-
B e s c h r e i b u n g zur Patentanmeldung betreffend Verfahren zur
Gewinnung von Vincristin beziehungsweise N-De sme thylvinb las tin Die Erfindung
betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Vincristin1 durch welches die Ausbeute
an Vincristin bei dessen Gewinnung aus Pflanzenteilen von Vinca rosea L erhöht wurde-,
beziehungsweise zur Gewinnung von N-Desmethylvinblastin.
-
Vincristin ist ein außerordentlich wichtiges-Cytostaticum, welches
auch bei akuter Leukämie im Kindesälter lebensrettend ist (Haggard, M. E.: Cancer
Chemother. Reports, 52, 477 [1968]) und ferner bewirkt seine Anwendung bei Erkrankungen
durch harte Geschwulste im Kindesalter in 60 bis 65% der Fälle eine wesentliche
Rückbildung beziehungsweise Regression (Selavry, D.,
Holland, J.
F., Wolmsn, I. J.: Cancer Chemother. Reports, 52 497 L1968)..
-
Es ist bekannt, daß Vincristin ein dimeres Alkn'oiii von Vinca rosea
L. ist, dessen zunge einige Zehntelprozente der in der Pflanze enthaltenen Alkaloidgesanitmenge
beträgt, weswegen die aus der Pflanze herstellbare Vincristinmenge dem auftretenden
Bedarf bei weitem nicht gerecht werden kann.
-
Nicht bekannt war bisher jedoch, daß N-Desmethylvinblastin als dimeres
Alkaloid ebenfalls in Vinca rosea L. enthalten ist.
-
Die Herstellung von N-Desmethylvinblastin ist im Beispiel 1 der US-Patentschrift
3 354 163 beschrieben. Nach diesem Verfahren wird reines Vincristinsulfat in 0,1%-iger
wäßriger Schwefelsäure gelöst und die Lösung, deren pH-Wert 2,03 beträgt, 18 Stunden
lang zum Sieden erhitzt. Die erhaltene klare Lösung wird mit konzentriertem Ammoniak
alkalisch gemacht und mit Methylenchlorid extrahiert, der Auszug wird unter Vakuum
zur Trockene eingedampft und der Rückstand wird mit Methylenchlorid angefeuchtet
und in Äther gelöst. Der unlösliche Anteil wird durch Zentrifugieren entfernt und
die überstehende klare Lösung wird unter Vakuum zur Trockene eingedampft. Der Trockenrückstand
beträgt 75% der als Ausgangsstoff eingesetzten Vincristinmenge. Er wird in Benzol
gelöst, in einer mit Aluminiumoxyd gefüllten Säule chromatographiert und mit einer
Mischung aus Benzol und Chloroform eluiert. Bei der chromatographischen Trennung
werden 2 Bestandteile gewonnen. Der in größerer Menge erhaltene Bestandteil ist
N-Desmethylvinblastin und der in geringerer Menge erhaltene Bestanzteil ist das
als Nebenprodukt anfallende DesacetyI-N--desmethylvinblastin. Im genannten Beispiel
ist das flengenverhältnis der beiden Bestandteile nicht angegeben, sondern es ist
nur erwähnt, daß bei einem pH-Wert von unterhalb 2 die
Menge des
Desucetylprodirtes ansteigt und bei einem-pH-Wert von oberhalb 2,5 die Umsetzung
des Vincristines nicht vollständig ist. Im Beispiel 3 der US-Patentschrift 3 354
163 ist die Formarlierung von N-Desmethylvinblastin mit Ameisensäure in Gegenwart
von Essigsäureanhydrid beschrieben. In dieser Weise kann das durch Demethylierung
von Vincristin erhaltene N-DesrLethylvinblastin in etwa 50,Q'-iger Ausbeute erneut
zu Vincristin ungesetzt werden. Ferner ist im Beschreibungsteil der US-Patentschrift
3 354 163 erwähnt, daß N-Desmethylvinblastin auch aus Vinblastin hergestellt werden
kann, und zwar durch Demethylierung, die mit einem schwach oxydierenden Systein,
zum Beispiel mittels biologischer Oxydation durch Wasserstoffperoxyd und ein Peroxydaseenzym,
durchgeführt wird.
-
Beuiglich der Herstallung von N-Desmethylvinblastin aus Vinblastin
wird jedoch über diese Feststellung hinaus keine Lehre gegeben.
-
Der Nachteil des Verfahrens der US-Patentschrift 3 354 163 besteht
darin, daß das wertvollste Alkaloid von Vinca rosea L., das Vincristin, nach seiner
Reindarstellung auf dem angegebenen komplizierten und daher mit außerordentlich
hohem Aufwand verbundenen Wege zum N-Desmethylvinblastin abgebaut werden muß und
aus diesem nur in etwa 5a;-iger Ausbeute rückgewonnen werden kann.
-
Weiterhin ist aus der US-Patentschrift 3 205 220 ein Verfahren zur
Herstellung von Vincristin bekannt, gemäß welchem die getrocknete Vinva rosea L.
nach einer sauren Vorbehandlung mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert wird
und nach einem Reinigungsvorgang, der in mehrfachem Umlösen mittels Wasser und eines
organischen Lösungsmittels besteht, die Lösung zur Trockene eingedampft wird. Die
so gewonnene schwach basische Alkaloidfraktion von komplizierter Zusammensetzung,
welche die dimeren Alkaloide insgesamt in einem Anteil von
1 bis
2% und das gewünschte Vincristin in einem Anteil von nur einigen Hundertstelprozenten
enthält, wird durch Chromatographieren getrennt und so wird das reine Vincristin
gewonnen.
-
Der Nachteil des obigen bekannten Verfahrens besteht darin, daß zur
Reindarstellung der wenigen Hundertstelprozente Vincristin die bei der Extraktion
von Vinca rosea L. gewonnene ne schwach basische Alkaloidfraktion von komplizierter
Zusammensetzung zuerst chromatographiert und dann in Abhängigkeit vom pH-Gradienten
extrahiert werden muß.
-
Ziel der Erfindung ist es, die Menge des aus Vin<a rosea L. gewinnbaren
Vincristines zu steigern und mittels Formylierung des zum ersten Mal durch die Anmelderin
isolierten natürlichen N-Desmethylvinblastines weiteres pharmazeutisch wertvolles
Vincristin herzustellen.
-
Die Erfindung beruht auf der Feststellung, daß die Mischung dimerer
Alkaloide von Vinca rosea L., die nach der ungarischen Pat-ntschrift 160 967 aus
dem entsprechend gereinigten Auszug durch eine Säure, zum Beispiel äthanolische
Schwefelsäure, in Form eines etwa 70% dimere Alkaloid enthaltenden Säureadditionssalzes
abgetrennt beziehungsweise im Auszug angereichert werden kaiiii, neben den Säureadditionssalzen
von Vinblastin, Vinleurosin, Vineristin und anderen dimeren Alkaloiden auch das
in Vinca rosea L. bisher nicht festgestellte und aus dem Pflanzenmaterial zum ersten
Male durch die Anmelderin isolierte N-Desm@thylvinblastin enthält. Weun also die
etwa 70,0 dimere Alksloide enthaltende Mischung von Säureadditionssalzen oder gegebenenfalls
das aus dem Gemisch der Säureadditionssalze freigesetzte Gemisch dimerer Alkaloidbasen
formyliert wird, dann wird auch das in Vinca rosea L. vorkommende natürliche N-Desmethylvinblastin
in Form von Vincristin gewonnen.
-
Die Formylierung wird in an sich bekannter Weise, zwn Beispiel mit
Ameisensäure in Essigsäureanhydrid, vorgenommen.
-
GcgensL-and der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Gewinnung von
Vincristin in erhöhter Ausbeute aus Pflanzenteilen von Vinca rosea L., welches dadurch
gekennzeichnet ist, doß eine aus Pflanzenteilen von Vinca rosea L. gewonnene und
angereicherte Mischung dimerer Alkaloide, in der auch das natürliche N-Desmethylvinblastin
enthalten ist, beziehungsweise eine aus dem ALkaloidgemisch gewonnene Mischung von
Säureadditionssalzen dimerer Alkaloide, in der auch ein Säureadditionssalz des natürlichen
N-Desmethylvinblastines enthalten ist, in an sich -bekannter Weise förmyliert wird
und aus dem formylierten Gemisch das Vincristin in an sich bekannter Weise isoliert
und gegebenenfalls in ein Säureadditionssalz überführt wird.
-
Erfindungsgemäß wird zweckmäßigerweise wie folgt vorgegangen: Ein
rohes Alkaloidsulfatgemisch, dessen Gewinnung in der ungarischèn-Eatentschrift 160
967 beschrieben ist, wird in einem Gemisch aus Ameisensäure und Essigsäureanhydrid
gelöst und das Reaktionsgemisch wird einige Minuten, vorzugsweise -1 bis 10 Minuten,
bei Zimmertemperatur stehengelassen.
-
Während dieses Zeitraumes geht die Formylierung des in der Alkaloidsulfatmischung
vorliegenden N-Desmethylvinblastines zu Vincristin vor sich. Danach wird-das Reaktionsgemisch
unter Kiihlen in das etwa 5-fache- Volumen Wasser eingegossen, wobei darauf zu achten
ist, daß sich die Temperatur der wäßrigen Lösung nicht über 100C erhöht, sondern
vorteilhafterweise O bis 50C beträgt. Darauffolgend wird der pH-Wert der sauren
Lösung ebenfalls unter Kühlen mit wäßrigem Ammoniak auf 8,5 bis 9,0 eingestellt
und anschließend wird mehrfach mit einem organischen Lösungsmittel, vorteilhafterweise
Methylenchlorid, bis zur Erreichung der Abwesenheit von Alkaloiden extráhiert. Die
beiden Phasen werden jeweils voneinander getrennt und die organischen Phasen werden
vereinigt, getrocknet
und unter verminde@tem Druck zur Trockene
eingedampft.
-
Der sandfarbene Rückstand enthält das N-Deswethylvinblastin, das in
der Ausgangsmischung der Alkaloidsulfate enthalten war, bereits als Vincristin.
Dieser sandfarbene Rückstand wird in einem Lösungsmittel, vorteilhafterweise Äthanol,
gelöst und mit 1%-iger äthanolischer Schwefelsäure versetzt.
-
Die Lösung wird einige Zeit stehengelassen, wobei das Gemisch der
formylierten Alkaloidsulfate auskristallisiert. Diese werden abfiltriert, gewaschen
und getrocknet.
-
Die Trennung des in der beschriebenell Weise erhaltenen Gemisches
von dimeren Alkaloidsulfaten kaiiri, zun Beispiel in folgender Weise durchgeführt
werden: Die Substanz wird in einem Gemisch von Methylenchlorid und Chloroform in
Verhältnis von 2 : 1 gelöst und in einer mit teilweise insktiviertem Aluminiumoxyd
gefüllten Säule chromatographiert. Bei der chromatographischen Trennung wird das
Sulfntion gebunden und die Fraktionen des Eiu,ttes enthalten die getrennten dimeren
Alkaloide in Form der freien Basen. Die Elution wird mit dem oben angegebenen Lösungsmittelgemisch
durchgeführt. Die erste Fraktion enthält Neben- beziehungsweise Begleitalkaloide,
die daran anschließenden enthielten das Vinblastin und das eventuell vorhandene
Vinleurosin und darauf folgt die das Vincristin enthaltende Fraktion. Die in den
einzelnen Fraktionen gelöst enthaltenen dimeren Alkaloide werden mittels Papier-
beziehungsweise Dünnschichtchromatographie identifiziert. Froktionen, die identische
dimere Alkaloide enthalten, werden vereinigt und unter schonenden Bedingungen, zweckmäßigerweise
winter vermindertem Druck, eingedampft. Die voneinander abgetrennten amorphen dimeren
Alkaloidbasen werden in einem Lösungsmittel, zweckmäßigerweise Äthanol, gelöst und
mit 1%-iger äthanolischer Schwefelsäure in ihre Sulfa-te überführt. Das erhaltene
Vincristinsulfat enthält dadurch nicht nur dns in Vinca rosea L. vorkommende Vincristin,
sondern außerdem noch zusatzlich
dns durch Formylierung des in der
Pflanze vorkommenden natürlichen N-Desmetliylvinblastines gewonnene Vincristin.
-
Eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens bestcht
darin, daß das nch der Formylierung erhaltene Gemisch dimerer Alkaloidbasen unmittelbar,
also ohne Überführen@in das Sulfat, getrennt wird. In diesem Falle wird das Gemisch
der dimeren Alkaloidbasen in Benzol gelöst und in einer mit Benzol getränktes Aluminiumoxyd
enthaltenden Säule chromatographiert. Zuerst wird mit Benzol eluiert, welches den
größten Tail der monomeren Neben- beziehungsweise Begleitalkaloide herauslöst. Danach
wird mit einem Gemisch von Benzol und Chloroform im Verhältnis von 2 : 1 weiter
eluiert und zum Schluß ein Gemisch von Benzol und Chloroform im Verhältnis von 1
: 1 verwendet. Das Aufarbeiten der Fraktion erfolgt in der weiter oben beschri@h
@en Weise.
-
Gegenüber den bekannten Verfahren hat da, erfindungsgemäße Verfahren
den Vorteil, daß das in Vinca rosea L. vorkommende natürliche N-Desmethylvinblastin,
welches zum ersten Mal von der Anmelderin in dieser Pflanze festgestellt und aus
ihr isoliest wurden, unmittelbir ohne Isolierung zum Vincristin umgesetzt werden
ka m.
-
Der durch das erfindungsgemäße Verfahren gegenüber den in der US-Patentschrift
5 ?05 220 und in der ungarischen Patentschrift 160 967 beschriebenen Verfahren erzielte
technische Fortschritt geht aus der folgenden Tabelle hervor. (Die in der Tabelle
enthaltenen Angaben bezeichnen Vincristinmengen1 die aus Pflanzen identischer Qualität
gewonnen werden können).
| Vincristinsulfat |
| in |
| mg/kg Pflanzenmaterial |
| US-Patentschrift 3 205 2f>0 4 |
| ungarische Patentschrift 160 967 6,5 |
| erfindungsgemäßes Verfahren 10,8 |
tiberraschenderweise wurde erfindungsgemäß auch festgestellt, daß N-Desmethylvinblastin
aus Vinca rosea L. in einfacher Weise gewonnen werden kann.
-
Gegenstand der Erfindung ist daher auch ein Verfahren zur Gewinnung
von N-Desmethylvinblastin aus einem dieses enthaltenden Material durch Extrahieren
mit organischen Lösungsmitteln bei alkalischen pH-Werten und Abtrennen des N-Desmethylvinblastines
aus den so erhaltenen Auszügen durch Chromat;ographieren, welches dadurch gekennzeichnet
ist, daß als Def methylvinblastin enthaltendes Material eine aus Pflanzenteilen
von Vinca rosea L. gewonnene und angereicherte Mischung dimerer Alkaloide beziehungsweise
eine aus dem Alkaloidgemisch gewonnene Mischung von Säureadditionssalzen dimerer
Alkalolde verwendet wird. Dieses bringt gegenüber den bekannten Verfahren den erheblichen
technischen Fortschritt mit sich, daß nicht mehr von reinem Vincristin beziehungsweise
Vinblastin ausgegangen werden muß, es also mit weniger Aufwand verbunden ist und
überdies die Gewinnung des N-Desmethylvinblastines nicht mehr auf Kosten der selbst
therapeutisch wertvol]en genannten Substanzen zu erfolgen hat.
-
Die Gewinnung des in Vinca rosea L. vorkommenden natiirlichen N-Desmethylvinblastines
kann im einzellen vorteilhafterweise
wie folgt durchgeführt werden:
Das rohe Alkaloidsulfatgemisch, dassen Gewinnung in der ungarischen Patentschrift
160 967 beschrieben ist, wird in der etwa 40-fachen Menge Wasser gelost und der
pH-Wert der wäßrigen Lösung wird mit Am!noniak auf 8,5 bis 9,0 eingestellt und mit
einem organischen Lösungsmittel, vorteilhafterrc-ise Methylenchlorid, mehrmals bis
zur Erreichung der Abwesenheit von Alkaloiden extrahiert.
-
Die Phasen-werden jeweils voneinander getrennt-und die organischen
Phasen werden vereinigt, getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft.
In dieser Weise wird ein Gemisch amorpher dimerer Alkaloidbasen erhalten, dieses
wird in einem nichtpolaren Lösungsmittel, zweckmäßigerweise Benzol, gelöst und die
Lösung wird in einer mit Benzol angefetchtetes Aluminiumoxyd ehthaltenden Säule
chromatographiert Es wird mit einem Gemisch von Benzol und Chloroform im Verhältnis
von 3 : 1 eluiert. Es werden jeweils Fraktionen von 900 cm3 aufgefangen und die
in den einzelnen Fraktionen gelöst enthaltenen Alkaloide durch Dünnschicht- beziehungsweise
PSpierchromatographie identifiziert. Die erste Fraktion enthält einen Teil der Neben-
beziehungsweise Begleitalkaloide und das Vinblastin, die daran anschließenden enthalten
das N-Desmethylvinblastin und die darauffolgenden das Vincristin. Die Fraktionen,
die das N-Desmethylvinblastin enthalten, werden vereinigt und in schonender Weise,
zweckmäßigerweise unter vermindertem Druck, zur Trockene eingedampft. Das N-Desmethylvinblastin
wird in einem polaren Lösungsmittel, zweckmäßigerweise Xthanol, gelöst und mit 1%-iger
äthanolischer Schwefelsäure zu N-Desmethylvinblastinsulfat umgesetz't. Die Lösung
wird stehengelassen, wobei das Produkt auskristallisiert.
-
Die Erfindung wird an Hand der folgenden nicht als Beschränkung aufzufassenden
Beispiele-näher erläutert.
-
Beispiel 1 Es wurden 3,85 g rohes Alkaloidsulfatgemisch, d@s noch
dem Beispiel 1 der ungarischen Patentschrift 160 967 gewonnen worden ist, in einer
Mischung aus 35 cm3 98%-iger Ameisensäure und 5,75 cm3 Essigsäureanhydrid gelöst
und bei Zbnrnertemperatur 5 Minuten land, stehen gelassen. Danach wurde'die Lösung
in 150 cm3 Wasser mit einer Temperatur von 0 bis 50C eingegossen und unter Kühlen
mit ebenfalls gekühltem konzentriertem wäßrigen Ammoniak auf einen pH-Wert von 8,5
bis 9,0 eingestellt und mit 300 cm3 Methylenchlorid in mehreren Stufen bis zur Erreichung
der negativen Alkaloidreaktion extrahiert. Die vereinigten und entwässerten Mothylenchloridphasen
wurden unter vermindertem Druck zur Trockene ein6redampft. So wurden 3,1 L eines
sandfarbenen amorphen Gemisches von dimeren Alkaloidbasen gezsonnen, in dem das
ursprünglich vorhandene N-Desmethylvinblastin durch die Formylierung bereits als
Vin@ristin vorlag. Das Gemisch wurd n ethanol gelöst und durch Zugabe von 1%-iger
äthanolischer Schwefelsäure wurde da Gemisch von dimeren Alkaloidsulfaten abgetrennt.
So wurden 2,46 g kristallines Gemisch von dlmeren Alkaloidsulfaten erhalten.
-
Das kristalline Gemisch von dimeren Alkaloidsulfaten wurde in 20
cm3 eines Gemisches von Kethylenchlorid und Chloroform im Verhältnis von 2 : 1 gelöst
und die Lösung wurde in einer 250 g mit Wasser teilweise inaktiviertes Aluminiumoxyd
enthaltenden Säule chromatographiert, wodurch einerseits die Sulfatgruppen gebunden
und andererseits die freien Alkaloidbasen getrennt wurden. Es wurde mit einem Lösungsmittelgemisch
der obigen Zusammensetzung eluiert. Die dimeren Alkaloide wurden in Form der freien
Basen aus der Säule herausgelöst. Es wurden Fraktionen von Je 50 cm3 aufgefangen.
Die Fraktionen 1 bis 3 enthalten die Neben- beziehungsweise Begleitalkaloide und
die Fraktionen 4 bis 9 das Vinblastin und das gegebenenfalls
vorhandene
Vinleurosin. Das Vincristin erschien in der.
-
9. Fraktion und seine Elution war mit der 18. Fraktion beendet. Die
die durch Papier- beziehungsweise Dünnschichtchromatographie identifizierten Vinblastin,
Vinleurosin und Vincristin enthaltenden Fraktionen wurden getrennt zur Trockene
eingedampft. Die erhaltenen amorphen dimeren Alkaloidbasen wurden in der oben beschriebenen
Weise in die entsprechenden sulfate überführt. Aus den Fraktionen 4 bis 9 wurden
2,0 g Vinblastinsulfat und aus den Fraktionen 9 bis 18 0,25 g rohes Vincristinsulfat
erhalten, welches aus einem Gemisch von Methanol und äthanol in einem Verhältnis
von 1 : 4 umkristallisiert wurde und einen [α]D20-Wert von +11 bis 12° (c
= 1; Wasser) und einen Rf-Wert von 0,30 (erschien mit lebhaft blauer Farbe) hatte.
Die Verbindung wurde durch Ultrarotspektroskopie identifiziert. Bei 5,94 µ erschien
im Vergleich zum Ultrarotspektrum des Vinblastines eine ausgesprochen starke Absorptionsbande.
-
Die dünnschichtchromatographischen Untersuchungen wurden mit dem
Adsorbens Aluminiumoxyd G. Merck durchgeführt. Als Fließmittel diente Chloroform,
welches 0,5% Methanol enthielt, und es wurde mit konzentrierter Phosphorsäure, die
1? Cer/Ammonium-sulfat enthielt, entwickelt.
-
Beispiel 2 Aus 3,1 g des nach Beispiel 1 gewonnenen sandfarbenen
Gemisches amorpher dimerer Alkaloidbasen wurden Vinblastin und Vincristin durch
Chromatographieren wie folgt abgetrennt.
-
Das Alkaloidbasengemisch wurde in 15 2 Benzol gelöst und die Lösung
wurde in einer Säule chromatographiert, die 150 g mit Benzol getränktes hluminiumoxyd
der Aktivität III enthielt. Zuerst wurde mit 400 om3 Benzol eluiert, wobei Fraktionen
von je 50 cm3 aufgefangen wurden. Der gröBte Teil
der Neben- beziehungsweise
Begleitalkaloide wurde durch das Benzol herausgelöst. Danach wurde mit 450 cm3 eines
Gemisches von Benzol und Chloroform im Verhältnis von 2 : 1 weitereluiert, wodurch
die noch verbliebenen monomeren Alkaloide und das nur in geringer Menge vorhandene
Vinleurosin herausgelöst wurden. Durch Elution mit weiteren 450 cm3 eines Gemisches
von Benzol und Chloroform im Verhältnis von 2 : 1 wurde das Vinblastin erhalten.
Zuletzt wurde mit 1 500 cm3 eines Gemisches von Benzol und Chloroform im Verhältnis
von 1 : 1 eluiert, wodurch das noch am Adsorbens gebundene Vincristin herausgelöst
wurde. Die auf Grund von papier- beziehungsweise dünnscllichtchromatographischen
Untersuchungen getrennten Eluate wurden zur Trockene eingedampft. Es wurden 2,6
g amorphe Vinblastinbase erhalten, aus der in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise
das Sulfat hergestellt wurde.
-
So wurden 2,2 g kristallines Vinblastinsulfat erhalten.
-
Beim Eindampfen des Vincristin enthaltenden Eluates wurden 0,32 g
amorphe Vincristinbase erhalten, aus der nach Beispiel 1 das Sulfat hergestellt
wurde. Ausbeute: 0,27 g rohes Vincristinsulfat. Ausbeute nach dem Umkristallisieren
aus Methanol und Äthanol im-Verhältnis von 1 : 4: 0,21 g Vincristinsulfat. Die physikalischen
Konstanten des Produktes waren mit denen des Produktes des Beispieles 1 identisch.
-
Beispiel 3 Gewinnung von N-Desmethylvinblastin Es wurden 6 g rohes
Gemisch dimerer slkaloidsulfate, das nach der ungarischen iiatentschrift 16C 967
hergestellt worden ist, in 100 cm3 Wasser gelöst und die wäßrige Lösung wurde mit
verdünntem Ammoniak alkalisch gemacht und mit 3 x 100 cm3 Methylenchlorid bis zur
Erreichung der Abwesenheit von
Alkaloiden extrahiert. Die beiden
Phasen wurden jeweils voneinander getrennt und die organischen Phasen wurden vereinigt
und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft.
-
In dieser Weise wurden 4,5 g amorphe dimere Alkaloidbasen erhalten,
die in 15 cm3 Benzol gelöst wurden. Die Lösung wurde chromatographiert, wobei als
Adsorbens mit Benzol getränktes Aluminiumoxyd der Aktivität III verwendet wurde.
Die dimeren Alkaloide wurden in folgender Weise eluiert: Das Vinblastin wurde mit
3 600- cm3 einer Mischung aus Benzol und Chloroform im Verhältnis von 3 : 1 herausgelöst.
Es wurden Fraktionen von je 100 cm3 aufgefangen und die dimeren Alkaloide in, den
einzelnen Fraktionen wurden durch Dünnschicht- beziehungsweise Papierchromatographie
identifiziert. Die Fraktionen 1 bis 9 enthielten einen Teil der Neben- beziehungsweise,
Begleitalkaloide und das Vinblastin. Die Fraktionen 10 bis 24 enthielten das N-Desmethylvinblastin.
Diese Fraktionen wurden zur Trockene eingedampft, wodurch ein Trockenrückstand von
0,35 g rohem N-Desmethylvinblastin erhalten wurde.
-
Das N-Desmethylvinblastin wurde in wasserfreiem Äthanol (ethanol)
gelöst und es wurde mit 1%-iger äthanolischer (ätherischer) Schwefelsäure das N-Desmethylvinblastinsulfat
abgetrennt. Dieses wurde abfiltriert, gewaschen und getrocknet. So wurden 0,26 g
rohes N-Desmethylvinblastinsulfat erhalten, welches aus einem Gemisch von Methanol
und Äthanol im Verhältnis von 1 : 4 umkristallisiert wurde. Ausbeute: 0,24 g N-Desmethylvinblastinsulfat.
-
Aus dem erhaltenen Salz wurde die N-Desmethylvinblastinbase freigesetzt.-
Die isolierte N-Desmethylvinblastinbase wurde durch folgende Daten identifiziert:
[α]20-Wert ,= +15g8° (c = 1; Chloroform) und Schmelzpunkt: 210 bis 2150e (Boetius).
-
UV-Absorptionsspektrum des N-Desmethylvinblastinsulfates: k 211 46
5b4 258 11 300 286 10 740 294 9 965 310 4 4 995 Charakteristische Wellenlängen des
Ultrarotspektrums von N-Desmethylvinblastin: 3 56D, 3 440, 3 000, 2 956, 2 940,
2 930, 2 870, 2 830, 2 785, 1 740, 1 620, 1 597, 1495, 1 487, 1 455, 1430, 1416,
1 390, 1 368, 1 328, 1 294, 1 252, 1 235, 1 195, 1 164, 1 140, 1 126, 1 112, 1 075,
1 C60, 1 035, 1 006, 998, 975, 954 und 915.
-
Beim Ohromatographieren auf Aluminiumoxyd, Schicht D, unter Verwendung
von Chloroform und Methanol im Verhältnis von 99,5 : 0,5 als Fließmittel und Entwickeln
durch Einsprühen von konzentrierter Phosphorsäure, die 1% Cer/Ammonium--sulfat enthielt,
war das N-Desmethylvinblastin durch einen bei Rf = 0,60 erschienenen, zuerst orangefarbenen
und später in lila ubergehenden Fleck charakterisiert.
-
Patentansprüche