SU586182A1 - Способ получени иммобилизованной амилазы - Google Patents

Description

Изобретение относитс  к способу получени  иммобилизованных ферментов, которые могут найти применение в химическом и фармацевтическом производстве, а также в пищевой промышленности. В числе ферментов, представл ющих особый интерес дл  получени  в иммобилизованном состо нии, следует назвать а-амилазу, котора  находит широкое применение в пищевой промышленности дл  гидролиза крахмала до Сахаров. К насто щему времени известен целый р д препаратов иммобилизованной сс-амилазы, полученных как ковалентным св зыванием фермента с полимерным носителем, например модифицированной целлюлозой, так и включением в полиакриламидный гель. В частности, известен способ ковалентного св зывани  а-амилазы с эфирами целлюлозы . В этом случае иммобилизацию фермента провод т на предварительно обработанном дл  введени  реакционноспособных групп носителе , например, диазосочетанием фермента с диазотированными 3-(«-аминофенокси)-2оксииропиловым и 2-окси-3-(л-изотиоциаиатофенокси )-пропиловым эфирами целлюлозы. Дл  иммобилизации раствор фермента в водном буфере при соответствующем значении рН перемешивают с нерастворимым носителем , причем иммобилизацию ведут при иониженных температурах в течение длительного времени, получа  в результате препарат иммобилизованного фермента, обладающий в зависимости от условий процесса различным содержанием активного фермента, не превышающим , однако, во всех случа х 15 мг активного фермента на 1 г полимерного носител . Однако такой способ, как и другие, известные к насто щему времени и имеющие лишь незначительные отличи , имеет р д недостатков , к которым относ тс ; сложность получени  активированных полимерных носителей, использование токсичных препаратов, низка  контролируемость процесса иммобилизации, мала  технологичность получаемых продуктов (а в случае включени  фермента в гель - заметное вымывание активного фермента в процессе работы), а также невысокое качество получаемых препаратов, определ емое количеством св занного активного фермента на единицу веса носител . Термическа  стойкость получаемых продуктов невысока-при выдерживании в течение 7 дней при 45° С они сохран ют лишь 20% исходной активности. Целью изобретени   вл етс  упрощение процесса иммобилизации фермента сс-амилазы , а также повышение качества продукта. Это достигаетс  за счет того, что а-амилазу ввод т в водную или спиртовую среду вместе с карбодиимидом, а в качестве полимерного носител  используют карбоксилсодержащий материал.

Предлагаемый способ заключаетс  в том, что а-амилазу ввод т в водную или спирто- 5 вую среду вместе с сочетающим агентом - карбодиимидом, иснользу  в качестве носител  карбоксилсодержащий материал, например полипропиленовую ткань с привитыми группами акриловой кислоты, частично гидролизо- 10 ванный полиэтилеитерефталат и т. д., в форме тканей, пленок, гранул, волокон и т. и.

При этом в случае проведени  иммобилизации в водной среде при значени х рН пор дка 5 в соответствующем буфере, когда 15 фермент полностью растворим, в качестве сочетающего агента примен ют водорастворимые карбодиимиды, например 1-циклогексил3- (2-морфолиноэтил) - карбодиимид-;и-д-толуолсульфоиат и т. д.20

Учитыва , что водорастворимые карбодиимиды представл ют собой дорогие и дефицитные реактивы и сложны в производстве, предлагаемый способ предусматривает возможность проведени  иммооилизации а-ами- 25 лазы в этиловом спирте с использованием в качестве сочетающих агентов значительно более дещевых и менее дефицитных карбодиимидов , растворимых в органических растворител х , например дициклогексилкарбоди- ЗО имида. При этом а-амилаза образует в спирте не раствор, как в воде, а суспензию, и таким образом иммобилизаци  протекает в гетерогенных услови х.

Схему иммобилизации можно представить 35 следующим образом: фермент образует в спирте суспензию, очень небольща  часть фермента нереходит в раствор, где взаимодействует с носителем через сочетающий агент, вызыва  таким образом переход в раствор еще 40 одной порции фермента, ее иммобилизацию и т. д.

Таким образом, насто щий способ предусматривает возможность иммобилизации фермента как из гомогенного раствора в во- 45 де, так и из суспензии в органическом растворителе- спирте. При этом количество иммобилизуемого фермента легко даетс  регулировать изменением его концентрации в исходной смеси, изменением концентрации со- 50 четающего агента и изменением времени реакции .

Примен емые в снособе в качестве исходных веществ соединени   вл ютс  продажными препаратами или могут быть получены из- 55 вестными способами.

Пример 1. 1 г а-амилазы (препарат Амиоризин-ПЮх производства рассказовского химзавода с амилолнтической активностью 2000 ед/г) раствор ют в 100 мл ацетатного 60 буфера с рН 5,0 и ионной силой 0,02. Раствор охлаждают до 4° С, помещают в него обраец полипропиленовой ткапи с 12 вес. % приитой акриловой кислоты размером 4X4 см и при перемещивании добавл ют различные 65

количества растворенного в том же буфере водорастворимого карбодиимида с мол. весом 492. Реакцию сочетани  ведут в течение 2- 48 ч. Затем ткань извлекают, промывают 500 мл того же ацетатного буфера, 250 мл 1М NaCl, 250 мл 0,001 н. НС1 и 500 мл воды, все промывки ведут порци ми по 50 мл и вы .сущивают. Амилолитическую активность препарата иммобилизованной а-амилазы определ ют фотокалориметрически по количеству расщепленного крахмала.

Количество активной иммобилизованной а-амилазы в мг/г носител  в зависимости от концентрации карбодиимида и времени реакции приведено в табл. 1.

Таблица I

Количество активной им.мобилизованной а-амилазы, мг/г, при

Врем  концентрации карбодиимида, мг

Пример 2. 1 г а-амилазы суспендируют в 100 мл 96%-ного этилового снирта, суспензию охлаждают до 4° С, помещают в нее такой же образец носител , как в примере 1, и при перемещивании добавл ют различные количества растворенного в спирте дициклогексилкарбодиимида . Врем  реакции и промывка ткани после иммобилизации такие же, как и в примере 1.

Количество активной иммобилизованной а-амнлазы, мг/г носител , в зависимости от концентрации карбодиимида и времени реакции приведено в табл. 2.

Таблица 2

Количество активной им.чобилизо..

ванной а-амилазы, мг/г, при

Врем  концентрации карбодии.мида, мг

Пример 3. Суспензию а-амилазы готов т по примеру 2 и помещают в нее образец полиэтилентерефталатной пленки 4X4 см, нредварительно подвергнутый гидролизу 3 н. НС1 при 80° С в течение 48 ч. Все дальнейщне процедуры провод т, как в примере 2.

Количество активной иммобилизованной аамилазы в мг/г носител  в зависимости от концентрации карбодиимида и времени реакции нриведено в табл. 3.

Таблица 3

Количество активной иммобилизованной а-амилазы/, мг/г, при

Врем  концентрации карбодиимида, мг

Во всех трех случа х дл  каждого образца было ироведено ио 120 исиытаний его активности , котора  оказывалась посто нной, к тому же все образцы сохран ли до 80% активности носле выдерживани  в течение 7 дней ири 40° С.

Claims (3)

1.Снособ получени  иммобилизованной а-амилазы на полимерном носителе, отличающийс  тем, что, с целью упрощени  процесса иммобилизации и повыщени  качества продукта, а-амилазу ввод т в водную или спиртовую среду вместе с карбодиимидом, а

в качестве полимерного носител  используют карбоксилсодержащий материал.

2.Способ по п. 1, отличающийс  тем, что в водной среде примен ют водорастворимый карбодиимид.

3. Способ по п. 1, отличающийс  тем, что в спиртовой среде примен ют карбодиимид , растворимый в органических растворител х .