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Verfahren zur Herstellung von 4-Pregnen-11 ß, 1'7a, 21-triol-3, 20-dion
(Hydrocortison) und 4-Pregnen-11 a, 1'7a, 21-triol-3, 20-dion (11-epi-Hydrocortison)
Unter den Verfahren zur Herstellung von Nebennierenrindenhormonen sind die biochemischen
besonders bedeutungsvoll, da es mit ihrer Hilfe gelingt, direkt Sauerstoff in die
11 ständige Methylengruppe einzuführen. Diese Biooxydation läßt sich besonders gut
mit Mikroorganismen, speziell mit Schimmelpilzen, durchführen. In den meisten Fällen
entstehen hierbei die unnatürlichen 11 a-Oxysteroide, die durch weitere chemische
Reaktionen in die biologisch wirksamen 11-Oxo- oder 11 ß-Oxysteroide umgewandelt
werden müssen. Die bisher technisch angewandten biochemischen Verfahren zur Gewinnung
von Cortison (4-Pregnen-17a, 21-diol-3, 11, 20-trion) und von Hydrocortison (Kendalls
Compound F - 4-Pregnen-11 ß, 17a, 21-triol-3, 20-dion) gehen von 11 a-Oxyprogesteron
aus, das z. B. nach dem USA.-Patent 2 602 769 durch Biooxydation von Progesteron
mit Schimmelpilzen hergestellt und über eine größere Zahl von Zwischenstufen in
Cortison oder Hydrocortison übergeführt wird.
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Da bei den genannten Verfahren die Biooxydation in einem sehr frühen
Stadium der Gesamtsynthese vorgenommen wird, wäre es erwünscht, diesen Schritt auf
eine spätere Reaktionsstufe zu verlegen. Besonders geeignet hierzu ist Reichsteins
Substanz S (I; 4-Pregnen-17a, 21-diol-3, 20-dion), die nach julian und Mitarb. (Journ.
Amer. Chem. Soc., Bd. 72, 1950, S.5145) leicht zugänglich ist.
Die meisten Schimmelpilze oxydieren Substanz S in der 11 a-Stellung zum 11-Epimeren
des Hydrocortisons (11) (Compound epi-F - 4-Pregnen-11 a, 17 a, 21-triol-3, 20-dion),
das hier als 11-epi-Hydrocortison bezeichnet werden soll (z. B. USA.-Patente 2 602
769, 2 649 402; weitere Literatur s. Journ. Amer. Chem. Söc., Bd.76 1954, S. 4050).
Bisher sind nur wenige Verfahren bekannt, die es erlauben, aus Substanz S Hydrocortison
(III) direkt durch Biooxydation mit Mikroorganismen zu erhalten: 1. Nach Colingsworth,
Karnemaat, Hanson, Brunner, Mann und Haines (J. Biol. Chem. Bd. 203, 1953, S.807)
sowie Haines und Colingsworth (USA.-Patentschrift 2 649 401) erhält man durch biochemische
Oxydation von Substanz S mit Hilfe von Streptomyces-Arten, speziell mit Streptomyces
fradiae, Hydrocortison. Die Ausbeuten liegen auf Grund papierchromatographischer
Messungen bei 2 bis 60/,. Der Durchsatz an Substanz S bei diesen Versuchen
(umgerechnet auf 1 g) beträgt 1 g auf 101 bis 1 g auf 31 Kulturlösung.
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2. In der USA.-Patentschrift 2 602 769 und Journ. Amer. Chem. Soc.,
Bd.75, 1953, S.5369, Hansen, Mann, Nielson, Anderson, Brunner, Karnemaat, Colingsworth,
Haines, ist beschrieben, daß Substanz S mit dem Schimmelpilz Cunninghamella blakesleeana
zu Compound F oxydiert werden kann. Bei einem Durchsatz
von 1 g
Substanz S auf 201 Kulturlösung werden Ausbeuten an Compound F bis 35 °/o, papiercbromatographisch
gemessen, und von 22°/o in Kristallform angegeben. Daneben entsteht auch Cortison
in einer Menge von etwa 14°/0; außerdem wird unveränderte Substanz S zurückerhalten.
In weiteren Untersuchungen (Applied Microbiology, Bd. 3, 1955, S. 14, 16) wurde
festgestellt, daß durch Zusatz von Alkoholen und durch Variation des Nährmediums
die Ausbeute an Compound F gesteigert werden kann; Zusatz von Phenol verminderte
den Gehalt an Nebenprodukten. Es könnten so in Ansätzen von 10 mg Substanz S auf
100 ml Kulturmedium, das etwa 10 °/o Äthanol enthielt, Ausbeuten bis zu 770/, Compound
F und 22 °/o Cortison, papierchrömatographisch gemessen, erzielt werden.
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3. Shull, Kita, Davisson (Journ. Amer. Chem. Soc., Bd. 77, 1955, S.
763, USA.-Patentschrift 2 658 023) geben an, daß Pilze der Gattung Curvularia Substanz
S mit Ausbeuten von etwa 40 °/o in Compound F überführen. Aus einem Ansatz von 0,5
g Substanz S auf 2 1 Kulturmedium (bzw. auf aus 21 Kulturmedium gewonnenes Mycel,
das abfiltriert und in 21 Wasser suspendiert wurde) konnten 410 mg Compound F gewonnen
werden. Als Nebenprodukte entstehen drei weniger polare und vier stärker polare
Steroide als Compound F.
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Für die technische Durchführung der Biooxydation von Substanz S zu
Compound F ist besonders wichtig, daß der Durchsatz an Substanz S, d. h. die pro
Liter Kulturlösung umgesetzte Menge, möglichst hoch ist. Des weiteren ist es erwünscht,
daß möglichst wenig Nebenprodukte gebildet werden bzw. daß solche in irgendeiner
Weise nutzbringend verwertet werden können. In der USA.-Patentschrift 2 602 769
ist zwar angegeben, daß die Konzentration eines Steroids bei der Biooxydation mittels
Schimmelpilzen bis zu 2 g/1 Kulturlösung betragen dürfe, doch ist in der gesamten
Literatur, besonders in den obengenannten Arbeiten und Patentschriften, kein einziges
Beispiel beschrieben, bei dem mehr als 1 g Substanz S auf 31 Kulturlösung umgesetzt
werden konnte.
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Es wurde nun gefunden, daß man Hydrocortison und 11-epi-Hydrocortison
aus Reichsteins Substanz S durch Biooxydation mit Hilfe eines Schimmelpilzes dadurch
erhalten kann, daß man Substanz S mit dem Schimmelpilz nov. spec. Nr. 7770, der
Absidia glauca nahesteht, vorzugsweise mit einem höheren Durchsatz als 0,5 g/1 Kulturlösung
der Biooxydation unterwirft.
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Der genannte Pilz Nr. 7770 wurde aus einer Bodenprobe aus der Umgebung
von Frankfurt a. M. isoliert. In der USA.-Patentschrift 2 602 769 ist unter den
Pilzen der Klasse der Mucoraceen, die zur Biooxydation benutzt werden können, auch
Absidia glauca genannt. Es wurde festgestellt, daß ein authentischer Stamm von Absidia
glauca bei der Bebrütung mit Substanz S Ausbeuten von nur 5 bis 8 °/o Hydrocortison
liefert, während mit dem erfindungsgemäß verwendeten Pilz die Ausbeuten über 50
°/p liegen. Der neue Pilz ähnelt in seiner Erscheinungsform Absidia glauca, er läßt
sich aber mit dem authentischen Stamm sowohl mit der minus- wie mit der plus-Form
nicht kreuzen. Im einzelnen läßt er sich folgendermaßen beschreiben: Mycelrasen
bis 3 cm hoch, anfangs fast weiß, später grau. Sporangien stehen einzeln, meist
auf den Böden von Ausläufern, sind stets vielsporig, birnenförmig, mit Apophyse.
Unterhalb der Apophyse stets eine Ouerwand. Kolumella häufig mit papillenartigem
Fortsatz. Sporen stets kugelig, glatt, 2 bis 5 fc dö .
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Der neue Pilz läßt sich auf den üblichen Nährböden, die Kohlenhydrate,
organisch gebundenen Stickstoff, Zusätze wie Maisquellwasser, anorganische Salze
und Spurenelemente enthalten, leicht züchten. Die Konzentration der Nährstoffe kann
dabei in weiten Grenzen schwanken. Der Pilz zeichnet sich durch besonders große
Stabilität und Unempfindlichkeit gegen äußere Einflüsse aus. Läßt man ihn auf Substanz
S unter Belüftung einwirken, so erhält man als Reaktionsprodukte Hydrocortison und
11-epi-Hydrocortison, daneben sehr geringe Mengen (etwa 3 bis 5 °/o) 6ß-Oxy-Substanz
S (4-Pregnen-6ß, 17a, 21-triol-3, 20-dion). Bei Ansätzen in Schüttelkulturen
mit 20 mg Substanz S in 2 ccm Acetonlösung auf 100 ccm einer 2 Tage vorgewachsenen
Kulturlösung bei 25° erhält man Ausbeuten von im Durchschnitt 400/, Hydrocortison,
50 bis 5501, 11-epi-Hydrocortison und bis 5111, 6ß-Oxy-Substanz S. Setzt
man die Substanz S in Methanollösung zu, so verschieben sich die Ausbeuten zugunsten
von Hydrocortison. Man erhält dann bis 55 °/o an Hydrocortison und 300/,
an 11-epi-Hydrocortison. Die günstigste Konzentration des Methanols nach der Zugabe
zur Kulturlösung liegt bei 3 bis 611/,. Andere Lösungsmittel, wie Äthanol, Propanol,
Butanol, sind ebenfalls zur Lösung der Substanz S geeignet. Die Ausbeuten an Hydrocortison
und epi-Hydrocortison liegen bei ihrer Anwendung aber niedriger als bei Aceton oder
Methanol.
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Bei der Übertragung in den präparativen Maßstab ist der neue Pilz
durch sein Vermögen, große Mengen an Substanz durchzusetzen, allen bisher beschriebenen
überlegen. Bei Zugabe von 5 g Substanz S, gelöst in 170 ccm Methanol, zu 31 einer
2 Tage vorgezüchteten Kulturlösung des Pilzes Nr. 7770 wurde eine Ausbeute von 45
°/o Hydrocortison und 30 °/a 11-epi-Hydrocortison erhalten. Ein so hoher Durchsatz
von Substanz S bei guter Ausbeute ist nach den Angaben der Literatur bisher noch
nicht möglich gewesen.
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Beim Arbeiten im präparativen Maßstab hat es sich als günstig erwiesen,
nicht die gesamte Menge der Lösung von Substanz S auf einmal zur Kulturlösung zuzusetzen,
sondern den Zusatz in Portionen vorzunehmen. So kann man z. B. 80 g Substanz S,
in 81 Aceton gelöst, zu 501 einer Kulturlösung des Pilzes 7770 in Anteilen von z.
B. je 1 1 Acetonlösung, über 24 Stunden verteilt, zugeben. Es ist hierbei zweckmäßig,
den Verlauf der Fermentierung durch Probeentnahme und papierchromatographische Bestimmung
der umgesetzten Menge von Substanz S zu verfolgen.
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Man erhält so Ausbeuten von z. B. 32 °/o Hydrocortison und
330/, 11-epi-Hydrocortison. Durch die fraktionierte Zugabe der Substanz S-Lösung
wird erreicht, daß die Konzentration an Lösungsmittel oder Substanz S nicht so hoch
wird, daß dadurch die Oxydation gehemmt wird.
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Die Isolierung der Oxydationsprodukte geschieht in an sich bekannter
Weise durch Extraktion mit z. B. Methylenchlorid, Chloroform, Äthylenchlorid, Essigester
oder Butylacetat. Hierzu wird das Mycel zunächst abfiltriert, und Mycel und Lösung
werden getrennt extrahiert. Es hat sich gezeigt, daß praktisch die gesamte Menge
an Hydrocortison und 11-epi-Hydrocortison sich in der Lösung befindet, während etwa
noch nicht umgesetzte Substanz S an das Mycel gebunden ist. Die weitere Isolierung
der Reaktionsprodukte erfolgt durch Einengen der Extraktionslösung. Hierbei kristallisiert
direkt ein Gemisch von Hydrocortison und 11-epi-Hydrocortison aus, das etwa 80 °/o
des vorhandenen Hydrocortisons enthält. Aus der Mutterlauge kann weiteres Hydrocortison
und 11-epi-Hydrocortison gewonnen werden. Bei den in der Literatur beschriebenen
Verfahren ist in allen Fällen eine Chromatographie der Extrakte notwendig, um überhaupt
zu kristallinen Produkten zu gelangen.
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Mitunter ist die Kristallisation der Mutterlaugen durch fettartige
Stoffwechselprodukte des Pilzes erschwert.
Benutzt man zur Fermentierung
nicht die üblichen Nährböden, sondern verdünntere Kulturlösungen, so bilden sich
viel weniger Stoffwechselprodukte, und die Isolierung der Restmengen an Hydrocortison
und 11-epi-Hydrocortison aus den Mutterlaugen wird erleichtert.
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Die Trennung des Kristallgemisches von Hydrocortison und 11-epi-Hydrocortison
läßt sich mit praktisch 900/,) Ausbeute an Hydrocortison leicht durchführen, wenn
man das Gemisch gegebenenfalls unter Verwendung verschiedener Acylierungsmittel
acyliert und das Acylatgemisch fraktioniert kristallisiert. Man erhält so z. B.
reines Hydrocortison-Acetat und 11-epi-Hydrocortison-Acetat (vgl. Patentanmeldung
F 17 828 IVb/12 o).
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Das oben beschriebene Verfahren ermöglicht es, die Oxydation von Substanz
S zu Hydrocortison in technischem Maßstab bei hohem Durchsatz an Substanz S und
guter Ausbeute durchzuführen. Das als Nebenprodukt anfallende 11-epi-Hydrocortison,
das nach Patentanmeldung F 17828 IVb/12o als 11-epi-Hydrocortison-Acetat abgetrennt
werden kann, läßt sich nach bekannten Verfahren mit etwa 90"/, Ausbeute in Cortison-Acetat
überführen. Es ist so möglich, in technischem Maßstab aus Substanz S z. B. 30 °/o
Hydrocortison-Acetat und 20 °/o Cortison-Acetat herzustellen.
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Beispiel 1 Erlenmeyerkölbchen von 300 ccm Inhalt werden mit 100 ccm
einer Nährlösung gefüllt, die im Liter 50 g Dextrose, 20 g Pepton und 5 g Maisquellwasser
enthält. Außerdem werden 2 ccm einer Lösung zugesetzt, die 10 g Ca (N03)2, 10 g
KCl, 5 g KH,P0" 10 g MgS04 7 HZ O, 1 g Fe S 04 und 3 g Mn S 04 im Liter enthält.
Nach dem Sterilisieren werden die Kolben mit Sporen beimpft, die aus Schrägagarröhrchen
von Kulturen des Pilzes Stamm nov. spec. Nr.7770 gewonnen wurden. Man läßt den Pilz
als Submerskultur 48 Stunden auf einer Schüttelmaschine von 200 Umdr./Min. bei 25°
wachsen.
-
Dieser Kultur werden 20 mg Substanz S in 2 ccm Aceton unter sterilen
Bedingungen zugesetzt, und man inkubiert sie 24 Stunden unter den obengenannten
Bedingungen.
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Zur Aufarbeitung wird der gesamte Kolbeninhalt dreimal mit 50 ccm
Methylenchlorid extrahiert, die vereinigten Methylenchloridlösungen werden einmal
mit Wasser ausgeschüttelt, kurz über Natriumsulfat getrocknet und auf ein kleines
Volumen eingeengt. Ein aliquoter Anteil der Lösung wird nach der Methode von Zaff
aroni und Mitarb. (Science, Bd. 111, 1950, S.6) papierchromatographisch unter Verwendung
von Schleicher & Schüll-Papier Nr. 2043 b M getrennt. Nach dem Festlegen der
Zonen durch UV-Fotografie bei 240 my werden die Zonen mit salzsaurem Äthanol extrahiert
und im Beckmann-Spektrophotometer bei 240 @n,u quantitativ gemessen. Dabei ergeben
sich z. B. folgende Ausbeuten
| Tabelle 1 |
| Versuch Nr. °/° e@@F°und °% Compound F |
| 1................... 56 38 |
| 2................... 55 40 |
| 3................... 60 40 |
| 4 .....,............. 50 40 |
| 5................... 52 40 |
| 6................... 56 42 |
| 7................... 52 38 |
| 8................... 48 42 |
| 9................... 50 36 |
| 10................... 51 41 |
| Compound F = Hydrocortison |
| Compound epi-F = epi-Hydrocortison |
Zur Identifizierung von epi-F und F dienten die Vergleichs-RF,-Werte von authentischen
Substanzen im Mischpapierchromatogramm sowie die Fluoreszenzfarben der mit Antimontrichlorid,
Phosphorsäure und Schwefelsäure besprühten Papierchromatogramme im sichtbaren und
im UV-Licht.
-
Beispiel 2 Ein Fermentierungskolben von 51 Inhalt, der mit Rührer,
Lufteinleitungsrohr und einem Zugabestutzen mit Kapsenberg-Verschluß versehen ist,
wird mit 31 eines Nährbodens, wie im Beispiel 1 beschrieben, gefüllt. Nach dem Sterilisieren
werden Sporen des im Beispiel l genannten Pilzes eingeimpft. Das Anwachsen wird
bei 28° unter Rühren (120 Umdr./Min.) und Einleiten von Luft (2001 pro Stunde) durchgeführt.
Nach dieser Periode gibt man 0,8 g Substanz S, in 80 ccm Aceton gelöst, unter sterilen
Bedingungen zur Kulturlösung zu und inkubiert 24 Stunden unter den gleichen Bedingungen.
Zur Aufarbeitung wird der gesamte Kolbeninhalt durch eine Glasfilternutsche abgesaugt.
Das abgetrennte Mycel wird mit Wasser gewaschen und drei- bis viermal bei Gegenwart
von 100 bis 200 ccm Aceton zerkleinert. Die vereinigte Acetonlösung wird im Vakuum
bei 40 bis 50° eingeengt, bis eine wäßrige Suspension zurückbleibt, die erschöpfend
mit Methylenchlorid ausgeschüttelt wird. Nach dem Trocknen mit Natriumsulfat wird
das Methylenchlorid auf ein kleines Volumen eingeengt.
-
Das wäßrige Filtrat der Kulturlösung wird direkt mit Methylenchlorid
extrahiert oder durch Einengen i. V. auf ein Volumen zwischen 200 und 500 ccm gebracht,
dann sechsmal mit 200 ccm Methylenchlorid extrahiert, über Natriumsulfat getrocknet
und zur Kristallisation auf ein kleines Volumen eingeengt.
-
Proben der beiden Fraktionen werden nach der oben angeführten Methode
papierchromatographisch getrennt und die Ausbeuten bestimmt.
| Tabelle 2 |
| /° Compound °/° Substanz /0 /0 |
| epi-F I 6ß-Oxy S I Compou |
| 10 nd F I Substanz S |
| Gefunden in der |
| Mycelfraktion................................... 2 = 2 7 |
| wäßrigen Fraktion .............................. 34 4 33 - |
Aus dem eingeengten Methylenchloridextrakt der wäßrigen Phase kristallisieren 0,446
g (55,6 °/o) eines Gemisches von Compound epi-F und Compound F aus, das zu 47 °/o
aus Compound epi-F und zu 50 °/a aus Compound F besteht. Die verbleibende ölige
Mutterlauge wird an einer Säule von 40 g Magnesiumsilikat, bekannt ,unter dem Handelsnamen
»Florisila, chromatographiert und letztere jeweils drei- bis viermal mit je 0,11
Benzol, Benzol zu Äther
(50: 50 V/V), Äther, Äther zu Aceton
(90:
10 V/V),
Äther zu Aceton
(70: 30 V/V), Äther zu Aceton
(50: 50 V/V), Äther zu Aceton
(30: 70 V/V) und Äther zu Aceton
(10: 90 V/V) eluiert.
-
Aus der Fraktion Äther zu Aceton (50: 50 V/V) werden weitere
0,028 g (3,5 °/o) Kristalle erhalten, die zu 50 °/o aus Compound epi-F und zu 50
°/o aus Compound F bestehen.
-
Die Trennung von Compound epi-F und Compound F erfolgt nach dem Verfahren
der Patentanmeldung F 17828 IV b/12o.
-
Beispiel 3 Man verfährt gemäß Beispiel 2, aber unter Verwendung von
1 g Substanz S, das in 100 ccm Aceton gelöst ist. Inkubationstemperatur 12 bis 15'.
| Tabelle 3 |
| Compound °/o Substanz °/o o/o |
| epi-F 6ß-Oxy S Compound F Substanz S |
| Gefunden in der |
| Mycelfraktion ................................... 4 - - 4 |
| wäßrigen Fraktion .............................. 36 3 30 8 |
Isoliert: 0,543g (54,30/,) mit einem Gehalt an Compound epi-F von
570/, und
an Compound F von 430/,.
-
Nach der Chromatographie an einer »Florisil«-Säure werden weitere
0,05 g eines Gemisches isoliert, das zu 50 °/o aus Compound epi-F und zu 50 °/o
aus Compound F besteht. Beispiel 4 Man verfährt gemäß Beispiel 2, aber unter Verwendung
von 2 g Substanz S, die in 200 ccm Aceton gelöst sind und in acht Portionen zu je
0,25 g Substanz S in 25 ccm Aceton innerhalb von 24 Stunden zur Kulturlösung gegeben
werden.
-
Inkubationstemperatur 12 bis 15'.
| Tabelle 4 |
| °/° Compound °/o Compound °/° °/o |
| epi-F 6ß-Oxy F Compound F Substanz S |
| Gefunden in der |
| Mycelfraktion ................................... 4 - 4 12 |
| wäßrigen Fraktion .............................. 34 2 24 9 |
Isoliert: 1,0 g (50 °/o) mit einem Gehalt an Compound epi-F von 60 °/p und an Compound
F von 40 °/o. Beispiel 5 Man verfährt wie im Beispie14, aber bei einer Inkubationstemperatur
von 36°.
| Tabelle 5 |
| °/o Compound °/o Compound °/o °/o |
| epi-F 6ß-Oxy F Compound F Substanz S |
| Gefunden in der |
| Mycelfraktion ................................... - - - - |
| wäßrigen Fraktion .............................. 50 3 22 - |
Isoliert:
1,19 g (59,5 °/o) mit einem Gehalt an Compound epi-F von 67 "/o
und an Compound F von 32 °/o. Beispiel 6 Man verfährt wie im Beispiel 2, aber unter
Verwendung von 3 g Substanz S, die in 300 ccm Aceton gelöst sind und in zwölf Portionen
zu j e 0,25 g Substanz S in 25 ccm Aceton zur Kulturlösung im Laufe von 2 Tagen
zugegeben werden.
| Tabelle 6 |
| °/° Compound °/o Substanz °/° °% |
| epi-F 6ß-Oxy S Compound F Substanz S |
| Gefunden in der |
| Mycelfraktion ................................... 4 - - 8 |
| wäßrigen Fraktion ............... ............ 45 2 26 - |
Isoliert: 1,735 g (58 °/o) mit einem Gehalt an Compound epi-F von 72
% und
an Compound F von 24 °/0.
Beispiel 7 Man verfährt wie im Beispiel
2, aber unter Verwendung von 5 g Substanz S, die in 500 ccm Aceton gelöst sind und
in zwanzig Portionen zu je 0,25 g Substanz S in 25 ccm Aceton im Laufe von 4 Tagen
zugegeben werden.
| Tabelle 7 |
| % Compound % Substanz 0/0 |
| epi-F 6ß-Oxy S Compound F Substanz S |
| Gefunden in der |
| Mycelfraktion ................................... 20 - 7 8 |
| wäßrigen Fraktion ............ . ................. 46
- 20 - |
Isoliert: 2,885 g (58 °/o) mit einem Gehalt an Compound epi-F von 64 °/o und an
Compound F von 36 °/o. Beispiel 8 Man verfährt wie im Beispiel 2, aber unter Verwendung
von 6 g Substanz S, die in 600 ccm Aceton gelöst sind und in vierundzwanzig Portionen
zu je 0,25 g Substanz S in 25 ccm Aceton im Laufe von 3 Tagen zugegeben werden.
| Tabelle 8 |
| °/o Compound 0/p Substanz °/o a/o |
| epi-F 6 ß-Oxy S Compound F Substanz S |
| Gefunden in der |
| Mycelfraktion ................................... 6 - - 10 |
| wäßrigen Fraktion .............................. 40 - 28 - |
Isoliert: 3,58 g (59,7 %) mit einem Gehalt an Compound epi-F von 67 °/a und an Compound
F von 32 °/o. Beispiel 9 Man verfährt gemäß Beispiel 2, aber unter Verwendung von
3 1 Nährboden in einer Verdünnung 1 : 3 (1 Teil Nährboden, 2 Teile Wasser) und 5
g Substanz S, die in 500 ccm Aceton gelöst sind und in zehn Portionen zu je 0,5
g Substanz S in 50 ccm Aceton im Laufe von 21/2 Tagen zugesetzt werden.
| Tabelle 9 |
| °/a Compound °/o Substanz °/o °/a |
| epi-F 6ß-Oxy S Compound F Substanz S |
| Gefunden in der |
| Mycelfraktion .................. .............. 8 - - - |
| wäßrigen Fraktion .............................. 46 - 30 - |
Isoliert: 3,01 g (60 °/o) mit einem Gehalt an Compound epi-F von 55 °/o und an Compound
F von 45 °/o. Beispiel 10 Man verfährt gemäß Beispiel 2, aber unter Verwendung von
501 Nährboden und 50 g Substanz S, die in 5 I Aceton gelöst sind und in fünf Portionen
zu je 10g Substanz S in einem Liter Aceton in einem Tage zur Kulturlösung zugesetzt
werden. Die Fermentierung wird so lange fortgesetzt, bis in Probeentnahmen keine
Substanz S mehr nachweisbar ist.
-
Inkubationszeit 1 bis 2 Tage.
| Tabelle 10 |
| Compound 0% Substanz ( °/o °/o |
| epi-F 6ß-Oxy S Compound F Substanz S |
| Gefunden in der |
| Mycelfraktion ................................... - - - - |
| wäßrigen Fraktion .............................. 38 - 26 17 |
Isoliert: 22,06 (44 °/(,) mit einem Gehalt an Compound epi-F von 50 °/o und an Compound
F von 48 °/o.
Beispiel 11 Man verfährt wie im Beispie12, aber unter
Verwendung von 50 l Nährboden in einer Verdünnung 1 : 3 (1 Teil Nährboden, 2 Teile
Wasser) und 80 g Substanz S, die in 81 Aceton gelöst sind und in Portionen von je
3,33 g Substanz S in 333 ccm Aceton 2stündlich zugesetzt werden. Die Fermentierung
wird so lange fortgesetzt, bis in Probeentnahmen keine Substanz S mehr nachweisbar
ist.
-
Inkubationszeit 2 bis 3 Tage.
| - Tabelle 11 |
| °/° Compound % Substanz °/° % |
| epi-F 6ß-Oxy S Compound F Substanz S |
| Gefunden in der |
| Mycelfraktion ................................... 14 - 6 2 |
| wäßrigen Fraktion ............................... 30 2 34 - |
Isoliert: 42,0 g (52,5 0/0) mit einem Gehalt an Compound epi-F von 48 0/0 und an
Compound F von 51 °/o.
-
Beispiel 12 Man verfährt wie im Beispiel 1, aber unter Verwendung
von 20 mg Substanz S, die in verschiedenen Mengen Methanol gelöst sind.
| Tabelle 12 |
| 0 |
| Versuch Nr. ccm Compound ° ° |
| Methanol epi-F Comp und F |
| 1 3 34 45 |
| 2 3 29 52 |
| 3 3 29 55 |
| 4 3 33 50 |
| 5 5 28 40 |
| 6 5 20 50 |
| 7 5 28 45 |
| 8 5 28 52 |
Beispiel 13 Man verfährt wie im Beispiel 2, aber unter Verwendung von 1,25 g Substanz
S, die in 125 ccm Aceton gelöst sind und in fünf Portionen zu je 0,25 g Substanz
S in 25 ccm Aceton im Laufe von 10 Stunden zur Kulturlösung zugesetzt werden. Vor
der ersten Zugabe von Substanz S gibt man 180 ccm Methanol zur Kulturlösung.
-
Die Inkubationszeit beträgt 2 Tage.
| Tabelle 13 |
| °I° °I° °/° |
| Compound Compound Substanz |
| epi-F F S |
| Gefunden in der |
| Mycelfraktion ...... 4 - 14 |
| wäßrigen Fraktion . . 31 35 - |
| Isoliert: 0,45 g (36°/0) mit einem Gehalt an Compound |
| epi-F von 30 0/0 und an Compound F von 70 0/0. |
Beispiel 14 Man verfährt wie im Beispiel 2, aber unter Verwendung von 31 Nährboden
in einer Verdünnung von 1 : 3 (1 Teil Nährboden, 2 Teile Wasser) und 1 g Substanz
S, die in 100 ccm Aceton gelöst sind und in vier Portionen zu je 0,25 g Substanz
S in 25 ccm Aceton im Laufe von 10 Stunden zur Kulturlösung zugesetzt werden. Vor
der ersten Zugabe von Substanz S gibt man 120 ccm Methanol zur Kulturlösung.
-
Inkubationszeit: 1 Tag.
| Tabelle 14 |
| Compound Compound Substanz |
| °lo 0111 °% |
| epi-F F S |
| Gefunden in der |
| Mycelfraktion ...... 4 - - |
| wäßrigen Fraktion . . 32 44 - |
Isoliert: 0,45 g (45 0/0) mit einem Gehalt an Compound epi-F von 29 0/0 und an Compound
F von 68 0/0.
-
Beispiel 15 Man verfährt wie im Beispiel 2, aber unter Verwendung
von 31 Nährboden in einer Verdünnung von 1 : 3 (1 Teil Nährboden, 2 Teile Wasser)
und 3 g Substanz S, die in 100 ccm Methanol gelöst sind und in einer Portion zu
der Kulturlösung zugesetzt werden.
-
Die Inkubationszeit beträgt 2 Tage.
| Tabelle 15 |
| Compound Compound Substanz |
| epi-F F S |
| Gefunden in der |
| Mycelfraktion ...... - - 14 |
| wäßrigen Fraktion . . 33 35 - |
Isoliert: 1,5 g (50°/0) mit einem Gehalt an Compound epi-F von 40 0/0 und an Compound
F von 55 0/0.
-
Beispiel 16 Man verfährt wie im Beispiel 2, aber unter Verwendung
von 31 Nährboden in einer Verdünnung von 1 : 20 (0,15 1 Nährboden, 2,85 1 Wasser)
und 3 g Substanz S, die in 100 ccm Methanol gelöst sind und in einer Portion zur
Kulturlösung zugesetzt werden.
-
Die Inkubationszeit beträgt 4 Tage.
| Tabelle 16 |
| °/o °% °/o |
| Compound Compound Substanz |
| epi-F F S |
| Gefunden in der |
| Mycelfraktion ...... - - 46 |
| wäßrigen Fraktion . . 27 24 - |
Isoliert: 1,1 g (370/0) mit einem Gehalt an Compound epi-F von 39 0/0 und an Compound
F von 55 0/0.
Beispiel 17 Man verfährt wie im Beispiel 2, aber unter
Verwendung von 31 Wasser, dem eine 2 Tage vorgezüchtete Kulturlösung in 100 ccm
des normalen Nährbodens zugesetzt werden. Es erfolgt ein Zusatz von 3 g Substanz
S, die in 100 ccm Methanol gelöst sind und in einer Portion zu der Kulturlösung
zugefügt werden.
-
Die Inkubationszeit beträgt 5 Tage.
| Tabelle 17 |
| % °/o |
| Compound Compound Substanz |
| epi-F F S |
| Gefunden in der |
| Mycelfraktion ...... - - 50 |
| wäßrigen Fraktion .. 22 24 - |
Isoliert: 1,0 g (33 °/a) mit einem Gehalt an Compound epi-F von 47 °/a und an Compound
F von 48 °/o.
-
Beispiel 18 Man verfährt gemäß Beispiel 2, aber unter Verwendung von
4 g Substanz S, die in 133 ccm Methanol gelöst sind und in einer Portion zur Kulturlösung
zugesetzt werden. Die Inkubationszeit beträgt 1 Tag.
| Tabelle 18 |
| °/o °% |
| Compound Compound Substanz |
| epi-F F S |
| Gefunden in der |
| Mycelfraktion ...... - - - |
| wäßrigen Fraktion .. 38 38 - |
Isoliert: 2,0 g (50 °/o) mit einem Gehalt an Compound epi-F von 36 °/o und an Compound
F von 64 °/o.
-
Beispiel 19 Man verfährt gemäß Beispiel 18, aber unter Verwendung
von 5 g Substanz S, die in 166 ccm Methanol gelöst sind. Die Inkubationzeit beträgt
4 Tage.
| Tabelle 19 |
| Compound Compound Substanz |
| epi-F F s |
| Gefunden in der |
| Mycelfraktion ...... - - - |
| wäßrigen Fraktion . . 30 45 - |
Isoliert: 2,5 g (50 °/o) mit einem Gehalt an Compound epi-F von 32 °/o und an Compound
F von 68 °/o.