DE2631045A1 - Verfahren zur verbesserung der aktivitaet von oxidoreduktase - Google Patents

Verfahren zur verbesserung der aktivitaet von oxidoreduktase

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Description

Snamprogetti S.p.A.
Corso Venezia 16, Mailand/Italien
betreffend
Verfahren zur Verbesserung der Aktivität von Oxidoreduktase
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verbesserung der Aktivität von Oxidoreduktaseenzymen, die in faserige Strukturen eingebettet sind, durch gleichzeitigen Einschluß von sowohl dem Enzym als auch einem Coenzym.
Es ist bekannt, daß Enzyme nach verschiedenen Verfahren auf wasserunlöslichen Trägern immobilisiert und dann als heterogene Katalysatoren angewandt werden können, die leicht von dem Reaktionsgemisch abgetrennt und erneut angewandt werden können.
Im Falle von Enzymen oder enzymatischen Komplexen, die ein Coenzym vom NAD -Typ erfordern, war es notwendig, dieses Coenzym zu dem Reaktionsgemisch zuzusetzen. Aufgrund des niederen Molekulargewichts des Coenzyms ist es natürlich schwierig, dieses zusammen mit dem Enzym auf dem gleichen Träger zu immobilisieren, um die kontinuierliche Zugabe dieses Coenzyms zu dem Reaktionsgemisch unnötig zu machen.
Außerdem ist eine kovalente Bindung des Coenzyms an den Träger selbst, an den das Enzym gebunden ist, ungünstig aufgrund der sterischen Hinderung, die die Wechselwirkung zwischen dem Enzym und dem Coenzym verhindert oder stark be-
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grenzt, die für die Aktivität erforderlich ist.
Soweit solche Coenzyme verhältnismäßig teuer sind, stellt die Tatsache, daß man sie kontinuierlich zu einem Reaktionsgemisch zusetzen muß, eine starke Begrenzung für die Anwendung von Oxidoreduktasesystemen in Faserform dar.
Es ist ferner "bekannt, daß NAD an der 6-Aminopuringruppe reaktionsfähig gemacht (funktionalisiert) werden kann und das reaktionsfähige NAD+an wasserlösliche hochmolekulare Polymere gebunden werden kann wie in der DT-OS 2 519 063 und der DT-OS 2 535 825 angegeben.
Es hat sich nun gezeigt, daß derartige Polymere, die Coenzymaktivität besitzen, in wasserunlöslichen polymeren Matrizes und besonders in faserigen Strukturen zusammen mit einem Enzym eingeschlossen werden können» Der gleichzeitige Einschluß von Enzymen und Coenzymen führt zu einer Stabilisierung der Oxidoreduktase, die( wenn kein Coenzym vorhanden ist, zu Assoziations- und Dissoziationsgleichgewichten der Untereinheiten führt, wodurch ein Aktivitätsverlust auftritt.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt es, ein polyenzymatisches biologisches Reagens herzustellen, bei dem das polymere Derivat von NAD+ kontinuierlich durch den Verbrauch von zwei Oxidoreduktasen von der oxidierten Form in die reduzierte Form (zurück)umgewandelt wird. Das NAD+-Derivat kann nicht nur auf enzymatische Weise umgewandelt werden mit Hilfe von zwei Oxidoreduktasen, sondern auch auf eine kombinierte chemische und enzymatische Weise, indem man eine Oxidoreduktase und eine chemische Verbindung anwendet. Das Umwandlungssystem wird so ausgewählt, daß es mit dem Produkt, das man erhalten möchte, in Übereinstimmung steht./Die Art,auf die das Enzym und Coenzym eingeschlossen werden könnai,ist in der IT-PS 836 462 beschrieben. Dort
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sind auch nähere Einzelheiten des Verfahrens angegeben.
Die Anwendung makromolekularer Coenzyme, die zusammen mit Enzymen in polymere Matrizes eingebettet sind, ermöglicht zahlreiche verschiedene Verfahren: In der präparativen chemischen Synthese von Steroiden oder Umwandlung von Steroidkernen an vorbestimmten Stellungen. Außerdem können stereospezifische Synthesen von Aminosäuren ausgehend von Hydroxysäuren oder Ketosäuren durchgeführt werden. Auf analytischem Gebiet ist es möglich, Enzym-Coenzym-Systeme einzuschließen, bei denen die letzte Reaktion der Oxidation des reduzierten Coenzyms oder der Reduktion des oxidierten Coenzyms mit Hilfe einer chemischen Substanz durchgeführt wird, deren Absorptionsspektrum davon abhängig ist, ob sie in reduzierter oder oxidierter Form vorliegt. Die Farbe einer solchen Substanz kann leicht gemessen werden und in Beziehung gesetzt werden zu der Menge der gesuchten Substanz.
Die Erfindung wird durch die folgenden, nicht einschränkenden Beispiele- näher erläutert.
Beispiel 1
Für den Einschluß steht eine Lösung in Puffer und Glycerin (75 : 25) von Polyäthylenimin-NAD+ (PEI-NAD+), Milchsäuredehydrogenase (LDH) (von Kaninchen, Boehringer, Mannheim, GmbH) und Alanindehydrogenase (Ala DH) (von B. Subtilis, Boehringer, Mannheim,GmbH) mit den folgenden Charakteristika zur Verfügung:
PEI-NAD+ 37,5 mg/ml (= 0,63 yuMol NAD+/ml)
LDH 17,5 mg/ml (70 I.U., NAD+ als Substrat) Ala DH 3,75 mg/ml
10 g Cellulosetriacetat (Fluka AG, Buchs) werden unter Rühren in einem Reaktor in 133 g Methylenchlorid gelöst. Dann werden 20 g Enzymlösung zu der Polymerlösung zu-
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gegeben und die Emuigierung der beiden Phasen durch heftiges Rühren bei O0C innerhalb von 30 Minuten erreicht.
Die Emulsion wird in einen kleinen Schmelztigel gegeben, bei O0C gehalten und unter Stickstoffdruck zu Fäden gesponnen. Die Fäden werden in Toluol bei O0C koaguliert und auf einem Spulenrahmen aufgenommen.
Es wird an der Luft getrocknet, um organische Lösungsmittel zu entfernen. 2 g der so erhaltenen Fasern, entsprechend ungefähr 1 g trockenem Polymer, v/erden mit Bicarbonatpuffer pH 8,0 gewaschen, um die Enzyme und PEI-NAD+, die an der Oberfläche adsorbiert sind, zu entferne^ und anschlisßend werden die Faden, in 10 ml einer wäßrigen Lösung der folgenden Zusammensetzung gegeben: 3 % Ammonium-L-lactat (Gew./Vol.) pH 7,4.
Es wird bei Raumtemperatur (ungefähr 22°C) gerührt. Nach 10 Stunden wird mit Hilfe eines automatischen Aminosäureanalysators die Menge des entstandenen L-Alanins gemessen. Sie beträgt 0,163 g (96 % der Theorie).
Nachdem das Gemisch entfernt worden ist, werden die gleichen Fäden . mit einer frischen Lösung von Ammoniumlactat zusammengebracht, um erneut die Reaktion durchzuführen. Nach 7 Tage langer Anwendung beträgt der Prozentsatz an Mlanin innerhalb von 10 Stunden 94 % und nach 30 Tagen wieder innerhalb von 10 Stunden 90 %, Das L-Alanin wird abgetrennt durch Ausfällung mit Äthanol bei einem pH-Wert von 6,2. /"cxj^5= + I4,6°(c = 2,0; 5n HCl).
Beispiel 2
Es wird ; entsprechend Beispiel 1 ein Faden hergestellt, wobei anstelle von PEI-NAD+ Formyl-PEI-NAD+ verwendet wird.
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2 g des so erhaltenen Fadens, entsprechend etwa 1 g trockenem Polymer, werden mit 0,05 m Phosphatpuffer pH 8,0 gewaschen und in 10 ml einer wäßrigen Lösung der folgenden Zusammensetzung gegeben: 0,05m Phosphatpuffer pH 8, enthaltend 5 % (Gew. /Vol.) Ammonium-DL-lactat. Nach 10 Stunden sind 98 % der Theorie Alanin entstanden. Der gleiche Faden wird wieder in 10 ml der Lösung gegeben und die Lösung alle 11 Stunden ausgewechselt. Nach 30 Tagen kontinuierlichem Arbeiten beträgt der Prozentsatz an Alanin, der innerhalb von 10 Stunden gebildet wird , 95 ?<>.
Beispiel 3
Es .wird ein Faden entsprechend den Beispielen 1 und 2 hergestellt unter Verwendung von Polylysin-NAD . Wenn entsprechend den Beispielen 1 und 2 gearbeitet wird ·, werden innerhalb von 10 Stunden 92 % der Theorie Alanin erhalten. Nach 30 Tagen ergibt die Anwendung des gleichen Fadens eine 87 %ige Umwandlung.
Beispiel 4
Es steht eine Puffer-Glycerin(75:25)-Lösung zur Verfügung, die entsprechend dem erfindungsgemäi3en Verfahren eingeschlossen werden kann, enthaltend: Polyäthylenimin-NAD+: 25,5 mg/ml (3,78 /uMol NAD+/ml). 3-<X, 20-ß-Hydroxysteroid-dehydrogenase (von Streptomyces hydrogenans, Boehringer, Mannheim, GmbH): 12,5 mg/ml (225 Einheiten/ml; 25°C, Cortison als Substrat), Alkoholdehydrogenase (ADH)(aus Pferdeleber, Boehringer, Mannheim, GmbH) : 30 mg/ml (81 Einheiten/ml; 250C; Äthanol als Substrat);
Aldehyd-dehydrogenase (aus Hefe, Sigma, St. Louis): 30 mg/ml (90 Einheiten/ml; 250C; Acetaldehyd als Substrat).
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Es wird ein Faden entsprechend Beispiel 1 hergestellt. 2 g des Fadens (der Fasern),entsprechend ungefähr 1 g trockenem Polymer, v/erden bei 25°C mit 10 ml einer Lösung in Triäthanolaminhydrochloridpuffer (0,1m, pH 7,3) gerührt, enthaltend 0,3m KCl, 5mMol ß-Mercaptoäthanol und 1 % Äthanol, um die Substanzen zu entfernen, die an der Oberfläche adsorbiert sind um .ein Stabilisierungsmedium für die eingeschlossene Aktivität zu erhalten.
Nach vollständigem Waschen liegt aufgrund der Wirkung Ikoholdehydrogenase
in reduzierter Form vor.
der Alkoholdehydrogenase und Aidehyddehydrogenase das PEI-NAD
Die Waschflüssigkeit wird abfiltriert und es werden 10 ml der gleichen Pufferlösung zugegeben, enthaltend 28 mg Cortison ( Δ^ -Pregnen-17- Of , 21-diol-3,11,20-trion).
Die Lösung wird 1 Stunde unter Rühren bei 25°C gehalten und das Gemisch anschliei3end entnommen. Die Lösung wird dreimal mit je 2 ml Chloroform extrahiert. Der organische Auszug wird im Vakuum auf ein Volumen von 1 ml eingeengt. Die Menge des Produktes (Δ -Pregnen-17- ZK, 20-ß, 21-triol-3,11-dion und Cortison werden gaschromatographisch bestimmt. Man berechnet eine Ausbeute von 95 %«
Der gleiche Faden wi.rd . 20mal zur Umwandlung von Cortison mit einem vernachläßigbar geringen Aktivitätsverlust angewandt.
Beispiel 5
Für den Einschluß steht eine Lösung in Puffer und Glycerin(75:25) zur Verfügung, enthaltend: Polyäthylenimin-NAD+ : 25,5 mg/ml (3,78 /uMol NAD+/nil) ß-Hydroxysteroiddehydrogenase (aus "Pseudomonas testosteron!", II, Sigma, St. Louis): 40 mg/mlr
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Diaphorase (aus Schweineherz II, Boehringer Mannheim Gmbi);i9,4 mg/ml des Handelsprodukts, (enthaltend 6,45 mg/ml Enzymprotein).
Es wird entsprechend Beispiel 1 ein Faden hergestellt.
2 g des Fadens, entsprechend ungefähr 1 g trockenem Polymer, werden mit 0,067 m Triäthanolaminhydrochloridpuff er pH 7,6 gewaschen, um Substanzen zu entfernen, die an der Oberfläche adsorbiert sind, und in 10 ml einer wäßrigen Lösung gegeben, enthaltend 0,067m Triäthanolaminhydrochloridpuffer pH 7,6, 288 /ug Testosteron (17-ß-Hydroxy-A^-androsten-3-on), 2,9 mg 2,6-Dichlor-phenolindophenol. Die Lösung wird bei 250C gerührt und Sauerstoff durchgeleitet, um den reduzierten Farbstoff wieder zu oxidieren. Nach 4 Stunden wird das Gemisch dreimal mit je 3 ml Äthylacetat extrahiert. Der organische Auszug wird mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und zur Trockne eingedampft. Der feste Rückstand wird in 0,5 ml Methanol gelöst. Die Menge des entstandenen Produktes (A^-Androsten-3,17-dion) beträgt 90 %, ausgehend von Testosteron.
Beispiel 6
Der gleiche Faden wie in Beispiel 5 wird angewandt. 1 g des Fadens,entsprechend ungefähr'0,5 g trockenem Polymer, wird mit 0,06m Triäthanolaminhydrochloridpuffer pH 7,6 gewaschen, um Substanzen zu entfernen, die an der Oberfläche adsorbiert sind.
Es werden 5 Lösungen hergestellt, enthaltend 0,06m Triäthanolaminhydrochloridpuffer pH 7,6, 80 /uMol 2,6-Dichlorphenolindophenol und Testosteron (17-ß-Hydroxy-£sZ|·- androsten-3-on) 10 /uMol, 20 /uMol, 30 /uMol, 40 /UMol bzw. 50 /uMol.
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- Φ r
Die gewaschenen Fäden werden jeweils in 5 ml jeder Lösung gegeben und das Gemisch bei 25 C gerührt und die Absorption bei 600 nra (mm) gemessen. Es wird eine Eichgerade aufgestellt aus den unterschieden der optischen Dichte und den Konzentrationen an Testosteron. Der gleiche Faden wird zur Messung von Testosteron in einer Lösung angewandt, enthaltend 30 /uMol. Bei 100 Ablesungen wurde keine Abweichung von der Eichgeraden festgestellt.
../Patentanspruch
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Claims (1)

  1. DR. ING. F.WTTESTirOFF I)K. ICv. ΡΕΟΙΓΜ ANN
    I)R. ING. D. BTEHRKNS DIPL·. IKG. It, GOETZ PATEN TANWÄXTE
    ft MUK-OlTJSK
    UN (089) G0 20S1 5 24:070
    TKJiICOJtAMMK : !■ilOTJBCTl'ATENT MttNOHEN
    1A-48
    Fat e η t a η s ρ r u c h
    Verfahren zur Verbesserung der Aktivität von Oxidoreduktase, dadurch gekennzeichnet , daß man in eine faserige Struktur das Enzym und ein Coenzym einbaut, das vorher funktionsfähig gemacht und an wasserlösliche hochmolekulare Polymere gebunden worden ist.
    6231
    f 1ST
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