substanzen mit veränderten Transport- und Wirkeigenschaften besondere Bedeutung. Das gilt sowohl für die Grundlagenforschung der Gibberelline und ihrer Konjugation als auch für die praktische Beeinflussung der natürlichen Steuerung von Wachstums- und Entwicklungsprozessen durch Gibberelline in pflanzlichen.Systemen.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Gibberelline besitzen als endogene Pflanzenhormone aufgrund ihres breiten Wirkungsspektrums große biologische Bedeutung.

Es ist bekannt, daß Strukturmodifizierungen von Gibberellinen, z. B. Glucosylierungen, zur Veränderung ihres Transportverhaltens, des Metabolismus und der physiologischen Wirkung führen. Beispielsweise können Gibberellin-0-glucoside als reversibel entaktivierte Gibberelline angesehen werden.

Weiterhin ist bekannt, daß Gibberellin-O-glucoside als Metabolite endogen in Pflanzen vorkommen (G. Schneider in „The Biochemistry and Physiology of Gibberellins" I, (A.Crozier Hrsg.) 389, Praeger Publishers, New York, 1983). Es wurde auch mitgeteilt, daß Gibberellin-O-glucoside durch chemische Partialsynthese hergestellt werden können (G. Schneider, Tetrahedron 37, 545 [1981]).

Glucosylierungen treten auch beim Verfüttern von Gibberellinen an pflanzliche Objekte auf. Diese Glucosylierungen, die sich überwiegend auf Hydroxygruppen im Ring A des ent-Gibberellan-Grundgerüsts beschränken, ergeben nur Ausbeuten von biochemischem Interesse (G.Schneiderin „The Biochemistry and Physiology of Gibberellins" I, [A.Crozier Hrsg.] 389, Praeger Publishers, New York, 1983).

Es ist jedoch bisher noch kein Verfahren bekannt, das eine selektive O-Glucosylierung bei Gibberellinen oder Gibberellinderivaten in Position 13 des ent-Gibberellan-Grundgerüsts in präparativem Maßstab ermöglicht.

Ziel der Erfindung

Es ist Ziel der Erfindung, 13-0-glucosylierte Gibberelline herzustellen, die sich durch veränderte physiologische Wirkung und modifizierte Transporteigenschaften auszeichnen und deshalb sowohl für die Entwicklung praktisch anwendbarer Wachstumsund Entwicklungsregulatoren als auch für die Erforschung der Biochemie und Physiologie der Gibberelline und ihrer Konjugate von Interesse sind.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur selektiven Herstellung von Gibberellin-13-O-glucosiden im präparativen Maßstab zu entwickeln.

Erfindungsgemäß wird ein Gibberellin oder Gibberellinderivat, das eine 13-Hydroxygruppe, aber keine 1(2)-Doppelbindung besitzt, in einem Lösungsmittel oder einem Lösungsmittelgemisch gelöst, an Pflanzen bzw. Pflanzenteile oder an Keimlinge bzw. Teile der Keimlinge von Mais (Zea mays L.) appliziert und nach einer Inkubationszeit von mindestens 12 Stunden das hergestellte Gibberellin-13-O-glucosid isoliert.

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Die erfindungsgemäße 13-0-Glucosylierung verläuft selektiv. Die als Ausgangsstoffe verwendeten Gibberelline bzw. Gibberellinderivate können eine 2(3)-Doppelbindung aufweisen und neben der obligatorischen 13-Hydroxygruppe noch weitere Hydroxygruppen besitzen, z. B. an C-3. Geeignete Gibberelline sind z. B. GA₁, GA₅, GAi₇, GA₁₃, GA₁₉, GA₂O.

Als Lösungsmittel verwendet man zweckmäßigerweise Wasser oder Gemische aus Wasser und organischen Lösungsmitteln,

z. B. Aceton, Ethanol, Dimethylsulfoxid. Die Umsetzung wird vorzugsweise mit Hilfe von Zwergmaismutanten, z.B. mitdwarf-1, durchgeführt. Besonders geeignete Pflanzenteile für das erfindungsgemäße Verfahren sind Keimlinge oder abgeschnittene Sprosse junger Pflanzen.

Die Inkubationszeit beträgt mindestens 12 Stunden und wird durch die Lebensfähigkeit des Systems limitiert. Die Inkubationsbedingungen sind dem Bedarf der Pflanze angepaßt. Zweckmäßigerweise wird die Umsetzung bei diffusem Tageslicht und Raumtemperatur durchgeführt.

Zur Isolierung des Gibberellin-13-O-glucosids wird das Gewebe mit einem organischen Lösungsmittel, z.B. Ethanol, Methanol oder Aceton, gegebenenfalls unter Zusatz von Wasser, extrahiert. Der Extrakt wird durch Verteilungsverfahren und Chromatographie, z. B. DEAE-Sephadex-Chromatographie, gereinigt.

Die erfindungsgemäße 13-0-Glucosylierung ermöglicht die Herstellung von 13-0-glucosylierten Gibberellinen in präparativem Maßstab.

Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Ausführungsbeispiele erläutert.

Ausführungsbeispiel Beispiel 1

GA₂₀-13-0-glucosid(2)

5mg GA₂O (1) werden in 2 ml Ethanol:Wasser (15:85 v:v) gelöst. Die Lösung wird in ein 50 ml Becherglas überführt, in das 50 Stck.' abgeschnittene Sprosse von 7 Tage alten Maiskeimlingen (Zea mays L.) eingestellt werden. Nach 48 Stunden bei Raumtemperatur und diffusem Tageslicht werdep die Pflanzen entnommen, abgespült und 2mal mit 150 ml 80%igem wäßrigen Methanol extrahiert (+4⁰C). Der Rückstand des Extrakts wird an 25ml DEAE-SephadexA25 mit je 25 ml von Methanol mit steigender Essigsäurekonzentration (0, 0,25 N, 0,5 N, 0,75 N, 1,0N, 2,ON, 4,ÖN, 8,0N) chromatographiert. Die Fraktionen 6-8 (2,0N-8,0N Essigsäure in Methanol) enthalten metabolisch gebildetes 2, das nachfolgend durch präparative Dünnschichtchromatographie (Kieselgel 60,0,3mm, Chloroform:Methanol:Essigsäure:Wasser = 80:20:4:2, v:v:v:v, Rf = 0,65 - 0,75) gereinigt wird.

Identifizierung:

1. HPLC PR18,2x62mm,Methanol:0,1%H₃PO₄=50:50v:v,100Ml/min,206nm,R_t = 5,1 min

2. GC-MS der permethylierten Probe

Schlüsselfragmente identisch mit authentischem 2 Quantifizierung: ;

HPLC Bedingungen siehe Identifizierung Ausbeute: 250/ng (A 3,4%)

Beispiel 2

GA₂₀-13-0-glucosid (2)

5mg GA₂O (1) in 2 ml Aceton:Wasser (10:90 v:v) werden nach Beispiel 1 an 50 Sprosse von 7 Tage alten Maiskeimlingen (Zeamays L.) dwarf-1 verfüttert und analog aufgearbeitet. Identifizierung: siehe Beispiel 1 Quantifizierung: Ausbeute 1 500/*g (A 20,6%)

Beispiel 3

GA_r13-0-glucosid(4)

5mg GAi (3) in 2 ml Ethanol :Wasser (10:90 v:v) werden nach Beispiel 2 verfüttert und analog aufgearbeitet. Für die präparative Reinigung mittels Dünnschichtchromatographie wird die Zone R_f 0,4-0,5 isoliert.

Identifizierung und Quantifizierung mittels HPLC.

RP 18 2 x 62, Methanol:0,1% H₃PO₄ = 30:70 v:v, ΙΟΟμΙ/min, 206 nm R, = 5,5min Ausbeute: 1 400/ig (A 19,2%)

Beispiel 4 —

GA₆-13-0-glucosid (67)

5mg GA₅ (5) werden in 2ml 30%igem wäßrigen Ethanol gelöst nach Beispiel 2 verfüttert und aufgearbeitet.

Identifizierung und Quantifizierung mittels HPLC.

RP 18 2 x 62, Methanol:0,1% H₃PO₄ = 40:60 v:v, ΙΟΟμΙ/min, 206nm R₁ = 9,0min Ausbeute: 510>l (A 7,0%)

Claims

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Erfindungsanspruch:

1. Verfahren zur Herstellung von 13-0-glucosylierten Gibberellinen, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Gibberellin oder Gibberellinderivat, das ein 13-Hydroxygruppe, aber keine 1 (2)-Doppelbindung besitzt, in einem Lösungsmittel oder einem Lösungsmittelgemisch löst, an Pflanzen, bzw. Pflanzenteile oder an Keimlinge bzw. Teile der Keimlinge von Mais (Zea mays L.) appliziert und nach einer Inkubationszeit von mindestens 12 Stunden das hergestellte Gibberellin-13-O-glucosid isoliert.
2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Lösungsmittel Wasser bzw. als Lösungsmittelgemische Gemische aus Wasser und organischen Lösungsmitteln einsetzt.
3. Verfahren nach Punkt 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man für die Umsetzung Keimlinge oder abgeschnittene Sprosse junger Pflanzen von Mais (Zea mays L.) verwendet.
4. Verfahren nach Punkt 1 bis2 oder3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung mit Hilfe einerZwergmutante,z.B. dwarf-1, durchgeführt.
5. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung bei diffusem Tageslicht und Raumtemperatur durchführt.
6. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das eingesetzte Gibberellin oder Gebberellinderivat neben der obligatorischen 13-Hydroxygruppe eine Hydroxygruppe am C-3 besitzt.