SU883175A1 - Способ получени иммобилизованной глюкозоизомеразы - Google Patents

Description

Изобретение относится к усовершенствованному способу получения иммобилизованной глюкозоизомеразы, которая может найти применение для получения глюкозо-фруктозного сиропа из гидролизаторов крахмалосодержащего сырья для нужд пищевой промышленности.

Известно получение иммобилизованной глюкозоизомеразы различными способами, например путем ковалентного связывания фермента с полимером, адсорбцией, включением в гель и т.д. ['1

Однако большинство известных препаратов иммобилизованной глюкозоизомеразы обладает или низкой активностью, или малой стабильностью (время полужизни препаратов составляет от 42 ч до 40 дн.).

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности является спо- ₂ соб получения иммобилизованной клюкозоизомеразы путем связывания фермента в буферном растворе с неорганическим Sί-содержащим носителем (в качестве которого обычно используется пористое стекло) с помощью сшивающего агента глутарового альдегида (2J.

При иммобилизации сохраняется 56% первоначальной активности, препарат теряет половину активности в течение 30 дн.

Однако дня известного способа ха- рактерны недостаточно высокие значения’ активности и стабильности получаемого продукта.

Кроме того, глутаровый- альдегид является ингибитором глюкозоизомеразы Применение глутарового альдегида в качестве сшивающего агента отрицательно сказывается на активности и стабильности получаемого препарата из-за малой длины углеродной цепочки молекулы глутарового альдегида.

Целью изобретения являет9я повышение активности и стабильности полу- чаемого препарата.

Указанная цель достигается тем, что согласно спосо’бу получения иммо билизованной глюкозоизомеразы путем связывания фермента в буферном растворе с неорганическим Sί-содержащим носителем с помощью сшивающего агента, в качестве последнего используют кватериизованный сополимер винилпиридина с акролеином.

Кроме того, в качестве неорганического Si-содержащего носителя обычно используют аминированный'силохром, а в качестве глюкозоимеразы - глюкозоизомеразу Actinomyces ol ivoci nereus 154.

Использование в качестве сшивающего агента кватернизованного сополимера винилпиридина с акролеином позволяет достаточно отдалить фермент от носителя и избегнуть отрицательного влияния матрицы.

Способ осуществляют следующим образом .

К аминированному силохрому добавляют водный раствор кватернизованного сополимера винилпиридина с акролеином в фосфатном буфере pH 7,6. К Полученному продукту добавляют глюкозоизомеразу, соли магния и кобальта и инкубируют в течение 6 ч при перемешивании. Иммобилизованную глюкозоизомера—' зу отделяют от раствора и хранят при 4°С в фосфатном буфере pH 7,6.

Полученный таким путем фермент сохраняет·58-62% первоначальной активности, имеет pH - оптимум 7,5 (pH оптимум нативного фермента 8,5) и сохраняет через 3 месяца работы в реакторе с перемешиванием 56% своей активности. При хранении при 4 С в течение года препарат иммобилизованной глюкозоизомеразы практически не теряет активности.

Пример. 1 г аминированного -аминопропилтриэтоксиланом макропористого силохрома (размер пор 700 1000 А, содержание аминогрупп 4,7 мг-экв/г) смешивают с 25 мл 1%-ого раствора кватернизованного сополимера винилпиридина с акролеином в 0,05 М фосфатном буфере pH 7,6. Смесь осторожно перемешивают на роторе в течение 6 ч, затем носитель отмывают на стеклянном фильтре от несвязавшегося полимера тем же буфером до исчезновения в промывных водах поглощения при 255 нм. Полученный носитель с пришитым сополимером помещают в 60 мп 3,1%-ого раствора глюкозоизомеразы, содержащего MgS04 в концентрации

I < Ю~³М и СоС12 в концентрации 1 х х ЮМ-М. Смесь инкубируют в течение 6 ч при 60°С при осторожном перемешивании на роторе, осадок иммобилизованного фермента отделяют на стеклянном фильтре, промывают буфером до исчезновения глюкозоизомеразной активности в промывных водах.

Полученный препарат сохраняет 62% исходной активности, имеет рН-оптимум 7,5; температурный оптимум 80°С. Через 3 месяца работы в реакторе с перемешиванием при 60°С препарат проявляет 56% своей первоначальной активности. При хранении при 4 °C в течение года активность препарата практически, не меняется. Скорость конверсии глюкозы во фруктозу для иммобилизованной глюкозоизомеразы составляет 11,3 мг фруктозы в час, что лишь ненамного ниже значения для растворимого фермента (12,1 мг/ч).

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить стабильный препарат иммобилизованной глюкозоизомеразы, обладающий высокой ферментной активностью.

Claims (2)

1. Изобретение относитс  к усовершенствованному способу получени  иммобилизованной глюкозоизомеразы, котора  может найти применение дл  получени  глюкозо-фруктозного сиропа из гидроли заторов крахмалосодержащего сьгрь  дл  нужд пищевой промьшшенности. Известно получение иммобилизованной глюкозоизомеразы различными способами , например путем ковалентног п св зывани  фермента с полимером, адсорбцией , включением в гель и т.д. Однако большинство известных препа ратов иммобилизованной глюкозоизомера зы обладает или низкой активностью, или мгаой стабильностью (врем  полужизни препаратов составл ет от 42 ч до 40 дн.). Наибап.ее близким к предлагаемому по технической сущности  вл етс  способ получени  иммобилизованной кпюкозоизомеразы путем св зывани  фермента в буферном растворе с неорганическим Si-содержащим носителем ( в качестве которого обычно используетс  пористое стекло) с помощью сшивающего агента глутарового альдегида 2j. При иммобилизации сохран етс  56% первоначальной активности, препарат тер ет половину активности в течение 30 дн. Однако дп  известного способа ха- рактерны недостаточно высокие значени  активности и стабильности получаемого продукта. Кроме того, глутаровьй- альдегид  вл етс  ингибитором глюкозоизомеразы. Применение глутаролого альдегида в качестве сшивакщего агента отрицательно сказываетс  на активности и стабильности получаемого препарата из-за малой длины углеродной цепочки молекулы глутарового альдегида. Целью изобретени   вл етс  повьшение активности и стабильности полу- чаемого препарата. Указанна  цель достигаетс  тем, что согласно способу получени  иммобилизованной глюкозоизомеразы путем св зывани  фермента в буферном раство ре с неорганическим Si-содержащим носителем с помощью сшивающего агента, в качестве последнего используют кватернизованный сополимер винилпиридина с акролеином. Кроме того, в качестве неорганического Si-содержащего носител  обычн используют аминированныйсилохром, а в качестве глюкозоимеразы - глюкозоизомеразу Act nomyces ol ivoci nereus 154. Использование в качестве сшиваюDiero агента кватернизованного сополимера винилпиридина с акролеином позвол ет достаточно отдалить фермент от носител  и избегнуть отрицательного вли ни  матрицы. Способ осуществл ют следующим образом . К аминированному силохрому добавл ют водный раствор кватернизованного сополимера винилпиридина с акролеином в фосфатном буфере рН 7,6. К Получен ному продукту добавл ют глюкозоизомеразу , соли магни  и кобальта и инкубируют в течение 6 ч при перемешивании . Иммобилизованную глюкозоизомера зу отдел ют от раствора и хран т при в фосфатном буфере рН 7,6. Полученный таким путем фермент сохран ет58-62% первоначальной акти ности, имеет рН - оптимум 7,5 (рН оптимум нативного фермента 8,5) и со хран ет через 3 мес ца работы в реак торе с перемешиванием 56% своей активности . При хранении при 4 С в теч ние года препарат иммобилизованной глюкозоизомеразы практически не тер  ет активности. Пример. 1 г аминированного ЗГ -аминопропилтриэтоксиланом макропо ристо о силохрома (размер пор 700 1000 А, содержание аминогрупп 4,7 мг-экв/г) смешивают с 25 мл 1%-о раствора кватернизованного сополимер винилпиридина с акролеином в 0,05 М фосфатном буфере рН 7,6. Смесь осторожно перемешивают на роторе в течение 6 ч, затем носитель отмывают на стекл нном фильтре от несв завшегос  полимера тем же буфером до исчезнове ни  в промывных водах поглощени  при 255 нм. Полученный носитель с приши fbiM сополимером помещают в 60 мп 3,1%-ого раствора глюкозоизомеразы, содержащего МдЗСЦ в концентрации I 4 и CoCl2 в концентрации 1 х . 4 X . Смесь инкубируют в течение 6 ч при при осторожном перемешивании на роторе, осадок иммобилизованного фермента отдел ют на стекл нном фильтре, промывают буфером до исчезновени  глюкозоизомеразной активности в промывных водах. Полученный препарат сохран ет 62% исходной активности, имеет рН-оптимум 7,5; температурный оптимум 80°С. Через 3 мес ца работы в реакторе с перемешиванием при 60 С препарат про вл ет 56% своей первоначальной активности . При хранении при 4 С в течение года активность препарата практически, не мен етс . Скорость конверсии глюкозы во фруктозу дл  иммобилизованной глюкозоизомеразы составл ет 11,3 мг фруктозы в час, что лишь ненамного ниже значени  дл  растворимого фермента (12,1 мг/ч), Таким образом, предлагаемый способ позвол ет получить стабильный препарат иммобилизованной глюкозоизомеразы , обладающий высокой ферментной активностью. Формула изобретени  1.Способ получени  иммобилизованной глюкозоизомеразы путем св зывани  фермента в буферном растворе с неорганическим Si-содержащим носителем с помощью сшивающего агента, отличающийс  тем, что, с целью повьш1ени  активности и стабильности получаемого препарата, в качестве сшивающего используют кватернизованный сополимер винилпиридина с акролеином. 2.Способ по п. I, отличающийс  тем, что в качестве неорганического S i-содержащего носител  используют аминированный силохром. 3.Способ по п. 1, отличающийс  тем, что используют глюкозоизомераз  Асtinomyces оlivocinereus 154. Источники информации, прин тые во внимание при экспертизе 1.Грачева И. М., Мосичев М. С. и Гавристова А. В. Глюкозоизомераза микроорганизмов. Сборник Итоги науки . Микробисшоги , т. 9, М., 1978, ВИНИТИ, с. 69-74.
2. 2.Lee Y. Y.Wun К., Tsao G. Т. Kinetics and mass Transfer chara -58831754

   cteristicsof glucose ipomerase im-etal I , S., Susukl , Plenum Press,

   nx) on porous glass. Immobili- N-Y, London, 1975, p. 132-140 (протоtfed frisyme Technology, ed. H. H. We- тип).